KR20090052575A

KR20090052575A - 인산결핍조건에서 발현되는 탈인산화효소유전자(ＯｓＰＡＰ2) 및 상기 유전자로 형질전환된 식물체

Info

Publication number: KR20090052575A
Application number: KR1020070119157A
Authority: KR
Inventors: 김도훈; 윤대진; 남재성; 이재헌; 정영수; 은무영; 허경혜; 남민희
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2007-11-21
Filing date: 2007-11-21
Publication date: 2009-05-26

Abstract

인산결핍조건에서 발현되어 인산의 흡수에 중요한 역할을 하는 벼 유래 탈인산화효소 유전자(OsPAP2) 및 상기 유전자로 형질전환된 식물체가 개시된다. 본 발명에 따른 벼 유래 탈인산화효소 유전자(OsPAP2)로 형질전환된 식물체는 인산 결핍시 야생종보다 효율적으로 영양결핍에서 오는 스트레스를 극복할 수 있고, 식물의 인산 흡수 능력을 향상시켜 농가의 비료 양에 따른 농업 비용 감소는 물론, 환경오염 방지와 작물의 생산량 및 생산의 질을 향상시킬 수 있다.

인산결핍, 벼, 탈인산화효소, 식물형질전환, OsPAP2

Description

인산결핍조건에서 발현되는 탈인산화효소 유전자(ＯｓＰＡＰ2) 및 상기 유전자로 형질전환된 식물체{Phosphatase Gene(OsPAP2) Expressing Under Phosphate Starvation Condition and Plants Tranformed by the Gene}

본 발명은 벼 유래 탈인산화효소 유전자 (OsPAP2) 및 상기 유전자로 형질전환된 식물체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 인산결핍조건에서 발현되어 인산의 흡수에 중요한 역할을 하는 벼 유래 탈인산화효소 유전자(OsPAP2) 및 상기 유전자로 형질전환된 식물체에 관한 것이다.

인산은 인지질, 핵산, 에너지 대사, 효소 활성의 조절, 신호전달과정 등에서 필수적인 생물학적 기능을 하여 식물의 성장과 발달에 가장 중요한 영양소 중의 하나이다.

지구의 암석권에는 인산이 많이 존재하나, 토양에서 80% 정도가 고정되어 있어 뿌리가 쉽게 이용할 수 없으므로 작물 생산성에 제한 인자로 작용한다. 따라서, 작물에 충분한 영양소를 공급하기 위해 시비를 많이 하게 되어 농업 비용이 증가하게 되고, 미처 흡수되지 못한 인산질 비료는 빗물에 씻겨 내려가 지하수를 오염시 키고 부영양화를 일으켜 환경오염을 야기하므로, 인산결핍 조건에서도 효율적으로 생장 가능한 작물 개발이 필요하다.

또한, 식물은 인산이 결핍된 조건에서 뿌리의 생장과 뿌리털의 형성을 촉진하여 표면적을 넓히고, 고친화성 인산 운반체, 탈인산화효소, 유기산 생합성과 분비에 관련된 유전자들의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명자들은 인산이 결핍된 조건에서 인산의 이용성을 향상시킬 수 있는 식물체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 인산 결핍 조건에서 발현하는 신규 탈인산화효소 유전자를 벼에서 분리하고, 분리된 유전자로 형질전환시킨 식물체가 인산 결핍 조건에서 인산 결핍 스트레스 저항성을 가진다는 사실을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 탈인산화효소를 코딩하는 유전자(OsPAP2), 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 탈인산화효소를 코딩하는 유전자(OsPAP2) 또는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 탈인산화효소 OsPAP2 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 벼(Oryza sp.) 유래 탈인산화효소를 코딩하는 유전자(OsPAP2), 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 탈인산화효소 OsPAP2를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터를 애기장대(Arabidopsis thaliana), 벼, 보리, 밀, 콩, 깨, 조, 수수, 메밀, 기장, 율무, 귀리, 고구마 및 감자로 구성된 군에서 선택되는 식물체에 도입하여 수득되는 형질 전환 식물체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 탈인산화효소 OsPAP2를 발현시키는 단계; 및 상기 발현된 탈인산화효소 OsPAP2를 회수하는 단계를 포함하는 탈인산화효소 OsPAP2의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 탈인산화효소를 코딩하는 유전자(OsPAP2)를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포와 공배양시켜 형질전환시키는 단계; 및 상기 형질전환된 숙주세포에서 발현된 OsPAP2 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 OsPAP2 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 탈인산화효소 OsPAP2에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

본 발명에 따른 벼 유래 탈인산화효소 유전자(OsPAP2)로 형질전환된 식물체는 인산 결핍시 야생종보다 효율적으로 영양결핍에서 오는 스트레스를 극복할 수 있고, 식물의 인산 흡수 능력을 향상시켜 농가의 비료 양에 따른 농업 비용 감소는 물론, 환경오염 방지와 작물의 생산량 및 생산의 질을 향상시킬 수 있다.

벼 전체 게놈 서열이 규명되어 있기는 하나(Kikuchi, S. et al ., Science, 301:376, 2003), 본 발명에 따른 유전자의 기능에 대해서는 밝혀진 바 없었다. 본 발명에 따르면, 동진벼에서 게놈 DNA를 분리하여 벼 유래의 탈인산화효소 유전자(OsPAP2)에 특이적인 프라이머를 제작하고, PCR 법에 의해 OsPAP2 유전자를 증폭한 후, 상기 유전자를 벡터에 클로닝하여 재조합벡터를 제작한 다음, triparental mating 방법으로 아그로박테리움 투메파시앙스 EHA105(Agrobacterium tumefaciens EHA105)로 옮기고, in planta 형질전환 방법으로 애기장대에 형질도입하여 형질전환 식물체를 제작하였다.

본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 벼(Oryza sp.) 유래 탈인산화효소 및 상기 효소를 코딩하는 유전자(OsPAP2), 상기 유전자(OsPAP2)를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 인산결핍 조건에서 발현되는 탈인산화효소 유전자 OsPAP2는 기존에 밝혀지지 않은 새로운 유전자로, 전체 1893bp의 염기서열을 가지고 있으며, 630 아미노산을 암호화하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드(plasmid), 파지(bacteriophage) 입자 또는 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라 스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법을 사용할 수 있으며, 전기천공법(electroporation)(Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포 내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며, 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더욱 포함하여야만 한다.

모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위 내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 본 발명에 따른 단백질의 cDNA를 클로닝하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩(binding)법, 페닝(panning)법, 필름 에멀션(film emulsion)법 등이 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포는 특별히 제한되지 않고, 형질전환에 통상적으로 사용되는 박테리아, 효모, 곰팡이, 곤충세포, 동물세포, 식물세포 등을 이용할 수 있으며, 원핵세포인 박테리아를 사용하는 것이 바람직하다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli JM109, E. coli DH5α, E. coli JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli B, E. coli B21 등을 예시할 수 있으며, FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera)등 또한 사용될 수 있다. 전술한 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 투메파시앙스와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 유전자(OsPAP2) 또는 상기 유전 자(OsPAP2)를 포함하는 재조합 벡터를 애기장대(Arabidopsis thaliana), 벼, 보리, 밀, 콩, 깨, 조, 수수, 메밀, 기장, 율무, 귀리, 고구마 및 감자로 구성된 군에서 선택되는 식물체에 도입하여 수득되는 형질전환 식물체에 관한 것이다.

식물체의 형질전환은 아그로박테리움이나 바이러스 벡터 등을 이용한 통상의 방법에 의해 달성할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 유전자(OsPAP2)를 함유하는 재조합 벡터로 아그로박테리움 속 미생물을 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 대상 식물의 조직 등에 감염시켜 형질전환된 식물을 수득할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 미생물을 배양하여 탈인산화효소 OsPAP2를 발현시키는 단계; 및 상기 발현된 탈인산화효소 OsPAP2를 회수하는 단계를 포함하는 탈인산화효소 OsPAP2의 제조방법에 관한 것이다.

상기 형질전환된 미생물은 앞서 설명한 바와 같이, 특별히 제한되지 않고, 형질전환에 통상적으로 사용되는 미생물을 이용할 수 있으며, 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp .)을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 탈인산화효소를 코딩하는 유전자(OsPAP2)를 함유하는 재조합 벡터를 숙주세포와 공배양시켜 형질전환시키는 단계; 및 상기 형질전환된 숙주세포에서 발현된 OsPAP2 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 OsPAP2 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 이때, 상기 숙주세포는 곤충세 포, 바람직하게는 sf9(Gibco)인 것을 특징으로 한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에 본 발명에 따른 OsPAP2 유전자로 형질전환된 식물체로 애기장대만을 예시하였으나, 동일한 방법을 벼, 보리, 밀, 콩, 깨, 조, 수수, 메밀, 기장, 율무, 귀리, 고구마 및 감자 등에 적용하여 인산 결핍에 의한 스트레스에 내성을 가지는 형질전환체를 제조하는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

실시예 1. 벼 유래의 탈인산화효소 유전자( OsPAP2 )의 클로닝

동진벼(Oryza sativa cv. Dongjin)에서 게놈 DNA를 분리하여 전체 염기서열을 토대로 벼 유래의 탈인산화효소 유전자 OsPAP2에 특이적인 서열번호 2 및 3의 프라이머를 제작한 후, PCR 법에 의해 OsPAP2 유전자를 증폭하였다.

서열번호 2: 5'-CCCGGGATGAGATGACTGT

서열번호 3: 5'-CCCGGGTGACGTCGCCGGC

상기 증폭된 PCR 산물을 pBluescript(Stratagene, USA) 벡터에 클로닝한 후, sequencing을 통해 유전자의 염기서열을 확인하였다(서열번호 5). 또한, 상기에서 분리된 OsPAP2과 다른 식물체의 탈인산화효소 유전자와의 상동성을 CLUSTAL X 프로그램을 이용하여 비교한 결과, 이들 유전자들 간에는 60% 정도의 아미노산 염기서열이 상동성을 나타내었다.

실시예 2. 인산 결핍 조건에서의 OsPAP2 유전자 발현 양상

유사 기능을 하는 유전자의 발현은 조직 특이적 또는 유도 인자 특이적으로 조절되므로, 상기에서 분리된 OsPAP2 유전자의 발현 양상을 RNA blot 방법으로 측정하였다.

동진벼 종자에서 유도된 캘러스(callus) 세포를 인산이 충분한 배지(1mM) 및 인산이 결핍된 배지(10μM)에서 각각 2일간 배양한 후, Trizol reagent(Invitrogen,USA)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 상기에서 분리된 RNA 10㎍를 1.2%(W/V) 변성 포름알데히드 아가로오스 겔(denaturing formaldehyde agarose gel)에서 전기영동하여 나일론 막(nylon membrane, Amersham)에 부착시켰다. 상기 RNA가 부착된 막은 [³²P] dATP로 표지된 3' DNA 단편(서열번호 4)을 프로브로 하고, 20%(W/V) SDS, 20X SSPE, 100g/L PEG(polyethyleneglycol, 8,000 mwt), 250 ㎎/L 헤파린 및 10㎖/L Hearing sperm DNA(10㎎/㎖, Sigma)가 포함된 용액에서 65℃, 하룻밤 동안 반응시켰다. 상기 OsPAP2 유전자의 cDNA 클론은 전체 1893bp의 염기서열(서열번호 5)을 가지고 있으며, 630개의 아미노산 서열(서열번호 1)을 암호화하 고 있다.

그 결과, 벼 캘러스 세포에서의 OsPAP2 유전자의 발현은 인산의 농도와 인산 결핍 시간에 따라 발현량에 차이가 있음을 확인하였다(도 1A, 1B). 즉, 저농도의 인산에서 발현량이 증가되었으며, 실험 3일째부터 발현량이 급격히 증가되었다. 또한, 벼 탈인산화효소 유전자인 OsPAP2는 인산 결핍 조건에서 발현양이 증가하는 양상을 보였다(도 1C).

또한, 벼 유식물체에 각각 인산결핍과 충분조건을 주어 지상부와 지하부로 나누어 OsPAP2 유전자의 조직 특이적인 발현 여부를 조사한 결과, 인산이 결핍된 뿌리에서 OsPAP2 유전자가 가장 많이 발현되었다 (도 1D). 이는 인산이 결핍된 환경에서 식물체의 뿌리는 수많은 뿌리털을 만들어 표면적을 넓혀주고, 뿌리로부터 탈인산화효소를 분비하여 토양에 고정된 인산을 유효화시켜 인산의 흡수를 돕는다는 기존의 연구결과로 미루어 볼 때, OsPAP2 유전자가 토양 내 인산의 유효화에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.

실시예 3. OsPAP2 재조합 단백질 및 OsPAP2 의 항체 제조

OsPAP2 재조합 단백질을 제조하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작된 OsPAP2 유전자가 클로닝된 pBluescript 벡터를 제한효소 BamHⅠ 및 BglⅡ로 처리하여 OsPAP2 유전자를 분리한 후, 동일 제한효소로 처리한 pBacPAK9(Clontech) 벡터의 AcNPV 폴리헤드린 프로모터(AcNPV polyhedrin promoter)의 하위 부분에 OsPAP2 유전자를 결합시켜 pBacPak9-OsPAP2를 제작하였다. AcNPV(서울대학교, 응용생물화학 부) DNA 100ng과 상기 pBacPak9-OsPAP2 500ng을 sf9(Gibco) 세포와 5시간 동안 공배양시켜 형질전환한 후, 상기 형질전환된 세포를 TC 100(Gibco) 배지에서 5일 동안 배양하여 OsPAP2 재조합 단백질을 수득하였다.

또한, OsPAP2의 항체를 제조하기 위하여, 상기에서 제조된 OsPAP2 재조합 단백질을 SDS-PAGE 겔에서 전기영동하여 분리하고(도 2A), Freund's complete adjuvant(Sigma)와 같은 양으로 섞어 Balb/c 마우스에 접종한 후, 상기 접종된 마우스로부터 피를 뽑아낸 다음, 원심분리하여 OsPAP2의 항체를 수득하였다.

상기에서 제조된 OsPAP2의 항체를 이용하여 상기에서 제조된 OsPAP2 재조합 단백질에 대해 웨스턴 블럿을 수행한 결과, 도 2B에 나타난 바와 같이, 야생형에서는 OsPAP2의 발현이 나타나지 않았지만, OsPAP2가 재조합된 조건에서는 강하게 발현되므로, 목적 단백질인 OsPAP2가 정상적으로 만들어진 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. OsPAP2 유전자가 도입된 형질전환체의 제작

벼는 대부분 물속에서 생활하기 때문에 밭작물에 비해 상대적으로 약한 인산 결핍 스트레스를 받으므로, 벼에서 분리한 탈인산화효소 유전자를 밭작물에 응용할 수 있는지 확인하고, 식물체 내에서 그 기능을 조사하기 위하여 쌍떡잎식물의 대표적인 모델 식물체인 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 이용하여 OsPAP2 유전자를 대량 발현하는 형질전환체를 제작하였다.

즉, 상기 OsPAP2 유전자의 코딩 영역을 pCAMBIA1300-35S(CAMBIA, Australia) 벡터의 SmaI 사이트에 클로닝하여, OsPAP2 유전자가 항상 강하게 발현하는 CaMV 35S 프로모터에 의해서 조절되는 재조합 벡터를 제작한 후, triparental mating 방법으로 아그로박테리움 투메파시앙스 EHA105(Agrobacterium tumefaciens EHA105)로 옮긴 다음, in planta 형질전환 방법(Clough and Bent, Plant J., 16:735, 1998)으로 애기장대에 도입하였다.

상기 형질전환된 애기장대 T1 식물체에서 수확한 종자를 무균 살균처리하여 카베니실린(carbenicillin, 100㎎/L)과 하이그로마이신(hygromycin, 20㎎/L)이 첨가된 B5 배지(Duchefa)에서 발아시켜서 형질전환된 식물체를 선택하고, OsPAP2 유전자의 발현량을 RNA BLOT 방법으로 확인한 후, 다음 세대에서 순종 식물체(T2)를 얻었다. 상기 T1 및 T2 식물체의 OsPAP2 유전자의 발현량을 PCR(도 3A), 노던 블럿(도 3B) 및 웨스턴 블럿(도 3C)으로 확인한 결과, 야생형(wild-type)에 비하여 형질전환된 애기장대 식물체에서 OsPAP2 유전자의 발현량이 증가한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 탈인산화효소 활성을 측정하기 위하여, 애기장대의 야생형 및 상기 형질전환된 애기장대로부터 단백질을 분리하여 100mM 아세트산 나트륨(sodium acetate, pH 5.6)을 처리하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 2N NaOH를 가하여 반응을 멈춘 다음, 7.5mM p-니트로페닐포스페이트(p-nitrophenylphosphate)로부터 니트로페놀(nitrophenol)이 방출되는 정도를 410㎚에서 흡광도를 측정하여 효소 활성을 정량하였다. 그 결과, 야생형에 비해 형질전환된 애기장대에서 탈인산화효소의 활성도가 높게 나타났다 (도 3D).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 벼의 캘러스 배양세포를 이용하여 인산 결핍 조건에서 OsPAP2 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이다 [A: 인산 농도의 변화에 따른 OsPAP2 유전자의 발현량 측정; B: 시간별 인산 결핍 조건에서의 OsPAP2 유전자의 발현 여부; C: 영양결핍 조건에서의 OsPAP2 유전자의 발현 여부 측정; D: 인산 결핍 조건에서 벼 유식물체의 줄기(S)와 뿌리(R)의 OsPAP2 유전자의 발현 여부 측정].

도 2는 OsPAP2 유전자의 발현 여부를 베큘로바이러스 시스템(Baculovirus system)을 이용하여 웨스턴 블럿한 결과를 나타낸 것이다 [A: 곤충 세포에서 OsPAP2 단백질의 발현량을 측정한 것; B: 항체를 이용한 웨스턴 블럿으로 발현 단백질을 확인한 것].

도 3은 형질전환체의 OsPAP2 유전자의 발현 여부 및 탈인산화효소의 활성을 나타낸 것이다 [A: 형질전환된 애기장대 식물체의 PCR 결과; B: 형질전환된 애기장대 식물체의 노던 블럿 결과; C: 형질전환된 애기장대 식물체의 웨스턴 블럿 결과; D: 형질전환된 애기장대 식물체의 탈인산화효소의 활성도].

<110> Technology Licencing Center Dong-A University <120> Phosphatase Gene(OsPAP2) Expressing Under Phosphate Starvation Condition and Plants Tranformed by the Gene <130> P07-B249 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 630 <212> PRT <213> Oryza sp. <400> 1 Met Ala Met Pro Leu Gly Gly Ile Leu Leu Leu Phe Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Val Trp Ala Phe Ser Ser 20 25 30 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ser Arg Ile Gly Glu Gln Pro Leu Ser 35 40 45 Leu Ile Gly Ile His Arg Ala Thr Val Gly Ile Asp Ala Ala Ala Ser 50 55 60 Val Gln Ala Ser Pro Arg Leu Leu Gly Val Lys Gly Glu Asp Thr Ala 65 70 75 80 Trp Val Thr Val Asp Phe Ala Ala Pro His Ala Ser Asp Gly Asp Trp 85 90 95 Ile Gly Val Phe Ser Pro Ser Asn Phe Asn Ala Ser Thr Cys Pro Gly 100 105 110 Pro Ser Gly Ser Asp Ser Gly Pro Val Ile Cys Ser Ala Pro Ile Lys 115 120 125 Tyr Gln Leu Ala Asn Tyr Ser Ser Asp Tyr Gly Lys Thr Gly Lys Gly 130 135 140 Thr Leu Lys Phe Gln Leu Ile Asn Gln Arg Gln Asp Phe Ser Phe Ala 145 150 155 160 Leu Phe Thr Gly Gly Leu Ser Asn Pro Lys Leu Ile Ala Val Ser Asn 165 170 175 Lys Ile Ala Phe Ala Asn Pro Lys Ala Pro Val Tyr Pro Arg Leu Ala 180 185 190 Gln Gly Lys Ser Trp Asn Glu Met Thr Val Thr Trp Thr Ser Gly Tyr 195 200 205 Asp Ile Lys Glu Ala Tyr Pro Phe Val Glu Trp Gly Met Lys Trp Ser 210 215 220 Pro Pro Thr Arg Thr Ala Ala Gly Thr Val Thr Phe Asp Arg Glu Ser 225 230 235 240 Leu Cys Gly Glu Pro Ala Arg Thr Val Gly Trp Arg Asp Pro Gly Phe 245 250 255 Ile His Thr Ala Phe Leu Thr Asp Leu Trp Pro Asn Lys Glu Tyr Tyr 260 265 270 Tyr Lys Ile Gly His Met Leu Pro Asp Gly Lys Ile Val Trp Gly Lys 275 280 285 Phe Tyr Ser Phe Lys Ala Pro Pro Phe Pro Gly Gln Lys Ser Leu Gln 290 295 300 Arg Val Val Ile Phe Gly Asp Met Gly Lys Ala Glu Arg Asp Gly Ser 305 310 315 320 Asn Glu Tyr Ser Asn Tyr Gln Pro Gly Ser Leu Asn Thr Thr Asp Thr 325 330 335 Leu Ile Lys Asp Leu Asp Asn Ile Asp Ile Val Phe His Ile Gly Asp 340 345 350 Ile Thr Tyr Ala Asn Gly Tyr Ile Ser Gln Trp Asp Gln Phe Thr Gln 355 360 365 Gln Val Glu Pro Ile Thr Ala Arg Val Pro Tyr Met Ile Ala Ser Gly 370 375 380 Asn His Glu Arg Asp Trp Pro Asn Ser Gly Ser Phe Phe Asn Gly Thr 385 390 395 400 Asp Ser Gly Gly Glu Cys Gly Val Leu Ala Glu Thr Met Tyr Tyr Thr 405 410 415 Pro Thr Glu Asn Arg Ala Asn Tyr Trp Tyr Lys Thr Asp Tyr Gly Met 420 425 430 Phe Arg Phe Cys Val Ala Asp Ser Glu His Asp Trp Arg Glu Gly Thr 435 440 445 Glu Gln Tyr Ala Phe Ile Glu Ser Cys Leu Ala Thr Val Asp Arg Lys 450 455 460 Lys Gln Pro Trp Leu Val Phe Ile Ala His Arg Val Leu Gly Tyr Ser 465 470 475 480 Ser Gly Phe Phe Tyr Gly Ala Gly Gly Ala Phe Ala Glu Pro Thr Ala 485 490 495 Arg Gln Ser Leu Gln Arg Leu Trp Gln Arg His Arg Val Asp Leu Ala 500 505 510 Phe Tyr Gly His Val His Asn Tyr Glu Arg Thr Cys Pro Val Tyr Asp 515 520 525 Gly Arg Cys Ala Ser Pro Glu Arg Ser Arg Tyr Ser Gly Ala Val Gly 530 535 540 Gly Thr Ile His Ala Val Val Gly Gly Gly Gly Ser His Leu Ser Asn 545 550 555 560 Phe Thr Ala Glu Ala Pro Pro Trp Ser Val Tyr Arg Glu Met Asp Tyr 565 570 575 Gly Phe Val Lys Leu Thr Ala Phe Asn Tyr Thr Ser Leu Leu Tyr Glu 580 585 590 Tyr Arg Arg Ser Ser Asp Gly Glu Val His Asp Ser Phe Thr Val His 595 600 605 Arg Glu Tyr Arg Asp Val Leu Ala Cys Val Ala Asp Ser Cys Pro Pro 610 615 620 Thr Ile Pro Pro Ala Thr 625 630 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cccgggatga gatgactgt 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cccgggtgac gtcgccggc 19 <210> 4 <211> 295 <212> DNA <213> 3' DNA <400> 4 gccggagagg tcgcgctact ccggcgcggt gggcggcacc atccacgcgg tggtcggcgg 60 cggcggcagc cacctgagca acttcaccgc cgaggcgccg ccgtggagcg tgtacaggga 120 gatggactac ggcttcgtca agctcacggc gttcaactac acgtcgctgc tctacgagta 180 caggcggtcc agcgacggcg aggtgcacga cagcttcacc gtccaccggg agtaccgcga 240 cgtgctcgcc tgcgtcgccg acagctgccc gccgaccatc ccgccggcga cgtga 295 <210> 5 <211> 1893 <212> DNA <213> Oryzias sp. <400> 5 atggcgatgc cgctgggtgg gattctcctc ctcttcctcg tgctcctcgc cgccgccgcg 60 gcgggcggcg gcggcggcgt gtgggcgttc tcctcgtcgt cgtcgtcgtc gtcgtattcc 120 aggatcggcg agcagccgct gtcgctgatc ggcatccacc gcgcgacggt cggcatcgac 180 gccgcggctt ccgtgcaagc gtcgcctcgg cttctcggtg tcaaggggga agatactgcc 240 tgggtaactg ttgatttcgc agctccgcat gcgagtgacg gcgattggat cggagtattc 300 tctccttcaa atttcaacgc gtccacatgc cccggtcctt ctggatcaga ctcaggacct 360 gttatatgct ctgcaccaat aaagtatcag cttgcaaatt attcttcaga ttatggcaag 420 acaggaaaag gcactctcaa gtttcagttg atcaatcaga ggcaggactt ctcctttgca 480 ctgttcactg gtggtctctc aaatccaaag cttatcgcag tatcaaataa gatcgccttc 540 gcaaacccga aagctccggt ttaccctcgt ctagctcaag gcaaatcctg gaatgagatg 600 actgtcacat ggactagtgg ttatgacatc aaagaggcat atccctttgt tgaatggggc 660 atgaaatgga gccctcctac gcgcacagca gctggcaccg tcacttttga tcgcgaaagc 720 ttatgcggag aacctgcccg tactgttggt tggagagatc caggtttcat acacacagca 780 ttcctgactg atttatggcc aaataaagaa tactattaca agattggaca tatgctacct 840 gatggaaaaa ttgtatgggg caaattttac tccttcaaag cacctccttt tcctgggcaa 900 aagtcactgc agagggttgt catttttggt gatatgggaa aggccgagag ggatggaagc 960 aacgagtaca gcaactacca gcctggatca ctgaacacaa ctgacacact gatcaaggac 1020 cttgacaaca tcgacattgt atttcacatc ggtgacatta cctatgccaa cgggtacatt 1080 tcccagtggg atcagttcac tcagcaagtc gagccgatca ctgctcgagt cccctacatg 1140 attgcaagtg gaaaccatga acgggattgg ccaaacagtg gatctttctt caatgggaca 1200 gattctggag gggagtgtgg ggtgcttgct gagaccatgt actacacacc cacagagaac 1260 agggcaaact actggtacaa gacggactac gggatgttca gattctgcgt ggcggacagc 1320 gagcacgact ggcgggaagg cacggagcag tacgcgttca tcgagagctg cctcgccacg 1380 gtggaccgga agaagcagcc atggctggtg ttcatcgcgc accgcgtcct cggctactcc 1440 tcgggcttct tctacggcgc cggcggcgcc ttcgcggagc cgacggcaag gcagagcctc 1500 cagaggctat ggcagcggca ccgcgtcgac ctcgccttct acggccacgt ccacaactac 1560 gagcggacgt gcccggtcta cgacgggcgg tgcgcgtcgc cggagaggtc gcgctactcc 1620 ggcgcggtgg gcggcaccat ccacgcggtg gtcggcggcg gcggcagcca cctgagcaac 1680 ttcaccgccg aggcgccgcc gtggagcgtg tacagggaga tggactacgg cttcgtcaag 1740 ctcacggcgt tcaactacac gtcgctgctc tacgagtaca ggcggtccag cgacggcgag 1800 gtgcacgaca gcttcaccgt ccaccgggag taccgcgacg tgctcgcctg cgtcgccgac 1860 agctgcccgc cgaccatccc gccggcgacg tga 1893

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 벼(Oryza sp .) 유래 탈인산화효소를 코딩하는 유전자(OsPAP2).
제1항에 있어서, 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자(OsPAP2).
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 탈인산화효소 OsPAP2.
제1항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
제1항의 유전자 또는 제4항의 재조합 벡터를 애기장대(Arabidopsis thaliana), 벼, 보리, 밀, 콩, 깨, 조, 수수, 메밀, 기장, 율무, 귀리, 고구마 및 감자로 구성된 군에서 선택되는 식물체에 도입하여 수득되는 형질전환 식물체.
제5항의 재조합 미생물을 배양하여 탈인산화효소 OsPAP2를 발현시키는 단계; 및 상기 발현된 탈인산화효소 OsPAP2를 회수하는 단계를 포함하는 탈인산화효소 OsPAP2의 제조방법.
제4항의 재조합 벡터를 숙주세포와 공배양시켜 형질전환시키는 단계; 및 상기 형질전환된 숙주세포에서 발현된 OsPAP2 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 OsPAP2 재조합 단백질의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 숙주세포는 곤충세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 곤충세포는 sf9(Gibco) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항의 탈인산화효소 OsPAP2에 특이적으로 결합하는 항체.