MXPA06012634A

MXPA06012634A - Nuevos genes con resistencia a los herbicidas.

Info

Publication number: MXPA06012634A
Application number: MXPA06012634A
Authority: MX
Inventors: Donald J Merlo; Justin M Lira; Terry R Wright; Nicole Hopkins
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2004-04-30
Filing date: 2005-05-02
Publication date: 2007-02-08
Also published as: EP2298901B1; CA2897475C; ES2435247T5; CA2563206A1; US20210147867A1; DK2298901T4; US11149283B2; DK2298901T3; WO2005107437A3; PL2298901T5; EP2298901A2; EP1740039B1; ES2389843T3; EP2308977A2; PT1740039E; WO2005107437A2; US10450549B2; EP1740039A2; BRPI0509460A; ES2406809T3

Abstract

La invencion en cuestion proporciona plantas novedosas que son no solo resistentes a 2,4-D y otros herbicidas de fenoxi auxina, sino tambien a herbicidas arilofenoxipropionato; antes, no habia expectativa o sugerencia que una planta con ambas de estas propiedades ventajosas pudiera ser producida mediante la introduccion de un solo gen; la invencion en cuestion tambien incluye plantas que producen una o mas enzimas de la invencion en cuestion solas o "apiladas" juntas con otro gen de resistencia a herbicida, preferiblemente un gen de resistencia a glifosato, para proporcionar un control mas amplio y mas robusto de la maleza, una mayor flexibilidad a tratamiento y mejores opciones de manejo de resistencia a herbicidas; mas especificamente, enzimas y genes preferidos para uso de conformidad con la invencion en cuestion se les llama aqui genes y proteinas AAD (ariloxialcanoato disoxigenasa); ninguna enzima disoxigenasa dependiente de a-cetoglutarato se habia reportado con la capacidad de degradar herbicidas de diferentes clases quimicas y modos de accion; el descubrimiento altamente novedoso es la base de oportunidades significativas sobre caracteristicas de cultivos tolerantes a herbicidas asi como el desarrollo de tecnologia seleccionable de marcador; la invencion en cuestion tambien incluye metodos relacionados para controlar malezas; la invencion en cuestion permite el uso de combinaciones novedosas de herbicidas en formas nuevas; aun mas, la invencion en cuestion proporciona metodos novedosos para prevenir la formacion de, y control de, malezas que son resistentes (o naturalmente mas tolerantes) a uno o mas herbicidas como glifosato.

Description

NUEVOS GENES CON RESISTENCIA A LOS HERBICIDAS REFERENCIA RECIPROCA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama prioridad a la Solicitud Provisional de los E.U.A. No. de serie 60/567,052, presentada el 30 de abril de 2004.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las malezas pueden agotar rápidamente el suelo de nutrientes valiosos necesarios para cultivos y otras plantas deseables. Existen muchos tipos diferentes de herbicidas utilizados actualmente para el control de malezas. Un herbicida extremadamente popular es el glifosato. Se han desarrollado cultivos, tales como maíz, soja, cañóla, algodón, remolacha, trigo, césped y arroz, que son resistentes al glifosato. De este modo, se pueden fumigar campos con maíz resistente al glifosato activamente creciente, por ejemplo, para controlar las malezas sin dañar significativamente las plantas de maíz. Con la introducción a mediados de la década de 1990 de cultivos tolerantes al glifosato diseñados genéticamente (GTCs), los agricultores dispusieron de una herramienta simple, conveniente, flexible y de bajo costo para controlar un amplio espectro de malezas de hoja ancha y gramíneas sin parangón en la agricultura. En consecuencia, los productores adoptaron rápidamente los GTCs y en muchos casos abandonaron muchas de las prácticas agronómicas más aceptadas tales como la rotación de cultivos, acción por rotación con modalidad herbicida, mezclado en tanque, incorporación de mecánica con control químico y de cultivo de malezas. La soja, algodón, maíz y cañóla normalmente tolerantes al glifosato están disponibles en el comercio en los Estados Unidos y en otros sitios del Hemisferio Occidental. Más GTCs (por ejemplo trigo, arroz, remolacha, césped, etc.) están suspendidos en su introducción a la espera de su aceptación por el mercado global. Muchas otras especies resistentes al glifosato están en etapas que van de la experimentación al desarrollo (por ejemplo, alfalfa, caña de azúcar, girasol, remolacha, habas, zanahoria, pepino, lechuga, cebolla, frutilla, tomate y tabaco; especies forestales tales como chopo y copalillo; y especies hortícolas tales como caléndulas, petunias y begonias; ver sitio web "isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm, 2005"). Además, el costo del glifosato ha disminuido drásticamente en los años recientes hasta el punto que pocos programas de control de malezas convencionales pueden competir eficazmente en precio y rendimiento con los sistemas GTC de glifosato. El glifosato ha sido utilizado con éxito en áreas consumidas totalmente por el fuego y otras áreas no cultivadas para el control de vegetación total durante más de 15 años. En muchos casos, como con los GTCs, el glifosato ha sido utilizado de 1 a 3 veces por año durante 3, 5, 10, hasta 15 años en una fila. Estas circunstancias han conducido a un exceso de confianza en el glifosato y a la tecnología de GTC y han colocado una pesada presión de selección sobre las especies de malezas nativas para plantas que son naturalmente más tolerantes al glifosato o que han desarrollado un mecanismo para resistir la actividad herbicida del glifosato. El uso extensivo de los programas de control de malezas sólo con glifosato está dando por resultado la selección de malezas resistentes al glifosato, y está seleccionando la propagación de especies de malezas que son inherentemente más tolerantes al glifosato que la mayoría de las especies atacadas (es decir, cambios de malezas). (Ng et al., 2003; Simarmata et al., 2003; Lorraine-Colwill et al., 2003; Sfiligoj, 2004; Miller et al., 2003; Heap, 2005; Murphi eí al., 2002; Martin eí al., 2002.) Si bien el glifosato ha sido utilizado ampliamente de manera global durante más de 15 años, sólo se ha informado de un puñado de malezas que han desarrollado resistencia al glifosato (Heap, 2005); sin embargo, la mayoría de estas han sido identificadas en los pasados 3 a 5 años. Las malezas resistentes incluyen tanto especies gramíneas como de hoja ancha — Lolium rígidum, Lolium multiflorum, Ele?sine indica, Ambrosia artemisiifolia, Conyza canadensis, Conyza bonariensis, y Plantago lanceolata. Además, las malezas que no han sido previamente un problema agronómico previo al amplio uso de los GTCs ahora se están tomando más frecuentes y difíciles de controlar en el contexto de los GTCs, que comprenden >80% del área cultivada de algodón y soja en Estados Unidos y >20% del área cultivada de maíz en Estados Unidos (Gianessi, 2005). Estos cambios de malezas se están produciendo en forma predominante (aunque no exclusiva) con las malezas de hoja ancha difíciles de controlar. Algunos ejemplos incluyen especies de Ipomoea, Amaranthus, Chenopodium, Taraxacum y Commelina. En áreas donde los agricultores se encuentran con malezas resistentes al glifosato o un cambio a especies de malezas más difíciles de controlar, los agricultores pueden compensar las debilidades del glifosato con el mezclado en tanque o alternando con otros herbicidas que controlen las malezas perdidas. Un compañero de tanque de mezcla popular y eficaz para controlar especies de hoja ancha en muchos casos ha sido el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). El 2,4-D ha sido utilizado para uso agronómico y en situaciones de no cultivo para el control de malezas de hoja ancha de amplio espectro durante más de 60 años. Se han informado casos individuales de especies más tolerantes, pero el 2,4-D sigue siendo uno de los herbicidas más ampliamente utilizados en forma global. Una limitación al uso adicional del 2,4-D es que su selectividad en cultivos dicotiledóneos como la soja o el algodón es muy baja, y por lo tanto el 2,4-D no se utiliza típicamente en (y en general ni en las cercanías de) cultivos dicotiledóneos sensibles. Además, el uso del 2,4-D en cultivos de malezas está limitado de algún modo por la naturaleza del daño que le pueda ocurrir al cultivo. El 2,4-D en combinación con el glifosato ha sido utilizado para dar un tratamiento de "quemado" más fuerte antes de la plantación directa de soja y algodón; sin embargo, debido a la sensibilidad de estas especies dicotiledóneas al 2,4-D, estos tratamientos de "quemado" deben ocurrir al menos 14-30 días antes de la plantación (Agriliance, 2003). El 2,4-D está dentro de la clase de herbicidas de los fenoxiácidos, como lo son el MCPA, mecoprop, y diclorprop. El 2,4-D ha sido utilizado en muchos cultivos monocotiledóneos (tales como maíz, trigo, y arroz) para el control selectivo de malezas de hoja ancha sin dañar seriamente las plantas de cultivo deseadas. El 2,4-D es un derivado de auxina sintético que actúa para desregular la homeostasis hormonal celular normal e impedir el crecimiento equilibrado y controlado; sin embargo, el modo exacto de acción todavía no se conoce. El 2,4-D tiene diferentes niveles de selectividad sobre ciertas plantas (por ejemplo las dicotiledóneas son más sensibles que los pastos). El metabolismo diferencial del 2,4-D por diferentes plantas es una explicación para los variados niveles de selectividad. En general, las plantas metabolizan lentamente el 2,4-D, de modo que la respuesta variada de la planta al 2,4-D puede explicarse mejor probablemente por la diferente actividad en el (los) sitio(s) blanco. (WSSA, 2002). El metabolismo vegetal del 2,4-D se produce típicamente mediante un mecanismo de dos fases, típicamente hidroxilación seguida de conjugación con aminoácidos o glucosa (WSSA, 2002). A lo largo del tiempo, las poblaciones microbianas han desarrollado una vía eficiente y alternativa para la degradación de este xenobiótico particular, que da por resultado la completa mineralización del 2,4-D. Aplicaciones sucesivas del herbicida seleccionan microorganismos que pueden utilizar el herbicida como fuente de carbono para el crecimiento, dándoles una ventaja competitiva en el suelo. Por esta razón, el 2,4-D normalmente se formula con un tiempo de vida útil en el suelo relativamente corto, y no se encuentran efectos significativos remanentes para los cultivos subsiguientes. Esto se agrega a la utilidad herbicida del 2,4-D. Un organismo que ha sido investigado extensamente por su capacidad de degradar el 2,4-D es Ralstonia eutropha (Streber et al., 1987). El gen que codifica para el primer paso enzimático en la vía de mineralización es el tfdA. Ver la Patente Estadounidense No. 6,153,401 y Acceso a GENBANK No. M16730. El tfdA cataliza la conversión del ácido 2,4-D a diclorofenol (DCP) mediante una reacción de dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato (Smejkal eí al., 2001). El DCP tiene poca actividad herbicida en comparación con el 2,4-D. El tfdA ha sido utilizado en plantas transgénicas para impartir resistencia al 2,4-D en plantas dicotiledóneas (por ejemplo algodón y tabaco) normalmente sensibles al 2,4-D (Streber eí al. (1989), Lyon eí al. (1989), Lyon (1993) y Patente Estadounidense No. 5,608,147). Una gran cantidad de genes del tipo tfdA que codifican proteínas capaces de degradar al 2,4-D han sido identificados del medio ambiente y depositados en la base de datos del Genbank. Muchos homólogos son similares al tfdA (>85% de identidad de aminoácidos) y tienen propiedades enzímáticas similares al tfdA. Sin embargo, existe una cantidad de homólogos que tienen una identidad significativamente más baja con el tfdA (25-50%), aunque tienen los residuos característicos asociados con las Fe+2 dioxigenasas del tipo a-cetoglutarato dioxigenasa. Por lo tanto no es obvio cuáles son las especificidades de sustrato de estas dioxigenasas divergentes. Un único ejemplo con homología baja al tfdA (28% de identidad de aminoácidos) es el rdpA del Sphingobium herbicidovorans (Kohier eí al., 1999, Westendorf eí al., 2002). Se ha demostrado que esta enzima cataliza la primera etapa en la mineralización del (R)-diclorprop (y otros ácidos (R)-fenoxipropiónicos) como así también del 2,4-D (un ácido fenoxiacético) (Westendorf eí al., 2003). Si bien los organismos que degradan el ácido fenoxipropiónico se describieron algún tiempo atrás, hasta hace poco tiempo se ha hecho poco progreso en la caracterización de esta vía (Horvath eí al., 1990). Otra complicación a la degradación del diclorprop es la estereoespecificidad (R vs. S) involucrada tanto en la recaptación (Kohier, 1999) como en la oxidación inicial del diclorprop (Westendorf eí al., 2003). La expresión heteróloga del rdpA en otros microorganismos, o la transformación de este gen en plantas, no ha sido informada hasta el momento. La literatura se ha dedicado esencialmente a los homólogos próximos al tfdA que degradan esencialmente los ácido fenoxiacéticos aquirales (por ejemplo el 2,4-D). El desarrollo de nuevas tecnologías de cultivos tolerantes a herbicidas (HTC) ha sido de éxito limitado debido principalmente a la eficacia, bajo costo y conveniencia de los GTCs. En consecuencia, se ha dado una proporción muy elevada de adopción de los GTCs entre los productores. Esto resultó un incentivo muy bajo para desarrollar nuevas tecnologías de HTC.

Las subestructuras químicas de ariloxialcanoato son una entidad común de muchos herbicidas comercializados, incluyendo las fenoxi auxinas (tales como 2,4-D y diclorprop), piridiloxi auxinas (tales como fluroxipir y triclopir), ariloxifenoxipropionatos (AOPP) inhibidores de acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa) (tales como haloxifop, quizalofop, y diclofop), e inhibidores de fenoxiacetato protoporfirinógeno 5-sustituido oxidasa IX (tales como piraflufen y flumiclorac). Sin embargo, estas clases de herbicidas son todas bastante distintas, y no existe evidencia en la literatura actual de vías comunes de degradación entre estas clases químicas. El descubrimiento de una enzima multifuncional para la degradación de herbicidas que cubra múltiples modos sería tanto único como valioso como una característica de los HTC.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención aporta nuevas plantas que no sólo son resistentes al 2,4-D, sino además a los herbicidas tipo AOPP. Hasta ahora, no había expectativa o sugerencia de que se pudiera producir una planta con ambas propiedades ventajosas mediante la introducción de un gen único. La presente invención además incluye plantas que producen una o más enzimas de la presente invención "apiladas" junto con uno o más genes con resistencia al herbicida, incluyendo, pero sin limitación, genes con resistencia al glifosato, imidazolinona y glufosinato, para aportar plantas tolerantes a los herbicidas compatibles con opciones más amplias y más fuertes de manejo de resistencia a los herbicidas y control de malezas. La presente invención además incluye métodos y composiciones que utilizan homólogos de los genes y proteínas ejemplificados en la presente invención. En algunas modalidades, la invención aporta plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas tolerantes al 2,4-D, AOPP, y uno o más herbicidas comerciales (por ejemplo glifosato, imidazolinonas, glufosinato, sulfonilureas, dicamba, bromoxinil y otros). Además se revelan vectores que comprenden secuencias de ácidos nucleicos responsables de tal tolerancia herbicida, como son los métodos para utilizar tales plantas tolerantes y combinaciones de herbicidas para el control y prevención de cambios de la población de malezas. La presente invención permite que las nuevas combinaciones de herbicidas se utilicen en formas nuevas. Además, la presente invención aporta nuevos métodos para prevenir el desarrollo de, y el control de, cepas de malezas que son resistentes a uno o más herbicidas tales como el glifosato. La presente invención permite nuevos usos de nuevas combinaciones de herbicidas y cultivos, incluyendo la aplicación de preplantas a un área a ser plantada inmediatamente antes de cultivarse con semillas para plantas que de otro modo serían sensibles a ese herbicida (tal como 2,4-D). La presente invención se refiere en parte a la identificación de una enzima que no sólo puede degradar el 2,4-D, sino además posee sorprendentemente nuevas propiedades, que distinguen a la enzima de la presente invención de las proteínas tfdA conocidas previamente, por ejemplo.

Más específicamente, la presente invención se refiere al uso de una enzima que es capaz de degradar tanto los herbicidas 2,4-D como AOPP, de una manera enantioespecífica. No se ha informado previamente de ninguna enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato que tenga la capacidad de degradar herbicidas de diferentes clases químicas y modos de acción. La enzima y el gen preferidos para su uso de acuerdo con la presente invención se denominan AAD-1 (AriloxiAlcanoato Dioxigenasa). Este descubrimiento muy novedoso es la base de la característica significativa de los HTC y de las oportunidades de los marcadores seleccionables. No había motivación anterior para producir plantas que contengan un gen AAD-1 (preferentemente un polinucleótido de AAD-1 que tiene una secuencia optimizada para la expresión en uno o más tipos de plantas, según se ejemplifica en la presente invención), y no había expectativas de que tales plantas pudiesen producir eficazmente una enzima AAD-1 para obtener las plantas resistentes no sólo a herbicidas tipo fenoxiácido (tales como 2,4-D) sino además a herbicidas tipo AAOP (tales como quizalofop, haloxifop, eíc). De este modo la presente invención aporta muchas ventajas que hasta ahora se creían imposibles en la técnica. Esta invención además se refiere en parte a la identificación y al uso de genes que codifican las enzimas ariloxialcanoato dioxigenasa que son capaces de degradar los herbicidas del tipo fenoxi auxina y ariloxifenoxipropionato. Los métodos para seleccionar las proteínas que poseen estas actividades están dentro del alcance de la presente invención.

De este modo, la presente invención incluye la degradación del ácido 2,4-diclorofenoxiacético, otros herbicidas tipo fenoxialcanoato auxina y herbicidas tipo ariloxifenoxipropionato mediante una enzima AAD-1 expresada en forma recombinante. La presente invención además incluye métodos para el control de malezas donde dichos métodos comprenden la aplicación de uno o más herbicidas tipo AOPP, fenoxi auxina u otros herbicidas tipo ariloxialcanoato a las plantas que contienen un gen AAD-1. La presente invención además aporta métodos para utilizar un gen AAD-1 como marcador seleccionable para identificar células de plantas y plantas completas transformadas con AAD-1, que incluye opcionalmente uno, dos, o más genes exógenos insertados simultáneamente en células de plantas blanco. Los métodos de la presente invención incluyen seleccionar células transformadas que son resistentes a niveles apropiados de un herbicida. La presente invención además incluye métodos para preparar un polipéptido, que tiene la actividad biológica de la ariloxialcanoato dioxigenasa, cultivando plantas y/o células de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la pérdida de actividad herbicida de una solución de 2,4-D tratada con AAD-1. La Figura 2 muestra la pérdida de actividad herbicida de una solución de haloxifop tratada con AAD-1.

La Figura 3 muestra la producción de 2,4-dicIorofenol por AAD-1 recombinante. Las Figuras 4A y 4B muestran la producción de fenol por AAD-1 recombinante a partir de varios sustratos herbicidas. La Figura 5 muestra la velocidad de reacción con AAD-1 respecto de la concentración de sustrato para cuatro sustratos herbicidas. Las Figuras 6A y 6B muestran que AAD-1 (v3) se expresó igualmente en hojas de Arabidopsis de diferentes edades pero continuó acumulándose a lo largo de los 25 días del experimento. Las plantas que no se fumigaron con el herbicida 2,4-D (panel A) expresaron un poco más de AAD-1 (v3) que las que habían sido fumigadas (panel B). Las barras representan la media ± SEM de cinco hojas de cinco plantas diferentes, con la expresión porcentual de AAD-1 (v3) normalizada a la proteína soluble total. Las barras claras representan las terceras hojas jóvenes (N-3) recolectadas de la parte superior, las barras oscuras representan las quintas hojas más viejas de la parte inferior. Las Figuras 7A, 7B y 7C muestran el daño de las plantas de Arabidopsis después del tratamiento con 2,4-D. Cuatro líneas diferentes se trataron, cada una, con cuatro dosis diferentes de 2,4-D y el daño se midió 4 (panel A) y 14 (panel B) días después del tratamiento. Además se determinó su expresión de AAD-1 (v3) en hojas utilizando ELISA (panel C). Los resultados fueron la media ± SEM de cinco hojas de cinco plantas diferentes que recibieron el mismo tratamiento.

La Figura 8 ilustra que la Arabidopsis (AAD-1 + EPSPS) transformada con pDAB3230 muestra un nivel de tolerancia al glifosato 14 veces mayor, 7 días después del tratamiento (DAT, siglas en inglés), que las líneas de Arabidopsis control de tipo silvestre y transformadas. La Figura 9 muestra la respuesta a la dosis de suspensiones de maíz callosas al R-haloxifop. La Figura 10 muestra que a una concentración 1 µM de cihalofop fenol, el crecimiento es aún el 76% del control sin cihalofop fenol. La Figura 11 ilustra los datos de respuesta a la dosis en un evento transgénico, 3404-006, al haloxifop. La Figura 12 muestra las respuestas de varios clones de evento no transformado y transformado con AAD-1 (v3) a dosis letales de dos herbicidas de tipo AOPP (haloxifop y quizalofop) aplicados como un rocío de post-emergencia una semana antes. La Figura 13 muestra tres linajes T2 diferentes a partir de transformaciones 3404 que se pre-seleccionaron con Liberty® para eliminar los nulos, que se eligieron para comparar su tolerancia al quizalofop con respecto a su expresión de AAD-1. La expresión se midió a los 14 DAT (no se muestran datos) y a los 30 DAT. La Figura 14 muestra el maíz transformado con AAD-1 (v3) tolerante a 8 veces las dosis de campo de quizalofop (Assure II) en condiciones de campo.

La Figura 15 ilustra los datos de embriones de maíz inmaduros desarrollados en medios que contienen cihalofop. La Figura 16 muestra el análisis de transferencia Western sobre callos de soja transformados con el gen AAD-1 (V3), indicando que las células de callos están expresando la proteína AAD-1 (v3). La Figura 17 muestra curvas ajustadas para las velocidades de degradación del 2,4-D por AAD-2 (v1 ) vs. AAD-1 (v1 ). La Figura 18 muestra la respuesta de Arabidopsis Ti transformada con AAD-1 v3 (planta optimizada), o AAD-1 (v2) (nativa), AAD-2 (v1) (nativa), o AAD-2 (v2) (planta optimizada) frente a un intervalo de dosis de 2,4-D aplicadas en post-emergencia. Cada maceta representa un evento de transformación individual dentro de cada familia del gen T-i. La Figura 19 muestra el análisis de transferencia western de plantas Arabidopsis Ti transformadas con AAD-2 (v1). Esto muestra que las plantas que expresan la proteína AAD-2 (v1) están sufriendo un severo daño por tratamientos de 2,4-D de 200 g de ea (equivalente de ácido)/ha, que normalmente causa un leve daño a Arabidopsis nativa AAD-1 (v2) o transformada con AAD-1 (v3) de planta optimizada. La proteína AAD-2 se identifica sobre el gel. Varias bandas de fondo se detectaron en muestras transformadas con AAD-2 y Pat/Cry1F. La Figura 20 muestra que la actividad relativa de AAD-2 (v1 ) sobre los sustratos fue 2,4-D = diclorprop > (R,S)-haloxifop » (R)-haloxifop.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 es la secuencia de un iniciador delantero utilizado para amplificar el gen rdpA/AAD-1 (v1). SEQ ID NO: 2 es la secuencia de un iniciador reverso utilizado para amplificar el gen rdpA/AAD-1 (v1). SEQ ID NO: 3 es la secuencia nucleotídica de AAD-1 (v1) del Sphingobium herbicidovorans. SEQ ID NO: 4 es la secuencia de ácido nucleico del gen AAD-1 nativo con el sitio de restricción Notl interno eliminado. Este gen se denomina AAD-1 (v2). El secuenciamiento de ADN confirmó que se generó el producto de PCR correcto, pero se produjo un cambio inadvertido en el aminoácido #212 de arginina a cisteína. SEQ ID NO: 5 es una secuencia de ADN de "planta-optimizada" AAD-1 (v3). Este "gen" codifica la SEQ ID NO: 11 , la cual es la misma que la SEQ ID NO: 9 salvo por el agregado de un residuo de alanina en la segunda posición. El codón de alanina adicional (GCT) se incluyó para codificar un sitio Ncol (CCATGG) extendiéndose sobre el codón de inicio ATG, para permitir las operaciones de clonación subsiguientes. SEQ ID NO: 6 ("rdpA(ncol)") y SEQ ID NO: 7 ("3'saci") se utilizaron para amplificar un fragmento de ADN utilizando el Sistema Fail Safe PCR (Epicenter).

SEQ ID NO: 8 es otro iniciador de PCR ("BstEII/Del Notl") que se utilizó con el iniciador "3' Sacl". SEQ ID NO: 9 es la secuencia de aminoácidos natural codificada por el gen AAD-1 (v1) de Sphingobium herbicidovorans. SEQ ID NO: 10 es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ADN AAD-1 (v2) de la SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 11 es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ADN AAD-1 (v3) de planta optimizada de la SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 12 es la secuencia de ADN del gen A4D-2 (v1) nativo. SEQ ID NO: 13 es la secuencia de aminoácidos de la proteína AAD-2 (v1 ). SEQ ID NO: 14 es un iniciador delantero utilizado para amplificar el ADN de AAD-2 (v1) para clonación. SEQ ID NO: 15 es un iniciador reverso utilizado para amplificar el ADN de AAD-2 (v1) para clonación. SEQ ID NO: 16 es el iniciador delantero M13. SEQ ID NO: 17 es el iniciador reverso M13. SEQ ID NO: 18 es un iniciador delantero utilizado para amplificar ADN de AAD-2 (v1) para clonación. SEQ ID NO: 19 es un iniciador reverso utilizado para amplificar ADN de AAD-2 (v1) para clonación. SEQ ID NO: 20 es la proteína EPSPS de soja nativa.

SEQ ID NO: 21 es una secuencia de la proteína EPSPS de soja doblemente mutada, que contiene una mutación en el residuo 183 (treonina de la proteína nativa, reemplazada con isoleucina), y en el residuo 187 (proiina en la proteína nativa reemplazada con serina). SEQ ID NO: 22 es la secuencia de ADN orientada a la soja que codifica la proteína EPSPS de la SEQ ID NO: 21. SEQ ID NO: 23 es el iniciador Pat 5-3. SEQ ID NO: 24 es el iniciador Pat 3-3. SEQ ID NO: 25 es el iniciador delantero AAD-1 PTU. SEQ ID NO: 26 es el iniciador reverso AAD-1 PTU. SEQ ID NO: 27 es el iniciador delantero para la Región Codificadora PCR AAD-1. SEQ ID NO: 28 es el iniciador reverso para la Región Codificadora PCR AAD-1. SEQ ID NO: 29 es el nucleótido AAD-2 (v2) (optimizado de planta). SEQ ID NO: 30 es la secuencia proteica AAD-2 (v2) traducida. SEQ ID NO: 31 es el iniciador delantero PCR AAD-1 del fragmento Southern. SEQ ID NO: 32 es el iniciador reverso PCR AAD-1 del fragmento Southern.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El presente desarrollo de un gen con resistencia al 2,4-D y cultivos resistentes subsiguientes aporta excelentes opciones para controlar especies de malezas resistentes al glifosato, de hoja ancha (o muy tolerantes y cambiantes) para aplicaciones en cultivos. El 2,4-D es un herbicida para malezas de hoja ancha, de amplio espectro, relativamente barato y fuerte, que aportaría una excelente utilidad para los agricultores si pudiera aportarse una mayor tolerancia del cultivo en cultivos dicotiledóneos y monocotiledóneos por igual. Los cultivos dicotiledóneos transgénicos tolerantes ai 2,4-D también contarían con mayor flexibilidad en el tiempo y dosis de aplicación. Otra utilidad de una característica de tolerancia al herbicida para el 2,4-D sería su utilidad para prevenir el daño a cultivos normalmente sensibles a la acumulación dei 2,4-D, volatilización, inversión (u otro fenómeno de movimiento fuera de su emplazamiento habitual), mala aplicación, vandalismo y similares. Otro beneficio adicional del gen AAD-1 es que a diferencia de todos los homólogos de tfdA caracterizados hasta la fecha, el AAD-1 es capaz de degradar los enantiómeros R (isómeros activos como herbicidas) de las fenoxi auxinas quirales (por ejemplo diclorprop y mecoprop) además de las fenoxi auxinas aquirales (por ejemplo, 2,4-D, MCPA, ácido 4-clorofenoxiacético). Ver Cuadro 1. Las mezclas múltiples de diferentes combinaciones de fenoxi auxinas han sido utilizadas de manera global para apuntar a espectros de malezas específicos y condiciones ambientales en diversas regiones. El uso del gen AAD-1 en plantas aportaría protección contra un espectro más amplio de herbicidas tipo fenoxi auxina, incrementando de este modo la flexibilidad y los espectros de malezas que pueden controlarse, protegiéndolos de la acumulación u otro daño del herbicida tipo fenoxi fuera del emplazamiento habitual para la gama total de fenoxi auxinas disponibles en el comercio. Cuadro 1. Fenoxi auxinas disponibles en el comercio. En general se denomina herbicidas tipo fenoxi auxinas a los ácidos activos pero algunos se formulan comercialmente como cualquiera de una variedad de formulaciones de esteres correspondientes y éstos se consideran de igual modo sustratos para la enzima AAD-1 in planta ya que las esterasas generales de las plantas convierten a estos esteres en los ácidos activos in planta. De igual modo también se puede hacer referencia a la sal orgánica o inorgánica correspondiente del ácido correspondiente. Cuando se indican herbicidas derivados del ácido propiónico, sal o éster quirales, los racematos (R,S) o los enantiómeros (R o S) ópticamente purificados se consideran los mismos herbicidas con el propósito de nombrar estos herbicidas, aún cuando diferentes números CAS puedan corresponder a compuestos ópticamente puros. El uso posible de los intervalos de proporción puede ser como tratamientos aislados o en combinación con otros herbicidas en usos de cultivo y no cultivo.

CUADRO 1 Un beneficio adicional del gen AAD-1 es su capacidad sin precedentes de degradar concomitantemente un huésped de los compuestos graminicidas comerciales y no-comerciales de la clase general de los ariloxifenoxipropionatos (AOPPs). Ver Cuadro 2. Este atributo puede permitir el uso de uno cualquiera entre una cantidad de compuestos tipo AOPP en cultivos transgénicos que contienen AAD-1 , donde la tolerancia de esos cultivos no había tenido previamente un uso garantizado en esos cultivos. De manera común estos incluirán cultivos de malezas tales como maíz, arroz, trigo, cebada, centeno, avena, sorgo, especies de céspedes de estación fresca y cálida, especies de pastos para pastoreo, y muchas otras, pero además podría incluir cultivos dicotiledóneos donde la tolerancia a los AOPP (naturalmente presente en la mayoría de las dicotiledóneas) no está en niveles aceptables para uso comercial para permitir el uso de AOPP en dicho cultivo dicotiledóneo. Cuadro 2. Compuestos graminicidas tipo AOPP enumerados por los nombres comunes aceptados. En general, la referencia a los herbicidas tipo AOPP se hace al ácido activo pero la mayoría se formula para el comercio como cualquiera de una variedad de formulaciones de éster correspondientes y éstas son de igual modo consideradas como sustratos para la enzima de AAD-1 in planta ya que las esterasas generales de las planta convierten estos esteres en los ácidos activos in planta. De igual modo también se puede hacer referencia a la sal orgánica o inorgánica correspondiente del ácido correspondiente. Cuando se indican herbicidas derivados del ácido propiónico, sal o éster quirales, los racematos (R,S) o los enantiómeros (R o S) ópticamente purificados se consideran los mismos herbicidas con el propósito de nombrar estos herbicidas, aún cuando diferentes números CAS puedan corresponder a compuestos ópticamente puros. Los posibles usos de intervalos de proporción pueden ser como tratamientos aislados o en combinación con otros herbicidas en usos de cultivo y no cultivo.

CUADRO 2 to 1 Un único gen (AAD-1) ha sido actualmente identificado que, cuando se manipula genéticamente para su expresión en plantas, tiene las propiedades para permitir el uso de herbicidas tipo fenoxi auxina en plantas donde la tolerancia inherente nunca existió o no era lo suficientemente elevada como para permitir el uso de estos herbicidas. Más aún, el AAD-1 puede aportar protección in planta a herbicidas tipo AOPP donde la tolerancia natural no era suficiente para permitir la selectividad. Las plantas que contienen AAD-1 solo ahora pueden tratarse secuencialmente o en mezcla de tanque con uno, dos o una combinación de varios herbicidas tipo fenoxi auxina. La proporción para cada herbicida tipo fenoxi auxina puede variar de 25 a 4000 g ea/ha, y más típicamente de 100 a 2000 g ea/ha para el control de un amplio espectro de malezas dicotiledóneas. De igual modo, se pueden aplicar uno, dos o una mezcla de varios compuestos de AOPP graminicidas a plantas que expresan el AAD-1 con riesgo reducido de lesión de dichos herbicidas. La proporción para cada AOPP puede variar de 10 a 2000 g ea/ha, y más típicamente de 20-500 g ea/ha para el control de un amplio espectro de malezas monocotiledóneas. Las combinaciones de estas diferentes clases de química y herbicidas con diferentes modos de acción y espectros en el mismo campo (ya sea en forma secuencial o en combinación con mezcla de tanque) aportarán control de la mayoría de las malezas potenciales para las cuales se desea el control herbicida. El glifosato se utiliza extensamente porque controla un espectro muy amplio de especies de hoja ancha y malezas herbáceas. Sin embargo, el uso repetido de glifosato en los GTCs y en aplicaciones de no cultivo ha seleccionado y continuará seleccionando cambios de malezas a especies naturalmente más tolerantes o biotipos resistentes al glifosato. Otros herbicidas de mezcla de tanque utilizados en proporciones eficaces que ofrecen control de la misma especie pero con diferentes modos de acción se prescriben en la mayoría de las estrategias de manejo de resistencia a herbicidas como un método para demorar la aparición de malezas resistentes. El AAD-1 acumulado con una característica de tolerancia al glifosato (y/o con otras características de tolerancia a herbicidas) podría aportar un mecanismo para permitir el control de especies de malezas resistentes al glifosato (ya sea especies de malezas herbáceas con uno o más herbicidas tipo AOPP, o especies de malezas de hoja ancha con una o más fenoxi auxinas) en los GTCs permitiendo el uso de herbicidas de glifosato, fenoxi auxinas (por ejemplo, 2,4-D) y de AOPP (por ejemplo, quizalofop) selectivamente en el mismo cultivo. Las aplicaciones de estos herbicidas podrían ser simultáneamente en un tanque de mezcla que contiene dos o más herbicidas de modos diferentes de acción; aplicaciones individuales de la composición de herbicida único en aplicaciones secuenciales como pre-planta, preemergencia o pos-emergencia y división de tiempo en las aplicaciones que varía de 2 horas a 3 meses; o, alternativamente, cualquier combinación de cualquier cantidad de herbicidas que representan cada clase química puede ser aplicada en cualquier momento dentro de los 7 meses de plantación del cultivo hasta la cosecha del cultivo (o el intervalo de pre-cosecha para el herbicida individual, el que sea más corto). Es importante tener flexibilidad en el control de un amplio espectro de malezas herbáceas y de hoja ancha en términos de tiempo de aplicación, proporción de herbicidas individuales y la capacidad de controlar malezas resistentes o difíciles. Las aplicaciones de glifosato en un cultivo con un gen de resistencia al glifosato / pila de AAD-1 varía de 250-2500 g ea/ha; herbicidas tipo fenoxi auxina (uno o más) se podrían aplicar de 25-4000 g ea/ha; y herbicidas tipo AOPP (uno o más) se podrían aplicar de 10-2000 g ea/ha. Las combinaciones y la cronología óptima de estas aplicaciones dependerán de la situación en particular, especies y medio ambiente, y estará mejor determinado por un experto en la técnica del control de malezas y con el beneficio de la presente descripción. Las formulaciones de herbicidas (por ejemplo, formulación de éster, ácido o sal; o concentrado soluble, concentrado emulsionable, o líquido soluble) y aditivos de mezcla de tanque (por ejemplo, adyuvantes o agentes de compatibilidad) pueden afectar significativamente el control de malezas de un herbicida dado o una combinación de uno o más herbicidas. Cualquier combinación de estos con cualquiera de los químicos herbicidas antes mencionados está dentro del alcance de esta invención. Un experto en la técnica verá, además, el beneficio de combinar dos o más modos de acción para incrementar el espectro de malezas controladas y/o para el control de especies naturales más tolerantes o especies de malezas resistentes también podría extenderse a químicos por los cuales se permitió tolerancia herbicida en cultivos con la participación humana (ya sea en forma transgénica o no transgénica) más allá de los GTCs. En verdad, características que codifican la tolerancia al glufosinato (por ejemplo, Pat, bar), resistencia al herbicida que inhibe el ALS (por ejemplo, imidazolinona, sulfonilurea, triazolopirimidina sulfonanilida, pirmidiniltiobenzoatos, y otros químicos = AHAS, Csr1, SurA, et al.), resistencia al bromoxinil (por ejemplo, Bxn), resistencia a los inhibidores de la enzima de HPPD, resistencia a los inhibidores de fitoen desaturasa, resistencia a los herbicidas que inhiben el fotosistema II (por ejemplo, psbA), resistencia a los herbicidas que inhiben el fotosistema I, resistencia a los herbicidas que inhiben el PROTOX {por ejemplo, Acuron™), resistencia a los herbicidas de fenilurea (por ejemplo, CYP76B1), y otros, podrían ser acumulados solos o en múltiples combinaciones para dar la capacidad de controlar o prevenir eficazmente los cambios de malezas y/o resistencia a cualquier herbicida de las clases antes mencionadas. Con respecto a los herbicidas adicionales, algunos inhibidores ALS adicionales preferidos incluyen las sulfonanilidas de triazolopirimidina (tales como cloransulam-metil, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, y penoxsulam), pirimidiniltiobenzoatos (tales como bispiribac, y piritiobac), y flucarbazona. Algunos inhibidores HPPD preferidos incluyen mesotriona, isoxaflutol, y sulcotriona. Algunos inhibidores PPO preferidos incluyen flumiclorac, flumioxazina, flufenpir, piraflufen, flutiacet, butafenacil, carfentrazona, sulfentrazona, y los difeniléteres (tales como acifluorfen, fomesafen, lactofen, y oxifluorfen). Más aún, el AAD-1 solo o sumado con una o más características de HTC adicionales podría acumularse con una o más características interiores adicionales (por ejemplo, resistencia a insectos, resistencia fúngica, o tolerancia al estrés, et al) o exteriores (por ejemplo, rendimiento aumentado, perfil de aceite mejorado, calidad de fibra mejorada, et al). De este modo, la presente invención puede utilizarse para aportar un paquete agronómico completo de calidad de cultivo mejorada con la capacidad de controlar los costos en forma eficaz y flexible de cualquier número de plagas agronómicas. La presente invención se refiere en parte a la identificación de una enzima que no sólo puede degradar el 2,4-D, sino que además posee sorprendentemente nuevas propiedades, que distinguen la enzima de la presente invención de las proteínas de tfdA previamente conocidas, por ejemplo. Aun cuando esta enzima tiene homología muy baja con tfdA, los genes de la presente invención se pueden clasificar en general dentro de la misma familia global de dioxigenasas dependientes de a-cetoglutarato. Esta familia de proteínas se caracteriza por tres residuos de histidina conservados en un motivo "HX(D/E)X23-26(T/S)X?? --i83HX?o-i3R" que comprende el sitio activo. Las histidinas coordinan al ion Fe+2 en el sitio activo que es esencial para la actividad catalítica (Hogan eí al., 2000). Los experimentos de expresión in vitro preliminares mencionados en la presente invención se diseñaron para ayudar a seleccionar los nuevos atributos.

Más específicamente, la presente invención se refiere en parte al uso de una enzima que no sólo es capaz de degradar el 2,4-D, sino además herbicidas tipo AOPP. No se ha informado previamente de ninguna enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato que tenga la capacidad de degradar herbicidas de diferentes clases químicas y modos de acción. Las enzimas y los genes preferidos para uso de acuerdo con la presente invención se denominan genes y proteínas de AAD-1 (AriloxiAlcanoato Dioxigenasa). Esta invención además se refiere en parte a la identificación y uso de genes que codifican las enzimas de ariloxialcanoato dioxigenasa que son capaces de degradar herbicidas tipo fenoxi auxina y ariloxifenoxipropionato. De este modo, la presente invención se refiere en parte a la degradación del ácido 2,4-diclorofenoxiacético, otros herbicidas tipo fenoxialcanoico auxina y herbicidas de ariloxifenoxialcanoato mediante una enzima AAD-1 expresada en forma recombinante. Las proteínas de la invención dieron ensayos positivos para la conversión de 2,4-D en 2,4-diclorofenol ("DCP"; inactivo para uso herbicida) en ensayos analíticos y biológicos. Las proteínas parcialmente purificadas de la presente invención pueden convertir rápidamente el 2,4-D en DCP (conversión que varía de 50 a 100%) in vitro. Una ventaja adicional que aportan las plantas transformadas con AAD-1 es que los herbicidas precursores se metaboiizan a formas inactivas, reduciendo de este modo el potencial para cosechar residuos herbicidas en grano o ensilado.

La presente invención además incluye métodos para controlar malezas donde dichos métodos comprenden la aplicación de un herbicida tipo AOPP y/o un herbicida tipo fenoxi auxina a plantas que contienen un gen de AAD-1. A la luz de estos descubrimientos, se proveen nuevas plantas que contienen un polinucleótido que codifican este tipo de enzima. Hasta ahora, no hubo motivación para producir tales plantas, y no hubo expectativa de que tales plantas pudiesen producir eficazmente esta enzima para lograr que las plantas sean resistentes a herbicidas no sólo del tipo fenoxiácido (tal como 2,4-D) sino además a los herbicidas tipo AOPP. De este modo, la presente invención aporta muchas ventajas que no se consideraron posibles en la técnica hasta ahora. Las cepas disponibles al público (depositadas en colecciones de cultivos como ATCC o DSMZ) se pueden adquirir y clasificar, utilizando técnicas reveladas en la presente invención, para nuevos genes. Las secuencias reveladas en la presente invención se pueden utilizar para amplificar y clonar los genes homólogos en un sistema de expresión recombinante para posterior clasificación y ensayo de acuerdo con la presente invención. Tal como se mencionó en la sección de antecedentes de la invención, un organismo que ha sido investigado extensivamente por su capacidad de degradar el 2,4-D es Ralstonia eutropha (Streber et al., 1987). El gen que codifica para la primera enzima en la vía de degradación es el tfdA.

Ver la Patente Estadounidense No. 6,153,401 y No. de Acceso al GENBANK M16730. El TfdA cataliza la conversión del ácido 2,4-D a DCP inactivo para uso herbicida mediante una reacción de dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato (Smejkal eí al., 2001 ). El TfdA ha sido utilizado en plantas transgénicas para impartir resistencia al 2,4-D en plantas dicotiledóneas (por ejemplo, algodón y tabaco) normalmente sensibles al 2,4-D (Streber eí al., 1989; Lyon eí al., 1989; Lyon eí al., 1993). Una gran cantidad de genes del tipo tfdA que codifican proteínas capaces de degradar el 2,4-D han sido identificados del ambiente y depositados en la base de datos del Genbank. Muchos homólogos son bastante similares al tfdA (>85% de identidad de aminoácidos) y tienen propiedades enzimáticas similares al tfdA. Sin embargo, en la actualidad se ha identificado una pequeña colección de homólogos de dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato que tienen un bajo nivel de homología con tfdA. El RdpA, de Sphingobium herbicidovorans (Westendorf eí al., 2002), es un ejemplo único con baja homología (28% de identidad de aminoácidos). Esta enzima ha demostrado catalizar la primera etapa en la mineralización del (R)-diclorprop (y otros ácidos (R)-fenoxipropiónico) como así también del 2,4-D (un ácido fenoxiacético) (Westendorf eí al., 2003). Si bien el organismo responsable de la degradación del ácido fenoxipropiónico ha sido conocido durante algún tiempo, hasta el presente se han hechos pocos avances en la caracterización de esta vía (Horvath eí al., 1990). Una complicación adicional a la degradación del diclorprop es la estereoespecificidad (R vs. S) involucrada tanto en la toma (Kohier, 1999) como en la oxidación inicial del diclorprop (Westendorf eí al., 2003). No se ha informado hasta ahora la expresión heteróloga del rdpA en otros microorganismos o transformación de este gen en plantas. La literatura se ha abocado esencialmente a los homólogos próximos del tfdA que degradan esencialmente los ácidos fenoxiacéticos aquirales. No había expectativa respecto a que los genes rdpA o AAD-1 pudiesen expresarse con éxito en plantas para dar plantas resistentes al 2,4-D (sin mencionar la resistencia al AOPP completamente sorprendente). Tal como se describe en mayor detalle en los Ejemplos a continuación, el rdpA se clonó del Sphingobium herbicidovorans y se ensayó para promiscuidad de sustrato entre varias clases químicas de herbicidas. Esta enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato purificada en su forma nativa había demostrado previamente que podía degradar el 2,4-D y el diclorprop (Westendorf eí al., 2002 y 2003). Sin embargo, no se ha informado previamente que alguna enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato tenga la capacidad de degradar herbicidas de diferentes clases químicas y modos de acción. El RdpA nunca se ha expresado en plantas, ni hubo motivación alguna para hacerlo dado que el desarrollo de nuevas tecnologías de HTC ha estado limitado debido principalmente a la eficacia, bajo costo y conveniencia de los GTCs (Devine, 2005). A la luz de la nueva actividad, las proteínas y genes de la presente invención se denominan en la presente invención como proteínas y genes de AAD-1. Recientemente se confirmó que el AAD-1 degrada una variedad de herbicidas tipo auxina fenoxiacético y fenoxiprooiónico in vitro. Sin embargo, sorprendentemente se halló que esta enzima, según se informó la primera vez, era además capaz de degradar sustratos adicionales de la clase de moléculas de ariloxialcanoato. Los sustratos de importancia agronómica significativa son los herbicidas de ariloxifenoxipropionato (AOPP) para pastos. Este descubrimiento muy nuevo es la base del significativo Cultivo Tolerante a los Herbicidas (HTC) y de oportunidades de características de marcadores seleccionares. Se ha informado, en la presente invención, que los herbicidas de pastos de AOPP de amplio espectro son excelentes sustratos para el AAD-1 como así también el 2,4-D, diclorprop y otras fenoxi auxinas. Esta enzima es única en su capacidad de suministrar actividad degradativa herbicida a una gama de herbicidas de hoja ancha de amplio espectro (fenoxi auxinas) y una gama de herbicidas de pastos muy activos de amplio espectro (AOPPs). De este modo, la presente invención se refiere en parte a la degradación del ácido 2,4-diclorofenoxiacético, otros herbicidas de fenoxialcanoico auxina, y herbicidas de ariloxifenoxialcanoato mediante una enzima de dioxigenasa ariloxialcanoato (AAD-1) expresada de manera recombinante. Esta invención además se refiere en parte a la identificación y usos de genes que codifican una enzima que degrada la ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD-1 ) capaz de degradar los herbicidas tipo fenoxi auxina y ariloxifenoxipropionato.

La enzima de la invención permite la expresión transgénica que da por resultado la tolerancia a combinaciones de herbicidas que controlarían casi todas las malezas herbáceas y de hoja ancha. El AAD-1 puede servir como una característica excelente de cultivo tolerante a herbicidas (HTC) para sumarse a otras características de HTC (por ejemplo, resistencia al glifosato, resistencia al glufosinato, resistencia a la imidazolinona, resistencia al bromoxinil, et al.), y características de resistencia a los insectos, (CrylF, CrylAb, Cry 34/45, et al.) por ejemplo. Además, el AAD-1 puede servir como un marcador seleccionable para ayudar a la selección de transformantes primarios de plantas diseñados genéticamente con un segundo gen o grupo de genes. Además, el gen microbiano de la invención ha sido rediseñado de modo que la proteína es codificada por codones con una propensión hacia el uso de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas (hemicot). Arabidopsis, maíz, tabaco, algodón, soja, cañóla y arroz han sido transformados con construcciones que contienen AAD-1 y han demostrado altos niveles de resistencia tanto a los herbicidas tipo fenoxi auxina como AOPP. De este modo, la presente invención además se refiere a los genes "optimizados de planta" que codifican proteínas de la presente invención. Como se muestra a continuación en el Ejemplo 6, el gen reconstruido ejemplificado fue más eficaz al transportar resistencia herbicida a la planta, en comparación con el gen bacteriano.

Los grupos oxialcanoato son útiles para introducir una funcionalidad acida estable en los herbicidas. El grupo ácido puede impartir movilidad floemática mediante "entrampamiento del ácido", un atributo deseable para la acción herbicida y por lo tanto podría ser incorporado en los nuevos herbicidas con fines de movilidad. Los aspectos de la presente invención además aportan un mecanismo para crear los HTCs. Existen muchos herbicidas experimentales y comerciales potenciales que pueden servir como sustratos para el AAD-1. De este modo, el uso de los genes de la invención también puede dar por resultado tolerancia herbicida a esos otros herbicidas. Las características del HTC de la presente invención se pueden utilizar en combinaciones novedosas con otras características del HTC (incluyendo, pero sin limitación, la tolerancia al glifosato). Estas combinaciones de características dan lugar a nuevos métodos para controlar especies de malezas (y similares), debido a la reciente resistencia adquirida o tolerancia inherente a los herbicidas (por ejemplo, glifosato). De este modo, sumado a las características del HTC, los nuevos métodos para controlar malezas utilizando herbicidas, para lo cual se creó la tolerancia al herbicida mediante dicha enzima en cultivos transgénicos, están dentro del alcance de la invención. Más aún, los cultivos tolerantes al glifosato desarrollados a nivel mundial son frecuentes. Muchas veces en rotación con otros cultivos tolerantes al glifosato, el control de voluntarios resistentes al glifosato puede ser difícil en cultivos rotacionales. De este modo, el uso de las características de la invención, sumado o transformado individualmente en cultivos, aporta una herramienta para controlar otros cultivos voluntarios de HTC. Esta invención puede aplicarse en el contexto de la comercialización de una característica de resistencia al 2,4-D sumada a las actuales características de resistencia al glifosato en sojas, por ejemplo. De este modo, esta invención aporta una herramienta para combatir cambios de especies de malezas de hoja ancha y/o selección de malezas de hoja ancha resistentes a herbicidas, lo que culmina con la confianza extremadamente alta por parte de los cultivadores en el glifosato para el control de malezas con varios cultivos. La expresión transgénica de los genes de AAD-1 de la invención se ejemplifica en, por ejemplo, Arabidopsis, maíz, tabaco, algodón, arroz, soja y cañóla. Sin embargo, la presente invención puede aplicarse a cualquier otro tipo deseado de planta. Las sojas son un tipo preferido para la transformación de acuerdo con la presente invención. Sin embargo, esta invención puede aplicarse a otros múltiples cultivos de hierbas y otros cultivos de hoja ancha. De igual modo, el 2,4-D puede utilizarse en forma más positiva en cultivos de hierbas donde la tolerancia al 2,4-D es moderada, y la tolerancia aumentada mediante esta vía daría a los cultivadores la oportunidad de usar el 2,4-D en proporciones más eficaces y durante un tiempo de aplicación más amplio sin el riesgo de dañar el cultivo.

Más aún, la presente invención aporta un único gen que puede aportar resistencia a los herbicidas que controlan malezas de hoja ancha (auxinas) y malezas herbáceas (AOPPs). Este gen puede utilizarse en múltiples cultivos para permitir el uso de una combinación herbicida de amplio espectro. La presente invención además puede controlar malezas resistentes a químicos corrientes, y ayuda en el control de cambios de espectros de malezas que resultan de prácticas agronómicas corrientes. El AAD-1 de la invención además puede utilizarse en esfuerzos para detoxificar eficazmente los sustratos herbicidas a formas no-herbicidas. De este modo, la presente invención provee el desarrollo de características de HTC adicionales y/o tecnología de marcador seleccionable. Aparte de, o además de, utilizar los genes de la invención para producir los HTCs, estos genes además se pueden utilizar como marcadores seleccionares para seleccionar con éxito los transformantes en cultivos celulares, invernaderos, y en el campo. Existe un valor inherente alto para los genes de la invención simplemente como un marcador seleccionable para proyectos biotecnológicos. La promiscuidad del AAD-1 para otros herbicidas fenoxialcanoico auxínicos aporta muchas oportunidades para utilizar este gen para HTC y/o con el propósito de marcador seleccionable. Un gen de la presente invención, denominado en la presente invención como AAD-1 (ariloxialcanoato dioxigenasa), se clonó de Sphingobium herbicidovorans (ATCC 700291 ) por PCR en pET 280-S/S (denominado pDAB 3203) y se expresó en BL-21 Star E. coli. Cuando este gen se sobreexpresa (por inducción de IPTG 1 mM y lisado de cultivo combinado con la siguiente mezcla de reacción: 112.5 µg/ml de 2,4-D, ácido ascórbico 1 mM, a-cetoglutarato 1 mM, de Fe(NH4)2(S04)2 50 µM, la enzima producida en forma recombinante degrada el 2,4-D a DCP inactivo para uso herbicida (según se determinó por CLAR, espectrometría de masa, ensayo colorimétrico, y ensayo de placa de Arabidopsis). Más aún, el AAD-1 ha demostrado que puede convertir los siguientes herbicidas en su correspondiente fenol inactivo: diclorprop, mecoprop, haloxifop, diclofop y otros (Ver Cuadros 3 y 4).

CUADRO 3 Cuadro 4: Efecto de AAD-1 (v1 ) purificada sobre varios graminicidas tipo AOPP y análogos, y sobre cloquintocet. Se ensayaron los sustratos a 1 mM en MOPS 25 mM, pH 6.8, Fez+ 200 µM, ascorbato de Na 200 µM, a-cetoglutarato 1 mM, utilizando ya sea 1 µg o 10 µg (10X) de AAD-1 (v1 ) purificada por ensayo de 0.16 ml.

CUADRO 4 Proteínas (y aislados de fuentes) de la presente invención. La presente invención aporta proteínas funcionales. Por "actividad funcional" (o "activa") se entiende aquí que las proteínas/enzimas para su uso de acuerdo con la presente invención tienen la capacidad de degradar o disminuir la actividad de un herbicida (solas o en combinación con otras proteínas). Las plantas que producen proteínas de la presente invención preferentemente producirán "una cantidad eficaz" de la proteína de modo que cuando la planta es tratada con un herbicida, el nivel de expresión de proteína es suficiente para hacer que la planta sea parcial o completamente resistente o tolerante al herbicida (en una proporción típica, a menos que se especifique lo contrario; las proporciones de aplicación típicas se pueden hallar en el Herbicide Handbook bien conocido (Weed Science Society of America, 8a edición, 2002), por ejemplo). El herbicida puede aplicarse en proporciones que normalmente matarían a la planta blanco, en proporciones y concentraciones de uso de campo normales. (Debido a la presente invención, el nivel y/o concentración puede ser opcionalmente más alto que los que se utilizaron previamente). Con preferencia, las células de planta y las plantas de la presente invención están protegidas contra la inhibición del crecimiento o daño causado por el tratamiento con herbicida. Las plantas y las células de plantas transformadas de la presente invención se tornan preferentemente resistentes o tolerantes a un herbicida, según se mencionó en la presente invención, significando que la planta y las células de planta transformadas pueden desarrollarse en presencia de cantidades eficaces de uno o más herbicidas según se mencionó en la presente invención. Las proteínas preferidas de la presente invención tienen actividad catalítica para metabolizar uno o más compuestos de ariloxialcanoato. La transferencia de la actividad funcional a la planta o sistemas bacterianos puede involucrar una secuencia de ácido nucleico, que codifica la secuencia de aminoácidos para una proteína de la presente invención, integrada en un vector de expresión de proteína apropiado al huésped en el cual el vector residirá. Una forma de obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína con actividad funcional es aislar el material genético nativo de las especies bacterianas que producen la proteína de interés, utilizando la información deducida de la secuencia de aminoácidos de la proteína, según se revela en la presente invención. Las secuencias nativas se pueden optimizar para expresión en plantas, por ejemplo, según se menciona en detalle a continuación. El polinucleótido optimizado además puede diseñarse en base a la secuencia proteica. La presente invención aporta clases de proteínas que tienen actividades nuevas según se identifican en la presente invención. Una forma de caracterizar estas clases de proteínas y los polinucleótidos que las codifican es definiendo un polinucleótido por su capacidad de hibridar, bajo un intervalo de condiciones específicas, con una secuencia nucleotídica ejemplificada (su complemento y/o una sonda o sondas derivadas de cualquier hebra) y/o por su capacidad de amplificarse por PCR utilizando iniciadores derivados de las secuencias ejemplificadas.

Existe una cantidad de métodos para obtener proteínas para su uso de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, los anticuerpos contra las proteínas descritos en la presente invención se pueden utilizar para identificar y aislar otras proteínas de una mezcla de proteínas. Específicamente, se pueden desarrollar anticuerpos contra las porciones de las proteínas que están más conservadas o son más distintas, en comparación con otras proteínas relacionadas. Estos anticuerpos se pueden utilizar entonces para identificar específicamente proteínas equivalentes con la actividad característica por inmunoprecipitación, ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas (ELISA), o inmuno-transferencia (immuno-blotting). Los anticuerpos contra las proteínas descritas en la presente invención, o a proteínas equivalentes, o a fragmentos de estas proteínas, se pueden preparar fácilmente utilizando procedimientos estándar. Tales anticuerpos son un aspecto de la presente invención. Los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, preferentemente producidos en respuesta a una proteína sugerida o ejemplificada. Un experto en la técnica reconocerá fácilmente que las proteínas (y genes) de la presente invención se pueden obtener de una variedad de fuentes. Dado que se sabe que los operones de degradación herbicida completa están codificados sobre elementos transportables tales como plásmidos, así como también genómicamente integrados, las proteínas de la presente invención se pueden obtener de una amplia variedad de microorganismos, por ejemplo, que incluyen bacterias recombinantes y/o del tipo silvestre. Otros miembros de los órdenes Firmicutes y Proteobacteria, y géneros específicos con rdpA's conocidos, tales como Sphingobium, Delñia, Rodoferax, y Comamonas por ejemplo, se pueden utilizar como aislados de fuentes. Los mutantes de aislados bacterianos se pueden obtener por procedimientos que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los mutantes asporógenos se pueden obtener a través de la mutagénesis con etilmetan sulfonato (EMS) de un aislado. Los mutantes se pueden obtener utilizando luz ultravioleta y nitrosoguanidina mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Una "proteína de" u "obtenible de" cualquiera de los aislados de la invención a la que se hace referencia o se sugiere en la presente invención significa que la proteína (o una proteína similar) se puede obtener del aislado o alguna otra fuente, tal como otra cepa bacteriana o una planta. "Derivado de" también tiene esta connotación e incluye proteínas obtenibles de un tipo dado de bacteria que se modifican para la expresión en una planta, por ejemplo. Un experto en la técnica reconocerá fácilmente que, dada la descripción de un gen y proteína bacteriana, se puede diseñar una planta para producir la proteína. Las preparaciones de anticuerpo, sondas de ácido nucleico (ADN, ARN, o PNA, por ejemplo), y similares se pueden preparar utilizando las secuencias polinucleotídicas y/o de aminoácidos reveladas en la presente invención y utilizadas para clasificar y recuperar otros genes relacionados de otras fuentes (naturales).

Las técnicas de biología molecular estándar se pueden utilizar para clonar y secuenciar las proteínas y genes descritos en la presente invención. Se puede hallar información adicional en Sambrook et al., 1989, el cual se incorpora a la presente invención como referencia.

Polinucleótidos y Sondas La presente invención además provee secuencias nucleotídicas que codifican proteínas para su uso de acuerdo con la presente invención. Esta invención además aporta métodos para identificar y caracterizar genes que codifican proteínas que tienen la actividad herbicida deseada. En una modalidad, la presente invención aporta secuencias nucleotídicas únicas que son útiles como sondas y/o iniciadores de hibridación para técnicas de PCR. Los iniciadores producen fragmentos génicos característicos que se pueden utilizar en la identificación, caracterización y/o aislamiento de genes específicos de interés. La secuencias nucleotídicas de la presente invención codifican proteínas que son diferentes de las proteínas descritas previamente. Los polinucleótidos de la presente invención se pueden utilizar para formar "genes" completos para codificar proteínas o péptidos en una célula huésped deseada. Por ejemplo, como el experto reconocería fácilmente, los polinucleótidos de la invención se pueden colocar apropiadamente bajo el control de un promotor en un huésped de interés, como se conoce en la técnica. El nivel de expresión génica y expresión específica temporal/tisular puede impactar enormemente la utilidad de la invención. En general, mayores niveles de expresión proteica de un gen degradante darán por resultado la degradación de un sustrato más rápida y más completa (en este caso un herbicida blanco). Los promotores expresarán el gen blanco a niveles altos a menos que la elevada expresión tenga un impacto negativo consiguiente sobre la salud de la planta. Típicamente, se desea tener el gen AAD-1 expresado constitutivamente en todos los tejidos para protección completa de la planta en todos los estadios del crecimiento. Sin embargo, se podría utilizar alternativamente un gen de resistencia expresado en forma vegetativa; esto permitiría el uso del herbicida blanco en cultivos para control de malezas y controlaría subsiguientemente la reproducción sexual del cultivo blanco mediante la aplicación durante la etapa de floración. Como conocen los expertos, el ADN típicamente existe en una forma de doble hebra. En esta disposición, una hebra es complementaria de la otra hebra y viceversa. A medida que el ADN se replica en una planta (por ejemplo), se producen hebras de ADN complementarias adicionales. La "hebra codificadora" a menudo se utiliza en la técnica para referirse a la hebra que se une con la hebra anti-sentido. El ARNm se transcribe de la hebra "antisentido" del ADN. La hebra "sentido" o "codificadora" tiene una serie de codones (un codón es tres nucleótidos que pueden leerse como una unidad de tres residuos para especificar un aminoácido particular) que pueden leerse como un marco de lectura abierto (ORF) para formar una proteína o péptido de interés. Para producir una proteína in vivo, una hebra de ADN se transcribe típicamente en una hebra complementaria de ARNm la cual se utiliza como molde para la proteína. De este modo, la presente invención incluye el uso de los polinucleótidos ejemplificados que se muestran en el listado de secuencias adjunto y/o equivalentes que incluyen las hebras complementarias. El ARN y PNA (ácidos nucleicos peptídicos) que son equivalentes funcionalmente a las moléculas de ADN ejemplificadas se incluyen en la presente invención. En una modalidad de la presente invención, los aislados bacterianos se pueden cultivar en condiciones que dan por resultado la elevada multiplicación del microorganismo. Después de tratar al microorganismo para proveer ácido nucleico genómico mono-hebra, el ADN puede ponerse en contacto con los iniciadores de la invención y someterse a la amplificación por PCR. Los fragmentos característicos de los genes de interés se amplificarán mediante el procedimiento, identificando de este modo la presencia del (de los) gen(es) de interés. Otros aspectos de la presente invención incluyen genes y aislados identificados utilizando los métodos y secuencias nucleotídicas revelados en la presente invención. Los genes identificados de este modo pueden codificar las proteínas de resistencia a herbicida de la presente invención. Las proteínas y genes para uso de acuerdo con la presente invención se pueden identificar y obtener utilizando sondas oligonucleotídicas, por ejemplo. Estas sondas son secuencias nucleotídicas detectables que se pueden detectar en virtud de una marca apropiada o se pueden hacer inherentemente fluorescentes según se describe en la Solicitud Internacional No. WO 93/16094. Las sondas (y los polinucleótidos de la presente invención) pueden ser ADN, ARN, o PNA. Además de la adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T), y uracilo (U; para moléculas de ARN), las sondas sintéticas (y polinucleótidos) de la presente invención pueden tener además inosina (una base neutra capaz de aparearse con las cuatro bases; algunas veces utilizada en lugar de una mezcla de las cuatro bases en sondas sintéticas) y/u otras bases sintéticas (no naturales). De este modo, cuando se hace referencia en la presente invención a un oligonucleótido sintético, degenerado, y se utiliza "N" o "n" genéricamente, "N" o "n" pueden ser G, A, T, C, o inosina. Los códigos de ambigüedad tal como se utilizan en la presente invención están de acuerdo con las convenciones de denominación lUPAC estándar respecto de la presentación de la presente solicitud (por ejemplo, R significa A o G, Y significa C o T, etc.). Como bien se conoce en la técnica, si una molécula de sonda hibrida con una muestra de ácido nucleico, se puede presumir razonablemente que la sonda y la muestra tienen homología/similitud/identidad sustancial. Con preferencia, primero se realiza la hibridación del polinucleótido seguida de lavados en condiciones de severidad baja, moderada o alta mediante técnicas bien conocidas en la técnica, según se describe en, por ejemplo, Keller, G.H., M.M. Manak (1987) ADN Probes, Stockton Press, New York, NY, págs. 169-170. Por ejemplo, según se establece en la presente invención, condiciones de baja severidad se pueden lograr lavando primero con 2x SSC (citrato salino estándar)/0.1% de SDS (dodecil sulfato de sodio) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Típicamente, se realizan dos lavados. Mayor severidad se puede lograr disminuyendo la concentración de sal y/o elevando la temperatura. Por ejemplo, el lavado anteriormente descrito puede estar seguido de dos lavados con 0.1x SSC/0.1 % de SDS durante 15 minutos cada uno a temperatura ambiente seguido de subsiguientes lavados con 0.1x SSC/0.1% de SDS durante 30 minutos cada uno a 55°C. Estas temperaturas se pueden utilizar con otros protocolos de hibridación y lavado establecidos en la presente invención y como serán conocidos por el técnico (se puede utilizar SSPE como sal en lugar de SSC, por ejemplo). El 2x SSC/0.1 % de SDS se puede preparar agregando 50 ml de 20x SSC y 5 ml de SDS 10% a 445 ml de agua. Se puede preparar 20x SSC combinando NaCI (175.3 g/0.150 M), citrato de sodio (88.2 g/0.015 M), ajustando el pH a 7.0 con NaOH 10 N, luego ajustando el volumen a 1 litro. Se puede preparar SDS 10% disolviendo 10 g de SDS en 50 ml de agua en autoclave, luego diluyendo a 100 ml. La detección de la sonda aporta un medio para determinar de manera conocida si se ha mantenido la hibridación. Tal análisis de sonda aporta un método rápido para identificar genes de la presente invención. Los segmentos nucleotídicos utilizados como sondas de acuerdo con la invención se pueden sintetizar utilizando un sintetizador de ADN y procedimientos estándar. Estas secuencias nucleotídicas además se pueden utilizar como iniciadores de PCR para amplificar genes de la presente invención.

Las características de hibridación de una molécula se pueden utilizar para definir polinucleótidos de la presente invención. De este modo, la presente invención incluye polinucleótidos (y/o sus complementos, preferentemente sus complementos completos) que hibridan con un polinucleótido ejemplificado en la presente invención. Esto es, una forma de definir un gen (y la proteína que él codifica), por ejemplo, es mediante su capacidad de hibridar (bajo cualquiera de las condiciones reveladas específicamente en la presente invención) con un gen conocido o específicamente ejemplificado. Tal como se utiliza en la presente invención, el término condiciones "severas" para hibridación se refiere a condiciones que logran el mismo, o casi el mismo, grado de especificidad de hibridación que las condiciones empleadas por los actuales solicitantes. Específicamente, la hibridación de ADN inmovilizado sobre transferencias Southern con sondas específicas génicas marcadas con 32P se puede llevar a cabo mediante métodos estándar (ver, por ejemplo, Maniatis et al. 1982). En general, la hibridación y subsiguientes lavados se pueden llevar a cabo en condiciones que permiten la detección de secuencias blanco. Para sondas génicas de ADN de doble hebra, la hibridación se puede llevar a cabo durante toda la noche a 20-25°C por debajo de la temperatura de fusión (Tf) del ADN híbrido en dx SSPE, 5x solución de Denhardt, 0.1% de SDS, 0.1 mg/ml de ADN desnaturalizado. La temperatura de fusión se describe por la siguiente fórmula (Beltz ef a/. 1983): Tmf = 81.5°C+ 16.6 Log[Na+] + 0.41 (% de G+C) - 0.61 (% de formamida) - 600/longitud del dúplex en pares de bases. Típicamente los lavados se pueden llevar a cabo de la siguiente forma: (1 ) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en 1x SSPE, 0.1 % de SDS (lavado de baja severidad). (2) Una vez a Tf-20°C durante 15 minutos en 0.2x SSPE, 0.1 % de SDS (lavado de severidad moderada). Para sondas oligonucleotídicas, la hibridación se puede llevar a cabo durante toda la noche a 10-20°C por debajo de la temperatura de fusión (Tf) del híbrido en 6x SSPE, 5x solución de Denhardt, 0.1% de SDS, 0.1 mg/ml de ADN desnaturalizado. La Tf para sondas oligonucleotídicas se puede determinar mediante la siguiente fórmula: Tf (°C) = 2(número de pares de bases T/A) + 4(número de pares de bases G/C) (Suggs et al., 1981). Típicamente los lavados se pueden llevar a cabo de la siguiente forma: (1 ) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos 1x SSPE, 0.1 % de SDS (lavado de baja severidad). (2) Una vez a la temperatura de hibridación durante 15 minutos en 1x SSPE, 0.1 % de SDS (lavado de moderada severidad).

En general, se puede alterar la sal y/o temperatura para cambiar la severidad. Con un fragmento de ADN marcado de >70 o aproximadamente de bases de largo, se pueden utilizar las siguientes condiciones: Baja: 1 ó 2x SSPE, temperatura ambiente Baja: 1 ó 2x SSPE, 42°C Moderada: 0.2x o 1x SSPE, 65°C Alta: 0.1 x SSPE, 65°C. La formación y estabilidad del dúplex depende de la complementariedad sustancial entre las dos hebras de un híbrido, y, según se mencionó anteriormente, se puede tolerar un cierto grado de falta de apareamiento. Por lo tanto, las secuencias de sondas de la presente invención incluyen mutaciones (tanto simples como múltiples), supresiones, inserciones de las secuencias descritas, y sus combinaciones, donde dichas mutaciones, inserciones y supresiones permiten la formación de híbridos estables con el polinucleótido blanco de interés. Las mutaciones, inserciones y supresiones se pueden producir en una secuencia polinucleotídica dada en muchas formas, y estos métodos son conocidos para el experto en la técnica. En el futuro pueden surgir otros métodos.

Tecnología de PCR. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una síntesis repetitiva, enzimática, cebada de una secuencia de ácido nucleico. Este procedimiento es bien conocido y normalmente lo utilizan los expertos en la técnica (ver Mullís, Patentes Estadounidenses Nos. 4,683,195, 4,683,202, y 4,800,159; Saiki eí al., 1985). La PCR se basa en la amplificación enzimática de un fragmento de ADN de interés que es flanquedo por dos iniciadores oligonucleotídicos que hibridan a hebras opuestas de la secuencia blanco. Los iniciadores están preferentemente orientados con los extremos 3' apuntando uno hacia otro. Los ciclos repetidos de desnaturalización por calor del molde, apareamiento de los iniciadores con sus secuencias complementarias, y la extensión de los iniciadores apareados con una ADN polimerasa dan por resultado la amplificación del segmento definido por los extremos 5' de los iniciadores de PCR. El producto de cada iniciador puede servir como molde para el otro iniciador, de modo que cada ciclo duplica esencialmente la cantidad de fragmento de ADN producido en el ciclo anterior. Esto da por resultado la acumulación exponencial del fragmento blanco específico, hasta varios millones de veces en una pocas horas. Al utilizar una ADN polimerasa termoestable tal como Taq polimerasa, aislada de la bacteria termofílica Thermus aquaticus, el proceso de amplificación puede automatizarse completamente. Otras enzimas que se pueden utilizar son conocidas por los expertos en la técnica. Las secuencias de ADN ejemplificadas, o sus segmentos, se pueden utilizar para amplificación por PCR. Al realizar la amplificación por PCR, se puede tolerar cierto grado de falta de apareamiento entre el iniciador y el molde. Por lo tanto, las mutaciones, supresiones e inserciones (especialmente adiciones de nucleótidos al extremo 5') de los iniciadores ejemplificados están dentro del alcance de la presente invención. Las mutaciones, inserciones y supresiones se pueden producir en un iniciador dado mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Modificación de genes y proteínas. Los genes y proteínas de la presente invención se pueden fusionar a otros genes y proteínas para producir proteínas quiméricas y de fusión. Los genes y proteínas útiles de acuerdo con la presente invención incluyen no sólo las secuencias de longitud completa específicamente ejemplificadas, sino además proteínas, segmentos y/o fragmentos (incluyendo fragmentos contiguos y supresiones internas y/o terminales en comparación con las moléculas de longitud completa) de estas secuencias, sus variantes, mutantes, quiméricas, y fusiones. Las proteínas de la presente invención pueden tener aminoácidos sustituidos en ia medida que retengan la actividad funcional deseada. Los genes "variantes" tienen secuencias nucleotídicas que codifican las mismas proteínas o proteínas equivalentes que tienen actividad equivalente o similar a una proteína ejemplificada. Los términos "proteínas variantes" y "proteínas equivalentes" se refieren a proteínas que tienen la misma o esencialmente la misma actividad biológica/funcional contra las plagas blanco y secuencias equivalentes que las proteínas ejemplificadas. Tal como se utiliza en la presente invención, la referencia a una secuencia "equivalente" se refiere a secuencias con sustituciones, supresiones, adiciones, o inserciones de aminoácidos que mejoran o no afectan adversamente la actividad en un grado significativo. Los fragmentos que retienen la actividad también se incluyen en esta definición. Los fragmentos y otros equivalentes que retienen la misma o similar función o actividad como un fragmento correspondiente de una proteína ejemplificada están dentro del alcance de la presente invención. Se pueden realizar cambios, tales como sustituciones o adiciones de aminoácidos, para una variedad de fines, tales como incrementar (o disminuir) la estabilidad frente a proteasas de la proteína (sin disminuir materialmente/sustancialmente la actividad funcional de la proteína), eliminar o agregar un sitio de restricción, y similares. Las variaciones de genes se pueden construir fácilmente utilizando técnicas estándar para realizar mutaciones puntuales, por ejemplo. Además, la Patente Estadounidense No. 5,605,793, por ejemplo, describe métodos para generar diversidad molecular adicional utilizando el reensamblado de ADN después de la fragmentación aleatoria o enfocada. Esto puede denominarse "transposición" de genes, lo que típicamente involucra mezclar fragmentos (de un tamaño deseado) de dos o más moléculas de ADN diferentes, seguido de rondas repetidas de renaturalización. Esto puede mejorar la actividad de una proteína codificada por un gen de inicio. El resultado es una proteína quimérica que tiene actividad mejorada, especificidad de sustrato alterada, estabilidad enzimática incrementada, estereoespecificidad alterada u otras características. La "transposición" puede ser diseñada y dirigida después de obtener y examinar coordenadas tridimensionales atómicas y la estructura cristalina de una proteína de interés. De este modo, la "transposición enfocada" puede estar dirigida a ciertos segmentos de una proteína que son ideales para modificación, tales como segmentos expuestos de superficie, y preferentemente segmentos no internos que están involucrados con el plegamiento de la proteína y la integridad estructural 3D esencial. Los genes variantes se pueden utilizar para producir proteínas variantes; se pueden utilizar huéspedes recombinantes para producir las proteínas variantes. Utilizando estas técnicas de "transposición génica", se pueden construir genes y proteínas equivalentes que comprenden 5, 10, o 20 residuos contiguos (aminoácidos o nucleótidos) de cualquier secuencia ejemplificada en la presente invención. Como es conocido en la técnica, las técnicas de transposición génica, por ejemplo, pueden ajustarse para obtener equivalentes que tienen por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, 113, 114, 1 15, 1 16 117, 118, 119, 120, 121 , 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141 , 142, 143, 144, 145, 146 147, 148, 149, 150, 151 , 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171 , 172, 173, 174, 175, 176 177, 178, 179, 180, 181 , 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 , 202, 203, 204, 205, 206 207, 208, 209, 210, 21 1 , 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241 , 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251 , 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261 , 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271 , 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281 , 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291 , 292, 293, 294, 295, 296, o 297 residuos contiguos (aminoácidos o nucleótidos), que corresponden a un segmento (del mismo tamaño) en cualquiera de las secuencias sugeridas o ejemplificadas (o sus complementos (complementos completos)). Los segmentos de tamaño similar, especialmente aquellos para regiones conservadas, se pueden utilizar además como sondas y/o iniciadores. Los fragmentos de genes de longitud completa se pueden obtener utilizando exonucleasas o endonucleasas disponibles en el comercio de acuerdo con procedimientos estándar. Por ejemplo, enzimas tales como Sa/31 o mutagénesis dirigida al sitio se pueden utilizar para cortar sistemáticamente nucleótidos de los extremos de estos genes. Además, los genes que codifican fragmentos activos se pueden obtener utilizando una variedad de enzimas de restricción. Se pueden utilizar proteasas para obtener directamente fragmentos activos de estas proteínas. Está dentro del alcance de la invención según se reveló en la presente invención que las proteínas pueden truncarse y aún retener la actividad funcional. Por "proteína truncada" se entiende que una porción de una proteína puede escindirse mientras que la proteína truncada remanente retiene y exhibe la actividad deseada después de la escisión. La escisión puede lograrse mediante varias proteasas. Más aún, se pueden producir proteínas efectivamente escindidas utilizando técnicas de biología molecular donde las bases de ADN que codifican dicha proteína se eliminan ya sea a través de la digestión con endonucleasas de restricción u otras técnicas disponibles al experto en la técnica. Después del truncamiento, dichas proteínas pueden expresarse en sistemas heterólogos tales como E. coli, baculovirus, sistemas virales basados en plantas, levadura, y similares y luego colocarse en ensayos de insectos según se revela en la presente invención para determinar la actividad. Es bien conocido en la técnica que las proteínas truncadas se pueden producir con éxito de modo que retienen la actividad funcional a la vez que tienen menos que la secuencia completa, de longitud total. Por ejemplo, las proteínas de B.t. se pueden utilizar en una forma truncada (proteína de núcleo) (ver, por ejemplo, Hofte et al. (1989), y Adang et al. (1985)). Tal como se utiliza en la presente invención el término "proteína" puede incluir truncamientos funcionalmente activos. En algunos casos, especialmente para la expresión en plantas, puede ser ventajoso utilizar genes truncados que expresan las proteínas truncadas. Los genes truncados preferidos codificarán típicamente 40, 41 , 42, 43, 44; 457 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% de la proteína de longitud completa.

Ciertas proteínas de la presente invención han sido ejemplificadas específicamente en la presente invención. Por ejemplo, la identidad y/o similitud puede ser 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% en comparación con una secuencia ejemplificada o sugerida en la presente invención. Cualquier número mencionado anteriormente se puede utilizar para definir los límites superiores o inferiores. A menos que se especifique lo contrario, tal como se utiliza en la presente invención, el porcentaje de identidad y/o similitud de la secuencia de dos ácidos nucleicos se determina utilizando el algoritmo de Karlin & Altschul, 1990, modificado como en Karlin & Altschul 1993. Tal algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al., 1990. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se llevan a cabo con el programa NBLAST, puntaje = 100, longitud de la palabra = 12. Gapped BLAST se puede utilizar según se describió en Altschul eí al., 1997. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se utilizan los parámetros predeterminados de los respectivos programas (NBLAST y XBLAST). Ver sitio web de NCBI/NIH. Para obtener alineaciones discontinuas con el propósito de comparación, se utilizó la función de AlignX del Vector NTI Suite 8 (InforMax, Inc., North Bethesda, MD, E.U.A.), empleando los parámetros predeterminados. Estos fueron: una penalidad de abertura Gap de 15, una penalidad de extensión Gap de 6.66, y un intervalo de penalidad de separación Gap de 8.

Varias propiedades y características tridimensionales de la proteína también se pueden cambiar sin afectar adversamente la actividad/funcionalidad de la proteína. Las sustituciones conservativas de aminoácidos pueden tolerarse o producirse de modo que no afectan adversamente la actividad y/o la configuración tridimensional de la molécula. Los aminoácidos pueden agruparse en las siguientes clases: no-polar, polar sin carga, básico y ácido. Las sustituciones conservativas por las que un aminoácido de una clase se reemplaza con otro aminoácido del mismo tipo están dentro del alcance de la presente invención en la medida que la sustitución no sea adversa para la actividad biológica del compuesto. El cuadro 5 aporta un listado de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.

CUADRO 5 En algunos casos, también pueden hacerse sustituciones no conservativas. Sin embargo, las sustituciones preferidas no se apartan significativamente de la actividad funcional/biológica de la proteína. Tal como se utiliza en la presente invención, la referencia a polinucleótidos "aislados" y/o proteínas "purificadas" se refiere a estas moléculas cuando no están asociadas con las otras moléculas con las cuales ellas se encontrarían en la naturaleza. De este modo, la referencia a "aislada" y/o "purificada" significa la participación de la "mano del hombre" según se describe en la presente invención. Por ejemplo un "gen" bacteriano de la presente invención puesto en una planta para expresión es un "polinucleótido aislado". De igual modo, una proteína derivada de una proteína bacteriana y producida por una planta es una "proteína aislada". Debido a la degeneración/redundancia del código genético, una variedad de diferentes secuencias de ADN pueden codificar las secuencias de aminoácidos reveladas en la presente invención. Está bien dentro de la capacidad de una persona capacitada en la técnica el crear secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas o esencialmente las mismas proteínas. Estas secuencias variantes de ADN están dentro del alcance de la presente invención. Esto además se menciona en detalle a continuación en la sección titulada "Optimización de secuencia para expresión en plantas".

Optimización de secuencia para expresión en plantas. A fin de obtener una elevada expresión de los genes heterólogos en plantas, en general se prefiere rediseñar los genes de modo que se expresen de forma más eficiente en (el citoplasma de) células de plantas. El maíz es una de esas plantas donde se prefiere rediseñar el gen heterólogo antes de la transformación para incrementar su nivel de expresión en dicha planta. Por lo tanto, un paso adicional en el diseño de genes que codifican una proteína bacteriana es el rediseño de un gen heterólogo para expresión óptima, utilizando el sesgo del codón más íntimamente alineado con la secuencia de planta blanco, sea una especie monocotiledónea o dicotiledónea. Además, las secuencias se pueden optimizar para expresión en cualquiera de los tipos más particulares de plantas mencionados en otra parte de la presente invención. Huéspedes transgénicos. Los genes que codifican proteínas de la presente invención se pueden introducir en una amplia variedad de huéspedes microbianos o vegetales. La presente invención incluye células de plantas transgénicas y plantas transgénicas. Las plantas preferidas (y células de plantas) son maíz, Arabidopsis, tabaco, soja, algodón, cañóla, arroz, trigo, revestimiento de césped y de pastoreo, y similares. También se pueden elaborar otros tipos de plantas transgénicas de conformidad con la presente invención, tales como frutos, vegetas, y árboles. Más generalmente, se pueden utilizar dicotiledóneas y monocotiledóneas en varios aspectos de la presente invención. En modalidades preferidas, la expresión del gen da por resultado, directa o indirectamente, la producción íntracelular (y mantenimiento) de las proteínas de interés. Las plantas pueden tornarse resistentes a herbicidas de esta manera. Se puede hacer referencia a tales huéspedes como huéspedes y/o células transgénicas, recombinantes, transformadas y/o transfectadas. En algunos aspectos de esta invención (cuando se clona y prepara el gen de interés, por ejemplo), las células microbianas (preferentemente bacterianas) se pueden producir y utilizar de acuerdo con técnicas estándar, con el beneficio de la presente descripción. Las células de planta transfectadas con un polinucleótido de la presente invención se pueden regenerar en plantas completas. La presente invención incluye cultivos celulares que incluyen cultivos celulares tisulares, cultivos líquidos, y cultivos sembrados. Las semillas producidas por y/o utilizadas para generar plantas de la presente invención además se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Otros tejidos y partes de plantas también se incluyen en la presente invención. La presente invención incluye, de igual modo, métodos para producir plantas o células que contienen un polinucleótido de la presente invención. Un método preferido para producir tales plantas es mediante la plantación de una semilla de la presente invención.

Inserción de genes para formar huéspedes transgénicos. Un aspecto de la presente invención es la transformación/transfección de plantas, células de plantas, y otras células huésped con polinucleótidos de la presente invención que expresan proteínas de la presente invención. Las plantas transformadas de esta manera se pueden tornar resistentes a una variedad de herbicidas con diferentes modos de acción. Se dispone de una variedad de métodos para introducir un gen que codifica una proteína deseada en el huésped blanco en condiciones que permiten un mantenimiento y expresión estable del gen. Estos métodos son bien conocidos para los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Patente Estadounidense No. 5,135,867. Los vectores que comprenden un polinucleótido de AAD-1 están incluidos en el alcance de la presente invención. Por ejemplo, una gran cantidad de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en E. coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas están disponibles para la preparación de la inserción de genes foráneos en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, serie pBR322, pUC, serie M13mp, pACYC184, etc. En consecuencia, la secuencia que codifica la proteína puede insertarse en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se utiliza para transformación en E. coli. Las células de E. coli se cultivan en un medio nutriente adecuado, luego se cosechan y se lisan. El plásmido se recupera por purificación del ADN genómico. El análisis de secuencias, análisis de restricción, electroforesis, y otros métodos biológicos bioquímicos-moleculares se llevan a cabo en general como métodos de análisis. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN utilizada puede ser digerida por restricción y unida a la próxima secuencia de ADN. Cada secuencia de plásmido puede clonarse en el mismo u otros plásmidos. Dependiendo del método de inserción de los genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, el plásmido Ti o Ri se utiliza para la transformación de la célula de planta, entonces al menos el borde derecho, pero a menudo el borde derecho y el izquierdo del ADN-T plásmido Ti o Ri, debe unirse como región flanqueante de los genes a ser insertados. El uso del ADN-T para la transformación de las células de planta ha sido investigado intensamente y se describe en EP 120 516; Hoekema (1985); Fraley et al. (1986); y An eí al. (1985). Se dispone de una gran cantidad de técnicas para insertar ADN a una célula huésped de planta. Esas técnicas incluyen transformación de ADN-T utilizando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, fusión, inyección, biolística (bombardero de micropartículas), filamento de carburo de silicio, emisión de aerosol, PEG, o electroporación así como también otros posibles métodos. Si se utilizan Agrobacteria para la transformación, el ADN debe insertarse para ser clonado en plásmidos especiales, es decir ya sea en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios se pueden integrar en el plásmido Ti o Ri por recombinación homologa debido a secuencias que son homologas a secuencias en el ADN-T. El plásmido Ti o Ri además comprende la región vir necesaria para la transferencia del ADN-T. Los vectores intermedios no pueden replicarse a sí mismos en Agrobacteria. El vector intermedio puede transferirse al Agrobacterium tumefaciens por medio de un plásmido auxiliar (conjugación). Los vectores binarios pueden repicarse a sí mismos tanto en el E. coli como en Agrobacteria. Comprenden un gen marcador de selección y un enlazador o polienlazador que está enmarcado por las regiones límites de ADN-T derecha e izquierda. Se pueden transformar directamente en Agrobacteria (Holsters, 1978). El Agrobacterium utilizado como célula huésped debe comprender un plásmido que transporta una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN-T en la célula de planta. El ADN-T adicional puede estar contenido. La bacateria transformada de este modo se utiliza para la transformación de células de planta. Los explantes de planta se pueden cultivar ventajosamente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula de planta. Las plantas completas luego se pueden regenerar del material de planta infectado (por ejemplo, partes de hoja, segmentos de tallo, raíces, y además protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para selección. Las plantas obtenidas de este modo pueden ensayarse para determinar la presencia del ADN inserto. No se hacen demandas especiales de los plásmidos en el caso de inyección y electroporación. Es posible utilizar plásmidos comunes, tales como, por ejemplo, derivados de pUC. Las células transformadas se desarrollan dentro de las plantas en la manera usual. Pueden formar células germinales y transmitir las características transformadas a plantas progenie. Tales plantas pueden desarrollarse de manera normal y cruzarse con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes. En algunas de las modalidades preferidas de la invención, los genes que codifican la proteína bacteriana se expresan a partir de unidades transcripcionales dentro del genoma de la planta. Con preferencia, dichas unidades transcripcionales son vectores recombinantes capaces de integración estable dentro del genoma de la planta y permiten la selección de líneas de planta transformadas que expresan el ARNm que codifica las proteínas. Una vez que el ADN inserto ha sido integrado en el genoma, está relativamente estable allí (y no sale nuevamente). Normalmente contiene un marcador de selección que confiere, sobre las células vegetales transformadas, resistencia a un biocida o un antibiótico, tal como kanamicina, G418, bleomicina, higromicina, o cloranfenicol, inter alia. Los marcadores seleccionares de planta además, típicamente, pueden aportar resistencia a varios herbicidas tales como glufosinato, (PAT), glifosato (EPSPS), imazethiapir (AHAS), y muchos otros. En consecuencia, el marcador empleado individualmente debe permitir la selección de células transformadas más que de células que no contengan el ADN inserto. El (los) genes de interés se expresan preferentemente mediante promotores constitutivos o inducibles en la célula de planta. Una vez expresado, el ARNm se traduce en proteínas, incorporando de este modo aminoácidos de interés en la proteína. Los genes que codifican una proteína expresada en las células de planta pueden estar bajo el control de un promotor constitutivo, un promotor específico de tejido, o un promotor inducible. Existen varias técnicas para introducir vectores recombinantes foráneos en las células de planta, y para obtener plantas que mantiene de manera estable y expresan el gen introducido. Tales técnicas incluyen la introducción de material genético recubierto sobre micropartículas directamente en las células (Patentes Estadounidenses Nos. 4,945,050 de Cornell y 5,141 ,131 de DowEIanco, actualmente Dow AgroSciences, LLC). Además, las plantas se pueden transformar utilizando la tecnología del Agrobacterium, ver Patentes Estadounidenses Nos. 5,177,010 de Universidad de Toledo; 5,104,310 de Texas A&M; Solicitud de Patente Europea 0131624B1 ; Solicitudes de Patentes Europeas 120516, 159418B1 y 176,112 de Schilperoot; Patentes Estadounidenses Nos. 5,149,645, 5,469,976, 5,464,763 y 4,940,838 y 4,693,976 de Schilperoot; Solicitudes de Patentes Europeas 116718, 290799, 320500, todas de Max Planck; Solicitudes de Patentes Europeas 604662 y 627752, y Patente Estadounidense No. 5,591 ,616, de Japan Tobacco; Solicitudes de Patentes Europeas 0267159 y 0292435, y Patente Estadounidense No. 5,231 ,019, todas de Ciba Geigy, actualmente Syngenta; Patentes Estadounidenses Nos. 5,463,174 y 4,762,785, ambas de Calgene; y Patentes Estadounidenses Nos. 5,004,863 y 5,159,135, ambas de Agracetus. Otra tecnología de transformación incluye tecnología de filamentos. Ver Patentes Estadounidenses Nos. 5,302,523 y 5,464,765, ambas de Zeneca, actualmente Syngenta. La tecnología de electroporación también ha sido utilizada para transformar plantas. Ver WO 87/06614 de Boyce Thompson Institute; Patentes Estadounidenses Nos. 5,472,869 y 5,384,253, ambas de Dekalb; y WO 92/09696 y WO 93/21335, ambas de Plant Genetic Systems. Más aún, los vectores virales también se pueden utilizar para producir plantas transgénicas que expresan la proteína de interés. Por ejemplo, las plantas monocotiledóneas se pueden transformar con un vector viral que utiliza los métodos descritos en la Patente Estadounidense No. 5,569,597 de Micogen Plant Science y Ciba-Geigy (actualmente Syngenta), como así también las Patentes Estadounidenses Nos. 5,589,367 y 5,316,931 , ambas de Biosource, actualmente Large Scale Biology. Como se mencionó previamente, la forma en que se introduce la construcción de ADN al huésped de planta no es crítica para esta invención. Se puede emplear cualquier método que aporte transformación eficiente. Por ejemplo, varios métodos para transformación de células de planta se describen en la presente invención e incluyen el uso de plásmidos Ti o Ri y similares para llevar a cabo la transformación mediada por el Agrobacterium. En muchos casos, será deseable contar con la construcción utilizada para la transformación bordeada sobre uno o ambos lados por bordes de ADN-T, más específicamente el borde derecho. Esto es particularmente útil cuando la construcción utiliza Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como modo para la transformación, si bien los bordes de ADN-T pueden encontrar su uso con otros modos de transformación. Cuando se utiliza Agrobacterium para la transformación de células de planta, se puede utilizar un vector que se puede introducir en el huésped para recombinación homologa con ADN-T o el plásmido Ti o Ri presente en el huésped. La introducción del vector se puede realizar mediante electroporación, apareamiento triparental y otras técnicas para transformar bacterias gram- negativas que es bien conocida de los expertos en la técnica. La forma de transformación del vector en el huésped de Agrobacterium no es crítica para la invención. El plásmido Ti o Ri que contiene el ADN-T para recombinacíón puede ser capaz o incapaz de causar formación de agalla, y no es crítico a dicha invención en la medida que los genes vir estén presentes en dicho huésped. En algunos casos cuando se utiliza Agrobacterium para la transformación, la construcción de expresión que está dentro de los bordes del ADN-T se insertará dentro de un vector de amplio espectro tal como el pRK2 o sus derivados según se describe en Ditta eí al. (1980) y EPO 0 120 515. Incluidos dentro de la construcción de expresión y el ADN-T habrá uno o más marcadores según se describe en la presente invenciónn, que permitirán la selección de Agrobacterium transformado y las células de planta transformadas. El marcador particular empleado no es esencial para esta invención, dependiendo el marcador preferido del huésped y la construcción utilizada. Para la transformación de las células de planta utilizando el Agrobacterium, los explantes se pueden combinar e incubar con el Agrobacterium transformado durante un tiempo suficiente como para permitir su transformación. Después de la transformación, las Agrobacteria se eliminan por selección del antibiótico apropiado y las células de planta se cultivan con el medio selectivo apropiado. Una vez que se forman los callos, la formación de brotes se puede fortalecer empleando las hormonas de planta apropiadas de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica del cultivo de tejidos de plantas y regeneración de plantas. Sin embargo, no siempre es necesaria una etapa intermedia de callo. Después de la formación del brote, dichas células de planta se pueden transferir al medio que fomenta la formación de la raíz completando de este modo la regeneración de la planta. Luego las plantas se pueden desarrollar hacia semilla y dicha semilla se puede utilizar para establecer generaciones futuras. Sin tomar en cuenta la técnica de transformación, el gen que codifica una proteína bacteriana se incorpora con preferencia a un vector de transferencia de genes adaptado para expresar dicho gen en una célula de planta incluyendo en el vector un elemento regulador del promotor de planta, como así también regiones de terminación transcripcional no traducidas 3' tales como Nos y similares. Además de numerosas tecnologías para la transformación de plantas, el tipo de tejido que se pone en contacto con los genes foráneos puede variar. Tal tejido incluiría, pero no estaría limitado, al tejido embriogénico, tipos de tejido de callo I, II y lll, hipocotiledones, meristema, tejido de raíz, tejidos para la expresión en el floema, y similares. Casi todos los tejidos de planta pueden transformarse durante la diferenciación utilizando técnicas apropiadas descritas en la presente invención. Tal como se mencionó anteriormente, se puede utilizar una variedad de marcadores seleccionables, sí se desea. La preferencia de un marcador particular queda a criterio del experto, pero se puede utilizar cualquiera de los siguientes marcadores seleccionables junto con cualquier otro gen no mencionado en la presente invención que podría funcionar como marcador seleccionable. Tales marcadores seleccionables incluyen, pero sin limitación, gen de aminoglicósido fosfotransferasa de transposón Tn5 (Aph II) que codifica la resistencia a los antibióticos kanamicina, neomicina y G418, como así también a los genes que codifican para la resistencia o tolerancia al glifosato; higromicina; metotrexato; fosfinotricina (bialafos o glufosinato); imidazolinonas, sulfonilureas y triazolopirimidina, tales como clorsulfuron; bromoxiníl, dalapon y similares. Además de un marcador seleccionable, puede ser conveniente utilizar un gen indicador. En algunos casos un gen indicador puede utilizarse con o sin un marcador seleccionable. Los genes indicadores son genes que típicamente no están presentes en el organismo receptor y típicamente codifican proteínas que resultan de algún cambio fenotípico o propiedad enzimática. Ejemplos de tales genes se aportan en Weising eí al., 1988. Los genes indicadores preferidos incluyen la beta-glucuronidasa (GUS) dei locus uidA de E. coli, el gen de cloranfenicol acetil transferasa del Tn9 de E. coli, la proteína fluorescente verde de la medusa bioluminiscente Aequorea victoria, y los genes de luciferasa de la luciérnaga Photinus piralis. Luego se puede llevar a cabo un ensayo para detectar la expresión del gen indicador en un momento adecuado después de que dicho gen haya sido introducido a las células receptoras. Un ensayo de este tipo preferido supone el uso del gen que codifica la beta-glucuronidasa (GUS) del locus uidA de E. coli según io describe Jefferson eí al., (1987) para identificar las células transformadas.

Además de los elementos reguladores del promotor de planta, se pueden utilizar, de manera eficiente, los elementos reguladores del promotor de una variedad de fuentes en células de plantas para expresar los genes foráneos. Por ejemplo, se pueden utilizar los elementos reguladores de promotores de origen bacteriano, tales como el promotor de octopin sintasa, el promotor de nopalina sintasa, el promotor de manopina sintasa; promotores de origen viral, tales como el virus del mosaico de la coliflor (35S y 19S), 35T (el cual es un promotor 35S re-diseñado, ver Patente Estadounidense No. 6,166,302, especialmente el Ejemplo 7E) y similares. Los elementos reguladores de promotores de planta incluyen, pero sin limitación, ribulosa-1 ,6-bisfosfato (RUBP) carboxilasa subunidad pequeña (ssu), promotor de beta-conglicinina, promotor de beta-faseolina, promotor de ADH, promotores de choque térmico, y promotores específicos de tejidos. Otros elementos tales como regiones de unión de matriz, regiones de unión de andamiaje, intrones, mejoradores, secuencias de poliadenilación y similares pueden estar presentes y de este modo mejorar la eficiencia de transcripción o integración del ADN. Tales elementos pueden o no ser necesarios para la función del ADN, si bien pueden aportar una mejor expresión o funcionamiento del ADN afectando la transcripción, la estabilidad del ARNm, y similares. Tales elementos pueden estar incluidos en el ADN según se desea para obtener un rendimiento óptimo del ADN transformado en la planta. Los elementos típicos incluyen, pero sin limitación, Adh-intrón 1 , Adh-intrón 6, la secuencia líder de proteína de la cubierta del virus del mosaico de la alfalfa, las secuencias de osmotin UTR, la secuencia líder de proteína de la cubierta del virus de la vena del maíz, como así también otras disponibles para un experto en la técnica. Los elementos reguladores de los promotores constitutivos también se pueden utilizar, dirigiendo de este modo una continua expresión génica en todos los tipos de células y en todo momento (por ejemplo, actina, ubiquitina, CaMV 35S, y similares). Los elementos reguladores de promotores específicos de tejido son responsables por la expresión génica en tipos de tejido o células específicos, tales como las hojas o semillas (por ejemplo, zeína, oleosina, napina, ACP, globulina y similares) y también se pueden utilizar. Los elementos reguladores del promotor además pueden ser activos (o inactivos) durante una cierta etapa del desarrollo de la planta así como también pueden ser activos en tejidos y órganos de planta. Ejemplos de éstos incluyen, pero sin limitación, elementos reguladores del promotor específico del polen, específico del embrión, específico de la seda del maíz, específico de la fibra del algodón, específico de la raíz, específico del endosperma de la semilla, o específico de la fase vegetativa y similares. Bajo ciertas circunstancias puede ser deseable utilizar un elemento regulador del promotor inducible, el cual es responsable por la expresión de genes en respuesta a una señal específica, tal como: estímulo físico (genes de choque térmico), luz (RUBP carboxilasa), hormonas (Em), metabolitos, químicos (respuesta a la tetraciclina), y estrés. Se pueden utilizar otros elementos de transcripción y traducción deseables que funcionan en plantas. En la técnica se conocen numerosos vectores de transferencia génica específicos de planta. También se pueden utilizar sistemas basados en el ARN de virus de plantas para expresar la proteína bacteriana. Al hacer esto, el gen que codifica una proteína puede insertarse en la región promotora de la cubierta de un virus de planta adecuado el cual infectará a la planta huésped de interés. La proteína luego puede expresarse de este modo aportando protección de la planta frente al daño herbicida. Los sistemas basados en ARN de virus de plantas se describen en la Patente Estadounidense No. 5,500,360 de Micogen Plant Sciences, Inc. y las Patentes Estadounidenses Nos. 5,316,931 y 5,589,367 de Biosource, actualmente Large Scale Biology. Todas las patentes, solicitudes de patentes, solicitudes provisorias y publicaciones a las que se hace referencia o se mencionan en la presente invención se incorporan como referencia en su totalidad en la medida que no sean inconsistentes con las enseñanzas explícitas de esta especificación. A continuación se presentan ejemplos que ilustran los procedimientos para poner en práctica la invención. Estos ejemplos no deben considerarse limitantes. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezcla de solventes son en volumen a menos que se especifique lo contrario.

EJEMPLO 1 Método para identificar genes que imparten resistencia al 2,4-D in planta Como una forma para identificar genes que posean actividades degradantes de herbicida in planta, es posible consultar bases de datos públicas actuales tales como la del NCBI (National Center for Biotechnology Information). Para comenzar el proceso, es necesario tener una secuencia génica funcional ya identificada que codifica una proteína con las características deseadas (es decir, una actividad de la a-cetoglutarato dioxigenasa). Esta secuencia proteica luego se utiliza como la entrada para el algoritmo de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul eí al., 1997) para comparar contra las secuencias proteicas de NCBI depositadas disponibles. Utilizando parámetros predeterminados, esta investigación retorna por encima de 100 secuencias proteicas homologas en variados niveles. Estos varían desde una identidad muy idéntica (85-98%) a muy baja (23-32%) en el nivel de aminoácidos. Tradicionalmente sólo las secuencias con alta homología podrían retener propiedades similares a la secuencia de entrada. En este caso, se elige sólo las secuencias con <50% de homología. Se continúa con la ejemplificación de que la clonación y los homólogos que se expresan en forma recombinante con tan poco como el 27% de conservación de aminoácidos, se pueden utilizar para impartir niveles comerciales de resistencia no sólo al herbicida destinado, sino además a los sustratos que nunca han sido ensayados previamente con estas enzimas.

PCR y clonación del gen en pET. Se identificó un único gen (rdpA) de la base de datos de NCB1 (ver el sitio web ncbi.nlm.nih.gov; acceso #AF516752) como homólogo con sólo 28% de identidad de aminoácidos al tfdA de Ralstonia eutropha. El porcentaje de identidad se determinó primero traduciendo ambas secuencias de ADN del rdpA y el tfdA depositadas en la base de datos a proteínas, luego utilizando el ClustalW en el paquete de software VectorNTI para llevar a cabo la alineación de secuencias múltiple. La cepa del Sphingobium herbicidovorans que contiene el gen rdpA se obtuvo de ATCC (American Type Culture Collection cepa #700291 ). La cepa liofilizada se reanimó de acuerdo con el protocolo de ATCC y se almacenó a -80°C en glicerol 20% para uso interno como la cepa Dow Bacterial DB 536. A partir esta solución para almacenamiento congelada, se sembró una placa de Triptic Soy Agar con un asa de células para aislamiento, y se incubó a 28°C durante 3 días. Se utilizó una única colonia para inocular 100 ml de caldo de Tryptic Soy in un matraz de tres pantallas de 500 ml, el cual se incubó durante toda la noche a 28°C en un agitador de piso a 150 rpm. A partir de esto, el ADN total se aisló con el protocolo gram negativo del equipo DNeasy de Qiagen (Qiagen cat. #69504). Los siguientes iniciadores se diseñaron para amplificar el gen blanco del ADN genómico, delantero: 5' TCT AGA AGG AGA TAT ACC ATG CAT GCT GCA CTG TCC CCC CTC TCC CAG CG 3' [(SEQ ID NO:1 ) (sitio de restricción Xba I agregado y sito de unión al ribosoma (RBS))] y Reverso: 5' CTC GAG TTA CTA GCG CGC CGG GCG CAC GCC ACC GAC CG 3' [(SEQ ID NO: 2) (codón de paro extra adicionado y sitio Xho I)]- Se establecieron reacciones de veinte microlitros de la siguiente manera: iniciador MasterMix 8 µl, ea. 1 µl (50 pmoles/µl), ADNg 2.5 µl, H20 7.5 µl. Luego se llevó a cabo la PCR en las siguientes condiciones: 94°C 45 segundos, 52°C 1.5 minuto, 72°C 1.5 minutos, durante 30 ciclos, seguido de un ciclo final de 72°C 5 minutos, utilizando el equipo Master Taq de Eppendorf (Eppendorf cat. #0032 002.250). El producto resultante de PCR de ~1 kb se clonó en pCR 2.1 (Invitrogen cat. # K4550-40) siguiendo el protocolo incluido TOP10F' E. coli químicamente competente como la cepa huésped, para verificación de la secuencia nucleotídica. Diez de las colonias blancas resultantes se levantaron en 4 ml de caldo Luria + 50 µg/ml de Kanamicin (LB K), y se desarrollaron durante la noche a 37°C con agitación. Los plásmidos se purificaron a partir de cada cultivo utilizando el equipo de Promega Wizard Plus SV (Promega cat. #A1460) y siguiendo el protocolo incluido. El secuenciamiento se llevó a cabo con el equipo Beckman CEQ Quick Start (Beckman Coulter cat. #608120) utilizando iniciadores delantero M13 (5' GTA AAA CGA CGG CCA GT 3') (SEQ ID NO: 16) y Reverso (5' CAG GAA ACÁ GCT ATG AC 3') (SEQ ID NO: 17) según instrucciones del fabricante. Esta secuencia génica (SEQ ID NO: 3), y su proteína correspondiente (SEQ ID NO: 9) recibió una nueva designación general para uniformidad interna AAD-1 (v1) (AriloxiAlcanoato Dioxigenasa).

Utilizando las enzimas de restricción correspondientes a los sitios agregados con los conectores del iniciador (Xba 1 , Xho 1 ) el AAD-1 (v1) se cortó del vector pCR2.1 vector y se ligó a un vector pET 280 resistente a estreptomicina/espectinomicina. Los productos ligados luego se transformaron en TOP10F' E. coli, y se sembraron sobre el Caldo Luria + 50 µg/ml en placas de estreptomicina & espectinomicina (LB S/S) agar. Para diferenciar entre las ligaciones de AAD-1 (v1):pET 280 y pCR2.1 :pET 280, aproximadamente se levantaron 20 colonias aisladas en 6 ml de LB S/S, y se desarrollaron a 37°C durante 4 horas con agitación. Luego se sembró en manchas cada cultivo sobre placas LB K, las cuales se incubaron a 37°C durante toda la noche. Las colonias que se desarrollaron sobre el LB K se presume que tienen el vector pCR2.1 ligado en ellas, y se descartaron. Los plásmidos se aislaron de los cultivos remanentes como se hizo anteriormente. Esta construcción de expresión se denominó pDAB 3203.

EJEMPLO 2 Expresión y Ensayo 2.1 - Análisis de CLAR El plásmido pDAB 3203 se mantuvo congelado a -80°C en células TOP10F' (Invitrogen) como cepa DR 1878 recombinante Dow. Para la expresión, el plásmido de ADN purificado dei cultivo de TOP10F' utilizando el equipo Wizard de Promega (Fisher cat. #PR-A1460) se transformó en células de BL-21 Star (DE3) (Invitrogen cat. #C6010-03) siguiendo el protocolo del fabricante. Después de la transformación, se sembraron 50 µl de las células sobre placas de LB S/S agar y se incubaron durante la noche a 37°C. A la mañana siguiente, todas las colonias de la planta completa se desecharon en 100 mis de LB en un matraz con tres desviaciones de 500 ml y se incubaron a 37°C/200 rpm durante 1 hora. Luego se indujo la expresión génica con IPTG 1 mM, y se incubó durante 4 horas a 30°C/200 rpm. Los 100 ml de cultivo se centrifugaron a 4000 rpm durante 20 minutos. Luego se descartaron los sobrenadantes, y los concentrados se suspendieron nuevamente en 10 ml de MOPS 50 mM. Estos luego se sometieron a tres rondas de sonicación de 45 segundos para lisar las células. A continuación, los usados se centrifugaron a 15,000 rpm para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se pipeteó y se almacenó a 4°C. Para controlar la expresión recombinante, se procesó una alícuota de 20 µl sobre un gel de Tris Glicina 4-20% (Invitrogen cat. #EC60255). Después que se confirmó la expresión, se ensayó la actividad enzimática de la siguiente forma. Primero, se desaló una alícuota del extracto celular con un cartucho de PD-10 (Amersham cat. #17-0435-01 ). Luego, esto se utilizó para reacciones enzimáticas con herbicidas subsiguientes. Para cada reacción, se combinó lo siguiente: 2,4-D (125 µg/ml), [Ascorbato (1 mM), ion ferroso (50 µM), a-cetoglutarato (1 mM), en MOPS 100 mM], extracto celular (100 µl). Luego esta reacción se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos, después de lo cual la reacción se detuvo con la adición de HCl 0.1 N hasta que el pH estuvo entre 2 y 3. La mitad del volumen de la reacción (-500 µl) se dejó para bioensayo, el volumen restante se extrajo orgánicamente utilizando tubos de Extracción de Fase Sólida (Fisher cat. #11 -131-6), eluyendo con 400 µl de acetonitrilo + 0.05% de TFA. Luego los extractos se ensayaron en CLAR para determinar la pérdida del pico de 2,4-D o presencia de cualquier pico adicional dando resultante de la degradación o modificación del 2,4-D. Las condiciones para la CLAR fueron: Luna 10µ C18(2) 250 x 4.6mm (Phenomenex cat. #00G-4253-E0), procesado a 50% de ACN + 0.05% de TFA: 50% de H20 + 0.05% de TFA a 100% de ACN + 0.05% de TFA durante 5 minutos. 2.2 - Bioensavos de ensayo en placa para degradación de herbicida. Los bioensayos se utilizaron para determinar si la transformación herbicida enzimática in vitro daba por resultado una pérdida concomitante en la actividad herbicida. Debido a la naturaleza selectiva de los herbicidas que se ensayan (es decir plantas monocotiledóneas controladas por herbicidas tipo AOPP y plantas dicotiledóneas controladas por herbicidas auxínicos), se utilizaron Agrostis palustris de tipo silvestre var. Pencross y Arabidopsis thaliana var. Columbia como especies de ensayo monocotiiedóneas y dicotiledóneas respectivamente. Cada especie es apta para germinación y desarrollo en cajas pequeñas de Petri.

Las semillas de Arabidopsis se esterilizaron en superficie durante 10 minutos en solución blanqueadora comercial/agua desionizada al 50% (v/v) con 1 µl de Tween-20 agregado como agente humectante con agitación vigorosa (agitador de mesa a 250 rpm). La solución blanqueadora se decantó dentro de un capuchón estéril y se enjuagó tres veces con agua estéril. Las semillas de agróstide se esterilizaron en superficie durante 20 minutos de igual manera. . Se agregaron veinte a treinta semillas esterilizadas para cada especie de ensayo sobre un Medio de Ensayo de Plaga de agar solidificada, estéril (PTM) [KNO32.5 M, KH2PO42.5 mM, FeSO450 mM, NaEDTA 10 mM (pH 8.0), MgS04 2 mM, Ca(N03)2 2 mM, H3BO3 70 µM, MnCl2 14 µM, CuS04 0.5 µM, ZnS04 1 µM, NaMo04- 2H20 0.2 µM, NaCI 10 µM, CoCI2- H2O 10 nM, 0.8% (p/v) de sacarosa, 0.4% de agarosa (p/v)] para bioensayo en cajas de Petri de 60x15 mm (Falcon 1007). Además el PTM se modificó agregando hasta seis proporciones de estándares de herbicida de ensayo o diluciones de solución de ensayo herbicida-enzimáticas de modo que los incrementos de cuatro veces la concentración cubrieron un intervalo de proporciones de tres órdenes de magnitud con la proporción de GR50 (50% de reducción del desarrollo) aproximadamente en el centro del intervalo. Para soluciones de ensayo herbicida-enzima, la máxima concentración se determinó en base a la concentración nominal antes de que cualquier degradación enzimática subsiguiente pudiera ocurrir. Las semillas se dispersaron uniformemente agregando 3 ml de PTM fundido de la misma composición, rotando, y permitiendo la solidificación. Las placas se sellaron y se mantuvieron en condiciones estériles en una cámara de desarrollo a baja luz (24 horas día"1, 100 µE/m2s1, 23°C) durante 7 días. La longitud de la raíz o la longitud de raíz + brote se midieron para cinco plantas de Arabidopsis y agróstide, respectivamente; se determinó la longitud media promedio (porcentaje de control no tratado) vs. la concentración herbicida nominal y la Este bioensayo se utilizó para confirmar la pérdida de actividad herbicida como resultado de la degradación del AAD-1 (v1 ) de la cadena lateral de oxialcanoato de varios herbicidas relevantes para uso agronómico. En varios casos, el producto fenol anticipado co-eluido con el ácido progenitor sobre CLAR y el bioensayo sirvió como selección primaria para degradación herbicida. Los cuadros 6 y 7 representan sustratos herbicidas ensayados.

CUADRO 6 VO * El vector blanco representa el tratamiento del lisado celular donde el vector de E. coli pET no tenía inserto de gen. ** La relación GR50 es una medida de la pérdida de actividad herbicida del tratamiento de lisado que expresa la enzima vs. tratamientos de vector blanco. Un número >2 se considera el umbral para detectar la pérdida de actividad herbicida con este ensayo.

CUADRO 7 J * El vector blanco representa el tratamiento del lisado celular donde el vector de E. coli pET no tenía inserto de gen. ** La relación GR50 es una medida de la pérdida de actividad herbicida del tratamiento de lisado que expresa la enzima vs. tratamientos de vector blanco. Un número >2 se considera el umbral para detectar la pérdida de actividad herbicida con este ensayo. 2.3 - Resultados de CLAR De la literatura, se conoce que las enzimas de dioxigenasa en esta clase requieren a-cetoglutarato como co-sustrato (para un esquema general, véase el esquema A) y ion ferroso para unirse en el sitio activo. Con referencia al esquema A éste muestra un esquema general para la escisión por parte de la dioxigenasa de herbicidas tipo fenoxi auxina o AOPP.

ESQUEMA A substrato (quiral) intermedio fenol AAD-1 7 A glioxilato a-cetoguturato succinato CO, • La adición de 02 es esteroespecífica • La ruptura del intermedio a fenol + glioxilato es espontánea Otros experimentos en la literatura han demostrado que la adición de ascorbato incrementó la actividad enzimátíca manteniendo el hierro en estado reducido, previniendo de este modo que la enzima sea degradada. En base a este trabajo previo, se realizaron ensayos iniciales con la presunción de que la enzima de la invención trabajaría de la misma forma que otros miembros de esta clase general de enzima. Sorprendentemente, los resultados de la CLAR inicial mostraron la presencia de un nuevo pico a 6.1 minutos, además de un pico reducido de 2,4-D a 5.5 minutos. Este nuevo pico no estuvo presente en el ensayo de control. Para una identificación inicial del pico a 6.1 minutos, se procesó un control de DCP en nuestras condiciones de ensayo y predeciblemente esto además eluyó a 6.1 minutos. La formación de este producto se confirmó utilizando un ensayo colorimétrico para detectar fenoles (ver ejemplo 3.1 ) como así también espectrometría de masa. Según se esperaba, el AAD-1 (v1 ) lleva a cabo una reacción similar a la de los otros miembros de esta clase de enzima. En el bioensayo, estas mismas muestras además mostraron tener una pérdida casi completa de la actividad herbicida del 2,4-D en el ensayo de placa de Arabidopsis (figura 1 ). Sin considerar las condiciones específicas del ensayo (es decir, incubaciones más prolongadas, más enzima), sólo el 50-75% del 2,4-D se podría degradar a DCP según se midió por CLAR. En realidad, la inducción más larga de las células de BL-21 E. coli con IPTG sólo dio por resultado menos enzima activa, aunque se expresó más proteína recombínante total. Después de mostrar la degradación del 2,4-D, se ensayaron sustratos adicionales con sustituciones de anillo similares (es decir, oxiacetatos y oxipropionatos). Los primeros compuestos ensayados fueron los análogos de piridina fluroxipir y triclopir, los cuales son piridíniloxiacetatos. No se detectó actividad enzimática sobre ninguno de estos como sustratos. Ensayos adicionales sobre varios análogos de estos dos piridiniloxiacetatos con los grupos flúor o amino eliminados tampoco se degradaron. De manera interesante, sin embargo, un flúor en la posición 5 del 2,4-D dio por resultado una pérdida casi total de la degradación enzimática (ver la próxima sección para resultados adicionales). Los inhibidores de ACCasa, haloxifop y diclofop, luego se ensayaron utilizando las mismas condiciones que con el 2,4-D. (Los metabolitos de fenol correspondientes co-eluyeron con el compuesto progenitor en las condiciones de CLAR utilizadas). Los resultados del bioensayo de estas muestras mostraron pérdida de actividad herbicida contra el haloxifop (figura 2) y diclofop. Estos resultados además se confirmaron mediante el ensayo colorimétrico, que además se utilizó para ensayar un muestreo más amplio de estos compuestos. 2.4 - Bioensayos de ensayo de placa para degradación de herbicida Los resultados de ensayos de bioensayo corroboraron los resultados de CLAR iniciales que indicaron pérdida de 2,4-D progenitor luego de la incubación de soluciones de 2,4-D con extractos de AAD-1 (v1 ) recombinante no purificado (figura 1 ). Además, la actividad herbicida del ácido fenoxipropiónico, diclorprop, también se degradó de manera eficaz. La relación del GR5u nominal para la solución de herbicida+enzima versus la solución de herbicida sola sirvió como medición de pérdida de la actividad herbicida progenitora resultante de la actividad enzimática. Una relación de 2-3 típicamente se correlacionó con 50-75% de pérdida de actividad herbicida progenitora (cuadro 6). A menudo no se pudo determinar la GR50 siguiendo el tratamiento enzimático; de facto, no quedó actividad herbicida detectable. La clase de AOPP de herbicidas, también sirvió como sustratos excelentes para AAD-1 (v1 ) según se muestra mediante la degradación casi completa de actividad graminicida utilizando el bioensayo de placa de agróstide (figura 2 y cuadro 7). Estos datos son significativos puesto que esta es la primera observación informada acerca de que cualquier miembro de esta clase de enzima es activo sobre herbicidas fuera de las fenoxi auxinas. Las implicaciones son que esta enzima es lo suficientemente promiscua como para utilizar químicos con subestructuras similares de fenoxialcanoato aún cuando tengan modos completamente diferentes de acción como herbicidas.

EJEMPLO 3 Ensayo In vitro de actividad de AAD-1 (v1) mediante detección colorimétrica por fenol 3.1 - Ensayo de AAD-1 (v1 ). La actividad enzimática de AAD-1 (v1 ) se midió por detección colorimétrica del producto fenol utilizando un protocolo modificado a partir del Fukumori & Hausinger (1993) (J. Biol. Chem. 268: 24311-24317) para permitir el despliegue en un formato de microplaca de 96 pozos. El ensayo colorimétrico se ha descrito para su uso en la medición de la actividad de dioxigenasas que escinden ei 2,4-D y diclorprop para liberar el producto 2,4-diclorofenol. Sin embargo, otros fenoles podrían liberarse potencialmente a partir de herbicidas de ariloxialcanoato diferentes tales como haloxifop y cihalofop (véase el esquema B). Con referencia al esquema B éste muestra fenoles anticipados producidos a partir de herbicidas representativos catalizados por AAD-1.

ESQUEMA B Haloxifop El rendimiento de color de varios fenoles se comparó con el del 2,4-diclorofenol utilizando el método de detección previamente descrito para evaluar cuáles productos de fenol podrían detectarse fácilmente. Los fenoles y análogos de fenoles se ensayaron a una concentración final de 100 µM en 0.15 ml de MOPS 20 mM pH 6.75 conteniendo NH4(FeS04)2 200 µM, ascorbato de sodio 200 µM. Los fenoles derivados de haloxifop y cihalofop tenían rendimientos de colores equivalentes al del 2,4-diclorofenol y por lo tanto se detectaron fácilmente. Los piridinoles derivados fluroxipir y triclopir no produjeron color significativo. El rendimiento del color de 2,4-diclorofenol y del haloxifop fenol fue lineal y proporcional a la concentración dei fenol en el ensayo hasta -500 µM. Una curva de calibración realizada en condiciones de ensayo estándar (160 µl de volumen de ensayo final) indicó que se obtuvo una absorbancia a 510 nm de 1.0 a partir de fenol 172 µM. Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo en un volumen total de 0.15 ml de MOPS 20 mM pH 6.75 conteniendo NH4FeS04 200 µM, ascorbato de sodio 200 µM, a-cetoglutarato 1 mM, el sustrato apropiado (agregado de una solución de almacenamiento 100 mM realizada en DMSO), y la enzima. Los ensayos se iniciaron por la adición del sustrato de ariloxialcanoato, la enzima o a-cetoglutarato en tiempo cero. Después de 15 minutos de incubación a 25°C, la reacción se detuvo por la adición de 10 µl de EDTA sódico 100 mM. El color se desarrolló por la adición de 15 µl de regulador de pH 10 (3.09 g de ácido bórico + 3.73 g de KCI + 44 ml KOH 1 N), 1.5 µl de 4-aminoantipirina al 2% y 1.5 µl de ferrocianuro de potasio al 8%. Después de 10 a 20 minutos, la absorbancia a 510 nm se registró en un lector espectrofoto métrico de microplaca. Los blancos contenían todos los reactivos salvo la enzima para dar cuenta de la contaminación leve ocasional de algunos de los sustratos por pequeñas cantidades de fenoles. Se realizaron ensayos posteriores consolidando las adiciones de la siguiente manera: la reacción se templó por la adición de 30 µl de una mezcla 1 :1 :1 de Na EDTA 50 mM; regulador de pH 10 y 4-aminoantipirina al 0.2%, luego agregando 10 µl de ferrocianuro de potasio al 0.8%. 3.2 - Extracción Actividad del AAD-1 (v1 ) recombinante expresado en Escherichia coli. Los concentrados de células de E. coli se suspendieron nuevamente en Tris 0.1 M, pH 7.4 + 1 mg/ml de lisozima (5 ml/células de cultivo de 250 ml; 20 ml/células de 1 litro) a temperatura ambiente. Después de aproximadamente 15 minutos con agitación ocasional, la suspensión se congeló en nitrógeno líquido y luego se descongeló. La DNasa se agregó a 0.02 mg/ml de concentración final y MgCI2 a 1 mM. Una vez que el extracto dejó de ser viscoso, el extracto se centrífugo durante 15 minutos. El sobrenadante se pasó sobre una columna a BioRad 10DG pre-equilibrada con MOPS 20 mM pH 6.75 y el eluyente se almacenó en alícuotas a -70°C. Los ensayos se llevaron a cabo ya sea con estos extractos desalados no purificados o con enzimas purificadas. Un concentrado celular de un cultivo de 250 ml de células E. coli inducidas que expresan el pDAB3203 que contiene el gen que codifica el AAD-1 (v1) se extrajo y se ensayó utilizando los protocolos descritos previamente. La actividad de escisión del 2,4-D en el extracto de AAD-1 (v1 ) se comparó con la de las células de E. coli que expresan un vector sin AAD-1 (v1) utilizando 2,4-D 1 mM y se muestra en la Figura 3. La cantidad de 2,4-diclorofenol formado es claramente proporcional a la cantidad de extracto agregado al ensayo por lo que el extracto de control no contiene actividad de escisión del 2,4-D. La actividad de este extracto se ensayó en otros cuatro herbicidas, (R,S)-diclorprop, (R,S)-mecoprop, (R,S)-haloxifop y (R,S)-diclofop en comparación con el 2,4-D (todos a una concentración final de 0.5 mM) utilizando 4 µl del extracto de E. coli por ensayo con un período de ensayo de 15. La Figura 4A muestra que el AAD-1 (v1 ) escindió los cinco herbicidas para dar un fenol con actividad relativa sobre los sustratos que son diclorprop = mecoprop > diclofop > haloxifop > 2,4-D. De este modo el AAD-1 (v1 ) tiene actividad sobre herbicidas de ariloxifenoxipropionato graminicida como así también de fenoxi auxinas. El extracto de AAD-1 (v1 ) luego se ensayó utilizando (R,S)-haloxifop racémico, el enantiómero R de haloxifop y el enantiómero S de cihalofop (todos a 0.5 mM) como sustratos potenciales para evaluar la especificidad probablemente enantiomérica del AAD-1 (v1 ). Los resultados se muestran en la Figura 4B. La actividad de la enzima sobre el (R)-haloxifop fue equivalente a la del (R,S)-haloxifop por lo que no se registró actividad sobre el enantiómero S de cihalofop indicando que el AAD-1 (v1 ) tiene especificidad R sobre los AOPPs.

EJEMPLO 4 Especificidad de sustrato de AAD-1 (v1) 4.1 - Sustratos adicionales de AAD-1 (v1 ). Se ensayó la especificidad de sustrato de AAD-1 (v1 ) hacia una variedad de herbicidas comerciales y experimentales. El AAD-1 (v1 ) purificado se utilizó a ya sea 1 o 10 µg por 160 µl de ensayo y cada sustrato se ensayó a 1 mM con un tiempo de ensayo de 15 minutos. El Cuadro 3 muestra la A510 detectada después de la acción del AAD-1 (v1 ) sobre una variedad de herbicidas de ariloxialcanoato auxínico y análogos de auxina. El mejor sustrato ensayado fue diclorprop, siendo el mecoprop también escindido eficazmente. Otros dos fenoxipropionatos, los análogos 4-fluoro y 3-amino de diclorprop, también fueron escindidos eficazmente por el AAD-1 (v1 ). El AAD-1 (v1 ) produjo pequeñas cantidades de fenol de una variedad de fenoxiacetatos incluyendo el 2,4-D. Las velocidades relativas de estos sustratos se midieron mejor a partir de los ensayos utilizando las cantidades más elevadas (10 µg) del AAD-1 (v1 ). A partir de estos datos, el 2,4-D es escindido por AAD-1 (v1 ), como lo son dos fenoxialquilsulfonatos, X188476 y X398166 (sesopa). El Cuadro 4 muestra los datos para una variedad de herbicidas graminicidas de AOPP como sustratos de AAD1 y además del antídoto cloquintocet. Todos los herbicidas tipo AOPP comerciales ensayados se escindieron eficazmente por AAD-1 (v1 ). Este es un hallazgo inesperado y aumenta enormemente la utilidad potencial de esta enzima confiriendo resistencia a una amplia variedad de herbicidas graminicidas en usos transgénicos, además de las auxinas. EI AAD-1 (v1 ) tiene la actividad más elevada sobre quizalofop (76% de la velocidad de diclorprop) y la actividad más baja sobre cihalofop (27% de la velocidad de quizalofop, 21% de la proporción de diclorprop). El análogo de ariloxiacetato de haloxifop (X043865) se escindió muy lentamente con sólo un pequeño aumento en A510 utilizando la cantidad más elevada de enzima (10 µg). Esto es uniforme con la actividad más elevada de AAD-1 (v1 ) vista sobre los fenoxipropionatos con relación a los fenoxiacetatos de auxina. La actividad mínima se detectó sobre (S)-cihalofop indicando que el AAD-1 (v1 ) tiene una preferencia significativa por los enantiómeros R de los sustratos de ariloxipropionato. De manera similar, no se observó actividad contra ei antídoto de quinolinoxiacetato, cloquintocet, lo cual es consistente con la observación de que el AAD-1 (v1 ) prefiere los sustratos de ariloxipropionato sobre las fenoxi auxinas. Los sustratos X11115427, X124987 y MCPA se ensayaron a 1 mM utilizando 27 µg de AAD-1 (v1 ) bruto recombinante por ensayo. Los tres compuestos fueron sustratos para la ADD-1 (v1 ) pero con diferente efectividad relativa (Cuadro 8). El X11115427 fue levemente mejor como sustrato que el 2,4-D (125% de la proporción de 2,4-D) en contraste con el análogo cercano 3-amino-diclorprop, el cual es aproximadamente 7 veces mejor que el 2,4-D como sustrato (Cuadro 3). La sustitución de 5-F parece disminuir la efectividad del X11115427 como sustrato para el AAD-1 (v1). Las velocidades de formación del producto a partir de 5-F-fenoxiacetato y MCPA fueron 32% y 55% del 2,4-D respectivamente. Cuadro 8: Efecto de la AAD-1 (v1 ) sobre los tres sustratos con relación al 2,4-D. Los sustratos se ensayaron como en el Cuadro 6 a 1 mM utilizando un extracto de AAD-1 (v1 ) bruto recombinante de E. coli.

CUADRO 8 4.2 — Caracterización cinética. Los valores de Km y kcat de AAD-1 (v1 ) purificado (ver Ejemplo 10) se determinaron para cuatro sustratos herbicidas, (R)-diclorprop, (R)-haloxifop, (R)-quizalofop y 2,4-D en condiciones de ensayo estándar (MOPS 25 mM, pH 6.8; ascorbato de Na 200 µM; Fe2+ 200 µM; a-cetoglutarato 1 mM; 25° C). Las curvas de respuesta a la dosis se fijaron usando Grafit (Erithacus Software, Reino Unido), y los gráficos y constantes derivadas se muestran en la Figura 5 y el Cuadro 9 respectivamente. Los valores de Km para los cuatro sustratos fueron bastante similares (75-125 µM), pero los valores de kcat variaron significativamente. El (R)-diclorprop tuvo el valor de kcat más elevado y el 2,4-D el más bajo (10% en comparación con el de (R)-diclorprop). Estos valores de kcat fueron consistentes con el intervalo de valores observados en los ensayos de especificidad de sustrato que se muestra en el Cuadro 3 y el Cuadro 4 ya que estos se llevaron a cabo a concentraciones de sustrato elevadas (de saturación) (1 mM). Cuadro 9: Constantes cinéticas para sustratos de AAD-1 (v1 ). Las constantes cinéticas derivaron de los datos de la Figura 5 utilizando ajuste de Grafit para la ecuación de Michaelis-Menten.

CUADRO 9 Los valores de Km y kcat para diclorprop y 2,4-D difieren significativamente de los publicados para la dioxigenasa R específica del Delftia acidovorans de Westendorf eí al. (2003) (Acta Biotechnol. 23: 3-17). El valor de kcat/Km publicado para 2,4-D es 0.6% del de diclorprop, mientras que en nuestros estudios, el valor de kcat/Km para 2,4-D es 8% del de diclorprop. De este modo, en este estudio, AAD-1 (v1 ) es inesperadamente eficaz para catalizar la escisión del 2,4-D. Esto incrementa su utilidad potencial para conferir características de tolerancia herbicida diversa en aplicaciones transgénicas. 4.3 - Sustratos adicionales para AAD-1 (v1 ). Se ensayaron tres sustratos adicionales a 1 mM utilizando 27 µg de AAD-1 (v1 ) bruto recombinante por ensayo: X11115427, X124987 y MCPA. Los resultados se muestran en el cuadro 8. Los tres compuestos fueron sustratos para AAD-1 (v1 ) pero con diferente efectividad relativa. El X11115427 sólo fue levemente mejor (125%) como sustrato que el 2,4-D. Esto es en contraste con el 3-aminodiclorprop el cual es siete veces mejor que el 2,4-D como sustrato (Cuadro 3). De este modo, la sustitución 5-F ha disminuido significativamente la efectividad de X11115427 como sustrato para AAD-1 (v1 ). Un patrón similar se observa con el 5-F-2.4-D el cual es solamente 32% tan efectivo como sustrato con relación al 2,4-D. En este ensayo, el MCPA además fue menos efectivo como sustrato de AAD-1 (v1 ) (55% con relación al 2,4-D).

EJEMPLO 5 Optimización de la secuencia para la expresión en plantas 5.1 - Antecedentes Para obtener una expresión alta de los genes heterólogos en plantas, se puede preferir rediseñar dichos genes de modo que se expresen en forma más eficiente en (el citoplasma de) células de planta. El maíz es un tipo de planta tal en la cual es preferible re-díseñar el gen o genes heterólogos antes de la transformación para aumentar su nivel de expresión en dicha planta. Por lo tanto, un paso adicional en el diseño de genes que codifican una proteína bacteriana consiste en re-diseñar un gen heterólogo para una expresión óptima. Una razón para re-diseñar una proteína bacteriana para expresión en maíz es el contenido de G+C no óptimo del gen natural. Por ejemplo, el contenido de G+C muy bajo de muchos genes bacterianos naturales (y el consiguiente sesgado hacia el contenido de A+T alto) da por resultado la generación de secuencias que imitan o duplican las secuencias de control génico de planta que son conocidas como muy ricas en A+T. La presencia de algunas secuencias de A+T ricas dentro del ADN de los genes introducidos en plantas (por ejemplo las regiones de caja TATA normalmente halladas en promotores génicos) pueden dar por resultado una transcripción aberrante de los genes. Por otro lado, la presencia de otras secuencias reguladoras en el ARNm (por ejemplo, secuencias de señal de poliadenilación (AAUAAA), o secuencias complementarias a pequeños ARNs nucleares involucrados en el pre-corte y empalme del ARNm) pueden conducir a la inestabilidad del ARN. Por lo tanto, un objetivo en el diseño de genes que codifican una proteína bacteriana para expresión de maíz, con mayor preferencia denominada gen optimizado de planta, consiste en generar una secuencia de ADN que tiene un contenido de G+C más alto, y con preferencia uno próximo al de los genes de maíz que codifican las enzimas metabólicas. Otro objetivo en el diseño de los genes optimizados de planta que codifican una proteína bacteriana consiste en generar una secuencia de ADN en la cual las modificaciones de la secuencia no impidan la traducción. El Cuadro 10 ilustra cuan alto es el contenido de G+C en el maíz. Para los datos del cuadro 10, regiones codificadoras de los genes se extrajeron de las entradas del GenBank (Publicación 71 ), y las composiciones de bases se calcularon utilizando el programa MacVectorTM (Accelerys, San Diego, California). Las secuencias de intrón se ignoraron en los cálculos.

CUADRO 10 Compilación del contenido de G + C de las regiones codificadoras de proteína de los genes del maíz Clase de Proteína.sup.a Intervalo % % Medio G + G + C C.sup.b Enzimas metabólicas (76) 44.4-75.3 59.0 (.+-.8.0) Proteínas estructurales (18) 48.6-70.5 63.6 (.+-.6.7) Proteínas reguladoras (5) 57.2-68.8 62.0 (.+-.4.9) Proteínas no caracterizadas 41.5-70.3 64.3 (.+-.7.2) (9) Todas las Proteínas (108) 44.4-75.3 60.8 (.+-.5.2) .sup.a Cantidad de genes de la clase dada entre paréntesis. .sup.b Desviaciones estándar dadas entre paréntesis. .sup.c Grupos combinados medios ignorados en el cálculo medio Debido a la plasticidad otorgada por la redundancia/degeneración del código genético (es decir, algunos aminoácidos son especificados por más de un codón), la evolución de los genomas en diferentes organismos o clases de organismos ha dado por resultado un uso diferencial de codones redundantes. Este "sesgo de codones" se refleja en la composición de bases media de regiones codificadoras de proteínas. Por ejemplo, los organismos con contenido de G+C relativamente bajo utilizan codones que tienen A o T en la tercera posición de los codones redundantes, por lo que aquellos que tienen contenido de G+C más elevados utilizan codones que tienen G o C en la tercera posición. Se piensa que la presencia de codones "menores" dentro de un ARNm puede reducir la proporción de traducción absoluta de ese ARNm, especialmente cuando la abundancia relativa del ARNt cargado correspondiente al codón menor es baja. Una extensión de esto es que la disminución de la proporción de traducción por codones menores individuales sería al menos aditiva para codones menores múltiples. Por lo tanto, los ARNm que tienen un contenido relativo alto de codones menores tienen las proporciones de traducción correspondientemente bajas. Esta proporción estaría reflejada por subsiguientes niveles bajos de la proteína codificada.

En el diseño de genes que codifican una proteína bacteriana para expresión de maíz (u otra planta, tal como algodón o soja), se ha determinado el sesgo de codones de la planta. El sesgo de codones para el maíz es la distribución estadística de codones que la planta utiliza para codificar sus proteínas y el uso preferido de codones se muestra en el cuadro 11. Después de determinar el sesgo, se determina el porcentaje de frecuencia de los codones en los genes de interés. Los codones primarios preferidos por la planta deben ser determinados, como así también la segunda, tercera y cuarta selección de codones preferidos cuando existen múltiples selecciones. Se puede diseñar entonces una nueva secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína bacteriana, pero la nueva secuencia de ADN difiere de la secuencia de ADN bacteriana nativa (que codifica la proteína) por la sustitución de los codones de la planta (primera preferida, segunda preferida, tercera preferida o cuarta preferida) para especificar el aminoácido en cada posición dentro de la secuencia de aminoácidos. La nueva secuencia luego se analiza para sitios enzimáticos de restricción que han sido creados por la modificación. Los sitios identificados luego se modifican reemplazando los codones con codones de primera, segunda, tercera o cuarta selección preferida. Otros sitios en la secuencia que podrían afectar la transcripción o traducción del gen de interés son las uniones exón:intrón (5' o 3'), señales de adición de poliA, o señales de terminación de ARN polimerasa. La secuencia luego se analiza y se modifica para reducir la frecuencia de dobletes TA o GC. Además de los dobletes los bloques de secuencia G o C que tienen más de aproximadamente cuatro residuos que son iguales pueden afectar la trascripción de la secuencia. Por lo tanto, estos bloques también se modifican reemplazando los codones de la primera o segunda selección, etc. con el próximo codón preferido de selección.

CUADRO 11 Codones de aminoácidos preferidos para proteínas expresadas en maíz Aminoácido Codón" Alanina GCC/GCG Cisteína TGC/TGT Ácido aspártico GAC/GAT Ácido glutámico GAG/GAA fenilalanina TTC/TTT Glicina GGC/GGG Histidina CAC/CAT Isoleucina ATC/ATT Lisina AAG/AAA Leucina CTG/CTC Metionina ATG Asparagina AAC/AAT Prolina CCG/CCA Glutamina CAG/CAA Arginina AGG/CGC Serina AGC/TCC Treonina ACC/ACG Valina GTG/GTC Triptofano TGG Tirosina TAC/TAT De paro TGA/TAG Se prefiere que el gen o genes optimizados de planta que codifican una proteína bacteriana contenga aproximadamente 63% de codones de primera selección, entre aproximadamente 22% y aproximadamente 37% de codones de segunda selección, y entre aproximadamente 15% y aproximadamente 0% de codones de tercera o cuarta selección, donde el porcentaje total es 100%. Se prefiere por sobre todo que el gen o genes optimizados de planta contengan aproximadamente 63% de codones de primera selección, al menos aproximadamente 22% de codones de segunda selección, aproximadamente 7.5% de codones de tercera selección, y aproximadamente 7.5% de codones de cuarta selección, donde el porcentaje total es 100%. El método descrito anteriormente permite a un experto en la técnica modificar los genes que son ajenos a una planta particular de modo que los genes se expresen óptimamente en plantas. El método se ilustra además en la Solicitud PCT WO 97/13402. De este modo, para diseñar los genes optimizados de planta que codifican una proteína bacteriana, se diseña una secuencia de ADN para codificar la secuencia de aminoácidos de dicha proteína utilizando un código genético redundante a partir de un cuadro de sesgo compilado para las secuencias génicas para la planta en particular. La secuencia de ADN resultante tiene un mayor grado de diversidad de codones, una composición de bases deseable, puede contener sitios de reconocimiento de enzimas de restricción colocados estratégicamente, y carece de secuencias que podrían interferir con la transcripción del gen, o la traducción del ARNm producto. De este modo, los genes sintéticos que son funcionalmente equivalentes a las proteínas/genes de la presente invención pueden ser utilizados para transformar huéspedes, incluyendo plantas. Una guía adicional referida a la producción de genes sintéticos se puede hallar en, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,380,831. 5.2 - Análisis de Reconstrucción. El análisis extensivo de los 888 pares de bases (pb) de la secuencia de ADN de la región codificadora de AAD-1 (v1) nativa (SEQ ID NO: 3) reveló la presencia de varios motivos de secuencia que se cree son dañinos para la expresión de planta óptima, como así también una composición de codones no óptima. Para mejorar la producción de la proteína recombinante en monocotiledóneas como así también en dicotiledóneas, se desarrolló una secuencia de ADN de "planta optimizada" que codifica la SEQ ID NO: 11 , la cual es la misma que la SEQ ID NO: 9 nativa salvo por la adición de un residuo de alanina en la segunda posición. El codón de alanina adicional (CGT; subrayado en la SEQ ID NO: 5) se incluyó para codificar un sitio Neo I (CCATGG) extendiéndose sobre el codón de inicio de ATG, para permitir subsiguientes operaciones de clonación. Las proteínas codificadas por las regiones codificadoras nativas (v1 ) y optimizadas de planta (v3) son 99.3% idénticas, difiriendo sólo en el número de aminoácido 2. En contraste, las secuencias de ADN nativa (v1 ) y de planta optimizada (v3) de las regiones codificadoras son sólo 77.7% idénticas. Se realizó una alineación de secuencia de los ADNs nativos y de planta optimizada, y el cuadro 12 muestra las diferencias en las composiciones de codones de las secuencias nativas y de planta optimizada.

CUADRO 12 5.3 - Terminación de vectores binarios. 5.3.1 -AAD-1 (v3) reconstruido. El gen de planta optimizada AAD-1 (v3) se recibió de Picoscript (el diseño de reconstrucción del gen se completó (ver lo arriba mencionado) y se encargó a Picospript para la construcción) y la secuencia se verificó internamente (SEQ ID NO: 5) para confirmar que no hubo alteraciones de la secuencia esperada. Las reacciones de secuenciamiento se llevaron a cabo con iniciadores Delanteros M13 (SEQ ID NO: 16) e Reversos M13 (SEQ ID NO: 17) utilizando los reactivos del "Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit" de Beckman Coulter como se mencionó anteriormente. Los datos de secuencia se analizaron y los resultados indicaron que no hubo anomalías en la secuencia de ADN de AAD-1 (v3) optimizado. El gen de AAD-1 (v3) se clonó en pDAB726 como un fragmento de Neo I - Sac I. La construcción resultante se denominó pDAB720, conteniendo: [promotor de AtUbilO: Nt OSM 5'UTR: AAD-1 (v3): Nt OSM3'UTR: ORF1 poIyA 3'UTR] (verificado con digestos de restricción de Not I). Un fragmento de Not l-Not I que contiene el cásete descrito luego se clonó en el sitio Not I del vector binario pDAB3038. El vector binario resultante, pDAB721 , que contiene el siguiente cásete [promotor de AtUbM O: Nt OSMd'UTR: AAD-1 (v3): Nt OSM 3'UTR: ORF1 poliA 3'UTR: promotor de CsVMV: PAT. ORF25/26 3'UTR] se digirió con restricción (con Bam Hl, EcoR I, EcoR V, HinD lll, Pac I, y Xmn I) para verificar la orientación correcta. La construcción completa verificada (pDAB721) se utilizó para la transformación del Agrobacterium (ver sección 6.2). 5.3.2 -AAD1 M) Nativo y AAD-1 (v2) modificado. El gen AAD-1 (v1) (SEQ ID NO: 3) se amplificó por PCR del pDAB3203. Durante la reacción de PCR se realizaron alteraciones dentro de los iniciadores para introducir los sitios de restricción de Ncol y Sacl en el iniciador de 5' y el iniciador de 3' respectivamente. Los iniciadores "rdpA(ncol)" [CCC ATG GCT GCT GCA CTG TCC CCC CTC TCC] (SEQ ID NO: 6) and "3'saci" [GAG CTC ACT AGC GCG CCG GGC GCA CGC CAC CGA] (SEQ ID NO: 7) se utilizaron para amplificar un fragmento de ADN utilizando el Sistema de Fail Safe PCR (Epicenter). El amplicón de PCR se ligó en el vector de clonación pCR 2.1 TOPO TA (Invitrogen) y se verificó la secuencia con los iniciadores Delantero M13 (SEQ ID NO: 16) e Reverso M13 (SEQ ID NO: 17) utilizando los reactivos de secuenciamiento del "Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit" de Beckman Coulter. Los datos de la secuencia identificaron un clon con la secuencia correcta. Durante el análisis se identificó un sitio de restricción Notl superfluo hacia el extremo 3' del AAD-1 (v1). Este sitio se eliminó para facilitar la clonación en pDAB3038. Para eliminar el sitio adicional se realizó una reacción de PCR con un iniciador interno de 5'. El sitio de Notl se alteró incorporando un nuevo codón para un aminoácido para eliminar el sitio Notl espurio. Este cambio alteraría la arginina de la posición 212 a una cisteína. Se utilizaron los iniciadores de PCR "BstEII/Del Notl" [TGG TGG TGA CCC ATC CGG GCA GCG GCT GCA AGG GCC] (SEQ ID NO: 8) y "3' saci" (SEQ ID NO: 7). Se completó una reacción de PCR utilizando el Sistema de Fail Safe PCR (Epicenter) y el fragmento resultante se clonó en el equipo de clonación pCR 2.1 TOPO TA (Invitrogen). Se completó la confirmación del producto correcto de PCR mediante el secuenciamiento del ADN, y el gen "fijo" recibió el nombre de AAD-1 (v2) (SEQ ID NO: 4). Una reacción de secuenciamiento utilizando el iniciador Reverso M13 (SEQ ID NO: 17) y los reactivos de secuenciamiento del "Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit" de Beckman Coulter indicaron que se había aislado el fragmento de PCR correcto. Esta construcción se digirió con las enzimas BstEII y Sacl. El fragmento resultante se clonó en el pCR2.1 AAD-1 (v2) construcción (pCR2.1 Delta Notl) y se confirmó mediante la digestión enzimática de restricción. El gen AAD-1 (v2) modificado luego se clonó en pDAB726 como un fragmento de ADN de Ncol/Sacl. La construcción resultante (pDAB708) se verificó con digestos de restricción. Esta construcción luego se clonó en el pDAB3038 como un fragmento de Notl - Notl. La construcción resultante final recibió el nombre de pDAB766, que contiene el promotor de [AtUbilO: Nt OSMd'UTR: AAD-1 (v2): Nt OSM 3'UTR: ORF1 poliA 3'UTR: promotor de CsVMV: PAT. ORF25/26 3'UTR] y se digirió por restricción para verificar la orientación correcta. La construcción completa luego se utilizó para transformación en el Agrobacterium. 5.3.3 - Diseño de una secuencia de ADN orientada a codones de soja que codifica una EPSPS de soja con mutaciones que confieren tolerancia al glifosato. Este ejemplo enseña el diseño de una nueva secuencia de ADN que codifica una 3-enolpiruvil-shiquimato-5-fosfato sintasa (EPSPS), pero se optimiza para expresión en células de soja. La secuencia de aminoácidos de un EPSPS de soja triplemente mutada se describe en la SEQ ID NO: 5 del documento WO 2004/009761. Los aminoácidos mutados en la secuencia revelada están en el residuo 183 (treonina de la proteína nativa reemplazada con isoleucina), residuo 186 (arginina en proteína nativa reemplazada con lisina), y residuo 187 (prolina en la proteína nativa reemplazada con serina). De este modo, se puede deducir la secuencia de aminoácidos de la proteína de EPSPS de soja natural reemplazando los aminoácidos sustituidos de la SEQ ID NO: 5 de WO 2004/009761 con los aminoácidos nativos en las posiciones apropiadas. Tal secuencia de proteína nativa se presenta aquí como SEQ ID NO: 20. Una secuencia proteica de EPSPS de soja doblemente mutada, que contiene una mutación en el residuo 183 (treonina de la proteína nativa reemplazada con isoleucina), y en el residuo 187 (prolina en proteína nativa reemplazada con serina) se presenta aquí como SEQ ID NO: 21. Un cuadro de uso de codones para proteína de soja (Glicina max) que codifica secuencias, calculado a partir de 362,096 codones (aproximadamente 870 secuencias codificadoras), se obtuvo del sitio www. "kazusa.or.jp/codon". Esos datos se reformatearon según se muestra en el cuadro 13. Las columnas D y H del cuadro 13 presentan las distribuciones (en % de uso para todos los codones para ese aminoácido) de codones sinónimos para cada aminoácido, según se halló en las regiones codificadoras de proteínas de genes de soja. Es evidente que algunos codones sinónimos para algunos aminoácidos (un aminoácido puede estar especificado por 1 , 2, 3, 4 ó 6 codones) están presentes en forma relativamente poco frecuente en regiones codificadoras de proteína de soja (por ejemplo, se compara el uso de los codones de GCG y GCT para especificar la alanina). Un cuadro para el uso de codones de soja sesgados se calculó a partir de los datos del cuadro 13. Los codones hallados en los genes de soja en una proporción inferior al 10% de las apariciones totales para el aminoácido en particular, se ignoraron. Para equilibrar la distribución de las selecciones de codones remanentes para un aminoácido, se calculó una representación promedio ponderado para cada codón, utilizando la fórmula: % ponderado de C1 =1/(%C1 + %C2 + %C3 + etc.) x %C1 x 100 donde C1 es el codón en cuestión, C2, C3, etc. representan los codones sinónimos restantes, y los valores en % para los codones relevantes se toman de las columnas D y H del cuadro 13 (ignorando los valores de codones raros en negrita). El valor % ponderado para cada codón se muestra en las columnas C y G del cuadro 13. El TGA se seleccionó arbitrariamente como el terminador de traducción. Las frecuencias de uso de codones sesgados luego se ingresaron a un cuadro de códigos genéticos especializada para su uso por el programa de diseño génico OptGene™ (Ocimum Biosolutions LLC, Indianapolis, Indiana). CUADRO 13 'DNU = No usa Para derivar una secuencia de ADN optimizada de soja que codifica la proteína de EPSPS doblemente mutada, la secuencia proteica de la SEQ ID NO: 21 se tradujo inversamente por el programa OptGene™ utilizando el código genético sesgado de soja derivado anteriormente. La secuencia de ADN inicial derivada de este modo luego se modificó compensando los cambios de codones (a la vez que retiene la representación promedio ponderada global para los codones) para reducir las cantidades de dupietes de GC y TA entre los codones adyacentes, incrementar las cantidades de dupletes CT y TG entre codones adyacentes, eliminar las estructuras secundarias intra-hebra muy estables, eliminar o agregar sitios de reconocimiento enzimático de restricción, y eliminar otras secuencias que podrían ser dañinas para ias manipulaciones de expresión o clonación del gen diseñado. Se realizaron otros refinamientos de la secuencia para eliminar los sitios de unión, procesamientos largos de residuos de A/T o C/G, y otros motivos que podrían interferir con la estabilidad, transcripción o traducción del ARN de la región codificadora en células de planta. Se realizaron otros cambios para eliminar los Marcos de Lectura Abiertos internos prolongados (marcos diferentes a +1 ). Estos cambios se realizaron dentro de las restricciones de retener la composición de codones sesgados de soja según se describió anteriormente, y a la vez preservar la secuencia de aminoácidos revelada según la SEQ ID NO: 21. La secuencia de ADN orientada a la soja que codifica la proteína EPSPS de la SEQ ID NO: 21 se da como bases 1-1575 de la SEQ ID NO: 22. La síntesis de un fragmento de ADN que comprende la SEQ ID NO: 22 fue realizada por un proveedor comercial (PicoScript, Houston TX). 5.3.4 - Clonación de construcciones binarias adicionales. La terminación del pDAB3295 y pDAB3757 incorporó el uso de la tecnología de Clonación GateWay Cloning (Invitrogen, cat #11791-043 y cat #12535-019). La tecnología GateWay utiliza la recombinación específica del sitio en base al fago lambda para insertar un cásete génico en un vector. Para mayor información referirse a Gateway Technology: A universal technology to clone DNA sequence for functional analysis and expression in múltiple systems, © 1999-2003, Invitrogen Corp., 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA 92008 (impreso - 2003). Las otras construcciones creadas para transformación en especies de plantas apropiadas se construyeron utilizando procedimientos similares a los anteriores y otros métodos de clonación molecular estándar (Maniatis et al., 1982). El Cuadro 14 enumera todas las construcciones de transformación utilizadas con los promotores apropiados y características definidas, como así también el cultivo transformado. El gen sacB se agregó al vector binario pDAB3289 como marcador.de selección negativa bacteriana para reducir la persistencia del Agrobacterium asociada al tejido de planta transformado. SacB es una enzima levan-sacarasa producida por el Bacillus spp. y es tóxica para la mayoría de las bacterias Gram negativas cuando se desarrolla en presencia de sacarosa (Gay et al., 1983). El gen sacB se recuperó sobre un fragmento Hin? lll del plásmido pRE112 (Edwards, et ai, 1998) y se clonó en el único sitio Hin? lll en el pDAB3289.

CUADRO 14 *A = Arabidopsis CsVMV = Promotor del Virus de Mosaico de Vean Cassava ZmUbil = Promotor de Zea mays Ubiquitina 1 T = Tabaco AtUbilO = Promotor de Arabidopsis thaliana Ubiquitina 10 Hptll = higromicina fosfotransferasa S = Soja RB7 Mar v2 = región asociada a la matriz de Nicotiana tabacum (MAR) Ct = Algodón Nt Osm = región no traducida Osmotina 5' de Nicotiana tabacum y la Región no traducida Osmotina 3' de Nicotiana tabacum R = Arroz Cn = Maíz (721 y 793) Atu ORF1 3' UTR = Región no traducida 3' del Marco de Lectura Abierto 1 del Agrobacterium tumefaciens Ca = Cañóla (3295 y 3757) Atu ORF24 3' UTR = Región no traducida 3' del Marco de Lectura Abierto 24 Agrobacterium tumefaciens EJEMPLO 6 Transformación en Arabidopsis y Selección 6.1 - Condiciones de desarrollo de Arabidopsis thaliana. Se suspendieron semillas del Arabidopsis de tipo silvestre en una solución al 0.1 % de Agarosa (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Las semillas suspendidas se almacenaron a 4°C durante 2 días para completar los requerimientos de latencia y asegurar la germinación sincrónica de las semillas.

El Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA) se cubrió con vermiculita fina y se sub-irrigó con solución de Hoagland hasta que se humedeció. La mezcla del suelo se dejó drenar durante 24 horas. La semilla estratificada se sembró sobre vermiculita y se cubrió con domos de humedad (KORD Products, Bramalea, Ontario, Canadá) durante 7 días. La semillas se germinaron y las plantas se desarrollaron en un Conviron (modelos y CMP3244, Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canadá) en condiciones de días extensos (16 horas de luz/8 horas de oscuridad) a una intensidad de luz de 120-150 µmol/m2seg a temperatura (22°C) y humedad (40-50%) constantes. La plantas se irrigaron inicialmente con solución de Hoagland y subsiguientemente con agua deionizada para mantener el suelo húmedo pero no mojado. 6.2 - Transformación del Aqrobacterium. Una placa de LB + agar con eritromicina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (200 mg/1) o espectinomicina (100 mg/l) conteniendo una colonia de DH5a sembrada se utilizó para dar una colonia para inocular 4 ml de cultivos mini prep (líquido LB + eritromicina). Los cultivos se incubaron durante la noche a 37°C con agitación constante. Los Qiagen (Valencia, CA) Spin Mini Preps, realizado según las instrucciones del fabricante, se utilizaron para purificar el ADN de! plásmido. Las células del Agrobacterium tumefaciens electro-competentes (cepas Z707s, EHA101s, y LBA4404s) se prepararon utilizando un protocolo de Weigel & Glazebrook (2002). La células del Agrobacterium competentes se transformaron utilizando un método de electroporación adaptado de Weigel & Glazebrook (2002). 50 µl de células de agro competentes se descongelaron sobre hielo y se agregaron 10-25 ng del plásmido deseado a las células. La mezcla de células y ADN se agregó a cubetas de electroporación pre-enfriadas (2 mm). Se utilizó un electroporador Eppendorf 2510 para la transformación con las siguientes condiciones, Voltaje: 2.4kV, longitud de pulso: 5 msegundos. Después de la electroporación, se agregó 1 ml de caldo de YEP (por litro: 10 g de extracto de levadura, 10 g de Bacto-peptona, 5 g de NaCI) a la cubeta y la suspensión de células-YEP se transfirió a un tubo de cultivo de 15 ml. Las células se incubaron a 28°C en un baño de agua con agitación constante durante 4 horas. Después de las incubaciones, el cultivo se plaqueó sobre YEP + agar con eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estreptomicina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (250 mg/l). Las placas se incubaron durante 2 a 4 días a 28°C. Las colonias se seleccionaron y se dispusieron sobre placas de YEP + agar fresco con eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estromicina (250 mg/l) y se incubaron a 28°C durante 1 a 3 días. Las colonias se seleccionaron para análisis de PCR para verificar la presencia del gen inserto utilizando iniciadores específicos del vector. Los Qiagen Spin Mini Preps, realizados según las instrucciones del fabricante, se utilizaron para purificar el ADN del plasma a partir de colonias de Agrobacterium seleccionadas con la siguiente excepción: 4 ml de alícuotas de un cultivo mini prep durante toda la noche de 15 ml (YEP líquido + eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l)) y estreptomicina (250 mg/l)) se utilizaron para la purificación de ADN. Una alternativa al uso de ADN de Qiagen Spin Mini Prep era lisar las células de Agrobacterium transformadas, suspendidas en 10 µl de agua, a 100°C durante 5 minutos. El ADN del plásmido del vector binario utilizado en la transformación del Agrobacterium se incluyó como control. La reacción de PCR se completó utilizando Taq ADN polimerasa de Takara Mirus Bio Inc. (Madison, Wisconsin) según las instrucciones del fabricante a concentraciones de 0.5x. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un Ciclador Térmico MJ Research Peltier programado con las siguientes condiciones; 1 ) 94°C durante tres minutos, 2) 94°C durante 45 segundos, 3) 55°C durante 30 segundos, 4) 72°C durante 1 minuto, para 29 ciclos luego 1 ciclo de 72°C durante 10 minutos. La reacción se mantuvo a 4°C después de la delación. La amplificación se analizó por electroforesis en gel de agarosa al 1 % y se visualizó por tinción con bromuro de etidio. Se seleccionó una colonia cuyo producto de PCR fue idéntico al control del plásmido. 6.3 - Transformación del Arabidopsis. El Arabidopsis se transformó utilizando el método de inmersión floral o floral dip. La colonia seleccionada se utilizó para inocular uno o más pre-cultivos de 15 a 30 ml de caldo de YEP que contenía eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estreptomicina (250 mg/l). Los cultivos se incubaron durante la noche a 28°C con agitación constante a 220 rpm. Cada pre-cultivo se utilizó para inocular dos cultivos de 500 ml de caldo de YEP con contenido de eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estreptomicina (250 mg/l) y los cultivos se incubaron durante la noche a 28°C con agitación constante. Luego las células se concentraron a aproximadamente 8700x g durante 10 minutos a temperatura ambiente, y se descartó el sobrenadante resultante. El pellet celular se suspendió nuevamente suavemente en 500 ml de medios de infiltración conteniendo: 1/2x de Murashige y sales de Skoog/vitaminas B5 de Gamborg, 10% (p/v) de sacarosa, bencilamino purina 0.044 µM (10 µl/litro de 1 mg/ml de reserva en DMSO) y 300 µl/litro de Silwet L-77. Las plantas de aproximadamente 1 mes de vida se sumergieron en el medio durante 15 segundos, asegurándose de sumergir la inflorescencia más nueva. Las plantas luego se colocaron sobre sus lados y se cubrieron (transparente u opaca) durante 24 horas, luego se lavaron con agua, y se colocaron derechas. Las plantas se desarrollaron a 22°C, con un fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad. Aproximadamente cuatro semanas después de la inmersión, las semillas se cosecharon. 6.4 - Selección de las plantas transformadas. Semillas Ti recién cosechadas (transformada con [AAD-1 (v2)] natural o [AAD-1 (v3j\ gene) de planta optimizada se dejaron secar durante 7 días a temperatura ambiente. Las semillas Ti se sembraron en bandejas de germinación de 26.5 x 51 -cm (T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN), recibiendo cada una alícuotas de 200 mg de semillas T* estratificadas (-10.000 semillas) que habían sido suspendidas previamente en 40 ml de solución de agarosa 0.1 % y almacenadas a 4°C durante 2 días para completar los requerimientos de latencia y asegurar la germinación sincrónica de la semilla. El Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture Inc., Bellevue, WA) se cubrió con vermiculita fina y se sub-irrigó con solución de Hoagland hasta que estuvo húmedo, luego se dejó drenar por gravedad. Cada alícuota de 40 ml de semillas estratificadas se sembró uniformemente sobre la vermiculita con una pipeta y se cubrió con domos de humedad (KORD Products, Bramalea, Ontario, Ganada) durante 4 a 5 días. Los domos se removieron 1 día antes de la selección transformante inicial utilizando rocío de postemergencia de glufosinato (seleccionando el gen PATtransformado). Cinco a seis días después de la plantación (DAP) y nuevamente 10 DAP, las plantas T-i (cotiledón y estadio de 2-4 hojas, respectivamente) se rociaron con una solución al 0.2% de herbicida Liberty (200 g ia/l de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) a un volumen de rocío de 10 ml/bandeja (703 L/ha) utilizando una escopeta de aire comprimido DeVilbiss para suministrar una proporción eficaz de 280 g ia/ha de glufosinato por aplicación. Las sobrevivientes (plantas de desarrollo activo) se identificaron 5 a 7 días posteriores al rociado final y se trasplantaron individualmente dentro de macetas de 7.5 centímetros preparadas con medios para macetas (Metro Mix 360). Las plantas transplantadas se cubrieron con domos de humedad durante 3 a 4 días y se colocaron en una cámara de desarrollo a 22°C como se mencionó anteriormente. Los domos se eliminaron subsiguientemente y las plantas se llevaron a un invernadero (22±5° C, 50±30% HR, 14 h de luz:10 de oscuridad, mínimo 500 µE/m2s1 natural + luz suplementaria) al menos un día antes del ensayo para determinar la capacidad del AAD-1 (v3) (gen de planta optimizada) o AAD-1 (v2) (gen microbiano nativo) para dar resistencia a herbicidas tipo fenoxi auxina. Las plantas T-i individuales aleatorias seleccionadas para resistencia al glufosinato anteriores se confirmaron para expresión de la proteína PAT utilizando un equipo PAT ELISA (Parte no. 7000045, Strategic Diagnostics, Inc., Newark, DE) para confirmar en forma no destructiva la fidelidad del proceso de selección (protocolo del fabricante). Las plantas luego se asignaron aleatoriamente a varias proporciones de herbicidas de fenoxí (diclorprop o 2,4-D). Las proporciones de fenoxi aplicadas inicialmente fueron 12.5 g ea/ha 2,4-D y 50 o 200 g ea/ha de diclorprop. El GRg9 para el Arabidopsis es aproximadamente 50 g ea/ha de 2,4-D y 200 g ea/ha de diclorprop. Proporciones elevadas se aplicaron en ensayos subsiguientes (50, 200, 800, o 3200g ea/ha). Todas las aplicaciones de herbicidas de auxina se realizaron utilizando el rociador DeVilbiss según se describió anteriormente para aplicar 703 L/ha de volumen de rocío (0.4 ml de solución/maceta de 7.5 centímetros) o aplicadas por atomizador de vía en un volumen de 187 L/ha. El 2,4-D utilizado era de grado técnico (Sigma, St. Louis, MO) disuelto en DMSO y diluido en agua (<1 % de concentración final de DMSO) o la formulación de sal de dimetilamina comercial (456 g ae/l, NuFarm, St Joseph, MO). El diclorprop utilizado era de grado técnico (Sigma, St. Louis, MO) disuelto en DMSO y diluido en agua (<1 % de concentración final de DMSO). A medida que las proporciones de herbicida aumentaban por encima de 800 g ea/ha, el pH de la solución de rocío se volvió excesivamente ácido, quemando las hojas de las plantas de Arabidopsis tiernas y jóvenes y complicando la evaluación de los efectos primarios de los herbicidas. Se tornó una práctica estándar aplicar estas proporciones elevadas de herbicidas de fenoxi en regulador de pH de Tris 200 mM (pH 9.0) hasta un pH final de -7-8. Algunas plantas individuales T< se sometieron a herbicidas comerciales alternativos en lugar de una fenoxi auxina. Un punto de interés consistió en determinar si el haloxífop podría ser degradado eficazmente in planta. Si bien Arabidopsis, que es una dicotiledónea, no es un sistema óptimo para ensayar los herbicidas herbáceos de AOPP que inhiben la ACCasa, las plantas T-i transformadas con el AAD-1 (v3) se sometieron a proporciones elevadas (400-1600 g ea/ha) del ácido RS-haloxifop (sintetizado internamente) que sí causan anormalidades en el crecimiento y muerte de Arabidopsis de tipo silvestre utilizando el atomizador DeVilbiss según se describió anteriormente. Las proporciones de lesión se tomaron 7 y 14 días posteriores al tratamiento. De igual modo, las plantas individuales T1 se trataron con el herbicida de piridiioxiacetato auxina, fluroxipir. 6.5 - Resultados de la selección de plantas transformadas. Las primeras transformaciones de Arabidopsis se llevaron a cabo utilizando el AAD-1 (v3) (gen de planta optimizada). Primero los transformantes de Ti se seleccionaron del ambiente de la semilla no transformada utilizando un esquema de selección de glufosinato. Alrededor de 400,000 semillas de Ti se clasificaron y se identificaron 493 plantas resistentes al glufosinato (gen PAT), igualando a una frecuencia de transformación/selección del 0.12%. Dependiendo del lote de semillas ensayado, éste varió de 0.05 a 0.23% (ver cuadro 15). Un pequeño lote de semillas transformadas con el AAD-1 (v2) (nativo) se seleccionó utilizando el agente de selección de glufosinato. Doscientos setenta y ocho plantas individuales de Ti se identificaron sobre 84,000 semillas evaluadas (0.33% de frecuencia de transformación/selección).

CUADRO 15 Selección de AAD-1 (v3) (planta optimizada) o AAD-1 (v2) (nativa), AAD-2 (v1 ) nativa), o plantas individuales T i transformadas con AAD-2 (v2) que utilizan glufosinato y 2,4-D. Semillas totales Sesgo sembradas % de plantas de y Cantidad Proporció Intervalo de seleccionadas Agente de Codoclasificada de Ti n de proporción que expresan selección Gen nes s resistente selección de selección PAT3 Sesgo de codones, n=gen microbiano nativo, p=planta optimizada Las plantas Ti seleccionadas anteriormente se transplantaron subsiguientemente a macetas individuales y se rociaron con varias proporciones de herbicidas de ariloxialcanoato comerciales. El cuadro 16 compara la respuesta de los genes AAD-1 (v2) nativo y AAD-1 (v3) de planta optimizada para impartir resistencia al 2,4-D a los transformantes Ti de Arabidopsis. Ambos genes impartieron resistencia a las plantas Ti de Arabidopsis individuales. Dentro de un tratamiento dado, el nivel de respuesta de planta varió enormemente y puede atribuirse al hecho de que cada planta representa un evento de transformación independiente. Es de importancia destacar que en cada proporción de 2,4-D ensayada, hubo individuos que no se vieron afectados mientras que algunos se afectaron severamente. Un promedio de lesión de población total por proporción se presenta en el cuadro 16 simplemente para demostrar la diferencia significativa entre las plantas transformadas con AAD-1 (v2) o AAD-1 (v3) versus los controles transformados de PAT/Cry1F o de tipo silvestre. Además es evidente que la tolerancia parece ser significativamente mayor (nivel de frecuencia y total de respuesta individual) para la secuencia de planta optimizada de AAD-1 (v3) versus la secuencia nativa de AAD-1 (v2) (ver cuadro 16). Proporciones más elevadas de 2,4-D (hasta 3,200 g ea/ha) han sido aplicadas a individuos Ti que expresan el AAD-1 (v3). Los niveles de lesión tienden a ser mayores y la frecuencia de plantas muy resistentes es inferior a estas proporciones elevadas (6x las proporciones de campo). Además a estas proporciones elevadas, la solución atomizadora se vuelve muy acida a menos que sea regulado el regulador de pH. Arabidopsis desarrollada mayormente en la cámara de desarrollo tiene una cutícula muy delgada y los efectos de quemadura severos pueden complicar el ensayo a estas proporciones elevadas. No obstante, algunos individuos han sobrevivido a 3.200 g ea/ha de 2,4-D con menos lesiones o ningún tipo de lesión. Cuadro 16. Respuesta de Arabidopsis Ti transformada con AAD-1 v3 (planta optimizada), o AAD-1 v2 (nativa), o AAD-2 (nativa) a un intervalo de proporciones de 2,4-D aplicadas en post-emergencia. La respuesta se presentó en términos de % de lesión visual 2 WAT. Los datos se presentaron como un histograma de individuos que exhiben una pequeña lesión o ninguna (<20%), lesión moderada (20-40%), o lesión severa (>40%). Dado que cada Ti es un evento de transformación independiente, se puede esperar una variación significativa de respuestas de T1 individuales dentro de una proporción dada. Una desviación aritmética estándar y media se presenta para cada tratamiento. El intervalo en la respuesta individual además se indica en la última columna para cada proporción y transformación. Arabidopsis transformada con PAT/Cry1F sirvió como control transformado sensible a la auxina. Arabidopsis de tipo silvestre no se transformó.

CUADRO 16 Respuesta de Arabidopsis T-¡ transformada con AAD-1 v3 (planta optimizada) o AAD-1 v2 (nativa) o AAD-2 (nativa) a un intervalo de proporciones de 2,4-D aplicadas en post-emergencia. % de lesión % de lesión Gen AAD-1 (v2) nativo 20- Prom Desv.

Promedios <20% 40% >40% Est.

Regulador de PH 20 6 7 25.3 34.7 control no tratado 50 g ea/ha 2,4-D 55 16 9 14.8 22.7 200 g ea/ha 2,4-D 45 11 24 34.1 39.3 800 g ea/ha 2,4-D 11 32 37 52.5 34.2 % de lesión | % de lesión gen AAD-2 nativo 20- Prom Desv.

Promedios <20% 40% >40% Est.

Regulador de PH 4 1 1 25.0 21.7 control no tratado 50 g ea/ha 2,4-D 1 2 11 68.2 30.2 200 g ea/ha 2,4-D 0 3 11 82.7 28.8 800 g ea/ha 2,4-D 0 0 14 99.8 0.8 gen AAD-1 (v3) % de lesión | % de lesión reconstruido 20- Prom Desv.

Promedios <20% 40% >40% Est.

Regulador de pH 9 0 0 0.0 0.0 control no tratado 50 g ea/ha 2,4-D 10 1 5 24.3 35.9 200 g ea/ha 2,4-D 11 4 1 14.0 25.9 800 g ea/ha 2,4-D 11 4 1 14.7 26.1 % de lesión j % de lesión Tipo silvestre 20- Prom Desv.

Promedios <20% 40% >40% Est.

Regulador de pH 11 0 0 0.0 0.0 control no tratado 50 g ea/ha 2,4-D 0 0 15 90.0 0.0 200 g ea/ha 2,4-D 0 0 15 95.1 0.5 800 g ea/ha 2,4-D 0 0 15 100.0 0.0 PAT/Cry1F (control % de lesión % de lesión transformado) 20- Prom Desv. Promedios <20% 40% >40% Est. Regulador de pH 11 0 0 0.0 0.0 control no tratado 50 g ea/ha 2,4-D 0 0 15 90.7 4.2 200 g ea/ha 2,4-D 0 0 15 97.2 1.7 800 g ea/ha 2,4-D 0 0 15 100.0 0.0 El Cuadro 17 muestra una respuesta a la dosis similar de Arabidopsis Ti al ácido fenoxipropiónico, diclorprop. Tendencias similares se observaron con el 2,4-D, indicando que la cadena lateral propiónica quiral sirve en realidad como sustrato aceptable. A continuación, se determinó que un grado de tolerancia aumentada al haloxifop podría impartirse a Arabidopsis transformada en proporciones elevadas de 400 - 1.600 g ea/ha (cuadro 18). La proporción de uso de campo normal para el haloxifop (un herbicida específico de pasturas) es alrededor de 50-70 g ea/ha. En general se considera que las dicotiledóneas son tolerantes por naturaleza a los herbicidas tipo AOPP; sin embargo, se producen efectos fisiológicos severos en Arabidopsis en estas proporciones elevadas. Algunos individuos transformados con AAD1 (v3) realmente mostraron tolerancia aumentada al haloxifop. Esto aporta los primeros datos in planta que el AAD-1 (v3) aportará resistencia a AOPP. No se observó resistencia con el fluroxipir (una piriridiloxiacetato auxina) en Arabidopsis transformada, consistente con el trabajo in vitro que utiliza enzimas expresadas de manera heteróloga. Cuadro 17. Respuesta de Arabidopsis Ti a un intervalo de proporciones de diclorprop aplicadas en post-emergencia. La respuesta se presentó en términos de % de lesión visual 2 WAT. Los datos se presentan como un histograma de individuos que exhiben una pequeña lesión o ninguna (<20%), lesión moderada (20-40%), o lesión severa (>40%). Dado que cada Ti es un evento de transformación independiente, se puede esperar una variación significativa de respuestas de T< individuales dentro de una proporción dada. Una desviación aritmética estándar y media se presenta para cada tratamiento. El intervalo en la respuesta individual además se indica en la última columna para cada proporción y transformación. Arabidopsis transformada con PAT/Cry1F sirvió como control transformado sensible a la auxina. Arabidopsis de tipo silvestre no se transformó.

CUADRO 17 Respuesta de Arabidopsis Ti a un intervalo de proporciones de diclorprop aplicadas en post-emergencia. % de lesión % de lesión AAD-1 v3 20- >40 Desv. Promedios <20% 40% % Prom. Est. Intervalo Control no tratado 3 0 0 0.0 0.0 0 12.5 g ea/ha RS-dicIorprop 7 1 0 5.0 7.6 0-20 50 g ea/ha RS-diclorprop 7 1 0 3.1 8.8 0-25 200 g ea/ha RS-diclorprop 4 1 3 40.0 50.1 0-100 800 g ea/ha RS-diclorprop 0 5 3 51.9 40.0 20-100 PAT/Cry1F % de lesión % de Promedios lesión 20- >40 Prom. Desv. Intervalo <20% 40% % Est. Control no tratado 3 0 0 0.0 0.0 0 12.5 g ea/ha RS-diclorprop 0 6 2 38.1 25.3 20-95 50 g ea/ha RS-diclorprop 0 0 8 80.0 25.3 50-100 200 g ea/ha RS-diclorprop 0 0 8 98.3 2.2 95-100 800 g ea/ha RS-diclorprop 0 0 8 100.0 0.0 100 Tipo silvestre % de lesión % de Promedios lesión <20% 20- >40 Prom. Desv. Intervalo 40% % Est. Control no tratado 3 0 0 0.0 0.0 0 12.5 g ea/ha RS-diclorprop 3 0 0 13.3 2.9 10-15 50 g ea/ha RS-diclorprop 0 0 3 53.3 5.8 50-60 200 g ea/ha RS-diclorprop 0 0 3 95.0 5.0 90-100 800 g ea/ha RS-diclorprop 0 0 3 100.0 0.0 100 Cuadro 18. Respuesta de Arabidopsis T1 a un intervalo de proporciones de haloxifop aplicadas en post-emergencia en proporciones artificialmente elevadas intentando mostrar la tolerancia de la dicotiledónea Arabidopsis al graminicida. La respuesta se presenta en términos de % de lesión visual 2 WAT. Los datos se presentan como un histograma de individuos que exhiben una pequeña lesión o ninguna (<20%), lesión moderada (20-40%), o lesión severa (>40%). Dado que cada Ti es un evento de transformación independiente, se puede esperar una variación significativa de respuestas de Ti individuales dentro de una proporción dada. Una desviación aritmética estándar y media se presenta para cada tratamiento. El intervalo en la respuesta individual además se indica en la última columna para cada proporción y transformación. La Arabidopsis transformada con PAT/Cry1F sirvió como control transformado sensible a la auxina. La Arabidopsis de tipo silvestre no se transformó.

CUADRO 18 Respuesta de Arabidopsis T1 a un intervalo de proporciones de haloxifop aplicadas en post-emergencia en proporciones artificialmente elevadas intentando mostrar la tolerancia de la dicotiledónea Arabidopsis al graminicida. % de lesión % de lesión AAD-1 v3 20- >40 Desv. Promedios <20% 40% % Prom. Est. Intervalo Control no tratado 3 0 0 0.0 0.0 0 100 g ea/ha haloxifop 4 0 0 0.0 0.0 0 200 g ea/ha haloxifop 4 0 0 0.0 0.0 0 400 g ea/ha haloxifop 3 1 0 6.3 9.5 0-20 800 g ea/ha haloxifop 1 1 2 46.3 42.7 0-85 1600 g ea/ha 1 0 3 65.0 47.3 0-100 haloxifop PAT/Cry1F % de lesión % de Promedios lesión 20- >40 Prom. Desv. Intervalo <20% 40% % Est. Control no tratado 3 0 0 0.0 0.0 0 100 g ea/ha haloxifop 4 0 0 0.0 0.0 0 200 g ea/ha haloxifop 4 0 0 10.0 0.0 10 400 g ea/ha haloxifop 0 4 0 27.5 5.0 20-30 800 g ea/ha haloxifop 0 0 4 78.8 6.3 70-85 1600 g ea/ha 0 0 4 47.5 43.5 80-100 haloxifop tipo silvestre % de lesión % de Promedios lesión <20% 20- >40 Prom. Desv. Intervalo 40% % Est. Control no tratado 3 0 0 0.0 0.0 0 100 g ea/ha haloxifop 3 0 0 0.0 0.0 0 200 g ea/ha haloxifop 3 0 0 0.0 0.0 0 400 g ea/ha haloxifop 0 3 0 20.0 0.0 20 800 g ea/ha haloxifop 0 0 3 73.3 10.4 70-85 1600 g ea/ha 0 0 3 93.3 11.5 80-100 haloxifop 6.6 - AAD-1 (v3) como marcador seleccionable. La capacidad de utilizar AAD-1 (v3) como marcador seleccionable utilizando 2,4-D como agente de selección se analizó inicialmente con la Arabidopsis transformada según se describió anteriormente. Las semillas Ti transformadas con PAT y AAD1 (v3) (pDAB 721 ) se sembraron en plano y se germinaron según se describió anteriormente y se comparó con semillas similares tratadas con el esquema de selección de glufosinato normal (5 y 10 DAP). El 2,4-D (50 g ea/ha) se aplicó al sembradío de Arabidopsis como se hizo previamente con el glufosinato. Se ensayó la variación en cantidad de aplicaciones y el tiempo de aplicación. Cada bandeja de plantas recibió ya sea uno o dos tiempos de aplicación de 2,4-D en uno de los siguientes esquemas de tratamiento: 5+10 DAP, 5+14 DAP, 10 DAP, 10+14 DAP, 14 DAP. Las plantas se identificaron como Resistentes o Sensibles 19 DAP y se procesaron líneas del ensayo ELISA para determinar la frecuencia de la co-transformación exitosa de un gen PAT activo. Cincuenta y tres de 70,000 semillas plantadas se identificaron como resistentes al 2,4-D. Se utilizó ELISA para clasificar un subconjunto de 44 individuos de esta población para expresión de la proteína de PAT.

Noventa y seis por ciento de los individuos fueron positivos indicando la presencia del gen co-transformado, PAT. La baja cantidad de resultados ELISA negativos (4%) está en línea con una relación de error del 3% en poblaciones de plantas resistentes al glufosinato (cuadro 15). La eficiencia en la selección parece ser de algún modo inferior con el 2,4-D (0.08%) vs. el glufosinato (0.12%); sin embargo, el intervalo de proporciones de selección a través de todos los experimentos indicaría que ambos agentes de selección son igualmente buenos para seleccionar la Arabidopsis transformada con genes de AAD-1 (v3) o PAT, respectivamente. Dos aplicaciones sucesivas identifican con mayor precisión individuos resistentes con ambos herbicidas ensayados. 6.7 - Heredabilidad. Una variedad de eventos Ti se autopolinizaron para producir semillas T2. Se ensayó la progenie de estas semillas aplicando 2,4-D (200 g ea/ha) a 100 consanguíneos T2 aleatorios. Cada planta T2 individual se transplantó a macetas cuadradas de 7.5 cm de lado antes de la aplicación con atomizador (atomizador de vía a una proporción de aplicación de 187 L/ha). Más del 60% de las familias Ti (plantas T2) se segregó en el modelo anticipado Resistente 3: Sensible 1 para un locus heredado dominante con herencia mendelíana según se determinó con el análisis de cuadrados Chi (P > 0.05).

Se recolectaron las semillas de 12 a 20 individuos T2 (semillas T3). Se ensayaron las progenies de veinticinco consanguíneos T3 de cada una de las ocho familias T2 seleccionadas aleatoriamente según se describió previamente. Aproximadamente un tercio de las familias T2 que se anticipó serían homócigas (poblaciones no segregantes) han sido identificadas en cada línea ensayada: variando en frecuencia de una a cuatro de las ocho familias ensayadas. Estos datos muestran que el AAD1 (v3) se integra de manera estable y se hereda de manera Mendeliana a al menos tres generaciones. 6.8 - Resistencia herbicida adicional atribuible al AAD-1 en Arabidopsis. La capacidad del AAD-1 (v3) para dar resistencia a otros herbicidas de ariloxifenoxialcanoato en Arabidopsis transgénico se determinó utilizando un ensayo de placa in vitro modificado. Las semillas de Arabidopsis thaliana de tipo silvestre como así también de Arabidopsis thaliana que contiene el gen AAD-1 (v3) de planta optimizada (plantas homócigas T4 id = PAAD1.315.064) se esterilizaron por agitación durante 10 minutos en una solución blanqueadora al 50%. Estas semillas luego se enjuagaron cuatro veces con agua estéril para eliminar la solución blanqueadora. Los ensayos de respuesta a la dosis utilizaron un medio nutriente (ver a continuación) suplementado con varias proporciones de compuestos de ensayo. Los compuestos de ensayo se agregaron al medio calentado (55°C) como soluciones concentradas en DMSO. Los pozos de control tenían la cantidad apropiada de DMSO sin ningún compuesto adicional. La concentración final de DMSO nunca excedió el 1 % (v/v). Después de mezclar intensamente, se agregó una alícuota del medio caliente conteniendo la concentración apropiada de compuesto a cada pozo de una bandeja de cultivo tisular de poliestireno, de base plana, de 6 pozos (Falcon 353046, Becton Dic son and Company, Franklin Lakes, NJ). Después que se solidificó el medio, aproximadamente 20 a 30 semillas de Arabidopsis se aplicaron sobre la parte superior del medio solidificado y los restantes 2 ml del medio se vertieron sobre las semillas. Las placas se agitaron levemente para dispersar las semillas, se cubrieron y se dejaron enfriar hasta que el medio se solidificó por completo. Las placas se incubaron durante 7 días a 25°C bajo iluminación fluorescente continua (75 µE m"2 s"1). La composición del medio nutriente fue según se describe en el Ejemplo 2.2 y en Somerville & Orgen (1982).

Evaluación de la reducción del desarrollo. La porción apical de las plantas de Arabidopsis desarrolladas en el medio tratado, se evaluó visualmente con relación a la porción apical de las plantas desarrollada en el medio que contiene sólo DMSO. Los valores se registraron como % de reducción del desarrollo. Las evaluaciones de inhibición de desarrollo de raíz de las plantas de Arabidopsis desarrolladas en el medio tratado se lograron extrayendo cuidadosamente las plantas del medio y midiendo la longitud de la raíz. Estas longitudes de raíz luego se compararon con la longitud de raíz de las plantas control para determinar un % de reducción del desarrollo. Se evaluó un mínimo de cinco plantas para cada tratamiento. Los valores registrados son un promedio de todas las plantas evaluadas. La concentración calculada para alcanzar el 50% de efecto de inhibición (l50) se determinó tanto para la raíz como para los brotes de Arabidopsis de tipo silvestre y transformada con el AAD-1. Las relaciones de biotipos resistentes a sensibles se incluyen en el cuadro 19. Una relación >2 para ambas mediciones de raíz y brote en general significa una resistencia significativa. Cuanto más alta la relación, mayor el nivel de resistencia. Todas las fenoxi auxinas comerciales mostraron niveles significativos de resistencia incluyendo los ácidos oxiacéticos (2,4-D y MCPA) como así también los ácidos oxipropiónicos (diclorprop y mecoprop). En realidad, la evaluación de raíz crónica muestra que la resistencia al ácido oxipropiónico es más elevada con el AAD-1 (v3) que para los ácidos oxiacéticos, consistentes con las características enzimáticas del AAD-1 (v1 ). La evaluación de otras auxinas que contienen anillos de piridina mostró que el AAD-1 (v3) no protegía eficazmente a Arabidopsis de los herbicidas piridiloxiacetatos, triclopir y fluroxipir, o el herbicida del ácido picolínico, picloram. La amplia resistencia a la fenoxi auxina es la primera informada in planta. Las auxinas alternativas a las cuales el AAD-1 no protege serían herramientas viables para el control y contención de los cultivos comerciales transformados con AAD-1 o especies de plantas experimentales.

CUADRO 19 6.9 - Resistencia al herbicida en aplicaciones foliares en rabidopsis conAAD-1 La capacidad de AAD-1 (v3) para dar resistencia a otros herbicidas de ariloxifenoxialcanoato auxina en Arabidopsis transgénica se determinó por aplicación foliar de varios sustratos descritos en el Ejemplo 6.8. La generación T de semillas de Arabidopsis, homóciga para AAD-1 (v3) (línea AAD1.01.315.076) se estratificó, y se sembró en bandejas de selección muy similares a las de Arabidopsis (Ejemplo 6.4). Una línea de control transformada que contenía PAT y el gen de resistencia a insectos Cryl F se plantó de manera similar. Los consanguíneos se transfirieron a maceta de 7.5 centímetros individuales en el invernadero. Todas las plantas se rociaron con el uso de un atomizador de vía colocado 187 L/ha. Las plantas se rociaron con una variedad de herbicidas tipo fenoxi auxina: 12.5-1600 g ea/ha de sal de dimetilamina de 2,4-D (DMA) (Riverside Chemicals), 12.5-1600 g ea/ha de mecoprop (AH Marks), 50-3200 g ea/ha de R-diclorprop (AH Marks), 8.75-1120 g ea/ha de 2,4, 5-T (grado técnico); herbicidas de piridiloxiacetatos 50-3200 g ea/ha de triclopir (Dow AgroSciences) y 50-3200 g ea/ha de fluroxipir (Dow AgroSciences);- y el metabolito de 2,4-D resultante de la actividad de AAD-1 ,2,4-diclorofenol (DCP, Sigma) (a 50-3200 g ea/ha, grado técnico). Todas las aplicaciones se formularon en regulador de pH de Hepes 200 mM (pH 7.5). Cada tratamiento se replicó 3 a 4 veces. Las plantas se evaluaron a los 3 y 14 días después del tratamiento y se promedian sobre dos experimentos.

Estos resultados (ver cuadro 20) confirman que la AAD-1 (v3) en Arabidopsis aporta una fuerte resistencia a las auxinas fenoxiacéticas, auxinas fenoxipropiónicas, pero no ha mostrado resistencia cruzada significativa a las auxinas piridíloxiacéticas ensayadas y corrobora los datos de la enzima in vitro y la especificidad de sustrato de placa completa. Además, no hay efecto del metabolito, 2,4-diclorofenol (DCP), sobre Arabidopsis de tipo silvestre o transgénica.

CUADRO 20 Comparación de respuesta de la planta Arabidopsis T con AAD-1 (v3) homóciga y de tipo silvestre a varios herbicidas auxínicos de aplicación foliar. Auxinas fenoxipropiónicas % Prom. de lesión 14DAT AAD1.01.315.076.T4 plantas AAD1 PatCrylf Tratamiento con herbicida homócigas Control 50 g ea/ha R-Diclorprop 3 31 200 g ea/ha R-Diclorprop 3 73 800 g ea/ha R-Diclorprop 3 89 3200 g ea/ha R-Diclorprop 3 95 12.5 g ea/ha Mecoprop 3 0 25 g ea/ha Mecoprop 0 2 50 g ea/ha Mecoprop 0 17 100 g ea/ha Mecoprop 0 33 200 g ea/ha Mecoprop 3 62 400 g ea/ha Mecoprop 0 78 800 g ea/ha Mecoprop 0 93 1600 g ea/ha Mecoprop 0 100 Auxinas fenoxiacéticas % Prom. de lesión 14DAT AAD1.01.315.076.T4 plantas AAD1 Pat/Cry1f Tratamiento con herbicida homócigas Control 12.5 g ea/ha 2,4-D DMA 0 67 25 g ea/ha 2,4-D DMA 0 78 50 g ea/ha 2,4-D DMA 0 93 100 g ea/ha 2,4-D DMA 0 100 200 g ea/ha 2,4-D DMA 0 100 400 g ea/ha 2,4-D DMA 0 100 800 g ea/ha 2,4-D DMA 0 100 1600 g ea/ha 2,4-D DMA 0 10 8.75 g ea/ha 2,4,5-T 0 0 17.5 g ea/ha 2,4,5-T 3 20 35 g ea/ha 2,4,5-T 0 43 70 g ea/ha 2,4,5-T 3 85 140 g ea/ha 2,4,5-T 0 95 280 g ea/ha 2,4,5-T 0 98 560 g ea/ha 2,4,5-T 17 100 1120 g ea/ha 2,4,5-T 3 100 Auxinas piridilacética % Prom. de lesión 14DAT AAD1.01.315.076.T4 plantas AAD1 Control de Tratamiento con herbicida homócigas Pat Cry1f 50 g ea/ha Triclopir 31 36 200 g ea/ha Triclopir 58 65 800 g ea/ha Triclopir 74 84 3200 g ea/ha Triclopir 97 95 50 g ea/ha Fluroxipir 48 76 200 g ea/ha Fluroxipir 75 85 800 g ea/ha Fluroxipir 88 85 3200 g ea/ha Fluroxipir 95 95 Metabolito DCP inactivo 50 g ea/ha 2,4-DCP 0 0 200 g ea/ha 2,4-DCP 0 0 800 g ea/ha 2,4-DCP 0 0 3200 g ea/ha 2,4-DCP 0 0 6.10 - Relación entre desarrollo de la planta y expresión del AAD-1 (v3) en Arabidopsis. Se diseñó un experimento para examinar si el nivel de expresión de la AAD-1 (v3) en Arabidopsis varía en diferentes etapas del crecimiento. Una línea AAD-1 (v3) T4 homóciga de elevada tolerancia, (id=PAAD1.01.345.163) se desarrolló en el invernadero. La mitad de las plantas se trataron con 800 g ae/ha de 2,4-D (según se describió previamente) mientras que la otra mitad no se trató. Dos hojas, la tercera hoja de la parte superior y la quinta hoja del fondo, se cosecharon a partir de 5 plantas, ambas tratadas y no tratadas, y se analizaron por experimentos de ELISA y Transferencia Western (según se describe en el Ejemplo 11 ) a 4, 10, 14, 20 y 25 DAT. Las figuras 6A y 6B mostraron que no hubo diferencia estadísticamente en la expresión del AAD-1 (v3) entre hojas jóvenes y viejas. Además, el herbicida 2,4-D tuvo poco impacto sobre el nivel de expresión de la proteína AAD-1 (v3). Los niveles de proteína se acumularon en plantas más viejas con alguna degradación de proteína significativa en los últimos puntos de tiempo. En un experimento separado, cuatro líneas T4 de Arabidopsis que muestran diferente nivel de tolerancia al herbicida 2,4-D se rociaron con varios niveles (0, 200, 800 y 3200 g/ha) de 2,4-D y se examinaron la lesión del herbicida y la expresión del AAD-1 (v3). Cuatro días después del tratamiento con herbicida, se observó poco daño en tres de las cuatro líneas, aún en la dosis más alta ensayada (figura 7A). Estas plantas además expresaron un alto nivel del AAD-1 (v3), de 0.1 a 0.25% (figura 7B). Por el contrario, la línea de baja tolerancia expresó menos del 0.1 % de AAD-1 (v3) en TSP y sufrió una lesión observable. De mayor importancia, se recuperaron de la lesión en 14 DAT (figura 7A), indicando que el bajo nivel de expresión del AAD-1 (v3) pudo proteger las plantas del daño herbicida serio. Todas las plantas control sufrieron una lesión seria y murieron 14 DAT a dosis de 800 g ea/ha de 2,4-D y anteriores. 6.11 - Análisis molecular del AAD-1 (v3) Arabidopsis Se realizó un ensayo Invader (métodos de Procedimientos Third WProm Agbio Kit) para número de copia del gen PAT y/o análisis de Southern blot con el ADN total obtenido del equipo Qiagen DNeasy sobre múltiples líneas homócigas del A D-7 (v3) para determinar la integración estable de la unidad de transformación de planta que contiene PAT y AAD-1 (v3). El análisis supuso un enlace físico directo de estos genes en la medida que estaban contenidos en el mismo plásmido. Para el análisis Southern, un total de 1 µg de ADN se sometió a digestión durante la noche de Nsi I para el pDAB721 para obtener los datos de integración. Las muestras se procesaron sobre gel de agarosa al 0.85% durante toda la noche a 40 voltios. El gel luego se desnaturalizó en NaOH 0.2 M, NaCI 0.6 M durante 30 minutos. El gel luego se neutralizó en Tris HCi 0.5 M, NaCI 1.5 M pH 7.5 durante 30 minutos. Luego se armó un aparato de gel 20SSC para obtener un gel de gravedad a transferencia de membrana de nylon (Millipore INYC00010) durante la noche. Después de la transferencia nocturna la membrana se sometió a luz UV mediante un entrecruzador (stratagene UV stratalinker 1800) a 1200 X100 microjoules. La membrana luego se lavó en SDS 0.1%, 0.1 SSC durante 45 minutos. Después del lavado de 45 minutos, la membrana se horneó durante 30 horas a 80°C, luego se almacenó a 4°C hasta la hibridación. El fragmento del molde de hibridación consistió en iniciadores preparados (Pat 5-3 AGATACCCTTGGTTGGTTGC) (SEQ ID NO: 23) y (Pat 3-3 CAGATGGATCGTTTGGA AGG) (SEQ ID NO: 24) diseñados para obtener la región codificadora de PAT. El producto se procesó sobre gel de agarosa al 1 % y se cortó y luego se extrajo el gel utilizando el procedimiento de extracción de gel Qiagen (28706). La membrana luego se sometió a un paso de pre-hibridación a 60°C durante 1 hora en regulador de pH de Perfect Hyb (Sigma H7033). Se utilizó el procedimiento Prime it RmT dCTP-labeling rxn (Stratagene 300392) para desarrollar la sonda de base de p32 (Perkin Elmer). La sonda se limpió utilizando las columnas de Probé Quant. G50 (Amersham 27-5335-01 ). Dos millones de conteos CPM por ml de regulador de pH Perfect Hyb se utilizaron para hibridar las transferencias southern durante la noche. Después de la hibridación nocturna las transferencias se sometieron a dos lavados de 20 minutos a 65°C en SDS 0.1 %, 0.1 SSC. Las transferencias luego se expusieron a una película durante ia noche, incubando a -80°C. Los resultados demostraron que todas las plantas resistentes al 2,4-D ensayadas contenían PAT ( de este modo por inferencia, AAD-1 (v3)).

El análisis del número de copias mostró que los insertos totales variaron de 1 a >10 copias. Esto se correlaciona también con los datos de expresión de proteína de AAD-1 (V3) indicando que la presencia de la enzima da niveles significativamente elevados de resistencia (»200 veces) a todos los ácidos fenoxiacéticos y fenoxipropiónicos disponibles en el comercio. 6.12 - Arabidopsis transformada con apilamiento molecular del AAD-1 (v3) y el gen de resistencia al glifosato. Se obtuvieron semillas de Arabidopsis T-i, según se describió previamente, conteniendo el plásmido pDAB3230 (AAD-1 (v3) + EPSPS) que codifica para una característica de resistencia al glifosato putativa. Los transformantes de Ti se seleccionaron utilizando AAD-1 (v3) como marcador seleccionable según lo descrito en el ejemplo 6.6, salvo que la proporción de 2,4-D utilizada fue 75 g ea/ha. Veinticuatro eventos de T-i individualmente transformados se recuperaron del intento de primera selección y se transfirieron a macetas de 7.5 centímetros en el invernadero según se describió previamente. Además se ensayaron tres líneas de Arabidopsis control diferentes: Columbia-0 de tipo silvestre, líneas homócigas de AAD-1 (v3) + PA7~ T5 (pDAB721 -transformado), y la línea homóciga PAT + CrylF (control transformado). Sólo las plantas de pDAB3230 se preseleccionaron en el estadio de plántula para tolerancia al 2,4-D. Cuatro días posteriores al transplante, las plantas se dividieron uniformemente para tratamiento foliar por atomizador de vía según se describió previamente con 0, 26.25, 105, 420, o 1680 g ea/ha de glifosato (Glyphomax Plus, Dow AgroSciences) en regulador de pH de Hepes (200 mM pH 7.5). Todos los tratamientos se replicaron 4 ó 5 veces. Las plantas se evaluaron 7 y 14 días después del tratamiento. Se calcularon los valores de l50 y muestran un nivel >14 veces de tolerancia impartida por el EPSPS apilado molecularmente con AAD-1 (v3) (ver figura 8). El AAD-1 (v3) no aportó resistencia al glifosato en sí mismo (re: respuesta de pDAB721). Estas plantas de T-i se desarrollarán hasta dar semillas, autopolinizadas para dar semillas T2. Las plantas de pDAB 3230 Ti han demostrado tolerancia a dosis letales de 2,4-D y glifosato. Además se ensayaron plantas T2 para demostrar que estas plantas no transformadas soportan tratamientos de glifosato + 2,4-D aplicados en mezcla de tanque según se describe en el Ejemplo 21 y que se muestran para maíz transformado con AAD-1 (v3) en el Ejemplo 8.

EJEMPLO 7 Transformación mediada por filamentos en maíz, y uso del AAD-1 (v3) como marcador seleccionable 7.1 - Clonación del AAD-1 (v3). El fragmento de AAD-1 (v3) se recibió sobre un fragmento de Ncol/Sacl. La construcción de pDAB4005 se digirió con Ncol y Sacl y se aisló el fragmento del esqueleto de 5175 pb. Los dos fragmentos se ligaron utilizando T4 ADN ligasa y se transformaron en células DH5a. Se realizaron Minipreps sobre las colonias resultantes utilizando el equipo QIA Spin mini prep de Qiagen y las colonias se digirieron para controlar la orientación. El plásmido intermedio correcto se denominó pDAB3403. Ambos, pDAB3403 y pDAB8505 (OsAct1/PAT/ZmLip) se digirieron con Notl. Las bandas de los 3442 pb del pDAB3403 y la banda de los 11017 pb del pDAB8505 se aislaron y se purificaron. Los fragmentos se ligaron, se transformaron en DH5a, y los plásmidos resultantes se rastrearon para orientación. La construcción final se denominó pDAB3404, la cual contiene ZmUbil /po-aad1/ZmPer5::OsAct1/PAT/ZmL¡p. 7.2 - Iniciación de callos/suspensión Para obtener embriones inmaduros para iniciación del cultivo de callos, se realizaron cruzamientos de Fi entre los progenitores Hi-ll desarrollados en invernaderos A y B (Armstrong et al. 1991 ). Cuando los embriones fueron de 1.0-1.2 mm de tamaño (aproximadamente 9 a 10 días posteriores a la polinización), las espigas se cosecharon y se esterilizaron en superficie mediante frotación con jabón Liqui-Nox®, se sumergieron en etanol 70% durante 2 a 3 minutos, luego se sumergieron en solución de blanqueo comercial 20% (hipoclorito de sodio 0.1%) durante 30 minutos. Las espigas se enjuagaron en agua destilada, estéril, y los embriones cigóticos inmaduros se dividieron asépticamente y se cultivaron sobre el medio 15Ag10 (Medio de N6 (Chu et al., 1975), 1.0 mg/l de 2,4-D, 20 g/l de sacarosa, 100 mg/l de hidrolizado de caseína (digesto enzimático), L- prolina 25 mM, 10 mg/l de AgN03, 2.5 g/l de Gelrite, pH 5.8) durante 2 a 3 semanas con el escutelo saliendo del medio. El tejido que mostró la morfología apropiada (Welter et al., 1995) se transfirió selectivamente en intervalos de dos semanas sobre medio fresco de 15Ag10 durante aproximadamente 6 semanas, luego se transfirió a medio 4 (Medio N6, 1.0 mg/l de 2,4-D, 20 g/l de sacarosa, 100 mg/l de hidrolizado de caseína (digesto enzimático), L-prolina 6 mM, 2.5 g/l de Gelrite, pH 5.8) en intervalos de dos semanas durante aproximadamente 2 meses. Para iniciar cultivos de suspensión embriogénicos, aproximadamente 3 ml de volumen de célula empacada (PVC) de tejido calloso que se origina de un único embrión se agregaron a aproximadamente 30 ml de H9CP+ medio líquido (mezcla de sales básales MS (Murashige and Skoog, 1962), vitaminas MS modificadas que contiene 10 veces menos ácido nicotínico y 5 veces más tiamina-HCI, 2.0 mg/l de 2,4-D, 2.0 mg/l de ácido a-naftalenacético (NAA), 30 g/l de sacarosa, 200 mg/l de hidrolizado de caseína (digesto ácido), 100 mg/l de m/o-inositol, L-prolina 6 mM, 5% v/v de agua de coco (agregada antes del subcultivo), pH 6.0). Los cultivos de suspensión se mantuvieron en condiciones oscuras en matraces Erlenmeyer de 125 ml en un agitador controlado por temperatura a 125 rpm a 28°C. Las líneas celulares típicamente se establecieron dentro de 2 a 3 meses después de la iniciación. Durante el establecimiento, las suspensiones se subcultivaron cada 3.5 días agregando 3 ml de PCV de células y 7 ml de medio acondicionado a 20 ml de h9CP fresco + medio líquido utilizando una pipeta de boca ancha. Una vez que el tejido empezó a duplicarse en desarrollo, las suspensiones se escalonaron y se mantuvieron en matraces de 500 ml por lo que 12 ml de PCV de células y 28 ml de medio condicionado se transfirieron a 80 ml de H9CP + medio. Una vez que las suspensiones se establecieron completamente, se criopreservaron para uso futuro. 7.3 - Criopreservación y descongelamiento de suspensiones Dos días después del sub-cultivo, 4 ml de PCV de células en suspensión y 4 ml de medio acondicionado se agregaron a 8 ml de medio crioprotector (disuelto en H9CP+ medio sin agua de coco, glicerol 1 M, DMSO 1 M, de sacarosa 2 M, esterilizado por filtración) y se dejó agitar a 125 rpm a 4°C durante 1 hora en un matraz de 125 ml. Después de 1 hora, se agregaron 4.5 ml a un vial Corning cryo de 5.0 ml enfriado. Una vez que se llenaron, los viales individuales, se mantuvieron durante 15 minutos a 4°C en un congelador de proporciones controladas, luego se dejó congelar a una razón de -0.5°C/minuto hasta alcanzar una temperatura final de -40°C. Después de alcanzar la temperatura final, los recipientes se transfirieron a cajas dentro de estantes dentro de una unidad de almacenamiento Cryoplus 4 (Forma Scientific) llena con vapores de nitrógeno líquido. Para descongelamíento, los viales se retiraron de la unidad de almacenamiento y se colocaron en un contenedor de hielo seco cerrado, luego se sumergieron en un baño de agua mantenido a 40-45°C hasta que cesó la "ebullición". Una vez descongelado, el contenido se vertió en una pila de papeles de filtro Whatman de ~8 estéril de 70 mm (No. 4) en cajas de Petri de 100x25 mm. Se dejó que el líquido se absorba en los filtros durante varios minutos, luego el filtro superior conteniendo las células se transfirió sobre el medio GN6 (medio N6, 2.0 mg/l de 2,4-D, 30 g/l de sacarosa, 2.5 g/l de Gelrite, pH 5.8) durante 1 semana. Después de 1 semana, sólo el tejido con morfología promisoria se transfirió al papel de filtro directamente sobre medio GN6 fresco. Este tejido se subcultivó cada 7 a 14 días hasta que 1 a 3 gramos estuvieron disponibles para iniciar la suspensión en aproximadamente 30 ml de H9CP fresco + medio en matraces Erlenmeyer de 125 ml. Tres mililitros de PCV se subcultivaron en H9CP fresco + medio cada 3.5 días hasta que se obtuvo un total de 12 ml de PCV, en cuyo momento el subcultivo tuvo lugar de la forma que se describió previamente. 7.4 - Respuesta a la dosis de tejido no transformado al ácido haloxifop Las líneas celulares Hi-ll donantes no transformadas se combinaron, se trataron con filamentos sin ADN, se filtraron sobre el medio GN6 en la proporción de 6 ml por filtro, y se permitió que formaran callos durante 2 a 3 semanas a 28°C. Aproximadamente 200 mg del tejido de suspensión con callos por tratamiento se transfirieron al medio de selección en placas de 60x20 mm que contenían ácido R-haloxifop 30, 100 ó 300 nM. Se utilizaron tres replicados por concentración. Un medio de control que contiene 1 mg/l de bialafos (de Herbiace commercial formulation, Meiji Seika, Japón), GN6 (1 H), también se incluyó para comparación. El callo se retiró después de 2 semanas, se pesó, y se transfirió a un medio fresco de la misma concentración durante otras dos semanas. Después de un total de 4 semanas de tiempo transcurrido, se retiró el tejido, se pesó una última vez, y luego se descartó. Los resultados se muestran en la figura 9. Además se completaron dos estudios de respuesta a la dosis separados de tejido de callo a los productos de degradación fenólicos de haloxifop y cihalofop, respectivamente, para confirmar que este producto final no sería dañino al desarrollo del callo. Los datos de respuesta a la dosis de cihalofop fenol (ver la figura 10) muestran que a 1 µM de cihalofop fenol, el crecimiento todavía es 76% tan elevado como el control sin cihalofop fenol. Los datos de respuesta a la dosis al haloxifop fenol mostraron que aún a 300 nM de haloxifop fenol, el crecimiento fue igual o superior al control que carece de haloxifop fenol (no se muestran datos). 7.5 - Transformación mediada con Filamentos utilizando selección de bialafos Aproximadamente 24 horas antes de la transformación, se subcultivaron 12 ml de PCV de células en suspensión de maíz embriogénico criopreservado previamente más 28 ml de medio acondicionado, en 180 ml de medio líquido de GN6 (medio de GN6 que carece de Gelrite) en un matraz Erlenmeyer de 500 ml, y se colocó sobre un agitador a 125 rpm a 28°C. Esto se repitió 2 veces utilizando la misma línea celular de modo que un total de 36 ml de PCV se distribuyeron en 3 matraces. Después de 24 horas se eliminó el medio líquido de GN6 y se reemplazó con 72 ml de medio osmótico de GN6 S/M (medio de N6, 2.0 mg/l de 2,4-D, 30 g/l de sacarosa, 45.5 g/l de sorbitol, 45.5 g/l de manitol, 100 mg/l de m/o-inositol, pH 6.0) por matraz para plasmolizar las células. Los matraces se colocaron sobre un agitador en la oscuridad durante 30 a 35 minutos, y durante este tiempo una suspensión de 50 mg/ml de filamentos de carburo de silicio se preparó agregando el volumen apropiado de medio líquido de GN6 S/M a ~405 mg de filamentos de carburo de silicio, pre-autoclavados (Advanced Composite Materials, Inc.). Después de la incubación en GN6 S/M, los contenidos de cada matraz se combinaron en una botella para centrífuga de 250 ml. Una vez que las células se depositaron en el fondo, todo salvo -14 ml de líquido de GN6 S/M se extrajo y se recolectó en un matraz de 1 litro para uso futuro. La suspensión pre-humedecida de los filamentos se agitó con vórtex durante 60 segundos a velocidad máxima y se agregaron 8.1 ml a la botella, a la cual se agregaron 170 µg de ADN como último paso. La botella se colocó inmediatamente en un mezclador de pintura comercial Red Devil 5400 modificado y se agitó durante 10 segundos. Después de la agitación, el cóctel de células, el medio, los filamentos y el ADN se agregó al contenido del matraz de 1 litro junto con 125 ml de medio líquido de GN6 fresco para reducir la osmolaridad. Las células se dejaron recuperar sobre un agitador durante 2 horas antes de filtrarse sobre papel de filtro #4 Whatman (5.5 cm) utilizando una unidad recolectora de células de vidrio que se conectó a una línea de vacío. Ya sea 3 ó 6 ml de suspensión dispersa se pipetearon sobre la superficie del filtro a medida que se sacó el vacío. Los filtros se colocaron sobre placas de 60 x 20 mm de medio GN6. Las placas se cultivaron durante 1 semana a 28°C en una caja oscura que se selló de manera flexible con una sola capa de plástico (<2 mils de espesor) para minimizar la evaporación de las placas individuales. Después de una semana, los papeles de filtro se transfirieron a placas de 60x20 mm de medio GN6 (1 H) (Medio de N6, 2.0 mg/l de 2,4-D, 30 g/l de sacarosa, 100 mg/l de m/o-inositol, 1.0 mg/l de bialafos, 2.5 g/l de Gelrite, pH 5.8) o medio GN6D (1 H) (igual que GN6 (1 H) salvo con 8.0 mg/l de dicamba y 0.8 mg/l de 2,4-D). Las placas se colocaron en cajas y se cultivaron como se mencionó anteriormente durante otra semana. Dos semanas de la postransformación, el tejido se insertó al raspar ya sea la mitad de las células sobre la placa o todas las células sobre la placa en 2.0 ml de medio de agarosa de GN6 fundido (medio N6, 2.0 mg/l de 2,4-D, 30 g/l de sacarosa, 100 mg/l de m/o-inositol, 7 g/l de agarosa Sea Plaque, pH 5.8, autoclavado durante sólo 10 minutos a 121 °C) conteniendo 1 mg/l de bialafos. El tejido se disgregó y ios 3 ml de agarosa y tejido se vertieron uniformemente sobre la superficie de una placa de 100 x 15 mm de GN6 (1 H) o medio GN6D (1 H). Esto se repitió para todas las placas restantes. Una vez insertas, las placas se sellaron individualmente con Nescofilm® o Parafilm M®, y luego se cultivaron durante 1 semana a 28°C en cajas oscuras. Los aislados transformados putativamente fueron típicamente visibles a las 5 a 8 semanas de pos-transformación. Todos los aislados potenciales se retiraron de la placa inserta y se transfirieron al medio de selección fresco de la misma concentración en placas de 60 x 20 mm. Si fue evidente un crecimiento sostenido después de aproximadamente 2 semanas, un evento se consideró resistente y se sometió a análisis molecular. La regeneración se inició transfiriendo el tejido de callo a un medio de inducción basado en cítoquinina, 28 (1 H), conteniendo 1 mg/l de bialafos, sales de MS y vitaminas, 30.0 g/l de sacarosa, 5 mg/l de BAP, 0.25 mg/l de 2,4-D, 2.5 g/l de Gelrite; pH 5.7. Las células se dejaron desarrollar en luz baja (13 µErtí2s"1) durante una semana, luego luz más alta (40 µEm'V) durante otra semana antes de ser transferidas al medio de regeneración, 36 (1 H), el cual fue idéntico a 28 (1 H) salvo que carecía de reguladores del crecimiento vegetal. Se retiraron pequeñas plántulas (3-5 cm) y se colocaron en tubos de cultivo de 150 x 25 mm conteniendo medio de SHGA libre de selección (sales básales de Schenk y Hildebrandt y vitaminas, 1972; 1 g/l de /77/o-inositol, 10 g/l de sacarosa, 2.0 g/l de Gelrite, pH 5.8). Una vez que las plántulas desarrollaron una raíz suficiente y un sistema de brote, se transplantaron a tierra en el invernadero. 7.6 - Transformación mediada por Filamentos utilizando selección de haloxifop. Los parámetros de administración de ADN para selección directa de "fops" fueron idénticos al procedimiento de selección de bialafos salvo que 85 µg de pDAB3403 y 85 µg de construcción conteniendo un indicador GFP (Proteína Fluorescente Verde) se co-transformaron juntos, y sólo 3 ml de suspensión se filtraron sobre el medio de GN6 luego de la recuperación de 2 horas. Después de 0 a 7 días sobre el medio libre de selección de GN6, los papeles de filtro se transfirieron a placas de 60x20 mm de medio de GN6 conteniendo 2 mg/l de 2,4-D más ácido R-haloxifop 50, 100 ó 200 nM. Las placas se colocaron en cajas y se cultivaron durante otra semana. Después de una semana, el tejido se insertó raspando todas las células de la placa en 3.0 ml de medio de agarosa de GN6 fundido conteniendo la misma concentración de agente de selección que en la transferencia previa. Todos los pasos posteriores fueron idénticos al protocolo de selección/regeneración de PAT salvo que se incluyó ácido R-haloxifop 100 nM en el medio de regeneración en lugar de 1 mg/l de bialafos. 7.7 - Resultados. Se iniciaron múltiples experimentos que ensayan varios niveles de haloxifop y cihalofop, y se recuperaron 47 aislados de la selección directa. Un subconjunto de los eventos de callo se sometieron a selección utilizando análisis de PCR y Western. Luego de estos datos de expresión, se sometieron 21 eventos líderes a análisis Southern. Los resultados utilizando Ncol, un único cortador, para obtener datos de integración luego del sondaje con AAD-1 (v3), mostraron inequívocamente una integración estable del AAD-1 (v3) luego de la transformación mediada por filamentos acoplada con selección "fop". 7.8 - Demostración cuantitativa de tolerancia in vitro a partir de selección de bialafos de los eventos de callo que expresan el AAD-1 (v3) Noventa y siete aislados de callo recuperados de la selección de bialafos se sometieron a análisis de número de copias de PAT mediante el Invader y análisis de PTU del AAD-1 (v3) mediante PCR (ver Ejemplo 7.10). La expresión de proteínas del AAD-1 (v3) utilizando Western blot/Sandwich ELISA (Ejemplo 11 ) se completó sobre un subconjunto de los eventos. Se describe un resumen en el cuadro 21 a continuación. Al menos 15 plantas T0 se regeneraron a partir de cada uno de estos eventos y se enviaron para ensayo de aspersión y producción de semillas.

CUADRO 21 Se evaluó un subconjunto más pequeño de estos eventos en estudios de respuesta a la dosis en comparación con un control no transformado. Se ensayó un intervalo de concentraciones de haloxifop (de formulación Gallant Super), hasta 400 nM. Los datos de respuesta a la dosis para un evento, 3404-006, se generaron utilizando los métodos generales del Ejemplo 7.4, y se muestran en la figura 11. Esto muestra que el evento 3404-006 no mostró una reducción significativa en el crecimiento del callo a concentraciones de haloxifop hasta 400 nM por lo que el desarrollo tisular del callo de maíz no transgénico se inhibió a esta proporción. Estos datos no han sido normalizados para dar cuenta de las diferencias de crecimiento inherentes que no están relacionadas con la expresión del transgen. 7.9 - Transformación mediada por Filamentos utilizando selección de imazetapir El cásete de ZmUbil IAAD-1 (V3 /ZmPer5 se eliminó del pDAB3404 con Ascl/Swal y se insertó en el pDAB2212 para crear el vector de transformación con filamentos pDAB3415 del AAD-1 (v3) y el AHAS, el cual se denomina también pDAS1283. Una vez completada, esta construcción se transformó en maíz mediante transformación mediada por filamentos de carburo de silicio según se describe en el ejemplo 7.4 salvo que se filtraron 2 ml de células, seguido de una recuperación de 7 días sobre medio GN6 seguido de la selección sobre el medio que contiene imazetapir 3 µM proveniente del herbicida Pursuit® DG. Luego del análisis Invader, se identificaron 36 eventos que contenían los genes AAD-1 (v3) y AHAS. Cincuenta y tres eventos de callo de maíz de estas transformaciones se ensayaron en experimentos de ELISA y Transferencia Western para su expresión de AAD-1 (v3) - un subconjunto de los datos se muestra a continuación. Para los eventos enumerados en el cuadro 22, los niveles de expresión de los detectados positivos oscilaron entre 90 y más de 1000 ppm de proteínas solubles totales.

CUADRO 22 10 15 20 7.10- Análisis molecular: Materiales y métodos para maíz. 7.10.1 - Aislamiento y cuantificación de ADN de cosecha de tejido. Se colocó tejido fresco dentro de tubos y se liofilizó a 4°C durante 2 días. Después que el tejido estuvo totalmente seco, una perla de tungsteno (valenita) se colocó en el tubo y las muestras se sometieron a 1 minuto de molienda seca utilizando un molino de vidrio Kelco. Se siguió el procedimiento de aislamiento de ADN Dneasy estándar (Qiagen, DNeasy 69109). Una alícuota del ADN extraído se tiñó luego con Pico Green (Sondas Moleculares P7589) y se leyó en el fluorómetro (BioTek) con estándares conocidos para obtener la concentración en ng/µl. 7.10.2 - Análisis del ensayo Invader. Las muestras de ADN se diluyeron a 20 ng/µl luego se desnaturalizaron en un termociclador a 95°C durante 10 minutos. Luego se preparó la mezcla de Signal Probé utilizando la mezcla oligo provista y MgCI2 (Third Wave Technologies). Una alícuota de 7.5 µl se colocó en cada pozo de la placa de ensayo Invader seguido de una alícuota de 7.5 µl de controles, estándares, y 20 ng/µl de muestras desconocidas diluidas. Cada pozo se superpuso con 15 µl de aceite mineral (Sigma). Luego las placas se incubaron a 63°C durante 1 hora y se leyeron sobre el fluorómetro (Biotek). El cálculo de % de señal respecto del fondo para la sonda blanco dividido por el % de señal sobre la sonda control interna de fondo calculará la relación. La relación de los estándares de copia conocidos desarrollada y validada con el análisis de transferencia Southern, se utilizó para identificar la copia estimada de los eventos desconocidos. 7.10.3 - Reacción en cadena de la polimerasa. Un total de 100 ng de ADN total se utilizó como molde. Se utilizaron 20 mM de cada iniciador con el equipo Takara Ex Taq PCR Polymerase (Mirus TAKRR001A). Los iniciadores para el AAD-1 (v3) PTU fueron (Delantero - ATAATGCCAGC CTGTTAAACGCC) (SEQ ID NO: 25) y (Reverso CTCAAGCATATGAATGACCT CGA) (SEQ ID NO: 26). La reacción de PCR se llevó a cabo en termociclador Geneamp 9700 (Applied Biosystems), sometiendo las muestras a 94°C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 63°C durante 30 segundos, y 72°C durante 1 minuto y 45 segundos, y 72°C durante 10 minutos. Los iniciadores para la PCR de Región Codificadora del AAD-1 (v3) fueron (Delantero -ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCC) (SEQ ID NO: 27) e (Reverso - CGGGC AGGCCTAACTCCACCAA) (SEQ ID NO: 28). La reacción de PCR se llevó a cabo en el termociclador Geneamp 9700 (Applied Biosystems), sometiendo las muestras a 94°C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos, y 72°C durante 1 minuto y 45 segundos seguido de 72°C durante 10 minutos. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis sobre gel de agarosa 1% teñido con EtBr. 7.10.4 - Análisis de trasnferencia Southern. El análisis de transferencia Southern se realizó con ADN total obtenido del equipo Qiagen DNeasy. Un total de 2 µg de ADN se sometieron a digestión de Afl II durante toda la noche y además EcoRV para pDAB3404, Ncol para pDAB3403, y Spel para pDAB1421 para obtener los datos de integración. Después de la digestión de toda la noche se procesó una alícuota de -100 ng sobre gel al 1 % para asegurar la completa digestión. Después de asegurarse esto, las muestras se procesaron sobre un gel de agarosa 0.85% durante toda la noche a 40 voltios. El gel luego se desnaturalizó en NaOH 0.2 M, NaCI 0.6 M durante 30 minutos. Luego el gel se neutralizó en Tris HCl 0.5 M, NaCI 1.5 M, pH 7.5, durante 30 minutos. Un aparato de gel conteniendo 20x SSC luego se colocó para obtener un gel de gravedad para la transferencia a membrana de nylon (Millipore INYC00010) durante la noche. Después de la transferencia nocturna, la membrana se sometió a luz UV mediante un entrecruzador (Stratagene UV stratalinker 1800) a 1200 X100 microjoules. Luego la membrana se lavó en SDS 0.1 %, 0.1 SSC durante 45 minutos. Después del lavado de 45 minutos, la membrana se horneó durante 3 horas a 80°C y luego se almacenó a 4°C hasta la hibridación. El fragmento de molde de hibridación se preparó utilizando la PCR de región codificadora anterior utilizando el plásmido pDAB3404. El producto se procesó sobre gel de agarosa 1 % y se recortó y luego se extrajo el gel utilizando el procedimiento de extracción de gel Qiagen (28706). La membrana luego se sometió a un paso de pre-hibridación a 60°C durante 1 hora en regulador de pH Perfect Hyb (Sigma H7033). El procedimiento de Prime it RmT dCTP-labeling rxn (Stratagene 300392) se utilizó para desarrollar la sonda de base p32 (Perkin Elmer). La sonda se limpió utilizando las columnas G50 de Probé Quant. (Amersham 27-5335-01). Dos millones de conteos CPM por ml de regulador de pH Perfect Hyb se utilizaron para hibridar las transferencias southern durante la noche. Después de la hibridación nocturna las transferencias se sometieron a dos lavados de 20 minutos a 65°C en SDS 0.1%, 0.1 SSC. Las transferencias luego se expusieron a una película durante la noche, incubando a -80°C.

EJEMPLO 8 Datos de tolerancia In vivo y tolerancia de campo generados a partir de eventos de (pDAB3404) AAD-1 (v3) seleccionados cíe PAT 8.1 - Tolerancia de las plantas de maíz T a los herbicidas tipo AOPP. Si más de 15 plantas clonadas por evento se regeneraban con éxito, luego las plantas extras se transferían al invernadero para muestreo de tolerancia preliminar con herbicidas tipo AOPP aplicados pos-emergencia sobre plantas de maíz T0. Las plantas aclimatadas en invernadero se dejaron desarrollar hasta que 2 a 4 hojas de vista normal nuevas, emergieron del verticilo (es decir, las plantas habían transitado de las condiciones de cultivo de tejido a la condiciones de desarrollo del invernadero). Las plantas se desarrollaron a 27°C en condiciones de 16 horas de luz: 8 horas de oscuridad en el invernadero. Las plantas luego se trataron con formulaciones comerciales de uno a tres herbicidas tipo AOPP: Assure® 11 (DuPont), Clincher* (Dow AgroSciences), o Gallant Super* (Dow AgroSciences) para quizalofop, cihalofop, o haloxifop, respectivamente. Las aplicaciones de herbicida se realizaron con un atomizador de vía a un volumen de atomización de 187 L/ha, con una altura de rocío de 50 cm, y todos los rocíos contenían 1 % v/v de adyuvante concentrado de aceite para cultivo Agridex. El número de clones de cada evento varió de semana en semana debido a la proporción de regeneración y aclimatación de cada evento. Globalmente, se hizo el intento de tratar clones representativos de cada evento con un intervalo de dosis de herbicida que varía de 1X de la dosis letal (-1/8 X dosis de campo) hasta 8X las dosis de campo (64 X la dosis letal). Una dosis letal se define como la proporción que causa >95% de lesión al endógamo Hi-ll. Hi-ll es el antecedente genético de los transformantes de la presente invención. En general, los AOPP son herbicidas muy potentes que matan el maíz. El maíz Hi-ll de tres a cuatro hojas proveniente de semillas se muere efectivamente (>95% de lesión) con 8.8, 62.5, y 4.4 g ea/ha de haloxifop, cihalofop, y quizalofop, respectivamente. Cada línea transformada con AAD-1 (v3) ensayada sobrevivió a una dosis letal mínima de cada herbicida tipo AOPP ensayado. En realidad, la mayoría de las líneas ensayadas sobrevivieron sin lesión visible (14 DAT) aún cuando se trataron con una dosis 8X la de campo (64X la dosis letal) de quizalofop. Varios clones individuales de los eventos "017" y "038," sin embargo, sí sufrieron una lesión significativa a proporciones elevadas. Esto podria ser una función de la expresión génica inferior debido a cómo y dónde se insertó el gen. El nivel elevado de tolerancia a AOPP se demostró en la mayoría de los eventos, aún cuando las aplicaciones se realizaron a plantas que salieron del cultivo tisular (etapa To). Significativamente, esta tolerancia se mostró para los tres herbicidas tipo AOPP y probablemente se extenderá a todos los herbicidas tipo AOPP según se mostró previamente para AAD-1 in vitro. La Figura 12 muestra las respuestas de varios clones del evento no transformado y transformado con AAD-1 (v3) a dosis letales de dos herbicidas tipo AOPP (haloxifop y quizalofop) aplicados 1 semana antes. El cuadro 23 muestra los datos para las respuestas de eventos de maíz T0 transformados con AAD-1 (v3) a tres herbicidas tipo AOPP aplicados pos-emergencia.

CUADRO 23 *Gallant super + 1 % COC (v/v) **Clincher * + 1 % COC (v/v) ***Assure 11 + 1 % COC (v/v) #Marca registrada de Dow AgroSciences, LLC 8.2 - Tolerancia de campo de plantas de maíz pDAB3404 Ti a los herbicidas quizalofop, 2,4-D y qlufosinato. Se establecieron dos pruebas de campo en estaciones en Hawai e Indiana. Se utilizaron semillas de maíz de plantas Ti endogámicas para evaluar dieciséis líneas de eventos de AAD1 para tolerancia contra quizalofop y 2,4-D. Se incluyeron tres híbridos no transformados con ei propósito de comparación. El híbrido Hi-ll x 5XH571 es de la misma familia que las líneas de eventos de AAD-1 (v3). El híbrido Croplan 585SR es una línea resistente al sethoxidim. El diseño experimental era una parcela de muestreo discontinua con cuatro replicaciones. La principal parcela de muestreo era el tratamiento con herbicida y la sub-parcela era el evento de AAD-1 (v3) o híbrido de comparación. Las parcelas eran una fila de 3,7 metros con aproximadamente veinticinco semillas plantadas en cada fila. Para eventos de AAD1 , las semillas de un linaje diferente dentro del evento se plantaron en cada replicado. El glufosinato a 560 g ia/ha se aplicó a las parcelas de AAD-1 (v3) en la etapa V2 para eliminar las plantas no transformadas. Los tratamientos experimentales incluyeron formulaciones comerciales de quizalofop aplicadas a 70 y 140 g ea/ha, de 2,4-D (sal de dimetilamina) a 560 y 1120 g ea/ha, y un control no tratado. Los tratamientos se aplicaron utilizando un equipo de lanza de transmisión de mochila que suministraba 187 l/ha de volumen de vehículo a una presión de 130-200 kpa. Los tratamientos de quizalofop se aplicaron en la etapa de maíz V3-V4 y los tratamientos de 2,4-D se aplicaron en la etapa V5-V6. Las parcelas tratadas con quizalofop se evaluaron visualmente para comprobar la lesión del cultivo a una y tres semanas después de la aplicación (WAA) utilizando una escala de 0-100%, donde 0 es igual a ninguna lesión y 100 es igual a muerte completa. Las parcelas tratadas con 2,4-D se evaluaron visualmente para el desplome de la planta a 2 días después de la aplicación (DAA) utilizando una escala de 0-100% donde 0 es igual a ningún desplome de ninguna planta y 100 es igual a todas ias plantas postradas. Además, las parcelas de 2,4-D se evaluaron visualmente a 3-4 WAA para determinar la deformación de la raíz de apoyo utilizando una escala de 0-10. 8.2.1 - Resultados. La respuesta del evento de AAD-1 (v3) a las proporciones más elevadas ensayadas de quizalofop y 2,4-D se muestran en el cuadro 24. Estas proporciones representan aproximadamente dos veces las proporciones de uso comercial normal. Los híbridos no transformados se lesionaron seriamente (80-100%) por quizalofop a 70 g ea/ha incluyendo la línea resistente al sethoxidim, si bien mostraron una tolerancia levemente mejor que los otros dos híbridos. Todos los eventos de AAD-1 (v3) salvo un linaje del evento 3404.001 mostraron excelente tolerancia al quizalofop a 70 g ea/ha. No se observaron síntomas visibles sobre los eventos de AAD-1 (v3) salvo con los eventos indicados anteriormente.

CUADRO 24 El 2,4-D en la proporción de 1120 g ea/ha originó niveles significativos (11-33%) de desplome epinástico en los híbridos no transformados, una respuesta normal cuando se aplicó más allá de la etapa de crecimiento V4. Se observó muy poco o ningún desplome con todos los eventos de AAD-1 (v3) salvo un linaje de 3404.001 (ubicación Indiana solamente) donde se produjeron niveles moderados de desplome (5-13%). Las raíces de apoyo de híbridos no transformados se deformaron severamente (variando de 9 en una escala de 0-10) con 2,4-D en la proporción de 1120 g ea/ha. Nuevamente, esta es una respuesta normal al 2,4-D aplicado sobre la etapa de crecimiento V4. Como con la respuesta al desplome, se observó poca o ninguna lesión de raíz de apoyo con todos los eventos de AAD-1 (v3) salvo un linaje de 3404.001. Se produjeron tendencias similares con proporciones ensayadas más bajas de quizalofop y 2,4-D si bien a niveles de respuesta reducidos pero aún significativos en los híbridos no transformados (no se muestran datos). Estos resultados indican que la mayoría de las líneas de eventos transformadas con AAD-1 (v3) mostraron un nivel elevado de resistencia al quizalofop y al 2,4-D en proporciones que fueron letales o causaron malformaciones epinásticas severas a híbridos de maíz no transformados. Véase también la figura 14. 8.2.2- Relaciones de segregación Mendelianas esperadas sobre tres eventos de T?. Las plantas de linajes individuales de cada evento se autopolinizaron al azar en el campo. Se cosecharon semillas de T2 a mano a la madurez fisiológica. En base al número de copias génicas simples (ver Cuadro 24 anterior) y el rendimiento total en la generación de T-i (segregación, tolerancia al herbicida, y vigor), se eligieron tres eventos (022, 031 , y 074) para una posterior evaluación en el campo. Las filas de crianza de cada evento se plantaron utilizando un plantador cónico de precisión consistiendo cada una de ellas en 2500-3000 semillas. En la etapa de crecimiento V2, todas las líneas de AAD-1 (v3) se rociaron con 140 g ea/ha de quizalofop (Assure® II) utilizando un atomizador de mochila según se describió previamente. Esta proporción rápidamente mató todos los segregantes "nulos" (no transformados). Cada evento tenía una relación de segregación consistente con la herencia Mendeliana de un gen dominante, de locus único (3 resistentes: 1 sensible, o 75% de supervivencia) (ver Cuadro 24). Los homocigotos y hemicigotos del evento 74 se identificaron por ensayo de cigosidad (referirsee a la descripción del ensayo Invader del AAD-1 (v3) para maíz). Las plantas hemicigotas se eliminaron y las plantas homócigas de AAD-1 (v3) se cruzaron con el endógamo de maíz BE1146 introgresado y homócigo para la característica de resistencia al glifosato, NK603, creando una semilla híbrida F-? homogénea que es hemicigota para la resistencia al glifosato, AAD-1 (v3), y resistente al glufosinato. 8.3 - Apilamiento de AAD-1 (v3) y PAT con genes de resistencia al glifosato en maíz. Las plantas de maíz homódgas T2 de AAD-1 (v3)/PAT se cruzaron con plantas de maíz resistentes al glifosato produciendo semilla Fi conteniendo AAD-1 (v3), PAT, y genes de resistencia al glifosato según se describió en el ejemplo anterior. Las semillas F-i se plantaron en forma individual en macetas de 7.5 centímetros preparados con medio de crecimiento Metro-Mix® 360 (Sun Gro Horticulture). Los macetas se subirrigaron inicialmente con solución de Hoagland hasta que se humedecieron, luego se dejaron drenar por gravedad, y se desarrollaron a 27°C en condiciones de 16 horas de luz: 8 horas de oscuridad en el invernadero. Para el resto del estudio las plantas se subirrigaron con agua desionízada. Las plantas se dejaron desarrollar hasta que emergieron 2 a 4 hojas del verticilo. En este punto las aplicaciones de herbicida se realizaron con un atomizador de vía a un volumen de atomización de 187 l/ha, con una altura de rocío de 50 cm. Las plantas se rociaron con proporciones de 2,4-D DMA, glifosato, glufosinato, y varias combinaciones de los tres. Todas las aplicaciones se formularon en regulador de pH de Hepes 200 mM (pH 7.5). En aplicaciones por atomización donde el glufosinato estaba presente el tratamiento se formuló con la adición de 2% p/v de sulfato de amonio. A los 3 y 14 días después del tratamiento (DAT) se evaluaron las plantas. Se asignó a las plantas una relación de lesión con respecto a atrofia, clorosis, y necrosis. Las plantas con una relación de lesión del 90% o por encima se consideraron muertas. Los resultados del estudio a 14 DAT pueden observarse en el cuadro 25.

CUADRO 25 Este estudio mostró que el gen de AAD-1 (v3) en maíz puede apilarse con un gen de resistencia al glifosato y un gen de resistencia al glufosinato para dar tolerancia a nivel de campo fuerte al 2,4-D, glifosato, y/o glufosinato solos o en combinaciones de mezcla de tanque. 8.3.1 - Resistencia del maíz con AAD-1 (v3) utilizando una mezcla de tanque de 2,4-D DMA y quizalofop. Las semillas de T2BC? del evento hemicigoto número 3404-025.001 R/R001 Bulked.001.S058 se plantaron individualmente en macetas de 7.5 centímetros preparados con un medio de crecimiento Metro-Mix® 360. Los macetas se sub-irrigaron inicialmente con solución de Hoagland hasta que se tornaron húmedos, luego se dejaron drenar por gravedad, y se desarrollaron a 27°C en condiciones de 15 horas de luz y 8 horas de oscuridad en el invernadero. Para el resto del estudio las plantas se sub-irrigaron con agua desionizada. Las plantas se dejaron desarrollar hasta la etapa V1 en el invernadero. En este punto las plantas se seleccionaron con 560 g ea/ha de Assure® II con la adición de 1 % de concentrado de aceite de cultivo Agridex en regulador de pH de Hepes 200 mM con el atomizador de vía fijado a 187 l/ha. Las plantas se dejaron 4 días para que muestren los síntomas de la selección. Ninguna planta sufrió lesiones. Las aplicaciones de herbicida se realizaron con un atomizador de vía a un volumen de atomizado de 187 l/ha, a una altura de rocío de 45.7 centímetros. Todas las aplicaciones se formularon en regulador de pH de Hepes 200 mM (pH 7,5) con la adición de 1 % v/v de Agridex. A los 3 y 14 días después del tratamiento (DAT) se evaluaron las plantas. A las plantas se les asignó una proporción de lesión con respecto a atrofia, clorosis, y necrosis. Las plantas que recibieron una proporción de lesión de 90% o más se consideran muertas. Las plantas de este linaje particular tenían 0% de lesión a 14 DAT para todas las combinaciones de mezcla de tanque, mientras que la del tipo silvestre tenían 100% de lesión. Estos resultados indican que el AAD-1 (v3) no sólo aporta fuerte resistencia a nivel de campo al 2,4-D y quizalofop en forma individual, sino además a proporciones exageradas de combinaciones múltiples de los dos productos químicos. Se podría esperar lógicamente implementar las mediciones de control de malezas nuevas con combinaciones de fenoxi auxinas y graminicidas de AOPP (u otros cultivos transformados con AAD-1 ) no posibilitados previamente por un único gen HTC. 8.3.2 - Tolerancia de las plantas de maíz Tn (pDAB3403) al herbicida quizalofop. Un blanco de aproximadamente ocho clones de planta T0 de cada uno de los 17 eventos se regeneraron y se transfirieron al invernadero para rastreo de tolerancia preliminar con proporción discriminatoria aplicada pos-emergencia del herbicida quizalofop aplicado mediante atomizador de vía a 35 g ea/ha (1X la proporción de campo, 4X la dosis letal) a plantas de maíz T0 adaptadas al invernadero, de 3 hojas, utilizando las condiciones del atomizador de vía previamente descriptas. Las plantas se clasificaron como resistentes o sensibles 7 días después del tratamiento. Se incluyó maíz no transgénico, control con cada aplicación de atomizado. Dos eventos, Evento 014 y 047, tenían dos o más clones T0 sensibles a 35 g ea/ha de quizalofop, indicando un nivel inesperado de sensibilidad para este evento. Los otros 15 eventos mostraron integración estable, expresión de proteína, y capacidad de tolerar una dosis 4X la letal de quizalofop a nivel de planta completa. 8.3.3 Expresión de AAD-1 (v3) con respecto a la tolerancia de quizalofop. Tres linajes T2 diferentes de 3404 transformaciones que se pre-rastrearon con Liberty® (según se describió previamente) para eliminar los nulos, se eligieron para comparar su tolerancia ai quizalofop con respecto a su expresión de AAD-1 (v3). La expresión se midió a 14 DAT (los datos no se muestran) y a 30 DAT (ver Figura 13). La línea de tolerancia más alta, evento 3404-074, siempre se expresó con una cantidad más alta de AAD-1 (v3) que los otros dos eventos a 1X y proporciones de campo más altas. Estos datos concluyen que el maíz que expresa el AAD-1 (v3) se puede proteger de la lesión de quizalofop al nivel más elevado ensayado (2,240 g/ha), el cual es 16 veces la dosis de campo de 35 g/ha. Además, el nivel de expresión fue consistente con el período del experimento.

EJEMPLO 9 Transformación del maíz con AAD-1 (v3) mediada por Agrobacteríum 9.1 - Material de Planta. Semillas de un cruce de F-? "High II" (es decir, Parentales A y B) (Armstrong et al., 1991 ) se plantaron directamente en macetas de 19 litros conteniendo 95:5 de Metro-Mix® 360: suelo mineral. Las plantas se desarrollaron en el invernadero con un fotoperíodo de 16 horas suplementado con una combinación de lámparas de sodio y haluro metálico de alta presión. 9.2 - Fuente de Tejido. Para obtener embriones Hi-ll (F2) inmaduros, se realizaron polinizaciones de plántulas. El día de la polinización, se embolsaron inflorescencias masculinas activamente separadas y se recolectó polen fresco y se aplicó cuidadosamente sobre las sedas. Los embriones inmaduros se aislaron según se describió en el Ejemplo 7.2. 9.3 - Preparación de un vector superbinario. La producción de una construcción del Agrobacterium, pDAB2272, conteniendo el gen de AAD-1 (v3) en combinación con el gen marcador AHAS seleccionable se logró aislando el fragmento Notl de 3443 pares de bases del pDAB3404 conteniendo el ZmUbil v2/ AAD-1 (V3J/ZmPer5 v2 e insertándolo en el sitio Notl de pDAB8549. El plásmido resultante contiene los casetes de ZmUb?'1 v2/ AAD-1 (v3)l ZmPerd v2 y el OsActl V2/AHAS v3/ZmLip v1 flanqueados por regiones MAR no-idénticas en la orientación directa. Esto se transformó subsiguientemente en LBA4404/pSB1 para crear el vector superbinario, el cual se denominó pDAB3602 pero además se denominó pDAS1421. 9.4 - Suministro bacteriano. Todas las transformaciones utilizan el vector "Super binario" de Japan Tobacco descripto en la Patente Estadounidense No. 5,591 ,616 ("Method for Transforming Monocotyiedons"). Para preparar la suspensión de Agrobacterium pava tratamiento, 1-2 asadas de la bacteria recombinante pDAS1421 de una placa marcada de YP se colocaron en 5 ml de medio LS-inf. Mod (Medio Basal LS (Linsmaier y Skoog, 1965), vitaminas N6, 1.5 mg/l de 2,4-D, 68.5 g/l de sacarosa, 36.0 g/l de glucosa, L-prolina 6 mM, pH 5.2). La mezcla se agitó con vórtex hasta que se logró una suspensión uniforme. La concentración bacteriana se tomó utilizando un colorímetro fotoeléctrico Klett-Summerson leyendo la densidad de la solución. La solución se ajustó a una concentración de Klett 200 (~ 1x109 cfu/ml) y se agregó a la solución actetosiringona 100 µM. 9.5 - Infección y co-cultivo Los embriones inmaduros se aislan directamente en un tubo de microcentrífuga conteniendo 2 ml de medio LS-inf. Mod liquid. Cada tubo, conteniendo -100 embriones, se agita con vórtex durante 3 a 5 segundos. El medio se elimina y se reemplaza con medio líquido fresco y se repite la agitación con vórtex. El medio líquido se elimina nuevamente y esta vez se reemplaza con solución de Agrobacterium a la concentración de Klett 200. La mezcla de Agrobacterium y embriones se agita durante 30 segundos. Al cabo de una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente, los embriones se transfirieron al medio LS-As Mod (Medio Basal LS, vitaminas N6, 1.5 mg/l de 2,4-D, 30.0 g/l de sacarosa, L-prolina 6 mM, 0.85 mg/l de AgNO3, actetosiringona 100 µM, 3.0 g/l de Gelrite, pH 5.8) para un co-cultivo de 5 días a 25°C. 9.6 - Respuesta a la dosis utilizando embriones inmaduros. Los estudios de respuesta a la dosis se iniciaron utilizando embriones inmaduros tratados con la cepa de Agrobacterium LBA4404 que carece de un plásmido según se describió previamente. Una vez tratados, los embriones se dejaron co-cultivar durante 5 días a 25°C y luego se transfirieron al medio de selección conteniendo varios niveles de R-haloxifop o R-cíhalofop. Además los embriones se transfirieron al medio conteniendo 1 mg/l de bialafos e imazetapir 100 nM como controles negativos. Se valoraron los embriones para el % de formación de callo embriogénico después de 2 semanas, y luego nuevamente después de 4 semanas. Los embriones se ensayaron a niveles de R-haloxifop hasta 30 nM; sin embargo, se observó una reducción insuficiente de formación de callo a los niveles más elevados, de modo que se utilizaron concentraciones más elevadas (50 - 100 nM) para los experimentos de transformación. Los datos de los embriones desarrollados sobre medios que contienen cihalofop se muestran en la Figura 15. 9.7 - Selección Después del co-cultivo, los embriones se movieron a través de un esquema de selección de 2 pasos después de lo cual se obtuvieron aislados transformados. Para selección, se utilizó medio LSD Mod (Medio Basal LS, vitaminas N6, 1.5 mg/l de 2,4-D, 0.5 g/l de MES, 30.0 g/l de sacarosa, L-prolina 6 mM, 1.0 mg/l de AgNO3, 250 mg/l de cefotaxima, 2.5 g/l de Gelrite, pH 5.7) junto con uno de dos niveles de selección de haloxifop, cihaiofop o imazetapir. A través de la fase de selección, los embriones se cultivaron en la oscuridad a 28°C. Primero los embriones se transfirieron a un nivel inicial de selección (R-haloxifop 50-100 nM o R-cihalofop 300 nM) durante 14 días, luego se movieron hasta un nivel de selección superior (ácido R-haloxifop 250-500 nM o cihalofop 1.5 µM) en una proporción de 5 embriones/placa. Un subconjunto de embriones se apuraron de manera similar con imazetapir 100 a 500 nM de Pursuit® DG como control positivo. Se utilizó Pursuit® como agente de selección química cuando se utilizó el gen AHAS, en base a la Patente Estadounidense No. 5,731 ,180. El tejido se transfirió a intervalos de 2 semanas en el mismo medio hasta que se obtuvieron colonias embriogénicas. Estas colonias se mantuvieron a una presión de selección elevada durante el período de cultivo restante. Las colonias transgénicas recuperadas se incrementaron transfiriéndolas a un medio fresco a intervalos de 2 semanas para regeneración y futuro análisis. 9.8. - Regeneración y producción de semillas Para regeneración, los cultivos se transfirieron a un medio de "inducción" 28 y un medio de "regeneración" 36 según se describió previamente conteniendo ya sea R-haloxifop 100 nM o cihalofop 1.5 µM para diferenciación de plántulas. Cuando se establecieron las plántulas, se transfirieron a tubos de SHGA para permitir un futuro crecimiento y desarrollo de brotes y raíces según se describió previamente. Las polinizaciones controladas para producción de semillas se llevaron a cabo según se describió previamente. 9.9 - Recuperación del evento y especificaciones del análisis; muestreo de planta completa de linajes de maíz To conteniendo el AAD-1 (v3) y el AHAS (pDAS1421 ). Setenta y dos eventos transformados con Agrobacterium se seleccionaron de varios niveles de ácido R-haloxifop y ácido R-cihalofop in vitro. Veintidós muestras de callo se analizaron por análisis de transferencia Southern para integración estable del AAD-1 (v3) en el genoma según se describió previamente. Se eligieron para su regeneración diez eventos de copia simple, según se indica en el cuadro 26.

CUADRO 26 Un mínimo de seis linajes clónales regenerados por evento se pasaron a tierra en el invernadero y se rastrearon utilizando un atomizador de vía según se describió anteriormente para aplicar 35 g ea/ha de quizalofop cuando hubieran emergido de 2 a 4 hojas nuevas normales (ver sección 8.3.3). La presencia de la proteína de AAD-1 en una transferencia Western se correlacionó perfectamente con la resistencia al herbicida en la generación de To sin considerar cuál herbicida tipo AOPP se utilizó para selección. No hay impacto negativo del segundo gen HTC (AHAS) sobre la función del AAD-1 (v3).

EJEMPLO 10 Purificación de AAD-1 (v1) para creación y caracterización bioquímica del anticuerpo Todas las operaciones durante la purificación se llevaron a cabo a 4°C. Las células de E. coli frescas o congeladas de aproximadamente 1 I de cultivo, desarrolladas e inducidas como en el Ejemplo 3, se suspendieron nuevamente en 200 ml de regulador de pH de extracción conteniendo Tris-HCl 20 mM, EDTA 1 mM, y 2 ml de cóctel inhibidor de proteasas (Sigma), y se desgarraron por tratamiento de ultrasonicación sobre hielo utilizando un sonicador Branson. El extracto soluble se obtuvo por centrifugación en un rotor GSA (Sorvall) a 12.000 rpm (24,000g) durante 20 minutos. Luego el sobrenadante se cargó sobre una columna de intercambio iónico Mono Q (Pharmacia HR 10/10) equilibrada con Tris-HCl 20 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0, y la columna se lavó con el mismo regulador de pH para 10 CV (80 ml). La proteína se eluyó con 80 ml de un gradiente lineal de 0 a 0.25 M de NaCI en regulador de pH de columna, mientras se recolectaron fracciones de 2 ml. Las fracciones conteniendo AAD-1 (v1) se unificaron y se concentraron utilizando columnas de centrifugación de membrana MWCO 30 kDa (Millipore). La muestra luego se separó sobre una columna de exclusión Superdex de tamaño 200 (Pharmacia, XK 16/60) con regulador de pH conteniendo Tris-HCl 20 mM, NaCI 0.15 M y DTT 1 mM, pH 8.0 a un caudal de flujo de 1 ml/minuto. Los procedimientos de purificación se analizaron por SDS-PAGE, y la concentración de proteína se determinó por el ensayo Bradford utilizando albúmina de suero bovino como estándar.

EJEMPLO 11 Purificación de AAD1 recombinante y producción de anticuerpo El plásmido pDAB3203 conteniendo el gen AAD-1 (v1) se mantuvo congelado a -80°C en células TOP10F' (Invitrogen) como cepa recombinante DR1878. Para expresión, el ADN del plásmido del cultivo celular TOP10F' utilizando el Equipo Wizard de Promega (Fisher cat. #PR-A1460) se transformó en células BL-21 Star (DE3) (Invitrogen cat. #C6010-03) siguiendo el protocolo del fabricante. Después de la transformación, 50 µl de las células se plaquearon sobre placas de LB S/S agar y se incubaron durante toda la noche a 37°C. Todas las colonias de la placa de agar completas se unificaron en 100 ml de LB en un matraz de tres pantallas de 500 ml y se incubaron a 37°C con agitación a 200 rpm durante 1 hora. La expresión génica luego se indujo con IPTG 1 mM, y se incubó durante 4 horas a 30°C con agitación a 200 rpm. Los 100 ml de cultivo se centrifugaron a 4000 rpm durante 20 minutos. Luego se descartó el sobrenadante, y los concentrados se suspendieron nuevamente en 200 ml de extracción conteniendo Tris-HCl 20 mM (pH 8.0), EDTA 1 mM y 2 ml de cóctel inhibidor de proteasas (Sigma), y se disgregaron por tratamiento de ultrasonicación sobre hielo utilizando un sonicador Branson. El lisado se centrifugó a 24,000x g durante 20 minutos para eliminar los detritos celulares. Ei sobrenadante conteniendo la proteína de AAD-1 luego se sometió a protocolo de purificación. Todas las purificaciones de AAD-1 (v1 ) se llevaron a cabo a 4°C según se menciona en el Ejemplo 10, a menos que se indique lo contrario. El lisado celular se cargó sobre una columna de intercambio iónico Mono Q (Pharmacia Cat. #HR 10/10) equilibrada con Tris-HCl 20 mM (pH 8.0), EDTA 1 mM, seguida de 80 mi de lavado con el mismo regulador de pH. Las proteínas se eluyeron con 80 ml de un gradiente lineal de 0 a 0.25 M de NaCI en regulador de pH de columna, mientras se recolectaron fracciones de 2 ml. Las fracciones conteniendo AAD-1 (v1 ) se unieron y se concentraron utilizando columnas de centrifugación de membrana MWCO 30 kDa (Millipore). La muestra luego se separó sobre una columna de exclusión Superdex de tamaño 200 (Pharmacia, XK 16/60) con regulador de pH conteniendo Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCI 0.15 M y DTT 1 mM. La concentración de proteína se determinó por el ensayo Bradford utilizando albúmina de suero bovino como estándar. Cinco miligramos de AAD-1 (v1 ) purificada se entregaron a Zymed Laboratories, Inc. (South San Francisco, CA) para producción de anticuerpo policlonal de conejo. El conejo recibió 5 inyecciones en el período de 5 semanas, conteniendo cada inyección 0.5 mg de la proteína purificada suspendida en 1 ml de adyuvante de Freund incompleto. Se ensayaron los sueros tanto en experimentos de ELISA como de transferencia Western para confirmar la especificidad y afinidad antes de la purificación de afinidad y conjugación de peroxidasa de rábano (HRP) (Zymed Lab Inc). 11.1 - Extracción de AAD-1 (v3) de hojas de plantas Aproximadamente 50 a 100 mg de tejido de hoja se cortaron en piezas pequeñas y se puso en tubos micrófugos conteniendo dos perlas de acero inoxidable (4.5 mm; Daisy Co., cat. #145462-000) y 300 µl de regulador de pH de extracción de planta (PBS conteniendo 0.1 % de Tritón X-100 y DTT 10 mM). Los tubos se agitaron durante 4 minutos con un batidor de perlas a velocidad máxima seguido de centrifugación durante 10 minutos a 5,000 x g. El sobrenadante conteniendo las proteínas solubles de planta se analizó para determinar ¡as concentraciones de proteínas solubles totaies (TSP) y AAD-1 (v3) 11.2 - Ensayo de Bradford La concentración de proteína soluble total de tejidos de hoja de planta se determinó por ensayo de Bradford utilizando albúmina de suero bovino (BSA) como estándar. Cinco microlitros de BSA diluido en serie en PBS o extracto de planta se transfirieron a una placa de microtitulación de 96 pozos por triplicado. Para estándares, las concentraciones variaron de 2000 a 15.6 µg/ml. El concentrado de ensayo de proteína primero se diluyó cinco veces en PBS y se agregaron 250 µl a cada pozo y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Cada densidad óptica (OD) se midió a 595 nm utilizando un lector de microplacas. La concentración de proteína de cada muestra se extrapoló de una curva estándar utilizando el Softmax® Pro (ver. 4.0) (Molecular Devices). 11.3 - Ensayo de inmunosorción ligado a enzimas (ELISA). El ensayo se llevó a cabo a temperatura ambiente a menos que se especificara lo contrario. Cien microlitros de anticuerpo anti-AAD-1 purificado (0.5 µg/ml) se recubrieron sobre un pozo de placa de microtitulación de 96 pozos y se incubó a 4°C durante 16 horas. La placa se lavó cuatro veces con regulador de pH de lavado (solución salina 100 mM regulada con regulador de pH fosfato (PBS; pH 7.4) conteniendo 0,05% de Tween 20) utilizando un lavador de placa, seguido del bloqueo con 4% de leche descremada disuelta en PBS durante 1 hora. Después del lavado, 100 µl de AAD-1 estándar de concentraciones conocidas o extracto de planta (ver sección previa) se incubaron en los pozos. Para una curva estándar, las concentraciones de AAD-1 purificadas variaron de 100 a 1.6 ng/ml por triplicado. Los extractos de planta se diluyeron 5, 10, 20, y 40 veces en PBS y se analizaron por duplicado. Después de 1 hora de incubación, la placa se lavó como se hizo anteriormente. Cien microlitros de conjugado de anticuerpo anti-AAD-1 y HRP (0.25 ug/ml) se incubaron en cada pozo durante 1 hora antes del lavado. Cien microlitros de sustrato de HRP, 1-Step™ Ultra TMB-ELISA (Pierce), se incubaron en cada pozo durante 10 minutos antes de que la reacción se detenga agregando 100 µl de H2SO4 0.4 N. La DO de cada pozo se midió utilizando un lector de microplacas a 450 nm. Para determinar las concentraciones de AAD-1 en extracto de planta, el valor de DO de los duplicados se promedió y se extrapolaron de la curva estándar utilizando el Softmax® Pro ver. 4.0 (Molecular Devices). Para comparación, cada muestra se normalizó con su concentración de TSP y se calculó el porcentaje de expresión a TSP. 11.4 - Análisis de transferencia Western Los extractos de planta o estándares de AAD-1 (5 y 0.5 µg/ml) se incubaron con regulador de pH de muestra Laemmli a 95°C durante 10 minutos y se separaron electroforéticamente en gel de Tris-Glicina 8-16% Precast. Las proteínas luego se electro-transfirieron sobre membrana de nitrocelulosa utilizando un protocolo estándar. Después del bloqueo en 4% de leche descremada en PBS, se detectó la proteína de AAD-1 medíante antisuero anti-AAD1 seguido de conjugados de cabra anti-conejo/HRP. La proteína detectada se visualizó por Reactivo de Análisis ECL Western de sustrato de quimioluminiscencia (Amersham cat. #RPN 21058).

EJEMPL0 12 Transformación del tabaco La transformación del tabaco con Agrobacterium tumefaciens se llevó a cabo mediante un método similar, pero no idéntico, a los métodos publicados (Horsch eí al., 1988). Para aportar tejido de origen para la transformación, la semilla de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Kentucky 160) se esterilizó en la superficie y se plantó sobre la superficie del medio de TOB, el cual es un medio Murashige y Skoog libre de hormonas (Murashige y Skoog, 1962) solidificado con agar. Las plantas se desarrollaron durante 6 a 8 semanas en un cuarto incubador iluminado a 28-30°C y las hojas se recolectaron en forma estéril para su uso en el protocolo de transformación. Partes de aproximadamente un centímetro cuadrado se cortaron de estas hojas, excluyendo la nervadura. Los cultivos de las cepas del Agrobacterium (EHA101S conteniendo pDAB721 , AAD-1 (v3) + PAT), se desarrollaron durante la noche en un matraz sobre un agitador colocado a 250 rpm a 28°C, se peletizaron en una centrífuga y se suspendieron nuevamente en sales de Murashige & Skoog estériles, y se ajustaron hasta una densidad óptica final de 0.5 a 600 nm. Las partes de hojas se sumergieron en esta suspensión bacteriana durante aproximadamente 30 segundos, luego se secaron sobre toallas de papel estéril y se colocaron con el lado derecho hacia arriba sobre el medio de TOB+ (medio Murashige & Skoog conteniendo 1 mg/l de ácido indolacético y 2.5 mg/l de benciladenina) y se incubaron en la oscuridad a 28°C. Dos días más tarde los trozos de hoja se movieron al medio de TOB+ conteniendo 250 mg/l de cefotaxima (Agri-Bio, North Miami, Florida) y 5 mg/l de glufosinato de amonio (ingrediente activo en Basta, Bayer Crop Sciences) y se incubaron a 28-30°C en la luz. Los trozos de hoja se movieron a un medio de TOB+ fresco con cefotaxima y Basta dos veces por semana durante las primeras dos semanas y una vez por semana en adelante. Cuatro a seis semanas después, los trozos de hoja se trataron con la bacteria, las pequeñas plantas que surgieron de los focos transformados se retiraron de esta preparación de tejido y se plantaron en un medio de TOB conteniendo 250 mg/l de cefotaxima y 10 mg/l de Basta en vasos de Phytatray™ II (Sigma). Estas plántulas se desarrollaron en un cuarto incubador iluminado. Después de 3 semanas, se tomaron cortes de tallos y se re-plantaron en el mismo medio. Las plantas estuvieron listas para ser enviadas al invernadero después de 2 a 3 semanas adicionales. Las plantas se trasladaron al invernadero lavando el agar de las raíces, transplantando en suelo en macetas cuadradas de 13.75 cm, colocando el maceta en una bolsa Ziploc® (SC Johnson & Son, Inc.), colocando agua potable en el fondo de la bolsa, y colocando a luz indirecta en un invernadero a 30°C durante una semana. Después de 3 a 7 días, la bolsa se abrió; las plantas se esterilizaron y se dejaron desarrollar en la bolsa abierta hasta que las plantas se aclimataron al invernadero, en cuyo momento la bolsa se retiró. Las plantas se desarrollaron en condiciones de invernadero cálidas ordinarias (30°C, 16 horas al día, 8 horas de noche, mínimo natural + luz suplementaria = 500 µE/m2s1). Previo a la propagación, las plantas T0 plantas se muestrearon para análisis de ADN para determinar el número de copias del inserto. El gen PAT que se unió molecularmente al AAD-1 (v3) se ensayó para conveniencia. El tejido fresco se colocó en tubos y se liofilizó a 4°C durante 2 días. Después que el tejido estuvo totalmente seco, se colocó una perla de tungsteno (valenita) en el tubo y las muestras se sometieron a 1 minuto de molienda seca utilizando un molino de vidrio Kelco. Luego se siguió el procedimiento de aislamiento de ADN Dneasy estándar (Qiagen, DNeasy 69109). Una alícuota del ADN extraído luego se tiñó con Pico Green (Molecular Probes P7589) y se leyó en el flouorómetro (BioTek) con estándares conocidos para obtener la concentración en ng/µl. Las muestras de ADN se diluyeron a 9 ng/µl, luego se desnaturalizaron por incubación en un termociclador a 95°C durante 10 minutos. Luego se preparó la mezcla de sonda de señal utilizando la mezcla de oligonucleótidos suministrada y MgCI2 (Third Wave Technologies). Una alícuota de 7.5 µl se colocó en cada pozo de la placa de ensayo Invader seguido de una alícuota de 7.5 µl de controles, estándares, y 20 ng/µl de muestras desconocidas diluidas. Cada pozo se cubrió con 15 µl de aceite mineral (Sigma). Las placas luego se incubaron a 63°C durante 1.5 hora y se leyeron sobre el fluorómetro (Biotek). El cálculo de % de señal sobre el fondo para la sonda blanco dividido por el % de señal sobre el fondo de la sonda control interna dará la relación. La relación de estándares de copias conocidas, desarrollada y validada con análisis de transferencia Southern se utilizó para identificar la copia estimada de los eventos desconocidos (Cuadro 27).

CUADRO 27 nd = no realizado Leyenda: Tolerancia relativa* lesión a 3200 g ea/ha de 2,4-D (14DAT) Baja >50% de lesión Media 20-50% de lesión Alta <20% de lesión Variable inconsistente Las estimaciones de número de copias se confirmaron por Análisis Southern en varios eventos. El análisis de transferencia Southern se realizó con ADN total obtenido del equipo Qiagen DNeasy. Un total de 2 µgs de ADN se sometió a digestión nocturna de Nsil y también Hindlll para pDAB721 para obtener los datos de integración. Después de la digestión nocturna, se procesó una alícuota de -100 ngs sobre gel 1% para asegurar la digestión completa. Después de asegurarse esto, las muestras se procesaron utilizando el mismo protocolo que en el Ejemplo 6 sección 11. Además todos los eventos se ensayaron para determinar la presencia del gen AAD-1 (v3) por PCR utilizando las mimas muestras de ADN extraídas. Un total de 100 ng de ADN total se utilizó como molde. Se utilizó 20 mM de cada iniciador con el equipo Takara Ex Taq PCR Polimerase (Mirus TAKRR001A). Los iniciadores para la PCR de la región codificadora del PCR AAD-1 fueron (RdpAcodF ATGGCTCA TGCTGCCCTCAGCC) (SEQ ID NO: 27) y (RdpAcodR CGGGCAGGCCTAACTCCACC AA) (SEQ ID NO: 28). La reacción de PCR se llevó a cabo en el termociclador 9700 Geneamp (Applied Biosystems), sometiendo las muestras a 94°C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 64°C durante 30 segundos, y 72°C durante 1 minuto y 45 segundos seguido de 72°C durante 10 minutos. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis sobre gel de agarosa 1 % teñido con EtBr. Cuatro a 12 linajes clónales de cada uno de los 30 eventos positivos de PCR se regeneraron y se trasladaron al invernadero. Una planta representativa de cada uno de los 19 eventos se ensayó para la expresión de AAD-1 (v3) por los métodos de ELISA previamente descriptos. Todos los eventos ensayados mostraron niveles detectables de AAD-1 (v3) (Cuadro 27). La expresión de la proteína varió entre eventos. Las plantas T0 de cada uno de los 30 eventos se provocaron con un amplio intervalo de 2,4-D rociado sobre plantas que tenían una altura de 3 a 4 pulgadas. Las aplicaciones de rocío se realizaron según se describió previamente utilizando un atomizador de vía a un volumen de rocío de 187 l/ha. Se aplicó sal de dimetilamina del 2,4-D (Riverside Corp) a 0, 50, 200, 800, o 3200 g ea/ha a clones representativos de cada evento mezclado en agua desionizada. Cada tratamiento se replicó de una a tres veces. Las proporciones de lesión se registraron 3 y 14 DAT. Cada evento ensayado fue más tolerante al 2,4-D que la línea control no transformada KY160. En varios eventos, alguna epinastía relacionada con el herbicida auxínico inicial se produjo a dosis de 800 g ea/ha o menos. Algunos eventos no estaban dañados con esta proporción (equivalente a 1.5X de proporción de campo). Todos los eventos sufrieron alguna lesión auxínica temporaria de nivel 3 DAT cuando se trataron con 3200 g ea/ha. También se produjo algo de quemado de hojas en esta proporción debido a la acidez de la solución de rocío. Se reguló el pH de ensayos futuros con proporciones elevadas de 2,4-D. La respuesta de las plantas T0 tratadas con 3200 g ea/ha de 2,4-D (~6X proporción de campo) se utilizó para discernir tolerancia relativa de cada evento: "baja" (>50% de lesión 14 DAT), "media" (20-50% de lesión), "alta" (<20% de lesión). Algunos eventos no fueron uniformes en respuesta entre los replicados y se consideraron "variables" (Cuadro 27).

Verificación de tolerancia alta al 2,4-D. Dos a cuatro individuos T0 que sobrevivieron a altas proporciones de 2,4-D se salvaron de cada evento y se dejaron auto-fertilizar en el invernadero para dar lugar a semillas T-i. Dos líneas de tabaco de AAD-1 (v3) (evento 721 (2)-013.010 y 721(3)-008.005) se eligieron de la generación T0. La semilla de Ti se estratificó, y se sembró en bandejas de selección similares a la de Arabidopsis (Ejemplo 6.4), seguido de eliminación selectiva de nulos transformados en esta población segregante con 280 g ia/ha de glufosinato (selección de PAT). Las sobrevivientes se transfirieron a macetas individuales de 7.5 centímetros en el invernadero. Estas líneas aportaron niveles medios y altos de resistencia al 2,4-D en la generación To. La consistencia mejorada de respuesta se prevé en plantas Ti que no surgieron directamente del cultivo tisular. Estas plantas se compararon contra el tabaco KY 160 de tipo silvestre. Todas las plantas se rociaron con el uso de un atomizador de vía colocado a 187 l/ha. Las plantas se rociaron desde un intervalo de 70-4480 g ea/ha de sal de dimetilamina del 2,4-D (DMA), R-Diclorprop, y una mezcla 50/50 de los dos herbicidas. Todas las aplicaciones se formularon en regulador de pH Hepes 200mM (pH 7.5). Cada tratamiento se replicó cuatro veces. Las plantas se evaluaron a los 3 y 14 días después del tratamiento. A las plantas se les asignó una relación de lesión con respecto a atrofia, clorosis y necrosis. La generación T-i es segregante, de modo que se esperó alguna respuesta variable debido a la diferencia en cigosidad. (Cuadro 28). No se observó lesión alguna en proporciones por debajo de las proporciones 1X de campo (560 g ea/ha) para ei 2,4-D o el R-diclorprop en cualquier evento. Se observó una baja lesión aún hasta 8 veces las proporciones de campo (4480 g ea/ha) y se exhibió como achaparrado, sin lesión herbicida auxínica. Estos resultados indicaron que el AAD-1 (v3), puede aportar tolerancia de nivel comercial, aún en un cultivo dicotiledóneo muy sensible a la auxina como el tabaco. Estos resultados además muestran que se puede impartir a los herbicidas tipo fenoxi auxina, resistencia tanto quiral (ácido 2,4-diciorofenoxipropiónico) como aquiral (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) solos o en combinación de mezcla de tanque.

CUADRO 28 Respuesta de plantas de tabaco Ti con AAD-1 segregantes a los herbicidas tipo fenoxi auxinas. 721(2)013.010 KY160 - (tolerancia 721(3)008.005 (alta de tipo media en tolerancia en silvestre generación T0) generación T0) Herbicida % Promedio de lesión de replicados 14 DAT 560 g ea/ha de 2,4-D DMA 75 5 0 1120 g ea/ha de 2,4-D DMA 80 5 2 2240 g ea/ha 2,4-D de DMA 90 5 0 4480 g ea/ha 2,4-D de DMA 95 5 5 560 g ea/ha de R-diclorprop 70 5 0 1120 g ea/ha de R-diclorprop 75 5 0 2240 g ea/ha de R-diclorprop 88 5 0 4480 g ea/ha de R-diclorprop 95 10 5 560 g ea/ha 2,4-D de 80 5 5 DMA/R-diclorprop 1120 g ea/ha de 2,4-D 80 10 10 DMA/R-diclorprop 2240 g ea/ha de 2,4-D 95 15 15 DMA/R-diclorprop 4480 g ea/ha de 2,4-D 95 15 15 DMA/R-diclorprop También se llevó a cabo un ensayo de progenie de 100 plantas sobre cada una de las dos líneas de AAD-1 (v3) (eventos 721 (2)-013.010 y 721(3)-008.005). Las semillas se estratificaron, se sembraron y se transplantaron con respecto al procedimiento anterior salvo que las plantas nulas no se eliminaron por selección de Liberty. Todas las plantas luego se rociaron con 560 g ea/ha de 2,4-D DMA según se describió previamente. Después de 14 DAT, se contaron las plantas resistentes y sensibles. Ambos eventos '013' y '008' se segregaron como una característica Mendeliana dominante de locus único (3R:1S) según se determinó por el análisis de Chi cuadrada. El AAD-1 es heredable como un gen de resistencia a la fenoxi auxina fuerte en múltiples especies. La tolerancia a nivel de campo se demostrará por la plantación de semillas de Ti o T2 en el invernadero, eliminando selectivamente las plantas nulas por selección de Liberty según se describió previamente, y levantando las plántulas individuales en mesetas de transplante de 72 pozos (Hummert International) en medio Metro 360 de acuerdo con las condiciones de crecimiento indicadas anteriormente. Las plantas individuales se transplantarán en los macetas de campo utilizando un plantador vegetal individual. Se utilizará irrigación por inmersión o superficial para mantener el crecimiento de las plantas con vigor. Una vez que las plantas alcancen una altura de 15 a 30 centímetros, las plantas de tabaco se rociarán con un intervalo amplio de fenoxi auxinas y se dosificarán según se mostró anteriormente. Las situaciones de estrés ambientales son más significativas en condiciones de campo; sin embargo, en base a la experiencia previa con maíz transformado con AAD-1 (v3), se espera un fuerte traslado de la resistencia del invernadero al campo.

EJEMPLO 13 Transformación de la Soja La mejora de la soja a través de técnicas de transferencia génica se ha logrado para rasgos tales como la tolerancia a los herbicidas (Padgette eí al., 1995), modificación de aminoácidos (Falco eí al., 1995), y resistencia a los insectos (Parrott eí al., 1994). La introducción de rasgos extraños en especies de cultivos requiere métodos que permitan la producción de rutina de líneas transgénicas usando secuencias marcadoras susceptibles de selección, que contienen inserciones simples. Los transgenes deben heredarse como locus funcional simple para simplificar el mejoramiento. Se ha informado sobre la colocación de genes extraños en la soja cultivada a través de bombardeo de microproyectiles de brotes embrionarios cigóticos (McCabe eí al., 1988) o cultivos embriogénicos somáticos (Finer y McMullen, 1991 ), y transformación de explantes con cotiledones mediada por Agrobacterium (Hinchee eí al., 1988) o embriones cigóticos (Chee et al., 1989). Los transformantes derivados de transformaciones mediadas por Agrobacterium tienden a poseer inserciones simples con un número bajo de copias (Birch, 1991 ). Existen beneficios y desventajas asociados con cada uno de los tres tejidos blanco investigados para la transferencia de genes en ejes embrionarios cigóticos de la soja (Chee eí al., 1989; McCabe eí al., 1988), cotiledones (Hinchee eí al., 1988) y cultivos embriogénicos somáticos (Finer y McMullen, 1991 ). Los últimos se han investigado de manera extensiva como tejido blanco para transferencia génica directa. Los cultivos embriogénicos tienden a ser bastante prolíficos y pueden mantenerse durante un período prolongado. Sin embargo, se han asociado esterilidad y aberraciones cromosómicas de los transformantes primarios con la edad de las suspensiones embriogénicas (Singh eí al., 1998) y de este modo la iniciación continua de nuevos cultivos resulta ser necesaria para los sistemas de transformación de la soja que utilizan este tejido. Este sistema necesita un alto nivel de 2,4-D, concentración de 40 mg/l, para iniciar el callo embriogénico y esto plantea un problema fundamental en el uso del gen AAD-1 (v3) ya que el locus transformado podría no desarrollarse en forma adicional con 2,4-D en el medio. Por lo tanto, la transformación basada en meristemas es ideal para el desarrollo de plantas resistentes al 2,4-D usando AAD-1 (v3). 13.1 - Método de transformación 1 : transformación del nodo cotiledónico de la soja mediado por Agrobacterium tumefaciens. Los primeros informes de transformación de soja apuntaban a células meristemáticas en la región del nodo cotiledónico (Hinchee eí al., 1988) y multiplicación de brotes a partir de los meristemas apicales (McCabe eí al., 1988). En el método del nodo cotiledónico basado en A. tumefaciens, la preparación de explantes y la composición del medio de cultivo estimulan la proliferación de meristemas auxiliares en el nodo (Hinchee et al., 1988). Aún no resulta claro si se inicia un cultivo de callo realmente desdiferenciado, aunque totipotencial, con el uso de estos tratamientos. La recuperación de múltiples clones de un evento de transformación de un explante única y la recuperación poco frecuente de plantas quiméricas (Clemente eí al., 2000; Olhoft eí al., 2003) indica un único origen celular seguido de multiplicación de la célula transgénica para producir un cultivo de meristemas transgénicos en proliferación o un brote transformado de manera uniforme que se somete a multiplicación adicional del brote. El método de multipllicación del brote de la soja, basado originalmente en el bombardeo de microproyectiles (McCabe eí al., 1988) y, más recientemente, adaptado para transformación mediada por Agrobacterium (Martinell eí ai, 2002), aparentemente no sufre el mismo nivei o tipo de desdiferenciación que el método del nodo cotiledónico dado que el sistema se basa en la identificación exitosa de las quimeras de las líneas germinales. La variedad de genotipos que se han transformado a través del método del nodo cotiledónico basado en Agrobacterium se encuentra en crecimiento sostenido (Olhoft y Somers, 2001). Este método de multiplicación de brote y meristema de novo está menos limitado a genotipos específicos. Además, este es un protocolo no basado en 2,4-D que sería ideal para el sistema de selección de 2,4-D. De este modo, el método del nodo cotiledónico puede ser el método de elección para desarrollar cultivares de soja resistentes al 2,4-D. Aunque este método se describió a principios de 1988 (Hinchee eí ai, 1988), sólo se ha optimizado muy recientemente para transformación de rutina de alta frecuencia de varios genotipos de soja (Zhang eí ai, 1999; Zeng et ai, 2004). 13.1.1 - Preparación del Agrobacterium. El plásmido, pDAB721 , contiene el gen AAD-1 (v3) bajo el control del promotor Arabidopsis Ubi10.

Este plásmido también transporta el gen PAT bajo el control del promotor de la actina del arroz que codifica una enzima que degrada el glufosinato, que puede usarse como agente de selección para los transformantes. Este vector puede usarse en el experimento de transformación descrito a continuación. La construcción pDAB721 se movilizó en la cepa de Agrobacterium EHA101S por electroporación. Los cultivos de Agrobacterium que albergan a pDAB721 usados en las transformaciones pueden cultivarse en medio YEP (10 g/l de peptona, 5 g/l de extracto de levadura y 5 g/l de NaCI, pH 7.0). Los cultivos de Agrobacterium se peletizan a baja velocidad y se resuspenden en medio líquido de SCM (ver más adelante) a una DO660 de 0.6 para usar en las inoculaciones. 13.1.2 - Transformación de la planta. Semillas de genotipos públicos "Thorne," "Williams82," o "NE3001 ," de soja, pueden desinfectarse a través de un lavado de 20 minutos en cloro comercial al 20% (v/v) (NaCIO) modificada con 2 gotas de Liqui-Nox®. Las semillas deben enjuagarse cinco veces con agua estéril en medio de SHGA sin hormonas y dejarse germinar durante 5 días a 24°C, con un régimen de luz/oscuridad de 18/6 horas. El medio B5 consiste en macro y micro nutrientes y vitaminas descritos por Gamborg et ai (1968) (Sigma, cat. #G 5893, St. Louis). Todos los medios se solidifican con agar lavado al 0.8% (p/v) (Sigma cat. #A 8678). En forma alternativa, ciertos genotipos de la soja pueden someterse a un procedimiento de esterilización de superficie seca usando cloro gaseoso (Cl2) mediante el cual se colocan las semillas maduras en cajas de Petri de 100 x 25 mm en una sola capa usando aproximadamente 130 semillas por placa. Se colocan aproximadamente 3-4 placas en un desecador dentro de una campana de humo de modo tal que todas las placas estén medio abiertas y que haya suficiente espacio para un vaso de precipitados de 250 ml en el medio del desecador. El vaso de precipitados se llena con 95 ml de blanqueador comercial, al cual se agrega 5 ml de HCl concentrado (12N) gota a gota a lo largo del lateral del vaso de precipitados. Inmediatamente se cierra el desecador y se deja reposar durante por lo menos 16 horas en una campana de humo. Luego de la esterilización, se cierran las placas, luego se llevan a una campana de flujo laminar y se deja abierta durante aproximadamente 30 minutos para eliminar cualquier exceso de gas Cl2. Luego se germinan las semillas como se describió con anterioridad. Las superficies esterilizadas en superficie seca permanecerán estériles a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 semanas. Se preparan explantes para inoculación como se describió con anterioridad (Hinchee eí ai, 1988). Los explantes deben inocularse durante 30 minutos. El medio de co-cultivo y re-suspensión de Agrobacterium consiste en medio B5 suplementado con 1 mg/l de BAP, 1 mg/l de GA3, sacarosa al 3% (p/v), MES (ácido 2-[N-morfolin]etan sulfónico) 20 mM, 400 mg/l de L-cisteína (Olhoft y Somers, 2001 ) pH 5.7, ditiotreitol 0.99 mM (DTT), y acetosiringona 200 µM (AS). Los explantes se co-cultivan durante 5 días a 25°C. Luego del co-cultivo, los explantes se lavan en el medio de co-cultivo que contiene 100 mg/l de timentina y 200 mg/l de cefotaxima, sin MES ni AS.

Los explantes deben colocarse en medio de inducción de brote y transferirse cada 14 días durante un total de 28 días antes de la selección del herbicida. El medio de inducción del brote consiste en medio B5 de potencia completa suplementado con 1.7 mg/l de BAP, 100 mg/l de timentina, 200 mg/l de cefotaxima pH 5.7 y sacarosa al 3% (p/v). Los cotiledones deben colocarse con adaxial hacia arriba con el brote de la región nodal cotiledónica hacia el medio, modificado con niveles crecientes de Basta (2, 5, 6 luego 7 mg/l de glufosinato de amonio) o niveles sub-letales de 2,4-D que varían desde 10 mg hasta 400 mg/l cada 2 semanas durante un total de 8 semanas. Los explantes que se diferencian se transfieren posteriormente a medio de elongación de brote durante un adicional de 4 a 10 semanas bajo la misma selección de glufosinato o bajo presión reducida de selección de 2,4-D que varían desde 10 mg hasta 100 mg/l. El medio de elongación consistía en medio B5 (Sigma cat. #M0404) modificado con 1 mg/l de zeatin ribósido, 0.1 mg/l de IAA (ácido indol-3-acético), 0.5 mg/l de GA3, 50 mg/l de glutamina, 50 mg/l de asparagina, y sacarosa al 3% (p/v), pH 5.8. Los brotes elongados deben plantarse, sin selección adicional, en medio MS/B5 de media potencia con vitaminas de potencia completa más 0.5 mg/l de NAA (ácido a-naftalenacético) o 0.1 mg/l de IAA y 2% (p/v) de sacarosa. Los antibióticos, timentina y cefotaxima, se mantienen dentro del medio durante toda la selección. Se transfieren los cultivos a medio recién preparado cada 2 semanas. Se aclimatan las plántulas durante 1 a 2 semanas antes de transferir al invernadero. 13.1.3 - Evaluación de la progenie. Se dejará auto-fertilizar plantas T0 en el invernadero para dar lugar a semillas Ti. Las plantas Ti (y en la medida que se produzcan clones de plantas T0) se asperjarán con un intervalo de dosis de herbicida para determinar el nivel de protección de herbicida producido por los genes AAD-1 (v3) y PAT en la soja transgénica. Los índices de 2,4-D usados en las plantas T0 normalmente usarán una o dos proporciones selectivas en el intervalo de 100-400 g ea/ha. Se tratará la semilla Ti con una dosis más amplia de herbicida que varía desde 50-3200 g ea/ha de 2,4-D. Del mismo modo, se seleccionarán las plantas T0 y Ti para determinar la resistencia al glufosinato mediante tratamiento de postemergencia con 200-800 y 50-3200 g ea/ha de glufosinato, respectivamente. El análisis de la expresión de proteínas ocurrirá como se describe en el Ejemplo 9 para Arabidopsis y maíz. La determinación de la herencia de AAD-1 (v3) se realizará usando segregación de la progenie de Ti y T2 con respecto a la tolerancia al herbicida. 13.2 - Método de transformación 2: Transformación mediada por Agrobacterium "Sin agitar" de células en suspensión de soja no regenerables. Se cultivaron las suspensiones de células de Soja DAS en un ciclo de 3d con 10 ml de volumen de suspensión asentado transferido a 115 ml de medio líquido recién preparado. El volumen celular asentado se determinó dejando reposar la suspensión celular durante 2 minutos en el matraz de 125 ml luego de girar vigorosamente y luego de sacar las células de la parte inferior del matraz con una pipeta de 10 ml de calibre amplio. Luego se transfierieron los matraces a agitadores orbitales a 140 rpm. Se transfirieron alícuotas de 4 ml de las células en suspensión a una DO600 de 0.72 junto con acetosiringona 200 µM (AS) sobre una caja de Petri estéril de 100x25. Se agregó suspensión de EHA105 Agrobacterium a una densidad DO650 de 1.2 en un volumen de 100 µl y se mezcló bien. La mezcla de Agrobacterium y la suspensión celular se agitó bien y se transfirió la placa a la cámara de cultivo en oscuridad donde se mantuvo la temperatura a 25°C. 13.2.1 - Selección de células en suspensión de soja v aislamiento de colonias transformadas. Luego de 4 días de co-cultivo se agitó nuevamente ia placa para mezclar bien la suspensión y se transfirió una alícuota de 1.5 ml al medio de selección y se esparció sobre el medio en gel sobre una caja de Petri de 100 x 15. El medio de selección consistía en medio B5 de potencia completa suplementado con 1.7 mg/l BAP, 100 mg/l de timentina, 200 mg/l de cefotaxima pH 5.7 y sacarosa al 3% (p/v) y el medio se modificó con glufosinato de amonio a nivel de 5 mg/l. Luego de un secado de 10 minutos en campana las placas se incubaron durante 4 semanas en la oscuridad a 28°C. Aparecieron colonias en la selección y se transfierieron un total de 11 colonias a medio fresco de 3 experimentos diferentes y se mantuvieron durante 3-4 meses. La totalidad de las 11 colonias resistentes produjeron callos que crecieron en el medio de selección que contenía 5 mg/l de glufosinato. Las células en suspensión no transformadas fueron sensibles cuando se colocaron en placas sobre medio con 0.5 mg/l de glufosinato de amonio. Sin embargo, las colonias transformadas fueron resistentes a una concentración 5x de glufosinato de amonio y se mantuvieron durante un máximo de 4 meses. Se tomaron muestras de los eventos de los callos para realizar análisis cuando alcanzaron los 2 a 3 cm de diámetro. Por lo menos dos de los aislados de colonias, cada uno de dos experimentos diferentes, se analizaron para determinar la expresión de las proteínas AAD1. Los análisis de ELISA y Western realizados sobre estos dos aislados mostraron expresión positiva de las proteíans AAD1. Tanto el análisis ELISA (Cuadro 29) como la transferencia Western (Figura 16) sobre dos callos de soja separados transformados con gen AAD-1 (v3) indicaron que las células de callo expresan proteína AAD-1 (v3). El análisis ELISA sandwich detectó 0.0318% y 0.0102% de proteína soluble total AAD-1 (v3) en dos muestras de tejidos de callos diferentes. Debido a la sensibilidad y reactividad cruzada del antisuero, se observaron múltiples bandas en la transferencia westem. Sin embargo, se observó banda específica de AAD-1 (v3) en ambas muestras de callos pero no en el tejido de tipo silvestre (negativo). Los análisis por PCR de la región de codificación mostraron productos de tamaño esperado de las regiones de codificación AAD1 y PAT en estas colonias indicando que se transformaron.

CUADRO 29 Datos de PCR y ELISA para eventos de soja transgénicos. AAD-1 PCR PAT PCR de de región región T SP AAD-1 % de ento codificadora codificadora (µg/ml) (ng/ml) Expresión 1-1 + + 1995.13 633.89 0.0318% 2-1 + + 2018.91 205.92 0.0102% Control 2074.63 -1.22 -0.0001 % Negativo 13.3 - Método de transformación 3: transformación mediada por haz de aerosol de tejido embriogénico de callo de soja El cultivo de tejido de callo de soja embriogénico y el haz posterior fueron como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 6,809,232 (Held eí ai). Se recolectaron por separado callos embriogénicos de varias variedades de Stine élite, incluyendo 96E750, 96E94, 97E986, 96E144 y 96E692, en el centro de las placas de B1-30 3Co5My o B1-30 3Co5My0.25PA0.5K tres días después de transferir a medio fresco. El tejido luego se roció con pDAB3295 usando ADN linealizado a una concentración de aproximadamente 0.2 µg/ml. Luego de rociar, el callo embriogénico se transfirió a B1-30 3Co5My o B1-30 3Co5My0.25PA0.5K fresco para un pasaje de un mes. El tejido se transfirió luego a medio selectivo que contenía 1 mg/l de bialafos. Con bialafos, la selección normalmente se mantuvo a 1 mg/l durante los primeros dos pasajes de un mes y luego aumentó a 2 mg/l para los siguientes tres a siete meses. Los eventos transgénicos se identificaron cuando el tejido del callo generado por experimentos de transformación comenzó a organizarse y desarrollarse en estructuras embriogénicas mientras que aún se encontraba en medio selectivo que contenía 2,4-D más bialafos. Una vez identificadas, las estructuras en maduración se regeneraron en plantas de acuerdo con el siguiente protocolo: Se transfirieron las estructuras embriogénicas B1-30 3Co5My o B1-30 3/co5My0.25PA0.5K a medio B3. Luego de 3 a 4 semanas de cultivo en medio B3, las estructuras individuales se transfierieron a medio fresco. Luego de otras 3 a 4 semanas, los embriones en maduración se transfierieron a medio B5G y se colocaron a la luz. Los embriones que se habían elongado y produjeron raíces se transfierieron a tubos que contenían medio 1/2 B5G donde continuaron el desarrollo hasta formar plántulas; y estas plántulas se retiraron de los tubos y se colocaron en macetas. Se evaluaron las variaciones del medio mencionado en el cuadro 30, por ejemplo B1-30 3Co5My, que se hizo agregando agua de coco al 3% y 5 gm/l de mioinositol a B1-30. Otras variaciones incluyeron: B1-30 3Co5My0.25 PA0.5K que contenía medio basal B1-30 más 3% de agua de coco, 5 gm/l de mioinositol, 0.25 gm/l de ácido fítico, y 0.5 gm/l de KH2PO adicional y 1/2 B5G que contenía todos los componentes del medio B5G a la mitad de la concentración.

CUADRO 30 EJEMPLO 14 Activación de AAD-1 (v3) en Algodón 14.1 - Protocolo de transformación del algodón. Se esteriliza la superficie de semillas de algodón (genotipo Co310) en etanol 95% durante 1 minuto, se enjuaga, se esteriliza con cloro comercial al 50% durante veinte minutos, y luego se enjuaga 3 veces con agua destilada estéril antes de germinar en medio G (cuadro 31 ) en recipientes Magenta GA-7 y se mantiene bajo intensidad de luz alta de 40-60 µE/m2, con el fotoperíodo fijado en 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad a 28°C. Se aislan segmentos de cotiledones (~5 mm) cuadrados de plántulas de 7-10 días en medio M líquido (cuadro 31 ) en cajas de Petri (Nunc, item #0875728). Los segmentos cortados se tratan con una solución de Agrobacterium (durante 30 minutos) luego se transfieren a medio M semisólido (cuadro 31 ) y se someten a co-cultivo durante 2-3 días. Luego del co-cultivo, se transfieren los segmentos a medio de MG (cuadro 31 ). La carbenicilina es el antibiótico usado para matar el Agrobacterium y el glufosinato de amonio es el agente seleccionado que permitiría el crecimiento sólo de aquellas células que contienen el gen transferido.

Preparación del Aqrobacterium. Inocular 35 ml de medio Y (cuadro 31 ) (que contiene estreptomicina (solución de almacenamiento de 100 mg/ml) y eritromicina (solución de almacenamiento de 100 mg/ml)), con un asa de bacteria para cultivo hasta la mañana siguiente en la oscuridad a 28°C, mientras se agita a 150 rpm. Al día siguiente, verter la solución de Agrobacterium en un tubo de oakridge estéril (Nalge-Nunc, 3139-0050), y centrifugar en Beckman J2-21 a 8,000 rpm durante 5 minutos. Verter para eliminar el sobrenadante y suspender nuevamente el concentrado en 25 ml de líquido M (cuadro 31 ) y pasar por vórtex. Colocar una alícuota en un tubo de cultivo de vidrio (Fisher, 14-961-27) para lectura de Klett (Klett-Summerson, modelo 800-3). Diluir la nueva suspensión usando medio M líquido a una lectura de medida de Klett de 108 unidades formadoras de colonia por ml con un volumen total de 40 ml. Luego de tres semanas, el callo de los segmentos de cotiledones se aisla y se transfiere a medio MG fresco. El callo se transfiere por 3 semanas adicionales en medio MG. Luego se transfiere el callo a medio CG (cuadro 31 ), y se transfiere nuevamente a medio fresco de selección después de tres semanas. Luego de otras tres semanas el tejido del callo se transfiere a medio D (cuadro 31 ) que carece de reguladores del crecimiento de las plantas para inducción del callo embriogénico. Luego de 4-8 semanas en este medio, se forma el callo embriogénico, y puede distinguirse del callo no embriogénico por su color blanco amarillento y células granulares. Los embriones comienzan a regenerarse apenas después y son de color verde distinto. Se aislan y se transfieren los embriones más grandes, bien desarrollados a medio DK (cuadro 31 ) para desarrollo embrionario. Luego de 3 semanas (o cuando se hayan desarrollado los embriones), los embriones germinados se transfieren a medio fresco para desarrollo de brote y raíz. Luego de 4-8 semanas, todas las plantas bien desarrolladas se transfieren al suelo y se cultivan hasta la madurez. Luego de un par de meses, la planta ha crecido hasta el punto que puede asperjarse para determinar si tiene resistencia al 2,4-D.

CUADRO 31 14.2 - Especificaciones del experimento. Para este experimento se trataron 500 segmentos de cotiledones con pDAB721. De los 500 segmentos tratados, 475 tenían callo aislado mientras se encontraban en selección (95% de frecuencia de transformación). El callo se seleccionó en glufosinato de amonio, debido a la inclusión del gen PAT en la construcción, dado que ya había un esquema de selección desarrollado. El análisis de la línea de callo en forma de PCR e Invader se inició para determinar los patrones de inserción y estar seguros de que el gen estaba presente en la etapa del callo, luego las líneas de callo que resultaron embriogénicas se enviaron para análisis Western. 14.3 - Resultados del análisis del callo El objetivo del análisis es eliminar cualquier línea que no tenga el PTU completo, no muestre expresión o que tenga un alto número de copias, de modo que esas líneas no se regeneran. De las 475 líneas de callos de pDAB721 transformadas, 306 se enviaron para análisis de PCR y valoración Invader (cuadro 32). Muy pocas linas fueron PCR negativas. Los resultados de Invader no están completos en este momento, ya que algunas muestras tenían bajas cantidades de ADN cuando se las extrajo, y estas se han re-sometido. Sin embargo, los datos actuales de Invader muestran que algunas de las líneas sometidas tenían un alto número de copias (número de copias >2) (cuadro 32). Debido al extenso número de líneas que pasaron el análisis, fue necesario reducir el número de líneas celulares embriogénicas mantenidas debido al volumen. Noventa líneas se habían enviado para análisis Western, y ocho de estas fueron negativas. El análisis western mostró una alta expresión de la mayoría de las líneas (cuadro 32). Ochenta y dos líneas de callos embriogénicas se mantienen para regeneración de las plantas en base a los resultados del estudio (y los resultados pendientes).

CUADRO 32 o 14.4 - Regeneración de la planta. Dos líneas de algodón AAD-1 (v3) han producido plantas de acuerdo con el protocolo anterior que se han enviado al invernadero. Para demostrar que el gen AAD-1 (v3) provee resistencia al 2,4-D en el algodón, tanto la planta del algodón AAD-1 (v3) y las plantas de algodón de tipo silvestre se asperjaron con un aspersor de rastreo configurado a 187 l/ha. Las plantas se asperjaron a 560 g ea/ha de 2,4-DMA formulado en regulador de pH de Hepes 200 mM (pH 7,5). Las plantas se evaluaron a los 3, 7, y 14 días después del tratamiento. Se asignó a las plantas clasificaciones de lesiones con respecto a atrofia, clorosis, y necrosis. Las plantas que recibieron una clasificación de lesión de 90% o más se consideraron muertas. Tres días después del tratamiento (DAT) la planta del tipo silvestre comenzó a mostrar epinasia y recibió una clasificación del 15%; en contraste, la planta AAD-1 (v3) mostró 0% de lesiones. Alrededor de 7 DAT la epinasia continuó en la planta de tipo silvestre y los nuevos brotes comenzaron a tornarse marrones. Recibió una clasificación de 50% en este momento. A los 14 DAT la planta AAD-1 (v3) aún no tenía lesiones, mientras qué la de tipo silvestre estaba severamente atrofiada, y las nuevas áreas de crecimiento fueron marrones y arrugadas. De este modo, la planta de tipo silvestre recibió una clasificación de 90% a los 14 DAT. Este estudio demuestra que el gen AAD-1 (v3) en el algodón provee tolerancia sustancial a 2,4-D hasta por lo menos 560 g ea/ha.

EJEMPLO 15 Transformación de Otros Cultivos con Aqrobacteríum En vista de la revelación de la invención, pueden transformarse cultivos adicionales de acuerdo con la presente invención usando técnicas que son conocidas en la técnica. Para la transformación mediada por Agrobacterium del centeno, ver, por ejemplo, Popelka y Altpeter (2003). Para la transformación mediada por Agrobacterium de ia soja, ver, por ejemplo, Hinchee eí ai, 1988. Para la transformación mediada por Agrobacterium del sorgo, ver, por ejemplo, Zhao eí ai, 2000. Para la transformación mediada por Agrobacterium de la cebada, ver, por ejemplo, Tingay eí ai, 1997. Para la transformación mediada por Agrobacterium del trigo, ver, por ejemplo, Cheng eí ai, 1997. Para la transformación mediada por Agrobacterium del arroz, ver, por ejemplo, Hiei et al., 1997. Los nombres en latín de estas y otras plantas se dan a continuación. Debe resultar claro que estas y otras técnicas de transformación (sin Agrobacterium) pueden usarse para transformar AAD-1 (v3) en estas y otras plantas, incluyendo sin carácter limitativo Maíz (Gramineae Zea mays), Trigo (Pooideae Triticum spp.), Arroz (Gramineae Oryza spp. y Zizania spp.), Cebada (Pooideae Hordeum spp.), Algodón (Abroma Dicotyiedoneae Abroma augusta, y Malvaceae Gossypium spp.), Soja (Soya Leguminosae Glycine max), Remolacha (Chenopodiaceae Beta vulgaris altissima), Caña de azúcar (Arenga pinnata), Tomate (Solanaceae Lycopersicon esculentum y otras spp., Physalis ixocarpa, Solanum incanum y otras spp., y Cyphomandra betacea), Papa, Batata, Centeno (Pooideae Sécale spp.), Pimientos (Solanaceae Capsicum annuum, sinense, y fruiescens), Lechuga (Compositae Lactuca sativa, perennis, y pulchella), Coles, Apio (Umbelliferae Apium graveolens), Berenjena (Solanaceae Solanum melongena), Sorgo (todas las especies de Sorghum), Alfalfa (Leguminosae Medicago sativum), Zanahoria (Umbelliferae Daucus carota sativa), Porotos (Leguminosae Phaseolus spp. y otros géneros), Salvado (Avena Sativa y Strigosa), Arvejas (Leguminosae Pisum, Vigna, y Tetragonolobus spp.), Girasol (Compositae Heliande Thus annuus), Calabaza (Dicotyiedoneae Cucúrbita spp.), Pepino (Dicotyiedoneae genera), Tabaco (Solanaceae Nicotiana spp.), Arabidopsis (Cruciferae Arabidopsis thaliana), Césped (Lolium, Agrostis, y otras familias), y Trébol (Leguminosae). Dichas plantas, con genes AAD-1 (v3), se incluyen en la presente invención.

EJEMPL0 16 Apilamiento de AAD-1 (v3) con Gen AHAS de Resistencia a los Herbicidas El apilamiento de AAD-1 (v3) con un gen AHAS con resistencia a los herbicidas se describe en el Ejemplo 7.9.

EJEMPLO 17 Evidencia Adicional de Resultados Sorprendentes: AAD-1 vs. AAD-2 17.1 - Clonación inicial de AAD-2 (v1). Se identificó otro gen de la base de datos NCBI (ver el sitio en Internet ncbi.nlm.nih.gov; # de acceso AP005940) como homólogo con solo 44% de identidad de aminoácidos con tfdA. Este gen se denomina aquí AAD-2 (v1) por consistencia. La identidad porcentual se determinó primero traduciendo las secuencias de ADN de AAD-2 y tfdA (SEQ ID NO: 12 y No. de Acceso al GENBANK M16730, respectivamente) a las proteínas (SEQ ID NO: 13 y No. de Acceso al GENBANK M16730, respectivamente), luego usando ClustalW en el paquete de software VectorNTI para realizar la alineación de las secuencias múltiples. La cepa de Bradyrhizobium japonicum que contenía el gen AAD-2(v1) se obtuvo de Northern Regional Research Laboratory (NRRL, cepa #B4450). La cepa liofilizada se revivió de acuerdo con el protocolo de NRRL y se almacenó a -80°C en glicerol 20% para uso interno como cepa Dow Bacterial DB 663. De esta solución de almacenamiento en el congelador, luego se llenó una placa de Tryptic Soy Agar con un asa de células para aislamiento, y se incubó a 28°C durante 3 días. Se usó una colonia única para inocular 100 ml de Tryptic Soy Broth en un matraz de 500 ml con tres desviaciones, que se incubó hasta la mañana siguiente a 28°C en un agitador de piso a 150 rpm. De esto, se aisló el ADN total con el protocolo gram negativo del equipo DNeasy de Qiagen (Qiagen cat. #69504). Se diseñaron los siguientes iniciadores para ampliar el gen blanco del ADN genómico, Delantero: 5' ACT AGT AAC AAA GAA GGA GAT ATA CCA TGA CGA T 3' [(brjap 5'(spel) SEQ ID NO: 14 (sitio de restricción agregado Spe l y Sitio de Unión al Ribosoma (RBS))] e Reverso: 5' TTC TCG AGC TAT CAC TCC GCC GCC TGC TGC TGC 3' [(br jap 3' (xhol) SEQ ID NO: 15 (se agregó un sitio Xho I)]. Se armaron reacciones de cincuenta microlitros de la siguiente manera: Regulador de pH Fail Safe 25 µl, ea. iniciador 1 µl (50 ng/µl), DNAg 1 µl (200 ng/µl), H2O 21 µl, Taq polimerasa 1 µl (2.5 unidades/µl). Tres Regulador de pHs Fail Safe — A, B, y C — se usaron en tres reacciones separadas. Luego se llevó a cabo (a PCR en las siguientes condiciones: 95°C 3.0 minutos de ciclo de desnaturalización por calor; 1.0 minuto a 95°C, 1.0 minuto a 50°C, 1.5 minutos a 72°C, durante 30 ciclos; seguido de un ciclo final de 5 minutos a 72°C, usando el FailSafe PCR System (Epicenter cat. #FS99100). El producto resultante de PCR de ~1 kb se clonó en pCR 2.1 (Invitrogen cat. #K4550-40) siguiendo el protocolo incluido, con E. coli TOP10F' químicamente compentente como cepa huésped, para verificación de la secuencia de nucleótidos. Diez de las colonias blancas resultantes se levantaron en 3 µl de Caldo Luria + 1000 µg/ml Ampicilina (LB Amp), y se cultivaron hasta la mañana siguiente a 37°C con agitación. Se purificaron los plásmidos de cada cultivo usando el equipo Nucleospin Plus Plasmid Miniprep (BD Biosciences cat. #K3063-2) y siguiendo el protocolo incluido. La digestión por restricción de los ADN aislados se completó para confirmar la presencia del producto de PCR en el vector pCR2.1. El ADN del plásmido se digirió con la enzima de restricción EcoRI (New England Biolabs cat. #R0101S). Se llevó a cabo la secuenciación con el Equipo CEQ Quick Start de Beckman (Beckman Coulter cat. #608120) usando iniciadores M13 Delantero [5' GTA AAA CGA CGG CCA GT 3'] (SEQ ID NO: 16) e Reverso [5' CAG GAA ACÁ GCT ATG AC 3'] (SEQ ID NO: 17), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esta secuencia génica y su correspondiente proteína recibió una nueva designación general AD-2 (v1) para consistencia interna. 17.2 - Completado del vector binario AAD-2 (v1) El gen AAD-2(v1) se amplificó por PCR a partir de pDAB3202. Durante la reacción por PCR se realizaron alteraciones dentro de los iniciadores para introducir los sitios de restricción Afllll y Sacl en el iniciador 5' y iniciador 3', respectivamente. Los iniciadores "Ncol of Brady" [5' TAT ACC ACÁ TGT CGA TCG CCA TCC GGC AGC TT 3'] (SEQ ID NO: 18) y "Sacl of Brady" [5' GAG CTC CTA TCA CTC CGC CGC CTG CTG CTG CAC 3'] (SEQ ID NO: 19) se usaron para amplificar un fragmento de ADN usando el Fail Safe PCR System (Epicentre). El producto de PCR se clonó en el vector de clonación pCR 2.1 TOPO TA (Invitrogen) y se verificó la secuencia con iniciadores M13 Delantero y M13 Reverso usando los reactivos de secuenciación de Beckman Coulter "Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit". Los datos de secuencia identificaron un clon con la secuencia correcta (pDAB716). El fragmento génico Afllll/Sacl AAD-2 (v1) se clonó luego en el vector Ncol/Sacl pDAB726. La construcción resultante (pDAB717); promotor AtUbilO: Nt OSM 5'UTR: AAD-2 (v1): Nt OSM3'UTR: ORF1 poIyA 3'UTR se verificó con las digestiones de restricción (con Ncol/Sacl). Esta construcción se clonó en el pDAB3038 binario como fragmento de ADN Notl -Notl. La construcción resultante (pDAB767); promotor AtUbilO: Nt OSMd'UTR: AAD-2 (v1): Nt OSM 3'UTR: ORF1 poIyA 3'UTR: promotor CsVMV: PAT: ORF25/26 3'UTR se digirió por restricción (con Notl, EcoRi, HinDIII, Ncol, Pvull, y Salí) para verificación de la orientación correcta. La construcción completada (pDAB767) luego se usó para transformación en Agrobacterium. 17.3 - Comparación de especificidades de sustrato de AAD-2 (v1) v AAD-1 (v1 ) La actividad de un extracto de E. coli que expresa AAD-2 (v1 ) (pDAB3202) preparado como en el Ejemplo 11 se evaluó en cuatro herbicidas, 2,4-D, (R,S)-diclorprop, (R,S)-haloxifop y (R)-haloxifop (todos a una concentración final de 0.5 mM) usando 3 µl (42 µg) de extracto de E. coli por ensayo con un período de ensayo de 15 minutos. La Figura 20 muestra que la actividad relativa de AAD-2 (v1 ) en los sustratos fue de 2,4-D = diclorprop > (R,S)-haloxifop » (R)-haloxifop. De este modo, AAD-2 (v1 ) difiere de AAD-1 (v1 ) en el sentido que tiene un nivel de actividad similar sobre 2,4-D que sobre diclorprop (mientras que la actividad de AAD-1 (v1 ) sobre 2,4-D es -10% la de diclorprop). AAD-2 (v1 ) también difiere de AAD-1 (v1 ) en el sentido que es incapaz de actuar sobre (R)-haloxifop. El cuadro 33 muestra datos de sustratos adicionales evaluados con AAD-1 (v1 ) y AAD-2 (v1 ) que confirman que AAD-2 (v1 ) es específico para sustratos (S)-enantioméricos, en contraste con AAD-1 (v1 ) que es específico para enantiómeros (R). En otra prueba, se encontró que AAD-2 (v1 ) difiere de AAD-1 (v1 ) en el sentido que libera poco o ningún fenol detectable del 2,4-D sulfonato (en el cual un grupo sulfonato reemplaza al carboxilato de 2,4-D) mientras que AAD-1 (v1 ) produce niveles significativos de fenol a partir de este compuesto (-25% de 2,4-D.) CUADRO 33 Las cinéticas enzimáticas de AAD-1 (v1 ) y AAD-2 (v1 ) parcialmente purificadas se compararon usando 2,4-D como sustrato. Los valores de Km para 2,4-D fueron de 97 y 423 µM para AAD-1 (v1 ) y AAD-2 (v1 ) respectivamente y los valores de Vmax aparentes fueron 0.11 y 0.86 unidades de A510, respectivamente (cuadro 34). Dado que se usaron cantidades equivalentes de enzima en los ensayos (según la determinación realizada por análisis SDS-PAGE), puede concluirse que la kcat de AAD-2 (v1 ) para 2,4-D es casi 8 veces mayor que AAD-1 (v1 ) y la relación kcat/Km es 2 veces mayor. De este modo AAD-2 (v1 ) es significativamente más eficiente en la ruptura del 2,4-D in vitro que AAD-1 (v1 ). Esto contrasta en forma sorprendente con los hallazgos in planta informados a continuación, donde las plantas que expresan AAD-1 (v1 ) son significativamente mejores al conferir resistencia contra 2,4-D con relación a AAD-2 (v1).

CUADRO 34 Comparación de los valores de Km y "Vmax" para las ariloxialcanoato dioxigenasas (AADs) de pDAB3202 (AAD-2) y pDAB3203 [AAD-1 (v1 )] con diferentes sustratos herbicidas: Km Vmax Km/Vmax (µM) (unidades (unidades Enzima Compuesto ±SE A510) arbitrarias) AAD-2 2,4-D 423 (±1 ) 0.86 2.03 AAD-1 2,4-D 97 (±21 ) 0.11 1.16 (v1 ) Notas: Los ensayos se realizaron en MOPS pH 6.75 + a- cetoglutarato 1 mM + ascorbato de Na 0.1 mM + Fe2+ 0.1 mM y los fenoles colorimétricamente liberados detectados usando 4- aminoantipirina/ferricianuro. 17.4 - Evaluación de Arabidopsis transformada. Se dejaron secar semillas T* recién cosechadas transformadas con un gen nativo [AAD-1 (v2)], optimizado en la planta [AAD-1 (v3)], o AAD-2 (v1) nativo, durante 7 días a temperatura ambiente. Las semillas T-i se sembraron en bandejas de germinación de 26.5 x 51 cm (T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN), recibiendo cada una alícuotas de 200 mg de semillas Ti estratificadas (-10,000 semillas) que se habían suspendido anteriormente en 40 ml de solución de agarosa al 0.1% y se almacenaron a 4°C durante 2 días para completar los requerimientos de latencia y asegurar la germinación sincrónica de las semillas. Se cubrió Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture Inc., Bellevue, WA) con vermiculita fina y se sub-irrigó con solución de Hoagiand hasta humedecerse y se dejó drenar por gravedad. Cada alícuota de 40 ml de semilla estratificada se sembró en forma pareja sobre la vermiculita con una pipeta y se cubrió con domos de humedad (KORD Products, Bramalea, Ontario, Canadá) durante 4-5 días. Se retiraron las cúpulas 1 día antes de la selección inicial del transformante us ndo aerosol de post-emergencia de glufosinato (selección del gen PATco-transformado). Cinco a seis días después de la plantación (DAP, siglas en inglés) y nuevamente 10 DAP, las plantas T* (etapa de cotiledones y 2-4 hojas, respectivamente) se asperjaron con una solución al 0.2% de herbicida Liberty (200 g ai/l de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) a un volumen de aspersión de 10 ml/bandeja (703 l/ha) usando una punta de aspersión de aire comprimido DeVilbiss para aplicar una tasa efectiva de 280 g ia/ha de glufosinato por aplicación. Las sobrevivientes (plantas que crecían en forma activa) se identificaron 5-7 días después de la aspersión final y se transplantaron individualmente en macetas de 7.5 centímetros preparados con medio para macetas (Metro Mix 360). Las plantas transplantadas se cubrieron con domos de humedad durante 3-4 días y se colocaron en una cámara para cultivo a 22°C como antes. Posteriormente se retiraron las cúpulas y las plantas se movieron al invernadero (22±5°C, 50±30% HR, 14 horas de luz: 10 de oscuridad, mínimo 500 µE/m2s1 natural + luz suplementaria) por lo menos 1 día antes de la prueba de la capacidad de AAD-1 (v3), AAD-1 (v2), o AAD-2 (v1) de proveer resistencia al herbicida tipo fenoxi auxina. Se confirmaron las plantas individuales T-i seleccionadas al azar por su resistencia al glufosinato para la expresión de la proteína PAT usando un equipo PAT ELISA (Parte no. 7000045, Strategic Diagnostics, Inc., Newark, DE), para confirmar de un modo no destructivo la fidelidad del proceso de selección (protocolo del fabricante). Luego se asignaron las plantas en forma aleatoria a varias proporciones de 2,4-D (50-800 g ea/ha). Las aplicaciones de herbicida se aplicaron por aspersor de bandeja en un volumen de aspersión de 187 l/ha. El 2,4-D fue la formulación de sal de dimetilamina comercial (456 g ae/l, NuFarm, St Joseph, MO) mezclada en regulador de pH de Tris 200 mM (pH 9.0). 17.5 - Resultados de la selección de plantas transformadas. Las primeras transformaciones con Arabidopsis se condujeron usando AAD-1 (v3). Los transformantes T-i se eligieron primero del fondo de semillas no transformadas usando un esquema de selección de glufosinato. Se seleccionaron más de 400,000 semillas Ti y se identificaron 493 plantas resistentes al glufosinato (gen PAT), que equivalen a una frecuencia de transformación/selección de 0.12%. Dependiendo del lote de semillas evaluadas, esta varió de 0.05-0.23% (ver cuadro 15 en el Ejemplo 6.5 anterior). Además se seleccionó un pequeño lote de semillas transformadas con AAD-1 (v2) nativo usando el agente de selección glufosinato. Se identificaron doscientos setenta y ocho individuos T-i resistentes al glufosinato de 84,000 semillas evaluadas (frecuencia de transformación/selección 0.33%). De manera sorprendente, las transformaciones de Arabidopsis usando el gen AAD-2(v1) nativo suministraron una muy baja frecuencia de transformación cuando se evaluaron para determinar la tolerancia al glufosinato (función del marcador seleccionable PAT). Aproximadamente se han evaluado 1.3 millones de semillas y sólo 228 transformantes de glufosinato se recuperaron, lo que equivale a una frecuencia de transformación/selección del 0.018% (ver cuadro 15). La frecuencia de transformación para AAD-2 (v1) nativo fue sólo del 6% de la del AAD-1 (v2) nativo. El gen AAD2 (v1) nativo se optimizó posteriormente en forma sintética, se clonó y se transformó como pDAB3705, en Arabidopsis usando métodos descritos anteriormente (ver Ejemplo 5). El AAD2 (v2) optimizado en la planta (SEQ ID NO: 29, que codifica la SEQ ID NO: 30) produjo una frecuencia de selección de Arabidopsis de Ti normal usando herbicida Liberty de aproximadamente 0.11 % (ver cuadro 15). Las plantas Ti seleccionadas anteriormente se trasplantaron posteriormente a macetas individuales y se asperjaron con varias dosis de herbicidas de ariloxialcanoato comerciales. El cuadro 16 (en el Ejemplo 6.5 anterior) compara la respuesta de los genes AAD-1 (v2), AAD-1 (v3), AAD-2 - (v1) y AAD-1(v2) al impartir resistencia al 2,4-D a los transformantes Ti de Arabidopsis. Todos los genes proporcionaron realmente cierta resistencia significativa al 2,4-D versus las líneas de control transformadas y no transformadas; sin embargo, las construcciones individuales fueron altamente variables en su capacidad de impartir resistencia al 2,4-D a plantas T-f de Arabidopsis individuales. Dentro de un tratamiento determinado, el nivel de respuesta de la planta varió ampliamente y puede atribuirse al hecho de que cada planta representa un evento de transformación independiente. Es importante observar que, en cada dosis de 2,4-D evaluado, hubo individuos que no se vieron afectados mientras que algunos se afectaron en forma severa. Se presenta un promedio de lesiones en la población global por índice en el cuadro 16 simplemente para demostrar la diferencia significativa entre las plantas transformadas con AAD-1 (v2), AAD-1 (v3), AAD-2 (vi) o AAD-2 (v2) versus los controles transformados con PAT/Cry1F o de tipo silvestre. De manera sorprendente, los transformantes de AAD-2 (v1) fueron mucho menos resistentes al 2,4-D que los genes AAD-1 (v2) o AAD-1 (v3) (cuadro 16) tanto a partir de la frecuencia de plantas altamente tolerantes como también del promedio global de lesiones. Ninguna planta transformada con AAD-2 (v1) sobrevivió a 200 g de ea/ha de 2,4-D relativamente sin lesiones (<20% de lesiones visuales), y el daño general de la población fue de aproximadamente el 83%. Por el contrario, 56% (45 de 80) de plantas Ti transformadas con AAD-1 (v2) sobrevivieron a 200 g de ea/ha de 2,4-D sin lesiones (promedio de lesiones de la población = 34%), y >73% (11 de 15) de plantas T-i de AAD-1 (v3) no tuvieron lesiones (promedio de lesiones de la población = 14%). Ver Figura 18. La tolerancia mejoró levemente para AAD2 (v2) optimizado en la planta versus el gen nativo; sin embargo, la comparación de ambos genes AAD-1 y -2 optimizados en la planta indica un promedio significativo para AAD-1 (v3) in planta (ver cuadro 16). Estos resultados son inesperados dado que la comparación in vitro de AAD-1 (v2) y AAD-2 (v1 ) nativos indicó que el 2,4-D se degradaba mejor por AAD-2 (v1 ). AAD-2 (v1 ) se expresa en plantas Ti individuales hasta niveles variables con el tamaño anticipado; sin embargo, se produce poca protección frente al 2,4-D por esta proteína expresada. Existe poca correlación entre el nivel de expresión observado en la transferencia Western y el nivel de lesión por 2,4-D en las mismas plantas. Ver Figura 19. No hubo ninguna diferencia significativa evidente en el nivel de expresión de las proteínas (in planta) para los genes AAD-2 nativos y optimizados en la planta. Estos datos corroboran hallazgos anteriores que hacen que la expresión funcional de AAD-1 (v3) in planta para impartir resistencia a los herbicidas 2,4-D y AOPP sea inesperada.

EJEMPLO 18 Aplicaciones para Quemado de Pre-plantas Este y los Ejemplos que siguen son ejemplos específicos de nuevos usos herbicidas hechos posibles por la presente invención de AAD-1. Las aplicaciones herbicidas de quemado de pre-plantas pretenden matar las malezas que han emergido durante el invierno o a principios de la primavera antes de plantar un cultivo determinado.

Normalmente estas aplicaciones se aplican en sistemas de manejo con agricultura reducida o sin agricultura donde la eliminación física de las malezas no se completa antes de la plantación. Un programa herbicida, por lo tanto, debe controlar un espectro muy amplio de malezas de hoja ancha y gramíneas presentes en el momento de la plantación. El glifosato, la gramoxona y el glufosinato son ejemplos de herbicidas no selectivos, no residuales ampliamente usados para aplicaciones herbicidas para el quemado de pre-plantas. Algunas malezas, sin embargo, son difíciles de controlar en este momento de la estación debido a uno o más de los siguientes hechos: insensibilidad inherente de las especies de malezas o biotipo al herbicida, tamaño relativamente grande de malezas anuales del invierno, y condiciones de clima frío que limitan la captación y la actividad del herbicida. Se encuentran disponibles varias opciones herbicidas para mezclar en tanque con estos herbicidas para aumentar el espectro y la actividad sobre las malezas donde los herbicidas no selectivos son débiles. Un ejemplo serían las aplicaciones para mezcla en tanque de 2,4-D con glifosato para ayudar en el control de Conyza canadensis (erigerón de Canadá). El glifosato puede usarse desde 420 hasta 1680 g ea/ha, más normalmente 560 a 840 g ea/ha, para el control por quemado de pre-plantas de la mayoría de las malezas presentes, 280 - 1120 g ea/ha de 2,4-D pueden aplicarse para ayudar en el control de muchas especies de malezas de hoja ancha (por ejemplo, maleza doméstica). El 2,4-D es un herbicida de elección ya que es efectivo sobre un intervalo muy amplio de malezas de hoja ancha, efectvo incluso a bajas temperaturas y es extremadamente económico. Sin embargo, si la cosecha posterior es una cosecha dicotiledónea sensible, los residuos de 2,4-D en el suelo (a pesar de su escasa vida útil) pueden producir un impacto negativo sobre ei cultivo. La soja es un cultivo sensible y requiere un período de tiempo mínimo de 7 días (para un índice de 280 g ea/ha de 2,4-D) a por lo menos 30 días (para aplicaciones de 2,4-D de 1120 g ea/ha) entre las aplicaciones de quemado y la plantación. El 2,4-D está prohibido como tratamiento para quemado antes de la plantación de algodón (ver rótulos federales, la mayoría se encuentran disponibles a través de CPR, 2003 o en Internet en cdms.net/manuf/manuf.asp). Con el algodón o soja transformados con AAD-1 (v3), estos cultivos deben tener la capacidad de sobrevivir a los residuos de 2,4-D en el suelo a partir de las aplicaciones para quemado aplicadas hasta el momento, e inciuso después, de la plantación antes del surgimiento del cultivo. La mayor flexibilidad y el reducido costo de los compañeros de mezclado en tanque (o premezcla comercial) mejorarán las opciones del control de las malezas y aumentarán la robustez de las aplicaciones de quemado en situaciones sin agricultura o con agricultura reducida. Este ejemplo es una de las muchas opciones que se encontrarán disponibles. Aquellas personas expertas en la técnica del control de malezas observarán una variedad de otras aplicaciones incluyendo, sin carácter limitativo, gramoxona + 2,4-D o glufosínato + 2,4-D mediante el uso de productos descritos en rótulos herbicidas federales (CPR, 2003) y usos descritos en Agriliance Crop Protection Guide (2003), como ejemplos. Aquellas personas expertas en la técnica reconocerán además que el ejemplo anterior puede aplicarse a cualquier cultivo sensible al 2,4-D (u otro herbicida tipo fenoxi auxina) que se protegería con el gen AAD-1 (v3) si está transformado de manera estable.

EJEMPLO 19 Uso en cultivo de Herbicidas tipo fenoxi auxinas en Soja, Algodón, y otros cultivos dicotoledóneos transformados sólo con AAD-1 (v3) AAD-1 (v3) puede permitir el uso de un herbicida tipo fenoxi auxina (por ej., 2,4-D, dichlorprop, MCPA, eí al.) para el control de un amplio espectro de malezas de hoja ancha en forma directa en cultivos normalmente sensibles a 2,4-D. La aplicación de 2,4-D a 280 hasta 2240 g ae/ha controlaría la mayoría de especies de maleza de hoja ancha presentes en ambientes agronómicos. Más normalmente, se usa 560 - 1120 g ae/ha. Para un control completo del sistema de malezas, deben controlarse las malezas gramíneas. Una variedad de herbicidas graminicidas de amplio espectro, incluyendo sin carácter limitativo haloxyfop, quizalofop, fenoxaprop, fluazifop, sethoxidim, y clethodim se encuentran registrados actualmente para usar en la mayoría de los cultivos dicotiledóneos que naturalmente son tolerantes a estos herbicidas. Una combinación de quizalofop (20 - 100 g ae/ha) más 2,4-D (420 - 840 g ae/ha) podría proveer dos modos de acción del herbicida en un cultivo dicotiledóneo transformado con AAD-1 (v3) (es decir, soja o algodón) que controlaría la mayoría de las malezas agronómicas en un modo similar al glifosato en cultivos tolerantes al glifosato (ver espectros de control de las malezas como referencia a las clasificaciones de rendimiento de Agriliance Crop Protection Guide). Una ventaja para esta herramienta adicional es el costo extremadamente bajo del componente herbicida de hoja ancha y el potencial control residual de las malezas de corta vida útil provisto por índices más altos de 2,4-D y/o herbicidas tipo AOPP cuando se usan a índices más elevados, mientras que un herbicida no residual como el glifosato no proveería control de las malezas que germinarían más tarde. Esta herramienta provee, además, un mecanismo para rotar los modos de acción del herbicida con la conveniencia de HTC como resistencia al herbicida integrado y estrategia de manejo cambiante de las malezas en una estrategia de rotación de HTC de un cultivo tolerante al glifosato/A4D-7 (v3), se roten o no las especies de cultivos. Adicionalmente, los componentes de control de malezas gramíneas y de hoja ancha de este sistema son independientes entre sí, de este modo permitiendo que una persona experta en la técnica del control de las malezas determine la relación más eficaz y efectiva económicamente del herbicida con auxina y AOPP. Por ejemplo, si las malezas de hoja ancha fueran ias únicas malezas significativas presentes cuando se necesitan aplicaciones herbicidas, una aplicación de herbicida de 560 a 1120 g ae/ha 2,4-D podría realizarse sin otro herbicida. Esto reduciría las aplicaciones de herbicida innecesarias, proveería flexibilidad para reducir los costros de entrada y reduciría las cargas ambientales de los plaguicidas, y reduciría la presión de selección innecesaria para el desarrollo de malezas resistentes a los herbicidas. Los beneficios adicionales podrían incluir tolerancia al cambio de 2,4-D o volatilización como mecanismos de lesión fuera del sitio por 2,4-D a cultivos dicotiledóneos; ningún intervalo requerido antes de la plantación luego de la aplicación de 2,4-D (ver ejemplo anterior); y menos problemas a partir de la lesión por contaminación de cultivos dicotiledóneos que surgen de tanques a granel limpiados en forma incompleta que habían contenido 2,4-D. Dicamba (y otros herbicidas) pueden usarse, incluso, para el control posterior de voluntarios de cultivos dicotiledóneos transformados con AAD-1 (v3). Aquellas personas expertas en la técnica reconocerán además que el ejemplo anterior puede apicarse sólo a cualquier cultivo sensible a 2,4-D (u otro herbicida de fenoxi auxina) que se protegería con el gen AAD-1 (v3) si está transformado de manera estable. Una persona con experiencia en la técnica del control de las malezas reconocerá ahora que el uso de varios herbicidas de fenoxi auxina comerciales solos o combinados con cualquier herbicida tipo AOPP comercial tiene la posibilidad de transformación con AAD-1 (v3). Los índices específicos de otros herbicidas representativos de estas químicas pueden determinarse mediante los rótulos de herbicidas compilados en el libro de la CPR (Crop Protection Reference) o compilación similar o cualquier referencia comercial o académica sobre protección de cultivos tal como la Crop Protection Guide de Agriliance (2003). Cada herbicida alternativo útil para usar en HTCs por AAD-1 (v3), ya sea si se usa solo, mezclado en tanque o en forma secuencial, se considera dentro del alcance de esta invención.

EJEMPLO 20 Uso en cultivo de Fenoxi auxinas y Herbicidas tipo AOPP en Maíz, Arroz, y otras especies monocotiledóneas sólo transformadas con AAD-1 (v3) De un modo análogo, la transformación de especies de pastos (tales como, sin carácter limitativo, maíz, arroz, trigo, cebada, o césped y pastos) con AAD-1 (v3) permitiría el uso de graminicidas de AOPP altamente eficaces en cultivos normalmente sensibles a estos herbicidas. La mayoría de las especies de pastos tienen una tolerancia natural a los herbicidas auxínicos tales como las fenoxi auxinas (es decir, 2,4-D, dichlorprop, et al.). Sin embargo, un nivel relativamente bajo de selectividad del cultivo ha generado una utilidad reducida en estos cultivos debido a una ventana acortada de tiempo de aplicación y malezas de hoja ancha alternativas. Los cultivos de monocotiledóneas transformados con AAD-1 (v3) permitirían, por consiguiente, el uso de una combinación similar de tratamientos descritos para cultivos dicotiledóneos tales como la aplicación de 2,4-D a 280 hasta 2240 g ae/ha para controlar la mayoría de las especies de malezas de hoja ancha. Más normalmente, se usaría 560 - 1120 g ae/ha. Una variedad de herbicidas graminicidas tipo AOPP de amplio espectro (incluyendo sin carácter limitativo haloxyfop, quizalofop, fenoxaprop, y fluazifop) podría utilizarse para controlar efectivamente una amplia selección de malezas gramíneas. Los herbicidas graminicidas con ciciohexandiona como setoxidim, cletodim, eí al. no podrían utilizarse en este sistema como se muestra para los cultivos de dicotiledóneas dado que AAD-1 no podría protegerlos de esta química, y los cultivos de césped serán naturalmente sensibles a las químicas de la ciciohexandiona. Sin embargo, este atributo podría permitir el uso de herbicidas con ciciohexandiona para el control posterior de voluntarios de cultivo de pasto transformado con AAD-1 (v3). Ahora se permiten estrategias similares de control de las malezas con ei uso de AAD-1 para ias especies de cultivos dicotiledóneos. Una combinación de quizalofop (20 - 100 g ae/ha) más 2,4-D (420 - 840 g ae/ha) podría proveer dos modos de acción del herbicida en un cultivo monocotiledóneo transformado con AAD-1 (v3) (por ejemplo, maíz y arroz) que controlaría la mayoría de las malezas agronómicas en un modo similar al glifosato en cultivos tolerantes al glifosato (ver espectros de control de las malezas como referencia a las clasificaciones de rendimiento de la Agriliance Crop Protection Guide). Una ventaja para esta herramienta adicional es el costo extremadamente bajo del componente herbicida de hoja ancha y el control residual de corta vida útil potencial de las malezas provisto por índices más altos de 2,4-D y/o herbicidas tipo AOPP cuando se usan en índices más altos. En contraste, un herbicida no residual como el glifosato no proveería ningún control de las malezas que germinaran más tarde. Esta herramienta proveería además un mecanismo para rotar los modos de acción del herbicida con la conveniencia de HTC como estrategia de resistencia integrada al herbicida y manejo de cambios de las malezas en una estrategia de rotación de HTC en cultivos tolerantes al glifosato/A4¿ 7 (v3), se roten las especies de cultivos o no. Adicionalmente, los componentes de control de las malezas gramíneas y de hoja ancha de este sistema son independientes entre sí, permitiendo de este modo que una persona experta en la técnica del control de las malezas determine la relación más eficaz y efectiva económicamente de herbicida de auxina y AOPP. Por ejemplo, si las malezas de hoja ancha fueran las únicas malezas significativas presentes cuando se necesitan aplicaciones de herbicidas, una aplicación de herbicida de 560 a 1120 g ae/ha 2,4-D podría realizarse sin otro herbicida. Esto reduciría las aplicaciones herbicidas innecesarias, proveería flexibilidad para reducir los costos de entrada y reducirían las cargas para el medio ambiente de los plaguicidas, y reduciría la presión de selección innecesaria para el desarrollo de malezas resistentes a los herbicidas. La mayor tolerancia del maíz, y otras monocotiledóneas a las fenoxi auxinas permitiría el uso de estos herbicidas en restricciones de la etapa de cultivo sin crecimiento o el potencial de inclinación, fenómenos de despliegue como "la cola de rata", la inclinación de los cultivos, debilidad del tallo inducida por el regulador del crecimiento en el maíz, y raíces deformadas. Aquellas personas expertas en la técnica reconocerán ahora que el ejemplo anterior puede aplicarse a cualquier cultivo monocotiledóneo que podría protegerse con el gen AAD-1 (v3) de las lesiones provocadas por cualquier herbicida tipo AOPP. Una persona con experiencia en la técnica de! control de las malezas reconocerá ahora que el uso de varios herbicidas de fenoxi auxina comerciales solos o combinados con cualquier herbicida tipo AOPP comercial tienen la posibilidad de transformación con AAD-1 (v3). Los índices específicos de otros herbicidas representativos de estas químicas pueden determinarse mediante los rótulos de herbicidas compilados en el libro de la CPR (Crop Protection Reference) o compilación similar, rótulos compilados por internet (por ejemplo, cdms.net/manuf/manuf.asp), o cualquier guía comercial o académica referida a la protección de cultivos tales como the Crop Protection Guide from Agriliance (2003). Cada herbicida alternativo útil para usar en HTCs por AAD-1 (v3), ya sea si se usa solo, mezclado en tanque o en forma secuencial, se considera dentro del alcance de esta invención.

EJEMPLO 21 AAD-1 (v3) Apilada con Rasgo de Tolerancia al Glifosato en cualquier cultivo La amplia mayoría de los acres de algodón, cañóla, y soja plantados en Norteamérica contienen un rasgo de tolerancia al glifosato (TG), y la adopción del maiz TG continúa en aumento. Cultivos TG adicionales (por ej., trigo, arroz, remolacha, y césped) se han encontrado en desarrollo pero no se han liberado comercialmente hasta la fecha. Muchas otras especies resistentes al glifosato se encuentran en etapa experimental para desarrollo (por ej., alfalfa, caña de azúcar, girasol, remolachas, arvejas, zanahoria, pepino, lechuga, cebolla, frutilla, Tomate, y tabaco; especies de silvicultura como álamo y liquidámbar; y especies hortícolas como caléndula, petunia, y begonias; isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm, 2005 en Internet). Los TGC son herramientas valiosas para la inmensa amplitud de malezas controladas y la conveniencia y efectividad económica provistos por este sistema. Sin embargo, la utilidad del glifosato como tratamiento base ahora estándar se selecciona para malezas resistentes al glifosato. Además, las malezas sobre las cuales el glifosato es inherentemente menos eficaz cambian a las especies predominantes en los campos en los cuales se practican programas químicos sólo con glifosato. Al aplicar AAD-1 (v3) con un rasto TG, ya sea a través de cultivo convencional o en forma conjunta como nuevo evento de transformación, la eficacia en el control de las malezas, flexibilidad y capacidad de manejar cambios de las malezas y el desarrollo de resistencia a los herbicidas podrían mejorarse. Como se mencionó en ejemplos anteriores, mediante la transformación de cultivos con AAD-1 (v3), se pueden aplicar selectivamente los herbicidas tipo AOPP en cultivos de monocotiledóneas, cultivos de monocotiledóneas que tienen un margen más alto de seguridad contra la fenoxi auxina, y las fenoxi auxinas pueden aplicarse en forma selectiva en los cultivos dicotiledóneos. Pueden observarse varios escenarios para el control mejorado de las malezas en los cuales AAD-1 (v3) y un rasgo TG se adosan en cualquier especie de cultivo monocotiledónea o dicotiledónea: a) El glifosato puede aplicarse a un índice de aplicación post-emergente estándar (420 a 2160 g ae/ha, con preferencia 560 a 840 g ae/ha) para el control de la mayoría de las especies de malezas gramíneas y de hoja ancha. Para el control de malezas de hoja ancha resistentes al glifosato como Conyza canadensis o malezas inherentemente difíciles de controlar con glifosato (por ejemplo, Commelina spp), puede aplicarse 280-2240 g ae/ha (con preferencia 560-1120 g ae/ha) de 2,4-D en forma secuencial, mezclada en tanque, o como premezcla con glifosato para proveer un control efectivo. b) El glifosato puede aplicarse a un índice de aplicación post-emergente estándar (420 a 2160 g ae/ha, con preferencia 560 a 840 g ae/ha) para el control de la mayoría de las especies de malezas gramíneas y de hoja ancha. Para el control de especies de plantas resistentes al glifosato como Lolium rigidum o Eleusine indica, 10-200 g ae/ha (con preferencia 20-100 g ae/ha) puede aplicarse quizalofop en forma secuencial, mezclada en tanque, o como premezcla con glifosato para proveer un control efectivo. c) Actualmente, los índices de glifosato aplicados en TGC varían generalmente desde 560 hasta 2240 g ae/ha por programa de aplicación. El glifosato es por mucho más eficaz sobre las especies de malezas gramíneas que sobre las especies de hoja ancha. Los rasgos de AAD-1 (v3) + TG permitirían índices efectivos para gramíneas de glifosato (105-840 g ae/ha, con mayor preferencia 210-420 g ae/ha). Luego podría aplicarse 2,4-D (a 280-2240 g ae/ha, con mayor preferencia 560-1120 g ae/ha) en forma secuencial, mezclada en tanque, o como premezcla con índices efectivos para gramíneas de giifosato para proveer el control necesario de las malezas de hoja ancha. Un herbicida tipo AOPP como quizalofop a 10-200 g ae/ha (con preferencia 20-100 g ae/ha y con mayor preferencia 20-35 g ae/ha), podría usarse para el control de las malezas gramíneas más robustas y/o para demorar el desarrollo de pastos resistentes al glifosato. El bajo índice de glifosato también proveería cierto beneficio para el control de las malezas de hoja ancha; sin embargo, el control primario sería a partir del 2,4-D. Una persona con experiencia en la técnica del control de las malezas reconocerá que el uso de uno o más herbicidas tipo fenoxi auxinas comerciales solos o combinados (en forma secuencial o en forma independiente) con uno o más herbicidas tipo AOPP comerciales tiene la posibilidad de transformación con AAD-1 (v3) en los cultivos. Los índices específicos de otros herbicidas representativos de estas químicas pueden determinarse mediante los rótulos de herbicidas compilados en el libro de la CPR (Crop Protection Reference) o compilación similar, rótulos compilados por internet (por ejemplo, cdms.net manuf/manuf.asp), o cualquier guía comercial o académica referida a la protección de cultivos tales como the Crop Protection Guide from Agriliance (2003). Cada herbicida alternativo útil para usar en HTCs por AAD-1 (v3), ya sea si se usa solo, mezclado en tanque o en forma secuencial, se considera dentro del alcance de esta invención.

EJEMPLO 22 AAD-1 (v3) Apilada con Rasgo de tolerancia al glufosinato en cualquier cultivo La tolerancia al glufosinato (PAT o bar) está actualmente presente en una cantidad de cultivos plantados en Norteamérica ya sea como marcador seleccionable para un rasgo de entrada como proteínas de resistencia a los insectos o específicamente como un rasgo HTC. Los cultivos incluyen, sin carácter limitativo, cañóla, maíz, y algodón tolerante al glufosinato. Cultivos adicionales tolerantes al glufosinato (por ejemplo, arroz, remolacha, soja, y césped) se han encontrado en desarrollo pero no se han liberado comercialmente hasta la fecha. El glufosinato, como el glifosato, es un herbicida relativamente no selectivo, de amplio espectro para gramíneas y hojas anchas. El modo de acción del glufosinato difiere del glifosato. Actúa más rápido, produciendo la desecación y "quemado" de las hojas tratadas 24-48 horas después de la aplicación del herbicida. Esto resulta ventajoso para el aspecto del rápido control de las malezas. Sin embargo, esto también limita la translocación del glufosinato a regiones meristemáticas de plantas blanco que producen un escaso control de las malezas como lo evidencian las clasificaciones de rendimiento del control relativo de las malezas de los dos compuestos en muchas especies (Agriliance, 2003). Al modificar AAD-1 (v3) con un rasgo de tolerancia al glufosinato, ya sea por sembrado convencional o en forma conjunta como un nuevo evento de transformación, podría mejorarse la eficacia en el control de las malezas, flexibilidad, y posibilidad de manejar los cambios de las malezas y desarrollo de resistencia al herbicida. Como se mencionó en ejemplos anteriores, al transformar los cultivos con AAD-1 (v3), se puede aplicar selectivamente herbicidas tipo AOPP en cultivos de monocotiledóneas, los cultivos de monocotiledóneas tendrán un margen más elevado de seguridad a la fenoxi auxina, y pueden aplicarse fenoxi auxinas en forma selectiva en los cultivos dicotiledóneos. Pueden preverse varios escenarios para opciones mejoradas del control de las malezas en los cuales AAD-1 (v3) y un rasgo de tolerancia al glufosinato se agregan en cualquier especie de cultivo monocotiledónea o dicotiledónea: a) El glufosinato puede aplicarse a un índice de aplicación post-emergente estándar (200 a 1700 g ae/ha, con preferencia 350 a 500 g ae/ha) para el control de muchas especies de malezas gramíneas y de hoja ancha. Hasta la fecha, no se han confirmado malezas resistentes al glufosinato; sin embargo, el glufosinato tiene un número mayor de malezas que son inherentemente más tolerantes que el glifosato. i) Las especies de malezas del césped inherentemente tolerantes (por ejemplo, Echinochloa spp o Sorghum spp) podrían controlarse por mezclado en tanque de 10-200 g ae/ha (con preferencia 20-100 g ae/ha) de quizalofop. ¡i) Las especies de malezas de hoja ancha inherentemente tolerantes (por ejemplo, Cirsium arvensis y Apocynum cannabinum) podrían controlarse mezclando en tanque 280-2240 g ae/ha, con mayor preferencia 560-2240 g ae/ha, 2,4-D para el control efectivo de estas especies más perennes más difíciles de controlar y para mejorar la robustez del control en las especies de maleza de hoja ancha anuales. b) Una combinación de tres vías de glufosinato (200-500 g ae/ha) + 2,4-D (280-1120 g ae/ha) + quizalofop (10-100 g ae/ha), por ejemplo, podría proveer un control más robusto, superpuesto del espectro de las malezas. Adicionalmente, el espectro superpuesto provee un mecanismo adicional para el manejo o el retraso de las malezas resistentes a los herbicidas. Una persona con experiencia en la técnica del control de las malezas reconocerá que el uso de uno o más herbicidas tipo fenoxi auxinas comerciales solos o combinados (en forma secuencial o en forma independiente) con uno o más herbicidas tipo AOPP comerciales tiene la posibilidad de AAD-1 (v3) transformación en los cultivos. Los índices específicos de otros herbicidas representativos de estas químicas pueden determinarse mediante los rótulos de herbicidas compilados en el libro de la CPR (Crop Protection Reference) o compilación similar, rótulos compilados por internet (por ejemplo, cdms.net/manuf/manuf.asp), o cualquier guía comercial o académica referida a la protección de cultivos tales como the Crop Protection Guide from Agriliance (2003). Cada herbicida alternativo útil para usar en HTCs por AAD-1 (v3), ya sea si se usa solo, mezclado en tanque o en forma secuencial, se considera dentro del alcance de esta invención.

EJEMPLO 23 AAD-1 (v3) apilada con rasgo AHAS en cualguier cultivo La tolerancia a los herbicidas de imidazolinona (AHAS, et ai) está actualmente presente en una cantidad de cultivos plantados en Norteamérica incluyendo, sin carácter limitativo, maíz, arroz, y trigo. Cultivos adicionales tolerantes a la imidazolinona (por ejemplo, algodón y remolacha) se han encontrado en desarrollo pero no se han liberado comercialmente hasta la fecha. Muchos herbicidas de imidazolinona (por ejemplo, imazamox, imazethapyr, imazaquin, e imazapic) se usan actualmente en forma selectiva en varias cosechas convencionales. Ei uso de imazetapir, imazamox, y el imazapir no selectivo se ha permitido a través de rasgos de tolerancia a la imidazolinona como AHAS et al. Los HTC tolerantes a la imidazolinona hasta la fecha tienen la ventaja de ser no transgénicos. Esta clase química también tiene una actividad residual en el suelo significativa, siendo de este modo capaz de proveer control de las malezas extendidas más allá del tiempo de aplicación, a diferencia de los sistemas basados en glifosato o glufosinato. Sin embargo, el espectro de malezas controladas por los herbicidas de imidazolinona no es tan amplio como el de glifosato (Agriliance, 2003). Adicionalmente, los herbicidas de imidazolinona tienen un modo de acción (inhibición de acetolactato sintasa, ALS) al cual muchas malezas han desarrollado resistencia (Heap, 2004). Al apilar AAD-1 (v3) con un rasgo de tolerancia a la imidazolinona, ya sea por sembrado convencional o en forma conjunta como un nuevo evento de transformación, eficacia en el control de las malezas, flexibilidad, y posibilidad de manejar los cambios de las malezas y desarrollo de resistencia al herbicida podría mejorarse. Como se mencionó en ejemplos anteriores, al transformar los cultivos con AAD-1 (v3), se puede aplicar selectivamente herbicidas tipo AOPP en cultivos de monocotiledóneas, los cultivos de monocotiledóneas tendrán un margen más elevado de seguridad a la fenoxi auxina, y pueden aplicarse fenoxi auxinas en forma selectiva en los cultivos dicotiledóneos. Pueden preverse varios escenarios para opciones mejoradasdel control de las malezas en los cuales AAD-1 (v3) y un rasgo de tolerancia a la imidazolinona se agregan en cualquier especie de cultivo monocotiledónea o dicotiledónea: a) Puede aplicarse ¡mazetapir a un índice de aplicación post-emergente estándar de (35 a 280 g ae/ha, con preferencia 70-140 g ae/ha) para el control de muchas especies de malezas gramíneas y de hoja ancha. i) Las malezas de hoja ancha resistentes al inhibidor de ALS como Amaranthus rudis, Ambrosia trífida, Chenopodium álbum (entre otras, Heap, 2004) podrían controlarse mezclando en tanque 280-2240 g ae/ha, con mayor preferencia 560-1120 g ae/ha, de 2,4-D. ii) Las especies de hoja ancha inherentemente más tolerantes a los herbicidas de imidazolinona como Ipomoea spp. pueden controlarse, también, mezclando en tanque 280-2240 g ae/ha, con mayor preferencia 560-1120 g ae/ha, de 2,4-D. ¡ii) Las malezas de pastos resistentes al inhibidor de ALS como Sorghum halepense y Lolium spp. pueden controlarse mezclando en tanque 10-200 g ae/ha (con preferencia 20-100 g ae/ha) de quizalofop. iv) Las especies de malezas gramíneas inherentemente más tolerantes (por ej., Agropyron repens) podrían controlarse también mezclando en tanque 10-200 g ae/ha (con preferencia 20-100 g ae/ha) de quizalofop. b) Una combinación triple de imazetapir (35 a 280 g ae/ha, con preferencia 70-140 g ae/ha) + 2,4-D (280-1120 g ae/ha) + quizalofop (10-100 g ae/ha), por ejemplo, podría proveer un control más robusto, superpuesto del espectro de las malezas. Adicionalmente, el espectro superpuesto provee un mecanismo adicional para el manejo o el retraso de malezas resistentes a los herbicidas.

Una persona con experiencia en la técnica del control de las malezas reconocerá que el uso de cualquiera de varios herbicidas de imidazolinona comerciales, herbicidas de fenoxi auxina, o herbicida tipo AOPP, solos o en combinaciones múltiples, tiene la posibilidad de transformación con AAD-1 (v3) y apilamiento con cualquier rasgo de tolerancia a la imidazolinona ya sea por sembrado convencional o por ingeniería genética. Los índices específicos de otros herbicidas representativos de estos tipos químicos pueden determinarse mediante los rótulos de herbicidas compilados en el libro de la CPR (Crop Protection Reference) o compilación similar, rótulos compilados por internet (por ejemplo, cdms.net/manuf/manuf.asp), o cualquier guía comercial o académica referida a la protección de cultivos tales como la Crop Protection Guide de Agriliance (2003). Cada herbicida alternativo útil para usar en HTCs por AAD-1 (v3), ya sea si se usa solo, mezclado en tanque o en forma secuencial, se considera dentro del alcance de esta invención.

EJEMPLO 24 AAD-1 (v3) en Arroz 24.1 - Descripción de los Medios. Los medios de cultivo empleados se ajustaron a un pH 5.8 con KOH 1 M y se solidificaron con 2.5 g/l de Phytagel (Sigma). Se cultivaron callos embriogénicos en cápsulas de Petri de 100 x 20 mm que contenían 40 ml de medio semisólido. Se cultivaron plantines de arroz en 50 ml de medio en cajas Magenta. Se mantuvieron las suspensiones celulares en matraces cónicos de 125 ml que contenían 35 ml de medio líquido y se rotaron a 125 rpm. La inducción y el manteniminto de los cultivos embriogénicos tuvo lugar en la oscuridad a 25-26°C, y la regeneración de la planta y la planta completa tuvo lugar en un período de luz de 16 horas (Zhang eí al. 1996). La inducción y el mantenimiento del callo embriogénico tuvo lugar en medio basal de NB como se describió con anterioridad (Li eí al. 1993), pero adaptado para contener 500 mg/l de glutamina. Los cultivos de suspensión se iniciaron y se mantuvieron en medio SZ líquido (Zhang eí al. 1998) con la inclusión de 30 g/l de sacarosa en lugar de maltosa. El medio osmótico (NBO) consistía en medio NB con el agregado de 0.256 M, cada uno, de manitol y sorbitol. Se seleccionó el callo resistente a higromicina-B en medio NB suplementado con 50 mg/l de higromicina B durante 3-4 semanas. La pre-regeneración tuvo lugar en medio (PRH50) formado por medio NB sin ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), pero con el agregado de 2 mg/l de 6-bencilaminopurina (BAP), 1 mg/l de ácido a-naftalenacético (NAA), 5 mg/l de ácido abscísico (ABA) y 50 mg/l de higromicina B durante 1 semana. A la regeneración de los plantines le siguió el cultivo en medio de regeneración (RNH50) que comprendía medio NB sin 2,4-D, y suplementado con 3 mg/l de BAP, 0.5 mg/l de NAA, y 50 mg/l de higromicina B hasta que se regeneraron los brotes. Los brotes se transfirieron a medio de formación de raíces con la mitad de la concentración y sales básales de Murashige y Skoog y vitamina B5 de Gamborg, suplementado con 1 % de sacarosa y 50 mg/l de higromicina B (1/2MSH50). 24.2 - Desarrollo del cultivo de tejido. Se esterilizaron semillas disecadas maduras de Oryza sativa L. japónica cv. Taipei 309 como se describe en Zhang et al. 1996. Se indujeron tejidos embriogénicos por cultivo de semillas de arroz maduras estériles en medio NB en la oscuridad. El callo primario de aproximadamente 1 mm de diámetro, se retiró de la escútula y se usó para iniciar la suspensión celular en medio líquido SZ. Luego se mantuvieron las suspensiones como se describe en Zhang 1995. Se retiraron los tejidos embriogénicos derivados de la suspensión del cultivo líquido 3-5 días después del sub-cultivo anterior y se colocaron en medio osmótico de NBO para formar un círculo de aproximadamente 2.5 cm a lo ancho de una caja de Petri y se cultivó durante 4 horas antes del bombardeo. De dieciséis a 20 horas después del bombardeo, se transfirieron los tejidos de medio NBO sobre medio de selección NBH50 de higromicina B, asegurando que la superficie bombardeada estuviera hacia arriba, y se incubaron en la oscuridad durante 14-17 días. Luego se separó el callo recién formado de los explantes bombardeadas originales y se colocaron cerca en el mismo medio. Luego de un adicional de 8-12 días, se identificó visualmente un callo opaco relativamente compacto, y se transfirió a medio de pre-regeneración PRH50 durante 7 días en la oscuridad. El callo en crecimiento, que se tornó más compacto y opaco, fue sub-cultivado luego sobre medio de regeneración de RNH50 durante un período de 14-21 días bajo un período de luz de 16 horas. Los brotes de la regeneración se transfierieron a cajas Magenta que contenían Vz medio MSH50. Múltiples plantas regeneradas de un único explante se consideran pares y se trataron como una línea de planta independiente. Una planta se clasificó como positiva respecto del gen hph si producía raíces blancas y gruesas y crecía vigorosamente en 1/2 medio MSH50. Una vez que los plantines habían alcanzado la parte alta de las cajas Magenta, se transfierieron al suelo en un maceta de 6 cm con 100% de humedad durante una semana, luego se movieron a una cámara de cultivo con un período de luz de 14 horas luz a 30°C y en la oscuridad a 21 °C durante 2-3 semanas antes de transplantarlos a macetas de 13 cm en el invernadero. Se recolectaron las semillas y se secaron a 37°C durante una semana antes de almacenar a 4°C. 24.3 - Bombardeo de microproyectiles. Todos los bombardeos se condujeron con el sistema Biolistic PDS-1000/He™ (Bio-Rad, Laboratories, Inc.). Se lavaron tres miligramos de partículas de oro de 1.0 micrón de diámetro una vez con etanol 100%, dos veces con agua destilada estéril y se resuspendieron en 50 µl de agua en un tubo Eppendorf siliconado. Se agregaron cinco miligramos del ADN del plásmido que representaba una relación molar 1 :6 de pDOW3303 (vector que contenía Hpt) a pDAB3403, 20 µl de espermidina (0.1 M) y 50 µl de cloruro de calcio (2.5 M) a la suspensión de oro. Se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos, se formaron concentrados a 10000 rpm durante 10 segundos, se resuspendieron en 60 µl de etanol 100% frío y se distribuyeron 8-9 µl sobre cada microvehículo. Se bombardearon las muestras de tejido a 77.33 kg/cm2 y 27 pulgadas de Hg de vacío como se describe en el texto escrito por Zhang eí al. (1996). 24.4 - Evaluación de la tolerancia. Se asperjaron plantines de arroz en la etapa de 3-5 hojas con una solución al 0.3% (v/v) de DuPont™ Assure® II que contenía concentrado de aceite para cultivo al 1% (v/v) Agridex usando un aspersor de bulbo DeVilbiss (atomizador de vidrio modelo 15-RD). Esta concentración corresponde a aproximadamente 140 g ae/ha. Se asperjó cada planta en una capucha de humo a una distancia de 20-30 centímetros con 6 chorros llenos de aspersor dirigido de modo tal que se cubiera la planta entera con una porción igual de herbicida. Cada chorro aplicó aproximadamente 100 µl de solución al plantín. Una vez asperjados, los plantines se dejaron secar durante una hora antes de sacarlos de la capucha de humo. La clasificación de severidad o resistencia se realizó a los 10-14 días luego del tratamiento (DLT) y se muestra en el cuadro 35 a continuación.

CUADRO 35 24.5 - Cosecha de tejido, aislamiento de ADN y cuantificación Se colocó tejido nuevo en tubos y se liofilizó a 4°C durante 2 días. Luego de que el tejido estuvo completamente seco, se colocó una perla de tungsteno (Valenite) en el tubo y se sometieron las muestras a 1 minuto de molienda en seco usando un molino de perlas Kelco. Luego se realizó el procedimiento de aislamiento de ADN estándar con DNeasy (Qiagen, Dneasy 69109). Luego se manchó una alícuota de ADN extraído con Pico Green (Molecular Probes P7589) y se realizó un barrido en el florómetro (BioTek) con estándares conocidos para obtener la concentración en ng/µl. 24.6 - Análisis por transferencia Southern El análisis Southern se realizó con ADN total obtenido del equipo Qiagen DNeasy. Se sometió un total de 2 µg de ADN a una digestión hasta la mañana siguiente de Hindlll para pDAB3403 para obtener datos de integración. Del mismo modo se sometió un total de 2 ug de ADN a una digestión hasta la mañana siguiente de Mfel para obtener los datos de PTU.

Luego de la digestión hasta la mañana siguiente se procesó una alícuota de -100 ng sobre un gel al 1 % para asegurar la digestión completa. Luego de este aseguramiento, se procesaron las muestras sobre un gel de agarosa extenso al 0.85% hasta la mañana siguiente a 40 voltios. Luego se desnaturalizó el gel en NaOH 0.2 M, NaCI 0.6 M durante 30 minutos. Luego se neutralizó el gel en Tris HCl 0.5 M, NaCI 1.5 M pH de 7.5 durante 30 minutos. Luego se configuró un aparato para gel que contenía 20 x SSC para obtener una transferencia del gel por gravedad a la membrana de nylon (Millipore INYC00010) hasta la mañana siguiente. Luego de la transferencia hasta la mañana siguiente se sometió la membrana a luz UV a través de un dispositivo de entrecruzamiento (Stratagene UV stratalinker 1800) a 1200 X100 microjoules. Luego se lavó la membrana en SDS 0.1 %, 0.1 SSC durante 45 minutos. Luego del lavado de 45 minutos, se horneó la membrana durante 3 horas a 80°C y luego se almacenó a 4°C hasta la hibridación. El fragmento patrón para hibridación se preparó usando PCR de la región codificadora usando plásmido pDAB3404. Se usó un total de 100 ng de ADN total como patrón. Se usó 20 mM de cada iniciador con el equipo Takara Ex Taq PCR Polymerase (Mirus TAKRR001A). Los iniciadores para el fragmento Southern PCR AAD-1 fueron (Delantero - ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCC) (SEQ ID NO: 31 ) e (Reverso - GGGCAGGCCTAACTCCACCAA) (SEQ ID NO: 32). La reacción por PCR se llevó a cabo en el termociclizador 9700 Geneamp (Applied Biosystems), sometiendo las muestras a 94°C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos, y 72°C durante 1 minuto y 45 segundos seguido de 72°C durante 10 minutos. El producto se procesó sobre gel de agarosa al 1 % y se separó, luego el gel se extrajo usando el procedimiento de extracción de gel Qiagen (28706). Luego se sometió la membrana a un paso de pre-hibridación a 60°C durante 1 hora en regulador de pH Perfect Hyb (Sigma H7033). Se usó el procedimiento de reacción para rotulación con dCTP Prime ¡t RmT (Stratagene 300392) para desarrollar la sonda con 32 pb (Perkin Elmer). Se limpió la sonda usando las columnas Probé Quant. G50 (Amersham 27-5335-01 ). Se usaron recuentos de dos millones de CPM para hibridar los Southern blots hasta la mañana siguiente. Luego de la hibridación hasta la mañana siguiente se sometieron los blots a dos lavados de 20 minutos a 65°C en SDS 0.1%, 0.1 SSC. Luego se expusieron los blots a una pantalla de imagen fosforescente hasta la mañana siguiente y se realizó un barrido usando un escáner storm (MOLECULAR DEVICES). En el cuadro 36 se presenta un resumen de los resultados.

CUADRO 36 Las plantas 63-1 A y 63-1 F no son el mismo evento; las plantas 63-4 A y 63-4 D son el mismo evento. Estos eventos tienen los PTU de tamaño esperado, pero son muy complejos. Estos datos de PTU de la transferencia Southern se correlacionan con los datos de expresión y los datos de aspersión. La muestra 63-6 C no tuvo suficiente ADN presente para realizar la integración y las transferencias southern PTU. 24.7 - Datos del análisis Western La preparación de las muestras y las condiciones de análisis fueron como se describió con anterioridad. Se analizaron cinco líneas de arroz transgénico y 1 control no transgénico para determinar la expresión de AAD-1 usando ELISA y transferencia Western. Se detectó AAD-1 en cuatro líneas (63-1 A, 63-1 F, 63-4B y 63-4D) pero no en la línea 63-1 C o la planta de control. Los niveles de expresión variaron desde 15.6 hasta 183 ppm de proteína total soluble. Se presenta un resumen de los resultados en el cuadro 37.

CUADRO 37 EJEMPLO 25 Procedimientos de Transformación de Césped La transformación genética, con AAD-1 (v3) sustituido para el gen "bar" como se describe a continuación, de pasto rastrero mediado por Agrobacterium tumefaciens pudo lograrse a través del callo embriogénico iniciado de semillas (cv. Penn-A-4), como se describe a continuación en un sentido general. Ver "Efficiency of Agrobacterium íu/nefac/ens-mediated grass (Agrostis stolonifera L) transformation" (Luo eí. ai, 2004). Se infecta el callo con una cepa de A. tumefaciens (LBA4404) que lleva un vector súper binario que contenía un gen bar resistente a los herbicidas conducido tanto por un promotor de ubiquitina del arroz. La eficiencia de la transformación estable general varió desde 18% hasta 45%. El análisis por transferencia Southern y genético confirmaron la integración transgénica en el genoma del pasto rastrero y la transmisión normal y la expresión estable del transgen en la generación T-i. Todos los eventos de transformación independientes llevaron una a tres copias del transgen, y una mayoría (60-65%) contenía sólo una copia del gen extraño sin reordenamientos aparentes. 25.1 - Preparación de las semillas para inducción del callo embrioqénico. Se retiró la cascara a semillas maduras con papel de lija y se esterilizó la superficie en blanqueador Clorox al 10% (v/v) (hipoclorito de sodio al 6%) más 0.2% (v/v) de Tween 20 (Polysorbate 20) con agitación vigorosa durante 90 minutos. Luego de enjuagar cinco veces en agua destilada estéril, se colocaron las semillas sobre medio de inducción del callo (sales básales MS y vitaminas, 30 g/l de sacarosa, 500 mg/l de hidrolizado de caseína, 6.6 mg/l de ácido 3,6-dicloro-o-anísico (dicamba), 0.5 mg/l de 6-bencilaminopurina (BAP) y 2 g/l de Phytagel. El pH del medio se ajustó hasta 5.7 antes de someter a autoclave a 120°C durante 20 minutos). 25.2 - Inducción del callo embriogénico. Se mantuvieron en la oscuridad las placas de cultivo que contenían explantes de semillas preparadas a temperatura ambiente durante 6 semanas. Se seleccionaron visualmente los callos embriogénicos y se sub- cultivaron en medio de inducción de callo fresco en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 semanas antes del co-cultivo. 25.3 - Infección con Agrobacteríum y co-cultivo. Un día antes de la agro-infección, el callo embriogénico se dividió en trozos de 1 a 2 mm y se colocó en medio de inducción del callo que contenía acetosiringona 100 µM. Una alícuota de 10 ul de suspensión de Agrobacterium (LBA4404) (OD=1.0 a 660 nm) se aplicó luego a cada trozo de callo, seguido de 3 días de co-cultivo en la oscuridad a 25°C. 25.4 - Etapa de reposo y control de Agrobacterium Para el paso de tratamiento antibiótico, luego se transfirió el callo y se cultivó durante 2 semanas en medio de inducción del callo más 125 mg/l de cefotaxima y 250 mg/l carbenicilina para suprimir el crecimiento de bacterias. 25.5 - Selección e identificación de colonias transqénicas potenciales Posteriormente, para selección, se movió el callo a medio de inducción del callo que contenía 250 mg/l de cefotaxima y 10 mg/l de fosfinotricina (PPT) durante 8 semanas. El tratamiento con antibiótico y el proceso completo de selección se realizaron a temperatura ambiente en la oscuridad. El intervalo de sub-cultivo durante la selección fue normalmente de 3 semanas. 25.6 - Regeneración de plantas transqénicas. Para regeneración de la planta, primero se mueven los eventos del callo proliferativos resistentes a PPT a medio de regeneración (medio basal de MS, 30 g/l de sacarosa, 100 mg/l de mio-inositol, 1 mg/l de BAP y 2 g/l de Phytagel) suplementado con cefotaxima, PPT o higromicina. Estos callos se mantuvieron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 semanas y luego se movieron a la luz durante 2-3 semanas para desarrollar los brotes. No se observaron plantas albinas con selección de PPT (si se usa higromicina como agente de selección, produce un alto nivel de plantas albinas). 25.7 - Inducción de las raíces y transferencia al invernadero. Luego se separaron los pequeños brotes y se transfirieron a medio de regeneración libre de hormonas que contenía PPT y cefotaxima para promover el crecimiento de las raíces mientras se mantenía la presión de la selección y la supersión de cualquier célula restante de Agrobacterium. Luego se transfirieron los plantines con raíces bien desarrolladas (3-5 semanas) al suelo y se cultivaron tanto en el invernadero como en el campo. 25.8 - Vernalización y entrecruzamiento de plantas transgénicas Se mantuvieron las plantas transgénicas en el exterior en un criadero de contención (3-6 meses) hasta el solsticio de invierno en Diciembre. Las plantas vernalizadas se transfirieron luego al invernadero y se mantuvieron a 25°C bajo un período de luz de 16/8 horas rodeadas por plantas no transgénicas de tipo silvestre que las aislaron físicamente de otras fuentes de polen. Las plantas comenzaron a florecer 3-4 semanas después de moverlas nuevamente al invernadero. Se realizó la cruza con el polen de las plantas de tipo silvestre que las rodeaban. Las semillas recolectadas de cada planta transgénica individual se germinaron en el suelo a 25°C, y las plantas T1 se cultivaron en el invernadero para posterior análisis. 25.9 - Otros céspedes blanco Otros céspedes que se pueden manipular para transformación de AAD-1 de conformidad con la presente invenciín incluyen el césped piojillo anual (Poa annua), pasto de Bahía, pasto curvo, pasto de las Bermudas, pasto azul, pasto duro azul, lanco, chépica (Agrostis capillaries), pasto de Búfalo, alpiste, Carpetgrass, Centipedegrass, Festuca para mascar (Festuca rubra commutate), Agróstide rastrera, Heno gris (Agrostis stolonifera), pasto de Koeler (Koeleria macrantha), pasto Dallis, Festuca, Festolium, Festuca dura/de ovejas (Festuca ovina), pasto Grama, pasto de las Indias, pasto Johnson, pasto Love, mezclas (Equina, Pastura, etc.), Céspedes nativos, pasto de huerto, ballico perene (Lolium perenne), Agrostis alba, Rescuegrass, ballicos anuales y perenes, festuca roja delgada trepadora (Festuca rubra trichophylla), pasto de la pradera de talo liso (Poa pratensis), St. Agustine, festuca roja fuerte trepadora (festuca rubra rubra), hierba del Sudán, Switchgrass, Festuca alta (Festuca arundinacea), Timothy, pasto empenachado (Deschampsia caespitosa), pastos de turba, pasto del trigo, y pasto Zoysia.

EJEMPLO 26 AAD-1 (v3) en Cañóla 26.1 - Transformación de la Cañóla El gen AAD-1 (v3) que confiere resistencia al 2,4-D se usó para transformar Brassica napus var. Nexera* 710 con transformación mediada por Agrobacterium. La construcción contenía gen AAD-1 (v3) transportado por el promotor CsVMV y el gen Pat transportado por el promotor AtUbil 0. Se esterilizó la superficie de las semillas con blanqueador comercial al 10% durante 10 minutos y se enjuagó 3 veces con agua destilada estéril. Las semillas luego se colocaron en media concentración de medio basal de MS (Murashige y Skoog, 1962) y se mantuvieron a régimen de crecimiento configurado a 25°C, y con un período de luz de 16 horas luz/8 horas de oscuridad. Se cortaron segmentos de hipocotiledones (3-5 mm) de plántulas de 5 - 7 días y se colocaron en medio de inducción del callo K1 D1 (medio MS con 1 mg/l de cinetina y 1 mg/l de 2,4-D) durante 3 días como pretratamiento. Luego se transfirieron los segmentos en una caja de Petri, se trataron con Agrobacterium cepa Z707S o LBA4404 cepa que contenía pDAB721. El Agrobacterium se cultivó hasta la mañana siguiente a 28°C en la oscuridad en un agitador 150 rpm y posteriormente se re-suspendió en medio de cultivo. Luego de 30 minutos de tratamiento de los segmentos de hipocotiledones Agrobacterium, se los colocó nuevamente en el medio de inducción del callo durante 3 días. Luego del co-cultivo, los segmentos se colocaron en K D1TC (medio de inducción del callo que contenía 250 mg/l de Carbenicilina y 300 mg/l de timentina) durante una semana de recuperación. Alternativamente, los segmentos se colocaron en forma directa sobre medio dé selección K1 D1 H1 (medio anterior con 1 mg/l de Herbiace). La Carbenicilaina y la Timentina fueron los antibióticos usados para matar el Agrobacterium. El agente de selección Herbiace permitió el crecimiento de las células transformadas. Las muestras de callo de 35 eventos independentes se evaluaron por PCR. La totalidad de las 35 muestras evaluadas fueron positivas para la presencia de AAD-1 (v3), mientras que los controles no transformados fueron negativos (sección en ensayo de PCR). Se confirmó que diez muestras de callos expresaban la proteína AAD-1 según la determinación realizada por ELISA (sección sobre análisis de proteínas).

Luego se colocaron los segmentos de hipocotiledones con callo en medio de regeneración de brote B3Z1 H1 (Medio de MS, 3 mg/l de bencilamino purina, 1 mg/l de Zeatina, 0.5 gm/l de MES [ácido 2-(N-morfolin)etan sulfónico], 5 mg/l de nitrato de plata, 1 mg/l de Herbiace, Carbenicilina y Timentina). Luego de 3 semanas los brotes comenzaron a regenerarse. Los segmentos de hipocotiledones junto con los brotes se transfieren a medio B3Z1 H3 (Medio de MS, 3 mg/l de bencilamino purina, 1 mg/l de Zeatina, 0.5 gm/l de MES [ácido 2-(N-morfolin)etan sulfónico], 5 mg/l de nitrato de plata, 3 mg/l de Herbiace, Carbenicilina y Timentina) durante otras 3 semanas. Se cortaron los brotes de los segmentos de hipocotiledones y se transfirieron a medio de elongación de brotes MESH10 (MS, 0.5 gm/l de MES, 10 mg/l de Herbiace, Carbenicilina, Timentina) durante 2-4 semanas. Los brotes alongados se cultivan para inducción de las raíces en MSI.1 (MS con 0.1 mg/l de ácido indolbutírico). Una vez que las plantas tenían un sistema de raíces bien establecido, se las transplantó al suelo. Se aclimataron las plantas en condiciones de ambiente controlado en el Conviron durante 1-2 semanas antes de transferir al invernadero. Las plantas T0 transformadas se auto-polinizaron en el invernadero para obtener semillas T1. Las plantas T0 y la progenie T1 se asperjaron con un intervalo de concentraciones de herbicida para establecer el nivel de protection realizado por el gen AAD-1 (v3). 26.2 - "Análisis molecular": materiales y métodos de la cañóla 26.2.1 - Aislamiento de ADN y cuantificación de cosecha de tejido. Se colocó tejido fresco en tubos y se liofilizó a 4°C durante 2 días. Luego de que el tejido estuvo completamente seco, se colocó una perla de tungsteno (Valenite) en el tubo y se sometió a las muestras a 1 minuto de molienda por secado usando un molino de perlas Kelco. Luego se siguió el procedimiento estándar DNeasy de aislamiento de ADN (Qiagen, DNeasy 69109). Una alícuota del ADN extraído se tiñó luego con Pico Green (Molecular Probes P7589) y se leyó en el fluorómetro (BioTek) con estándares conocidos para obtener la concentración en ng/ul. 26.2.2 - Reacción en cadena de la polimerasa. Se usó un total de 100 ng de ADN total como patrón. Se usó 20 mM de cada iniciador con el equipo Takara Ex Taq PCR Polymerase (Mirus TAKRR001A). Los iniciadores para PCR de la región codificadora AAD-1 (v3) fueron (Delantero -ATGGCTCATG CTGCCCTCAGCC) (SEQ ID NO: 27) y (Reverso -CGGGCAGGCCTAACTCCACCAA) (SEQ ID NO: 28). La reacción por PCR se llevó a cabo en el termociclizador 9700 Geneamp (Applied Biosystems), sometiendo las muestras a 94°C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos, y 72°C durante 2 minutos seguido de 72°C durante 10 minutos. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1 % teñido con EtBr. 35 muestras de 35 plants con eventos AAD-1 (v3) arrojaron resultados positivos. Tres muestras de control Negativo dieron resultado negativo. 26.3 - ELISA. Usando ELISA establecido descrito en la sección anterior, se detectó la proteína AAD-1 en 10 eventos de transformación de cañóla diferentes. Los niveles de expresión variaron desde 150 hasta más de 1000 ppm de proteína soluble total (TSP). Se evaluaron tres muestras de callo no transformados diferentes en paralelo con escasa señal detectada, indicando que los anticuerpos usados en el ensayo tienen reactividad cruzada mínima con la matriz celular de la cañóla. En el cuadro 38 se presenta un resumen de los resultados.

CUADRO 38 Referencias Adang, M.J., M.J. Staver, T.A. Rocheleau, J. Leighton, R.F. Barker, y D.V. Thompson. 1985. Characterized full-length and truncated plasmid clones of the crystal protein de Bacillus thuringiensis subsp kurstaki HD-73 and their toxicity to Manduca sexta. Gene 36: 289-300. Agriliance Crop Protection Guide. 2003. Agriliance, LLC. St Paul, MN. 588 p. Altschul, S. F., W. Gish, W. Miller, E. W. Myers y D.J. Lipman. 1990. Basic local alighment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410. Altschul, S. F., T.L. Madden, A.A. Schaffer, J. Zhang, Z, Zhang, W. Miller y D.J. Lipman. 1997. Gapped BLAST and PSIBLAST: a new generación of protein databasesearch programs. Nucí. Acids Res. 25: 3389-3402. An, G., B.D. Watson, S. Stachel, M.P. Gordon, E. W. Nester. 1985. New cloning vehicles for transformation of higher plants. EMBO J. 4: 277-284. Armstrong C.L., CE. Green, R.L. Phillips. 1991. Development and availability of germplasm with high Type ll culture formation response. Maize Genet Coop News Lett 65: 92-93.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una célula de planta transgénica que comprende un polinucleótido que codifica una proteína AAD-1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 9 y una variante de la SEQ ID NO: 9, teniendo dicha variante tiene actividad de ariloxialcanoato dioxigenasa, por lo menos una supresión o sustitución conservada de aminoácido, y por lo menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9.

2.- La célula de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha célula de planta se selecciona de células dicotiledóneas y células monocotiledóneas.

3.- La célula de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque dicha célula de planta es dicotiledónea y se selecciona de una célula de algodón, una célula de tabaco, una célula de cañóla, una célula de soja, y una célula de Arabidopsis.

4.- La célula de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque dicha célula de planta es una célula monocotiledónea seleccionada de una célula de arroz y una célula de maíz.

5.- Una planta transgénica que comprende una pluralidad de células de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la expresión de dicho polinucleótido torna dichas células tolerantes a un herbicida de ariloxialcanoato.

6.- La planta de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicho herbicida es un herbicida fenoxi auxínico.

7.- La planta de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicho herbicida se selecciona de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, MCPA, diclorprop y mecoprop.

8.- La planta de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicho herbicida es un ariloxi fenoxipropionato.

9.- La planta de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicho herbicida se selecciona de fluazifop, haloxifop, diclofop, quizalofop, fenoxaprop, metamifop, cihalofop y clodinofop.

10.- La planta de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque la expresión de dicho polinucleótido toma dicha planta resistente tanto a un herbicida fenoxi auxínico como a un herbicida de ariloxi fenoxipropionato.

11.- La planta de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicha planta comprende además un segundo gen de resistencia al herbicida.

12.- La planta de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque dicho segundo gen de resistencia a los herbicidas torna dicha planta resistente a un herbicida seleccionado de glifosato, glufosinato, inhibidores de ALS, inhibidores de 4-hidroxifenil- piruvato-dioxigenasa (HPPD) e inhibidores de protoporfirinógeno oxidasa (PPO).

13.- Un método para controlar al menos una maleza en un campo, en donde dicho campo contiene una planta de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho método comprende aplicar a dicho campo un primer herbicida seleccionado de un herbicida fenoxi auxínico y un herbicida tipo ariloxifenoxipropionato.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho herbicida es un enantiómero R de una fenoxi auxina quiral.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho herbicida se selecciona de R-diclorprop y mecoprop.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho herbicida es una fenoxi auxina aquiral.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho herbicida se selecciona de 2,4-D y MCPA.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho primer herbicida es un ariloxifenoxipropionato y dicha planta es una monocotiledónea.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque dicha monocotiledónea se selecciona de maíz, arroz, trigo, cebada, centeno, césped, avena, sorgo y pastos.

20.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho primer herbicida es una fenoxi auxina y dicha planta es una dicotiledónea.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dicha dicotiledónea se selecciona del grupo que consiste de algodón, tabaco, cañóla, y soja.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho método comprende aplicar un segundo herbicida

23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicho primer herbicida y dicho segundo herbicida se aplican en forma secuencial.

24.- El método de conformidad con ia reivindicación 22, caracterizado además porque dicho primer herbicida y dicho segundo herbicida se aplican concurrentemente.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicho primer herbicida es una fenoxi auxina y el segundo herbicida es un ariloxifenoxipropionato.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicha planta es resistente al glifosato.

27.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho enantiómero R es un componente de una mezcla racémica.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicha planta comprende además un segundo gen de resistencia a los herbicidas que torna dicha planta resistente a dicho segundo herbicida.

29.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque dicho segundo herbicida se selecciona de un inhibidor de ALS (acetolactato sintasa) y dicho segundo gen se selecciona de AHAS modificado, SurA, SurB, Csr1 , Csr1-1 y Csr1-2; glifosato y dicho segundo gen se selecciona de un EPSPS modificado (tolerancia al glifosato, 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa), GOX y GAT; y glufosinato y dicho segundo gen se selecciona de PAT (fosfinotricin-N-acetiltransferasa), bar, y una enzima que degrada dicamba.

30.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque dicho segundo herbicida se selecciona de glifosato, glufosinato, dicamba, inhibidores de acetolactato sintasa, inhibidores de protoporfirinógeno oxidasa, e inhibidores de hidroxifenil-piruvatodioxigenasa.

31.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicho segundo herbicida es un inhibidor de acetolactato sintasa seleccionado a partir del grupo que consiste de herbicidas tipo imidazilinonas, sulfonil ureas y triazolopirimidina.

32.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque dicho segundo herbicida es una imidazilinona seleccionada a partir del grupo que consiste de imazamox, imazetapir, imazaquin e imazapic.

33.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque dicho primer herbicida es una fenoxi auxina y dicho segundo herbicida se selecciona a partir def grupo que consiste de glifosato y glufosinato.

34.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicha fenoxi auxina es 2,4-D y dicho segundo herbicida es glifosato.

35.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque dicho primer herbicida es un ariloxifenoxipropionato y dicho segundo herbicida es glifosato.

36.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque dicho primer herbicida se selecciona a partir del grupo que consiste de quizalofop, haloxifop y cihalofop.

37.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque dicho segundo herbicida es una sulfonil urea seleccionada a partir del grupo que consiste de amidosulfuron, bensulfuron, clorimuron, clorsulfuron, cinosulfuron, flupirsulfuron, foramsulfuron, halosulfuron, nicosulfuron, primisulfuron, prosulfuron, rimsulfuron, sulfometuron, sulfosulfuron, tifensulfuron, triasulfuron, trifloxisulfuron y triflusulfuron.

38.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque dicho método comprende además aplicar un tercer herbicida.

39.- El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque dichos herbicidas son 2,4-D, quizalofop y glufosinato.

40.- Un método para controlar malezas en un campo, en donde dicho método comprende aplicar un primer herbicida a dicho campo y plantar una semilla en dicho campo dentro de los 14 días de aplicación de dicho primer herbicida, en donde dicha semilla comprende una célula de conformidad con la reivindicación 1 , y en donde dicho primer herbicida se selecciona a partir del grupo que consiste de una fenoxi auxina y un ariloxifenoxipropionato.

41.- El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque dicho primer herbicida es un ácido, una sal inorgánica, una sal orgánica, un éster, un isómero R-enantioespecífico o un componente de una mezcla racémica.

42.- El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque dicha semilla comprende un segundo gen que torna dicha planta resistente a un segundo herbicida, y dicho método comprende además aplicar dicho segundo herbicida a dicho campo antes de dicha plantación.

43.- El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque dicho segundo herbicida se selecciona a partir del grupo que consiste de glifosato, gramoxona y glufosinato

44.- Un polinucleótido optimizado para la expresión en una planta, en donde dicho polinucleótido codifica una proteína que tiene actividad de ariloxialcanoato dioxigenasa, en donde una molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína se hibrida bajo condiciones rigurosas con el complemento completo de una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.

45.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque dicho polinucleótido está optimizado para la expresión en una planta dicotiledónea o una planta monocotiiedónea.

46.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque dicho polinucleótido comprende SEQ ID NO: 5.

47.- Un polinucleótido aislado que codifica una proteína que degrada enzimáticamente un herbicida seleccionado a partir del grupo que consiste de una fenoxi auxina y un ariloxifenoxipropionato, en donde una molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína hibrida bajo condiciones rigurosas con el complemento completo de una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, en donde dicho polinucleótido está operativamente unido a un promotor que es funcional en una célula de planta.

48.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado además porque dicho promotor es un promotor de planta.

49.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado además porque dicho promotor es un promotor del virus del mosaico de la vena de la cassava.

50.- Un método para seleccionar una célula de planta transformada, en donde dicho método comprende someter a una pluralidad de células de planta a transformación con un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 44 ó 47 y cultivar dichas células en una concentración de un herbicida que permita que las células transformadas que expresan dicho polinucleótido crezcan mientras que mata o inhibe el crecimiento de células no transformadas, en donde dicho herbicida se selecciona a partir del grupo que consiste de una fenoxi auxina y un ariloxifenoxialcanoato.

51.- Él método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque dichas células son células de una planta y dicho método se usa para seleccionar una planta transformada.

52.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 47 ó 50, caracterizado además porque dicho polinucleótido se usa como marcador seleccionable en el método de conformidad con la reivindicación 50.

53.- El método para detectar si una planta comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 47 ó 50, caracterizado además porque dicho método comprende recolectar una muestra de dicha planta y analizar dicha muestra para determinar la presencia de dicho polinucleótido.

54.- El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque dicho método comprende analizar dicha muestra para determinar la presencia de una proteína codificada por dicho polinucleótido.

55.- El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque dicho método comprende usar un iniciador o sonda de PCR para detectar la presencia de dicho polinucieótido.

56.- El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque dicho método comprende usar un anticuerpo para detectar la presencia de dicha proteína.

57.- Una semilla que comprende una célula de planta de conformidad con la reivindicación 1.

58.- Una planta desarrollada a partir de la semilla de conformidad con la reivindicación 57.

59.- Una parte, progenie o propagado asexual de la planta de conformidad con la reivindicación 5.

60.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho método se usa para tratar o prevenir malezas resistentes a herbicida.

61.- La planta de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicha planta comprende además un gen de resistencia a los insectos derivado a partir de un organismo seleccionado a partir del grupo que consiste de Bacillus thuringiensis, Photorhabdus y Xenorhabdus.

62.- La planta de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicha planta comprende además un gen para un rasgo agronómico seleccionado a partir del grupo que consiste de resistencia a los hongos, tolerancia al estrés, mayor rendimiento, perfil mejorado de aceite, mejor calidad de fibra, resistencia viral, maduración tardía, tolerancia al frío y tolerancia a las sales.

63.- Un método para conferir resistencia al herbicida 2,4-D a un cultivo en donde dicho método comprende introducir dentro de al menos una célula de planta de dicho cultivo un ácido nucleico que codifica una enzima que tiene actividad ariloxialcanoato dioxigenasa R-específica en relación con un herbicida 2,4-D.

64.- Un método para controlar a las malezas resistentes a glifosato en un campo de plantas de cultivo tolerantes a glifosato, en donde dichas plantas comprenden un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 47, y dicho método comprende aplicar una herbicida ariloxialcanoato a al menos una porción de dicho campo.

65.- El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado además porque dicho herbicida es una fenoxi auxina.

66.- El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado además porque dicho herbicida es un ariloxi fenoxipropionato.

67.- El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado además porque dichas plantas son dicotiledóneas.

68.- El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado además porque dichas plantas son monocotiledóneas. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee nuevas plantas que son no sólo resistentes al 2,4-D y otros herbicidas fenoxi auxínicos, sino también a los herbicidas de ariloxifenoxipropionato; hasta ahora, no había expectativas o sugerencia de que una planta con ambas propiedades ventajosas pudiera producirse por la introducción de un gen único; la presente invención incluye, también, plantas que producen una o más enzimas de la presente invención solas o "apiladas" junto con otro gen de resistencia a los herbicidas, con preferencia un gen de resistencia al glifosato, para proveer un control más amplio y más robusto de ias malezas, mayor flexibilidad al tratamiento, y mejores opciones de manejo de la resistencia a los herbicidas; más específicamente, las enzimas y los genes preferidos para usar de acuerdo con la presente invención se denominan aquí genes y proteínas AAD (ariloxialcanoato dioxigenasa); no se ha informado anteriormente ninguna enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato que tenga la capacidad de degradar los herbicidas de diferentes clases químicas y modos de acción; este descubrimiento altamente novedoso es la base de significativas oportunidades de rasgos de los cultivos tolerantes a los herbicidas como así también el desarrollo de una tecnología de marcadores seleccionables; la presente invención también incluye métodos relacionados para controlar malezas; la presente invención permite nuevas combinaciones de herbicidas para usar de nuevas maneras; además, la presente invención provee nuevos métodos para prevenir la formación de, y controlar, malezas que son resistentes (o naturalmente más tolerantes) a uno o más herbicidas tales como el glifosato. MA/cgt* P06/1904F