KR101421308B1

KR101421308B1 - 변형된 디캄바 모노옥시게나제 효소 및 그의 사용 방법

Info

Publication number: KR101421308B1
Application number: KR1020097000113A
Authority: KR
Inventors: 토마스 이. 클레멘테; 라즈반 두미트루; 폴 씨.씨. 펭; 스타니슬로우 플라신스키; 도날드 피. 윅스
Original assignee: 몬산토 테크놀로지 엘엘씨; 보드 오브 리젠츠 오브 디 유니버시티 오브 네브라스카
Priority date: 2006-06-06
Filing date: 2007-06-06
Publication date: 2014-07-18
Also published as: WO2007146706A8; US7884262B2; KR20090059103A; BRPI0712249A2; DK2032702T3; EA017638B1; ATE502109T1; GEP20125504B; EA200870619A1; AP2008004715A0; AP2812A; EP2032702B1; GT200800274A; CO6140070A2; MX2008015741A; ZA200810237B; CA2653987C; IL195694A0; WO2007146706A3; EP2032702A2

Abstract

본 발명은 디캄바 모노옥시게나제 (DMO)의 변형된 변이체를 제공한다. 본 발명은 이러한 DMO를 발현하는 세포가 제초제 디캄바에 대하여 높은 수준의 내성을 나타낸다는 예측밖의 발견에 관한 것이다. DMO-코딩 핵산을 포함하는 조성물 및 사용 방법을 제공한다.

변형된 디캄바 모노옥시게나제 효소, 디캄바, 내성

Description

변형된 디캄바 모노옥시게나제 효소 및 그의 사용 방법{MODIFIED DICAMBA MONOOXYGENASE ENZYME AND METHODS OF ITS USE}

본 출원은 2006년 6월 6일 출원된 미국 가특허 출원 시리얼 번호 제60/811,152호, 및 2007년 6월 5일 출원된 미국 특허 출원 시리얼 번호 제11/758,657호 (그의 개시 내용 전문이 본원에서 참고로 인용된다)의 우선권을 주장한다.

1. 본 발명의 분야

본 발명은 일반적으로 생물공학 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 트랜스제닉 유기체에서 제초제 디캄바에 대한 내성을 부여할 수 있는 변형된 디캄바 모노옥시게나제 효소에 관한 것이다.

2. 관련 분야의 설명

예로서, 옥수수, 대두 및 목화와 같은 목초지 작물을 생산하는 방법은 예를 들면, 식물 유전공학 기법의 사용을 통한 곤충-내성 및 제초제 내성과 같은 특징의 도입으로 인하여 지난 십여년 동안 극적으로 변하여 왔다. 이러한 변화를 통해 1헥타르당 생산성은 더 증가하였고, 생산 비용은 절감되었으며; 생산 방식에 있어서 유연성 및 효율은 증가하였고, 살충제의 사용은 감소하였으며, 곤충-내성 목화의 경우, 농부의 건강은 개선되었다. 따라서, 트랜스제닉 작물이 광범위하게 채용되었고, 현재는 전세계 수백만의 토지에서 재배되고 있다. 그러나, 시장에서 계속적으로 경쟁 대상이 되는 트랜스제닉 작물의 경우에는 새로운 부가가치를 붙인 특징이 요구될 것이다.

농작물 및 원예 작물의 양과 질을 개선시킬 수 있는 새로운 특징이 출현하였고, 장래에도 증가하는 비율로 계속적으로 출현하게 되겠지만, 식품, 사료 및 기타 제품의 생산 방법을 개선시킬 수 있는 특징에 대해서도 요구된다. 예를 들면, 제초제인 글리포세이트, 브롬옥시닐, 설포닐우레아제 및 기타 제초제를 사용한 처리에 대하여 내성을 띤 트랜스제닉 식물이 현재 이용가능하지만, 방제되는 잡초의 범위와, 추가의 제초제-내성 작물의 개발을 통해서 해결될 수 있는 처리 옵션 사이에는 큰 차이가 있다. 더욱이, 일반적으로는 국소적이면서 가변적으로 함유되어 있지만, 상기 언급한 제초제에 대하여 내성을 띤 잡초가 출현한다는 것은 보충적이거나 대체적인 잡초 방제책에 대한 필요성을 부과한다.

그러므로, 상업적으로는 트랜스제닉 제초제 내성이 가치가 있는 것으로 입증되었다 할지라도, 임의의 단일 제초제에 의존하는 것을 피할 수 있으며, 잡초 종을 방제하는 것이 어려운 관리 옵션을 증가시킬 수 있는 기타 제초제에 대하여 내성을 띤 식물이 필요시 된다. 친환경적이면서 잡초를 방제하는데 고도로 효과적이기까지 한 제초제에 대한 제초제 내성을 개발하는 것이 특히 필요시 된다. 디캄바는 40년을 초과하는 기간 동안 농부가 사용해 온, 효과적이면서 친환경적인 제초제 중의 한 일례이다. 디캄바는 특히 일년생 및 다년생 광엽 잡초 및 옥수수, 사탕수 수, 작은 곡물들, 목초, 건초, 방목지, 사탕수수, 아스파라거스, 잔디 및 풀 종자 작물들에서의 여러 초원 잡초를 방제하는데 유용하다 [Crop Protection Reference, 1995]. 불행하게도, 디캄바는 특히 심지어 낮은 수준의 제초제에 대해서도 감수성인 수많은 상업적 농작물들과 쌍떡잎 식물들, 예로서, 대두, 목화, 완두콩, 감자, 해바라기, 및 캐놀라를 손상시킬 수 있다. 이럼에도 불구하고, 디캄바는 잡초 성장을 제어하는데 고도로 효과적이며, 따라서, 농업에 있어서 중요한 도구가 된다.

최근, 디캄바에 대한 내성을 부여하는 디캄바 모노옥시게나제 (DMO) 코딩 유전자가 슈도모나스 말토필리아(Pseudomonas maltophilia)로부터 단리되었다 (미국 특허 번호 제7,022,896호). DMO는 제초제 디캄바 (3,6-디클로로-o-아니스산)의 비독성 3,6-디클로로살리실산으로의 전환에 관여한다. 이러한 유전자는 DMO 유전자를 발현하는 식물에서 디캄바에 대한 내성을 제공하는 것으로서 미국 특허 번호 제7,022,896호에 개시되어 있다. 그러나, 이러한 유전자의 변이체의 발생은 매우 유익할 것이다. 그러한 변이체는 잠재적으로 특정 환경 조건하에서 발현율을 변경시킬 수 있다. 이러한 방식으로 사용하고자 하는 특정 환경에 대하여 최적화된 변이체가 선택될 수 있고, 변이체는 특히 유익한 동역학적 특징을 나타낼 수 있다. 변이체는 특히 상이한 온도 또는 pH 조건하에서 최대의 효율을 나타낼 수 있으며, 이로써 세포내 조건 및/또는 예기되는 작물 재배 조건에 따라 특정 작물 종에 대하여 선택될 수 있다.

본 발명의 요약

하나의 측면에서, 본 발명은 a) 서열 번호: 1의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열; b) 서열 번호: 2의 서열을 포함하는 핵산 서열; 및 c) 서열 번호: 1의 폴리펩티드와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서, 여기서, 상기 폴리펩티드는 디캄바 모노옥시게나제 활성을 갖고, 서열 번호: 1의 아미노산 112에 상응하는 위치에 시스테인을 포함하는 것인 핵산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 단리된 핵산 서열을 제공한다. 다른 실시태양에서, 프로모터에 작동가능하게 연결된 본원에 기술된 DMO 코딩 핵산을 DNA 벡터를 제공한다. 프로모터는 식물 세포에서 기능성일 수 있다. 특정 실시태양에서, 디캄바 모노옥시게나제를 코딩하는 핵산 서열은 엽록체 전이 펩티드에 작동가능하게 연결될 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호: 1과 90% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열로서, 여기서, 상기 폴리펩티드는 디캄바 모노옥시게나제 활성을 갖고, 서열 번호: 1의 아미노산 112에 상응하는 위치에 시스테인을 포함하는 것인 폴리펩티드 서열을 제공한다.

추가의 또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 디캄바 모노옥시게나제 코딩 핵산으로 형질전환된 숙주 세포 또는 조직을 제공한다. 특정 실시태양에서, 숙주 세포는 식물 세포일 수 있다. 추가의 실시태양에서, 식물 세포는 쌍자엽 식물 세포 또는 단자엽 식물 세포로서 정의될 수 있다. 특정 실시태양에서, 숙주 세포는 대두, 목화, 옥수수 또는 평지씨 식물 세포일 수 있다. 추가의 실시태양에서, 본원에 기술된 트랜스제닉 세포를 포함하는 조직 배양물을 제공한다.

추가의 또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 디캄바 모노옥시게나제 코딩 핵산으로 형질전환된 트랜스제닉 식물, 및 그의 자손을 제공한다. 특정 실시 태양에서, 식물은 쌍자엽 또는 단자엽 식물로서 정의될 수 있다. 특정 실시태양에서, 식물은 대두, 목화, 옥수수 또는 평지씨 식물이다.

추가의 또다른 측면에서, 본 발명은 식물내로 본원에서 제공하는 형질전환 작제물을 도입시키는 것을 포함하는, 디캄바 내성 식물을 생산하는 방법을 제공한다. 본 방법의 하나의 실시태양에서, 형질전환 작제물을 도입시키는 것은 하나 이상의 식물 세포를 안정적으로 형질전환시키고, 하나 이상의 세포를 디캄바 내성 식물로 재생시킴으로써 수행될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 디캄바 내성 식물은 모체 식물을 그 자체 또는 제2 식물과 교배시킴으로써 생산될 수 있는데, 여기서, 모체 식물 및/또는 제2 식물은 형질전환 작제물을 포함하고, 디캄바 내성 식물은 모체 식물 및/또는 제2 식물로부터 형질전환 작제물을 유전받는다.

추가의 또다른 측면에서, 본 발명은 a) 본원에서 제공되는 바와 같은 본 발명의 식물 또는 그의 일부분을 수득하고; b) 식물 또는 그의 일부분으로부터 식품 또는 사료를 제조하는 것을 포함하는, 식품 또는 사료를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 식물의 일부분은 종자이다. 특정의 추가적인 실시태양에서, 식품 또는 사료는 오일, 굵은 가루(meal), 단백질, 곡물, 전분 또는 단백질이다. 다른 실시태양에서, 사료는 마초 또는 목초 식물, 예로서, 건초를 포함한다. 본 발명은 또한 섬유, 약제, 건강 보조 식품, 및 생물 연료를 비롯한 산업용 화학약품 뿐만 아니라, 본원에서 제공하는 식물로부터 유래된 임의의 기타 생성물을 생산하는 방법을 제공한다.

추가의 또다른 측면에서, 본 발명은 잡초 성장을 제어하는데 유효한 양의 디 캄바 제초제를 작물 성장 환경에 적용시키는 것을 포함하는, 본원에서 제공하는 본 발명의 식물 또는 그의 종자를 포함하는 작물 성장 환경에서 잡초 성장을 제어하는 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 디캄바 제초제는 상부에서 작물 성장 환경에 적용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 디캄바 제초제의 양은 본 발명의 식물 또는 그의 종자는 손상시키지 않고, 본 발명에 의해 제공되는 DMO-코딩 핵산이 존재하지 않되 유전자형은 동일한 식물은 손상시킨다.

본 발명의 추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명에 의해 제공되는 DMO-코딩 핵산, 및 예를 들면, 적어도 2, 3, 4, 5개 이상의 코딩 서열을 비롯한, 적어도 1개의 기타 트랜스제닉 코딩 서열을 포함하는 식물을 제공한다. 특정 실시태양에서, 식물은 하나 이상의 추가의 유익한 특징, 예로서, 제초제 또는 해충/곤충 내성을 부여하는 트랜스진을 포함한다. 예를 들면, 본원 하기에 기술되는 바와 같이, 기타 유익한 특징 뿐만 아니라, 디캄바 이외의 하나 이상의 제초제에 대한 내성 또한 제공될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 특히 추가의 트랜스제닉 특징을 갖는 임의의 바람직한 조합물로 "적층된," 본 발명의 DMO-코딩 핵산을 포함하는 식물을 제공한다.

하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며, 본 발명의 특정 측면을 추가적으로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에서 제시한 특정 실시태양에 관한 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이들 도면을 참고로 하여 더욱 잘 이해될 수 있다.

도 1. 땅콩 백화 줄무늬 바이러스로부터의 FLt36 프로모터, 담배 식각 바이 러스 (TEV 리더) 번역 인핸서 서열, 및 완두콩 루비스코의 작은 하위유니트 유전자로부터의 종결 인자 영역을 사용하여 고등 식물에서의 발현을 위한 디캄바 모노옥시게나제 유전자 (DMOc)의 유전공학 처리에 사용되는 카세트에 관한 개략도. TEV 번역 인핸서 영역과 DMOc에 대한 코딩 영역 사이의 DMO 엽록체 위치 확인을 위한, 완두콩 루비스코의 작은 하위유니트 유전자로부터의 전이 펩티드 코딩 영역을 함유하도록 제조된 DMOc 유전자의 또다른 유전공학 처리 버전.

도 2. T₁ 세대 트랜스제닉 담배 식물에서의 유전공학 처리된 DMO 유전자의 존재 및 발현을 입증하는 DNA, RNA 및 단백질 블롯 패널. 래인 Q부터 V까지는 다양한 T₁ 세대 트랜스제닉 담배 식물로부터 추출된 DNA, mRNA 및 DMO 종을 도시한다. 비트랜스제닉 담배 식물로부터 추출된 추출물은 래인 WT에 도시한 반면, 래인 Ox는 클로닝된 DMO 유전자 작제물의 제한 분해된 생성물 (상단 패널)과 E. 콜라이(E. coli)에서 과생산된 ~37 kDa DMO 효소 (하단 패널)를 나타낸다. 루비스코의 ~55 kDa의 큰 하위유니트는 루비스코 항체를 DMO 항혈청에 가하고, 각 래인에서 전체 단백질 적재량 비교를 위해 내부 표준으로서 작용하는 루비스코를 검출함으로써 단백질 블롯에서 검출되었다. 상기와 똑같은 겔 사본의 에티디움 브로마이드 염색으로 판단해본 바, 동량의 RNA가 각 래인에 적재되었다. 화살표 표시는 DMO DNA, mRNA, 또는 단백질 밴드의 위치를 나타낸다.

도 3. 엽록체 전이 펩티드 코딩 서열이 존재하지 않는 유전공학 처리된 DMOc 유전자를 함유하는 식물 하나 (우측)와 DMOc 유전자가 존재하지 않는 식물 하나 (우측에서 두번째 것)인 2개의 T₁ 담배 식물에 2.2 kg/ha의 디캄바로 처리하였을 때의 효과. 우측에 있는 트랜스제닉 식물에서의 디캄바 처리로부터의 손상은 있다해도 거의 없는 것으로 나타났다. 좌측의 식물 2개는 디캄바로 처리하지 않았으며, 이는 비트랜스제닉 식물 (좌측)과 DMOc 유전자를 함유하는 트랜스제닉 식물 (좌측에서 두번째 것)을 나타낸다.

도 4. DMOw에 의한 DCSA 형성 대 시간.

도 5. DMOw에 대한 최적의 분석 pH 측정.

도 6. DMOw에 대한 최적의 분석 온도 측정.

도 7. DMOc에 대한 최적의 pH 측정.

도 8. DMOc에 대한 최적의 온도 측정.

도 9. DMOc 및 DMOw에 대한 최적의 온도 및 pH 조건 요약.

도 10. DMOw에 대한 항정 상태의 동역학.

도 11. DMOc에 대한 항정 상태의 동역학.

도 12. 50 mM TRIS pH7.5 및 100 mM KPi pH 7.0 중 30℃에서 45분 동안 DMOc를 예비인큐베이션시켰을 때의 효과.

도 13. 1주 동안 방치되고, TRIS 완충액 중 (좌측 2개의 분석: 각각 저장 전후의 분석) 및 KPi 완충액 중 (우측 2개의 분석: 각각 저장 전후의 분석) 4℃에서 저장된 효소를 사용한 DMOc 분석.

도 14. 담배 엽록체에서 상동성 재조합 및 발현을 위해 유전적으로 공학 처 리된 디캄바 모노옥시게나제 유전자의 작제물.

도 15. 담배 엽록체에서 상동성 재조합 및 발현을 위해 디자인된 DMO 유전자로 형질전환된 트랜스제닉 담배 세포주의 엽록체 게놈의 동종색소체 지위 입증. 좌측 패널은 상동성 재조합에 의한 DMO의 엽록체 내로의 통합 (도 14에서 나타냄)을 위한 작제물을 나타낸다. 좌측 표적화 서열 위쪽의 막대는 디곡시게닌-표지된 혼성화 프로브의 제조를 위해 증폭된 DNA 단편을 표시한다. 우측 패널은 DNA 블롯을 나타낸다: 래인 1은 크기-마커를 함유한다. 래인 2는 비트랜스제닉 담배 식물로부터의 DNA를 함유한다. 래인 3-11은 1차 선별하고, 스펙티노마이신 존재하에서 재생시킨 후에 바로 (상부 패널), 그리고, 수회에 걸쳐 선별하고, 엽록체 게놈의 외관상 동종색소체를 수득하였을 때 재생시킨 후에 바로 (하부 패널) 트랜스제닉 식물로부터 단리된 DNA를 함유한다. DNA 블롯 분석용 DNA를 트랜스제닉 및 비트랜스제닉 식물로부터 단리시키고, BamH I를 사용하여 제한 효소 분해를 실시한 후, 전기영동으로 분리하고, 엽록체 게놈 형질전환 벡터의 "좌측 표적화 서열"에 상보적인 표지된 DNA 단편 (즉, 디곡시게닌-표시된 혼성화 프로브)으로 블롯팅된 DNA를 블롯팅한다. 5.6 kb DNA 밴드는 DMO 유전자를 함유하는 엽록체 DNA 단편에 상응하고, 3.3 kb 밴드는 삽입된 DMO 유전자 작제물이 존재하지 않는 상동성인 본래의 엽록체 밴드에 상응한다.

도 16. 28 kg/ha 수준의 디캄바로 처리된, 엽록체-코딩 디캄바 모노옥시게나제 유전자를 함유하는 T₁ 세대 동종색소체 트랜스제닉 담배 식물 (식물 1-2 및 식물 3-4는 독립적으로 형질전환된 2개의 R₀ 식물로부터 유래되었다).

도 17. 비트랜스제닉 식물 및 엽록체 게놈 중 DMO 유전자를 함유하는 트랜스제닉 담배 식물에서 DMO의 발현, 및 디캄바 처리에 대한 감수성 및 내성. DMO 항체로 프로빙된 단백질 블롯: 래인 1은 정제된 DMO를 함유한다. 래인 2는 블랭크이고, 래인 3은 비트랜스제닉 담배 식물로부터의 단백질 추출물을 함유한다. 래인 4 및 8은 "위-양성" 담배 식물로부터 단리된 단백질을 함유하는데, 이는 스펙티노마이신상에서의 선별시에는 항생제 내성을 나타내지만, 온전한 DMO 유전자는 존재하지 않는다. 래인 5-7은 엽록체 게놈내로 통합된 DMO 유전자에 의해 코딩된 DMO를 발현하는 트랜스제닉 식물의 추출물을 함유한다. S = 0.56 kg/ha의 디캄바에 대하여 감수성인 식물; R = 5.6 kg/ha의 디캄바에 대하여 내성을 띤 식물. 항-루비스코 항체로 검출된 루비스코의 큰 하위유니트 단백질의 양으로 판단해본 바, 거의 동량의 추출물이 래인 4-8로 적재된 반면, 유의적으로 더 많은 비트랜스제닉 식물로부터의 단백질은 래인 3으로 적재되었다. 화살표는 DMO 단백질의 위치를 나타낸다.

도 18. 야생형 DMO 폴리펩티드 서열의 일부와, 다른 철-황 옥시게나제의 보존 영역 비교, 이는 DMO는 독특하고, 공지 효소에 대하여 낮은 동일성을 가지만, W112 (화살표 표시)는 다른 철-황 옥시게나제에서 보존되고, 2개의 보존 도메인, 도메인, 리스케(Rieske) 및 비-햄 Fe 도메인 (서열 번호: 4-23)과 접해있음을 나타낸다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은 본원에서 DMOc로 지정된 것으로서, 서열 번호: 1에 제시된 DMO의 112번 위치에 상응하는 위치에 시스테인을 포함하는 디캄바 모노옥시게나제 (DMO) 변이체를 제공한다. DMOc는 트랜스제닉 식물에서 발현되었을 때, 제초제 디캄바에 대하여 높은 수준의 내성을 일으키는 것으로 입증되었다. 변경된 아미노산 위치는 다른 철-황 옥시게나제에서 고도로 보존적인 것으로서 그 결과는 놀라웠다. 45개의 종으로부터 분석된 78개의 철-황 옥시게나제 중, 적어도 15%의 동일성을 갖는 52개의 옥시게나제 서열 모두 가장 높은 총 동일성은 단지 38%임에도 불구하고, 서열 번호: 1의 아미노산 112번 위치에 상응하는 W를 가졌다. 상기 위치는 또한 2개의 보존적인 기능성 도메인과 접해있다 (도 18). 따라서, 높은 수준의 제초제 내성 DMOc를 얻을 것으로 기대되지 않았다.

서열이 변경되지 않은 것 (DMOw; 미국 특허 번호 제7,022,896호)과 비교하여 DMOc에 대한 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 파라미터 분석을 통해 효소는 촉매 효율에 있어 상이한 것으로 밝혀졌다: DMOc는 DMOw보다 5배 더 효율적이고, DMOc의 전환수는 더 높고, 기질 결합성은 더욱 강한 것으로 나타났다. 추가로, DMOc는 본래의 효소와 비교하여 더욱 낮은 pH 조건 및 더욱 높은 온도에서 더 잘 작용하였다. 이러한 결과들은 예측되는 사용 조건, 예로서, 작물 재배 조건에 기초한 특정 트랜스제닉 식물에서 사용하기 위한 DMO 변이체를 선별할 수 있는 것에 관한 가능성을 나타내었다. 그러므로, 본 발명의 하나의 측면은 적어도 제1 작물 종에 대한 후보 작물 성장 환경을 확인하고, 예를 들면, DMOc 및 DMOw의 동역학에 기초하여 상기 환경에 가장 적합화된 DMO 효소를 확인하는 것을 포함한다. 예를 들면, 특정 실시태양에서, 당업자는 각각 기타 식물 종 또는 성장 환경과 비교하여 플랜타(planta)내 더 낮은 pH 조건을 나타내는 식물 중 및/또는 온도가 더 높은 성장 환경의 경우에서 사용하기 위한 서열을 코딩하는 DMOc를 선별할 수 있다. 디캄바는 토양내 혼입 (파종전 혼입)에 의해; 토양으로의 분무 (발아전)에 의해; 및 식물 상부 위에서 (발아후 처리) 가해질 수 있는 반면, 디캄바에 대한 내성 수준은 식물 성장시 다양한 시점마다 상이할 수 있다.

상기 제시한 바와 같이, 극도로 높은 수준의 제초제 디캄바에 대한 내성은 DMOc를 발현하는 트랜스제닉 식물에서 수득되었다. 예를 들면, 일반적으로 극도로 매우 낮은 수준의 디캄바에 감수성인 담배에서 5.6 kg/ha 이상, 예를 들어, 광엽 잡초 방제를 위해 일반적으로 권고되는 목초지 적용율보다 10-20배 초과의 디캄바 처리에 대하여 내성을 띤 DMOc를 발현하는 트랜스제닉 식물이 생성되었다. 담배 식물의 엽록체 게놈내로 DMOc 유전자를 삽입하였을 때, 적어도 28 kg/ha에 대한 디캄바 내성을 얻었다. 핵-코딩된 DMOc 유전자를 갖는 트랜스제닉 대두, 토마토 및 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 식물 또한 생성되었고, 이는 높은 수준의 디캄바에 대한 내성을 띠는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 대두 식물의 핵 게놈내로 DMOc를 삽입하였을 때 2.8 kg/ha의 처리에 대하여 내성을 일으켰고, 이로써 DMOc를 발현하는 식물의 목초지에서 잡초를 방제하기 위해 디캄바를 사용할 수 있었다.

따라서, DMOc는 예로서, P. 말토필리아(P. maltophilia), 균주 DI-6, 페레독신 또는 리덕타제와 같은 추가의 코딩 서열을 필요로 하지 않으면서 디캄바 내성을 부여하는데 효과적인 것으로 입증되었다. 변형된 DMO 유전자는 침투도 또는 발현의 뚜렷한 손실없이 멘델 유전자로서 안정적으로 유전되었다. 엽록체 전이 펩티드의 경우 다소 좀 더 강하게 발현될 수 있지만, 전이 펩티드 코딩 서열이 존재하지 않는 DMO 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 식물 또한 높은 수준의 발아후 디캄바 내성을 나타내었다.

A. 핵산 및 재조합 작제물

1. 디캄바 모노옥시게나제 (DMO)

본 발명의 하나의 실시태양에서, 서열 번호: 1의 112번 위치에 상응하는 위치에 시스테인을 포함하는 디캄바 모노옥시게나제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 작제물을 제공한다. 대표적인 DMO 코딩 서열을 본원에서는 서열 번호: 2로서 제공한다. 이러한 서열은 서열 번호: 1의 112번 위치에 시스테인을 포함하는 것 이외에도, 본래의 코딩 서열에 비교하여 Nco I 제한 부위를 추가하고 클로닝을 촉진시키기 위하여 ATG 개시 코돈 다음에 GCC 코돈 (알라닌)을 포함하였다. 그러므로, 서열 번호: 1에서 폴리펩티드는 또한 개시 코돈에 의해 코딩되는 Met 바로 다음에 추가의 Ala 잔기를 포함하였다. Bgl II 및 EcoR I를 사용하여 전이 펩티드 서열을 플라스미드로부터 잘라낸 후, pBluescript II KS+ 벡터의 BamH I 및 EcoR I 부위내로 클로닝하였다. 전이 펩티드 코딩 서열의 어느 쪽 말단에든 Nco I 제한 부위를 부가하는, 프라이머를 사용한 PCR 반응에서 주형으로서 이러한 작제물을 사용하였다. PCR 생성물을 Nco I로 분해함으로써 변형된 DMO 유전자의 ATG 개시 코돈 부위내로 전이 펩티드 코딩 서열을 삽입할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 하나의 실시태양에서, 서열 번호: 2를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 서열 번호 : 1의 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 제공한다. 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, 상동성 서열 및 이들 서열의 유도체는 용이하게 제조될 수 있고, 사용될 수 있다. 예를 들면, 서열 번호: 1의 DMOc 폴리펩티드와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 DMO 폴리펩티드로서, 상기 서열과 적어도 약 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성인 것을 비롯한 것을 갖는 DMO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 사용할 수 있다. 서열 번호: 2로서 제공되는 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 나타내는 것으로서, 상기 서열과 적어도 약 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성인 것을 비롯한 것을 나타내고, 112번 위치에 시스테인을 포함하는 DMO를 코딩하는 핵산 또한 사용될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 서열 동일성은 디폴트 파라미터와 함께 GCG 위스콘신 패키지 (캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 엑설리스(Accelrys)), MEGAlign (위스콘신주 53715 매디슨 S. 파크 스트리즈 1228에 소재하는 DNAStar, 인크.(DNAStar, Inc.)의 서열 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 측정한다. 그러한 소프트웨어는 유사도 또는 동일도를 지정함으로써 유사한 서열을 매치한다.

DMO 폴리펩티드를 발현하는 폴리뉴클레오티드 분자는 현 개시 내용을 고려하여 당업계에 잘 알려져 있는 기법에 의해 수득될 수 있다. 따라서, 디캄바를 분해할 수 있는 능력을 갖는, 본원에서 제공되는 DMO의 변이체는 본원에 개시된 방법론에 따라 제조될 수 있고, 활성에 대하여 분석될 수 있다. 그러한 서열은 또한 예를 들면, 디캄바를 분해하는 세균을 비롯한, 적합한 유기체로부터 동정될 수 있다 (미국 특허 번호 제5,445,962호; [Krueger et al, 1989]; [Cork and Krueger, 1991]; [Cork and Khalil, 1995]). 클로닝된 DMO 서열을 단리시키는 한가지 수단은 예를 들면, 공급원 유기체로부터 작제된 라이브러리에 핵산을 혼성화시키는 것에 의한 것, 또는 개시된 DMO에 기초하여 공급원 유기체로부터의 mRNA와 프라이머를 사용하는 RT-PCR에 의한 것이다. 그러므로, 본 발명은 엄격한 조건하에서 본원에 개시된 서열을 코딩하는 DMO에 혼성화하는 핵산의 용도를 포함한다. 당업자는 염 농도를 증가시키고, 온도를 저하시킴으로써 조건은 덜 엄격해질 수 있다는 것을 이해한다. 따라서, 혼성화 조건을 쉽게 조작할 수 있고, 이로써, 일반적으로는 원하는 결과에 따라 최상의 방법을 달리할 수 있을 것이다. 고도의 엄격한 조건의 일례는 5XSSC, 50% 포름아미드 및 42℃이다. 예를 들면, 10분 동안 상기 조건하에서 세척을 수행하면 이러한 조건하에서 특정 표적 서열에 혼성화하지 못한 서열을 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 실시태양은 10분 동안 5XSSC, 50% 포름아미드 및 42℃의 세척 조건하에서 서열 번호: 2에 따른 핵산에 혼성화하는 것으로서 정의되는 DMO-코딩 핵산의 용도를 포함한다.

변이체는 또한 당업계에 잘 알려져 있는 기법에 따라 본원에 기술된 DMO 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들면, 자동 DNA 합성기에서 포스포아미다이트 화학적 성질에 의해 DNA 서열을 합성할 수 있다. 화학적 합성법은 다수의 잇점을 갖고 있다. 특히, 화학적 합성법은 DNA 서열이 발현되는 숙주가 선호하는 코돈을 사용하여 발현을 최적화시킬 수 있기 때문에 바람직할 수 있다. 아라비도프시스 탈리아나 코돈 선호도를 사용하여 쌍떡잎식물에서 발현에 대하여 최적화된 상기와 같은 서열의 일례는 서열 번호: 3에 제시한 DMO 서열이다. 각각 2번, 3번, 112번 위치에 Ala, Thr, Cys를 가질 것으로 예측되는 폴리펩티드를 서열 번호: 1로서 제공한다. 2번 위치의 Ala 잔기는, 하기 설명하는 바와 같이 벡터 작제를 간소화시키기 위하여 ATG 개시 코돈 바로 다음에 존재하는 알라닌에 대한 코돈을 부가한 결과로서, 야생형 DMO와 비교하면 추가된 것이다.

발현을 개선시키기 위하여 모든 코돈을 변경시킬 필요는 없지만, 적어도 숙주에서 드물게 사용되는 코돈을 숙주가 선호하는 코돈, 예를 들어, 숙주에서 더욱 빈번하게 사용되는 코돈, 및 일반적으로는, 휘귀한, 선호하지 않는 코돈보다는 더 쉽게 번역되는 코돈으로 변화시키는 것이 바람직하다. 약 50% 초과, 가장 바람직하게 적어도 약 80%의 선호하지 않는 코돈을 숙주가 선호하는 코돈으로 변화시킴으로써 높은 수준의 발현을 얻을 수 있다. 많은 숙주 세포의 코돈 선호성이 알려져 있다 (PCT WO 97/31115; PCT WO 97/11086; EP 646643; EP 553494; 및 미국 특허 번호 제 5,689,052호; 제5,567,862호; 제5,567,600호; 제5,552,299호; 및 제5,017,692호). 다른 숙주 세포의 코돈 선호성은 당업계에 공지되어 있는 방법에 의해 추론할 수 있다. 또한, 화학적 합성법을 사용함으로써 DNA 분자 또는 그의 코딩된 단백질 서열을 쉽게 변화시킴으로써 예를 들면, 발현을 최적화시킬 수 있고 (예를 들면, 전사 또는 번역을 간섭하는 mRNA의 2차 구조를 제거할 수 있고), 편리한 지점에 독특한 제한 부위를 부가할 수 있고, 프로테아제 절단 부위를 결실시킬 수 있다.

효소 활성을 유지시키면서 예로서, 본원에서 제공하는 DMO 서열과 같은 단백질의 폴리펩티드 서열을 변형 및 변화시킬 수 있다. 등가의, 또는 심지어는 개선된 변형된 폴리펩티드 및 상응하는 코딩 서열을 생성하기 위해 단백질의 아미노산을 변화시키는 것에 기초한 논의가 하기에서 이루어질 것이다. 본 발명의 특정 실시태양에서, DMO 서열은 이러한 방식으로 변경될 수 있고, 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 아미노산 변화는 DNA 서열의 코돈 변화를 통해 이루어질 수 있다.

예를 들면, 구조, 예로서, 기질 분자상의 결합 부위와 상호작용하는 결합능에 있어서의 뚜렷한 손실없이 특정 아미노산이 단백질 구조에서 다른 아미노산으로 치환될 수 있다는 것은 공지되어 있다. 단백질의 상호작용 능력 및 성질이 단백질의 생물학적인 기능적 활성을 정의하는 것이기 때문에 단백질 서열에서 특정 아미노산 서열 치환이 이루어질 수 있고, 물론 근원적인 DNA 코딩 서열에서도 이루어질 수 있으며, 그럼에도 불구하고 유사한 성질을 갖는 단백질을 수득할 수 있다. 따라서, 그의 생물학적 유용성 또는 활성에 있어서의 뚜렷한 손실없이 본원에 기술된 DMO 펩티드 서열 및 상응하는 DNA 코딩 서열에서 다양한 변화가 이루어질 수 있다고 생각한다.

그러한 변화를 만드는데 있어서, 아미노산의 친수성 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질상에서 상호작용하는 생물학적 기능을 부여하는 아미노산의 친수성 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다 [Kyte et al., 1982]. 아미노산의 상대적인 친수성 특성은 생성된 단백질의 2차 구조를 결정하는 것으로 생각되고 있으며, 이는 결국 다른 분자, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과 단백질의 상호작용을 한정한다. 각각의 아미노산에 대해 그들의 소수성 및 전하 특성을 기초로 하는 친수성 지수가 지정되어 있으며 [Kyte et al., 1982], 이는 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 리신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5)이다.

아미노산들은, 유사한 친수성 지수 또는 점수를 갖고 있으며, 여전히 유사한 생물학적 활성을 가진 단백질이 될 수 있는, 즉, 여전히 생물학적으로 기능상 등가인 단백질을 얻을 수 있는 다른 아미노산으로 치환될 수 있다는 것이 공지되어 있다. 그러한 변화를 이루는데 있어서, 친수성 지수가 ±2 이내에 있는 아미노산의 치환이 바람직하며, ±1 이내에 있는 것이 특히 바람직하며, ±0.5 이내에 있는 것이 더욱더 특히 바람직하다. 이 점에서, 112번 위치에 있는 트립토판이 시스테인으로 치환된 DMO가 생물학적 활성을 갖고, 이를 통해 높은 수준의 디캄바에 대하여 내성을 띤 식물을 수득하였다는 관찰 결과는, 본래의 아미노산과 변경된 아미노산의 친수성 지수가 서로 상이하다고 가정하면 놀라운 것이었고, 따라서, 선행 기술에 따라 기능적인 변이체를 생성하기 위해서 당업자에 의해서는 사용되지 못했을 것이다.

당업계에서는 또한 친수성에 기초하여 유사한 아미노산을 효과적으로 치환시킬 수 있다는 것이 이해되고 있다. 미국 특허 4,554,101은 인접한 아미노산의 친수성에 의해서 좌우되는 단백질의 가장 높은 국부적 평균 친수성이 단백질의 생물학적 성질과 관련한다는 것을 설명하고 있다. 미국 특허 4,554,101에서 상세히 설명되어 있는 바와 같이, 하기와 같은 친수성 값이 아미노산 잔기에 지정되었다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파테이트 (+3.0 ± 1); 글루타메이트 (+3.0 ± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 또다른 것으로 치환될 수 있고, 이는 여전히 생물학적으로 등가인 단백질을 얻을 수 있다고 이해된다. 그러한 변화에 있어서, 친수성 값이 ±2 이내에 있는 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내에 있는 것이 특히 바람직하며, ±0.5 이내에 있는 것이 더욱더 특히 바람직하다. 이들 및 다양한 상기의 특징들을 고려한 대표적인 치환은 당업자에게 공지되어 있으며, 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다. 다시 말해, DMOc의 활성은, 변경된 아미노산과 본래의 아미노산의 친수성 지수가 서로 상이하다고 가정하면 놀라운 것이었고, 이러한 치환은 선행 기술에 따라 기능적인 변이체를 생성하기 위해서 당업자에 의해서는 사용되지 못했을 것이다.

본 발명에 따른 DMO 서열의 변형은 효소내 보존되는 도메인을 고려하는 것에 의해 좌우될 수 있다. 예를 들면, DMO 효소는 기능적 도메인, 예로서, 리스케 철-황 클러스터 및 유리 철에 대한 결합 부위를 함유한다고 하기에서 입증된다 (예를 들면, 도 18 참조). 그러므로, 기능적 도메인과 단백질 변형에 관하여 당업계에 공지되어 있는 지식과 조합을 이룬 이러한 정보는 일반적으로 본 발명의 범주내에서 효소 활성은 유지하면서 변형된 DMO 효소를 생성하는데 사용될 수 있다 (예컨대, ([Mason and Cammack, 1992]; [Jiang et al., 1996]) 참조).

2. 형질전환 작제물

본 발명에 따라 사용되는 DMO-코딩 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 효율적인 발현을 위해 필요한 발현 제어 요소를 포함하는 작제물로서 세포내로 도입될 것이다. 발현 제어 요소를 코딩 서열에 작동적으로 연결시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 ([Maniatis et al, 1982]; [Sambrook et al, 1989]). 발현 제어 서열은 어느 방식으로든 전사를 제어하는데 관여하는 DNA 서열이다. 적합한 발현 제어 서열 및 그를 사용하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 특히 프로모터는 인핸서 요소, 5' 비번역 영역, 단백질 또는 RNA 생성물의 식물 세포소기관 특히 엽록체로의 표적화를 위한 전이 또는 신호 펩티드 및 3' 비번역 영역, 예로서, 폴리아데닐화 부위와 함께 또는 이들 없이 사용될 수 있다. 당업자는 다양한 인핸서, 프로모터, 인트론, 전이 펩티드, 표적 신호 서열, 및 5' 및 3' 비번역 영역 (UTRs)이 효과적인 식물 발현 벡터, 예로서, 미국 특허 출원 공개번호 2003/01403641에 개시되어 있는 것을 디자인하는데 유용하다는 것을 알고 있을 것이다.

현 용도 및 기타 용도에 적합한 프로모터는 당업계에 잘 알려져 있다. 그러한 프로모터를 기술하고 있는 예로는 미국 특허 6,437,217 (옥수수 RS81 프로모터), 미국 특허 5,641,876 (쌀 액틴 프로모터), 미국 특허 6,426,446 (옥수수 RS324 프로모터), 미국 특허 6,429,362 (옥수수 PR-I 프로모터), 미국 특허 6,232,526 (옥수수 A3 프로모터), 미국 특허 6,177,611 (구성적 옥수수 프로모터), 미국 특허 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142 및 5,530,196 (35S 프로모터), 미국 특허 6,433,252 (옥수수 L3 올레이신 프로모터), 미국 특허 6,429,357 (쌀 액틴 2 프로모터 뿐만 아니라, 쌀 액틴 2 인트론), 미국 특허 5,837,848 (뿌리 특이 프로모터), 미국 특허 6,294,714 (광 유도성 프로모터), 미국 특허 6,140,078 (염 유도성 프로모터), 미국 특허 6,252,138 (병원체 유도성 프로모터), 미국 특허 6,175,060 (인 결핍 유도성 프로모터), 미국 특허 6,635,806 (감마 코익신 프로모터), 및 미국 특허 출원 시리얼 번호 제09/757,089호 (옥수수 엽록체 알돌라제 프로모터)를 포함한다. 용도가 발견될 수 있는 추가의 프로모터는 노팔린 신타제 (NOS) 프로모터 [Ebert et al, 1987], 옥토핀 신타제 (OCS) 프로모터 (이는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium 투메파시엔스)의 종양-유도성 플라스미드상에서 전해진다), 콜리모바이러스 프로모터 예로서, 콜리플라우어 모자이크 바이러스 (CaMV) 19S 프로모터 [Lawton et al, 1987], CaMV 35S 프로모터 [Odell et al, 1985], 피그워트 모자이크 바이러스 35S-프로모터 [Walker et al, 1987], 수크로스 신타제 프로모터 [Yang et al, 1990], R 유전자 복합체 프로모터 [Chandler et al, 1989], 및 클로로필 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터 등이다. 본 발명에 사용하기에 특히 유익한 것은 CaMV35S (미국 특허 번호 제5,322,938호; 제5,352,605호; 제5,359,142호; 및 제5,530,196호), FMV35S (미국 특허 6,051,753; 5,378,619), PCISV 프로모터 (예컨대, 미국 특허 5,850,019, 및 서열 번호: 24), 및 AGRtu.nos (진뱅크 수탁(GenBank Accession) V00087; [Depicker et al, 1982]; [Bevan et al, 1983]) 프로모터일 수 있다.

이종성 유전자를 발현시키기 위해서는 전이 펩티드를 코딩하는 서열을 사용하는 것이 유익할 수 있다. 전이 펩티드는 일반적으로 관심의 대상이 되는 단백질에 연결되었을 때, 단백질을 특정 조직, 세포, 세포하 위치, 또는 세포 세포소기관에 지시하는 펩티드 분자를 지칭한다. 예로는 엽록체 전이 펩티드, 핵 표적 신호, 및 액포 신호를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 엽록체 전이 펩티드는 DMO 효소의 발현을 엽록체에 지시하는데 있어 본 발명에서 특히 유용하다. DMO 기능은 디캄바를 분해하는 식물 세포에서 발견되는 내인성 리덕타제 및 페레독신에 의해 촉진될 것이라는 것이 예기된다. 식물 엽록체에는 특히 리덕타제 및 페레독신이 풍부하다. 따라서, 트랜스제닉 디캄바-내성 식물을 생산하는 바람직한 실시태양에서 디캄바-분해 옥시게나제를 엽록체내로 지시하는, 펩티드를 코딩하는 서열이 사용될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 이종성 리덕타제 및/또는 페레독신 또한 세포에서 발현될 수 있다.

엽록체 표적 서열을 코딩하는 DNA는 DMO을 코딩하는 서열의 상류 (5')에 배치되는 것이 바람직할 수 있지만, 코딩 서열의 하류 (3'), 또는 코딩 서열의 상류 및 하류, 둘 모두에 배치될 수 있다. 엽록체 전이 펩티드 (CTP)는 특히 식물 엽록체로 표적시키고자 하는 단백질의 N-말단에 융합되도록 공학처리될 수 있다. 다수의 엽록체-국부화된 단백질이 전구체로서 핵 유전자로부터 발현되고, 이는 유입 단계시에 제거되는 CTP에 의해 엽록체에 대하여 표적화된다. 엽록체 단백질의 예로는 리불로스-1,5,-비스포스페이트 카르복실라제의 작은 하위유니트 (RbcS2), 페레독신, 페레독신 옥시도리덕타제, 집광 복합체 단백질 I 및 단백질 II, 및 티오레독신 F를 포함한다. 비-엽록체 단백질은 CTP와의 단백질 융합을 사용함으로써 엽록체에 의해 표적화될 수 있고, CTP는 단백질을 엽록체에 표적화시키는데 충분하다는 것이 생체내 및 시험관내에서 입증되었다. 예를 들면, 적합한 엽록체 전이 펩티드, 예로서, 아라비도프시스 탈리아나 EPSPS CTP [Klee et al, 1987], 및 페튜니아 하이브리다(Petunia hybrida) EPSPS CTP [della-Cioppa et al, 1986]의 혼입이 트랜스제닉 식물에서 이종성 EPSPS 단백질 서열을 엽록체에 표적화시키는 것으로 나타났다. 기타 대표적인 엽록체 표적 서열로는 옥수수 cab-m7 신호 서열 ([Becker et al, 1992]; PCT WO 97/41228) 및 완두콩 글루타티온 리덕타제 신호 서열 ([Creissen et al, 1991]; PCT WO 97/41228)을 포함한다. 본 발명에서 AtRbcS4 (CTP1; 미국 특허 5,728,925), AtShkG (CTP2; [Klee et al, 1987]), AtShkGZm (CTP2synthetic; WO04009761의 서열 번호: 14 참조), 및 PsRbcS [Coruzzi et al, 1984]는 예를 들면, DMO 폴리펩티드의 발현과 관련하여 특히 유익할 수 있다.

번역 리더 서열로서 작용하는 5' UTR은 유전자의 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 위치하는 DNA 유전 요소이다. 번역 리더 서열은 전체적으로 프로세싱된 mRNA 중 번역 개시 서열 상류에 존재한다. 번역 리더 서열은 mRNA로의 1차 전사체의 프로세싱, mRNA 안정성 또는 번역율에 영향을 줄 수 있다. 번역 리더 서열의 예로는 그중에서도 특히 옥수수 및 페튜니아 열 쇼크 단백질 리더 (미국 특허 번호 제5,362,865호), 식물 바이러스 외피 단백질 리더, 식물 루비스코 리더를 포함한다 [Turner and Foster, 1995]. 본 발명에서, 특히 유익한 것으로 제시될 수 있는 5' UTRs은 GmHsp (미국 특허 5,659,122), PhDnaK (미국 특허 5,362,865), AtAnt1, TEV [Carrington and Freed, 1990], 및 AGRtunos (진뱅크 수탁 V00087; [Bevan et al, 1983])이다.

3' 비번역 서열, 3' 전사 종결 영역, 또는 폴리아데닐화 영역은 유전자의 코딩 영역에 연결되어 있고, 그의 하류에 위치하는 DNA 분자를 의미하며, 이는 폴리아데닐화 신호 및 전사, mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 기타 조절 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 식물에서 폴리아데닐화 신호는 폴리아데닐레이트 뉴클레오티드를 mRNA 전구체의 3' 말단에 첨가하는 작용을 한다. 폴리아데닐화 서열은 천연 유전자로부터, 각종 식물 유전자로부터, 또는 T-DNA 유전자로부터 유래될 수 있다. 3' 전사 종결 영역의 일례는 노팔린 신타제 3' 영역 (nos 3'; [Fraley et al, 1983])이다. 상이한 3' 비번역 영역의 용도가 기재되어 있다 [Ingelbrecht et al, 1989]. 피숨 사티붐(Pisum sativum) RbcS2 유전자 (Ps.RbcS2-E9; [Coruzzi et al, 1984]) 및 AGRtu.nos ([Rojiyaa et al, 1987], 진뱅크 수탁 E01312)로부터의 폴리아데닐화 분자가 특히 본 발명에 사용하기에 유익할 수 있다.

DMO-코딩 폴리뉴클레오티드 분자 발현 유니트는 선별가능한/점수화될 수 있는 마커에 대한 유전 요소 또는 원하는 특징을 부여하는 유전자에 대한 유전 요소를 함유하는 발현 유니트에서 제2 폴리뉴클레오티드 분자에 연결될 수 있다. 가정적으로 형질전환된 세포를 선별하는데 통상 사용되는 유전자로는 β-글루크로니다제 (GUS), β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 ([Jefferson, 1987]; [Teeri et al, 1989]; [Koncz et al, 1987]; [De Block et al, 1984]), 녹색 형광 단백질 (GFP) ([Chalfie et al, 1994]; [Haseloff et al, 1995]; 및 PCT 출원 WO 97/41228)을 포함한다.

제2 폴리뉴클레오티드 분자는 선별가능한 마커로서 작용하는 유전자를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 제2 또는 추가의 유전자는 식물 형태, 생리, 성장 및 발생, 수율, 영양학적 향상, 질환 또는 해충 내성, 또는 환경적 또는 화학적 내성과 관련된 바람직할 수 있는 특징들을 제공할 수 있고, 제초제 내성 (미국 특허 6,803,501; 6,448,476; 6,248,876; 6,225,114; 6,107,549; 5,866,775; 5,804,425; 5,633,435; 5,463,175), 수율 증가 (미국 특허 RE38,446; 6,716,474; 6,663,906; 6,476,295; 6,441,277; 6,423,828; 6,399,330; 6,372,211; 6,235,971; 6,222,098; 5,716,837), 곤충 방제 (미국 특허 6,809,078; 6,713,063; 6,686,452; 6,657,046; 6,645,497; 6,642,030; 6,639,054; 6,620,988; 6,468,523; 6,326,351; 6,313,378; 6,284,949; 6,281,016; 6,248,536; 6,242,241; 6,221,649; 6,177,615; 6,156,573; 6,153,814; 6,110,464; 6,093,695; 5,959,091; 5,942,664; 5,942,658, 5,880,275; 5,763,245; 5,763,241), 진균 질환 내성 (미국 특허 6,653,280; 6,573,361; 6,506,962; 6,316,407; 6,215,048; 5,516,671; 5,773,696; 6,121,436; 6,316,407; 6,506,962), 바이러스 내성 (미국 특허 6,617,496; 6,608,241; 6,015,940; 6,013,864; 5,850,023; 5,304,730), 선충류 내성 (미국 특허 6,228,992), 세균 질환 내성 (미국 특허 5,516,671), 식물 성장 및 발생 (미국 특허 6,723,897; 6,518,488), 전분 생산 (미국 특허 6,538,181; 6,538,179; 6,538,178; 5,750,876; 6,476,295), 변형된 오일 생산 (미국 특허 6,444,876; 6,426,447; 6,380,462), 오일 함량이 높은 생산 (미국 특허 6,495,739; 5,608,149; 6,483,008; 6,476,295), 지방산 함량 변형 (미국 특허 6,828,475; 6,822,141; 6,770,465; 6,706,950; 6,660,849; 6,596,538; 6,589,767; 6,537,750; 6,489,461; 6,459,018), 단백질 함량이 높은 생산 (미국 특허 6,380,466), 과실 숙성 (미국 특허 5,512,466), 동물 및 인간 영양물 증진 (미국 특허 6,723,837; 6,653,530; 6,5412,59; 5,985,605; 6,171,640), 생체중합체 (미국 특허 RE37,543; 6,228,623; 5,958,745 및 미국 특허 공개 번호 제US20030028917호), 환경 스트레스 내성 (미국 특허 6,072,103), 약제학적 펩티드 및 분비가능 펩티드 (미국 특허 6,812,379; 6,774,283; 6,140,075; 6,080,560), 프로세싱 특징의 개선 (미국 특허 6,476,295), 소화도 개선 (미국 특허 6,531,648), 낮은 라피노오스 (미국 특허 6,166,292), 산업적 효소 생산 (미국 특허 5,543,576), 향미 개선 (미국 특허 6,011,199), 지소 고정 (미국 특허 5,229,114), 하이브리드 종자 생산 (미국 특허 5,689,041), 섬유 생산 (미국 특허 6,576,818; 6,271,443; 5,981,834; 5,869,720) 및 생체연료 생산 (미국 특허 5,998,700)을 포함하는 유전 요소를 포함할 수 있다. 본 개시 내용을 고려하여 당업자가 이해하는 바와 같이, 이들 또는 기타의 유전 요소, 방법 및 트랜스진 중 임의의 것이 본 발명에 사용될 수 있다.

발현 유니트는 아그로박테리움에서 T-DNA 전달 및 통합 기능을 갖는 제2 플라스미드와 함께 제1 플라스미드의 우측 경계 (RB)와 좌측 경계 (LB) 영역 사이의 T-DNA로서 제공될 수 있다. 작제물은 또한 세균 세포에서 복제 기능 및 항생제 선별을 제공하는 플라스미드 골격 DNA 세그먼트, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 복제 기점, 예로서, ori322, 광범위한 숙주의 복제 기점, 예로서, oriV 또는 oriRi, 및 선별가능한 마커에 대한 코딩 영역, 예로서, 스펙티노마이신 또는 스트렙토마이신에 대한 내성을 부여하는 Tn7 아미노글리코시드 아데닐트랜스퍼라제 (aadA)를 코딩하는 Spec/Strp, 또는 젠타마이신 (Gm, Gent) 선별가능한 마커 유전자를 함유할 수 있다. 식물 형질전환의 경우, 숙주 세균 균주는 주로 아그로박테리움 투메파시엔스 ABI, C58, 또는 LBA4404이다. 그러나, 식물 형질전환 분야에서 당업자에게 알려져 있는 기타 균주가 본 발명에서 작용할 수 있다.

3. 트랜스제닉 세포 제조

당업계에 공지되어 있는, 트랜스진을 세포내로 도입시키는 기법들 중 임의의 것에 의해 식물 세포를 형질전환시킬 수 있다 (예를 들면, [Miki et al., 1993] 참조). 상기 방법들의 예는 실제로 DNA를 세포내로 도입시킬 수 있는 임의 방법을 포함하는 것으로 여겨진다. 기술된 방법으로는 미국 특허 번호 제5,384,253호에 설명되어 있는 전기천공; 미국 특허 번호 제5,015,580호; 제5,550,318호; 제5,538,880호; 제6,160,208호; 제6,399,861호; 및 제6,403,865호에 설명되어 있는 유전자 총 충격; 미국 특허 번호 제5,635,055호; 제5,824,877호; 제5,591,616호; 제5,981,840호; 및 제6,384,301호에 설명되어 있는 아그로박테리움-매개 형질전환; 및 미국 특허 번호 제5,508,184호에 설명되어 있는 원형질체 형질전환을 포함한다. 예로서, 이와 같은 기법을 적용시킴으로써 실질적으로 임의 식물 종의 세포를 본 발명에 따라 안정적으로 형질전환시킬 수 있고 선별할 수 있으며, 이들 세포를 트랜스제닉 식물로 발생시킬 수 있다.

발현 벡터를 식물내로 도입시키는데 가장 널리 사용되는 방법은 아그로박테리움의 천연 형질전환 시스템에 기초한다 (예를 들면, [Horsch et al, 1985] 참조). A. 투메파시엔스(A. tumefaciens) 및 A. 라이조제네스(A. rhizogenes)가 유전적으로 식물 세포를 형절전환시키는 식물 병원성 토양 세균이다. A. 투메파시엔스 및 A. 라이조제네스의 Ti 및 Ri 플라스미드는 각각 식물의 유전적 형질전환을 담당하는 유전자를 포함한다 (예를 들면, [Kado, 1991] 참조). 아그로박테리움 벡터 시스템 및 아그로박테리움-매개 유전자 전달 방법에 관한 설명은 ([Miki et al, supra, Moloney et al, 1989], 및 미국 특허 번호 제4,940,838호 및 제5,464,763호)를 비롯한 다수의 참고 문헌에서 제공된다. 식물과 상호작용하는 기타 세균, 예로서, 시노리조비움(Sinorhizobium), 리조비움(Rhizobium), 및 메조리조비움(Mesorhizobium)은 천연적으로 다수의 각종 식물로의 유전자 전달을 매개하기 위해 변형될 수 있다. 이들 식물-관련 공생 세균은 병원성이 해제된(disarmed) Ti 플라스미드 및 적합한 이원 벡터, 둘 모두를 습득함으로써 유전자 전달에 관한 자격을 갖추게 될 수 있다 [Brothers et al, 2005].

B. 조직 배양 및 식물 재생

먼저 외식편을 슈팅(shooting) 배지에서 배양한 후, 이어서 루팅(rooting) 배지에서 배양함으로써 형질전환된 식물 세포를 수정 식물로 재생시킬 수 있다. 때때로, 외식편을 슈팅 배지로 옮기기 전에 캘러스 배지에서 배양할 수 있다. 식물 형질전환 및 트랜스제닉 식물의 소생을 위해 각 식물 시스템에 대하여 다양한 배지 및 전달 요건이 충족될 수 있고, 최적화될 수 있다. 결과적으로는 상기 배지 및 배양 조건은 트랜스제닉 이벤트의 선별 및 소생을 위해 영양학적으로 등가인 성분 또는 유사 공정으로 변형되거나 치환될 수 있다.

영양 배지는 액체로 제조될 수 있지만, 이는 고체 지지체를 제공할 수 있는 물질에 액체를 첨가함으로써 고형화될 수 있다. 이러한 용도로 아가가 가장 보편적으로 사용된다. 박토아가(Bactoagar), 헤이즐턴(Hazelton) 아가, 겔라이트(Gelrite), 및 겔그로(Gelgro)는 조직 배양에 있어서 식물 세포 성장에 적합한 특정 유형의 고체 지지체이다. 몇몇 세포 유형은 액상 현탁액 중에서 또는 고체 배지 상에서 또는 두가지 배지 모두에서 성장하고 분열할 것이다.

수혜 세포 표적으로는 분열 조직 세포, 캘러스, 미성숙 배아 및 생식체 세포, 예로서, 소포자 화분, 정핵 및 난세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시태양에서, 수정 트랜스제닉 식물이 재생될 수 있는 임의의 세포가 사용될 수 있다. 예를 들면, 미성숙 배아가 형질전환된 후, 캘러스의 선별 및 개시가 이어지고, 이어서 수정 트랜스제닉 식물은 재생될 수 있다. 미성숙 배아의 직접적인 형질전환을 통해 수혜 세포 배양물의 장기간에 걸친 발생은 필요하지 않게 된다. 분열 조직 세포 (즉, 계속적으로 세포 분열을 할 수 있고, 일반적으로는 예로서, 근단, 줄기 정단, 측아 등과 같이 식물에 있는 성장점 또는 조직에서 발견되는, 미분화된 세포학적 외관을 특징으로 하는 식물 세포) 또한 수혜 식물 세포로서 사용될 수 있다. 전체의 형질전환된 식물은 그의 미분화된 성장과, 기관 분화능 및 분화 전능성 때문에 단일의 형질전환된 분열 조직 세포로부터 소생될 수 있다.

체세포는 다양한 유형이 존재한다. 배발생 세포는 배 형성을 통해 식물을 재생시키도록 유도될 수 있는 체세포의 일례이다. 비-배발생 세포는 전형적으로 상기와 같은 양식으로는 반응하지 않는 것이다.

세포 군집내 수혜 세포를 강화시키는 특정 기법이 사용될 수 있다. 예를 들면, II형 캘러스 발생에 이어 수동 선별 및 부서지기 쉬운, 배발생 조직의 배양을 통해 일반적으로는 예를 들면, 유전자 총 형질전환에 사용하기 위한 수혜 세포를 강화시킬 수 있다.

특정 실시태양에서, 배양물에서 배양한 후, 수혜 세포를 선별한다. 배양된 세포를 고체 지지체상에서 또는 액상 현탁액 중에서 배양할 수 있다. 어느 경우든, 영양을 배지 형태로 세포에 제공할 수 있으며, 환경 조건을 조정할 수 있다. 아미노산, 염, 당, 성잘 조절 인자 및 비타민으로 구성된 여러 유형의 조직 배양 배지가 존재한다. 본 발명의 실시에 사용되는 대부분의 배지는 몇몇 유사 성분들을 갖지만, 배지는 공지된 조직 배양의 실시 방법에 따라 성분들의 조성 및 비율을 달리할 수 있다. 예를 들면, 다양한 세포 유형은 일반적으로 1 초과의 배지 유형에서 배양되지만, 이는 성장 배지에 따라 상이한 성장 속도 및 상이한 형태를 나타낼 것이다. 몇몇 배지에서 세포는 생존하지만 분열을 하지 못한다. 배지 조성은 또한 선별된 종 또는 세포 유형에 기초하여 빈번히 최적화된다.

식물 세포 배양에 적합한 다양한 유형의 배지가 종전에 기술된 바 있다. 이러한 배지의 예로는 [Chu et al. (1975)]에 기재된 N6 배지 및 MS 배지 [Murashige & Skoog, 1962]를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 몇몇 실시태양에서는 지속적으로 분열할 수 있는 전배 상태로 세포를 유지시킴으로써 수혜 세포의 재생을 촉진시키기 위해 암모니아/질산염 비율이 다소 좀 더 낮은 배지, 예로서, N6을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 수목 식물 배지 (WPM) 또한 사용될 수 있다 ([Lloyd and McCown, 1981].

세포 배양물을 유지시키는 방법이 형질전환을 위한 수혜 세포의 공급원으로서의 그의 유용성에 기여할 수 있다. 새로운 배양 배지로 옮기기 위해 세포를 수동으로 선별하는 것, 새로운 배양 배지로 옮기는 빈도수, 배양 배지의 조성, 및 빛의 질 및 빛의 양, 및 온도를 포함하나, 이에 한정되지 않는 환경적 인자가 수혜 세포의 공급원으로서 유용한 캘러스 및/또는 현탁액 배양물을 유지시키는데 있어서의 모든 인자가 된다. 상이한 배양 조건 사이에서 캘러스를 서로 교대시키는 것이 배양물내 수혜 세포를 강화시키는데 있어서 유익할 수 있다. 예를 들면, 세포를 현택액 배양물에서 배양시킬 수 있지만, 일정한 간격으로 고체 배지로 옮길 수 있다. 고체 배지상에서 일정 기간 배양한 후, 액상 배양 배지로 다시 돌려놓기 위해 수동으로 세포를 선별할 수 있다. 새로운 배양 배지로 옮기는 이러한 순서를 반복하는 것을 사용함으로써 수혜 세포를 강화시킬 수 있다. 1.9 mm 체를 통해 세포 배양물을 통과시키는 것 또한 캘러스의 부스럼짐성 또는 현택액 배양물을 유지시키는데 있어서, 그리고 상기 세포 유형이 사용되는 경우, 형질전환이 가능한 세포를 강화시키는데 있어서 유용할 수 있다.

C. 트랜스제닉 식물

일단 트랜스제닉 세포가 선별되면, 당업계에 잘 알려져 있는 기법을 사용함으로써 세포를 수정 트랜스제닉 식물로 재생시킬 수 있다. 이어서, DNA 작제물내 관심의 대상이 되는 특정 핵산의 존재 여부를 측정하기 위해 형질전환된 식물을 분석할 수 있다. 분자 분석법은 써던 블롯 [Southern, 1975], 또는 PCR 분석법, 면역진단학적 접근법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 목초지 평가 또한 사용될 수 있다. 개시된 방법에 의해 생산된 형질전환 식물의 안정성을 확인하기 위해서 이들 및 기타의잘 알려진 방법을 실시할 수 있다. 이러한 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있다 [Sambrook et al, 1989].

따라서, 본원에서 제공하는 DMO 코딩 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물이 생산될 수 있다. 특히, 작물, 수목 및 기타 식물을 비롯한, 경제적으로 중요한 식물은 본 발명의 DNA 작제물로 형질전환됨으로써 디캄바에 대하여 내성을 띠거나, 내성은 증가될 수 있다. 현재 옥신-유사 제초제에 대하여 내성을 띠는 것으로 간주되는 식물을 형질전환시켜 제초제에 대한 그의 내성을 증가시킬 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 것으로 제시된 식물의 몇몇 비제한적인 일례로는 알팔파, 대맥, 콩, 비트, 브로콜리, 양배추, 당근, 캐놀라, 콜리플라워, 셀러리, 배추, 옥수수, 목화, 오이, 가지, 부추, 상추, 멜론, 귀리, 양파, 완두콩, 후추, 땅콩, 감자, 호박(pumpkin), 무, 쌀, 사탕 옥수수, 사탕수수, 대두, 시금치, 호박(squash), 사탕무, 해바라기, 토마토, 수박, 및 소맥을 포함한다.

일단 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 식물을 제조하고 나면, 여느 때처럼 제2 식물을 직접 형질전환시킬 필요없이 교배시킴으로써 제1 식물과 성적으로 일치되는 임의의 식물로 상기 트랜스진을 도입시킬 수 있다. 그러므로, 본원에서 사용되는 바, "자손"이라는 용어는 본 발명에 따라 제조된 모체 식물의 임의 세대의 소산물이여, 여기서, 자손은 본 발명에 따라 제조된 선택된 DNA 작제물을 포함한다. 따라서, "트랜스제닉 식물"은 임의 세대의 것일 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 출발 식물주와 비교하여 하나 이상의 트랜스진 또는 대립유전자가 첨가된 식물을 제공하기 위해 식물을 "교배시키는 것"은 본 발명의 트랜스진 또는 대립유전자를 포함하는 공여 식물주와 출발 식물주를 교배시킴으로써 식물주내로 도입된 특정 서열을 수득하는 기법으로서 정의되어 있다. 이를 달성하기 위해서 예를 들면, 하기 단계: (a) 제1 (출발 식물주) 및 제2 (원하는 트랜스진 또는 대립유전자를 포함하는 공여 식물주) 모체 식물의 종자를 심는 단계; (b) 제1 및 제2 모체 식물의 종자를 꽃을 피우는 식물로 재배하는 단계; (c) 제1 모체 식물로부터 얻은 꽃과 제2 모체 식물로부터 얻은 화분을 수분시키는 단계; 및 (d) 수정된 꽃을 피우는 제1 식물상에서 생산된 종자를 수거하는 단계를 실시할 수 있다.

따라서, 본 발명은 본원에서 제공하는 DMO-코딩 핵산을 포함하는 트랜스제닉 식물 조직을 제공한다. 조직은 DMO-코딩 핵산으로 직접 형질전환될 수 있거나, 선조 세포로부터 핵산을 유전받을 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 조직은 구체적으로 세포, 배아, 미성숙 배아, 분열 조직 세포, 미성숙 수염, 소포자, 화분, 잎, 꽃밥, 뿌리, 근단, 꽃 및 종자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 핵산을 포함하는, 임의의 식물 부분을 비롯한, 상기와 같은 임의 조직을 제공한다. 특히 종자는 곡물 형태로 상업적 용도 또는 식품 용도로서 뿐만 아니라, 추가 작물을 재배하기 위한 용도로 이를 심기 위한 이들 두가지 용도로 사용하기에 특히 유용하다는 것이 제시될 것이다.

하기 실시예는 본 발명의 실시태양들을 설명하기 위해 포함된 것이다. 하기 실시예에 개시된 기법은 본 발명을 실시함에 있어 잘 작용하는 것으로 본 발명자가 발견해낸 기법을 나타낸다는 것을 당업자는 이해하여야 한다. 그러나, 본 개시와 관련하여 본 발명의 개념, 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 개시된 특정 실시태양은 다수가 변형될 수 있고, 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 얻응ㄹ 수 있다는 것을 당업자는 이해하여야 한다. 더욱 특히, 화학적으로 그리고 생리학적으로, 두가지 모두에 대하여 관련된 특정 물질은 본원에 기술된 물질로 치환될 수 있고, 동시에 동일하거나 유사한 결과를 달성할 수 있다는 것은 자명할 것이다. 당업자에게는 자명한, 상기와 같은 유사한 치환 및 변형은 모두 첨부된 청구의 범위에서 정의된 바와 같은 본 발명의 정신, 범주 및 개념내 포함되는 것으로 간주된다.

실시예 1

유전공학 처리된 DMO 유전자에 대한 벡터 작제

먼저, DMOw 주형으로부터의 PCR 증폭에 의해 DMOc 변이체 코딩 서열을 생성하였다. 이러한 증폭에서 DMOw의 코딩 영역은 P. 말토필리아, 균주 DI-6, DNA의 3.5 kbp Xho I/Sst I 단편으로서 DMOw 유전자를 함유하는 플라스미드 pPLH1로부터 증폭시켰다. DNA 증폭을 위해 PCR 생성물의 5' 말단 부근에 Nco I 제한 부위와 ATG 개시 코돈 바로 다음에 알라닌에 대한 코돈을 삽입하는 5' 프라이머, 및 PCR 생성물의 3' 말단에 Xba I 제한 부위를 생성하는 3' 프라이머를 사용하였다 (방법에 관한 설명은 하기에 제공한다). 이어서, 112W에서 112C로의 변화는 핵산 서열화를 통해 동정하였다.

식물 형질전환 벡터를 생성하기 위해 각각 코딩 영역의 5' 및 3' 말단에 첨가된 Nco I 및 Xba I 부위를 사용하여 DMOc 유전자를 pRTL2 벡터내로 삽입함으로써 [Carrington and Freed, 1990], 코딩 영역을 벡터의 담배 식각 바이러스 (TEV 리더) 번역 인핸서 요소에 융합시켰다. 5' Nco I 부위는 ATG 개시 코돈 다음의 GCC 코돈 (알라닌) 첨가에 따라 도입되었고, Xba I 제한 부위는 특이적으로 디자인된 PCR 프라이머의 사용으로 코돈 영역의 3' 말단에서 형성되었다. DMOc를 엽록체로 전달하기 위해 완두콩 루비스코 하위유니트 유전자로부터의 엽록체 전이 펩티드 코딩 영역 [Coruzzi et al., 1983]을 DMO 코딩 영역의 상류에 배치함으로써 엽록체에 대해 표적화시킬 수 있었다. Bgl II 및 EcoR I 단편상에서 운반되는 전이 펩티드 코딩 서열을 pBluescript II KS+ 벡터의 BamH I 및 EcoR I 부위로 클로닝하였다. 이 작제물을, 전이 펩티드 서열의 3' 및 5' 말단, 양쪽 모두에 Nco I를 삽입하는 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다. 증폭된 생성물을 pRLT2 벡터의 Nco I 부위로 클로닝하여 전이 펩티드 서열을 DMO 유전자의 코딩 영역의 바로 상류에, 그리고 그 프레임내 존재하도록 하였다. TEV 리더, 전이 펩티드 영역 및 DMO DNA 코딩 서열로 구성된 카세트를 Xho I 및 Xba I를 사용하여 pRTL2 벡터로부터 절단시키고, PC1SV 프로모터 및 PsRbcS2-E9 폴리 A 서열에 카세트를 연결시키기 위해 동일한 제한 부위를 사용하여 pKLP36 벡터 (미국 5,850,019; 도 5)로 클로닝하였다. 신규 벡터를 pKLP36-TEV-TP-DMOc로 표지하고 (pKLP36-DMOc로도 명명함), 2006년 2월 2일 미국 버지니아주 20110-2209 마나싸스 유니버시티 불르바드 10801에 소재하는 아메리칸 타이프 컬쳐 컬랙숀(American Type Culture Collection: ATCC)에 기탁하고, ATCC 수탁 번호 PTA-7357을 지정받았다.

담배, 아라비도프시스 및 토마토 식물을 형질전환하는데 pKLP36-DMOc 벡터를 사용하였다. 대두 형질전환을 위해, DMOc 카세트를 EcoR I/Acc I 세그먼트로서 pKLP36-TEV-TP-DMOc에서 절단시키고, 우측 및 좌측 경계를 얻기 위해 EcoR I/Acc I 분해된 pPZP101 [Hajdukiewicz et al., 1994]로 클로닝하였다. 이어서 상기 벡터 (pPZP101+DMOc 카세트)를 ScaI로 절단하고, DMOc 카세트를 좌측 및 우측 T-DNA 경계 측면에 위치하는 바(bar) 카세트를 함유하고, 제초제 바스타(Basta)의 존재하에 형질전환체를 재생하는 것을 선별할 수 있도록 하는, pPZP201 [Hajdukiewicz et al., 1994]의 유도체인 이원 벡터 pPTN200 (하기 참조)로 클로닝하였다. 신규한 2개의 T-DNA 이원 벡터는 pPTN348로 지정하고 대두 형질전환에 사용하였다. 벡터 pPTN200은, 먼저 pGPTV-바 [Becker et al., 1992]로부터의 nos 프로모터-바 요소를 PstI/BamHI 세그먼트로서 pPZP201 ([Hajdukiewicz et al., 1994] 참조)로 클로닝하여 제조하고, 생성된 플라스미드를 pPTN193으로 명명하였다. pE7113-GUS ([Mitsuhara et al., 1996] 참조)로부터의 nos 종결인자를 nos 프로모터-바 요소의 하류의 pPTN193으로 클로닝하여 바 카세트를 수득하였다.

제한 효소 및 기타 효소들을 퍼맨타스(Fermentas) 또는 인비트로겐(Invitrogen)으로부터 입수하였다. DIG-11-dUTP (알칼리-표지), CSPD (즉석용), DIG III 분자량 마커, 항-디곡시게닌-AP (Fab 단편) 및 차단 시약은 로쉬(Roche)로부터 입수하였다. 전혼성화 용액인 ULTRAhyb는 앰비온(Ambion)으로부터 입수하였다. DIG-RNA 분자량 마커 I는 로쉬로부터 입수하였다. 항-래빗 IgG, 퍼옥시다제-연결 항체 (동키) 및 Hybond ECL (니트로셀루로스) 막은 애머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences)로부터 입수하였다. DNA, RNA 및 단백질 블롯, 재조합 DNA 기법, 및 기타 분자 생물학 방법은 표준 기법 [Ausubel et al., 1995]을 사용하여 수행하였다.

실시예 2

트랜스제닉 식물의 생산 및 분석

유전공학 처리된 DMOc 유전자의 트랜스제닉 발현 및 유전자를 발현하는 식물에서 디캄바 내성을 확인하기 위해 담배, 토마토, 대두 및 아라비도프시스를 사용하였다. 삼중모계 교배에 의해 [Ditta 1980] 병원성이 해제된 Ti 플라스미드 pMP90을 함유하는 A. 투메파시엔스 균주 C58C1 [Koncz and Schell, 1986]내로 이원 벡터 pKLP36의 DMOc 코딩 서열을 도입하였다. 생성된 트랜스접합체는 홀쉬(Horsch) 등 [Horsch 1985]에 의해 기재된 잎 원판 프로토콜을 사용한 담배 (cv Xanthi) 및 토마토 (cv Rutgers) 형질전환을 위해 사용하였다. 플로랄 딥(floral dip) 기법 [Clough and Bent, 1998]에 의해 아라비도프시스 탈리아나를 형질전환시켰다. 대두 품종 Thome 및 NE-3001의 형질전환은 자엽-마디 아그로박테리움-매개 형질전환 시스템 [Zhang et al., 1999]에 의해 수행하였다.

아그로박테리움-매개로 DMOc 유전자를 담배 식물의 핵 게놈으로 유전자 전달을 함으로써 수개의 독립적으로 유도된 T₁ 세대 식물을 수득하였다. DNA, RNA 및 단백질 블롯 분석법을 사용하여 DMOc 유전자의 존재 및 발현에 대하여 식물을 시험하였다. 도 2는, 비록 본 분석에서 모든 트랜스제닉 식물 (래인 1-6)이 제한 효소 분해 후에는 클로닝된 DMO 유전자 (래인 8)와 동일한 DNA 단편을 함유하였지만, mRNA 전사체 및 DMO 단백질의 수준은 형질전환체 사이에 유의적으로 상이하였다는 것을 도시한다. 예를 들면, 그의 추출물이 래인 5에 도시되어 있는 식물은 상대적으로 높은 수준의 DMO mRNA를 나타내지만, 효소는 매우 낮은 수준으로 나타낸다. 반대로, 래인 3에 제시된 추출물에서 거의 동일한 수준의 DMO mRNA가 높은 수준의 DMO 발현과 커플을 이루었다. 그러나, 발현이 강한 이벤트는 상기 방법에 의해 일관되게 수득할 수 있다는 것으로 나타났다.

1.87 mph에서 순회하는, 플랫-팬 8002E 노즐 장착형의 모터-구동식 압축 공기 트랙 분무기를 사용하여 용매 및 시판 등급의 디캄바 (클래러티(Clarity); BASF)로 온실내 식물에 분무하였다. 첨가물로는 1.25% v/v의 28% 우레아 질산암모늄 및 1.0% v/v의 비이온 계면활성제를 포함하였다. 다양한 농도의 디캄바를 함유하는 용액을 182 L/ha (40 갤런/에이커)로 가하였다. 대두 목초지 조림에 클래러티 제초제를 2.8 kg/ha (2.5 lb/ac)로 분무하였다.

대부분의 쌍자엽 식물처럼 담배 식물도 디캄바 처리에 대하여 매우 감수성이 다. 이는 처리하지 않거나, 디캄바의 양을 증가시키면서 처리한 비트랜스제닉 담배 식물을 비교함으로써 나타내었다. 제초제 손상 증상은 디캄바를 0.017 kg/ha로 분무한 후에 쉽게 검출하였다. 농작용으로 잡초 방제를 위해 일반적으로 사용되는 수준인 0.28 kg/ha 및 0.56 kg/ha에서의 증상은 매우 중증이었다.

DMOc-함유 트랜스제닉 담배 식물을 5.6 kg/ha (일반 적용 비율보다 10 내지 20배 더 높다)로 발아후에 처리하였을 때에도 설사 증상이 있다 해도 거의 없었지만, 비트랜스제닉 식물은 중증의 손상으로 고생하였다. 디캄바 적용을 위해 비히클로서 사용된 계면활성제-함유 용매액을 식물에 분무함으로써 하단에 있는 트랜스제닉 식물의 잎에 대한 손상은 2배가 될 수 있다. 트랜스제닉 식물을 디캄바로 처리한 후에 생산된 잎에서는 눈에 보이는 어떤 손상 징후도 나타나지 않았다. 유사하게, 유전공학 처리된 DMOc 유전자를 갖는 트랜스제닉 토마토 식물도 높은 수준의 디캄바를 분무하였을 때, 특별한 경우, 먼저 0.56 kg/ha로 분무한 후에 이어서 5.6 kg/ha로 분무하였을 때 어떤 손상도 나타내지 않았다. DMOc 유전자를 발현하는 아라비도프시스 탈리아나도 디캄바 처리에 대하여 강한 내성을 보였다. 본 연구에서, 사용된 디캄바의 농도는 용량 1.12 kg/ha로 제공되었다. 예상외로, 전이 펩티드 코딩 영역이 존재하지 않는 DMOc 유전자로 형질전환된 담배 식물 또한 전이 펩티드 코딩 영역을 갖는 DMOc 유전자를 수반하는 식물의 것보다 평균적으로 단지 미세하게 좀더 낮은 농도의 디캄바로 발아후 처리하였을 때 이에 대하여 내성을 띠었다는 관찰 결과를 발견하게 되었다. 본 연구에서는 엽록체 전이 펩티드가 존재하 지 않는 DMOc를 갖는 T₁ 담배 식물 하나 및 유전자 분리로 인하여 DMOc 유전자가 완전히 존재하지 않는 다른 T₁ 담배 식물 하나, 이 두가지 T₁ 담배 식물상에서 2.2 kg/ha 디캄바를 사용하여 처리를 비교하였다. 후자의 식물은 디캄바 처리에 의해 완전히 쉽게 손상되었고, 그러한 처리로 인하여 죽었다 (도 3). 전이 펩티드가 존재하지 않는 DMOc 유전자를 갖는 트랜스제닉 식물은 2.2 kg/ha의 디캄바 처리에 대하여 완전히 내성을 띠었다. 트랜스제닉 담배 식물에서 DMOc 유전자의 유전에 관한 유전자 연구를 통해서도 특징은 대부분의 식물에서 일반적인 멘델의 법칙으로 유전되었고, 제초제 내성에 관해서는 원래 발현 수준대로 유지되었다는 것이 입증되었다.

대두에서, 50개 초과의 R₀ 트랜스제닉 대두 이벤트를 형성하고, T₁, T₂, 및 T₃ 세대 종자를 수집하였다. 아그로박테리움 투메파시엔스 이원 벡터 시스템을 사용하였기 때문에 마커 유전자를 수반하는 트랜스제닉 식물과, DMOc 유전자를 함유하며 마커를 갖지 않는 트랜스제닉 식물, 이 두가지 모두를 회수하였다. 어느 경우든, 대부분의 트랜스제닉 대두 계열은 온실 조건하에서는 2.8 kg/ha 및 5.6 kg/ha의 디캄바 처리에 대하여 유의적인 내성을 나타내었고, 목초지에서 2년간 시험하였을 때에는 2.8 kg/ha (시험된 것 중 가장 높은 수준)의 디캄바에 대하여 강한 내성을 나타내었다. 이러한 결과는 광범위한 광엽 잡초에 관해 고도로 효과적인 방제와 커플을 이루는, DMOc 유전자를 갖는 트랜스제닉 대두 및 기타 작물에 관한 넓은 마진의 안전성을 제안한다.

DMO 유전자를 수반하는 트랜스제닉 대두 식물에서 높은 수준의 디캄바-내성은 작물 손상없이 광엽 잡초로부터의 경쟁을 강하게 억제시키기 위해 대두 목초지에 디캄바를 적용시킬 수 있는 능력을 지시한다. 추가로, 디캄바-내성 작물은 트랜스제닉, 제초제-내성 작물을 사용하는 현 잡초 방제 옵션에 대한 중요한 보충물일 수 있다. 즉, 이는 현존하는 제초제-내성 잡초를 방제하고, 궁극적으로는 현 제초제의 장기간의 사용 및 가치, 및 제초제-내성 작물을 위협할 수 있는 추가의 제초제-내성 잡초의 출현을 억제시키는 전략법으로서 가치있는 자산이 될 수 있다.

실시예 3

DMOw 및 DMOc 효소 과발현, 정제 및 상기 효소 성질의 비교

A. 클로닝 및 과발현

야생형 (DMOw) 및 변이체 (DMOc) DMO 코딩 서열을 플라스미드 pMON95900DMO (DMOw) 및 pMON58499DMO (DMOc)로부터 벡터 pET28b (캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 노바젠(Novagen))로 클로닝하고, 에스케리키아 콜라이 BL21 세포 (캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 노바젠)로 형질전환시켰다. 세포를 37℃하에 1 ℓ의 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 브로쓰 중에서 600 nm에서의 흡광도가 0.4 내지 0.6일 때까지 배양하였다. 50 μM Fe(NH₄)SO₄, 100 μM Na₂S, 및 1 mM 이소프로필-베타-티오갈락-토피라노시드 (IPTG)를 가하여 단백질 발현을 유도하고, 세포를 15℃로 바꾸었다. 15℃에서 48-72시간이 경과한 후에 20분 동안 10000xg로 원심분리하여 세포를 수거하였다. 추가 사용을 위해 세포를 -20℃에서 저장하였다.

E. 콜라이에서 DMOw 및 DMOc에 대한 단백질 발현율은 상이하였다. DMOw 발현율은 LB 배지 1 ℓ당 약 100 내지 150 mg의 순수한 단백질인 반면, DMOc 발현율은 10배 더 낮거나, 1 ℓ당 약 10 내지 15 mg의 순수한 단백질이었다. E. 콜라이는 시스테인에 대한 희귀 코돈을 갖지 않으며, 트립토판에 대한 단 하나의 코돈만이 존재하는 바, 상기는 예측되지 못했지만, E. 콜라이에서 이종적으로 단백질을 생산할 수 있는 능력은 발현율과는 상관없이 양쪽 두가지 경우에서 모두 나타났다. 봉입체내 단백질의 양은 양쪽 두가지 경우에서 모두 낮았는데, 이는 단백질이 주로 가용성 분획으로 있다는 것을 제안한다.

슈도모나스 말토필리아, 균주 DI-6로부터의 His-태깅된 재조합 DMOw 단백질 및 E. 콜라이 균주 BL21에서 발현된 His-태깅된 재조합 DMOc를 Ni-NTA 칼럼 크로마토그래피에 의해 균질하도록 정제하였다. 세포를 용해 완충액 (100 mM NaPi pH 8.0, 300 mM NaCl, 및 10 mM 이미다졸)에 현탁시키고, 초음파 처리하여 파괴하였다. 세포 용해물을 1시간 동안 55000xg로 원심분리하였다. 상등액을 Ni-NTA 칼럼상에 로딩하고, 이를 세척 완충액 (100 mM NaPi pH 8.0, 300 mM NaCl, 및 20 mM 이미다졸)으로 세척하여 수지에 비특이적으로 부착된 단백질을 제거하였다. His-태깅된 단백질을 용리 완충액 (100 mM NaPi pH 8.0, 300 mM NaCl, 및 250 mM 이미다졸)에 용리시켰다. DMOw 정제를 위해서는 95%의 순수한 효소를 수득하는데 단계식 구배가 충분한 반면, DMOc의 경우, 동일한 순도를 얻는데는 20 내지 250 mM 농도의 이미다졸의 선형 구배가 필요하였다. SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동상에서의 크기-분별 후, 효소의 단백질 블롯 (웨스턴 블롯)에 의해 예측한 바, 칼럼으로부터 용리된 효소는 대략 95% 순수하였다. 대략 40 kDa (37.3 kDa DMO 효소 + His-태그에 대해 3 kDA)로 이동하는 단일 주요 밴드는 정확한 단백질이 과생산되었음을 지시하였다.

B. DMOc 및 DMOw에 대한 분석 및 항정 상태의 동역학

표준으로서 IgG를 사용하는 브래드포드(Bradford) 분석법에 의해 단백질 농도를 측정하였다. 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시 블루로 염색하였다. DMO 활성은 디스커버리(Discovery) C18 칼럼 (Supelco, 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))을 사용하여 HPLC (매사추세츠주 밀퍼드에 소재하는 워터스 코포레이션(Waters Corporation))에 의해 분리된 하기와 같은 DCSA 형성에 의해 측정하였다. DCSA에 대한 체류 시간은 8분이고, 디캄바의 경우는 9.5분이었다. 동역학 연구를 위해 DCSA를 검출하고, HPLC 칼럼상에서 반응 혼합물로부터 분리한 후, 420 nm (여기 파장 310 nm)에서의 형광 발산에 의해 측량하였다. DCSA의 설정 농도 (12 및 24 μM)를 측량 표준으로서 사용하였다.

디캄바 (100, 200, 400, 800, 1000, 2000, 5000, 및 10000 μM), 0.1 M KPi pH 7.2, 0.1 M FeSO₄, 0.1 M NADH, 및 1 M MgCl₂의 스톡액을 사용하였다. 20분 동안 30℃에서 분석을 실시하고, 40 ㎕의 H₂SO₄를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 활성 측정을 위해 DMO를 과량의, P. 말토필리아 균주 DI-6으로부터의 정제된 페레독신 및 리덕타제와 커플링시켰다.

DMO 활성에 대한 분석법은 불연속 분석법이기 때문에 의미가 있는 동역학 파 라미터를 얻기 위해서는 분석법이 진행되어야 하는 시간을 확립하는 것이 중요하였다. 따라서, 생산되는 DCSA의 양에 따른 초기 조건하에서 진행되어야 하는 분석법은 분석법이 진행되는 시간 동안 선형이다 (도 4). 결과는, 분석법은 20 내지 30분 사이에 진행될 수 있으며, 여전히 선형성을 유지할 수 있다는 것을 제안하였다. 도 5는 0.1 M Kpi 완충액의 존재하에 실시되는 분석법의 경우 최적의 pH는 7.2이라는 것을 나타내고, 최적의 온도는 대략 37℃인 것으로 밝혀졌음을 나타낸다 (도 6).

C. 동역한 데이타 분석

데이타를 비선형항정 상태 방정식 (방정식 1)에 피팅하여 미카엘리스-멘텐 파라미터를 측정하였다. 시그마 플롯 8.0 (Jandel Scientific)을 사용하여 데이타를 분석하였다:

V₀ = Vmax * [S]/(Km + [S])

DMOw 및 DMOc에 대한 최적의 pH 및 온도 또한 측정하였다. 최적의 pH를 20분 동안 30℃에서 측정하고, 최적의 온도 측정 또한 20분 동안 pH 7.2에서 두가지 형태의 효소 모두에 대하여 측정되었다. 결과는 도 7-9에 요약하고, 하기에서 논의한다.

본 연구는 동역학 성질에 있어서 DMOw 및 DMOc가 상이하다는 것을 나타낸다. 예를 들면, DMOw 및 DMOc에 대하여 계산된 미카엘리스-멘텐 파라미터는 DMOw의 경 우, Km = 49 ± 7 μM 및 Vmax = 633 ± 24 nmoles/분/mg이고, DMOc의 경우, Km = 20.5 ± 5 μM 및 Vmax = 676 ± 37 nmoles/분/mg였다. 이들 결과는 도 10 및 11에 나타내고, 하기 표 1에 요약되어 있다. 추가로, DMOw 및 DMOc에 대하여 수행된 추가의 두가지 분석을 통해 유사한 결과를 수득하였다 (표 2 및 3).

관찰할 수 있는 바와 같이, 촉매 효율에 있어 DMOw 및 DMOc 효소는 상이한 성질을 갖는다: 상기 분석에 의하면 DMOc는 DMOw보다 5배 더 우수한 효소이다. DMOc에 대한 pH 프로파일은 DMOw의 것과 상이하다. 먼저, DMOw와의 비교에 의하면 DMOc는 사용된 완충 시스템 (TRIS 대 KPi)에 대하여 감수성인 것으로 나타났다 (도 9, 12, 및 13). 두번째로 DMOc는 pH 단위가 증가함에 따라 DMOc의 활성이 감소하는 TRIS와 비교하면 KPi 완충액에서 분석하였을 때 광범위한 pH에 있어서 안정적인 활성을 나타낸다. KPi 또는 TRIS 완충액에서 인큐베이션된 DMOc에 대한 온도 프로파일은 유사하다.

이들 두가지 형태의 효소 사이의 온도 프로파일을 볼 때 DMOw는 37℃에서 보다 잘 작용한 반면, DMOc는 다소 더 낮은 온도에서 보다 잘 작용하였다 (도 9). 도 9는 DMOc에 대한 저온의 최적 조건을 나타내며, 이는 식물 생장기 중 조기에 트랜스제닉 식물에 있어서 유용할 수 있다.

실시예 4

DMO의 보존 영역에 대한 생물정보학적 분석

DMO의 폴리펩티드 서열을 다른 철-황 옥시게나제와 비교하고, 보존 영역을 동정하기 위하여 생물정보학적 분석을 수행하였다. 먼저, 1e-08의 e-값 컷오프 및 서열 정렬상에서의 70% DMO 서열 적용 범위에 기초하여 78개의 서열을 선별하였다. 이들 78개 서열의 추가 분석을 통해 다른 연구에서 동정되었던, 리스케 및 비-햄 Fe 도메인 [Herman et al., 2005]을 비롯한 2개의 도메인이 존재한다는 것이 밝혀졌다. 이들 78개의 서열 중 68개는 두 도메인 모두를 함유하는 반면, 10개는 도메인 중 오직 하나만을 가졌다. 추가의 모티프 분석을 위해 두 도메인를 갖는 68개의 분자를 사용하였다.

동일성 수준이 상이한 두 도메인를 갖는 68개의 분자를 정렬함으로써 새로운 WXWX 모티프를 밝혀냈다. 몇몇 서열은 모티프를 함유하지 않았지만, 계통발생학적 분석은 모티프를 갖지 않는 분자가 계통수에서 모티프를 갖는 분자와 동일한 군에 속하지 않는 특정 분기군에 속한다는 것을 지시하였다. 이로써, 모티프를 갖지 않는 상기와 같은 서열을 원래의 데이타세트로부터 제거하여 남은 52개의 서열은 추가 분석을 위해 재-정렬시켰다.

재-정렬된 52개의 서열은 하기 포맷: WX₁WX₂G (W는 Trp이고, G는 Gly 잔기이며, X₁은 비극성 잔기이고, X₂는 임의의 아미노산이다)을 함유하는, 약 2개의 W 잔기에서 보존을 나타내었다. 이 경우 두번째 W는 서열 번호: 1의 112번 위치에 상응하는 것이다. WX₁WX₂G 모티프의 WXG는 최근에 보고된 바 있고, WXG 모티프를 갖는 단백질은 세포 분비 시스템와 관련이 있다 [Desvaux et al., 2005].

트립토판 (W) 및 시스테인 (C)은 크기가 현저하게 상이한 잔기이다. W는 큰 잔기인 반면, C는 상대적으로 작은 잔기이다. W 및 C, 둘 모두 극성 아미노산이기 때문에 이들은 예로서, 양자 공여와 같은 몇몇의 공통된 특징을 공유한다. W 잔기는 TGG에 의해, Cys는 TGC 및 TGT에 의해 코딩되는 바, 세번째 코돈에서의 특정의 전환 (G→C 또는 G→T)을 통해 W으로부터 C으로의, 또는 C으로부터 W으로의 미스센스 돌연변이를 수득할 수 있다. 그러한 전환은 사실상 동정된 바 있고, 이러한 돌연변이에 의해 생체 기능 및 활성이 변하였다 (예컨대, 유전성 유방암 및 난소암에서의 BRCA1 유전자 [Xiaoman and Jinghe, 1999]; 응고 인자 XII 결핍증 [Wada et al., 2003], 및 I형 고지방단백혈증에서 지단백 리파제 돌연변이 [Hoffmann et al., 2000] 참조).

그러므로, 상기 결과는 DMO는 독특하고, 공지 효소에 대하여 낮은 동일성을 가지만, W112는 다른 관련 철-황 옥시게나제에서 보존된다는 것을 지시하였다. 추가로, 112번 위치는 보존되는 2개의 기능성 도메인과 접해있다 (도 18). 또한, W에서 C으로의 전환은 전형적으로 생물학적 활성에 영향을 준다. 따라서, DMOc가 트랜스제닉 식물에서 발현되었을 때, DMOc를 통해 야생형 DMOw 효소보다 우수한 동역학 파라미터를 갖는 기능성 효소를 수득하였고, 디캄바에 대하여 높은 수준의 내성을 얻었다는 연구 결과는 특히 놀라운 것이었다.

실시예 5

엽록체 코딩 DMO는 높은 수준의 디캄바-내성을 수득하였다

DMO는 오직 엽록체 내에서만 작용할 수 있는지 여부를 측정하고, 화분 표류를 통한 "유전자 확산"을 제한할 수 있는지에 관한 가능성을 조사하기 위하여 상동성 재조합 및 항생제 내성에 대한 선별을 사용한 형질전환체 단리에 의해서 DMOc 유전자가 담배의 엽록체 게놈내로 통합될 수 있도록 pFMDVl 벡터 (예컨대, [Svab et al., 1990])에 기초하여 작제물을 생성하였다 (도 14). 이러한 작제물에서 DMOc 유전자 코딩 영역은 완전한 psbA 5' UTR 서열을 함유하는 psbA 엽록체 유전자 프로모터에 의해 구동된다. 항생제-내성 트랜스제닉 식물의 초기 DNA 블롯 분석법 (도 15A)을 통해 엽록체 게놈내 DMOc 트랜스진 (5.6 kb 밴드) 및 DMOc 유전자의 상동성 통합에 의해 대체된 본래의 유전자 영역 (3.3 kb 밴드), 둘 모두가 존재한다는 것이 입증되었다 (즉, 엽록체는 본래의 유전자 및 DMOc 트랜스진에 대하여 이종색소체였다). 항생제-함유 배지상에서 트랜스제닉 식물을 반복적으로 재생시키고 선별함으로써 DMOc 유전자 단편은 수반하되, 본래의 유전자 영역은 대체되지 않은 외관상으로 동종색소체인 엽록체를 수득하였다 (도 15B).

2개의 독립적으로 유도된 엽록체 형질전환체로부터 얻은 T₁, T₂ 및 T₃ 세대의 자손을 다양한 용량의 디캄바 처리에 대한 내성에 관하여 시험하였다. 이들 모두 높은 수준 내성을 나타내었다. 사실상, 엽록체 게놈 형질전환체는 28 kg/ha (25 lb/ac)의 비율로 디캄바를 분무했을 때 (하단에 있는 잎은 "오직 용매에 대해서만 손상"을 갖는 것을 제외하면) 외관상 손상은 나타내지 않았고 (도 16) 및 식물을 112 및 224 kg/ha로 극도로 높게 디캄바를 적용하여 처리하였을 때에는 단지 일시적인 손상이 관찰되었다. 상기와 같이 극도로 높은 수준에서 초기의 손상은 주로 계면활성제 및 디캄바가 그안에서 전달되어 지는 것인 용매의 다른 성분들에 의해 유발되며; 손상된 정단으로부터 성장하는 조직은 정상적인 표현형과 거의 정상인 것부터 정상적인 표현형을 나타내었고, 초기의 발육 이후에 성장 속도는 감소하지 않았으며, 보통의 질을 갖는 종자를 보통의 갯수로 생산할 수 있는 능력을 유지하였다.

결과는, 담배 엽록체에서 환원된 페레독신이 디캄바가 DCSA로 산화되는데 필요한 전자를 DMO에 주는 공여체일 수 있다는 가능성과 일치하였다. 이러한 가능성에 대한 직접적인 실험으로서 디캄바가 DCSA로 전환된다는 것을 지지할 수 있는 정제된 시금치 페레독신의 능력을 P. 말토필리아, 균주 DI-6으로부터 정제되거나, E. 콜라이로부터 과생산되고 정제된 DMO의 존재 및 부재하에서 조사하였다 (표 4). 디캄바 분해 또는 DCSA 출현에 의해 측정된 바, 시금치 또는 클로스트리듐(Clostridium)으로부터의 환원된 페레독신이 시험관내에서 전반적으로 DMO에 전자를 공여할 수 있다는 것이 결과적으로 입증되었다.

표 4A-B. 정제된 디캄바 모노옥시게나제는 시험관내에서 디캄바를 3,6-디클로로살리실산으로 전환시키는 것을 촉진시키는 전자의 공급원으로서 환원된 엽록체 페레독신 또는 환원된 클로스트리듐 페레독신을 사용할 수 있다.

도 2의 결과는 생산된 DMO 수준이 가변적이고, 때때로 DMOc 수준과 디캄바 내성 수준과는 밀접한 관계가 없다는 것을 나타내었지만, 결과적으로는 디캄바에 대하여 높은 수준의 내성을 일관되게 얻을 수 있는 능력이 입증되었다. 형질전환체에서 핵 국부화된 DMOc 유전자 및 엽록체 국부화된 DMOc 유전자, 둘 모두로부터 DMOc가 생산되는 것으로 나타났다. 핵 형질전환체에서는 어느 것도 총 단백질과 비교하여 월등히 높은 수준의 총 DMOc를 구성하진 못했고, 엽록체 형질전환체에서 DMOc의 양은 크게 다르지는 않았고, 때때로는 핵 형질전환체보다는 더 낮았다. 잎 조직 샘플의 무세포 추출물에서 상대적인 효소 활성의 추산이 좀더 높은 비율의, 엽록체에서 생산된 DMOc가 세포질에서 합성되고, 가정컨대 엽록체로 전달된 DMOc보다 활성이라는 것을 지시하였다.

분석된 모든 식물에서 페레독신 또는 리덕타제 유전자로 공형질전환하지 않고도 디캄바 내성을 이루었다. 상기 결과는 디캄바가 3,6-디클로로살리실산 (DCSA)로 전환될 수 있도록 하는 필수의 전자를 DMO로 전달할 수 있는 하나 이상의 분자를 식물이 함유하고 있다는 것을 입증하였다. 전이 펩티드 서열을 사용하는 엽록체에 대한 DMO의 초기의 표적화는 엽록체에서 풍부하게 이용할 수 있는 환원된 페레독신을 잠재적으로 이용가능하는 것을 목표로 삼았다. 이와 관련하여, 엽록체 펩티드 코딩 서열이 존재하지 않는 DMOc 유전자 작제물로 담배 식물을 형질전환하였을 때 예상밖으로 디캄바를 사용한 발아후 처리에 대하여 내성을 띤 식물을 수득하였다는 것은 흥미로운 것이다. 그럼에도 불구하고 소수의 T₁ 세대 식물을 사용한 제한된 시험으로부터 얻은 결과는 이들 트랜스제닉 식물을 통해 관찰된 내성 수준은 전이 펩티드를 함유하는 DMOc를 생산하는 담배 식물을 통해 관찰된 내성 수준보다 평균적으로 미세하게 좀 더 낮았다는 것을 지시하였다. 이러한 연구 결과는 생산적으로 DMO에 전자를 공여할 수 있는 트랜스제닉 식물내 분자와 관련하여 흥미로운 의문점을 불러 일으킨다. 엽록체 게놈내로 통합된 DMOc 유전자로부터 내부적으로 DMO를 생산하는 동종색소체인 엽록체는 극도로 높은 수준의 디캄바에 대하여 내성을 나타내었다는 사실 (도 16)과, 정제된 DMO가 환원된 시금치 엽록체 페레독신과 함께 시험관내에서 작용할 수 있다는 사실 (표 4), 이 두가지 모두는 엽록체 페레독신이 생산적으로 DMO와 상호작용함으로써 전자가 전달될 수 있도록 할 수 있다라는 것을 제안한다. 그러나, 엽록체 전이 펩티드 코딩 서열이 존재하지 않는 핵 유전자로부터 생산되는 DMO에 대한 전자 공급원은 분명치 않다. 페레독신이 식물 엽록체 밖에는 존재하지 않는다고 가정하면, 미지의 세포질 단백질이 DMO에 안정적으로 전자를 공급할 수 있다는 가능성을 고려하여야 한다. 별법으로, DMO 그 자체는 충분한 DMO가 엽록체로 진입할 수 있도록 함으로써 디캄바 처리후 세포내 이동하는 디캄바로부터 보호할 수 있도록 하는 무상의 엽록체 전이 펩티드를 함유할 수 있다.

본원에서 개시하고 주장한 조성물들 및/또는 방법들 모두는 본 개시 내용에 비추어 부당한 실험없이도 이루어질 수 있고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물들 및 방법들은 바람직한 실시태양에 의해 기술되어 있지만, 본 발명의 개념, 정신, 및 범주를 벗어나지 않으면서 본원에 기술된 조성물들 및/또는 방법들과, 방법의 단계에 있어서 또는 방법의 단계의 순서에 있어서 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게는 자명할 것이다. 더욱 특히, 화학적으로 그리고 생리학적으로, 두가지 모두에 대하여 관련된 특정 물질은 본원에 기술된 물질로 치환될 수 있고, 동시에 동일하거나 유사한 결과를 달성할 수 있다는 것은 자명할 것이다. 당업자에게는 자명한, 상기와 같은 유사한 치환 및 변형은 모두 첨부된 청구의 범위에서 정의된 바와 같은 본 발명의 정신, 범주 및 개념내 포함되는 것으로 간주된다.

참고 문헌

하기 열거하는 참고 문헌은 본원에서 사용되는 방법론, 기법, 및/또는 조성물들을 보충하거나, 설명하거나, 그에 대한 배경을 제공하거나, 그를 교시하기 위한 것이라는 점에서 본원에서 참고로 인용된다.

미국 특허 4,554,101; 미국 특허 4,940,838; 미국 특허 5,015,580; 미국 특허 5,017,692 미국 특허 5,229,114; 미국 특허 5,304,730; 미국 특허 5,322,938; 미국 특허 5,352,605; 미국 특허 5,359,142; 미국 특허 5,362,865; 미국 특허 5,378,619; 미국 특허 5,384,253; 미국 특허 5,445,962; 미국 특허 5,463,175; 미국 특허 5,464,763; 미국 특허 5,508,184; 미국 특허 5,512,466; 미국 특허 5,516,671; 미국 특허 5,530,196; 미국 특허 5,538,880; 미국 특허 5,543,576; 미국 특허 5,550,318; 미국 특허 5,552,299; 미국 특허 5,567,600; 미국 특허 5,567,862; 미국 특허 5,591,616; 미국 특허 5,633,435; 미국 특허 5,635,055; 미국 특허 5,641,876; 미국 특허 5,659,122; 미국 특허 5,689,041; 미국 특허 5,689,052; 미국 특허 5,716,837; 미국 특허 5,728,925; 미국 특허 5,750,876; 미국 특허 5,763,241; 미국 특허 5,763,245; 미국 특허 5,773,696; 미국 특허 5,804,425; 미국 특허 5,824,877; 미국 특허 5,837,848; 미국 특허 5,850,019; 미국 특허 5,850,023; 미국 특허 5,866,775; 미국 특허 5,869,720; 미국 특허 5,880,275; 미국 특허 5,942,658; 미국 특허 5,942,664; 미국 특허 5,958,745; 미국 특허 5,959,091; 미국 특허 5,981,834; 미국 특허 5,981,840; 미국 특허 5,985,605; 미국 특허 5,998,700; 미국 특허 6,011,199; 미국 특허 6,013,864; 미국 특허 6,015,940; 미국 특허 6,023,013; 미국 특허 6,051,753; 미국 특허 6,063,597; 미국 특허 6,063,756; 미국 특허 6,072,103; 미국 특허 6,080,560; 미국 특허 6,093,695; 미국 특허 6,107,549; 미국 특허 6,110,464; 미국 특허 6,121,436; 미국 특허 6,140,075; 미국 특허 6,140,078; 미국 특허 6,153,814; 미국 특허 6,156,573; 미국 특허 6,160,208; 미국 특허 6,166,292; 미국 특허 6,171,640; 미국 특허 6,175,060; 미국 특허 6,177,611; 미국 특허 6,177,615; 미국 특허 6,215,048; 미국 특허 6,221,649; 미국 특허 6,222,098; 미국 특허 6,225,114; 미국 특허 6,228,623; 미국 특허 6,228,992; 미국 특허 6,232,526; 미국 특허 6,235,971; 미국 특허 6,242,241; 미국 특허 6,248,536; 미국 특허 6,248,876; 미국 특허 6,252,138; 미국 특허 6,271,443; 미국 특허 6,281,016; 미국 특허 6,284,949; 미국 특허 6,294,714; 미국 특허 6,313,378; 미국 특허 6,316,407; 미국 특허 6,326,351; 미국 특허 6,372,211; 미국 특허 6,380,462; 미국 특허 6,380,466; 미국 특허 6,384,301; 미국 특허 6,399,330; 미국 특허 6,399,861; 미국 특허 6,403,865; 미국 특허 6,423,828; 미국 특허 6,426,446; 미국 특허 6,426,447; 미국 특허 6,429,357; 미국 특허 6,429,362; 미국 특허 6,433,252; 미국 특허 6,437,217; 미국 특허 6,441,277; 미국 특허 6,444,876; 미국 특허 6,448,476; 미국 특허 6,459,018; 미국 특허 6,468,523; 미국 특허 6,476,295; 미국 특허 6,483,008; 미국 특허 6,489,461; 미국 특허 6,495,739; 미국 특허 6,501,009; 미국 특허 6,506,962; 미국 특허 6,518,488; 미국 특허 6,521,442; 미국 특허 6,531,648; 미국 특허 6,537,750; 미국 특허 6,537,756; 미국 특허 6,538,109; 미국 특허 6,538,178; 미국 특허 6,538,179; 미국 특허 6,538,181; 미국 특허 6,541,259; 미국 특허 6,555,655; 미국 특허 6,573,361; 미국 특허 6,576,818; 미국 특허 6,589,767; 미국 특허 6,593,293; 미국 특허 6,596,538; 미국 특허 6,608,241; 미국 특허 6,617,496; 미국 특허 6,620,988; 미국 특허 6,635,806; 미국 특허 6,639,054; 미국 특허 6,642,030; 미국 특허 6,645,497; 미국 특허 6,653,280; 미국 특허 6,653,530; 미국 특허 6,657,046; 미국 특허 6,660,849; 미국 특허 6,663,906; 미국 특허 6,686,452; 미국 특허 6,706,950; 미국 특허 6,713,063; 미국 특허 6,716,474; 미국 특허 6,723,837; 미국 특허 6,723,897; 미국 특허 6,770,465; 미국 특허 6,774,283; 미국 특허 6,803,501; 미국 특허 6,809,078; 미국 특허 6,812,379; 미국 특허 6,822,141; 미국 특허 6,828,475; 미국 특허 번호 제7,022,896; 미국 특허 공개 2003/0028917; 미국 특허 공개 2003/0135879; 미국 특허 공개 2003/01403641; 미국 특허 Serial 09/757,089; 미국 특허 RE37,543; 미국 특허 RE38,446

SEQUENCE LISTING <110> CLEMENTE, THOMAS E. DUMITRU, RAZVAN FENG, PAUL C. C. FLASINSKI, STAN WEEKS, DONALD P. <120> MODIFIED DMO ENZYME AND METHODS OF ITS USE <130> MONS:093WO <140> UNKNOWN <141> 2007-06-06 <150> 11/758,657 <151> 2007-06-05 <150> 60/811,152 <151> 2006-06-06 <160> 24 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 1 Met Ala Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu 1 5 10 15 Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu 20 25 30 Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile 35 40 45 Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly 50 55 60 His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln 65 70 75 80 Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn 85 90 95 Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Cys 100 105 110 Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly 115 120 125 Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly 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Synthetic Peptide <400> 9 Glu Asp Phe Cys Pro His Arg Gly Ala Pro Leu Ser Leu Gly Phe Val 1 5 10 15 Arg Asp Gly Val Leu Val Cys Gly Tyr His Gly Leu Glu Met Gly Cys 20 25 30 Asn Gly Lys Pro Ala Gly Met Pro Gly Gln Arg Val Gly Gly Phe Pro 35 40 45 Ser Ile Arg Ser Phe Pro Ala Val Glu 50 55 <210> 10 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 10 Glu Asp Phe Cys Pro His Arg Gly Ala Pro Leu Ser Leu Gly Phe Val 1 5 10 15 Arg Asp Gly His Leu Val Cys Gly Tyr His Gly Leu Thr Met Lys Ala 20 25 30 Asp Gly Lys Cys Ala Ser Met Pro Gly Gln Arg Val Gly Gly Phe Pro 35 40 45 Cys Ile Arg Gln Phe Pro Val Val Glu 50 55 <210> 11 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 11 Glu Asp Phe Cys Pro His Arg Gly Ala Pro Leu Ser Leu Gly Phe Val 1 5 10 15 Arg Asp Gly Gln Leu Val Cys Gly Tyr His Gly Leu Glu Met Gly Cys 20 25 30 Asp Gly Lys Cys Ser Ser Met Pro Gly Gln Arg Val Arg Gly Phe Pro 35 40 45 Ser Ile His Ala Tyr Pro Val Val Glu 50 55 <210> 12 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 12 Glu Asp Ala Cys Trp His Arg Leu Val Pro Leu Ser Lys Gly Arg Leu 1 5 10 15 Glu Gly Asp Thr Val Val Cys Gly Tyr His Gly Leu Lys Phe Asn Pro 20 25 30 Gln Gly Arg Cys Thr Tyr Met Pro Ser Gln Glu Thr Ile Asn Pro Ser 35 40 45 Ala Cys Val Arg Ser Tyr Pro Val Val Glu 50 55 <210> 13 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 13 Glu Asp Ala Cys Trp His Arg Leu Val Pro Leu Ser Lys Gly Arg Leu 1 5 10 15 Glu Gly Asp Thr Val Val Cys Gly Tyr His Gly Leu Lys Tyr Asn Ala 20 25 30 Gln Gly Arg Cys Thr Phe Met Pro Ser Gln Glu Thr Ile Asn Pro Ser 35 40 45 Ala Cys Val Arg Ala Tyr Pro Val Val Glu 50 55 <210> 14 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 14 Lys His Ser Leu Ile Trp Val Trp Met Gly Glu Gln Ala Ala Ala Asp 1 5 10 15 Pro Ser Val Ile Pro Asp Phe Ser Met Leu Asp Pro Asp Ser Gly Phe 20 25 30 Gln Val Ser Arg Arg Asp Trp Leu His Met Asp Ala Ser Tyr Asp Leu 35 40 45 Val Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Ser His Thr Ala 50 55 60 <210> 15 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 15 Lys His Thr Gly Leu Trp Phe Trp Pro Gly Asp Ala Asp Arg Ala Asp 1 5 10 15 Pro Ala Leu Ile Pro Asp Phe Gly Phe Leu Asp Val Glu Arg Pro Leu 20 25 30 His Arg Gly His Leu Lys Met Asp Ala Gly Tyr Glu Leu Val Thr Asp 35 40 45 Asn Leu Met Asp Leu Ser His Ala Glu 50 55 <210> 16 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 16 Arg His Ala Leu Leu Trp Ile Trp Met Gly Asp Ala Ala Lys Ala Asp 1 5 10 15 Pro Ala Ser Ile Pro Asp Phe Ser Trp Leu Ser Asp Pro Arg Trp Glu 20 25 30 Ala Val Arg Gly Ala Thr Val Ala Glu Gly His Phe Glu Leu Tyr Ser 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gcaataatgg agccatgacg 60 taagggctta cgcccatacg aaataattaa aggctgatgt gacctgtcgg tctctcagaa 120 cctttacttt ttatgtttgg cgtgtatttt taaatttcca cggcaatgac gatgtgaccc 180 aacgagatct tgagccaatc aaagaggagt gatgtagacc taaagcaata atggagccat 240 gacgtaaggg cttacgccca tacgaaataa ttaaaggctg atgtgacctg tcggtctctc 300 agaaccttta ctttttatat ttggcgtgta tttttaaatt tccacggcaa tgacgatgtg 360 acctgtgcat ccgctttgcc tataaataag ttttagtttg tattgatcga cacggtcgag 420 aagacacggc cat 433

Claims

a) 서열 번호: 1의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및

b) 서열 번호: 2의 서열을 포함하는 핵산 분자

로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 분자.
제1항에 있어서, 핵산 분자가 플라스미드 pKLP36-TEV-TP-DMOc (ATCC 수탁 번호 PTA-7357)에 의해 코딩된 디캄바 모노옥시게나제를 코딩하는 것인 핵산 분자.
프로모터에 작동가능하게 연결된,

a) 서열 번호: 1의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및

b) 서열 번호: 2의 서열을 포함하는 핵산 분자

로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 분자

를 포함하는 DNA 작제물.
제3항에 있어서, 프로모터가 식물 세포에서 가동되는 것인 작제물.
제3항에 있어서, 핵산 분자가 엽록체 전이 펩티드에 작동가능하게 연결된 것인 작제물.
삭제
제1항의 핵산 분자로 형질전환된 식물 세포.
제7항에 있어서, 식물 세포가 쌍자엽 식물 세포인 세포.
제7항에 있어서, 식물 세포가 단자엽 식물 세포인 세포.
제8항에 있어서, 쌍자엽 식물 세포가 대두, 목화, 옥수수 또는 평지씨 식물 세포인 세포.
제7항의 세포를 포함하는 식물 조직 배양물.
제1항의 핵산 분자로 형질전환된 트랜스제닉 식물.
제12항에 있어서, 식물이 쌍자엽 식물인 트랜스제닉 식물.
제12항에 있어서, 식물이 단자엽 식물인 트랜스제닉 식물.
제12항에 있어서, 식물이 대두, 목화, 옥수수 또는 평지씨 식물인 트랜스제닉 식물.
제3항의 작제물을 식물내로 도입시키는 것을 포함하는, 디캄바 내성 식물을 생산하는 방법.
제16항에 있어서, 출발 식물 세포를 안정적으로 형질전환시키고, 세포를 상기 디캄바 내성 식물로 재생시킴으로써, 제3항의 작제물을 식물내로 도입시키는 것을 포함하는 방법.
제16항에 있어서, 디캄바 내성 식물이 모체 식물을 그 자체 또는 제2 식물과 교배시킴으로써 생산되며, 여기서, 모체 식물 또는 제2 식물 또는 둘 다는 형질전환 작제물을 포함하고, 디캄바 내성 식물은 상기 모체 식물 또는 제2 식물 또는 둘 다로부터 형질전환 작제물을 유전받는 것인 방법.
잡초 성장을 제어하는데 유효한 양의 디캄바 제초제를 작물 성장 환경에 적용시키는 것을 포함하는, 제12항의 식물 또는 그의 종자를 포함하는 작물 성장 환경에서 잡초 성장을 제어하는 방법.
제19항에 있어서, 디캄바 제초제를 작물 성장 환경 위에 적용시키는 것인 방법.
제19항에 있어서, 디캄바 제초제의 양이 제12항의 식물 또는 그의 종자는 손상시키지 않고, 유전자형이 제12항의 식물과 동일하나 제1항의 핵산은 존재하지 않는 식물은 손상시키는 것인 방법.
a) 제12항의 식물, 또는 세포, 배아, 미성숙 배아, 분열 조직 세포, 미성숙 수염, 소포자, 화분, 잎, 꽃밥, 뿌리, 근단, 꽃 및 종자로부터 선택되는 그의 일부분을 수득하고;

b) 상기 식물 또는 그의 일부분으로부터 식품, 사료 또는 산업 제품을 제조하는 것을 포함하는, 식품, 사료 또는 산업 제품을 생산하는 방법.
제22항에 있어서, 식품 또는 사료가 오일, 으깬 곡물(meal), 곡물, 전분, 소맥분, 또는 단백질인 방법.
제22항에 있어서, 산업 제품이 생물 연료, 섬유, 산업용 화학약품, 약제, 또는 건강 보조 식품인 방법.