TW201410148A - 促進２，４－ｄ抗性作物產量的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於用以改良作物的植株高度及/或產量的方法，該作物藉由使用2,4-D以對植物無害的施用率處理該植物而對除草劑2,4-D有抗性。特別地，所提供一種的方法係使用2,4-D施用以增加表現對2,4-D抗性之AAD-12基因的作物植物的產量。所提供的方法特別有興趣用於處理的作物包括玉米、大豆、春油菜及冬油菜(油菜)、甜菜、小麥、向日葵；大麥及稻米。

Description

促進2,4-D抗性作物產量的方法 相關申請案之交叉參考
本申請案主張2012年7月7日申請之美國臨時申請案第61/656,546號之優先權，其揭示內容以參考方式全體併入本文。
電子方式檢送參考資料的併入
該參考資料是以參考方式全體併入本文者為與本文同時檢送之電腦可讀式序列表且標示為：一11,342位元ASCII(內文)檔案名稱”72747_ST25.txt”，建檔於2013年5月13日。
本發明係關於一種用以改良作物的植株高度及/或產量的方法，該作物藉由使用2,4-D以對植物無害的施用率處理該植物而對除草劑2,4-D有抗性。特別地，所提供之一種方法係使用2,4-D施用以增加表現對2,4-D抗性之AAD-12基因的作物的產量。
雜草可快速地燒盡(burndown)作物與其他所欲植物所需要的泥土的有價值營養成分。目前有許多不同型式的除草劑用於防治雜草。一個極端常見的除草劑為嘉磷塞(glyphosate)。
作物，如玉米、大豆、油菜、棉花、甜菜、小麥、草皮及稻米，已開發對嘉磷塞之抗性株。因此，具有活性生長嘉磷塞抗性玉米的田間，例如可噴灑嘉磷塞以防治雜草而不顯著損傷玉米植物。
於1990年代中期利用遺傳工程的導入，嘉磷塞耐受作物(glyphosate tolerant crop,GTC)，使培育者能以簡單、便利、彈性、及不昂貴的工具防治於廣譜的闊葉雜草與禾科雜草而於農業上無與倫比。結果，生產者快速的接受GTC且於許多情況下放棄許多已接受的最佳農藝操作如作物輪替、除草作用模式輪替、槽混合、利用化學的機械併入與培養雜草防治。同時，嘉磷塞耐受大豆、棉花、玉米及油菜於西半球的美國及其他地區商品化。更多的GTC(例如小麥、稻米、甜菜、草皮等)蓄勢用以導入懸而未決的全球市場的可接受度。許多其他嘉磷塞耐性物種處於試驗至開發階段(例如苜蓿、甘蔗、向日葵、甜菜、豌豆、紅蘿蔔、黃瓜、蘿蔓、洋蔥、草莓、番茄及菸草；林業物種如白楊屬及楓香屬；及園藝物種如萬壽菊、矮牽牛及秋海棠；參照“isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm,2005”網頁)。此外，近年來嘉磷塞的價格已大幅降低至顯示少數傳統雜草防治方案可有效地在價格與效能上與嘉磷塞GTC系統競爭。
嘉磷塞已成功使用於燒盡及其他非作物區，以用於全植物防治持續超過15年。於許多情況中，至於利用GTC，嘉磷塞已每年使用1至3次持續3、5、10直至15年。這些情勢已導致過度倚賴於嘉磷塞與GTC技術且對於植物在天然雜草物種加諸沉重的選擇壓力，該等植物對嘉磷塞為天然地更為耐受或該等植 物已發展出阻抗嘉磷塞除草活性的機制。
單僅嘉磷塞雜草防治方案的廣泛使用造成嘉磷塞抗性雜草的選擇性，且對於雜草物種繼代係選擇遺傳上較大多數標靶物種對於嘉磷塞更為耐受者(亦即，雜草移位)(Ng等，2003；Simarmata等，2003；Lorraine-Colwill等，2003；Sfiligoj,2004；Miller等，2003；Heap,2005；Murphy等，2002；Martin等，2002.)。雖然嘉磷塞於全球廣泛使用已超過15年，但僅有少數雜草已被報導發展出對嘉磷塞的抗性(Heap,2005)；然而，其多數已於過去的3至5中被鑑定。抗性雜草包括禾本及闊葉種一硬直黑麥草(Lolium rigidum)、多花黑麥草(Lolium multiflorum)、牛筋草(Eleusine indica)、豬草(Ambrosia artemisiifolia)、小蓬草(Conyza Canadensis)、美洲假蓬(Conyza bonariensis)及長葉車前草(Plantago lanceolata)。此外，先前已知於廣泛使用GTC之前不成為農藝問題的雜草，於GTC的背景下目前正變成更為普遍且更難以調控，其包含>80%的美國棉花及大豆耕地以及>20%的美國玉米耕地(Gianessi,2005)。這些雜草移位發生主要為(但不排除)難以調控之闊葉雜草。某些實例包括牽牛屬(Ipomoea)、莧屬(Amaranthus)、藜屬(Chenopodium)、蒲公英屬(Taraxacum)及圓葉鴨拓草屬(Commelina)物種。
於種植者面臨嘉磷塞抗性雜草或移位至更難以調控的雜草物種的區域中，種植者可藉由與調控錯失的雜草的其他除草劑藉由槽混合或槽改變而補足對於嘉磷塞的弱點。對於再許多情況中已用於調控闊葉逃脫者的一種普遍且有效的槽混合夥伴為2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)。2,4-D已於農藝上使用且於非作物環境對於廣譜、闊葉雜草調控超過60年。已有報導更有耐受性的物 種的個案，但2,4-D仍為全球像最廣為使用的除草劑之一。使用2,4-D的進一步限制為於例如大豆或棉花之雙子葉作物中的選擇性非常低，且因此2,4-D典型地不使用於(且通常不接近)於敏感雙子葉作物。此外，2,4-D於禾本作物的使擁有些受到可能發生的作物損傷的本質性所限制。於種植不整地栽培(no-till)的大豆及棉花之前已使用2,4-D與嘉磷塞組合以提供更強力的燒盡處理；然而，由於這些雙子葉物種對於2,4-D的敏感性，這些燒進處理必須於種植前14至30日發生(Agriliance,2003)。
2,4-D為苯氧基酸類型的除草劑，如同MCPA。2,4-D已使用於許多單子葉作物(如玉米、小麥及稻米)針對闊葉雜草的敏感性調控而不嚴重傷害所期望的作物。2,4-D為合成的生長素衍生物，其可作用為向下調控正常細胞-荷爾蒙恆定狀態及阻礙平衡、調控生長；然而，作用的確切模式仍然未知。三氯比(triclopyr)及氟氧比(fluroxypyr)為吡啶基氧基乙酸除草劑，其作用模式也如同合成性生長素。
該等除草劑對於某些植物具有不同程度的敏感性(例如，雙子葉較禾本更為敏感)。由不同值物的不同代謝為敏感性遲動變化的一個解釋。一般而言，植物代謝2,4-D非常緩慢，因此改變對於2,4-D的植物回應似乎可以藉由於標靶位點的不同活性予以解明(WSSA,2002)。2,4-D的植物代謝典型地經由二相代謝而發生，典型地為羥化接著與胺基酸或葡萄糖接合(WSSA,2002)。
歷時經過，微生物族群已發展出降解此特定外來抗生素的替代及有效的途徑，其造成2,4-D的完全代謝。選擇對於 微生物之除草劑的後續施用可利用除草劑作為生長用的碳源，提供該些者於土壤中的競爭優勢。為此理由，2,4-D目前經調配為具有相對短的土壤半衰期，且遭遇到對於後續作物沒有顯著的遞送效果。此增加2,4-D的除草利用性。
已經對於其降解2,4-D的能力進行強地研究的有機體為羅爾斯頓菌(Ralstonia eutropha)(Streber等，1987)。編碼礦化途徑(mineralization pathway)中第一個酵素步驟的基因為tfdA。參照美國專利第6,153,401號及GENBANK讀取編號M16730。TfdA經由α-酮基戊二酸二氧酶反應催化2,4-D為二氯酚(DCP)的轉化(Smejkal等，2001)。相較於2,4-D，DCP具有低的除草劑活性。TfdA已經使用於基因轉殖植物，以於正常對於2,4-D為敏感的雙子葉植物(例如，棉花與煙草)中賦予2,4-D抗性(Streber等(1989)、Lyon等(1989)、Lyon(1993)及美國專利第5,608,147號)。
已經由環境中檢定出許多數目的編碼能降解2,4-D的蛋白質的tfdA-型基因且存放於Genbank資料庫。許多同源物類似於tfdA(>85%胺基酸同一性)，且具有類似於tfdA的酵素性質。然而，有許多具有與tfdA(25至50%)為顯著較低同一性的同源物，但仍具有與α-酮基戊二酸二氧酶Fe+2二氧酶相關的特性殘基。因此該等多歧的二氧酶的基質特異性非顯而易見。
一個對tfdA(31%胺基酸同一性)具有低同源性的獨特實例為來自代爾夫特食酸菌(Delftia acidovorans)的sdpA(Kohler等，1999,Westendorf等，2002,Westendorf等，2003)。此酵素已顯示催化(S)-滴丙酸(及其他(S)-苯氧基丙酸類)以及2,4-D(苯氧基乙酸)礦化的第一步驟(Westendorf等，2003)。此基因進入植物的轉 形，目前尚未被報導。
新的除草劑-耐受性作物(HTC)技術的開發由於GTC大幅的有效性、低價及便利性而成功的受到限制。接著，於製造者中發生對於GTC非常高比率的吸收。此對於發展新的HTC技術創造低的激勵性。
芳基氧基烷酸酯化學結構為包括苯氧基乙酸生長素(如2,4-D及滴丙酸)、吡啶基氧基乙酸生長素(如氟氧比及三氯比)、醯氧基苯氧基丙酸(AOPP)、乙醯基-輔酶A羧化酶(ACCase)抑制劑(如吡氟氯禾草靈(haloxyfop)、喹禾草靈(quizalofop)及禾草靈(diclofop))及5-取代苯氧基乙酸原卟啉原氧化酶(protoporphyrinogen oxidase)IX抑制劑(如吡草醚(pyraflufen)及氟烯草酸(flumiclorac))之許多市售除草劑的共通部份。然而，該等種類之除草劑皆為相當不同，且於目前文獻中對於該等化學類型間沒有證據存在共通降解途徑。對於降解涵蓋多作用模式的除草劑的多功能酵素已被揭示(PCT US/2005/014737；申請於May 2,2005)。
本發明係關於藉由以對植物沒有害的施用比率以2,4-D處理對除草劑2,4-D有抗性的植物，而改良植株高度及/或作物產量的方法。特別地，本發明提供一種使用2,4-D施用以增加對於2,4-D抗性表現AAD-12基因的作物產量的方法。本發明進一步相關於使用2,4-D以改良2,4-D抗性作物產量的方法。所提供的方法特別有興趣於處理作物，包括玉米、大豆、春油菜及冬油菜(油菜籽)、甘蔗、小麥、向日葵、大麥及稻米。
某些具體例中，2,4-D抗性作物為經以芳基氧基烷酸 酯二氧酶(AAD)轉形之基因轉殖作物。進一步的具體例中，該芳基氧基烷酸酯二氧酶(AAD)為AAD-1或AAD-12。AAD-1已揭示於先前技術之美國專利US 2009/0093366，以及AAD-12已揭示於先前技術WO2007/053482，其全部內容以參考方式併入本文。
2,4-D處理的產量改良效果可於25g ae/ha至5000g/ha或100g ae/ha至2500g ae/ha，或特別於1000g ae/ha至2000g ae/ha的施用比率觀察到。一具體例中，使用1000g ae/ha至1500g ae/ha的2,4-D。另一具體例中，使用2000g ae/ha至2500g ae/ha。此外，當2,4-D施用於開花前的植物2-至8-葉階段時，特別宣稱2,4-D處理的產量改良效果為D。然而，需要作物的施用比率及/或葉階段變化作為植物、其高度及氣候條件的函數。
產量增加的量意指植物生長產量多達50%或更多。一具體例中，產量增加至少10%。另一具體例中，產量增加至少20%。另一具體例中，產量增加10%至60%。另一具體例中，產量增加20%至50%。另一具體例中，產量增加為統計上顯著的。2,4-D對2,4-D抗性作物的生長增強活性可於田間試驗或盆中試驗量測。具有不同作用模式之除草劑一般習知為對產量具有副作用或對產量無效果。
一態樣中，提供一種改良2,4-D抗性作物產量的方法，該方法包含以刺激量之包含芳基氧基烷酸酯部分的除草劑處理該植物。
一具體例中，2,4-D抗性作物為經以芳基氧基烷酸酯二氧酶(AAD)轉形之基因轉殖植物。進一步的具體例中，該芳基氧基烷酸酯二氧酶(AAD)為AAD-1或AAD-12。另一具體例中，包 含芳基氧基烷酸酯部分的除草劑為苯氧基除草劑或苯氧基乙酸除草劑。進一步的具體例中，包含芳基氧基烷酸酯部分的除草劑為2,4-D。進一步的具體例中，該2,4-D包含2,4-D膽鹼或2,4-D二甲基胺(DMA)。
一具體例中，經以芳基氧基烷酸酯二氧酶(AAD)轉形之基因轉殖植物係選自棉花、大豆及油菜籽。另一具體例中，該處理係以如同應用於對照雜草的2,4-D施用比率實施至少一次。另一具體例中，該處理係以如同應用於對照雜草的2,4-D施用比率至少實施二次。進一步的具體例中，2,4-D係於具有2,4-D耐受性大豆的V3及R2生長階段施用。另一具體例中，該處理係以如同應用於對照雜草的2,4-D施用比率實施至少三次。另一具體例中，該包含芳基氧基烷酸酯部分的除草劑經由根部吸收到該達2,4-D抗性作物。
另一具體例中，該2,4-D抗性作物也以不同於對照雜草的2,4-D的除草劑處理。進一步的具體例中，該不同於2,4-D的除草劑為磷除草劑或芳基氧基苯氧基丙酸除草劑。進一步的具體例中，該磷除草劑包含嘉磷塞、草丁膦、其衍生物或其組合。進一步的具體例中，該磷除草劑形式為銨鹽、異丙基銨鹽、異丙基胺鹽或鉀鹽。另一具體例中，該磷除草劑經由根部吸收到達該2,4-D抗性作物。另一具體例中，該芳基氧基苯氧基丙酸除草劑包含比氯禾草靈(chlorazifop)、噁唑禾草靈(fenoxaprop)、吡氟禾草靈(fluazifop)、吡氟氯禾草靈(haloxyfop)、喹禾草靈(quizalofop)、其等之衍生物、或其組合。進一步的具體例中，該芳基氧基苯氧基丙酸除草劑經由根部吸收到達該2,4-D抗性作物。
一具體例中，該2,4-D抗性作物係以25g ae/ha至5000g ae/ha 2,4-D處理至少一次。另一具體例中，該2,4-D抗性作物係以100g ae/ha至2000g ae/ha 2,4-D處理至少一次。另一具體例中，該2,4-D抗性作物係以100g ae/ha至2500g ae/ha 2,4-D處理至少一次。另一具體例中，該2,4-D抗性作物係以1000g ae/ha至2000g ae/ha 2,4-D處理至少一次。進一步的具體例中，該2,4-D包含2,4-D膽鹼或2,4-D二甲基胺(DMA)。
一具體例中，提供一種改良2,4-D抗性作物產量的方法。該方法包含：(a)以包含編碼芳基氧基烷酸酯二氧酶(AAD)的核苷酸序列的核酸分子轉形植物細胞；(b)選擇轉形細胞；(c)由轉形細胞再生植物；以及(d)以刺激量之包含芳基氧基烷酸酯部分的除草劑處理該植物。
一具體例中，該芳基氧基烷酸酯二氧酶(AAD)為AAD-1或AAD-12。另一具體例中，該核酸分子包含不為芳基氧基烷酸酯二氧酶(AAD)之可選擇標記。進一步的具體例或替代的具體例中，該可選擇標記為草胺膦乙醯轉移酶(phosphinothricin acetyltransferase)基因(pat)或畢拉草(bialaphos)抗性基因(bar)。另一具體例中，該核酸分子係經植物最適化。
另一態樣中，提供一種包含芳基氧基烷酸酯部分的除草劑於製造相較於其非基因轉殖親代植物具有增加產量的具有2,4-D抗性的基因轉殖植物的用途。一具體例中，該包含芳基氧基 烷酸酯部分的除草劑為2,4-D。進一步的具體例中，該2,4-D係以25g ae/ha至5000g/ha 2,4-D施用至少一次。另一具體例中，該2,4-D係以100g ae/ha至2000g ae/ha 2,4-D施用至少一次。另一具體例中，該2,4-D係以100g ae/ha至2500g ae/ha 2,4-D施用至少一次。另一具體例中，該2,4-D係以1000g ae/ha至2000g ae/ha 2,4-D施用至少一次。進一步的具體例中，該2,4-D包含2,4-D膽鹼或2,4-D二甲基胺(DMA)。進一步的具體例中，該2,4-D抗性作物係於開花前以2,4-D處理至少二次。另一具體例中，該2,4-D抗性作物係經以芳基氧基烷酸酯二氧酶(AAD)轉形之基因轉殖植物。進一步的具體例中，該芳基氧基烷酸酯二氧酶(AAD)為AAD-1或AAD-12。
序列編號：1為來自代爾夫特食酸菌(Delftia acidovorans)的AAD-12的核苷酸序列。
序列編號：2為序列編號：1所編碼之轉譯蛋白質序列。
序列編號：3為AAD-12(v1)之植物最適化核苷酸序列。
序列編號：4為序列編號：3所編碼之轉譯蛋白質序列。
序列編號：5為AAD-12(v1)之大腸桿菌(E.coli)最適 化核苷酸序列。
序列編號：6為M13前置引子序列。
序列編號：7為M13反置引子序列。
序列編號：8為前置AAD-12(v1)PTU引子序列。
序列編號：9為反置AAD-12(v1)PTU引子序列。
序列編號：10為編碼PCR引子之前置AAD-12(v1)序列。
序列編號：11為編碼PCR引子之反置AAD-12(v1)序列。
序列編號：12顯示“sdpacodF”AAD-12(v1)引子序列。
序列編號：13顯示“sdpacodR”AAD-12(v1)引子序列。
序列編號：14顯示“Nco1 of Brady”引子序列。
序列編號：15顯示“Sac1 of Brady”引子序列。
第1圖說明本發明之AA-12酵素予以催化之一般化學反應。
第2圖顯示質體pDAB4468的代表圖譜。
第3圖顯示質體pDAS1740的代表圖譜。
如使用於本文，詞語“經轉形”或“轉形”意指DNA導入至細胞。詞語“轉形株”或“基因轉殖”意指已經轉形或已進行轉形步驟的植物細胞等。所導入的DNA通常以含有DNA插入片的載體形式使用。
如使用於本文，詞語“可選擇標記”或“可選擇標記基因”意指視需要使用於植物轉形的基因，例如，用以保護植物細胞免於選擇藥劑的傷害或對選擇藥劑提供抗性/耐受性。僅有接受功能性可選擇標記的細胞或植物能於具有選擇性藥劑的條件 下分裂或生長。選擇性藥劑的實例可包括，例如，抗生素包括大觀黴素、新黴素、卡那黴素、巴龍姆黴素、健他黴素及潮黴素。該些可選擇標記包括用於新黴素磷酸轉移酶(npt II)的基因，其表現賦予對於抗生素卡那黴素的抗性的酵素，以及用於相關抗生素新黴素、巴羅姆黴素、健他黴素及G418的基因，或用於潮黴素磷酸轉移酶(hpt)的基因，其表現授予對於潮黴素的抗性的酵素。其他可選擇標記基因可包括編碼除草劑抗性的基因，包括Bar(抗性對抗避免支鏈胺基酸合成的第一步驟的BASTA®(草磷銨(glufosinate ammonium)、或草胺膦(PPT))、乙醯乳酸合成酶(ALS，對抗抑制劑如磺醯基脲(SU)、咪唑啉酮(IMI)、三唑并嘧啶(TP)、嘧啶氧基苯甲酸酯(POB)及磺醯基胺基羰基三唑啉酮的抗性)、嘉磷塞、2,4-D及金屬抗性或敏感性。詞語“標記-陽性”意指經轉形為包括可選擇標記基因的植物。
多種可選擇或可偵測表標記可併入所選擇的表現載體而允許鑑定及選擇轉形植物或轉形株。有許多方法可用以確認轉形植物中選擇標記的表現，包括例如DNA定序及PCR(聚合酶鏈鎖反應)、南方墨點、RNA墨點、免疫學方法用，以偵測由載體所表現的蛋白質，如，涉及草胺膦抗性的沉澱蛋白質，或其他蛋白質如受體基因β-葡萄糖醛酸酶(GUS)、螢光素酶(luciferase)、綠色螢光蛋白質(GFP)、DsRed、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)、鹼性磷酸酶等(參照Sambrook，等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor Press,N.Y.,2001，其全部內容以參考方式併入本文)。
利用可選擇標記基因選擇轉形細胞或組織。可選擇 標記基因包括編碼抗生素抗性的基因，如編碼新黴素磷酸轉移酶II(NEO)與潮黴素磷酸轉移酶(HPT)的基因，以及授予對除草劑化合物的抗性的基因。除草劑抗性基因通常編碼對除草劑為不敏感的經修飾目標蛋白質或於植物中於除草劑可作用前降解或去毒性化的酵素。參照DeBlock等(1987)EMBO J.,6：2513-2518；DeBlock等(1989)Plant Physiol.,91：691-704；Fromm等(1990)8：833-839；Gordon-Kamm等(1990)2：603-618)。例如，對於嘉磷塞或磺醯基脲除草劑的抗性已藉由使用編碼突變目標酵素(5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)及乙醯乳酸合成酶(ALS)的基因獲得。對於草丁膦、溴苯腈(bromoxynil)及2,4-二氯苯氧基乙酸酯(2,4-D)的抗性已藉由使用編碼使各別的除草劑去毒性化的草胺膦乙醯轉移酶、腈化酶或2,4-二氯苯氧基乙酸酯單氧酶的基因獲得。2,4-D抗性的酵素/基因已揭示於先前技術US 2009/0093366及WO 2007/053482，其內容以參考方式併入本文。
其他除草劑可抑制生長點或分裂組織，包括咪唑啉酮或磺醯基脲。此領域中編碼所述之突變ALS及AHAS酵素的例示性基因，例如，分別為Lee等，EMBO J.7：1241(1988)；和Miki等，Theon.Appl.Genet.80：449(1990)。
嘉磷塞抗性基因分別包括突變5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPs)基因(經由導入重組核酸及/或各種形式的原始EPSP基因的活體內突變)、aroA基因及嘉磷塞乙醯轉移酶(GAT)基因。對於包括草丁膦(來自鏈黴菌屬的草胺膦乙醯轉移酶(PAT)基因，鏈黴菌包括吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)及綠色產色鏈黴菌(Streptomyces viridichromogenes))及吡啶養基或苯氧基 丙酸及環己酮(ACCase抑制劑編碼基因)之其他膦醯基化合物的抗性基因，參照，例如美國專利第4,940,835號授予Shah，等及美國專利第6,248,876號授予Barry等，其揭示可對植物賦予嘉磷塞抗性的EPSP形式的核甘酸序列。編碼aroA基因的DNA分子可於ATCC讀取編號39256獲得，以及該突變基因序列揭示於美國專利第4,769,061號授予Comai、歐洲專利申請案第0 333 033號授予Kumada等，及美國專利第4,975,374號授予Goodman等，揭示賦予對如L-草胺膦之除草劑的抗性的麩胺醯胺合成酶基因的核甘酸序列。PAT基因的核甘酸序列係提供於歐洲申請案第0 242 246號授予Leemans等。再者，DeGreef等，Bio/Technology 7：61(1989)，揭示表現編碼PAST活性之嵌合性bar基因的基因轉殖植物的生產。對包括西殺草(sethoxydim)及吡氟氯禾草靈(haloxyfop)的苯氧基丙酸及環己酮賦予抗性的基因的示例，為Marshall等，Theon.Appl.Genet.83：435(1992)所揭示的Acc1-S1、Acc1-S2及Acc1-S3基因。能賦予嘉磷塞抗性的GAT基因揭示於WO 2005012515授予Castle等。對2,4-D、fop及吡啶基氧基生長素除草劑賦予抗性的基因係揭示於WO 2005107437及美國專利申請案第11/587,893號。
其他除草劑可抑制光合成，包括三(psbA及1s+基因)或苯甲腈(腈化酶基因)。Przibila等，Plant Cell 3：169(1991)，揭示利用編碼突變psbA基因的質體的衣藻屬轉形。腈化酶基因的核苷酸序列揭示於美國專利第4,810,648號授予Stalker，以及含有該等基因的DNA分子可於ATCC讀取編號53435、67441及67442取得。編碼穀胱甘肽S-轉移酶的DNA的選殖與表現係揭示於Hayes等，Biochem.J.285：173(1992)。
為了本發明的目的，可選擇標記基因包括，但不限於編碼下述者之基因：新黴素磷酸轉移酶II(Fraley等(1986)CRC Critical Reviews in Plant Science,4：1-25)；氰醯胺水合酶(Maier-Greiner等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88：4250-4264)；天冬胺酸激酶；二氫吡啶二羧酸合成酶(Perl等(1993)Bio/Technology,11：715-718)；色胺酸脫羧酶(Goddijn等(1993)Plant Mol.Bio.,22：907-912)；二氫吡啶二羧酸合成酶及去敏化天冬胺酸激酶(Perl等(1993)Bio/Technology,11：715-718)；bar基因(Toki等(1992)Plant Physiol.,100：1503-1507和Meagher等(1996)和Crop Sci.,36：1367)；色胺酸脫羧酶(Goddijn等(1993)Plant Mol.Biol.,22：907-912)；新黴素磷酸轉移酶(NEO)(Southern等(1982)J.Mol.Appl.Gen.,1：327；潮黴素磷酸轉移酶(HPT或HYG)(Shimizu等(1986)Mol.Cell Biol.,6：1074)；二氫葉酸還原酶(DHFR)(Kwok等(1986)PNAS USA 4552)；草胺膦乙醯轉移酶(DeBlock等(1987)EMBO J.,6：2513)；2,2-二氯丙酸脫鹵酶(Buchanan-Wollatron等(1989)J.Cell.Biochem.13D：330)；乙醯羥基酸合成酶(Anderson等，美國專利第4,761,373；Haughn等(1988)Mol.Gen.Genet.221：266)；5-烯醇丙酮酸莽草酸磷酸酯合成酶(aroA)(Comai等(1985)Nature 317：741)；鹵芳基腈化酶(Stalker等，公開的PCT申請案WO87/04181)；乙醯-輔酶A羧化酶(Parker等(1990)Plant Physiol.92：1220)；二氫蝶酸合成酶(sul I)(Guerineau等(1990)Plant Mol.Biol.15：127)；以及32 kD光系統II多肽(psbA)(Hirschberg等(1983)Science,222：1346)。
也包含編碼對下述者之抗性的基因：氯黴素(氯黴 素)(Herrera-Estrella等(1983)EMBO J.,2：987-992)；甲氨蝶呤(Herrera-Estrella等(1983)Nature,303：209-213；Meijer等(1991)Plant Mol Bio.,16：807-820(1991)；潮黴素(Waldron等(1985)Plant Mol.Biol.,5：103-108；Zhijian等(1995)Plant Science,108：219-227及Meijer等(1991)Plant Mol.Bio.16：807-820)；鏈黴素(Jones等(1987)Mol.Gen.Genet.,210：86-91)；大觀黴素(Bretagne-Sagnard等(1996)Transgenic Res.,5：131-137)；博來黴素(Hille等(1986)Plant Mol.Biol.,7：171-176)；磺胺類(Guerineau等(1990)Plant Mol.Bio.,15：127-136)；溴苯腈(Stalker等(1988)Science,242：419-423)；2,4-D(Streber等(1989)Bio/Technology,7：811-816)；嘉磷塞(Shaw等(1986)Science,233：478-481)；及草胺膦(DeBlock等(1987)EMBO J.,6：2513-2518)。本文所述及的所有文獻除非另行指明否則其內容以參考方式併入本文。
上述列舉之可選擇標記基因與報導子基因不限制為該等。任何報導子基因或可選擇標記基因皆涵括於本發明。必要時，該等基因可藉由習知方法定序。
報導子基因與可選擇標記基因係合成用於植物中最適化表現。亦即，基因之編碼序列經修飾以增強於植物中的表現。合成的標記基因設計為於植物中以高程度表現而造成較高的轉型效率。用於基因合成最適化的方法已習知於此項技術領域。事實上，已有數種基因經最適化以增加植物中基因產物的表現。
標記基因序列可最適化以於特定植物品種中最適化表現或替代地可經修飾以於植物家族中最適化表現。植物較佳編碼可由於感興趣的特定植物品種中以最高頻率大量表現蛋白質的 編碼所決定。參照，例如，EPA 0359472；EPA 0385962；WO 91/16432；Perlak等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88：3324-3328；和Murray等(1989)Nucleic Acids Research,17：477-498；美國專利第5,380,831號；以及美國專利第5,436,391號，以參考方式併入本文。此方式中，核苷酸序列可最適化以於任何植物中表現。應理解基因序列的全不或任何部分可最適化或合成。亦即，亦可使用完全最適化或部分最適化的序列。
此外，已開發利用農桿菌媒介轉形系統的數種轉形方案。例如，二源載體方案係基於二種質體系統，其中T-DNA係位於不同於Ti質體其餘部分的不同質體。於共積成方案(co-integration strategy)中，T-DNA的一小部分係如同外來基因置於相同載體，該載體後續與Ti質體重組。
如使用於本文，詞語“植物”包括雙子葉植物與單子葉植物。雙子葉植物的實例包括菸草、阿拉伯芥、大豆、番茄、木瓜、油菜、向日葵、棉花、苜蓿芽、馬鈴薯、葡萄屬、木豆、豌豆、甘藍、雞豆、甜菜、油菜子、西瓜、甜瓜、花生、南瓜、辣根、菠菜、下南瓜、青花菜、白菜、紅蘿蔔、花椰菜、芹菜、中國白菜、黃瓜、茄子及萵苣。單子葉植物的實例包括玉米、稻米、小麥、甘蔗、大麥、黑麥、高粱、蘭科、竹、香蕉、貓尾草、百合、燕麥、洋蔥、粟草及小黑麥。
2,4-D抗性基因的主要發展及後續的抗性作物對於防治耕種應用中闊葉、嘉磷塞-抗性(或高度耐受與位移的)雜草品種提供優良的選項。2,4-D為廣譜、相對不昂貴且為強效的闊葉除草劑，如果能提供雙子葉及單子葉作物等較大的作物耐受性，該 除草劑對於耕種者提供優良的利用性。2,4-D-耐受性基因轉殖雙子葉作物也可於施用時間點及比率具有較大的彈性。對於2,4-D之主要除草劑耐受性特點的額外利用性為預防正常敏感作物免於2,4-D漂流、揮發、倒置(或其他反置動作現象)、誤用、破壞等的損傷。AAD-12基因的額外優勢為與所有目前特徵化的tfdA同源物不相同，除了非手性苯氧基生長素(例如，2,4-D、MCPA、4-氯苯氧基乙酸)之外，AAD-12能降解吡啶基氧基乙酸生長素(例如，三氯比、氟氧比)，參照表1。由主要AAD-12酵素所催化之化學反應的一般說明係示於第1圖(O2的加成係立體特異的；中間體成為酚與乙醛酸的分解為自發的)。應理解第1圖之化學結構說明分子骨架以及各種R基團等(如示於表1者)係包含於但不必要具體說明於第1圖。不同苯氧基生長素組合的多種混合物已全球性地使用於針對特定雜草譜域及各種區域的環境條件。植物中AAD-12基因的使用提供對多種廣譜生長素除草劑的保護，因而增加可調控雜草的彈性及譜域。
目前已鑑定單一基因(AAD-12)，當其基因重組用以表現於植物中時，具有允許在植物使用中苯氧基生長素除草劑的性質，該植物的固有耐受性從未存在或非顯著地高至允許使用該等除草劑。此外，AAD-12可於植物提供對於吡啶基氧基乙酸除草劑的保護，該植物的天然耐受性也不足以允許敏感性，擴充該等除草劑的潛在利用性。僅含有AAD-12的植物目前可依序以一種、二種或數種苯氧基生長素除草劑或與其槽混合而處理。各苯氧基生長素除草劑的比率範圍可為以25至4000g ae/ha，及更典型為100至2000g ae/ha用於廣譜域雙子葉雜草的調控。類似地，吡啶 基氧基乙酸生長素化合物之一種、二種或數種之混合物可施用至表現AAD-12而具有降低的來自該除草劑的損傷的風險的植物。對於各吡啶基氧基乙酸除草劑的比率範圍可為以25至2000g ae/ha，及更典型為35至840g ae/ha用於其他雙子葉雜草的調控。
因為嘉磷塞調控非常廣譜域的闊葉與禾科雜草品種而廣泛地使用。然而，於GTC及非耕種應用中的嘉磷塞重複使用，具有及將持續選擇雜草位移置天然地更耐受的品種或嘉磷塞-抗性生化型。多數除草劑抗性管理方案採用以有效比率使用槽混合除草劑夥伴而提供相同品種但具有不同作用模式的調控的方法，以延遲抗性雜草的出現。堆疊具有嘉磷塞耐受性特性(及/或具有其他除草劑耐受性特性)的AAD-12可提供藉由能使用嘉磷塞、苯氧基生長素(例如，2,4-D)及吡啶基氧基乙酸生長素除草劑(例如，三氯比)-相同作物中之選擇性，而能於GTC調控嘉磷塞抗性雙子葉雜草品種的機制。該等除草劑的施用可為同時於包含二種或更多種不同作用模式的除草劑的槽混合物中；可為個別施用單一除草劑組成物依序施用如種植前、出芽前或出芽後以及施用時間分割範圍由約2小時至約3個月；或替代地，代表各化學類別之任何數目的除草劑的任何組合可於正值作物之約7個月內至作物收穫(或對於個別除草劑之收獲間隔，無論何者最短)之期間內的任何時間施用。
就施用時點、個別除草劑的比率以及防治困難或抗性雜草的能力而言，重要的是於防治廣譜域的禾科及闊葉雜草具有彈性。於具有嘉磷塞抗性基因/AAD-12堆疊的作物中之嘉磷塞施用可為範圍由約250至2500g ae/ha；苯氧基生長素除草劑(一種 或多種)可施用由約25至4000g ae/ha；以及吡啶基氧基乙酸生長素除草劑(一種或多種)可施用由約25至2000g ae/ha。該等施用之最適組合及時點將取決於特定狀況、物種及環境，且最佳可由雜草防治技術領域中具有通常知識者予以決定且具有本揭露之優勢。
植物體典型地經由完整的生長循環而為具抗性的。轉形植物典型地對於基因表現的任何時間對新的除草劑施用為具抗性的。使用迄今所測試的組成性啟動子(主要為CsVMV及AtUbi10)的跨生命週期對於2,4-D的耐受性顯示於本文。典型地將期待此耐受性，但例如於其他非代謝性活動為改良的，其中耐受性可藉由降低的抗性機制的作用位點的表現而顯著受到影響。一實例為Roundup Ready棉花，其中該植物如早期噴灑為具耐受性的，但如太後期噴灑，嘉磷塞於分生組織中濃縮(由於其不代謝且為轉位的)；孟山都(Mosanto)所使用的病毒啟動子不期望於開花植物中良好表現。本發明提供相關改良。
除草劑調配物(例如，酯、酸或鹽調配物；或可溶性濃縮物、可乳化濃縮物或可溶性液體)及槽混添加物(例如，佐劑、界面活性劑、阻漂移劑或可相容試劑)可由規定的除草劑或一種或多種除草劑的組合而顯著影響雜草防治。利用前述除草劑化學品的該等組合之任一者皆於本發明之範疇中。
此項技術領域中具有通常知識者也將觀察到組合一種或多種作用模式用以增加雜草防治的譜域及/或用以天然多種耐受性或抗性雜草種類的防治的優勢。此也可能延伸至化學品，以對該化學品的耐受性經由人類參予(基因轉殖或非基因轉殖)於 除了GTC以外於耕作使用。確實地，編碼嘉磷塞抗性的性狀(例如，抗性植物或細菌EPSPS，嘉磷塞氧化還原酶(GOX)、GAT)、草丁膦抗性(例如，Pat、bar)、乙醯乳酸合成酶(ALS)-抑制除草劑抗性(例如，咪唑啉酮、磺醯基脲、三唑并嘧啶、磺醯苯胺、嘧啶硫代苯甲酸酯及其他化學品=AHAS、Csr1、SurA等)、溴甲腈抗性(例如，Bxn)、對HPPD(4-羥基苯基-丙酮酸-二氧酶)酵素的抑制劑的抗性、對八氫茄紅素氫酶(phytoene desaturase)(PDS)的抑制劑的抗性、對於抑制光系統II的除草劑的抗性(例如，psbA)、對於抑制光系統I的除草劑的抗性、對於抑制原卟啉原氧化酶(protoporphyrinogen oxidase)IX(PRO)的除草劑(例如，PPO-1)的抗性、對於苯基脲除草劑(例如，CYP76B1)的抗性、麥草畏降解酵素(參照，例如，US 20030135879)以及其他可單獨堆疊或呈多重組合以提供有效地防治或預防雜草位移的能力及/或對前述類別中之任何除草劑的抗性。活體內經修飾的EPSPS可使用於某些較佳具體例，以及第I類、第II類及第III類的嘉磷塞抗性基因。
關於其他除草劑，某些其他較佳ALS抑制劑包括，但不限於，磺醯基脲(如氟磺隆(chlorsulfuron)、氯吡嘧磺隆(halosulfuron)、煙嘧磺隆(nicosulfuron)、甲嘧磺隆(sulfometuron)、磺醯磺隆(sulfosulfuron)、三氟啶磺隆(trifloxysulfuron))、咪唑啉酮類(imidazoloninones)(如甲氧咪草煙(imazamox)、咪唑乙烟酸、咪唑喹啉酸(imazaquin))、三唑并嘧啶磺苯胺類(triazolopyrimidine sulfonanilides)(如氯酯磺草胺(cloransulam-methyl)、雙氯磺草胺(diclosulam)、雙氟磺草胺(florasulam)、咪唑磺草胺(flumetsulam)、磺草唑胺(metosulam)及五氟磺草胺(penoxsulam))、嘧啶硫代苯甲酸 酯類(如雙草醚(bispyribac)及吡硫草醚(pyrithiobac))以及福唑磺隆(flucarbazone)。某些較佳的HPPD抑制劑包括，但不限於，硝草酮(mesotrione)、異噁唑草酮(isoxaflutole)及磺草酮(sulcotrione)。某些較佳PPO抑制劑包括，但不限於，氟烯草酸(flumiclorac)、丙炔福草胺(flumioxazin)、氟噠嗪草酯(flufenpyr)、吡草醚(pyraflufen)、氟噻草酯(fluthiacet)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、唑酮草酯(carfentrazone)、磺醯唑草酯(sulfentrazone)及二苯基醚類(如亞喜芬(acifluorfen)、氟磺胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草靈(lactofen)及復祿芬(oxyfluorfen))。
此外，單獨或與一種或多種其他HTC性狀堆疊的AAD-12可與一種或多種其他輸入(例如，昆蟲抗性、真菌抗性或壓力耐受性等)或輸出(例如，增加的產量、經改良的油分布、腈改良的纖維品質等)的性狀堆疊。因此，本發明可使用於提供具有能力彈性地且成本有效地防治任何數目的農藝害蟲的經改良作物品質的完整農藝套裝品。
本發明部份關於鑑定不能降解2,4-D的酵素，但意外地具有新穎性質，例如該性質使本發明的酵素與習知tfdA蛋白質區隔。即使此酵素對於tfdA具有非常低的同源性，本發明的基因仍可分類為α-酮戊二酸-依賴性二氧酶的相同全家族。此家族的蛋白質界由於包括活性位點的「HX(D/E)X23-26(T/S)X114-183HX10-13R」功能域中的三個保留性的組胺酸殘基予以特徵化。該等組胺酸於活性位點配位Fe+2離子而為催化活性的基礎(Hogan等，2000)。本文所討論之初步的活體外表現試驗客製以有助於選擇新穎屬性。這些試驗也顯示AAD-12酵素係獨特於相同類型的另一不同酵 素，其討論於先前申請的專利申請案(PCT US/2005/014737；申請於20056年5月2日)。該申請案之AAD-1酵素與本發明AAD-12蛋白質僅有約25%的序列同一性。
更具體地，本發明部份關於酵素的用途，該酵素不僅能降解2,4-D，也能降解吡啶基氧基乙酸除草劑。先前沒有α-酮戊二酸-依賴性二氧酶酵素被報導具有能力降解不同化學類型與作用模式的除草劑。根據本發明之用途的較佳酵素及基因於本文係稱為AAD-12(芳基氧基烷酸酯二氧酶)基因與蛋白質。
本發明蛋白質於分析測試中對於2,4-D轉化為2,4-二氯酚(「DCP」；無除草劑活性)經測試為陽性。本發明之部分經純化蛋白質於活體外可快速地將2,4-D轉化為DCP。AAD-12轉形植物所提供的額外優勢為親代除草劑係經代謝為無活性形式，藉此降低於榖糧或禾桿收或除草劑殘留的可能性。
本發明也包括防治雜草的方法，其中該方法包含施用吡啶基氧基乙酸除草劑及/或苯氧基生長素除草劑至包含AAD-12基因的植物。
由該等發現可知，本發明提供包含有編碼此型酵素的多核苷酸的新穎植物。迄今為止，沒有動機去製造該等植物，且沒有期待該等植物能有效地制造此酵素，以賦予植物不僅對苯氧基酸除草劑(如2,4-D)有抗性也對吡啶基氧基乙酸除草劑有抗性。因此，本發明提供迄今為止不認於此項技術領域有可能的許多優勢。
公眾可取得菌株(寄存於菌種保存中心如ATCC或DSMZ)，可使用揭示於本文的技術，用以取得或篩選新穎基因。 揭示於本文之序列可使用於擴增及選殖同源性基因至重組表現系統而根據本發明用以進一步篩選及測試。
如上述先前技術段所討論，一經強力地地研究其降解2,4-D的能力的有機體為羅爾司特菌(Ralstonia eutropha)(Streber等，1987)。編碼用於此降解途徑中的第1酵素的基因為tfdA。參照美國專利第6,153,401號及GENBANK讀取編No.M16730。TfdA催化2,4-D酸經由α-戊二酮酸-依賴性二氧酶反應轉化為除草劑無活性之DCP(Smejkal等，2001)。TfdA以使用於基因轉殖植物以於正常為2,4-D敏感的雙子葉植物(例如，棉花及菸草)賦予2,4-D抗性(Streber等，1989；Lyon等，1989；Lyon等，1993)。編碼能降解2,4-D的蛋白質的多數tfdA-型基因已由環境中被鑑定且寄存於Genbank資料庫。許多同源物係與tfdA十分類似(>85%的胺基酸同一性)且具有類似於tfdA的酵素性質。然而，α-酮戊二酸-依賴性二氧酶類似物的小部分集合目前經鑑定與tfdA低程度的同源性。
本發明部份關於來自對tfdA具有低同源性(31%胺基酸同一性)的代爾夫特食酸菌(Delftia acidivorans)(Westendorf等，2002,2003)之遠緣酵素，sdpA)的新用途與功能的意外發現。此以其原始形式經純化之α-酮戊二酸-依賴性二氧酶酵素先前已顯示降解2,4D及S-滴丙酸(Westendorf等，2002和2003)。然而，先前沒有α-酮戊二酸-依賴性二氧酶酵素被報導具有降解吡啶基氧基乙酸化學類別的除草劑的能力。SdpA從未被表現於植物，也沒有任何動機進行，此部分因新的HTC技術的開發已大幅因GTC的有效性、低成本及便利性而受限(Devine,2005)。
就新穎活性而言，本發明之蛋白質及基因於本文係指稱為AAD-12蛋白質與基因。AAD-12目前確認活體外降解各種苯氧基乙酸酯生長素除草劑。然而，此酵素，如本文所第1次報導，意外地發現也能降解芳基氧基烷酸酯分子類的其他基質。顯著的農藝重要性基質包含吡啶基氧基乙酸生長素除草劑。此高度新穎的發現為顯著除草劑耐受作物(HTC)及可選擇標記性狀機會的基礎。此酵素獨特於其傳遞除草劑降解活性至廣譜域闊葉除草劑(苯氧基乙酸酯及吡啶基氧基乙酸生長素)範圍的能力。
因此，本發明部份關於藉由重組表現的芳基氧基烷酸酯二氧酶酵素(AAD-12)而降解2,4-二氯乙酸、其他苯氧基乙酸及吡啶基氧基乙酸除草劑。此發明也部份關於編碼能降解苯氧基及/或吡啶基氧基生長素除草劑的芳基氧基烷酸酯二氧酶降解酵素(AAD-12)的基因鑑定與用途。
本發明酵素能基因轉殖表現而造成將防治幾乎所有闊葉雜草的除草劑組合。AAD-12可作為優異的除草劑耐受作物(HTC)性狀而例如與其他HTC性狀[例如，嘉磷塞抗性、草丁膦抗性、ALS-抑制劑(例如，咪唑啉酮、磺醯基脲、三唑并嘧啶磺苯胺)抗性、溴甲腈抗性、HPPD-抑制劑抗性、PPO-抑制劑抗性等]及昆蟲抗性性狀(Cry1F、Cry1Ab、Cry 34/45、其他Bt.蛋白質或非桿菌來源之殺昆蟲蛋白質等)堆疊。此外，AAD-12可作為可選擇標記以有助於植物經基因遺傳工程而具有第二基因或基因群的主要轉形株的選擇。
此外，本發明之微生物基因已被重新設計已使得該蛋白質由對單子葉及雙子葉植物用途(半子葉(hemicot))二者具有 偏好的密碼子所編碼。阿拉伯芥、玉米、菸草、棉花、大豆、油菜及稻米已經以含有AAD-12的構築體轉形且已顯示對苯氧基及吡啶基氧基生長素除草劑二者有高程度的抗性。因此，本發明也關於編碼本發明蛋白質的「植物最適化」基因。
氧基烷酸酯基團係使用於將安定的酸功能性導入至除草劑。酸性基團可藉由「酸捕捉」而賦予韌皮部移動性，對於除草劑作用為所期望的屬性且因此可併入新的除草劑用於移動性目的。本發明的態樣也提供創造HTC的機制。存在許多可作為AAD-12的基質的潛在性商業及試驗的除草劑。因此，本發明的基因的用途也可造成對其他除草劑的除草劑耐受性。
本發明之HTC性狀可使用於與其他HTC性狀(包含但不限於對嘉磷塞的耐受性)的新穎組合。這些性狀的組合提供防治雜草(等)種類的新穎方法，此乃因對除草劑(例如，嘉磷塞)之新獲得抗性或遺傳耐受性。因此，除了HTC性狀之外，使用除草劑之防治雜草的新穎方法，對於其中之除草劑耐受性係藉由該酵素創造於基因轉殖作物中，係於本發明範疇中。
例如，本發明可於商業化情況下於大豆中應用2,4-D抗性性狀與目前的嘉磷塞抗性性狀堆疊。因此，本發明提供衝擊闊葉雜草品種移位及/或選擇除草劑抗性闊葉雜草的手段，其藉由耕種者利用各種作物以嘉磷塞用於雜草防治而由非常高信心達頂點。
以本發明之AAD-12基因的基因轉殖表現為例，例如，阿拉伯芥、菸草、大豆、棉花、稻米、玉米及油菜。根據本發明，大豆為用於轉形的較佳作物。然而，本發明可利用於多種 其他單子葉(如牧草(pasture grasses)或草坪草(turf grass))以及雙子葉作物如紫花苜蓿(alfalfa)、三葉草(clover)、樹木種類等。類似地，2,4-D(或其他AAD-12-基質)可更為正向地利用於其中耐受性為中度的禾本作物，且經由此性狀增加的耐受性將以更有效的比率及更廣泛的施用時點而無作物損傷風險對耕種者提供機會以使用該等除草劑。
又進一步地，本發明提供可提供防治闊葉雜草的除草劑的抗性的單一基因。此基因可利用於多種作物以使其能使用廣譜域的除草劑組合。本發明也可防治對目前化學品有抗性的雜草，且有助於由目前農藝實施所造成的位移雜草譜域的防治。本發明之AAD-12也可致力於有效地將額外的除草劑基質去毒性為飛除草劑形式。因此，本發明提供額外的HTC性狀及/或可選擇標記技術的開發。
不同於，或額外於，使用本發明基因以產生HTC，本發明基因也可使用作為可選擇標記以成功地於細胞培養物、溫室及田間選擇轉形株。對於本發明基因簡單地作為生物技術方案中的可選擇標記有高遺傳價值。AAD-12對於其他芳基氧基烷酸酯生長素系除草劑的混亂提供利用此基因於HTC及/或可選擇標記目的的許多機會。
無法輕易地討論「抗性」而不使用動詞「耐受」或形容詞「耐受的」。工業界已耗費無法計數的時間爭論除草劑耐受作物(HTC)相對於除草劑抗性作物(HRC)。HTC為工業界的較佳用語。然而，抗性之美國雜草科學學會官方定義為「在暴露於對野生型通常為致死的除草劑劑量下之植物的存活及再製造的遺傳能 力。植物中，抗性可為天然發生的或由如基因工程或由組織培養物或突變所製造之變異株選擇的技術所誘導。」除非特別指明，使用於本文之除草劑「抗性」為可遺傳且對於規定的植物以除草劑之典型的除草劑有效處理的存在下使植物生長及再製造，如本發明揭示內容所提出之除草劑操作手冊目前版本所建議的。由此項技術領域中具有通常知識者可辨識，植物可仍被認為「抗性的」，即使賴自除草劑的某些程度的植物損傷為明顯的。如使用於本文，用語「耐受性」係較廣於用語「抗性」，且包含本文所定義的「抗性」，以及特定植物忍受典型於相同除草劑劑量於相同基因型的野生型植物所造成的各種程度的除草劑誘導的損傷的經改良能力。
對植物或細菌系統的功能性活性的轉移可涉及將核酸序列，其編碼本發明蛋白質的胺基酸序列，整合至適合載體將留駐於其中的宿主的蛋白質表現載體。獲得編碼具有功能性活性的蛋白質的核酸序列的一種途徑係由製造感興趣蛋白質的細菌種類，使用如本文所揭示的由蛋白質的胺基酸序列所演繹的資訊，單離原始的基因材料。原始序列可經最適化用以於植物中表現，例如，如後文中將更詳細討論。最適化多核苷酸也可根據蛋白質序列設計。
根據本發明有數種方法用於獲得蛋白質。例如，揭示於本文之對於蛋白質的抗體可使用於由蛋白質混合物鑑定及單離其他蛋白質。具體地，當相較於其他相關蛋白質時，抗體可針對該等蛋白質之最為保留或最為不同的部分提出。後該等抗體可使用特異於鑑定藉由免疫沉澱、效素連結免疫吸附分析(ELISA) 或免疫墨點而鑑定具有特徵活性的等效蛋白質。對於本文所揭示蛋白質、或等效蛋白質或該等蛋白質的片段的抗體，可容易地使用標準步驟製備。該等抗體為本發明之態樣。本發明之抗體包含單株抗體與多株抗體，較佳回應於例示或建議的蛋白質而製造。
此項技術領域中具有通常知識者將容易地辨識本發明之蛋白質(或基因)可由各種來源獲得。由於完全除草劑降解的操縱已知為編碼於可轉座元件如質體，以及基因體性整合，本發明之蛋白質可由廣泛種類的微生物，例如，包含重組及/或野生型細菌獲得。
細菌單離物的突變株可藉由此項技術領域所習知的步驟製造。例如，不產孢子突變體可經由單離體之乙基甲烷磺酸酯(EMS)突變而獲得。突變菌株也可藉由此項技術領域所習知的步驟藉由紫外光及亞硝基胍而製造。
本文之「來自」或由任何本發明之單離物「可獲得」之蛋白質意指或建議該蛋白質(或類似蛋白質)可由單離物或某些其他來源，如另一細菌菌株或植物而獲得。「衍生自」也具有此內涵，且包括由規定形式的細菌，例如，經修飾於植物中的表現，而獲得。此項技術領域中具有通常知識者應容易地辨識，所提出之細菌基因及蛋白質的揭示，植物可經工程化以製造該蛋白質。抗體製備、核酸探針(例如DNA、RNA或PNA)等可使用揭示於本文之多核苷酸及/或胺基酸序列而製備且可使用於由其他(天然)來原篩選及回收其他相關基因。
標準分子生物技術可使用於選殖及定序本文所揭示的蛋白質及基因。其他資訊可見於Sambrook等，1989，其以參方 式併入本文。
多核苷酸及探針：本發明進一步提供編碼蛋白質之核酸序列用於本發明之用途。本發明進一步提供鑑定及特徵化編碼具有所期望之除草劑活性的蛋白質的基因。一具體例中，本發明提供又用於作為雜交探針及/或用於PCR技術之引子的獨特核苷酸序列。引子製造可使用於感興趣的基因的鑑定、特徵化及/或單離的特徵基因片段。本發明之合甘酸序列編碼與先前所敘述蛋白質為不相同的蛋白質。
本發明之多核苷酸可用於形成完整「基因」以於所期望宿主細胞中編碼蛋白質或肽。例如，此項技術領域中具有通常知識者應容易地辨識，本發明之多核苷酸可合適地於感興趣的宿主中置於啟動子的調控下，如此項技術領域所容易習知的。基因表現及暫時/組織特異性表現的程度可大幅影響本發明的利用性。一般而言，較大程度的可降解基因的蛋白質表現將造成較快及更完全的基質(此情況中為目標除草劑)降解。啟動子被期望以高程度表現目標基因而除非高表現對於植物健康具有後續的不良影響。典型地，將期望具有AAD-12基因組成性地表現於所有組織用已於所有生長段完全保護植物。然而，或者可替代地使用有生長力地表現抗性基因；此將允許目標除草劑於耕種的使用於雜草防治且將後續地藉由於開花階段施用而調控目標作物的有性生殖。此外，表現的所期望程度與時點也可取決於植物類型與所期望的耐受程度。某些較佳具體例使用強的組成性啟動子與轉錄增強子等組合以增加表現程度與增強耐受性達所期望程度。某些該等係於後文中於實施例段落前更詳細地討論。
如此項技術領域的技術人員所習知，DNA典型地以雙股形式存在。於此安排中，一股係互補於另一股，反之亦然。由於DNA係於植物(例如)中複製，製造DNA額外的互補股。「編碼股」通常於此項技術領域使用於指稱與反義股結合的股。mRNA係由DNA的「反義」股轉錄。「義」股或「編碼」股具有一系列的密碼子(密碼係三個核苷酸可讀取為三個殘基單元以特定化依特殊胺基酸)可讀取為開放讀架(ORF)以形成感興趣的蛋白質或肽。為了於活體內製造蛋白質，一股DNA典型地係轉錄為mRNA的互補股而使用作為蛋白質模板。因此，本發明包括示於隨附的序列表及/或包括互補股的等效物的例示多核苷酸的用途。功能性等效於例示DNA的RNA及PNA(肽核酸)分子包括於本發明。
根據本發明之用途的蛋白質及基因，例如可藉由使用寡核苷酸探針而鑑定與獲得。該等探針為可藉由合適的標示或可為如國際專利申請案第WO 93/16094號所揭示之製成本質為螢光的而可偵測的可偵測的核苷酸序列。該等探針(以及本發明的多核苷酸)可為DNA、RNA或PNA。除了腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸嘧啶(T)及尿嘧啶(U)(U；用於RNA分子)之外，本發明之合成探針(及多核苷酸)亦可為肌苷(可與所有四個鹼基配對的天然鹼基；有時於合成探針中使用於置換所有四個鹼基)及/或合成(非天然)鹼基。因此，當於本文中指稱合成、簡併寡核苷酸時，且「N」或「n」為一般性使用，「N」或「n」可為G、A、T、C或肌苷。如使用於本文之歧義密碼係根據標準IUPAC命名協定而於本申請案提出(例如R意指A或G，Y意指C或T等)。
如此項技術領域中的技術人員所習知，若探針分子 與核酸樣品雜交，其可合理地推測該探針及樣品具有實質同源性/類似性/同一性。較佳第，多核苷酸的雜交係首先進行接著於低嚴苛度、中嚴苛度或高嚴苛度的條件下藉由此項技術領域習知的技術清洗，例如揭示於Keller,G.H.,M.M.Manak(1987)DNA Probes,Stockton Press,New York,N.Y.,pp.169-170。例如，如本文所述，低度嚴苛條件首先可藉由以2 x SSC(標準檸檬酸鹽)/0.1% SDS(十二烷基硫酸納)於室溫清洗15分鐘達成。典型地實施二次清洗。然後較高嚴苛度可藉由降低鹽濃度及/或藉由藉由昇高溫度而達成。例如，上述清洗可接著以0.1 x SSC/0.1% SDS於室溫各為15分鐘清洗二次接著以0.1 x SSC/0.1% SDS各於55℃後序清洗30分鐘。該等溫度可使用於本文所述之其他雜交及清洗方案且為此項技術領域中具有通常知識者所習知(例如，SSPE可使用作為取代SSC)。2 x SSC/0.1% SDS可藉由添加50ml of 20 x SSC及5ml之10% SDS至445ml之水而製備。20 x SSC可藉由組合NaCl(175.3g/0.150M)、檸檬酸鈉(88.2g/0.015M)及水，以10NaOH調整pH至7.0，然候調整容積至1升而製備。10% SDS可藉由溶解10g之SDS於50ml之滅菌水，然後稀釋至100ml而製備。
探針的偵測提供於習知方式中偵測雜交是否維持的手段。探針分析提供鑑定本發明基因的快速方法。根據本發明之使用作為探針的核苷酸段可使用DNA合成儀及標準步驟合成。該等核苷酸序列亦可使用作為PCR引子以擴增本發明的基因。
分子的雜交特徵可使用於定義本發明之多核苷酸。因此本發明包括與本文例示之多核苷酸雜交的多核苷酸(及/或其互補體，較佳為其完全互補體)。亦即，定義基因的一法為，例如， 藉由與習知或特異例示基因雜交(於本文所揭示的特異條件下)的能力。
如使用於本文，用於雜交之「嚴苛」條件意指藉由本申請人所施用的條件達成相同或約相同特異性程度的條件。具體地，固定化DNA於南方墨點與32P-標示基因特異性探針的雜交可藉由標沝方法實施(參照，例如，Maniatis等1982)。一般而言，雜交集後續清洗可於能偵測目標序列的條件下進行。對於雙股DNA基因探針，雜交可於比DNA雜合物的溶解溫度(Tm)低20至25℃於6 x SSPE、5 x Denhardt's solution、0.1% SDS,0.1mg/ml變性DNA中進行隔夜。
清洗典型地可如下術進行：(1)於室溫於1 x SSPE、0.1% SDS(低嚴苛度清洗)清洗15分鐘二次；以及(2)於Tm-20℃於0.2 x SSPE、0.1% SDS(中嚴苛度清洗)清洗15分鐘一次。
對於寡核甘酸探針，雜交可於比DNA雜合物的溶解溫度(Tm)低10至20℃於6倍SSPE、5 x Denhardt's solution、0.1% SDS,0.1mg/ml變性DNA中進行隔夜。
清洗典型地可如下術進行：(1)於室溫於1 x SSPE、0.1% SDS(低嚴苛度清洗)清洗15分鐘二次；以及(2)於雜交溫度於1 x SSPE、0.1% SDS(中嚴苛度清洗)清洗15分鐘一次。
一般而言，可改變鹽及/或溫度以變化嚴苛度。具有經標示DNA片段>70或更多的鹼基長度，可使用下述條件：(1)低：1或2 x SSPE，室溫；(2)低：1或2 x SSPE，42℃；(3)中：0.2 x或1 x SSPE，65℃或(4)高：0.1 x SSPE，65℃。
雙螺旋(Duplex)的形成及安定性取決於雜合物之二 股之間的實質互補性，以及如上述之可耐受的某些錯配程度。因此，本發明之探針序列包括所述序列之突變(單一與多重二者)、刪除、插入及其組合，其中該突變、插入及刪除允許與感興趣之目標多核苷酸形成安定的雜合物。突變、插入及刪除可於規定的多核苷酸序列以許多方式製造，且該等方法為此項技術領域中具有通常知識者所習知。其他方法於未來可能變成習知方法。
PCR技術：聚合酶鏈鎖反應(PCR)係核酸序列之重複、酵素的、經啟動的合成。此步驟為習知且通常為此項技術領域中具有通常知識者所使用(參照Mullis，美國專利第4,683,195號、第4,683,202號及第4,800,159號；Saiki等，1985)。PCR係基於由雜交至目標序列之相反股的二寡核苷酸引子所挾持之感興趣DNA片段的酵素性擴增。引子較佳係導向於3'末端而朝向另一者。模板之熱變性、引子對其互補序列的黏合以及利用DNA聚合酶的黏合引子的延伸的重複循環，造成由PCR引子的5’末端所界定的段的擴增。各引自的延伸產物可作為另一引子的模板，所以各循環基本上倍增前一循環所製造的DNA片段產物數量。此結果造成特異目標片段的指數累積，於數小時內達數百萬倍。藉由使用熱安定的DNA聚合酶如Tag聚合酶，嗜熱性細菌(Thermus aquaticus)單離，擴增步驟可完全自動化。可使用之其他酵素為此項技術領域所習知。
例示DNA序列或其段，可使用作為引子用於PCR擴增。於實施PCR擴增中，可耐受於引子與模板之間某種程度的錯配。因此，例示引子之突變、刪除及插入(特別是5’末端的核苷酸添加)皆於本發明之範疇中。突變、插入及刪除可藉由此項技 術領域所習知方法於規定的引子中製造。
基因及蛋白質的改質：本發明的基因及蛋白質可融合至其他基因及蛋白質以製造嵌合蛋白質或融合蛋白質。根據本發明可使用之基因及蛋白質不僅包括特異性例示的全長序列也包括該等序列之部分體、段及/或片段(包括連續片段及相較於全長分子為內部及/或終端刪除體)、其變異體、突變體、嵌合體及融合體。本發明之蛋白質可具有經取代胺基酸只要其保留所期望的功能活性。「變異體」基因具有編碼蛋白質或等效蛋白質的核苷酸序列，該蛋白質或等效蛋白質具有與例示蛋白質為相等或類似的活性。
具有原始aad-12核苷酸序列的BLAST研究的頂端二結果顯示朝果120個鹼基對序列的可理解程度的同源性(約85%)。於某些條件下的雜交被期待包括該二序列。參照GENBANK讀取編號DQ406818.1(89329742；Rhodoferax)及AJ6288601.1(44903451；Sphingomonas)。紅育菌屬(Rhodoferax)非常類似於代爾夫特菌(Delftia)但鞘胺醇單胞菌屬(Sphingomonas)為系統發育上完全不同類型。
用語「變異體蛋白質」與「等效蛋白質」意指對於目標基質及等效序列具有如同例示蛋白質之相同或基本上相同生物/功能活性的蛋白質。如使用於本文，指稱「等效」序列意指具有胺基酸取代、刪除、加成或插入而改良或無不良影響活性的顯著程度的序列。保留活性的片段也包含於此定義。保留相同或類似功能或活性的片段及其他等效物如同例示蛋白質之對應片段也於本發明範疇中。變化，如胺基酸取代或加成，可製造用於各種 目的，如增加(或降低)蛋白質的蛋白酶安定性(無物質地/實質地降低該蛋白質的功能活性)、移除或增加限制位點等。基因的各種變化例如可容易地使用標準技術用於製造點突變而構築。
此外，美國專利第5,605,793號，例如，揭示藉由於隨機或重點的片段化後使用DNA再組裝而產生分子多歧性的方法。此可意指基因「調換」(shuffling)，其典型涉及混合不同DNA分子的二種或更多種的片段(或所期望的尺寸)，接著重複復性(renaturation)的循環。此可改良藉由起始基因所編碼的蛋白質的活性。結果為具有改良活性的嵌合蛋白質、改變的基質特異性、增加的酵素安定性、改變的立體特異性或其他特徵。
「調換」可於獲得與檢測感興趣蛋白質的原子3D(三維)座標與晶體結構後予以設計及標定。因此，「重點調換」(focused shuffling)可關於理想用於改質的蛋白質的某些段，例如表面外露段，且較佳不為涉及蛋白質折疊與基本3D結構完整性的內部段。
可製造對於酵素的「活性位點」的特異變化以相對於活性或立體特異性影響本質功能性。Muller等(2006)。習知的tauD晶體結構使用作為模式二氧酶以測定結合至其本質基質牛磺酸之活性位點殘基。Elkins等(2002)“X-ray crystal structure of Escerichia coli taurine/alpha-ketoglutarate dioxygenase complexed to ferrous iron and substrates,”Biochemistry 41(16)：5185-5192。關於酵素活性位點的序列最適化及設計性，參照Chakrabarti等，PNAS,(Aug.23,2005),102(34)：12035-12040。
根據標準步驟可使用市售可得之核酸外切酶或核酸內切酶製造全長基因的片段。例如，酵素如Bal31或定位突變 (site-directed mutagenesis)可使用於由該等基因的末端系統性地切除核苷酸。再者，編碼活性片段的基因可使用各種限制酵素獲得。蛋白酶可使用於直接獲得該等蛋白質的活性片段。
如本文所述於本發明之範疇中，蛋白質可被截短以及仍保留功能活性。藉由「截短的蛋白質」，其意指可切除蛋白質的部份而殘餘的截短的蛋白質於切斷後保有且顯現所期望的活性。切斷可藉由各種蛋白酶達成。再者，有效切斷的蛋白質可使用分子生物技術製造，其中編碼該蛋白質的DNA鹼基係經由限制性核酸內切酶或此項技術領域習知的其他技術而被移除。截短後，該等蛋白質可表現於異源系統如大腸桿菌、桿狀病毒、植物為主的病毒系統、酵母等且，然後置於如本文所揭示之昆蟲測試中以測定活性。此項技術領域已習知該節短的蛋白質可成功地製造而使得其等雖然具有較短的完整、全長序列但仍保留功能活性。例如，Bt蛋白質可使用於截短的(芯蛋白質)形式(參照，例如，Hofte等(1989)，以及Adang等(1985))。如使用於本文，用語「蛋白質」可包括功能活性截短物。
除非特別指明，如使用於本文，二核酸的序列同一性百分比及/或相似性係使用Karlin and Altschul，1990，經修改於Karlin and Altschul 1993的運算法而測定。該運算法係經併入Altschul等，1990之NBLAST及XBLAST程式中。BLAST核苷酸研究係以NBLAST程式，分數=100，字長=12實施。空位(Gapped)BLAST可使用如Altschul等，1997所揭示者。當利用BLAST與Gapped BLAST程式時，使用各程式(NBLAST及XBLAST)的預設參數。參照NCBI/NIH網站。為了獲得用於比較目的的空位運算 法，所使用的Vector NTI Suite 8的AlignX功能(InforMax,Inc.,North Bethesda,Md.,U.S.A.)應用預設參數。有：空位開放處罰為152，空位延伸處罰為6.66以及空位分離處罰範圍為8。
亦可改變蛋白質的各種性質及三維特徵而無不良影響於蛋白質的活性/功能性。保留性胺基酸取代可耐受/製造而無不良影響於該分子的活性及/或三維構型。胺基酸分為下述類型：非極性、不帶電極性、鹼性及酸性。據此將一類型胺基酸以相同型態的另一胺基酸取代的保留性取代係於本發明範疇中，只要該取代對於化合物的生物活性無不良影響。表1提供屬於各類型的胺基酸實例的列表。某些情況中，也可製造非保留性取代。然而，較佳的取代不顯著減損該蛋白質的功能/生物活性。
如使用於本文，指稱「經單離」多核苷酸及/或「經純化」蛋白質意指該等分子當其等不與其他分子聯結時，與該等其他分子聯結為天然可見。因此，指稱「經單離」及/或「經純化」表示如本文所涉及「人為」(hand of man)。例如，置入植物中用以表現之本發明之細菌「基因」為「經單離之多核苷酸」。類似地，由細菌蛋白質衍生且由植物所製造的蛋白質為「經單離之蛋白質」。
由於基因密碼的簡併/冗餘，各種不同DNA可編碼 本為所揭示之胺基酸序列。此項技術領域中具有通常知識者已知去創造編碼相同或基本上相同的蛋白質的替代性DNA序列。該等變異DNA序列皆於本發明範疇中。此亦於後文中標題為「用於植物中表現的序列的最適化」的段落中更詳細討論。
用於植物中表現的序列的最適化：為了獲得異源性基因於植物之高表現，一般較佳係再工程化該等基因以使得其等於植物細胞(的細胞質)為更有效率地表現。玉米為該等植物之一，其終其可較佳於轉形前重新設計異源性基因以增加其於該植物中之表現程度。因此，編碼細菌蛋白質的基因的設計中的額外步驟為用於最適表現的異源性基因的再工程化，使用密碼偏差更為接近對準目標植物序列，無論是雙子葉或單子葉種類。序列也可最適化用以表現本文其他處所討論之植物的更具體類型的任一者。
基因轉殖宿主：本發明之編碼蛋白質的基因可導入至廣泛種類的微生物宿主或植物宿主。本發明包括基因轉殖細胞及基因轉殖植物。較佳的植物(及植物細胞)為玉米、阿拉伯芥、菸草、大豆、棉花、油菜、稻米、小麥、草皮、豆科牧草(legume forages)(例如，紫花苜蓿及三葉草)、草皮草等。基因轉殖植物的其他類型亦可根據本發明而製造，例如果類、蔬菜、觀賞植物及數目。更一般而言，本發明之各種態樣中可使用雙子葉及/或單子葉。
較佳具體例中，基因的表現直接或間接造成感興趣蛋白質的細胞內製造(及維持)。植物可以此方式被賦予除草劑抗性。該宿主可指稱為基因轉殖、重組、轉形及/或轉染宿主及/或細 胞。本發明之某些態樣中(例如當選殖及製備感興趣的基因時)，微生物(較佳為細菌)細胞可根據標準技術製造及使用，而具有本發明揭露之優勢。
經以本發明之多核苷酸轉染的植物細胞可再生為全植物。本發明包括含組織細胞培養物、葉體培養物及盤培養物之細胞培養物。製造及/或使用於產生本發明植物的種子也包括於本發明範疇中。其他植物組織及部分體也包括於本發明。本發明同樣地包括製造包含本發明之多核苷酸的植物或細胞的方法。製造該等植物的一較佳方法係藉由種植本發明之種子。
雖然植物可為較佳，本發明也包括例如於螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens；Pf)菌株之高活性重組AAD-12的產生。本發明包括於此宿主中用以維持可溶性活性AAD-12的較佳生長溫度；其中AAD-12係製造超過40%總細胞蛋白質的醱酵條件，或至少10g/L；造成自Pf宿主之活性重組AAD-12的高回收的純化步驟；每公斤細胞產生至少10g活性AAD-12的純化流程；每公斤細胞可產生20g活性AAD-12的純化流程；可儲存及回復AAD-12活性於溶液中的調配方法；以及對於長時期儲存及保質可保留AAD-12活性的凍乾方法。
基因插入以形成基因轉殖宿主：本發明之一態樣為利用表現本發明蛋白質之本發明多核苷酸之植物、植物細胞及其他宿主細胞的轉形/轉染。此方式之植物轉形可對具有不同作用模式的各種除草劑賦予抗性。
有廣泛的各種方法可用於將編碼所期望蛋白質的基因能使基因安定的維持與表現的條件下導入至目標宿主。該等方 法為此項技術領與所習知且揭示於例如美國專利第5,135,867號。
包含AAD12多核苷酸的載體系包括於本發明範疇。例如，可取得包含於大腸桿菌之複製系統以及允許轉形細胞的選擇之標記的大數目選殖載體用於製備將外來基因插入至較高等植物。該等載體包含例如pBR322、pUC系列、M13 mp系列、pACYC184等。因此，編碼蛋白質的序列可於適合限制位點插入至載體。所得質體使用於轉形至大腸桿菌。該大腸桿菌細胞於適合的營養培養基培養後，收獲與分解。藉由純化自基因體DNA回收質體。一般而言，進行序列分析、限制酵素分析、電泳及其他生化-分子生物方法做為分析方法。各者製備後，所使用之DNA序列可經限制酵素分解且參予至次一DNA序列。各質體卹列可選直至相同或不同質體。取決於將所期望基因插入至植物的方法，可能需要其他DNA序列。例如，若Ti或Ri質體使用於植物細胞轉形，則至少右邊界，但通常為Ti or Ri質體T-DNA的右邊界及左邊界，必須連結呈欲插入基因的挾持區域。T-DNA用於植物細胞轉形的用途已經強力地研究且揭示於EP 120 516；Hoekema(1985)；Fraley等(1986)；以及An等(1985)。
為數眾多的技術可用於插入DNA至植物宿主細胞。該等技術包括使用根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)作為轉形劑之利用T-DNA的轉形、融合、注射、生物彈道法(微粒子衝擊法)(biolistics(microparticle bombardment))、碳化矽晶鬚(silicon carbide whiskers)、浮質束(aerosol beaming)、PEG或電穿孔以及其他可能方法。若濃桿菌使用於轉形，欲插入的DNA必須選殖至特殊質體，亦即進入中間體 載體或進入二元載體。中間體載體可藉由屬於與T-DNA中之序列同源的序列支同源性重組而整合至Ti或Ri質體。Ti或Ri質體也包含對於T-DNA移轉為必需的vir區域。中間體載體不能於農桿菌複製。中間體載體可藉由助手質體(連結)的手段而轉移至根瘤農桿菌。二元載體可於大腸桿菌及農桿菌二者中複製。其包含選擇標記基因以及藉由T-DNA邊界區域的右側及左側所框住的連結子或多連結子。其等可直接轉形至農桿菌(Holsters,1978)。使用作為宿主細胞的農桿菌細胞含帶有vir區域的質體。該vir區域對於T-DNA轉移至植物細胞為必需的。可含有額外的T-DNA。依此轉形的細菌係使用於植物細胞的轉形。植物外植體可有利地與根瘤農桿菌毛根農桿菌培養用於轉移DNA進入植物細胞。然後全植物可由經感染的植物材料(例如，葉的小片、莖段、根、但也可為原生質或懸浮-培養細胞)於適合培養基中，該培養基可含有用於選擇的抗生素或殺菌劑。然後所獲得的植物可測試所插入DNA的存在。於注射及電穿孔的情況下，製造質體不需要特殊要求。可使用傳統質體，例如pUC衍生物。
經轉形之細胞依通常方式於植物內生長。該等可形成生殖細胞且轉移轉形性狀至後代植物。該等植物可依通常方式生長且與具有相同轉形遺傳性因子或其他遺傳性因子的植物異交。所得雜合個體具有對應的表現型性質。本發明之某些較佳具體例中，編碼細菌蛋白質的基因係由經插入至植物基因體的轉錄單元表現。較佳地，該轉錄單元為能安定的整合至植物基因體且能選擇表現編碼該蛋白質之mRNA的轉形值物品係的重組載體。
一但所插入的DNA已整合至基因體，於該處其為相 對地安定(且不再露出)。其正常含有選擇標記，其賦予該轉形植物細胞對於殺菌劑或抗生素的抗性，其中包括如卡那黴素、G418、博萊黴素、潮黴素或氯黴素。植物可選擇標記典型地亦可提供對各種除草劑的抗性，如草丁膦(例如，PAT/bar)、嘉磷塞(EPSPS)、ALS-抑制劑(例如，咪唑啉酮、磺醯脲、三唑并嘧啶磺苯胺等)、溴甲腈、HPPD-抑制劑抗性、PPO-抑制劑、ACC-ase抑制劑以及其多種。個別施用的標記因而應允許轉形細胞相對於不含有所插入DNA的細胞的選擇。感興趣的基因較佳藉由組成性或誘導性啟動子於植物細胞中表現。一旦表現，mRNA轉譯為蛋白質，藉此將感興趣的胺基酸併入蛋白質。編碼蛋白質的基因可於組成性啟動子、組織-特異性啟動子或誘導性啟動子的調控下於植物細胞中表現。
已有數種技術用於將外來重組載體導入至植物細胞，以及用於獲得安定地維持與表現所導入的基因的植物。該等技術包括將基因材料包覆至微粒子而直接導入至細胞(美國專利第4,945,050號授予Cornell以及第5,141,131號授予DowElanco，目前為Dow AgroSciences,LLC)。此外，植物可使用農桿菌技術予以轉形，參照美國專利第5,177,010號授予托雷多大學(University of Toledo)；第5,104,310號授予德州農工大學(Texas A&M)；歐洲專利第0131624B1號；歐洲專利第120516號、第159418B1號及第176,112號授予Schilperoot；美國專利第5,149,645號、第5,469,976號、第5,464,763號及第4,940,838號及第4,693,976授予Schilperoot；歐洲專利案第116718號、第290799號、第320500號，全授予Max Planck；歐洲專利案第604662號及第627752號， 以及美國專利第5,591,616號授予Japan Tobacco；歐洲專利案第0267159號及第0292435號，以及美國專利第5,231,019號，全授予Ciba Geigy，現為Syngenta；美國專利第5,463,174號及第4,762,785號，二者皆授予Calgene；以及美國專利第5,004,863號及第5,159,135號，二者皆授予Agracetus。其他轉形技術包括晶鬚技術。參照美國專利第5,302,523號及第5,464,765，二者皆授予Zeneca，現為Syngenta。其搭直接的DNA傳遞轉形技術包括浮質束技術。參照美國專利第6,809,232號。電穿孔技術也已使用於轉形植物。參照WO 87/06614授予Boyce Thompson Institute；美國專利第5,472,869號及第5,384,2535號，二者皆授予Dekalb；以及WO 92/09696及WO 93/21335，二者皆授予Plant Genetic Systems。再者，病毒載體也使用於製造表現感興趣蛋白質的基因轉殖植物。例如，單子葉植物可利用病毒載體使用揭示於下述專利的方法轉形，美國專利第5,569,597號授予Mycogen Plant Science及Ciba-Geigy(現為Syngenta)，以及美國專利第5,589,367號及第5,316,931號，二者皆授予Biosource，現為Large Scale Biology。
如前所述，DNA構築體導入至植物宿主的方式對本發明非為重點。可應用提供有效轉形的任何方法。例如，用於植物細胞轉形的各種方法係揭示於本文且包括使用Ti或Ri-質體等以實施農桿菌媒介轉形。在許多情況中，期望具有用於轉形鞭姐於T-DNA邊界的一側或二側的構築體，更具體地為右邊界。當構築體使用根瘤農桿菌或毛根農桿菌作為轉形模式時此為特別有用的，然而T-DNA邊界可發現使用其他轉形模式。在農桿菌使用於植物細胞轉形處，可使用載體，其可利用存在於植物細胞的T-DNA 或Ti或Ri質體而導入至宿主用於同源性重組。載體的導入可經由電穿孔、三雜交體(tri-parental mating)及此項技術領域習知用於轉形革蘭氏陰性細菌的其他技術。載體轉形至農桿菌宿主的方式非為本發明之重點。含有用於重組的T-DNA的Ti或Ri質體可為能或不能引起蟲癭(gall)形成，且只要vir基因存在於該宿主則對於本發明非為重點。
農桿菌使用於轉形的某些情況中，於T-DNA邊界內的表現構築體將被插入至廣域載體如pRK2或其衍生物如揭示於Ditta等(1980)以及歐洲專利第0 120 515號。一種或多種標記將包含於表現構築體及T-DNA如本文所述，該等標記將允許轉形農桿菌期轉形植物細胞的選擇。所使用的特殊標記對本發明非為重點，而較佳標記取決於所使用的宿主及構築體。
對於使用農桿菌的植物細胞的轉形，可合併外植體且與經轉形的農桿菌培養充足時間以允許其轉形。轉形後，藉由以合適的抗生素選擇殺死農桿菌且植物細胞與合適的選擇培養基培養。一旦形成癒合組織，可藉由施用植物組織培養及植物再生之技術領域中習知的合適的植物荷爾蒙激勵根形成。然而，通常不需要癒合組織中間體階段。根形成後，該植物細胞可轉移至激勵根形成的培養基藉此完成植物再生。然後該植物可生長至有種子且該種子可使用於建立未來世代。無關於轉形技術，編碼細菌蛋白質的基因，較佳係併入基因轉移載體且該載體適用於藉由包括於該載體的植物啟動子調控單元，以及3’非轉譯之轉錄終結區域如Nos等而表現該基因。
除了用於轉形植物的多種技術之外，與外來基因接 觸的組織類型也可變化。該組織包括，但不限於，胚性組織，癒合組織類型I、II及III，胚軸(hypocotyls)、分生組織(meristem)、根組織、用於韌皮中表現的組織等。幾乎所有植物組織皆可於分化期間使用本文所揭示的合適技術予以轉形。
如上文所述，可使用各種的可選擇標記。對於特別標記的偏好係由此項技術領域中具有通常知識者予以處理，但可使用任何下述可選擇標記以及任何其他未列示於本文之可作用為可選擇標記的基因。該等可選擇標記包括，但不限於，編碼對抗生素卡那黴素、新黴素及G41的抗性的跳躍子Tn5(Aph II)的胺基糖苷磷酸轉移酶；潮黴素抗性；甲氨喋呤抗性，以及編碼對於嘉磷塞之抗性或耐受性之基因；草胺膦(雙丙胺膦(bialaphos)或草丁膦)；ALS-抑制除草劑(咪唑啉酮類、磺醯脲類及三唑并嘧啶除草劑)、ACC-ase抑制劑(例如，芳基氧基丙酸酯類或環己烷二酮類)以及其他如溴甲腈(bromoxynil)及HPPD-抑制劑(例如，硝草酮(mesotrione))等。
除了可選擇標記之外，可期望使用報導子基因。某些情況中，報導子基因可與或不與可選擇標記使用。報導子基因為典型不存在接受體器官或組織中的基因且典型編碼造成某些表現型改變或酵素性質的蛋白質。該等基因的實例係提供於Weising等，1988。較佳的報導子基因包括大腸桿菌的uidA位點的β-尿甘酸化物酵素(GUS)、來自大腸桿菌的Tn9的氯黴素乙醯轉移酶基因、來自生物冷光水母(維多利亞多管發光水母(Aequorea Victoria)的綠色螢光蛋白質以及來自螢火蟲(北美螢火蟲(Photinus pyralis)之螢光素酶(luciferase)基因。然後於該基因以導入至接受體 細胞一段適合的時間後可進行用以偵測報導子基因表現的測試。較佳的該等測試意味著如Jefferson等(1987)所揭示之使用編碼大腸桿菌的uidA位點的β-尿甘酸化物酵素(GUS)的基因去鑑定轉形細胞。
除了植物啟動子調控單元之外，可使用來自各種來源的啟動子調控單元以有效地於植物細胞表現外來基因。例如，可使用細菌起源的啟動子調控單元，如章魚鹼合成酶(octopine synthase)啟動子、胭脂鹼合成酶(nopaline synthase)啟動子、甘露鹼合成酶(mannopine synthase)啟動子；病毒起源的啟動子，如十字花科嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus)(35S及19S)、35T(其係再工程化的35S啟動子，參照美國專利第6,166,302號，特別是實施例7E)等。植物啟動子調控單元包括，但不限於，核酮糖-1,6-二磷酸(RUBP)羧化酶小次單元(ssu)、β-伴大豆球蛋白(beta-conglycinin)啟動子、β-菜豆蛋白(beta-phaseolin)啟動子、ADH啟動子、熱-休克啟動子以及組織特異性啟動子。可存在其它單元如基質粘附區域、支架(scaffold)黏附區域、內含子、增強子、多腺苷序列等且因此可改良轉錄有效性或DNA整合性。該等單元可為或不為DNA功能所需，然而其可藉由影響轉錄、mRNA安定性等而提供DNA的較佳表現或功能。該等單元如期望可包括於DNA以獲得轉形DNA於植物中的最適運作。典型的單元包括，但不限於，Adh-內含子1、Adh-內含子6、紫花苜蓿嵌紋病毒包覆蛋白質導引序列、滲調蛋白(osmotin)UTR序列、玉米條紋病毒包覆蛋白質導引序列、以及其此項技術領域可取得者。亦可組成性啟動子調控單元藉此於所有細胞類型中且於所有時間導向連續基因表現 (例如，肌動蛋白(actin)、泛素(ubiquitin)、CaMV 35S等)。組織特異性啟動子調控單元係於特異的細胞或組織類型中負責基因表現，如葉或種子(例如，玉米醇溶蛋白(zein)、油質蛋白(oleosin)、貯藏蛋白(napin)、ACP、球蛋白(globulin)等)且也可使用該等。
啟動子調控單元可於於植物發展的某些階段為活性(或不活性)以及於植物組織及器官中為活性。該等之實例包括，但不限於，花粉特異性、胚特異性、玉米-鬚特異性、棉花-纖維特異性、根特異性、種子-胚乳特異性或營養階段特異性的啟動子調控單元等。在某些情況下，可期望使用誘導型啟動子調控單元，該誘導型啟動子調控單元負責回應於特定信號的基因表現，如：物理刺激物(熱休克基因)、光(RUBP羧化酶)、荷爾蒙(Em)、代謝物、化學藥物(四環素應答型)及應激。可以使用其他在植物中有功能的期望的轉錄和翻譯單元。多數種植物-特異性基因轉移載體已知於此項技術領域。
以植物RNA病毒為主的系統也可以用於表現細菌蛋白質。在這樣的操作中，可以將編碼蛋白質的基因插入將感染感興趣的宿主植物的合適植物病毒的外殼啟動子區域。然後可以表現該蛋白質，因此提供植物免於除草劑損害的保護。以植物RNA病毒為主的系統在揭示於Mycogen Plant Sciences,Inc.的美國專利第5,500,360號和Biosource(現為Large Scale Biology)的美國專利第5,316,931號及第5,589,367號。
進一增加耐受性或抗性程度的手段。本文顯示本發明的植物可被賦予新穎除草劑抗性性狀而於包括產量的表現型無可觀察的不良效果。該等植物係於本發明範疇中。本文所例示與 建議的植物例如可經得起至少一種本發明除草劑之2 x、3 x、4 x及5 x典型施用程度。於該等耐受性程度的改良係於本發明範疇中。例如，已知於此項技術領域之各種技術，且可預見對於規定的基因可最適化及進一步發展。
一種該等方法包括增加本發明AAD-12基因(於表現匣中等)的組數。轉形個案亦可用於選擇具有多組的基因。
強力的啟動子及增強子可使用於「增壓」(supercharge)表現。該等啟動子的實例包括使用35S增強子的較佳35T啟動子。35S、玉米泛素、阿拉伯芥泛素、A.t.肌動蛋白及CSMV啟動子包括於該等用途。其他的強力病毒啟動子亦為較佳。增強子包括4OCS及35S雙重增強子。基質粘附區域(MAR)亦可使用於增加轉形效率及基因轉殖表現。
改組(Shuffling)(演化導向)及轉錄音子亦可使用於本發明之具體例。
各種蛋白質亦可設計於序列等級不同但仍保留相同或類似的整體的主要三為結構、表面電荷分布等。參照例如美國專利第7,058,515；Larson等，Protein Sci.2002 11：2804-2813,“Thoroughly sampling sequence space：Large-scale protein design of structural ensembles”；Crameri等，Nature Biotechnology 15,436-438(1997),“Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling”；Stemmer,W.P.C.1994.“DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：in vitro recombination for molecular evolution” Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer,W.P.C.1994.“Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling”Nature 370：389-391；Stemmer,W.P.C.1995.Searching sequence space.Bio/Technology 13：549-553；Crameri,A.，等1996.“Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling”Nature Medicine 2：100-103；and Crameri,A.，等1996.“Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling”Nature Biotechnology 14：315-319。
插入至植物細胞的重組多肽的活性可受到緊鄰插入的內生性植物DNA的影響。因此，另一選項係利用已知於植物基因體中為用於插入的優良場所。參照例如WO 2005/103266 A1，相關於cry1F及cry1Ac棉花個案；本發明AAD-12基因可被取代於該等基因體位點以取代cry1F及/或cry1Ac插入。因此，例如，根據本發明可使用目標的同源性重組。此類型的技術，例如為WO 03/080809 A2及對應美國公開案20030232410的主體，相關於使用鋅指(zinc fingers)用於目標重組。亦已知使用重組酶(例如cre-10 x及flp-frt)。
咸信AAD-12去毒化係發生於細胞質。因此，用於進一步安定此蛋白質及mRNA(包括阻斷mRNA降解)系包括於本發明之態樣，且因此可應用已知於此項技術領域的技術。本發明蛋白質可設計為對抗因蛋白酶等的降解(蛋白酶裂解位點可藉由再工程化蛋白質的胺基酸序列而有效地移除)。該等具體例包括使用f 5'及3'莖結構如來自滲調蛋白的UTRs，及per5(AU-富含之未轉譯5'序列)。也可使用5'帽如7-甲基或2'-O-甲基，例如，7-甲基單磷酸鳥苷殘基。參照例如：Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.74,No.7,pp.2734-2738(July 1977)Importance of 5'-terminal blocking structure to stabilize mRNA in eukaryotic protein synthesis。亦可使用蛋白質複合物或配體阻斷基。
對於最適合AAD-12(合成髮夾)的5'或3' UTR的演算設計亦可於本發明範疇中進行。一般而言，電腦模式化，以及基因改組及演化導向係於本文他處討論。更具體地，關於電腦模式化及UTR，用於本發明之預測/評估5’及3’UTR衍生物的電腦模式化技術包括，但不限於：MFold version 3.1可得自Genetics Corporation Group,Madison,Wis.(參照Zucker等，Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction：A Practical Guide.In RNA Biochemistry and Biotechnology,11-43,J.Barciszewski & B.F.C.Clark,eds.,NATO ASI Series,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht,NL,(1999)；Zucker等，Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure.J.Mol.Biol.288,911-940(1999)；Zucker等，RNA Secondary Structure Prediction。In Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry S.Beaucage,D.E.Bergstrom,G.D.Glick,and R.A.Jones eds.,John Wiley & Sons,New York,11.2.1-11.2.10,(2000)),COVE(RNA structure analysis using covariance models(stochastic context free grammar methods))v.2.4.2(Eddy & Durbin,Nucl.Acids Res.1994,22：2079-2088)其為免費地分布作為分數碼且其可藉由登入下述網站下載genetics.wust1.edu/eddy/software/，以及FOLDALIGN亦為免費分布且可於下述網站下載取得bioinf.au.dk.FOLDALIGN/(參照Finding the most significant common sequence and structure motifs in a set of RNA sequences.J.Gorodkin,L.J.Heyer and G.D. Stormo.Nucleic Acids Research,Vol.25,no.18 pp 3724-3732,1997；Finding Common Sequence and Structure Motifs in a set of RNA Sequences.J.Gorodkin,L.J.Heyer,and G.D.Stormo.ISMB 5；120-123,1997)。
本發明之具體例可使用與天然放出或化學誘發的突變株結合(突變株可藉由篩選技術選擇，然後利用AAD-12其可能的其他基因轉形)。本發明的植物可與ALS抗性及/或放出的嘉磷塞抗性合併。例如，胺草啶(Aminopyralid)抗性亦可與AAD-12基因合併或「堆疊」。
傳統育種技術亦可與本發明組合以有效地合併、滲入及改良所期望的性狀。
進一步的改良也包括使用合適的保護劑(safener)以進一步保護植物及/或添加對更多除草劑的交叉抗性。保護劑典型地活化/表現cP450而作用為增加植物免疫系統。保護劑為藉由生理或分子機制而降低除草劑對作物植物的光毒性，而不損毀雜草防治有效性。
除草劑保護劑包括解草酮(benoxacor)、解毒喹(cloquintocet)、解草胺腈(cyometrinil)、二氯丙烯胺(dichlormid)、二環隆酮(dicyclonon)、二乙草酯(dietholate)、解草唑(fenchlorazole)、解草唳(fenclorim)、解草胺(flurazole)、氟草肟(fluxofenim)、呋喃解草唑(furilazole)、雙苯噁唑酸(isoxadifen)、吡唑解草酸(mefenpyr)、孟啡酯(甲基胺基甲酸4-氯苯基酯)(mephenate)、萘酸酐(naphthalic anhydride)及解草臆(oxabetrinil)。植物活化子(藉由活化其防衛機制而保護化合物的新類型化合物)亦可使用於本發明之具體例。該等 包括阿拉酸式苯(acibenzolar)及撲殺熱(probenazole)。
市售保護劑可使用於保護大種子的禾科作物，如玉米、高粱及水稻稻米，對抗種植前併入或發芽前施用之硫代甲酸酯及氯乙烯苯胺家族的除草劑。保護劑亦已開發以保護冬季榖類作物如小麥對抗發芽前施用的芳基氧基苯氧基丙酸酯及磺醯脲除草劑。亦已建立使用保護劑用以保護玉米及稻米對抗磺醯脲、咪唑啉酮、環己烷二酮、異噁唑及三酮除草劑。於經保護植物之保護劑-誘發之除草劑去毒性化的增強廣為被接受作為涉及保護劑作用的主要機制。保護劑誘發共因子如胱榖甘肽及除草劑-去毒性化酵素如胱榖甘肽S-轉移酶、細胞色素P450單氧化酶及糖苷轉移酶。Hatzios K K,Burgos N(2004)"Metabolism-based herbicide resistance：regulation by safeners," Weed Science：Vol.52,No.3pp.454-467。
細胞色素p450單氧化酶與AAD-12堆疊的用途為一較佳具體例。例如有P450類涉及除草劑代謝；cP450可為源自哺乳動物或植物。於高等植物中，細胞色素P450單氧化酶(P450)已知進行二次代謝。其亦與NADPH-細胞色素P450氧化還原酶(還原酶)合作於異生物質的氧化代謝中扮演要角。對某些除草劑的抗性已被報導為藉由P450以及穀胱甘肽S-轉移酶的代謝結果。於哺乳動物中涉及異生物質代謝的多數的微粒體P450種類已藉由分子選殖倍特徵化。其等某些被報導有效地代謝數種除草劑。因此，具有植物或哺乳動物P450的基因轉殖植物對數種除草劑可顯示抗性。
前述之一較佳具體例為利用cP450對於乙草胺(乙 草胺為基礎之產物包含Surpass®、Keystone®、Keystone LA、FulTime®及TopNotch®除草劑)及/或三福林(trifluralin)(如Treflan®)的抗性。該等於大豆及/或棉花的抗性係包含於某些較佳具體例。關於該等具體例的額外指導方針，參照例如Inui等，"A selective mark using cytochrome P450 monooxygenases for Arabidopsis transformation," Plant Biotechnology 22,281-286(2005)(關於經由使用人類細胞色素P450單氧化酶固定除草劑之農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)之阿拉伯芥轉形的選擇系統；除草劑耐受種苗係經轉形且以除草劑乙草胺(acetochlor)、甲基胺草磷(amiprophos-methyl)、氯苯胺靈(chlorpropham)、氯磺隆(chlorsulfuron)、噠草伏(norflurazon)及施德圃(pendimethalin))；Siminszky等，"Expression of a soybean cytochrome P450 monooxygenase cDNA in yeast and tobacco enhances the metabolism of phenylurea herbicides," PNAS Vol.96,Issue 4,1750-1755,Feb.16,1999；Sheldon等，Weed Science：Vol.48,No.3,pp.291-295,"A cytochrome P450 monooxygenase cDNA(CYP71A10)confers resistance to linuron in transgenic Nicotiana tabacum"；及"Phytoremediation of the herbicides atrazine and metolachlor by transgenic rice plants expressing human CYP1A1,CYP2B6,and CYP2C19," J Agric Food Chem.2006 Apr.19；54(8)：2985-91(關於測試稻米中人類細胞色素p450單氧化酶，其中該稻米植物經報導顯示對氯乙醯胺類(chloroacetomides)(乙草胺(acetochlor)、甲草胺(alachlor)、異丙甲草胺(metoachlor)、普拉草(pretilachlor)及噻吩草胺(thenylchlor))、氧基乙醯胺類(oxyacetamides)(苯噻草胺(mefenacet))、噠嗪酮類(pyridazinones)(噠草呋(norflurazon))、2,6-二硝基苯胺類(dinitroanalines)(三福林(trifluralin)及施得圃 (pendimethalin))、磷醯胺類(phosphamidates)(甲基胺草磷(amiprofos-methyl)、硫代胺基甲酸酯類(thiocarbamates)(稗草畏(pyributicarb))及脲類(氯麥隆(chlortoluron)))。
亦有可能改變或使用不同的2,4-D化學物以更有效率的製造AAD-12基因。該等可能的變化包括創造較佳受質以及較佳脫離基團(較高的電磁性)。生長素轉運子抑制劑(例如，氟吡草腙(Diflufenzopyr))也可使用於增加具有2,4-D的除草劑活性。
除非具體指明或指示，如使用於本文之用語"一"、”一個"及"該"意指"至少一者"。所有本文所引用之專利、申請案、臨時申請案及文獻，其內容皆以參考方式併入本文且其內容與本說明之教示不相衝突。
下述實施例說明實施本發明之步驟。該等實施例不應視為限制。除非特別指明，所有百分比以重量計之且所有溶劑混合物比例以容積計之。
實施例 實施例1
用於鑑定植物中賦予對2,4-D抗性之基因的方法
關於鑑定植物中具有除草劑降解活性的基因之道，可能是挖掘例如NCBI(生物技術資訊國家中心)之目前公開的資料庫。要開始此程序，必須有經鑑定編碼所期望特徵(亦即，α-酮基戊二酸二氧酶活性)之蛋白質的功能性基因序列。然後使用此蛋白質序列作為用於BLAST(基礎局部對準搜尋工具)(Altschul等，1997)演算法的輸入以對於可取得之經存放於NCBI的蛋白質序列進行比較。使用預設值，此搜尋於各種程級回送多達100個 同源蛋白質序列。這些蛋白質序列範圍在胺基酸程級由高度同一性(80至98%)至非常低同一性(23至32%)。傳統上，只有具高度同源性的序列期望保有與輸入序列相似的性質。此情況中，只選擇大於或等於(.gtoreq.(greater than or equal))50%同源性的序列。作為本文中的示例，選殖與重組表現具有低至31%胺基酸保留(相對於來自真氧產鹼桿菌(Ralstonia eutropha)之tfdA)之同源性可使用於賦予商業程級的抗性不僅是對於所欲之除草劑，也對於之前未以這些酵素測試的基質。
自NCBI資料庫(參照ncbi.nlm.nih.gov website；讀取編號#AF516752)鑑定單一基因(sdpA)僅具有對tfdA為31%胺基酸同一性的同源性。同一性百分比係由存放於資料庫之sdpA與tfdA兩個DNA序列第1轉錄為蛋白質而測定，然後使用於VectorNTI套裝軟體的ClustalW進行多序列對準。
實施例2
植物及細菌中序列表現的最適化
為獲得植物中較高程級的異源性基因表現，較佳可再工程化編碼該等序列的蛋白質以使該等於植物細胞中更有效率地表現。玉米為該等植物之一，其中較佳可於轉形前重新設計編碼區域的異源性蛋白質以於植物中增加基因程級的表現與所編碼蛋白質的表現。因此，於編碼細菌蛋白質的基因的設計中的額外步驟係再工程化異源性基因用以最適化表現。
a括號內的數字為此分類的基因數目。b括號內的數字為標準偏差。c於平均值計算中忽略合併群組的平均值。
玉米中用於表現的細菌蛋白質的再工程化的一個理由係因為原生基因的G+C涵量的未最適化。例如，許多原生細菌基因非常低的G+C含量(以及結果傾向於高的A+T含量)造成產生的序列模仿或重複以之為高富含A+T的植物基因調控序列。於導入至植物的基因的DNA內某些富含A+T序列的存在(例如，正常可見於基因啟動子的TATA盒區域)可造成基因的異常轉錄。另一方面，留在經轉錄mRNA的其他調節性序列的存在(例如，聚腺核苷化訊號序列((AAUAAA)，或互補於涉及前-mRNA剪切的小的核酸RNA的序列)可導致RNA的不穩定性。因此，編碼細菌蛋白質的基因的設計用以最適化表現的一目標，更佳為關於植物最適化基因，係產生具有較高G+C含量的DNA序列，且較佳地為接近於編碼用於代謝酵素的玉米基因者。編碼細菌蛋白質的植物最適化基因另一目標係產生其中序列修改不為較高轉譯的DNA序列。
表2說明與米中G+C含量的高含量。表2中的數據，基因的編碼區域係由GenBank(Release 71)入口資料取得，以 及鹼基組成係使用MacVectorTM程式(Accelerys,San Diego,Calif.)計算。內含子序列於計算中被忽略。
由於基因編碼的重複性/簡併性所提供的可適應性(亦即，某些胺基酸由多於一個編碼予以特定化)，於不同有機體或不同類有機體的基因體演化已造成重複性編碼的不同用途。此「編碼偏差」反映於蛋白質編碼區域的平均鹼基組成。例如，具有相對低G+C含量的有機體於利用於重複性編碼的第三個位置具有A或T的編碼，反之，具有較高G+C含量者則利用於第三位置具有G或C的編碼。咸認為於mRNA內的微量編碼存在可能降低mRNA的絕對轉譯率，特別是當回應於此微量編碼的所改變的tRNA的相對富含量低時。此項的延伸為藉由各別微量編碼的轉義率的減值為對於多種微量編碼的至少一額外加成。因此，具有相對高含量的微量編碼的mRNA將具有回應地低轉譯率。此轉譯率將藉由後續的所編碼蛋白質的低濃度而反映。
於玉米(或其他植物，如棉花或大豆)中編碼細菌蛋白質的再工程化基因的表現中，可測定植物的編碼偏差。對於玉米的編碼偏差為植物用於編碼其蛋白質的統計上編碼分布且較佳編碼使用係示於表3。測定這些偏差後，測定感興趣基因中的編碼頻率百分比。應測定植物的較佳主要編碼，以及當多重選擇存在時的較佳編碼的第二、第三及第四選項。然後可設計編碼細菌蛋白質的胺基酸序列的新的DNA序列，但是該新的DNA序列藉由特定於蛋白質胺基酸序列內各位置的胺基酸的植物編碼(第一較佳、第二較佳、第三較佳或第四較佳)的取代而不同於原生的細 菌DNA序列(編碼該蛋白質)。然後，分析此新序列之藉由修改所可能具有的限制效素位點。相同位點藉由以第一、第二、第三或第四選項的較佳編碼置換該等位點而進一步修改。將影響感興趣基因的轉錄或轉譯的序列中的其他位點為外顯子：內含子接合處(5’或3’)、聚腺核苷酸加成信號、或RNA聚合酶終止信號。進一步分析與修改該序列以降低TA或GC重複的頻率。除了重複之外，具有相同的多餘約四個殘基的G或C序列塊段可影響該序列的轉錄。因此，這些塊段也藉由以次一較佳編碼選項置換第一或第二選項而予以修改。
較佳為編碼細菌蛋白質的植物最適化基因含有約63%的第一選項編碼、界於約22%至約37%的第二選項編碼以及藉於約10%至約0%的第三或第四選項編碼，其中總百分比為100%。最佳為植物最適化基因含有約63%的第一選項編碼、至少約22%的第二項編碼、約7.5%的第三選項編碼集約7.5%的第四選項編碼，其中總百分比為100%。上述所揭示的方法能使此項技術者修改對於特定植物為外來的基因，而使該等基因最適化表現於植物。該方法進一步揭示於PCT申請案WO 97/13402。
因此，為了設計編碼細菌蛋白質的植物最適化基因，利用由對於特定植物或植物群的基因序列所編纂的編碼偏差表所建立的重複性基因編碼而設計編碼該蛋白質的胺基酸序列的DNA序列。所得DNA序列具有較高程度的編碼多歧性，所期望的鹼基組成，可含有策略性射製的限制效素辨識位點，且缺乏可能干擾基因轉錄、或產生mRNA轉譯的序列。因此，可使用功能性相等於目標發明的蛋白質/基因的合成基因轉形宿主，包括植 物。關於合成基因產生的額外方針可見於例如，美國專利第5,380,831號。
AAD-12植物重建分析：原生AAD-12編碼區域(參照序列編號：1)的DNA序列的876個鹼基對的廣泛分析顯示被認為對最適植物表現為不利的數個序列功能域，以及非最適編碼組成的存在。由序列編號：1所編碼的蛋白質呈現為序列編號：2。為了改良單子葉植物以及雙子葉植物中重組蛋白質的產生，開發出「植物最適化」DNA序列AAD-12(v1)(序列編號：3)其編碼蛋白質(序列編號：4)，該蛋白質與原生序列編號：2相同，除了於第二位置(於序列編號：4加底線)加成丙胺酸殘基外。加成的丙胺酸殘基編碼(GCT；於序列編號：3加底線)編碼生成ATG轉譯起始編碼的部分的NcoI限制效素辨識位點(CCATGG)。因此，其作為有助於選殖操作的後續操作同時改良環繞於ATG起始編碼的序列的雙重目的以最適化轉譯起始。由原生及植物最適化編碼區域所編碼的蛋白質為99.3%同一性，僅於第2號胺基酸不同。相對於此，編碼區域的原生及植物最適化(v1)的DNA序列僅為73.9%同一性。
表4顯示原生(A欄與D欄)以及植物最適化序列(B欄與E欄)的鹼基組成的差異且給予理論植物最適化序列(C欄與F欄)的比較。由表4的檢測清楚可知原生與植物最適化編碼區域，同時編碼接近相同的蛋白質，彼此為實質上不同。植物最適化版本(v1)接近模仿編碼AAD-12蛋白質的理論植物最適化編碼區域的鹼基組成。
重建大腸桿菌(E.coli)表現：大腸桿菌(Escherichia coli)的特殊工程化菌株以及相關載體系統通常用於產生相對大量的蛋白質以供生物化學與分析研究。有時發現編碼所期望蛋白質的原生基因不適合於大腸桿菌中高濃度表現，即使該基因的有 機體來源可能為另一細菌菌種。於該等情況中可能且期望在工程化編碼該基因區域的蛋白質以使其更為示合表現於大腸桿菌。大腸桿菌第二類基因係定義於大腸桿菌細胞的對數生長期間為高度且持續表現者(Henaut,A.和Danchin,A.(1996)in Escherichia coli and Salmonella typhimurium cellular and molecular biology,vol.2,pp.2047-2066.Neidhardt,F.,Curtiss III,R.,Ingraham,J.,Lin,E.,Low,B.,Magasanik,B.,Reznikoff,W.,Riley,M.,Schaechter,M.and Umbarger,H.(eds.)American Society for Microbiology,Washington,D.C.)。經由檢測大腸桿菌第二類基因的編碼區域的鹼基組成，可設計與均化對於這些大腸桿菌第二類基因編碼區域的鹼基組成。
咸認為具有模仿第二類基因的平均編碼組成的蛋白質編碼區域於大腸桿菌的對數生長期間的表現為有利的。使用這些準則，根據大腸桿菌第二類基編碼去域的平均編碼組成而設計編碼AAD-12蛋白質(序列編號：4)；包含如上所述於第二位置的加成丙胺酸)的新DNA序列。此起始許序列，其設計係僅基於鹼基組成，進一步工程化已包含適合用於選殖至大腸桿菌表現載體的某些限制效素辨識序列。避免例如高度適合莖環結構之減值序列特徵，如同同源於16S核糖體RNA的3’端的基因內序列(L e.Shine Dalgarno sequences)。大腸桿菌最適化序列(v2)揭示於序列編號：5以及所編碼的蛋白直揭示於序列編號：4。
原生與大腸桿菌最適化(v2)DNA序列為84.0%同一性，而植物最適化(v1)與大腸桿菌最適化(v2)DNA序列為76.0%同一性。表5呈現原生AAD-12編碼區域的編碼組成(A欄與D欄)、最適化用以表現於大腸桿菌的AAD-12編碼區域(v2；B欄與E欄) 以及具有大腸桿菌第二類基因之最適化編碼組成的AAD-12蛋白質的理論編碼區域的編碼組成(C欄與F欄)。
由表6的檢測清楚可知原生與大腸桿菌最適化編碼區域，同時編碼接近同一的蛋白質，係實質上不同於另一者。大腸桿菌最適化版本(v2)接近模仿編碼AAD-12蛋白質的大腸桿菌最適化編碼區域的編碼組成。
編碼具有授予嘉磷塞耐受性的圖變的大豆EPSPS的大豆-編碼-偏差DNA序列的設計。此實施例教示編碼突變的大豆5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvoylshikimate 3-phosphate synthase(EPSPS)的新DNA序列的設計，但是最適化用以表現於大豆細胞。三重突變的大豆EPSPS的胺基酸序列揭示於WO 2004/ 009761的序列編號：5。於所揭示的序列中經圖變的胺基酸為殘基183(原生蛋白質的蘇胺酸經以異白胺酸置換)、殘基186(原生蛋白質的精胺酸經以離胺酸置換)以及殘基187(原生蛋白質中的脯胺酸經以絲胺酸置換)。因此，藉由以原生胺基酸於合適位置置換WO 2004/009761之序列編號：5的經取代胺基酸可推斷原生大豆EPSPS蛋白質的胺基酸序列。該原生蛋白質序列揭示於PCT/US2005/014737的序列編號：20(申請於2005年5月2日)。雙重突變的大豆EPSPS蛋白質序列，含有突變於殘基183(原生蛋白質的蘇胺酸經以異白胺酸置換)以及殘基187(原生蛋白質中的脯胺酸經以絲胺酸置換)係揭示於PCT/US2005/014737的序列編號：21。
對於大豆(極大甘胺酸)蛋白質編碼序列的編碼使用表，計算自362,096編碼(接近870編碼序列)，取得自"kazusa.or.jp/codon" World Wide Web site。這些數據重新格式化呈現於表6。表6的D欄與H欄呈示對於各胺基酸的同義編碼的分布(對各胺基酸之所有編碼的使用%)，如同大豆基因的蛋白質編碼區域所見。其證實對於某些胺基酸的某些同義編碼(胺基酸可由1、2、3、4、5或6個編碼特定化)於大豆蛋白質編碼區域呈現相對稀少(例如，特定化丙烯酸的GCG與GCT編碼的使用比較)。
偏差的大豆編碼使用表係由表6的數據計算。忽略可見於大豆蛋白質之對於特別胺基酸的總發生率的10%的編碼。為了平衡對於胺基酸所選擇的其餘編碼的分布，使用下述公式計算各編碼的加權平均表示式：C1之加權%=1/(%C1+%C2+%C3+等等)x %C1 x 100其中C1為公式中的編碼，C2、C3、等等表示其餘的同義編碼， 以及對於相對編碼的%值係取自表6的D欄與H欄(忽略粗體的稀有編碼值)。對於各編碼的加權%值係提供於表6的C欄與G欄。TGA係獨斷地選擇作為轉譯終止子。然後輸入偏差編碼使用頻率製特殊化基因編碼表以為OptGeneTM基因設計程式(Ocimum Biosolutions LLC,Indianapolis,Ind.)所使用。
為了衍生編碼雙重突變的EPSPAS蛋白質的大豆最適化DNA序列，將來自PCT/US2005/014737的序列編號：21的蛋白質序列藉由OptGeneTM程式使用上述大豆偏差基因編碼反轉譯。然後將由此衍生的起始DNA序列藉由補償編碼變換予以修改(同時對於該些編碼保留完整加權平均表示式)以降低相鄰編碼之間的CG與TA重複的數目，增加相鄰編碼之間的CT與TH重複的數目，移除高度安定的股間二級結構，移除或增加限制效素辨識位點，以及移除可能減低工程化基因的表現或選殖的製備的其他序列。作成序列的進一步精製化以去除前在的植物內含子剪切位點，長距離的A/T或C/G殘基，以及可能於植物細胞中干擾編碼區域的RNA安定性、轉錄或轉譯的其他功能域。作成其他變換以去除長的內部開放讀架(Open Reading Frames(讀架非為+1))。這些變換皆如上所述之保留大豆偏差編碼組成之限制中作成，同時保存揭示於PCT/US2005/014737之序列編號：21的胺基酸序列。
編碼序列編號：21的EPSPS蛋白質大豆-偏差DNA序列的係揭示於PCT/US2005/014737的序列編號：22的鹼基1-1575。包含PCT/US2005/014737的序列編號：22的DNA片段的合成係藉由市售供應者(PicoScript,Houston Tex.)實施。
實施例3
表現與轉形載體的選殖
構築大腸桿菌，PET表現載體：使用回應於位點的限制酵素添加額外的選殖連結子(Xba 1,Xho 1)的AAD-12(v2)由PicoScript載體切出，且接合至pET280鏈黴素/大觀酶黴素抗性載體。然後將接合產物轉形至TOP10F'大腸桿菌，且塗覆於Luria培 養液+50μg/ml鏈黴素及大觀黴素(LB S/S)瓊脂培養皿培養。
為了區分AAD-12(v2)：pET280與pCR2.1：pET280接合物之間的差異，大約20個經單離選殖株挑選至6ml的LB-S/S，且於37℃振盪下生長4小時。然後將各培養物點至LB+卡那黴素50μg/ml培養皿，於37℃培養隔夜。生長在LB-K的選殖株係推測為具有pCR2.1載體接合其中，且予以丟棄。如同之前由其餘培養物單離質體，且以XbaI/XhoI分解確認正確性。所提供最終表現構築體命名為pDAB3222。
構築假綠膿桿菌(Pseudomonas)表現載體：首先將AAD-12(v2)開放讀架選殖至經修飾的pET表現載體(Novagen)，“pET280 S/S”，作為XbaI-XhoI片段。所得質體pDAB725以限制酵素分解與定序反應予以確認。來自pDAB725的AAD-12(v2)開放讀架轉移至假綠膿桿菌表現載體，pMYC1803，作為XbaI-XhoI片段。陽性選殖株經由限制酵素分解予以確認。完整構築體pDAB739轉形至MB217與MB324假綠膿桿菌表現株。
完成二元載體：植物最適化基因AAD-12(v1)由Picoscript(基因再造設計為完整(參照上文)且外包至Picoscript用以構築)接收且內步驗證序列(序列編號：3)，以確認沒有所期望序列的改變存在。定序反應係以M13前置引子(序列編號：6)與M13反置引子(序列編號：7)使用Beckman Coulter“Dye Terminator Cycle Sequencing如前文所述利用Quick Start Kit”試劑進行。分析序列數據且結果顯示於植物最適化AAD-12(v1)DNA序列中沒有反常存在。將AAD-12(v1)基因選殖至pDAB726作為Nco I-Sac I片段。所得構築體命名為pDAB723，含有：[AtUbi10啟動子：Nt OSM 5'UTR：AAD-12(v1)：Nt OSM3'UTR：ORF1 polyA 3'UTR](以PvuII與Not I限制分解驗證)。然後將含有所述表達盒的Not I-Not I片段選殖至二元載體pDAB3038的Not I位點。所得二元載體，pDAB724，含有下述表達盒[AtUbi10啟動子：Nt OSM5'UTR：AAD-12(v1)：Nt OSM 3'UTR：ORF1 polyA 3'UTR：CsVMV啟動子：PAT：ORF25/26 3'UTR]進行限制分解(利用Bam HI、Nco I、Not I、SacI及Xmn I)以驗證正確的導向。經驗證的完整構築體(pDAB724)用於轉形至農桿菌(Agrobacterium)。
額外轉形構築物的選殖：創造用於轉形至合適植物種類的所有其他構築體係使用如本文先前所描述的類似步驟，以及其他標準的分子選殖方法(Maniatis等，1982)予以構築。
實施例4
轉形至阿拉伯芥(Arabidopsis)與選擇
阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)生長條件：野生型阿拉伯芥種子懸浮於0.1%瓊脂(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.)溶液。經懸浮的種子於4℃儲存2日以完成需要的休眠與確效同步種子發芽(層化)。
Sunshine Mix LP5(Sun Gro Horticulture,Bellevue,Wash.)以精細蛭石覆蓋且利用Hoagland溶液底部給水直到濕潤。使固體混合物排水24小時。層化種子播種於蛭石且以潮濕拱形物(KORD Products,Bramalea,Ontario,Canada)覆蓋7日。
種子發芽且植物於恆定的溫度(22℃)與濕度(40-50%)以120至150μmol/m2 sec的光強度的長的日間條件(16小時光/8小時暗)下生長於Conviron(模式CMP4030及CMP3244，對照led Environments Limited,Winnipeg,Manitoba,Canada)。植物起始以Hoagland氏溶液給水以及後續以去離子水保持土壤潮濕但不濕潤。
農桿菌(Agrobacterium)轉形：LB+瓊脂的培養皿具有紅黴素(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.)(200mg/L)或大觀黴素(100mg/L)含有挑染的DH5 α選殖株使用於提供選殖株以接種4ml微量培養物(液體LB+紅黴素)。該培養物於37℃以恆定振盪培養隔夜。使用Qiagen(Valencia,Calif.)Spin Mini Preps，實施製造商的指示，純化質體DNA。
電受容(Electro-competent)根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)(菌株Z707s、EHA101s及LBA4404s)細胞係使用來自Weigel及Glazebrook(2002)的方案製備。受容膿桿菌細胞使用修改自Weigel及Glazebrook(2002)的電穿孔方法予以轉形。將50μl的受容細胞溶解於冰且將10至25ng所期望的質體添加至細胞。DNA與細胞的混合物添加至經預冷的電穿孔管(electroporation cuvettes)(2mm)。使用Eppendorf Electroporator 2510以下述條件用以轉形，伏特：2.4kV，脈衝長度：5微秒(msec)。
電穿孔後，對管添加1ml之YEP培養液(每公升：10g酵母萃取物、10g Bacto-蛋白腖、5g NaCl)，且細胞-YEP懸浮物移轉至15ml培養管。細胞於28℃於水浴中以恆定振盪培養4小時。培養後，將培養物置於具有紅黴素(200mg/L)或大觀黴素(100mg/L)與鏈黴素(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.)(250mg/L)的YEP+瓊脂。培養皿於28℃培養2至4日。
選擇選殖株且挑染至新鮮YEP+瓊脂具有紅黴素 (200mg/L)或大觀黴素(100mg/L)與鏈黴素(250mg/L)培養盤且於28℃培養1至3日。選擇選殖株用於PCR分析藉由使用載體特異性引子以確認基因插入。使用Qiagen Spin Mini Preps，根據製造廠商的指示，由所選擇之具有以下例外之農桿菌選殖株純化質體DNA：15ml之4ml之分取隔夜微量準備培養物(液體YEP+紅黴素(200mg/L)或大觀黴素(100mg/L))與鏈黴素(250mg/L))使用於DNA純化。替代係使用Qiagen Spin Mini Prep DNA裂解經轉形之農桿菌細胞，懸浮於10μl水中，於100℃培養5分鐘。包含來自使用於同桿菌轉形之二元載體的質體DNA作為對照。使用得自Takara Mirus Bio Inc.(Madison,Wis.)的Taq DNA聚合酶根據製造廠商指示於0.5 x濃度完成PCR反應。PCR反應於MJ Research Peltier Thermal Cycler根據下述條件設定程式；1)94℃、3分鐘，2)94℃、45秒，3)55℃、30秒，4)72℃、1分鐘，進行29循環然後1循環於72℃、10分鐘。循環後反應維持於4℃。擴增物藉由1%瓊脂凝膠電泳分析且藉由溴化乙錠染色肉眼判別。選擇其PCR產物與對照質體相同的選殖株。
阿拉伯芥(Arabidopsis)轉形：阿拉伯芥使用花序浸漬法(floral dip method)轉形。所選擇之選殖株使用於接種一個或多個含有紅黴素(200mg/L)或大觀黴素(100mg/L)與鏈黴素(250mg/L)的YEP培養基的15至30ml預培養物。培養物於28℃以恆定振盪於220rpm培養隔夜。使用各預培養物接種二個含有紅黴素(200mg/L)或大觀黴素(100mg/L)與鏈黴素(250mg/L)的YEP培養基的培養物且該培養物以恆定振盪於28℃培養隔夜。細胞於室溫以約8700 x g、10分鐘形成沉澱，且拋棄所得上清部分。細胞沉澱物 溫和地再懸浮於500ml滲濾培養基含有：½ x Murashige與Skoog鹽類/Gamborg's B5維生素、10%(w/v)蔗糖、0.044μM苄基胺嘌呤(10μl/公升之1mg/ml母液於DMSO中)與300μl/公升Silwet L-77。約1個月大的植物浸自於培養基15秒，確定最新的花序浸入。然後將植物擺放於其側邊且覆蓋(透明或不透明)24小時，然後以水清洗，且放直。植物生長於22℃，以16-小時光/8-小時暗的光期。浸漬後約4週，收獲種子。
轉形植物的選擇：使新鮮收獲的T1種子[AAD-12(v1)基因]於室溫乾燥7日。T1種子種植於26.5 x 51-cm發芽盤(T.O.Plastics Inc.,Clearwater,Minn.)，各接受曾化T1種子的200mg分取樣品(約10,000個種子)其已預先懸浮於40ml的0.1%瓊脂膠溶液且於4℃儲存2日以完成休眠需要且確保同步化的種子發芽。
Sunshine Mix LP5(Sun Gro Horticulture,Bellevue,Wash.)以精細蛭石覆蓋且利用Hoagland溶液底部給水直到濕潤，然後使其重力排水。使固體混合物排水24小時。層化種子之各40ml分取樣品以滴管均勻接種至蛭石且以潮濕拱形物(KORD Products,Bramalea,Ontario,Canada)覆蓋4至5日。使用草丁膦突出後噴灑(選擇用於共轉形PAT基因)於起始轉形選擇的前1日移除拱形物。
種植7日後(DAP)以其再次於11 DAP，T1植物(分別為子葉與2-4-1葉階段)以Liberty除草劑(200g ai/L草丁膦，Bayer Crop Sciences,Kansas City,Mo.)之0.2%溶液以噴灑容積10ml/盤(703L/ha)使用DeVilbiss壓縮空氣噴灑頭進行噴灑以遞送每次施用為有效速率的280g ae/ha草丁膦。存活者(植物活性地生長)於 最終噴灑的4至7日後鍵定且各別轉移至以盆土基質(Metro Mix 360)所製備的3-英吋盆。所轉移的植物如同之前以潮濕的拱形物覆蓋3至4日且置放於22℃生長腔室或直接移至溫室。之後移除拱形物且植物在測試AAD-12(v1)(植物最適化基因)之前於溫室中培育(22±5℃、50±30% RH、14h光：10暗、最低500μE/m2 s1天然+補充光)至少1日以提供苯氧基生長素除草劑抗性。
然後T1植物隨機指定於各種比率的2,4-D。對於阿拉伯芥，50g ae/ha 2,4-D為去除來自具有顯著抗性程度者之敏感性質物的有效劑量。也施用增加的比率以測定相對抗性程度(50、200、800或3200g ae/ha)。
所有生長素除草劑施用係使用如上所述之DeVilbiss噴灑機進行以施用703L/ha噴灑容積(0.4ml溶液/3-英吋盆)或藉由履帶式噴灑機(track sprayer)以187L/ha噴灑容積施用。所使用之2,4-D為技術等級(Sigma,St.Louis,Mo.)經溶解於DMSO且稀釋於水中(<1% DMSO最終濃度)或為市售二甲基胺鹽調配物(456g ae/L,NuFarm,St Joseph,Mo.)。所使用之滴丙酸為市售等級經調配為R-滴丙酸的鉀鹽(600g ai/L,AH Marks)。隨著除草劑比率增加超過800g ae/ha，噴灑溶液的pH變成過酸，燒傷幼齡、幼嫩的阿拉伯芥植物的葉且複雜化該等除草劑之主要效果的評估。除草劑以200mM HEPES緩衝液，pH 7.5，高比例施用成為標準操作。
某些T1個體接受另外的除草劑以替代苯氧基生長素。有興趣的點為無論是吡啶基氧基乙酸生長除草劑、三氯比及氟氧比的測定，皆有效地於植物中降解。除草劑係以187L/ha噴灑容積利用履帶式噴灑機施用至T1植物。顯示對2,4-D DMA之 耐受性的T1植物進一步於T2世代中評估。
轉形植物的選擇結果：使用AAD-12(v1)(植物最適化基因)進行第1個阿拉伯芥轉形。轉形株使用草丁膦選擇方案由未轉形種子的背景選擇。篩選超過300,000個T1種子且鑑定316個草丁膦抗性植物(PAT基因)，相當於0.10%的轉形/選擇頻率，其位於使用PAT+資料庫選擇之構築體的選擇頻率的正常範圍內。上述所選擇之T1植物後續轉移至個別盆且以不同比率噴灑市售芳基氧基烷酸酯除草劑。
表7比較AAD-12(v1)與對照基因對阿拉伯芥T1轉形株賦予2,4-D抗性之回應。回應表示為可見損傷之2 WAT百分比(%)。數據呈現為個體顯現少或無損傷.(<20%)、中度損傷(20至40%)或嚴重損傷(>40%)之直方圖。由於各T1為獨立的轉形個案， 可於規定的比率內期待各別T1回應的顯著變化。對於各處理呈現算術平均與編準偏差。個別回應的範圍亦對各比率與轉形顯示於最後欄中。PAT/Cry1F-轉形阿拉伯芥作為生長素-敏感轉形對照。AAD-12(v1)基因對於個別T1阿拉伯芥植物賦予除草劑抗性。於規定處理內，植物回應的程度大幅變化且可歸責於各植物表示獨立轉形個案之事實。
應注意為，所測試的各2,4-D比率，有個體不受影響而某些嚴重受影響。總族群損傷平均比例呈現於表7簡略地顯 示以AAD-12(v1)轉形之植物相對於野生型或PAT/Cry1F-轉形對照之間的顯著差異。於增加比率達3,200g ae/ha(或~6 x田間比率)時損傷程度傾向越大且未損傷植物的頻率越低。於這些高比率時，除非經緩衝否則噴灑溶液變成高度酸性。多數生長於生長腔室之阿拉伯芥具有非常薄的表皮且嚴重燒傷效果可複雜化測試這些增加的比率。然而，許多個體以具有少或無損傷而存活於3,200g ae/ha 2,4-D。
表8顯示T1阿拉伯芥對苯氧基丙酸(滴丙酸)之類似進行劑量回應。數據顯示滴丙酸的除草活性®-異構物不作為AAD-12(v1)的合適基質。AAD-1將充分代謝R-滴丙酸以足以賦予市場可接受的耐受性的事實為分別該二基因的明顯特徵(表8)。咸信AAD-1與AAD-12被認為分別為R-與S-特異的α-酮基戊二酸二氧酶。
AAD-12(v1)作為可選擇標記：使用2,4-D作為選擇劑而使用AAD-12(v1)作為可選擇標記的能力首先利用如上所述之阿拉伯芥轉形而予以分析。大約50個T4世代的阿拉伯芥種子(為AAD-12(v1)同型合子)混至約5,000野生型(敏感)種子。比較數種杵哩，各植物盤以下述處理方案接受一次或二次時間點的2,4-D施用：7 DAP、11 DAP或7接著11 DAP。由於所有個體也含有PAT基因於相同轉形載體中，以2,4-D選擇AAD-12可直接以草丁膦所選擇的PAT相比較。
以先前所述之DeVilbiss噴灑管進行處理。植物經鑑定為抗性或敏感性17 DAP。最適處理為75g ae/ha 2,4-D於種植後(DAP)7及11日施用，於選擇頻率為同等有效，且對轉形個體比 資料庫選擇方案造成較少的除草劑損傷。這些結果顯示AAD-12(v1)對於轉形阿拉伯芥族群可有效地作為替代性可選擇標記。
遺傳可能性：多種T1個案係自花授粉以產生T2種子。這些種子藉由施用2,4-D(200g ae/ha)對100個隨機T2同屬成員(siblings)進行後代測定(progeny tested)。於噴灑施用前(履帶式噴灑機為187L/ha施用比率)各個別T2植物轉移至7.5-cm平方的盆中。T1家族(T2植物)的75百分比分離在預期的3個抗性株：1對於主要繼承的具有孟德爾遺傳性單一聚落的敏感模式以Chi平方分析(P>0.05)測定。
由12至20個T2個案的種子(T3種子)。來自8個隨機選擇的T2家族的23個T3同屬成員如上所述進行後代測定。於各品系中鑑定為約三分之一的T2家族預期為同型合子(非分離的族群)。這些數據顯示AAD-12(v1)為安定地整合且以孟德爾性狀遺傳至少三個世代。
於AAD-12阿拉伯芥之額外的葉部施用除草劑抗性：AAD-12(v1)於基因轉殖阿拉伯芥中提供對於其他芳基氧基烷酸酯生長素除草劑抗性的能力係藉由各種基質的葉部施用而測定。層化T2世代阿拉伯芥種子，且多數類似於阿拉伯芥的方式播種於選擇盤。含有PAT與昆蟲抗性基因的轉形-對照品系以類似方式種植。種苗轉移至溫室中個別3-吋盆。所有植物使用履帶式噴灑機以187L/ha噴灑。植物以一定範圍的吡啶基氧基乙酸除草劑噴灑：280-2240g ae/ha三氯比(Garlon 3A,Dow AgroSciences)與280-2240g ae/ha氟氧比(Starane,Dow AgroSciences)；以及來自AAD-12活性的2,4-D代謝物，2,4-二氯酚(DCP,Sigma)(莫耳等量於280-2240g ae/ha之2,4-D，使用技術等級DCP)。所有施用物調配於水中。各處理重複3至4次。植物於處理後3及14日評估。
2,4-D代謝物，2,4-二氯酚(DCP)，對於基因轉殖非AAD-12對照阿拉伯芥(Pat/Cry1F)沒有效果。AAD-12-轉形植物也清楚地由三氯比與氟氧比除草劑損傷受到保護，於轉形非抗性株對照可見到損傷(參照表9)。這些結果證實AAD-12(v1)於阿拉伯芥提供對於吡啶基氧基乙酸生長素測試的抗性。此係首先報導對於吡啶基氧基乙酸除草劑具有顯著活性的酵素。沒有其他2,4-D降解酵素被報導具有類似活性。
AAD-12(v1)阿拉伯芥的分子分析：對於PAT基因組數分析的侵染分析(Invader Assay)(Third Wave Agbio套組步驟的方法)以由Qiagen DNeasy套組對於多重AAD-12(v1)同型合子品系所獲得之總DNA進行，以測定含有PAT與AAD-12(v1)之植物轉形單元的安定整合。由於含於相同質體而分析推測為這些基因的直接物理連結。
結果顯示所分析的所有2,4-D抗性植物，含有PAT(且因而推論，AAD-12(v1))。組數分析顯示總插入範圍由1至5組。此也相關於AAD-12(v1)蛋白質表現數據顯示有對於所有市售可得之苯氧基乙酸與吡啶基氧基乙酸產生顯著高程度抗性的酵素存在。
利用AAD-12(v1)與嘉磷塞抗性基因的分子疊層物之阿拉伯芥轉形：如前文所述，製造T1阿拉伯芥種子，含有編碼嘉磷塞抗性特性之pDAB3759質體(AAD-12(v1)+EPSPS)。如上所述使用AAD-12(v1)作為可選擇標記選擇T1轉形株。由第一選擇嘗試回收T1植物(個別的轉形個案)且如上所述轉移至溫室中之3-吋盆。也測試三個不同的對照阿拉伯芥品系：野生型Columbia-0、AAD-12(v1)+PAT T4同型合子品系(pDAB724-轉形)及PAT+Cry1F 同型合子品系(轉形對照)。於種苗階段預選擇2,4-D耐受性的pDAB3759與pDAB724轉形植物。轉殖4日後，如上所述藉由履帶式噴灑機以0、26.25、105、420或1680g ae/ha嘉磷塞(Glyphomax Plus,Dow AgroSciences)於水中進行植物平均地葉部處理。所有處理重複5至20次。植物於處理7及14日後評估。
起始的抗性估算顯示當相較於三個對照品系的回應時，耐受於2,4-D的植物後續耐受於嘉磷塞。這些結果顯示可以不同作用模式對於植物賦予對該二除草劑的抗性，包括2,4-D與嘉磷塞耐受性，使得該二除草劑施用於出苗後。此外，AAD-12+2,4-D對於真實的抗性選擇有效地使用作為可選擇標記。
與AAD-1遺傳堆疊之AAD-12阿拉伯芥給予更廣譜的除草劑耐受性：AAD-12(v1)(pDAB724)與AAD-1(v3)(pDAB721)植物互交且收集F1種子。種植8個F1種子且使其生長至產生種子。由8個F1植物取得組織樣品且進行西方墨點分析以確認該二基因的存在。結論為所有8個植物測試表現AAD-1與AAD-12二蛋白質。聚集種子且於種植一週前使其乾燥。
播種100個F2種子且施用280g ai/ha草丁膦。存活於草丁膦選擇的96個F2植物符合對於所期望的草丁膦抗性(15 R：1 S)為獨立的二個獨立傳遞基因座的分離。然後以560g ae/ha R-滴丙酸+560g ae/ha三氯比處理草丁膦抗性植物，如使用於其他測試之相同噴灑方案下施用制植物。植物於3及14DAT分級。96個植物之63個存活於草丁膦選擇也存活於除草劑施用。這些數據與所期望的二個獨立傳遞主要特性的分離方式(9R：6S)相符，其中各基因僅對於生長素除草劑之一者提供抗性(R-滴丙酸或三氯比)。這些結果顯示AAD-12(pDAB724)可成功地與AAD-1(pDAB721)堆疊，因此增加除草劑範圍，該除草劑可施用至感興趣的作物[分別為(2,4-D+R-滴丙酸)與(2,4-D+氟氧比+三氯比)]。此有用於對非常敏感的物種經由傳統堆疊二個不同2,4-D抗性基因賦予2,4-D耐受性。此外，如果基因經由獨立轉形活性使用作為第 三個與第四個感興趣基因的可選擇標記，然後各基因對可一起經由傳統育種活性帶入且後續經由以除草劑配對噴灑於F1世代選擇，該除草劑排除於AAD-1與AAD-12酵素之間(如以R-滴丙酸與三氯比分別對於AAD-1與AAD-12)。
其他AAD堆疊物也在本發明範疇內。本文他處(Streber等)所討論之TfdA蛋白質(Streber等)，例如，可與目標之AAD-12基因一起使用以賦予本發明之基因轉殖植物的除草劑抗性範圍。
實施例5
使用咪唑乙烟酸選擇之玉米的WHISKERS媒介轉形
AAD-12(v1)之選殖：AAD-12(v1)基因自中間載體pDAB3283剪切為Nco1/Sac1片段。將其直接接合至經類似剪切之含有ZmUbi1單子葉啟動子的pDAB3403載體。使用T4 DNA接合酶一起接合該二片段且轉形至DH5 α細胞。使用Qiagen's QIA Spin mini prep kit對所得選殖株進行微量製備，且分解選殖株以確認導向。此第一中間構築體(pDAB4100)含有ZmUbi1：AAD-12(v1)表達盒。此構築體以Not1與Pvu1分解以釋出基因表達盒且分解不欲之骨架。此接合至Not1剪切的pDAB2212，其含有衍生自稻米肌動蛋白啟動子OsAct1的AHAS可選擇標記。最終構築體命名為pDAB4101或pDAS1863，且含有ZmUbi1/AAD-12(v1)/ZmPer5：OsAct1/AHAS/LZmLip。
癒合組織/懸浮起始物：為了獲得癒合組織培養起始物的不成熟胚囊，F1於溫室生長H-II親代A與B之間進行互交(Armstrong等1991)。當胚囊為1.0至1.2mm大小時(接近受粉後9至10日)，收集雌穗且以Liqui-Nox®肥皂清洗、於70%乙醇浸 漬2至3分鐘、然後於20%市售漂白劑(0.1%次氯酸鈉)浸漬30分鐘使表面無菌化。
於無菌、蒸餾水中潤洗雌穗，且未成熟合子胚囊經無菌性激化且於15Ag10培養基(N6 Medium(Chu等，1975)、1.0mg/L 2,4-D、20g/L蔗糖、100mg/L酪蛋白水解物(酵素性分解)、25mM L-脯胺酸、10mg/L AgNO3、2.5g/L Gelrite、pH 5.8)以子葉盤面對遠離培養基而培養2至3週。顯示合適形態的組織(Welter等，1995)以雙週間格選擇性轉移至新鮮15Ag10培養基持續約6週，然後以雙週間隔轉移至4培養基(N6 Medium、1.0mg/L 2,4-D,20g/L蔗糖、100mg/L酪蛋白水解物(酵素性分解)、6mM L-脯胺酸、2.5g/L Gelrite,pH 5.8)持續約2個月。
為了起始胚囊懸浮培養物，約3ml收集細胞容積(packed cell volume)(PCV)之源自單一胚囊的癒合組織添加至約30ml之H9CP+液體培養基(MS基礎鹽混合物(Murashige和Skoog,1962)，含有少於10倍的菸酸與高於5倍硫胺素的經修飾的MS維生素類、2.0mg/L 2,4-D、2.0mg/L α-萘乙酸(NAA)、30g/L蔗糖、200mg/L酪蛋白水解物(酵素性分解)、100mg/L肌-肌醇、6mM L-脯胺酸、5% v/v椰子水(恰於次培養前添加)，pH 6.0)。懸浮培養物維持於暗環境下於125培養燒瓶中在設定為125rpm的28℃溫度調控振盪器。細胞品系典型地於起始的2至3個月內建立。建立期間，每3.5日藉由添加3ml的PCV細胞與7ml的條件培養基使用寬口移液管進行次培養至20ml新鮮的H9CP+液體培養基。一旦組織於生長中開始加倍，放大懸浮物等級且維持於500ml燒瓶，據此將12ml PCV之細胞與28ml條件培養基轉移至80ml H9CP+培養基。一旦懸浮物完全建立，將其冷凍用於將來使用。
懸浮物的冷凍與解凍：次培養後2日，將4ml PCV之懸浮細胞與4ml之條件培養基添加至8ml之冷凍保護劑(溶解於H9CP+培養基而無椰子水、1M甘油、1M DMSO、2M蔗糖、過濾無菌化)且使其於125ml燒瓶中以125rpm於4℃振盪1小時。1小時候，4.5ml添加至經冷凍之5.0ml Corning冷凍館。一旦經填充的個別管於速率經調控的冷凍機終於4℃維持15分鐘後，使其以-0.5℃./分鐘的速率冷凍直到最終溫度-40℃。達到最終溫度後，將管轉移至Cryoplus 4儲存單元(Form a Scientific)之盒內有支架的盒中且以液態氮填充。
對於解凍，將館自儲存單元移出且置於密閉乾冰容器中，然後速放至維持在40至45℃的水浴中直到「沸騰」消退。當解凍後，內容物到至約8張無菌的70mm Whatman濾紙(No.4)疊於加蓋的100 x 25mm培養皿中。使液體吸收至濾紙數分鐘後，含有細胞的頂端濾紙轉移至GN6培養基(N6培養基，2.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、2.5g/L Gelrite,pH 5.8)維持1週。1週後，僅將具有確效型態的組織自濾紙移出直接放至新鮮.GN6培養基。此組織每7至14日次培養直到可獲得1至3克用於懸浮物起始至30ml H9CP+培養基於125培養燒瓶中。每3.5天將3毫升的次培養至新鮮H9CP+培養基直到總共獲得12ml PCV，於該時點次培養如前述發生。
安定的轉形：轉形前約24小時，12ml PCV之先前冷凍的玉米胚囊懸浮細胞加上28ml之條件培養基，於500ml培養燒瓶中次培養至80ml之GN6液體培養基(GN6培養基缺乏 Gelrite)，且置於125rpm的28℃振盪器中。使用相同細胞品系重複此操作2次以使總共36ml PCV分布於3燒瓶。24小時後，移除GN6液體培養基且各燒瓶以72ml GN6 S/M等張培養基(N6培養基，2.0mg/L 2,4-D,30g/L蔗糖、45.5g/L山梨醇、45.5g/L甘露糖醇、100mg/L肌-肌醇，pH 6.0)置換以使細胞胞漿分離。將燒瓶置於振盪器中於28℃黑暗中以125rpm振盪30至35分鐘且於此時藉由添加合適容積8.1ml之GN6 S/M液體培養基至約405mg之預先經高溫高壓滅菌的無菌碳化矽晶鬚(sterile silicon carbide whiskers(Advanced Composite Materials,Inc.))而製備碳化矽晶鬚的50mg/ml懸浮物。
於GN6 S/M中培養後，各燒瓶的內容物收集至250ml離新館。一旦所有細胞沉降於底部，排出所有約44ml之GN6 S/M液體且收集於無菌1-L燒瓶以供未來使用。晶鬚之預先濕潤的懸浮物於最高速度漩渦振盪60秒然後對管添加8.1ml，最後步驟對其添加170μg DNA。迅速將管置於經修改的Red Devil 5400市售漆料混合氣且振盪10秒。振盪後，細胞、晶鬚及DNA的混合物與125ml新鮮GN6液體培養基添加至該1-L燒瓶以降低等張溶質(osmoticant)。使細胞於28℃振盪器以125RPM回復2小時後使用連接至室內真空管線的玻璃細胞收集器單元過濾至Whatman #4濾紙(5.5cm)。
雖著拉出真空約2ml之經分散的懸浮物以滴管分取至濾紙表面。將濾紙放置在60 x 20mm盤之GN6培養基。將盤於暗盒中於28℃培養1週。
1週後，將濾紙轉移至60 x 20mm盤之GN6(3P)培 養基(N6培養基，2.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、100mg/L肌-肌醇、得自Pursuit® DG之3μM咪唑乙烟酸、2.5g/L Gelrite，pH 5.8)。將站於盒中且再培養一週。
轉形後二週，藉由刮取細胞將組織包埋於盤中至3.0ml之熔融的GN6瓊脂膠培養基(N6培養基，2.0mg/L 2,4-D,30g/L蔗糖、100mg/L肌-肌醇、7g/L Sea Plaque瓊脂膠，pH 5.8，於121℃高溫高壓滅菌僅10分鐘)含有得自Pursuit® DG之3M咪唑乙烟酸。弄破組織且將3ml之瓊脂膠與組織均勻地倒至100 x 15mm盤之GN6(3P)的表面。對所有其餘盤重複此操作。一旦包埋，各盤分別以Nescofilm®或Parafilm M®密封，然後培養直到呈現疑似的單離物。
用於單離物回復與再生的方案：疑似的轉形個案於轉形後約9週藉由轉移新鮮的相同濃度選擇培養基於60 x 20mm盤而自Pursuit®-含有包埋盤單離。如果約2至3週可見到持續生長，則該個案應為具抗性的且進行分子分析。
再生的起始係藉由將癒合組織轉移至細胞分裂素為主之誘導培養基，28(3P)，含有得自Pursuit.RTM.DG之3μM咪唑乙烟酸、MS鹽類與維生素類、30.0g/L蔗糖、5mg/L BAP、0.25mg/L 2,4-D、2.5g/L Gelrite；pH 5.7。使細胞於低亮度(13μEm-2 s-1)再生長一週後轉移至再生培養基，36(3P)，其與28(3P)相同惟缺少植物生長調節劑。移除小的(3-5cm)植株且放置於含有無選擇性SHGA培養基(Schenk與Hildebrandt基礎鹽類與維生素類；1g/L肌-肌醇、10g/L蔗糖、2.0g/L Gelrite,pH 5.8)150 x 25-mm培養管中。一旦植株漲出足夠的根與枝系系統，將其移植至溫室中的土壤。
由4個試驗，形成完整植株，包括根與枝系，於暗條件下包埋於選擇盤而不進行傳統癒合階段。來自該這些「早期再生者」中9個的葉組織分別進行對於AAD-12的編碼區域PCR與對於基因表達盒的植物轉錄單元(PTU)PCR。所有皆具有完整AAD-12編碼區域，而有3個不具有全長PTU(表11)。這些「早期再生者」由經鑑定為1283個源自傳統個案所衍生經鑑定4101個案。來自19個額外個案的植物，經由標準選擇與再生所獲得者，置於溫室，生長至成熟且以專有的自交系交叉授粉以產生T1種子。由於根據南方墨點法的類似區帶圖案，某些個案呈現另一個選殖株，所以僅表現14個獨特的個案。來自個案的T0植物耐受70g/ha咪唑乙烟酸。Invader分析(AHAS基因)顯示插入複雜性範圍由1至>10組數。13個個案含有AAD-12的完整編碼區域；然而，進一步的分析顯示9個個案中沒有併入完整的植物轉形單元。所包含的1863個個案中沒有超出T1階段且使用這4101個個 案進一步特徵化。
分子分析-玉米材料與方法：組織收集DNA的單離物與定量。新鮮組織置於管中且於4℃凍乾2日。組織完全乾燥後，於管中放置鎢珠粒(Valenite)且使用Kelco珠粒研磨機將樣品進行1分鐘乾燥研磨。接著進行標準DNeasy DNA單離程序(Qiagen,DNeasy 69109)。然後所萃取DNA的部份以Pico Green(Molecular Probes P7589)染色且於螢光儀(BioTek)利用已知標準品獲得濃度為ng/μl。
Invader測試分析：DNA樣品稀釋為20ng/μl然後藉由於熱循環機以95℃ 10分鐘予以變性。然後使用所提供的寡混合物與MgCl2(Third Wave Technologies)製備Signal Probe混合物。分取7.5μl放置於Invader分析盤之各孔中，接著分取7.5μl之對照、標準品及20ng/μl經稀釋的未知樣品。各孔覆蓋15μl之礦物油(Sigma)。然後將該等盤於63℃培養1 hour後於螢光儀(Biotek)判讀。計算標靶探針的信號對背景百分比除以信號對背景內部對照探針百分比將計算比例。已知組數標準品以南方墨點分析所發展與驗證的比例係使用於鑑定未知個案的估計組數。
聚合酶鏈鎖反應：使用總計100ng的總DNA作為模板。20mM的各引子與Takara Ex Taq PCR聚合酶套組(Mirus TAKRR001A)一起使用。對於AAD-12(v1)PTU的引子為前置-GAACAGTTAG ACATGGTCTA AAGG(序列編號：8)及反置-GCTGCAACAC TGATAAATGC CAACTGG(序列編號：9)。PCR反應於9700 Geneamp熱循環機(Applied Biosystems)進行，使樣品於94℃維持3分鐘後進行94℃維持30秒、63℃維持30秒，及72 ℃維持1分鐘45秒的循環35次後接著於72℃維持10分鐘。
對於AAD-12(v1)編碼區域PCR的引子為前置-ATGGCTCAGA CCACTCTCCA AA(序列編號：10)及反置-AGCTGCATCC ATGCCAGGGA(序列編號：11)。PCR反應於9700 Geneamp熱循環機(Applied Biosystems)進行，使樣品於94℃維持3分鐘後進行94℃維持30秒、65℃維持30秒，及72℃維持1分鐘45秒的循環35次後接著於72℃維持10分鐘。PCR產物藉由於1%瓊脂膠電泳以EtBr染色予以分析。
南方墨點分析：南方墨點方係以得自Qiagen DNeasy kit的基因體DNA進行分析。總計2μg的葉基因體DNA或總計10μg的癒合組織基因體DNA使用BSM I及SWA限制酵素進行隔夜分解以獲得PTU數據。
隔夜分解後分取約100ng進行1%凝膠電泳以確認完全分解。經確認後，將樣品於大的0.85%瓊脂膠與40伏特電泳隔夜。然後將凝膠於0.2M NaOH、0.6M NaCl中變性30分鐘。然後將凝膠於in 0.5M Tris HCl、1.5M NaCl、pH7.5中中和30分鐘。然後置於含有20 x SSC的凝膠裝置上轉移隔夜以獲得重力凝膠至尼龍膜(Millipore INYC00010)。隔夜轉移後將該膜經由交聯劑(Stratagene UV stratalinker 1800)以1200 x 100微焦耳進行UV照光。然後將膜以0.1% SDS、0.1 SSC清洗45分鐘。45分鐘清洗後，將膜於80℃烘烤3小時然後在雜交前保存於4℃。使用質體DNA利用上述編碼區域PCR製備雜交模板片段。產物於1%瓊脂凝膠進行電泳且切除，然後使用Qiagen(28706)凝膠抽出步驟將凝膠抽出。然後將該膜於60℃ Perfect Hyb緩衝液(Sigma H7033)中預雜交 步驟1小時。使用Prime it RmT dCTP-labeling rxn(Stratagene 300392)步驟以開展p32為基礎的探針(Perkin Elmer)。使用Probe Quant.G50管柱(Amersham 27-5335-01)清潔探針。使用2百萬計數的CPM雜交南方墨點隔夜。隔夜雜交後，將墨點於65℃之0.1% SDS、0.1 SSC中進行清洗20分鐘。然後將墨點暴露至薄膜隔夜，於-80℃培育。
於AAD-12轉形T0玉米之出苗後除草劑耐受性：使40個T0個案適應於溫室中且生長直至由輪生體出苗2至4個新的正常外觀葉片(亦即，植物以由組織培養轉至溫室生長條件)。植物於27℃於16小時光：8小時暗的條件於溫室生長。然後將植物以市售調配物之Pursuit®(咪唑乙烟酸)和2,4-D Amine 4處理。噴灑Pursuit®以顯示測個案中所存在之可選擇標記基因的功能。除草劑施用係以履帶式噴灑機以噴灑容積為187L/ha，50-cm噴灑高度實施。植物以致死劑量之咪唑乙烟酸(70g ae/ha)或能顯著損傷未轉形玉米品系的比率的2,4-D DMA鹽(2240g ae/ha)噴灑。致死劑量係定義為對於Hi-II自交系引起大於95損傷%的比率。Hi-II為本發明轉形株之基因背景。
數個個體由於其中所期待的基因提供抗性而存活於除草劑。個體選殖株‘001’來自個案"001"(換言之，4101(0)-001-001)，然而，確實招致輕微損傷但於14DAT回復。四個個案中之三個繼續且個體與5XH751交錯且帶至下一世代。各除草劑耐受植物分別為2,4-D和咪唑乙烟酸-耐受植物之AAD-12編碼區域(PCR分析)的存在或AHAS基因(Invader分析)的存在的陽性結果。於含有完整編碼區域之所有2,4-D耐受T0植物個案中偵 測到AAD-12蛋白質。轉殖基因(AHAS，且以AAD-12為參考)的組數顯著地由1至15組數變化。個體T0植物生長至成熟且與自有的自交品系交叉授粉以產生T1種子。
於T1玉米之高2,4-D耐受性的確認：T1 AAD-12(v1)種子種植於含有Metro Mi培養基的3吋盆中且於2葉階段以70g ae/ha咪唑乙烟酸噴灑以移除無效株。存活植物轉移至含有Metro Mi培養基的1-加侖盆中且置於與前述相同生長條件。於V3-V4階段，植物以履帶式噴灑機組噴灑187L/ha之560或2240g ae/ha的2,4-D DMA。於3及14DAT將植物分級且與5XH751 x Hi II對照植物比較。發展出分級等級為0至10(無損傷至極端生長素損傷)以區別支柱根損傷。支柱根於14DAT分級以顯示2,4-D耐受性。2,4-D引起支柱根畸形，且與玉米中的生長素除草劑損傷的指標一致。支柱根數據(如示於下表)顯示3個測試個案中之二者強韌地耐受於2240g ae/ha的2,4-D DMA。個案"pDAB4101(0)001.001"明顯地不安定；然而，其他二個案強韌地耐受2,4-D與2,4-D+咪唑乙烟酸或2,4-D+嘉磷塞(參照表12)。
玉米中之AAD-12(v1)遺傳性：於經與5XH751交錯的7個AAD-12(v1)T1家族進行後代檢定。種子種植於如上述之3吋盆中。於3葉階段，所有植物以如前所述之履帶式噴灑機噴灑70g ae/ha咪唑乙烟酸。14 DAT後，計數抗性與敏感性植物。測試的6個品系中之4個分離為單位點(single locus)，藉由Chi平方分析主要為孟德爾性狀(1R：1S)。存活植物繼續噴灑2,4-D且所有植物應耐受於2,4-D(比率560g ae/ha)。當正反交於市售雜交系時，AAD-12於多種物種中可遺傳為強力的芳基氧基烷酸酯生長素抗性基因。
AAD-12(v1)之堆疊以增加除草劑譜域：AAD-12(v1)(pDAB4101)與優良的Roundup Ready自交系(BE1146RR)正反交且收集F1種子。種植來自F1品系的種子且於V2葉階段以70g ae/ha咪唑乙烟酸處理以去除無效株。對存活植物於校正為187L/ha的履帶式噴灑機以1120g ae/ha 2,4-D DMA+70g ae/ha咪唑乙烟酸(以確認AHAS基因的存在)或1120g ae/ha 2,4-D DMA+1680g ae/ha嘉磷塞(確認Round Up Ready基因的存在)處理。植物於3及16DAT分級。噴灑數據顯示AAD-12(v1)可傳統地與嘉磷塞耐受基因(如Roundup CP4-EPSPS基因)或除草劑耐受基因堆疊以提供可安全地應用於玉米的增加的除草劑譜域。同樣地，於F1植物觀察到咪唑啉酮+2,4-D+嘉磷塞耐受性且藉由該等多種轉殖基因的分子或育種的堆疊組合未顯示隱性表現形。
pDAB4101轉形玉米植物對於2,4-D，三氯比與氟氧比除草劑之田間耐受性：田間程度耐受性試驗於二個AAD-12(v1)pDAB4101個案(4101(0)003.R.003.AF與4101(0)005.R001.AF)及一個Roundup Ready(RR)對照雜交系(2P782)在Fowler,Ind.與Wayside,Miss進行。種子於Wayside以40吋溝距且於Fowler以溝距30吋種植於錐形播種筒(planter)。試驗設計以3重複為隨機完全阻斷設計。除草劑處理為2,4-D(二甲基胺鹽t)以1120、2240及4480g ae/ha，三氯比為840g ae/ha，氟氧比為280g ae/ha以及未處理對照。AAD-12(v1)個案含有AHAS基因作為可選擇標記。F2玉米個案分離以使AAD-12(v1)植物以咪唑乙烟酸at 70g ae/ha處理以移除無效株植物。當玉米達到V6階段時使用壓縮空氣後背式噴灑機除遞送187L/ha載體容積以130至200kpa壓力施用除草劑處理。於處理後7、14及21日進行目視損傷評等。支柱根損傷評等於28DAT進行等級0至10以0至1為些微支柱根融合，1至3為中度支柱根浸潤/偏離，3至5為中度支柱根融合，5至9為嚴重支柱根融合與畸形，以及10為支柱根的完全抑制。
AAD-12(v1)個案對於2,4-D，三氯比與氟氧比於處理後14日的回應顯示於表14。作物損傷於14DAT最嚴重。藉由2,4-D為正常田間使用比率的8倍(8 x)的4480g ae/ha的RR對照玉米(2P782)為嚴重的損傷(44%於14 DAT)。AAD-12(v1)個案於14DAT皆顯示對於2,4-D的優良耐受性分別為0損傷%為1、2及4倍比率。對照玉米(2P782)藉由2倍比率的三氯比(840g ae/ha)為嚴重損傷(31%於14 DAT)。AAD-12(v1)個案顯示於2倍比率的三氯比於14DAT以平均3損傷%涵蓋2個個案的耐受性。對於野生型玉米於14DAT，氟氧比以280g ae/ha引起11%目視損傷。AAD-12(v1)個案於5DAT以平均8損傷%顯示增加的耐受性。
生長素系除草劑對玉米於V6階段的施用可引起支柱根的畸形。表15顯示因2,4-D、三氯比及氟氧比所引起之支柱根損傷的嚴重性。三氯比以840g ae/ha引起最嚴重的支柱根融合與畸形而造成於2P782對照型玉米中平均支柱根損傷分數為7。
AAD-12(v1)玉米個案雙方顯示無來自於三氯比處理的支柱根損傷。於2P782玉米之支柱根損傷隨著2,4-D比率增加而增加。於4480g ae/ha之2,4-D，AAD-12個案顯示無支柱根損傷；然而，嚴重的支柱根融合與畸形可見於2P782雜交者。顯示無支柱根損傷的具有AAD-12(v1)個案的野生型玉米中，氟氧比僅引起中度的支柱根浸潤與漂移。
此數據清楚顯示AAD-12(v1)於玉米對2,4-D、三氯比及氟氧比遠超過其等商業使用的比率，且因而引起非AAD-12(v1)玉米嚴重的可觀察到與支柱根損傷傳送高程度的耐受性。
實施例6
菸草轉形
利用農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)之菸草轉形係藉由類似於，但不完全相同的已公開方法(Horsch等，1988)進行。為提供用於轉形之來源組織，菸草種子(Nicotiana tabacum cv.KY160)表面經無菌化且種植於TOB-培養基表面，該培養基為經瓊脂固化之無荷爾蒙之Murashige and Skoog培養基(Murashige和 Skoog,1962)。於亮培養室中於28至30℃培養植物6至8週且無菌地收集葉片以用於轉形方案。約一平方公分的片狀物無菌地由該等葉片切出，去除中脈。農桿菌菌株(含有pDAB3278、aka pDAS1580、AAD-12(v1)+PAT之EHA101S)的培養物，經隔夜生長於設定於250rpm於28℃的振盪器中，離心中沉澱且再懸浮於無菌Murashige & Skoog鹽類中，且調整為600nm的最終光學密度為0.5。葉片狀物浸漬於細菌懸浮物中約30秒，然後於無菌紙巾上吸乾且置於TTOB+培養基(Murashige and Skoog培養基含有1mg/L吲哚乙酸及2.5mg/L苯甲基腺嘌呤)的正面上且於案處於28℃培養二日後將該葉片狀物移至含有250mg/L頭孢菌素(Agri-Bio,North Miami,Fla.)和5mg/L草丁膦銨(Basta中活性成分，Bayer Crop Sciences)的TOB+培養基且於亮處於28至30℃培養。葉片狀物移至具有頭孢菌素的TOB+培養基且起先二週為每週二次Basta且之後為每週一次。葉片狀物以細菌處理4至6週後，由轉形灶長出之小植物由組織製備物移出且種植於含有250mg/L頭孢菌素及10mg/L Basta於PhytatrayTM II vessels(Sigma)之培養基TOB。該等植物於亮培養室中生長。3週後，切除莖且再根植於相同培養基中。額外的2至3週後，植物準備外送至溫室。
藉由自根清洗瓊脂將植物移入溫室，轉植於13.75平方公分盆的土壤中，且將盆置於Ziploc®袋(SC Johnson & Son,Inc.)中，於袋的底部放置自來水，且直接置於亮的30℃溫室中一週。3至7日後，將袋打開；使植物受粉且於開袋中生長直至溫室馴化，此時將袋移除。植物於傳統溫室條件(30℃，16小時亮，8小時暗，最低天然+補充光=500μE/m2 s1)生長。
繁殖前，取樣本T0植物進行DNA分析以測定插入組數。為了便利分析分子性連結至AAD-12(v1)的PAT基因。將新鮮組織置入管中且於4℃抽乾2日。組織完全乾燥後，將鎢珠粒(Valenite)置入管中且樣品使用Kelco珠粒研磨機進行乾式研磨1分鐘。然後進行標準DNeasy DNA單離步驟(Qiagen,DNeasy 69109)。然後所萃取的DNA的分取樣品以Pico Green(Molecular Probes P7589)染色且於螢光儀(BioTek)中利用已知標準品判讀以獲得濃度呈ng/μl。
DNA樣品稀釋為9ng/μl後屆由於熱循環機中以95℃培養10分中變性。然後使用所提供的寡核苷酸混合物與MgCl2(Third Wave Technologies)製備Signal Probe混合物。分取樣品7.5μl置於Invader分析盤之各孔，接著為分取對照物7.5μl、標準品及20ng/μl經稀釋的未知樣品。各孔以15μl礦物油(Sigma)覆蓋。然後將盤餘63℃培養1.5小時後於螢光儀(Biotek)判讀。藉由將信號百分比以背景內標準對照探針相除而計算信號對於背景的百分比將計算比率。以南方墨點分析所發展及確證之已知組數標準品的比率使用於鑑定未知個案的估計組數。
所有個案也使用相同所萃取DNA樣品的PCR之AAD-12(v1)基因的存在下分析。總計100ng的總DNA使用作為樣品。20mM之各引子與Takara Ex Taq PCR Polymerase套組使用。用於Plant Transcription Unit(PTU)PCR AAD-12的引子為(SdpacodF：ATGGCTCATG CTGCCCTCAG CC)(序列編號：12)及(SdpacodR：CGGGCAGGCC TAACTCCACC AA)(序列編號：13)。PCR反應的進行係於9700 Geneamp熱循環機(Applied Biosystems)，藉由將樣 品進行至94℃維持3分鐘及35循環之94℃維持30秒鐘、64℃維持30秒鐘及72℃維持1分鐘45杪，接著於72℃維持10分鐘。藉由於1%瓊脂膠電泳以EtBr染色分析PCR產物。來自具有1至3個組數的PAT基因(且由於該等基因為物理性連結而假定為AAD-12(v1))的18個PCR陽性個案4至12個譜系(clonal lineage)經再生且移至溫室。
來自19個個案之各者的AAD-12(v1)轉形T0菸草：T0植物中之出芽後除草劑耐受性係以廣範圍的2,4-D、三氯比或 氟氧比噴灑於3至4英吋高的植物進行挑戰。噴灑施用細如前文所述使用履帶式噴灑機以噴灑容積為187L/ha. 2,4-D二甲基胺鹽(Riverside Corp)與去離子水混合以0、140、560或2240g ae/ha施用至來自各個案之代表性品系。氟氧比係同樣方式以35、140或560g ae/ha施用。三氯比係以70、280或1120g ae/ha施用。各處理重複1至3次。損傷評比係於3及14DAT紀錄。各測試個案對於2,4-D係較未轉形品系更為耐受的。於數個個案中，某些起始生長素系-除草劑相關上偏性(epinasty)發生於劑量為560g ae/ha 2,4-D或更低。某些個案於2,4-D以2240g ae/ha(相當於4 x田間比率)施用未損傷。總而言之，AAD-12(v1)個案對氟氧比更為敏感，接著是三氯比，且最不受2,4-D所影響。使用T0植物回應於560g ae/ha氟氧比之個案就抗性程度而言為降低的。個案分類為「低」(>40損傷% 14 DAT)，「中」(20至40損傷%)，「高」(<20損傷%)。某些個案於重複間的回應不一致且應為「可變的」。
於T1菸草之高2,4-D耐受性的確認：存活於高比率的2,4-D與氟氧比的2至4個T0個體由個案保存且使其於溫室中自花授粉以產生T1種子。T1種子分層且如同阿拉伯芥的方式植入選擇盤，接著藉由於分離族群中以560g ai/ha草丁膦(PAT基因選擇)選擇移除未轉形無效物。存活者於溫室中轉移至個別的3-英吋盆中。該等品系於T0世代提供對於2,4-D之高程度抗性。改良的回應一致性被期待發生於不具有直接來自組織培養物的T1植物中。該等植物與野生型KY160菸草比對。所有植物以設定為187L/ha的履帶式噴灑機噴灑。植物噴灑範圍為140至2240g ae/ha 2,4-D二甲基胺鹽(DMA)、70至1120g ae/ha三氯比或35至560g ae/ha氟氧比。所有施用皆調配於水中。各處理重複2至4次。植物於處理後3及14日評估。植物損傷評比以矮化(stunting)、退綠(chlorosis)及壞疽(necrosis)表示。分離T1世代，以預期起因於不同接合性(zygosity)的某些可變回應。
對2,4-D於4倍田間比率(2240g ae/ha)或該比率以下未觀察到損傷。一個個案品系中利用三率比處理觀察到某些損傷，但最大損傷係於利用氟氧比觀察到。氟氧比損傷為於一個案之段生命期及新生長藉由14DAT幾乎與未處理對照無法區別(表17)。重要應注意的是未轉形菸草對於氟氧比為極端敏感。該等結果顯示商業程度的2,4-D耐受性可由AAD-12(v1)所提供，即便於例如菸草之非常生長素敏感的雙子葉作物中。該等結果亦顯示對於吡啶基氧基乙酸除草劑、三氯比及氟氧比的抗性可被賦予。對於由具有改變雜草防治譜域的可變活性成分之AAD-12所保護之雜草耐受作物中具有提出處理能力對於種植者為非常有用。
AAD-12(v1)於菸草之遺傳性：也於AAD-12(1)品系之T1品系進行100個植物後裔檢定(plant progeny test)。將種子根據上述步驟分層、種植及轉職除了無效植物借由Liberty選擇予以移除。然後所有植物如上所述以560g ae/ha 2,4-D DMA噴灑。14DAT後，計數抗性與敏感性植物。七個測試品系中的五個分離為單一位點，由Chi平方分析測定為顯性孟德爾性狀(3R：1S)。AAD-12於多種物種中可遺傳作為強力的芳基氧基烷酸酯生長素抗性基因
pDAS1580菸草植物對於2,4-D、滴丙酸(Dichloprop)、三氯比及氟氧比除草劑之田間耐受性：田間等級耐受性於三個AAD-12(v1)品系(個案pDAS1580-[1]-018.001、pDAS1580-[1]-004.001及pDAS1580-[1]-020.016)及一個野生型品系(KY160)於印弟安納州與密西西比州的田間試驗站進行。煙草轉殖株根據上述生長條件藉由將T1種子種植至含有Metro 360培養基的於72孔移植盤(Hummert International)於溫室中生長。藉由如上所述之Liberty選擇而選擇性移除無效植物。轉殖植物運送至田間試驗站且使用工業植物種植機以相隔14或24英吋種植。於密西西比州處使用滴灌且於印第安那州處使用頂灌以維持植物快速生長。
試驗設計為具有4重複的分裂區設計。主區為除草劑處理以及亞區為菸草品系。除草劑處理為2,4-D(二甲基胺鹽)為280、560、1120、2240及4480g ae/ha，三氯比為840g ae/ha，氟氧比為280g ae/ha以及未處理對照。區為25至30呎的植溝。除草劑處理係於種植後3至4週使用壓縮氣體後背式噴灑機以130至200kpa壓力傳送187L/ha載體容積而施用。損傷、生長益智及 上偏性的目視評比係於處理後第7、14及21日進行。
AAD-12(v1)個案回應於2,4-D、三氯比及氟氧比係示於表18。非轉形菸草品系為嚴重損傷(63%於14 DAT)藉由2,4-D為560g ae/ha其被認為1倍的田間施用比率。AAD-12(v1)品系於14DAT全顯示對於2,4-D的優良耐受性，分別於2、4及8倍觀察到1、4及4損傷%的平均損傷。非轉形菸草品系為嚴重損傷(53%於14 DAT)藉由2倍比率的三氯比(840g ae/ha)；然而，AAD-12(v1)品系顯示涵蓋三個品系於14DAT具有平均5損傷%的耐受性。氟氧比於280g ae/ha對於非轉形品系於14DAT引起嚴重損傷(99%)。AAD-12(v1)品系顯示於14DAT具有平均11損傷%的增加耐受性。
該等結果顯示AAD-12(v1)轉形個案品系於代表性田間條件下，於對非轉形菸草引起嚴重上偏性畸型的多重商業使用比率，對於2,4-D、三氯比及氟氧比顯現高程度的耐受性。
對於提升的2,4-D比率的AAD-12(v1)保護：顯示溫 室中對於2,4-D DMA的提升比率之AAD-12(v1)保護的結果示於表19。來自個案分離3R：1S的T1 AAD-12(v1)植物當以560g ai/ha Liberty選擇時使用與上述相同的方案。T1 AAD-1(v3)種子也對轉形菸草對照種植(參照PCT/US2005/014737)。未轉形KY160作為敏感對照。植物使用設定於187L/ha的履帶式噴灑機噴灑為140、560、2240、8960及35840g ae/ha的2,4-D DMA且於3及14DAT評比。
AAD-12(v1)及AAD-1(v3)二者皆有效地保護菸草對抗2,4-D損傷達4倍商業使用比率。然而，AAD-12(v1)藉由保護達64倍標準田間比率而顯示優於AAD-1(v3)的顯著優點。
AAD-12的堆疊增加除草劑譜域：同合子AAD-12(v1)(pDAS1580)及AAD-1(v3)(pDAB721)植物(對於後者參照PCT/US2005/014737)二者正反交且收集F1種子。來自各基因之二的正反交的F1種子經分層且各雜交的4重複係於下述處理之一者之如同使用於其他測試的相同噴灑方法下處理：70、140、280g ae/ha氟氧比(用於AAD-12(v1)基因選擇性)；280、560、1120g ae/ha R-滴丙酸(用於AAD-1(v3)基因選擇性)；或560、1120、2240g ae/ha 2,4-D DMA(以確認2,4-D耐受性)。也種植各基因之同合子T2植 物使用作為對照。植物於3及14DAT分級。噴灑結果示於表20。結果確認AAD-12(v1)可成功地與AAD-1(v3)堆疊，因此增加施用至感興趣作物之除草劑譜域(分鼻對於AAD-1及AAD-12為苯氧基乙酸類+苯氧基丙酸類相對於苯氧基乙酸類+吡啶基氧基乙酸)。除草劑交叉抗性方式的互補本質便利於使用該二基因作為互補與可堆疊的田間-可選擇標記。作物中之耐受性利用單一基因可為邊緣性，此項技術領域者藉由對於相同除草劑堆疊第二耐受基因可增加耐受性。該等可使用具有相同或不同的啟動子的相同基因而完成；然而，如此處所觀察的，堆疊與追蹤二個互補特性可藉由區別對於苯氧基丙酸類[來自AAD-1(v3)]或吡啶基乙酸類[AAD-12(v1)]而交叉保護而容易完成。
實施例7
大豆轉形
經由基因轉形技術之大豆改良已完成於該些特性如除草劑耐受性(Padgette等，1995)、胺基酸修改(Falco等，1995)及昆蟲抗性(Parrott等，1994)。外來特性對於作物品種的導入需要將使利用含有簡單插入物之可選擇標記序列常規製造基因轉殖品系的方法。該轉殖基因應被遺傳做為單一功能位點以簡化育種。已有報導藉由合子胚軸的微注射(McCabe等，1988)或體細胞胚性培養物(Finer和McMullen,1991)以及農桿菌媒介之子葉外植體(Hinchee等，1988)或合子胚(Chee等，1989)的轉形而將外來基因的傳遞至培養的大豆。
由農桿菌媒介之轉性所衍生之轉形物傾向以低組數擁有簡單插入物(Birch,1991)。對於基因轉移至大豆所研究之三個目標組織之各者有相關的優勢與不利處，合子胚軸(Chee等，1989；McCabe等，1988)、子葉(Hinchee等，1988)及體細胞胚培養物(Finer和McMullen,1991)。後者經強力地的研究作為直接基因轉移的目標組織。胚培養物傾向為多產的且可維持延長的期間。然而，主要轉型株的不育性與染色體畸變與胚性懸浮細胞的時期相關(Singh等，1998)且因此新培養物的連續起始對於使用此組織的大豆轉型系統為必需的。此系統需要高濃度的2,4-D，40mg/L濃度，以起始胚性癒合組織且由於轉形位點不能於培養基中與2,4-D進一步發育而使此點在使用AAD-12(v1)基因上造成基本問題。所以，分生組織為主的轉形對於使用AAD-12(v1)的2,4-D抗性植物的開發為理想的。
二元構築物的Gateway選殖：AAD-12(v1)編碼序列係選殖至含有不同植物啟動子的5個不同的Gateway供體。所得 AAD-12(v1)植物表現匣接著經由LR Clonase reaction(Invitrogen Corporation,Carlsbad Calif.,Cat #11791-019)選殖至Gateway Destination二元載體。
含有AAD-12(v1)編碼序列的NcoI-SacI片段由DASPICO12分解且接合至下述Gateway Donor載體中之對應的NcoI-SacI限制位置：pDAB3912(attL1//CsVMV啟動子//AtuORF23 3'UTR//attL2)；pDAB3916(attL1//AtUbi10啟動子//AtuORF23 3'UTR//attL2)；pDAB4458(attL1//AtUbi3啟動子//AtuORF23 3'UTR//attL2)；pDAB4459(attL1//ZmUbi1啟動子//AtuORF23 3'UTR//attL2)；及pDAB4460(attL1//AtAct2啟動子//AtuORF23 3'UTR//attL2)。所得含有下述植物表現匣的構築物指名為：pDAB4463(attL1//CsVMV啟動子//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//attL2)；pDAB4467(attL1//AtUbi10啟動子//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//attL2)；pDAB4471(attL1//AtUbi3啟動子//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//attL2)；pDAB4475(attL1//ZmUbi1啟動子//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//attL2)；及pDAB4479(attL1//AtAct2啟動子//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//attL2)。該等構築物經由限制酵素分解及定序予以確認。
植物表現匣經由Gateway LR Clonase反應而重組至Gateway Destination二元載體pDAB4484(RB7 MARv3//attR1-ccdB-氯黴素抗性-attR2//CsVMV啟動子//PATv6//AtuORF1 3'UTR)。Gateway Technology使用λ噬菌體為主的位點特異性重組，取代限制內切核酸酶與接合酶而將感興趣的基因插入至表現載體。Invitrogen Corporation，Gateway Technology：A Universal Technology to Clone DNA Sequences for Functional Analysis and Expression in multiple Systems,Technical Manual,Catalog #'s 12535-019及12535-027，Gateway Technology Version E,Sep.22,2003，#25-022。DNA重組序列(attL及attR)及LR Clonase酵素混合物使得任何DNA片段挾於欲轉移至含有對應位置的任何載體的重組位置中。供體載體的attL1位置與二元載體的attR1對應。類似地，供體載體的attL2與二元載體的attR2對應。使用Gateway Technology，挾於attL位置的植物表現匣(來自供體載體)可重組至二元載體的attR位置。所得含有下述植物表現匣的構築物標示為：pDAB4464(RB7 MARv3//CsVMV啟動子//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//CsVMV啟動子//PATv6 AtuORF1 3'UTR)；pDAB4468(RB7 MARv3//AtUbi10啟動子//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//CsVMV啟動子//PATv6//AtuORF1 3'UTR)；pDAB4472(RB7 MARv3//AtUbi3啟動子//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//CsVMV啟動子//PATv6//AtuORF1 3'UTR)；pDAB4476(RB7 MARv3//ZmUbi1啟動子//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//CsVMV啟動子//PATv6 AtuORF1 3'UTR)；及pDAB4480(RB7 MARv3//AtAct2啟動子//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//CsVMV啟動子//PATv6//AtuORF1 3'UTR)。該等構築物經由限制酵素分解及定序予以確認。
轉形方法1-農桿菌媒介轉形：大豆轉形的首先報導目標於子葉節區域的分生組織(Hinchee等，1988)及來自頂端分生組織的莖芽增殖(shoot multiplication)(McCabe等，1988)。於農桿腫瘤菌(A.tumefaciens)-為主的子葉節方法中，培植體(explant)製備及培養基組成物刺激節中輔助性分生組織的增生(Hinchee等，1988)。 真實的分化為何仍不清楚，但藉由這些處理起始了全能、癒合組織培養物。來自單一培植體的轉形個案的多種純系的回收以及嵌合性植物的罕見回收(Clemente等，2000；Olhoft等，2003)顯示單一細胞起始後接著多重基因轉殖細胞產生增生的基因轉殖分生組織培養物或進行進一步莖芽增殖之均一地轉形莖芽。大豆莖芽增殖方法，原始根基於粒子槍法(microprojectile bombardment)(McCabe等，1988)以及，近來適用於農桿菌媒介轉形(Martinell等，2002)，因為此系統根基於成功的生殖細胞嵌合體的鑑定而如同子葉節方法明顯地不進行相同程度或類型的去分化(dedifferentiation)。再者，此非2,4-D為基準的方案對於2,4-D選擇系統為理想的。因此，子葉節方法可為發展2,4-D抗性大豆培養體的方法選項。
AAD-12(v1)耐受表現型的植物轉形製造。衍生自「Maveick」的外植體的種子以及農桿菌媒介之子葉節轉形方案係用於製造AAD-12(v1)基因轉殖植物。
農桿菌的製備及接種：農桿菌菌株EHA101(Hood等1986)，各帶有5個二元pDAB載體(表8)係使用於啟始轉形。各二元載體含有AAD-12(v1)基因及植物-可選擇基因(PAT)皆匣置於T-DNA區域。質體藉由電穿孔固定至農桿菌之EHA101菌株。然後所選擇之純株於大豆外質體的農桿菌處理前分析基因的整合。使用Maverick種子於所有轉形試驗且該等種子由密蘇里州哥倫比亞市密蘇里大學獲得。
進行使用PAT基因作為可選擇標記與除草劑草丁膦作為選擇劑的大豆(Glycine max)之農桿菌媒介的轉形。該等種子於經3g/L Phytagel(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.)固化之B5基礎 培養基(Gamborg等1968)發芽。然後將所選擇的嫩芽轉移至發根培養基。最適化的選擇方案係於培養基中使用草丁膦為8mg/L跨第1及第2嫩芽起始階段以及於培養基中使用3至4mg/L於嫩芽延伸期間。
將經延伸的嫩芽(3至5cm)轉移至發根培養基之前，節間之經切除末端浸漬於1mg/L吲哚3-丁酸維持1至3分鐘以促進發根(Khan等1994)。嫩芽於含有發根培養基的25 x 100mm的玻璃管中發根後將其轉移至土壤以馴化植物體於Metro-mix 200(Hummert International,Earth City,Mo.)於開放的Magenta盒於Convirons培養箱中。草丁膦，Liberty除草劑(Bayer Crop Science)的活性成分，係於嫩芽起始與延伸期間使用於選擇。發根植物體於其篩選前於開放的Magenta盒持續數週予以馴化且轉移至溫室用於進一步馴化及建立。
溫室中疑似轉形植物體的分析，以及分析已建立之T0植物：所選擇之該等植物體的葉的頂生小葉(terminal leaflets)以每週二次的間隔塗覆50mg/L的草丁膦以觀察疑似轉形株的篩選結果。然後將經篩選的植物體轉移至溫室且於馴化後將葉片再次塗覆草丁膦以確認於GH中該等植物體之耐受性狀態且視為疑似轉形株。
經轉移至溫室的植物可進一步以非破壞性方式藉由以草丁膦溶液[0.05至2% v/v Liberty除草劑，較佳為0.25至1.0%(v/v)，=500至2000ppm草丁膦，Bayer Crop Science]塗覆T0主要轉形株之葉部份，或其後代，以分析活性PAT基因的存在。根據所使用的濃度，草丁膦損傷的估算可於處理後1至7日進行。植 物也可以非破壞方式藉由對最晚發芽的三葉之下的新展開的三葉的一節或二節(較佳為二節)的頂生小葉選擇性施用2,4-D水溶液(0.25至1% v/v市售2,4-D二甲基胺鹽調配物，較佳為0.5% v/v=2280ppm 2,4-D ae)以測試對2,4-D的耐受性。此分析藉由估算葉由相鄰小葉的平面反轉或旋轉超過90度而允許估算施用後6小時至數日之2,4-D敏感性植物。耐受於2,4-D的植物將不回應於2,4-D。T0植物將允許於溫室中自交以提供T1種子。T1植物(以及產生足夠程度的T0植物)將以一範圍的除草劑劑量噴灑以測定藉由AAD-12(v1)基因及PAT基因於基因轉殖大豆中所提供的除草劑保護的程度。使用於T0植物的2,4-D比率典型地包含如前述之使用履帶式噴灑機於100至1120g ae/ha的範圍中之一個或二個選擇性比率。T1植物將以由50至3200g ae/ha 2,4-D之較廣的除草劑劑量範圍處理。類似地，T0及T1植物可分別藉由以200至800及50至3200g ae/ha草丁膦之發芽後處理而篩選草丁膦抗性。嘉磷塞抗性(於含有EPSPS之構築體的植物轉形中)或另外的嘉磷塞耐受性基因可藉由以280至2240g ae/ha嘉磷塞劑量範圍之嘉磷塞發芽後施用而估算T1世代。個別的T0植物估算感興趣的(AAD-12(v1)或PAT v6)基因的編碼區域的存在以及套數。AAD-12(v1)遺傳性的測定係使用T1及T2後代分離涉及如前束實施例所揭示之除草劑耐受性。
起始轉形株的亞集(subset)係根據上述方法於T0世代中估算。經確認具有AAD-12(v1)編碼區域的任何植物，無關於啟動子驅動該基因，不回應於2,4-D葉塗覆而相反於野生型Maverick大豆。僅PAT轉形植物對於2,4-D的葉塗覆施用與野生 型植物相同回應。
2,4-D係施用至以560或1120g ae 2,4-D施用至與野生型對照植物為類似大小的植物亞集。含有AAD-12(v1)的所有植物相對於野生型大豆皆對於除草劑施用有清楚的抗性。二個AAD-12(v1)植物觀察到些微程度的損傷(2日)，然而，損傷為暫時的且於7DAT未觀察到損傷。野生型對照植物以560g ae/ha 2,4-D於7至14DAT為嚴重損傷且以1120g ae/ha被殺死。該等數據與AAD-12(v1)可對敏感性作物如大豆賦予高耐受性(2倍的田間比率)的事實一致。然後取樣所篩選的植物進行分子及生化分析以確認AAD12(v1)基因的整合、套數及基因表現程度。
分子分析-大豆：組織收穫DNA單離與定量。新鮮組織至於管中且於4℃凍乾2日。在組織完全乾燥後，於管中置入鎢珠粒(Valenite)且使用Kelco珠磨機進行樣品乾式研磨1分鐘。然後進行標準DNeasy DNA單離步驟(Qiagen,DNeasy 69109)。然後所萃取DNA的分取樣品以Pico Green(Molecular Probes P7589)染色且於螢光儀a(BioTek)利用已知標準品以獲得濃度呈ng/μL。
聚合酶鏈鎖反應：總計100ng的整體DNA係使用作為模板。20mM之各引子使用於Takara Ex Taq PCR聚合酶套組(Mirus TAKRR001A)。用於AAD-12(v1)PTU的引子為(前置-ATAATGCCAG CCTGTTAAAC GCC)(序列編號：8)以及(反置-CTCAAGCATA TGAATGACCT CGA)(序列編號：9)。PCR反應係於9700 Geneamp熱循環機(Applied Biosystems)進行，藉由將樣品於94℃維持3分鐘以及35個循環之94℃維持30秒、63℃維持30秒以及72℃維持1分鐘又45秒且之後於72℃維持10分鐘。用於 PCR AAD-12(v1)的引子為(前置-ATGGCTCATG CTGCCCTCAG CC)(序列編號：10)以及(反置-CGGGCAGGCC TAACTCCACC AA)(序列編號：11)。PCR反應係於9700 Geneamp熱循環機(Applied Biosystems)進行，藉由將樣品於94℃維持3分鐘以及35個循環之94℃維持30秒、65℃維持30秒以及72℃維持1分鐘又45秒且之後於72℃維持10分鐘。PCR產物係藉由電泳於1%瓊脂膠以EtBr染色而分析。
南方墨點分析：南方墨點分析係以由Qiagen DNeasy獲得的總DNA進行。總計10μg之基因體DNA係進行隔夜分解以獲得整合數據。隔夜分解後分取約100ng於1%凝膠電泳以確認完全分解。此確認後，樣品於0.85%瓊脂膠上以40伏特電泳隔夜。然後將此凝膠於0.2M NaOH、0.6M NaCl變性30分鐘。然後此凝膠於0.5M Tris HCl、1.5M NaCl及pH7.5中進行中和30分鐘。然後設置含有20 x SSC之凝膠裝置以獲得重力凝膠於尼龍膜(Millipore INYC00010)上轉移隔夜。隔夜轉移後將該膜經由交聯劑(Stratagene UV stratalinker 1800)以1200 x 100微焦耳進行UV光照射。然後將該膜於0.1% SDS、0.1 SSC中清洗45分鐘。45分鐘的清洗後，將該膜於80℃烘烤3小時後於雜交前儲存於4℃。使用上述利用質體DNA的編碼區域PCR製備雜交模板片段。產物於1%瓊脂膠上電泳且切除後使用Qiagen(28706)凝膠萃取步驟萃取凝膠。然後將該膜於Perfect Hyb緩衝液(Sigma H7033)中於60℃進行1小時預-雜交步驟。使用Prime it RmT dCTP-labeling rxn(Stratagene 300392)步驟展開p32為主的探針(Perkin Elmer)。探針使用Probe Quant.G50管柱(Amersham 27-5335-01)清潔。使用二百 萬計數的CPM雜交南方墨點隔夜。隔夜雜交後墨點在65℃於0.1%SDS、0.1SSC中進行20分鐘清洗。然後墨點曝光至薄膜隔夜，於-80℃培養。
生化分析-大豆：由大豆葉片之組織取樣及萃取AAD-12(v1)蛋白質。由經2,4-D葉塗覆但於1DAT後之N-2葉取樣接近50至100mg的葉組織。移除頂生N-2小葉且切成小片或2-單-孔-穿洞葉圓片(直徑約0.5cm)且立即於乾冰冷凍。由此而完成蛋白質分析(ELISA及西方墨點分析)。
T1後代評估：T0植物將使其自交以衍生T1家族。後代測試(分離分析)將使用草丁膦於560g ai/ha作為選擇劑施用於V1至V2生長階段而測試。存活植物將進一步由V2至V6於一個或更多個生長階段測試2,4-D耐受性。種子將經由自交產生以允許於基因轉殖大豆之較廣的除草劑測試。
AAD-12(v1)基因轉殖Maverick大豆植物已經由農桿菌媒介轉形系統產生。所得T0植物耐受達2倍程度的2,4-D田間施用濃度且發展可孕性種子(fertile seeds)。可孕性基因轉殖大豆植物的頻率達5.9%。AAD1-12(v1)基因整合至大豆基因體係經由南方墨點分析予以確認。此分析顯示多數的基因轉殖植物含有低套數。以AAD-12(v1)抗體篩選的植物顯示對於ELISA為陽性以及於西方墨點分析中為合適的帶條。
轉形方法2-胚性大豆癒合組織的浮質束(aerosol-beam)媒介轉形：胚性大豆癒合組織及其後續束的培養物可使用本文所提供的構築體以揭示於美國專利第6,809,232號(Held等)的方法完成以創造轉形株。
轉形方法3-大豆之生物彈道轟擊法(Biolistic Bombardment)：此可使用成熟種子衍生之胚軸分生組織而完成(McCabe等(1988))。根據生物彈道轟擊法已建立的方法，可期望回收轉形大豆植物。
轉形方法4-鬚媒介轉形：鬚製備及鬚轉形可根據先前Terakawa等(2005))所揭示的方法實施。根據生物彈道轟擊法已建立的方法，可期望回收轉形大豆植物。
Maverick種子於70%乙醇中進行表面無菌化1分鐘接著於1%次氯酸鈉中浸漬20分鐘後於無菌蒸餾水中潤洗三次。種子浸泡於蒸餾水中18至20小時。由種子切除胚軸，以及頂端分生組織藉由移除主要葉片而曝露。胚軸至於轟擊培養基[BM：MS(Murashige和Skoog 1962)基礎鹽類培養基、3%蔗糖及0.8% phytagel Sigma，pH 5.7]中以頂端區域直接朝向含有12ml培養物培養基的5-cm培養盤。
轉形方法5-對於胚性癒合組織的粒子轟擊媒介轉形可根據先前方法(Khalafalla等，2005；El-Shemy等，2004，2006)予以最適化。
實施例8
棉花中之AAD-12(v1)
棉花轉形方案：棉花種子(Co310基因型)係於95%乙醇中表面無菌化1分鐘，潤洗，以50%市售漂白劑無菌化20分鐘後，於發芽前以無菌蒸餾水潤洗3次，發芽係於G-培養基(表21)在Magenta GA-7容器中且維持於高光強度40至60μE/m2，利用設定於28℃之16小時光及8小時暗的光週期。
子葉段(約5mm)平方物係由7至10日齡的種苗單離至於培養皿(Nunc，item #0875728)中的液體M液體培養基(表21)。切割段以農桿菌溶液處理(持續30分鐘)後轉移至半固體M-培養基(表21)且進行共培養2至3日。共培養後，將段轉移至MG培養基(表21)。卡苯尼西林為使用於殺農桿菌的抗生素以及草丁膦-銨為僅使該等含有經轉移基因的細胞生長的選擇劑。
農桿菌製備：以一接種環之細菌接種35ml之Y培養基(表21)(含有鏈黴素(100mg/ml母液)及紅黴素(100mg/ml母液))，於28℃暗處生長隔夜，伴隨於150rpm振盪。次日，將農桿菌溶液倒至無菌圓底懸蓋管(oakridge tube)(Nalge-Nunc,3139-0050)，且於Beckman J2-21於8,000rpm離心5分鐘將上清部份倒出且將沉積物再懸浮於25ml之M液體(表21)且漩渦震盪。將分取樣品置於玻璃培養管(Fisher,14-961-27)用於Klett判讀(Klett-Summerson,model 800-3)。使用M液體培養基稀釋新懸浮物至Klett-meter判讀為以總容積40ml之各ml為108選殖株形成單位。
三週後，單離來自子葉節的癒合組織且轉移至新鮮MG培養基。癒合組織轉移至MG培養基再維持3週。於並行比較(side-by-side comparison)中，MG培養基可補充滴丙酸(以濃度0.01及0.05mg/L添加至培養基)以補充2,4-D的降解，此乃由於滴丙酸不是AAD-12酵素的基質，然而低丙酸對於棉花為較2,4-D為更有活性。於不同的比較中，經置於不含生長調節素之MG培養基的段與標準MG培養基比較，顯示降低的癒合組織，但仍有癒合組織生長。然後將癒合組織轉移至CG-培養基(表21)，且三 週後再次轉移至新先選擇培養基。再三週後，癒合組織轉移至缺乏胚性癒合組織誘導之植物生長調節素的D培養基(表21)。於此培養基4至8週後，形成胚性癒合組織，且可藉由其淡黃-白色及顆粒細胞而與非胚性癒合組織區隔。胚開始快速再生且之後顏色為明顯綠色。棉花的再生及形成胚耗時，加速此步驟的方法之一給組織壓力。乾燥為完成此的常用方法，經由改變組織及培養盤的微環境，藉由使用較少培養基及/或適用於各種模式的培養盤內含物(貼紮相對於石蠟膜(parafilm))。
單離較大、良好發展的胚且轉移至DK培養基(表21)用於胚發展。3週後(或當胚已發展時)，萌發的胚轉移至新鮮培養基用於嫩芽及根發展。4至8週後，任何良好發展的植物轉移至土壤且生長至成熟。接著的二個月後，植物已生長到可噴灑以測定是否對2,4-D具有抗性的時點。
細胞轉形：起始數個試驗其中子葉節係經以含有pDAB724之農桿菌處理。超過2000個所得節使用各種生長素選項處理用以增殖pDAB724棉花瘉合組織，任意為：0.1或0.5mg/L R-滴丙酸、標準2,4-D濃度以及無生長素處理。由於構築體中包含PAT基因，癒合組織於草丁膦-銨選擇。癒合品系分析呈PCR形式以及使用Invader以測定使否與確定基因存在於癒合階段；然後為胚性之癒合品系進行西方墨點分析。胚性棉花癒合組織使用乾燥技術加壓以改良回收組織的質與量。為了完整PTU篩選接近200個癒合個案且使用西方墨點分析篩選AAD-12(v1)基因的表現。
植物再生：將已根據上述方案製造之AAD-12(v1)棉花品系送至溫室。為了顯示AAD-12(v1)基因提供於棉花對2,4-D的抗性，AAD-12(v1)棉花植物及野生型棉花植物二者將利用履帶式噴灑機以噴灑容積187L/ha遞送560g ae/ha 2,4-D予以噴灑。植物於處理後第3及14日評估。存活於2,4-D選擇比率的植物將自花授粉以創造T1種子或與優良棉花品系交配以製造F1種子。種植所產生的後代種子以及如前束評估除草劑抗性。AAD-12(v1)個案可與其它所期望的HT或IR性狀合併。
實施例9
其他作物之農桿菌轉形
由本揭露觀點，額外的作物可根據本發明使用此項技術領域習知技術予以轉形。對於黑麥之農桿菌媒介轉形，例如參照Popelka及Altpeter(2003)。對於大豆之農桿菌媒介轉形，例如參照Hinchee等，1988。對於高樑之農桿菌媒介轉形，例如參照Zhao等，2000。對於大麥之農桿菌媒介轉形，例如參照Tingay等， 1997。對於小麥之農桿菌媒介轉形，例如參照Cheng等，1997。對於稻米之農桿菌媒介轉形，例如參照Hiei等，1997。
該等及其他植物之拉丁名係提供於下。應了解該等及其他(非農桿菌)轉型技術可使用於將AAD-12(v1)轉形至，例如，該等及其他植物，包括，但不限於，玉米(Zea mays)、小麥(小麥屬(Triticum spp.))、稻米(稻屬(Oryza spp.)及菰屬(Zizania spp.))、大麥(大麥屬(Hordeum spp.))、棉花(昂天蓮(Abroma augusta)及棉屬(Gossypium spp.))、大豆(黃豆(Glycine max)、甜菜及紅甜菜(甜菜屬(Beta spp.))、甘蔗(桄榔(Arenga pinnata))、蕃茄(蕃茄(Lycopersicon esculentum)及其他屬、黏果酸漿(Physalis ixocarpa)、黃水茄(Solanum incanum)及其他屬以及樹番茄(Cyphomandra betacea))、馬鈴薯(Solanum tubersoum)、甜薯(蕃薯(Ipomoea betatas))、黑麥(黑麥屬(Secale spp.))、椒類(辣椒(Capsicum annuum)、小臘椒(Capsicum sinense)及小米椒(Capsicum frutescens))、萵苣(皺葉萵苣(Lactuca sativa)、藍萵苣(Lactuca perennis)及野萵苣(Lactuca pulchella))、甘藍(油菜屬(Brassica spp))、芹菜(旱芹(Apium graveolens))、茄子(Solanum melongena)、花生(Arachis hypogea)、高梁(Sorghum)(所有高粱品種)、紫花苜蓿(Medicago sativua)，胡蘿蔔(Daucus carota)、豆類(菜豆屬(Phaseolus spp.)及其他種)、燕麥(燕麥(Avena sativa)及毛燕麥(Avena strigosa))、豌豆類(豌豆屬(Pisum)、豇豆屬(Vigna)及四稜豆屬(Tetragonolobus spp.))、向日葵(Helianthus annuus)、節瓜(南瓜屬(Cucurbita spp.))、黃瓜(小黃瓜(Cucumis sativa))、菸草(菸草屬(Nicotiana spp.))、阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)、草坪草(毒麥屬(Lolium)、剪股穎屬(Agrostis)、早熟禾屬(Poa)、狗牙根屬 (Cynadon)及其他品種)、幸運草(clover)(三葉草屬(Tifolium))、紫雲英(Vetch)(蠶豆屬(Vicia))。例如，具有AAD-12(v1)基因的該等植物，係包括於本發明。
AAD-12(v1)具有潛力於許多落葉及常綠木材農耕系統中增加重要生長素系除草劑於季節中用途的應用。三氯比、2,4-D及/或氟氧比抗性木材品種將增加該等除草劑之越頂使用的彈性而無損傷疑慮。該等品種包括，但不限於：赤楊木(赤楊屬(Alnus spp.))、白臘樹(白臘木屬(Fraxinus spp.))、白楊樹及種陽樹(白楊木屬(Populus spp.))、山毛櫸(山毛櫸屬(Fagus spp.))、樺樹(樺木屬(Betula spp.))、櫻樹(李屬(Prunus spp.))、桉樹(桉屬(Eucalyptus spp.))、山胡桃木(山胡桃屬(Carya spp.))、楓樹(槭樹屬(Acer spp.))、橡木(櫟屬(Quercus spp))及松樹(松屬(Pinus spp))。於觀賞植物及果物生產品種中之用於選擇性雜草防治的生長素抗性的用途也落入本發明範疇中。實例可包括，但不限於，玫瑰(薔薇屬(Rosa spp.))、火焰衛矛(burning bush)(衛矛屬(Euonymus spp.))、矮牽牛(矮牽牛屬(Petunia spp))、秋海棠(秋海棠屬(Begonia spp.))、杜鵑(石楠屬(Rhododendron spp))、野生酸蘋果(crabapple)或蘋果(蘋果屬(Malus spp.))、梨(梨屬(Pyrus spp.))、桃(桃屬(Prunus spp))及金盞花(萬壽菊屬(Tagetes spp.))。
實施例10
令人驚訝結果的進一步證據：AAD-12相對於AAD-2
AAD-2(v1)起始選殖：由NCBI資料庫(參照ncbi.nlm.nih.gov網站；存取編號AP005940)鑑定另一基因為對於tfdA僅具有44%胺基酸同一性之同源物。為了一致性，此基因於 本文稱為AAD-2(v1)。藉由第一次轉譯AAD-2及tfdA二者的DNA序列(分別為PCT/US2005/014737之序列編號：12及GENBANK存取編號M16730)為蛋白質(分別為PCT/US2005/014737之序列編號：13及GENBANK存取編號M16730)以測定同一性百分比，然後使用ClustalW於VectorNTI套裝軟體以實施多重序列對準。
含有AAD-2(v1)基因之慢生性大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)菌株係由Northern Regional Research Laboratory(NRRL，菌株編號B4450)獲得。經凍乾之菌株係根據NRRL方案予以復活且於20%甘油中儲存於-80℃用於內部使用作為陶氏細菌菌株DB 663。由此冷凍原種，然後以數菌環的細胞塗佈於Tryptic Soy Agar培養盤用以單離，且於28℃培養3日。單一純株用於接種100ml之Tryptic Soy Broth於500ml的三檔板燒瓶，其於平板振盪器以150rpm於28℃培養隔夜。由此，利用Qiagen’s DNeasy套組(Qiagen cat. #69504)之革蘭陰性方案單離總DNA。設計下述引子用以由基因體DNA擴增目標基因前置引子：5' ACT AGT AAC AAA GAA GGA GAT ATA CCA TGA CGA T 3'[PCT/US2005/014737之(brjap 5'(speI)序列編號：14 of PCT/US2005/014737(增加Spe I限制位點及核糖體結合位點(RBS))]以及反置引子：5' TTC TCG AGC TAT CAC TCC GCC GCC TGC TGC TGC 3'[PCT/US2005/014737之(br jap 3'(xhoI)序列編號：15(增加Xho I位點))。
50微升反應係設定如下述：Fail Safe緩衝液25μl，各引子1μl(50ng/μl)，gDNA 1μl(200ng/μl)，H2O 21μl，Taq聚合酶1μl(2.5 units/μl)。三種Fail Safe緩衝液-A、B及C 使用於三種不同反應。然後於下述條件進行PCR：於95℃維持3.0分鐘熱變形循環；95℃維持1.0分鐘，50℃維持1.0分鐘，72℃維持1.5分鐘，進行30個循環；接著最終循環為72℃維持5分鐘，使用FailSafe PCR系統(Epicenter cat. #F599100)。所得約1kb之PCR產物選殖至pCR 2.1(Invitrogen cat. #K4550-40)接著包含下述方案，利用化學膦任TOP10F'大腸桿菌作為宿主菌株，用以確認核甘酸序列。
所得白色選殖株之10個挑選至3μl Luria培養液+1000μg/ml Ampicillin(LB Amp)，且於37℃振盪下生長隔夜。使用Nucleospin Plus質體Miniprep Kit(BD Biosciences cat. #K3063-2)由各培養物純化質體以及後續所包含方案。完成經單離之DNA的限制酵素分解以確認於pCR2.1載體中之PCR產物的存在。質體DNA以限制酵素EcoRI(New England Biolabs cat. #R0101S)分解。定序係於Beckman CEQ Quick Start Kit(Beckman Coulter cat. #608120)使用M13前置引子[5' GTA AAA CGA CGG CCA G 3'](序列編號：6)及反置引子[5' CAG GAA ACA GCT ATG AC 3'](序列編號：7)，根據製造商的指示而完成。為了內部一致性此基因序列及其對應蛋白質係給予新的一般命名AAD-2(v1)。
AAD-2(v1)二元載體的完成：AAD-2(v1)基因係由pDAB3202進行PCR擴增。PCR反應期間製造改變以於引子內分別於5-引子導入AflIII以及於3’引子導入SacI之限制位點。參照PCT/US2005/014737。使用引子"NcoI of Brady"[5' TAT ACC ACA TGT CGA TCG CCA TCC GGC AGC TT 3'](序列編號：14)以及"SacI of Brady"[5' GAG CTC CTA TCA CTC CGC CGC CTG CTG CTG CAC 3'](序列編號：15)於利用Fail Safe PCR System(Epicentre)以擴增DNA片段。PCR產物選殖至pCR2.1 TOPO TA選殖載體(Invitrogen)且序列使用Beckman Coulter "Dye Terminator Cycle Sequencing以Quick Start Kit"定序試劑以M13前置引子與M13反置引子予以確認。定序數據鑑定具有正確序列的選殖株(pDAB716)。然後將The AflIII/SacI AAD-2(v1)基因片段選殖至NcoI/SacI pDAB726載體。所得構築體(pDAB717)；AtUbi10啟動子：Nt OSM 5'UTR：AAD-2(v1)：Nt OSM3'UTR：ORF1 polyA 3'UTR係以限制酵素分解(利用NcoI/SacI)確認。此構築體選殖至二元pDAB3038作為NotI-NotI DNA片段。所得構築體(pDAB767)；AtUbi10啟動子：Nt OSM5'UTR：AAD-2(v1)：Nt OSM 3'UTR：ORF1 polyA 3'UTR：CsVMV啟動子：PAT：ORF25/26 3'UTR係經限制酵素分解(利用Nod、EcoRI、HinDIII、NcoI、PvuII及SalI)以確認正確定向。然後將完成的構築體(pDAB767)使用於轉形至農桿菌。
轉形阿拉伯芥的評估：種植新鮮收穫之經以植物最適化AAD-12(v1)或原始AAD-2(v1)基因轉形之T1種子且的如前述以對草丁膦的抗性予以選擇後將植物隨機指定於各種比率的2,4-D(50-3200g ae/ha)。除草劑施用係藉由履帶式噴灑機以187L/ha噴灑容積。所使用之2,4-D為市售之二甲基胺鹽調配物(456g ae/L，NuFarm，St Joseph，Mo.)混合有200mM Tris緩衝液(pH 9.0)或200mM HEPES緩衝液(pH7.5)。
AAD-12(v1)及AAD-2(v1)未提供可偵測的2,4-D抗性相對於轉形品系及未轉形對照品系；然而，個別構築體對於個別T1阿拉伯芥植物的2,4-D抗性的影響能力為廣泛變化。驚訝 地，AAD-2(v1)轉形株及AAD-2(v2)轉形株對於2,4-D抗性為遠低於AAD-12(v1)基因，二者皆來自高耐受植物以及整體平均損傷的頻率。沒有經以AAD-2(v1)轉形之植物存活於d 200g ae/ha 2,4-D相對於未損傷(<20%目視損傷)，以及整體族群損為約83%(參照PCT/US2005/014737)。相反地，當以3,200g ae/ha 2,4-D處理時，AAD-12(v1)具有族群損傷平均約6%。相對於原始基因，對於植物最適化AAD-2(v1)的耐受性稍為改良；然而，AAD-12及AAD-2植物最適化基因二者的比較顯示值物中AAD-12(v1)之顯著有利。
該等結果為不可預期給予活體外比較AAD-2(v1)(see PCT/US2005/014737)及AAD-12(v2)顯示二者為高度有效於降解2,4-D且二者共享對應於手幸芳基氧基烷酸酯基質的S-型特異性。AAD-2(v1)係表現於個別T1植物至各種程度；然而，藉由此所表現蛋白質提供免於2,4-D損傷的保護。對於原始及植物最適化AAD-2基因於蛋白質表現程度(植物體中)確證無實質差異(參照PCT/US2005/014737)。這些數據證實製造AAD-12(v1)於植物體的功能性表現的早期發現，以及造成不可預期的2,4-D及吡啶基氧基乙酸除草劑的除草劑抗性。
實施例11
於僅具有AAD-12(v1)轉形之大豆、棉花及其他雙子葉作物的苯氧基生長素除草劑於耕種的用途
AAD-12(v1)能使苯氧基生長素除草劑(例如，2,4-D及MCPA)及吡啶基氧基生長素(三氯比及氟氧比)用於防治直接於正常對2,4-D為敏感的作物的廣譜域闊葉雜草。2,4-D於280至2240g ae/ha的施用將防治存在於農藝環境的多數闊葉雜草品種。更典 型地，使用560至1120g ae/ha。對於三氯比，施用比率典型地範圍由70至1120g ae/ha，更典型為140至420g ae/ha。對於氟氧比，施用比率典型範圍由35至560g ae/ha，更典型為70至280 ae/ha。
此額外手段的優勢為極端低價的闊葉除草劑成分以及藉由高比率的2,4-D、三氯比或氟氧比所提供的短壽命殘餘雜草調控的可能性，相對於此，非殘餘除草劑如嘉磷塞將提供晚期發芽雜草的無防治。此手段也將提供具有HTC便利性的組合除草劑的作用模式作為整合的除草劑抗性與雜草遷移管理策略。
此手段所提供的另一優勢為廣譜域闊葉雜草防治除草劑(例如，2,4-D、三氯比及氟氧比)與商業使用之其餘雜草防治除草劑的槽混合能力。該等除草劑典型地於種植前或種植時施用，但通常對於種植前可能存在於田間的已發芽、已建立的雜草的效果較小。藉由延伸該等芳基氧基生長素除草劑的利用性至包括耕種、發芽前或種植前施用，殘餘雜草防治方案的彈性增加。此項技術領域者應辨知殘餘除草劑方案將根據感興趣作物而有所不同，但典型的方案將包括包括氯乙醯胺(chloracetmide)及二硝基苯胺(dinitroaniline)除草劑家族的除草劑，但也包括例如可滅蹤(clomazone)、甲磺草胺(sulfentrazone)及各種ALS-抑制除草劑、PPO-抑制除草劑及HPPD-抑制除草劑。
進一步的優勢包括種植前對需要於2,4-D、三氯比或氟氧比的耐受性以及後續之芳基氧基乙酸生長素除草劑施用(參照前述實施例)之耐受性；以及較少由受到2,4-D、三氯比或氟氧比污染的母料槽的不完全清潔對於雙子葉作物所造成之污染損傷。麥草畏(以及許多其他除草劑)仍可使用於AAD-12(v1)-轉形 雙子葉作物自願者的後續對照。
此項技術領域者也辨知上述實施例可應用至藉由安定轉形之AAD-12(v1)基因所保護之任何2,4-D-敏感性(或其他芳基氧基生長素除草劑)作物。雜草防治之技術領域者將辨知藉由AAD-12(1)轉形能使用各種市售苯氧基生長素除草劑或吡啶基氧基生長素除草劑單獨或與除草劑組合。其他化學品之代表性其它除草劑之特定比例可藉由CRP(作物保護參考資料(Crop Protection Reference))書冊或類似會編或任何市售或學術的作物保護參考資料如來自Agriliance(2005)的作物保護指引所編譯的除草劑標識。各替代的除草劑能藉由AAD-12(v1)使用於HTC，無論單獨使用、槽混合或依序使用，皆認為於本發明範圍。
實施例12
苯氧基生長素及吡啶基氧基生長素除草劑於AAD-12(v1)於耕種的用途僅轉形玉米、稻米及其他單子葉品種
於類似方式中，利用AAD-12(v1)之禾科品種(例如，但不限於玉米、稻米、小麥、大麥或草皮及牧草)的轉形將允許高效的苯氧基生長素及吡啶基氧基生長素使用於作物，無論是否確定正常的選擇性。多數的禾科品種對於生長系除草劑如苯氧基生長素類(亦即，2,4-D)具有天然的耐受性。然而，起因於施用時點的較短運作窗(shortened window)或不可接受的損傷風險，相對低的作物選擇性已造成於該等作物的減低利用性。因而，AAD-12(v1)-轉形單子葉作物將能利用對於雙子葉作物所敘述之類似的處理組合如施用2,4-D為280至2240g ae/ha以防治大多數的闊葉雜草品種。對於三氯比，施用比率典型的範圍由70至1120g ae/ha， 更典型為140至420g ae/ha。對於氟氧比，施用比率典型範圍由35至560g ae/ha，更典型為70至280 ae/ha。
此額外手段的優勢為極端低價的闊葉除草劑成分以及藉由高比率的2,4-D、三氯比或氟氧比所提供的短壽命殘餘雜草調控的可能性。相對於此，非殘餘除草劑如嘉磷塞將提供晚期發芽雜草的無防治。此手段也將提供以HTC的便利性於嘉磷塞耐受作物/AAD-12(v1)HTC合併策略作為整合的除草劑抗性與雜草遷移管理策略以輪作除草劑作用模式的機制，無論輪作或不輪作作物品種。
此手段提供的進一步的優勢為槽混合廣譜域闊葉雜草防治除草劑(例如，2,4-D、三氯比及氟氧比)與通常使用殘餘雜草防治除草劑的能力。該等除草劑典型於種植前或種植時施用，但通常對於於種植前可能存在於田間已發芽、已建立的雜草為較少效果。藉由延伸該等芳基氧基生長素除草劑的利用至包括種植時、發芽前或種植前施用，殘餘雜草防治方案的彈性增加。此項技術領域者應辨知殘餘雜草方案將依感興趣的作物為基礎而不同，但典型的方案將包括氯乙醯胺(chloracetmide)及二硝基苯胺(dinitroaniline)除草劑家族的除草劑，但也包括例如可滅蹤(clomazone)、甲磺草胺(sulfentrazone)及各種ALS-抑制除草劑、PPO-抑制除草劑及HPPD-抑制除草劑。
玉米、稻米及其他單子葉對於苯氧基生長素或吡啶基氧基生長素的增加的耐受性能使得該等除草劑使用於作物而無生長階段限制或作物歉收(crop leaning)、解開現象(unfurling phenomena)如「鼠尾」、作物歉收、生長調節誘導之莖脆性或畸型 支柱根。各替代的除草劑藉由AAD-12(v1)能使用於HTC，無論單獨使用、槽混合或依序使用，皆認為於本發明範疇中。
實施例13
稻米中的AAD-12(v1)
培養基說明：應用的培養基係利用1M KOH調整至pH 5.8且利用2.5g/L Phytagel(Sigma)固化。胚性細胞培養於含有40ml半固體培養基的100 x 20mm培養皿中。稻米植物體於Magenta箱中生長於50ml培養基。細胞懸浮液維持於含有35ml液體培養基且於125rpm旋轉的125-ml錐形燒瓶中。胚性培養物的誘導與維持發生於25至26℃暗處中，以及植物再生與全植物培養發生於16-小時光周期(Zhang等1996)。
胚性癒合組織的誘導及維持如前述(Li等1993)發生於NB基礎培養基，但適應於含有500mg/L麩胺醯胺。懸浮液培養物以含有30g/L蔗糖替代麥芽糖的SZ液體培養基中啟始與維持(Zhang等1998)。NBO培養基由NB培養基與添加各0.256M之甘露糖醇與山梨糖醇所組成。潮黴素-B-抗性癒合組織係於補充有50mg/L潮黴素的NB培養基培養3至4週予以選擇。預-再生(Pre-regeneration)發生於由NB培養基無2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)，但添加2mg/L 6-苄基胺基嘌呤(BAP)、1mg/L α-萘乙酸(NAA)、5mg/L脫酪酸(ABA)及50mg/L潮黴素B所組成的培養基(PRH50)1週。植物體的再生接著經由培養於包含NB培養基無2,4-D，且補充有3mg/L BAP、0.5mg/L NAA及50mg/L潮黴素B的再生培養基(RNH50)直到嫩芽再生。嫩芽轉移至具有一半強度的Murashige與Skoog基礎鹽類以及Gamborg's B5維生素，補充有1% 蔗糖與50mg/L潮黴素B(1/2MSH50)的發根培養基。
組織培養物發展：粳稻(Oryza sativa L.japonica cv.Taipei 309)的成熟乾燥種子係如Zhang等所述(1996)無菌化。胚性組織藉由於暗處在NB培養基培養無菌成熟稻米種子而誘導。接近1mm直徑之主要癒合組織，由鱗片(scutellum)移除且使用用以起始細胞懸浮於SZ液體培養基。然後將懸浮液如Zhang1995所述予以維持。前述之次培養後3至5日由液體培養物移除懸浮衍生的胚性組織且置於NBO等張培養基以形成約2.5cm涵蓋於培養皿的環且於撞擊前培養4小時。撞擊後16至20小時，組織由NBO培養基轉移至NBH50潮黴素B選擇培養基，確保精壯及表面朝上，且於暗處培養14至17日。然後由原始撞擊外植體分離新形成的癒合組織且置於接近相同的培養基。在另外的8至12日後，目視鑑定相對緊縮、不透明的癒合組織，且轉移至PRH50預再生培養基於暗處培養7日。生長癒合組織，其變成更為緊縮與不透明然後次培養至RNH50再生培養基於16小時光周期培養14至21日期間。再生的嫩芽轉移至含有1/2 MSH50培養基的Megenta箱。由單一外植體再生之多重植物被認為近緣者且如同一個獨立的植物品系處理。如果植物於1/2MSH50培養基產生厚實、白色根且有活力地生長則對於hph基因評分為陽性。一旦植物體達到Magenta箱的頂部，將其轉移至6-cm盆土壤中於100%濕度培養一週，然後移至具有14-小時光其間的30℃生長室且於轉殖至溫室中13-cm盆之前於暗處21℃培養2至3週。收集種子且於儲存前於37℃乾燥一週。
微彈撞擊(Microprojectile Bombardment)：所有撞擊皆 以Biolistic PDS-1000/HeTM系統進行(Bio-Rad,Laboratories,Inc.)。3毫克之1.0微米直徑金粒係以100%乙醇清洗一次、以無菌蒸餾水清洗2次且再懸浮於矽酮化Eppendorf管的50μl水中。5毫克質體DNA呈1：6莫耳比例的pDOW3303(含Hpt的vector)對pDAB4101(AAD-12(v1)+AHAS)、20μl亞精胺(0.1M)及50μl氯化鈉(2.5M)添加至金懸浮液。混合物於室溫培育10分鐘，於10000rpm沉積10秒，再懸浮於60μl冷100%乙醇以及8至9μl係分布至各巨載體。組織樣品係如Zhang等(1996)所述以1100psi與27英吋Hg真空進行撞擊。
於AAD-12(v1)轉形T0稻米的發芽後除草劑耐受性：稻米植物於3至5葉階段使用校正至187L/ha的履帶式噴灑機噴灑致死劑量的含有1% Sunit II(v/v)及1.25% UAN(v/v)的Pursuit的0.16%(v/v)溶液(以確認AHAS基因的存在)。敏感性或抗性的評比係於處理後(DAT)36日實施。33個案中之10個被送至溫室為對Pursuit為強力的耐受；其他則遭受各種程度的除草劑損傷。取樣植物且進行特徵化以鑑定該等含有AAD-12(v1)PTU及完整AHAS編碼區域二者的10個案中之7個。
T1稻米的AAD-12(v1)遺傳性：於含有AAD-12(v1)PTU及AHAS編碼區域二者的AAD-12(v1)品系的5個T1品系進行100-植物後代測試。以對應的上述步驟種植種子且如上所述使用履帶式噴灑機噴灑140g ae/ha咪唑乙烟酸。於14DAT後，計數抗性與敏感性植物。5個品系的2個測試分離為單一位點、主要孟德爾性狀(3R：1S)如Chi平方分析所策定。AAD-12與AHAS可選擇標記共分離如同下述2,4-D耐受性測試所測定。
T1稻米的高2,4-D耐受性的確認：下述T1 AAD-12(v1)單一分離位點品系係種植於含有Metro Mix培養基的3英吋盆中：pDAB4101(20)003及pDAB4101(27)002。於2至3葉階段以140g ae/ha噴灑咪唑乙烟酸。移除無效物且各者於V3至V4階段以設定為187L/ha之履帶式噴灑機噴灑1120、2240或4480g ae/ha的2,4-D DMA(分別為2 x、4 x及8 x的典型商業使用比率)。於7及14DAT評比植物且與未轉形商業稻米栽培品種「Lamont」作為陰性對照植物。
損傷數據(表22)顯示AAD-12(v1)-轉形品系對於高比率的2,4-D DMA相較於未轉形對照為更耐受。品系pDAB4101(20)003相較於品系pDAB4101(27)002對於高程度的2,4-D為更耐受。數據也顯示對於至少2個世代2,4-D的耐受性為安定的。
組織收獲、DNA單離及定量：新鮮組織係置入管中且於4℃凍乾2日。在組織完全乾燥後，管中置入鎢珠粒(Valenite)且使用Kelco珠磨機將樣品進行1分鐘乾式研磨。然後進行標準DNeasy DNA單離方案(Qiagen,Dneasy 69109)。然後以Pico Green(Molecular Probes P7589)染色所萃取DNA的分取樣品且利用已知 標準品於螢光儀(BioTek)掃描以獲得濃度呈ng/μl。
AAD-12(v1)表現：所有33個T0基因轉殖稻米品系及1個非基因轉殖對照係使用ELISA墨點分析AAD-12表現。AAD-12係於20個品系的純株中偵測，但不於品系Taipai 309對照植物偵測。有某些純株耐受於咪唑乙烟酸的20個品系中之12個表現AAD-12蛋白質，為AAD-12 PCR PTU陽性，及AHAS編碼區域陽性。表現程度範圍為2.3至1092.4ppm的總可溶蛋白質。
pDAB4101稻米植物對於2,4-D及三氯比除草劑的田間耐受性：田間程度耐受性試驗係以AAD-12(v1)個案pDAB4101[20]及野生型稻米(Clearfield 131)於密西西比州威塞德(Wayside)市進行(非基因轉殖之咪唑啉酮-抗性品種)。試驗設計為具有單一重覆之隨機完全區塊設計。除草劑處理係2倍比率之2,4-D(二甲基胺鹽)為2240g ae/ha以及三氯比為560g ae/ha加上未處理對照。於各除草劑處理中，使用具有8英吋植溝間隔的小條植區種植2植溝的T1世代pDAB4101[20]以及2植溝的Clearfield稻米。pDAB4101[20]稻米含有AHAS基因作為AAD-12(v1)基因之可選擇標記。咪唑乙烟酸於一葉階段施用做為選擇劑以移除來自區中的任何AAD-12(v1)無效植物。當稻米達2葉階段時使用壓縮空氣背式噴灑機以130至200kpa壓力遞送187L/ha載體容積施用除草劑處理。施用後於7、14及21日進行損傷的目視評比。
AAD-12(v1)個案對於2,4-D及三氯比的回應係顯示於表23。非轉形稻米品系(Clearfield)藉由被認為是4倍商業使用比率的2,4-D於2240g ae/ha為嚴重損傷(30%於7DAT及35%於15DAT)。AAD-12(v1)個案於7或15DAT觀察到無損傷而對於2,4-D 顯示優異耐受性。非轉形稻米藉由2倍比率的三氯比(560g ae/ha)為顯著的損傷(15%於7DAT及25%於15DAT)。AAD-12(v1)個案於7或15DAT皆觀察到無損傷而對2倍比率的三氯比顯示優異耐受性。
該等結果顯示AAD-12(v1)轉形稻米於對Clearfield稻米引起嚴重目視損傷的比率而對2,4-D及三率比展現高程度的抗性。其也顯示對於具有AAD-12 I多重性品種之堆疊多重除草劑耐受性基因的能力以提供對於廣譜有效化學品的抗性。
實施例14
AAD-12(v1)於油菜
油菜轉形：賦予對於2,4-D的抗性的AAD-12(v1)基因係使用於轉形Brassica napus var.Nexera*710具有農桿菌媒介轉形及質體pDAB3759。構築體含有由CsVMV啟動子驅動的AAD-12(v1)基因以及由AtUbi10啟動子驅動的Pat的基因以及EPSPS嘉磷塞抗性性狀由AtUbi10啟動子驅動。
種子以10%市售漂白劑進行表面無菌化10分鐘且以無菌蒸餾水清洗3次。然後將種子置於一半濃度的MS基礎培養 基(Murashige和Skoog,1962)且維持於設定為25℃以及16小時光/8小時暗的光周期的生長規範。
胚軸段(3至5mm)係由成長5至7日的種苗切除且置於癒合誘導培養基K1D1(MS培養基具有1mg/L激動素(kinetin)及1mg/L 2,4-D)3日做為前處理。然後將段轉移至培養盤，以含有pDAB3759的農桿菌Z707S或LBA4404菌株處理。該農桿菌係於暗處振盪器中以150rpm於28生長隔夜且後序在懸浮於培養基中。
胚軸段以農桿菌處理30分鐘後，將其等放回癒合誘導培養基3日。接著共培養，將段置於K1D1TC(含有250mg/L卡比西林及300mg/L特美汀的癒合誘導培養基)用於一週或二週回復。替代地，將段直接置於選擇培養基K1D1H1(具有1mg/L雙丙氨膦的上述培養基)。卡比西林及特美汀為用於殺死農桿菌的抗生素。選擇藥劑雙丙氨膦使轉形細胞生長。
然後將癒合胚軸段置於B3Z1H1(MS培養基，3mg/L苄基胺基嘌呤、1mg/L Zeatin、0.5gm/L MES[2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸]、5mg/L硝酸銀、1mg/L雙丙氨膦(Herbiace)、卡比西林(卡苯尼西林)及特美汀(Timentin))嫩芽再生培養基。2至3週後嫩芽開始再生。具有嫩芽的胚軸段轉移至B3Z1H3培養基(MS培養基，3mg/L苄基胺基嘌呤、1mg/L Zeatin、0.5gm/L MES[2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸]、5mg/L硝酸銀、3mg/L雙丙氨膦、卡比西林及特美汀)再培養2至3週。
由胚軸段切除嫩芽且轉移至嫩芽延伸培養基MESH5或MES10(MS，0.5gm/L MES、5或10mg/L雙丙氨膦(Herbiace)、 卡比西林(卡苯尼西林)、特美汀(Timentin))維持2至4週。延伸的嫩芽係於MSI.1(MS with 0.1mg/L吲哚丁酸)培養用以誘導根。一旦植物具有良好發展的根系統，將其等轉移至土壤。植物於轉移至溫室前於經調控環境條件下在Conviron植物生長箱中馴化1至2週。
分子分析-油菜材料與方法：收獲DNA的組織的單離與定量。將新鮮組織置於管中且於4℃凍乾2日。在組織完全乾燥後，於管中置入鎢珠粒(Valenite)且樣品使用Kelco珠磨機進行1分鐘乾式研磨。然後接著進行標準DNeasy DNA單離步驟(Qiagen,DNeasy 69109)。然後分取所萃取的DNA樣品以Pico Green(Molecular Probes P7589)染色且以已知標準品於螢光儀(BioTek)判讀以獲得濃度呈ng/μl。
聚合酶鏈鎖反應：總計100ng的總DNA使用作為模板。20mM的各引子與Takara Ex Taq PCR聚合酶套組(Mirus TAKRR001A)使用。對於編碼區域PCR AAD-12(v1)的引子為(序列編號：10)(前置)及(序列編號：11)(反置)。PCR反應係於9700 Geneamp熱循環機(Applied Biosystems)進行，藉由使樣品進行94℃維持3分鐘以及35個循環的94℃維持30秒、65℃維持30秒以及72℃維持2分鐘接著於72℃維持10分鐘。PCR產物藉由與EtBr於1%瓊脂凝膠進行電泳而分析。來自35個具有AAD-12(v1)個案的35個樣品測試為陽性。三個陰性對照陰性對照樣品測試為陰性。
ELISA：使用如前段所述之已建立的ELISA，偵測於5個不同油菜轉形植物個案中的AAD-12蛋白質。表現程度範圍由 14至超過700ppm的總可溶性蛋白質(TSP)。以平行測試三個不同的未轉形植物樣品無偵測信號，顯示使用於分析的抗體對於油菜細胞基質具有最低恆跨反應性。該等樣品也經由西方墨點分析(Western analysis)確認為陽性。結果的總結呈示於表24。
於AAD-12(v1)轉形T0油菜的發芽後除草劑耐受性：來自經以構築體pDAC3759轉形的45個T0個案，移送至溫室歷時一段期間請於溫室中使其馴化。植物生長直至2至4個新的、正常外觀的葉片發芽(亦即，植物已由組織培養物轉移至溫室生長條件)。然後將植物以比率560g ae/ha之2,4-D胺4的市售調配物的致死劑量處理。除草劑係以履帶式噴灑機以噴灑容積187L/ha、50-cm噴灑高度施用。致死劑量係定義為對於未轉形對照引起>95損傷%的比率。轉形對照24個個案耐受於2,4-D DMA除草劑施用。某些個案招致微小損傷但於14DAT回復。個案於調控、套袋條件下藉由自花授粉進行至T1(及T2世代)。
油菜的AAD-12(v1)遺傳性：對於AAD-12(v1)的11個T1品系也進行100的植物後代檢定。將種子播種且轉植至填充 有Metro Mix培養基的3-英吋盆。然後如前述以560g ae/ha 2,4-D DMA噴灑所有植物。14 DAT後，計數抗性及敏感性植物。11個測試品系的7個分離為單一位點，如同Chi-平方分析所決定的主要的孟德爾性狀(3R：1S)。如同於多重品種之強力的芳基氧基烷酸酯生長素抗性基因，AAD-12係可遺傳的，且可與一種或多種額外的除草劑抗性基因堆疊。
油菜的AAD-12(v1)遺傳性：對於AAD-12(v1)的11個T1品系也進行100的植物後代檢定。將種子播種且轉植至填充有Metro Mix培養基的3-英吋盆。然後如前述以560g ae/ha 2,4-D DMA噴灑所有植物。14 DAT後，計數抗性及敏感性植物。11個測試品系的7個分離為單一位點，如同Chi-平方分析所決定的主要的孟德爾性狀(3R：1S)。如同於多重品種之強力的芳基氧基烷酸酯生長素抗性基因，AAD-12係可遺傳的，且可與一種或多種額外的除草劑抗性基因堆疊。
於T1油菜之高2,4-D耐受性的確認：對於T1 AAD-12(v1)，5至6mg的種子分層，以及於土壤的頂層添加一細層的Sunshine Mix #5培養基。種植後發芽植物於7及13日以560g ae/ha的2,4-D選擇。
存活植物轉植至含有Matro Mix培養基的3-英吋盆。經以560g ae/ha 2,4-D選擇之來自T1繼代的存活植物，也轉 植至填充Metro Mix土壤的3-英吋盆。於2至4葉階段對植物噴灑280、560、1120或2240g ae/ha的2,4-D DMA。植物於3及14DAT評比且與未轉形對照植物比較。T1個案損傷數據14DAT取樣可見於表25。數據建議多重個案係對於2240g ae/ha 2,4-D為強力的抗性，而其他個案顯示達1120g ae/ha 2,4-D之較低的強力耐受性。存活植物係轉植至含有Metero Mix培養基的51/4英吋盆，以及置於如前述相同生長條件且自花授粉以僅產生同合子種子。
pDAB3759油菜植物對於2,4-D、滴丙酸、三氯比及氟氧比除草劑的田間耐受性：田間等級耐受性試驗係對於二個AAD-12(v1)個案之3759(20)018.001及3759(18)030.001與野生型油菜(Nex710)於美國印第安納州佛勞爾市(Fowler,Ind)進行。試驗設計為具有3重複之隨機完全區塊設計。除草劑處理為2,4-D(二甲基胺鹽)為280、560、1120、2240及4480g ae/ha，三氯比為840g ae/ha，氟氧比為280g ae/ha以及未處理對照。於各除草劑處理內，用於個案3759(18)030.0011、3759(18)018.001及野生型品系(Nex710)的每個案單一20英呎植溝係以4條播機以8英吋植溝間隔種植。除草劑處理係當油菜達4至6葉階段時使用壓縮空氣後背式噴灑機130至200KPA壓力傳遞，以187L/ha載體容積予以施用。在施用後7、14及21日進行目視損傷評比。
油菜對於2,4-D、三氯比及氟氧比的回應顯示於表26。被認為是4倍比率的2,4-D於2240g ae/ha嚴重損傷(72%於14DAT)野生型油菜(Nex710)為。AAD-12(v1)個案於14DAT對於2,4-D全顯示優良的耐受性，於1、2及4倍比率分別觀察到2、3及2%的平均損傷。藉由2倍比率的三氯比(840g ae/ha)嚴重損傷(25%於14DAT)野生型油菜。AAD-12(v1)個案以跨2個案於14DAT為平均6損傷%顯示對於2倍比率三氯比的耐受性。氟氧比於280g ae/ha於14DAA對於非轉形品系引起嚴重損傷(37%)。AAD-12(v1)個案於5DAT以平均8損傷%顯示增加的耐受性。
該等結果顯示AAD-12(v1)轉形個案對於以對非轉形油菜為致命的，或引起嚴重畸形轉形的比率的2,4-D、三氯比及氟氧比展現高程度的抗性。AAD-12已顯示具有2,4-D>三氯比>氟氧比的相對有效性。
實施例15
AAD-12大豆個案DAS-68416-4的轉形及選擇
基因轉殖大豆(Glycine max)個案DAS-68416-4係經由大豆子葉節外植體的農桿菌媒介轉形而產生。回復平常狀態的 農桿菌(Agrobacterium)菌株EHA101(Hood等，2006)帶有於T-股DNA區域內的可選擇標記(pat)及感興趣(AAD-12)基因的二元載體pDAB4468(第二圖)，而且使用於起始轉形。
進行農桿菌媒介轉形。簡明地，大豆種子(cv Maverick)於基礎培養基發芽，且單離子葉節，並將其以農桿菌感染。嫩芽起始、嫩芽延伸及發根介質係補充頭孢子菌(cefotaxime)、特美汀(timentin)及萬古黴素(vancomycin)以移除農桿菌。應用草丁膦選擇以抑制非轉形嫩芽的生長。經選擇的嫩芽轉移至發根介質用於根部發育後移轉至土壤混合物用以馴化植物。
經選擇植物的頂生小葉(terminal leaflets)以草丁膦進行葉塗佈以篩選疑似的轉形株。經篩選的植物轉移至溫室，使其馴化後以草丁膦進行葉塗佈以確認耐受性及確信疑似的轉形株。經篩選植物取樣與分子分析以進行可選擇標記基因及/或感興趣基因的確認。使T0植物於溫室中自我受粉以提供T1種子。
T1植物係經回交且導入至優良種質(Maverick)。此個案，大豆個案DAS-68416-4，係由獨立轉形單離體產生。個案係基於其獨特特徵如單一插入位點、正常孟德爾分離及安定的表現，以及效果的優異組合，包含於廣域基因型背景與跨多重環境場所之除草劑耐受性及農藝表現。大豆個案DAS-68416-4的其他敘述已揭示於WO 2011/066384，其全部內容以參考方式併入本文。
實施例16
2008年農藝數據的產生
以大豆個案DAS-68416-4及非基因轉殖對照(var.Maverick)的農藝研究係於2008年在位於愛荷華州、伊利諾州、印 第安那州、內布拉斯加州及加拿大渥太華州(2個位點)的6個位點進行。農藝測定值，評估包含立株/族群計數、苗/植株活力、植株高度、倒伏性、疾病發生率、蟲害及至開花日數，以研究大豆個案DAS-68416-4大豆(具有或不具有除草劑處理)相對於對照品系Maverick。此研究稱為農藝試驗S1。
測試與對照的大豆種子係以具有接近30英吋(75cm)的植溝間距之每25英呎接近112個種子的種植比率種植。各位點，以2至25英呎植溝所組成之各區建立各處理的三重複。將區安排為隨機完全區塊(RCB)設計，於各位點具有獨特的隨機化。各大豆區係由類似成熟度的非基因轉殖大豆的二植溝為邊界。品項試驗位點係由類似於相對成熟度的非基因轉殖大豆的最少10英呎所圍繞。
除草劑處理以每公畝接近20加侖的噴灑容積(187L/ha) 施用。該等施用係設計為重複最大標示比率商業實施。2,4-D係施用對於季節總計為三次全面超過頂端施用3 lb ae/A。個別施用1.0 lb ae A(1,120g/ha)於發芽前與接近V4及R2生長階段。草丁膦係施用施用對於季節總計為三次全面超過頂端施用0.74 lb ai/A(828g ai/ha)。個別施用0.33 lb ai/A與0.41 lb ai/A(374和454g ai/ha)係於接近V6及R1生長階段製造。
使用固定模式(SAS Version 8；SAS Institute 1999)對於農藝數據進行跨田間位點的變異分析。將品項考慮為固定效果，以及場所、場所內區塊、根據品項的場所以及場所內根據區塊的品項，設計為隨機效果。整體處理效果的顯著性係使用F檢定法估算。於對照與未噴灑大豆個案DAS-68416-4(未噴灑)、大豆個案DAS-68416-4噴灑草丁膦(大豆個案DAS-68416-4+草丁膦)、大豆個案DAS-68416-4噴灑2,4-D(大豆個案DAS-68416-4+2,4-D)以及大豆個案DAS-68416-4噴灑草丁膦及2,4-D二者(大豆個案DAS-68416-4+both)基因轉殖品項之間使用t檢定法製造配對對照。也使用錯誤發現比率(FDR)相對於對照對於多重性計算P-值(Benjamini和Hochberg,1995)。
進行由對照、大豆個案DAS-68416-4未噴灑、大豆個案DAS-68416-4+2,4-D、大豆個案DAS-68416-4+草丁膦及大豆個案DAS-68416-4+二除草劑所收集的農藝數據的分析。對於立株計數、早期族群、苗活力、施用後損傷、倒伏性、最終立株計束或至開花日數，沒有觀察到統計上的顯這差異(表28)。對於高度，於對照及大豆個案DAS-68416-4+2,4-D噴灑之間觀察到顯著的配對t檢定法。然而，觀察到沒有顯著的整體處理效果，於大 豆個案DAS-68416-4處理及對照之間的差異非常小，且於不同大豆個案DAS-68416-4處理之間沒有共通的差異。基於該等結果，大豆個案DAS-68416-4係農藝均等於進等基因非基因轉殖對照。
實施例17
2009農藝數據的產生
以大豆個案DAS-68416-4及非基因轉殖對照(var.Maverick)的農藝研究係於2009年在位於阿肯色州、愛荷華州、伊 利諾州、印第安那州、密蘇里州及內布拉斯加州的8個位點進行。農藝測定值，評估包含立株/族群計數、苗/植株活力、植株高度、疾病發生率、蟲害及至開花日數，以研究大豆個案DAS-68416-4大豆(具有或不具有除草劑處理)相對於對照的均等性(表29)。
對於試驗使用隨機-完全-區塊設計(randomized-complete-block design)。品項為大豆個案DAS-68416-4、Maverick對照品系及市售可得非基因轉殖大豆品系。測試、對照 及參考大豆係以具有約30英吋(75cm)的植溝間距的每植溝為約112個種子的接種比率種植。於各位點，以2至25英呎植溝所組成之各區而建立各處理為4重複區。每個大豆區係藉由非基因轉殖大豆(Maverick)的2植溝為界。品項試驗最少係由非基因轉殖大豆(Maverick)的4個植溝(或10英呎)所圍繞。施用合適的昆蟲、雜草及疾病對照實施以製造農藝上可接受的作物。
除草劑處理係施用係設計為重複最大標示比率商業實施。處理係由非噴灑對照與在特定生長階段施用2,4-D、草丁膦、2,4-D/固殺草的除草劑施用所組成。對於2,4-D施用，除草劑於V4及R2生長階段以比率1.0 lb ae/A(1,120g ae/ha)施用。對於草丁膦處理，於V4及V6至R2生長階段對植物進行施用。對於該二施用，草丁膦於V4及V6至R2施用係分別以比率0.33 lb ai/A(374g ai/ha)及0.41 lb ai/A(454g ai/ha)施用。對於二除草劑施用的品項為大豆個案DAS-68416-4及包含非基因轉殖Maverick的對照。Maverick區塊係期待於除草劑施用後死亡。
使用固定模式(SAS Version 8；SAS Institute 1999)對於農藝數據進行跨田間位點的變異分析。將品項考慮為固定效果，以及場所、場所內區塊、根據品項的場所以及場所內根據區塊的品項，設計為隨機效果。個別場所的分析係以品項做為固定效果，且區塊及根據區塊的品項作為隨機效果的類似方式完成。數據未進行統計分析。顯著差異宣告於95%可信度(confidence level)，以及整體處理效果的顯著性係使用F檢定法估算。配對對比係於未噴灑AAD-12(未噴灑)、AAD-12噴灑與草丁膦(AAD-12+草丁膦)、AAD-12噴灑與2,4-D(AAD-12+2,4-D)以及AAD- 12噴灑與草丁膦及2,4-D(AAD-12+2,4-D+草丁膦)二者的基因轉殖品項之間產生以及對照品項使用T檢定法。
由於此研究中所製造的大數量的對比，多重性為議題。當於單一研究中製造大數量的比較以觀察未預期的效果時，多重性為議題。此等條件下，基於比較性(comparison-wise)p-值的虛偽宣告差異的可能性非常高(1至0.95比較的數目)。此研究中每個分析物有四個比較(對於農藝為16個分析觀察類型)，造成對於農藝為64個比較。因此，對於農藝基於未經調整p-值所宣告的一種或多種虛偽差異的可能性為99%(1至0.9564)。
進行由對照、AAD-12未噴灑、AAD-12+草丁膦、AAD-12+2,4-D及AAD-12+2,4-D+草丁膦品項所收集的農藝數據的分析。對於跨位點分析，於苗活力、最終族群、植物活力/損傷(V4、R1)、倒伏性、疾病發生率、蟲害、至開花日數、至成熟日數、莢數目、種子數目、產量及植株高度沒有觀察到統計上的顯著差異。對於立株計數及早期族群，於對照及AAD-12+草丁膦品項之間觀察到顯著的配對t檢定法，但不伴隨總處理效果或經p-值調整的錯誤發現率(FDR)而顯著。對於植物活力/損傷(R2)，於對照及AAD-12+草丁膦與AAD-12+2,4-D+草丁膦品項二者之間，觀察到顯著的配對t檢定法，但不伴隨經p-值調整的錯誤發現率(FDR)而顯著。對於此研究中所測試的參考品系，所有該等變數的平均結果也在可觀察範圍。
實施例18
AAD1個案pDAS 1740-278的轉形及選擇
AAD1個案，pDAS 1740-278，係藉由玉米品系Hi-II 的WHISKER媒介轉形而製造。所使用的轉形方法係揭示於美國專利申請案第20090093366號。質體pDAS1740(第3圖)的Fspl片段，也稱為pDAB3812，係轉形至玉米品系。此質體構築物含有植物表現匣，該匣含有RB7 MARv3：：Zea mays Ubiquitin 1啟動子v2//AADl v3//Zea mays PER5 3'UTR：：RB 7 MARv4植物轉錄單元(PTU)。
產生多數個案。存活及製造健康的快伏草-抗性癒合組織的該等個案係給予表示疑似轉形個案的獨特鑑別碼，且持續轉移至新鮮培養基。由衍生自各獨特個案的組織再生植物且轉移至溫室。
取樣葉片樣品進行藉由南方墨點、DNA邊界確認及地理標記輔助確認的分子分析以確認AAD-I轉殖基因的存在。陽性TO植物以自交品系授粉以獲得T1種子。個案pDAS 1470-278-9(DAS-40278-9)的T1植物經選擇、自體受粉及特徵化5個世代。同時，T1植物係對於數個世代經由標記-輔助選擇而回交且且導入至優良種質(elite germplasm)(XHH 13)。此個案由獨立轉形單離體產生。根據其獨特特徵如單一插入位點、正常孟德爾分離及安定的表現，以及包括跨多重環境場所的廣效基因型中的除草劑耐受性及農藝表現的優異組合而選擇個案。關於玉米個案pDAS-1740-278-9的其他說明已揭示於專利WO 2011/022469，其全部內容以引用方式併入本文。
實施例19
除草劑施用及農藝數據
除草劑施用係以每英畝約20加侖的噴灑容積(187 L/ha)施用。
該等施用係設計為重複最大標示比率商業實施。Weedar 64(026491-0006)使用濃度為39%、3,76 lb ae/gal、451g ae/l以及Assure II(106155)使用濃度為10.2%、0.87 lb ai/gal、104g ai/g。
2,4-D(Weedar 64)係對測試品項4及5呈3次全面施用於超越頂端(over-the-top)施用(季節總計為3 Ib ae/A)。個別施用係於發芽前與接近V4及V8至V8.5階段。對於Weedar64，個別目標施用比率為1.0 lb ae/A，或1120g ae/ha。實際失用比率範圍由1096至1231g ae/A。
快伏草(Quizalofop)(Assure II)係對測試品項3及5呈單一全面施用於超越頂端施用。施用時點係約V6生長階段。對於Assure II，目標施用比率為0.0825 lb ai/A，或92g ai/ha。實際施用比率範圍由約90.8至103g ai/ha。對於各場所於區塊2、3及4內的所有測試品項紀錄農藝特徵。表30列出所測量的特徵。
進行由對照、aad-1未噴灑，、aad-1+2,4-D、aad-\+快伏草(quizalofop)及aad-\+二品項所收集的農藝數據的分析。對於跨位點(across-site)分析，於跨場所總結分析中在早期族群(V1及V4)、苗活力、最終族群、作物損傷、至吐鬚時間、至花粉散發時間、莖倒伏性、根倒伏性、疾病發生率、蟲害、至成熟日數、植株高度及花粉存活率(形狀及顏色)的數值，沒有觀察到統計上的顯著差異。對於滯綠及穗位高度，於對照及aad-1+快伏草品項之間觀察到顯著的配對t檢定法，但不伴隨總處理效果或經p-值調整的錯誤發現率(FDR)而顯著(表31)。
實施例20
額外的農藝試驗
玉米品系40278相較於近-等值品系玉米品系的農藝特徵係於橫跨多歧環境予以評估。處理包括橫跨總計21個場所之4個基因上不同的雜交系且以及其合適的近-等值品系對照雜交系。
四個測試雜交系為範圍由99至113日相對成熟度之中度至晚成熟度雜交系。試驗A測試個案DAS-40278-9於基因背景自交系C x BC3S1轉化。此雜交系具有109日的相對成熟度且 於16個場所測試(表32)。試驗B測試雜交系背景自交系E x BC3S1轉化，113日相對成熟度雜交系。此雜交系於14個場所測試，使用宇試驗A稍微不同的場所設定。試驗C及D分別測試雜交系背景BC2S1轉化x自交系D及BC2S1轉化x自交系F。該等雜交系二者皆具有99日相對成繩度且於相同的10個場所測試。
對於各試驗，隨機完全區集設計(randomized complete block design)使用於每場所具有二重複與二植溝區塊。植溝長度為20英呎且各植溝於每植溝種植34個種子。標準區域農一實施使用於試驗管理。
對於8種農藝特徵收集與分析數據；植株高度、穗位高度、莖倒伏性、根倒伏性、最終族群、籽粒濕度、測試重量及產量。參數植株高度與穗位高度提供關於雜交系外觀的資訊。百分比莖倒伏性與根倒伏性的農藝特徵決定雜交系的可收穫性。最終族群計數測量種子品質與影響產量的季節生長條件。收穫的百分比籽粒濕度界定雜交系成熟度以及產量(對濕度調整為蒲式耳/英畝)及測試重量(對15.5%濕度調整為重量呈玉米的蒲式耳的磅數)說明雜交系的再製造能力。
變異分析係使用線性模式橫跨田間位置進行。包含於模式中的品項與場所作為固定效應。探測藉由品項作為隨機效應的包括場所與場所的混合模式，但藉由品項的場所僅解釋小部分的變異且其變異組份為零時通常為不顯著差異。對於主莖羽根的倒伏性，使用對數轉換以安定變異，然而平均與範圍係於原始等級報導。顯著差異系主張95%可信度。所有處理效應的顯著性係使用t檢定法估算。
來自該等農藝特徵試驗的結果可見於表32。相較於等值品系對照，在四個40278的雜交系中對於穗位高度、莖倒伏性、根倒伏性、籽粒濕度、測試重量及產量的參數沒有任何顯著的差異(p<0.05)。最終族群計數與植株高度於試驗A及B為顯著不同，但類似的差異未見於其他測試的40278雜交系。可見的某些變化可能起因於來自DAS-40278-9個案進入優良自交系的回交所保留的低程度基因可變性。測量參數地總範圍直皆在傳統玉米雜交系所獲得的數值範圍內且不會導致增加的雜草的結論。綜上，農藝特徵數據顯示40278玉米為生物性等效於習知玉米。
與近-等值品系玉米相比較之含有個案DAS-40278-9雜交玉米的農藝特徵係由對於生長季節涵蓋多其地理環境的多重田間試驗收集。相較於無效植物之含有個案DAS-40278-9的雜交玉米品系的結果列表於表33。
對於含有DAS-40278-9的雜交玉米與無效植物於發展的V3階段噴灑除草劑除草劑快伏草(280g ae/ha)以及於發展的V6階段噴灑2,4-D(2,240g ae/ha)的農藝特徵示於表34。
實施例21
2,4-D增加2,4-D抗性大豆的生長
具有AAD-12轉殖基因的基因轉殖大豆對大豆提供保護同時藉由施用2,4-D破壞雜草。未期望觀察到2,4-D也於2,4-D耐受性大豆中增加生長。此增加的生長造成噴灑作物相較於未-噴灑作物之植株高度及/或產量的增加。
2,4-D施用造成的植物生長及/或產量的增加係敘述為對於大豆植物遺傳上經工程化為耐受於2,4-D。試驗於涵蓋本美大豆生長區域的橫跨多重場所生長。包括優良品系的品項進入已被導入之個案DAS-68416-4(其修正對2,4-D的耐受性)。由未噴灑-噴灑與2,4-D噴灑處理所組成的處理施用於V3及R2二生長階段。於整個季節期間對區塊測量各種農藝特徵包括植株高度及籽粒產量。於整個季節對噴灑與未-噴灑區塊二者皆防治雜草以去除任何競爭效果。於試驗結論時，數據分析對於經噴灑2,4-D的品項與未接受處理者比較以測量高度於產量的顯著增加。產量的增加為對於2,4-D抗性大豆藉由2,4-D所傳遞的雜草防治的額外益處。
田間試驗於2011年進行以比較經噴灑2,4-D大豆個案DAS-68416-4(國際專利申請案第2011/066384號)的農藝特徵，與未噴灑大豆個案DAS-68416-4的農藝特徵。田間試驗中係導入含有4個優良大豆品系品項的大豆個案DAS-68416-4，以及不含有大豆個案DAS-68416-4的4個大豆優良品系的個別無效等值品系。試驗係種植涵蓋不同地理場所(總計十個場所)。實驗係經設定為每場所具有二個重複的修正裂區塊。處理全部區塊且次區塊 皆為品項。由1.25英尺長的二個植溝所組成的各區塊，相隔30英吋種植。區塊於V3及R2生長階段噴灑2,4-D(1120g ae/ha)處理。整個季節中，田間區塊維持於正常農藝實施條件且保持無雜草。對於大豆植物測量各種農藝特徵以測定2,4-D的施用如何影響大豆農藝特徵的表現。所測試的農藝特徵與收集數據時的生長階段列表於表35。
於大豆生長季節結束時，合併來自所有場所的數據 且進行跨場所的分析。數據分析係使用JMP® Pro 9.0.3(SAS,Cary,NC)進行。來自分析的最小平方平均值示於表28。對於含有AAD-12轉殖基因的大豆個案DAS-68416-4的2,4-D施用造成生長增加的修整效應(conditioning effect)。生長增加歸因於噴灑2,4-D區塊相較於未噴灑2,4-D區塊測量的顯著較高的產量與植株高度。該些增加當所分析數據累積橫跨所有場所時為可確定的。相對於此，噴灑2,4-D的大豆個案DAS-68416-4的產量增加藉由場所處理交互作用而減少。表36中，藉由施用2,4-D之平均高度與產量二者增加約5%。
如表37所示，10個場所中至少一個報導對於未噴灑大豆個案DAS-68416-4植物相較於2,4-D噴灑大豆個案DAS-68416-4植物為顯著較高產量收穫。當所有場所的結果累積 時，對於含有AAD-12轉殖基因的大豆的施用2,4-D顯示修整效應(conditioning effect)造成生長增加。例如，噴灑2,4-D的大豆個案DAS-68416-4植物的產量為56.4 bu/acre，其被認為較大於未噴灑大豆個案DAS-68416-4植物地產量(其為53.7 bu/acre)。同樣地，噴灑2,4-D的大豆個案DAS-68416-4植物的高度為81cm其被認為較大於未噴灑大豆個案DAS-68416-4植物的高度(其為77cm)。
實施例22
2,4-D增加2,4-D抗性大豆於2,4-D/嘉磷塞組合中之生長
如前述實施例類似的田間試驗於2010年進行但採用2,4-D與嘉磷塞組合的二個施用。結果顯示2,4-D抗性大豆的生長，噴灑區塊相較於未噴灑區塊的植株高度及/或產量的增加，係起因於2,4-D的施用。
顯著處理效果係由數種參數測量而觀察到。2,4-D與嘉磷塞二者係於V3及R2生長階段噴灑。試驗係涵蓋不同地理場所(總計六個場所)。測試的農藝特徵及收集數據的生長階段列於表30。表38中對於噴灑大豆之平均高度增加6%且平均產量增加17%。此外，對於噴灑大豆的平均種子重量增加6%。
如表39所示，也於此實施例中觀察到某些地理變異性。對於表39中的噴灑大豆，平均產量增加21.6%。
實施例23
比較噴灑處理與未噴灑處理的產量試驗結果
經以芳基氧基烷酸酯二氧酶(AAD)轉形之2,4-D抗性基因轉殖作物當以刺激量的包含芳基氧基烷酸酯部分的除草劑處理時造成增加的產量。包含AAD-12基因表現盒的大豆案例於噴灑處理與未噴灑處理下於重複的產量試驗中測試。有一系列的試驗係含有適合於北方緯度的早期大豆以及另一系列試驗係含有適合於更南方緯度的晚期大豆。前述試驗中，有案例為包含AAD-12基因表現盒的大豆品項於生長季節中以2,4-D處理而相對於未噴灑處理顯現與增加產量。
經修正之裂區設計(split plot design)以2重複使用於試驗。各區為2行(row)寬具有30吋行距與12.5呎長。種植端到 端的各區之間有2.5至3個踩踏通道以於整個季節試驗中可移動。噴灑區塊係於生長季節以2,4-D膽鹼+嘉磷塞(預混物)為2185g ae/ha+AMS為2%重量/重量依序噴灑(二次)。
第一次施用在V3生長期以及第二次施用在R2生長期。實驗性田間試驗與對照田間試驗二者皆藉由使用傳統除草劑與手工除草於整個季節保持無雜草。收集出苗、種子活力、作物損傷、開花日、於R2的立株計數、疾病發生率、蟲害植株高度、成熟日、倒伏性、脫粒、100個種子重量與產量的數據。數據使用JMP® Pro 9.0.3分析。表40列出使用於最終分析的場所。某些種植的場所因在區變異性內而未包含於分析中。
涵蓋場所分析對於早期試驗與晚期試驗皆進行。表 41與表42分別顯示對於早期試驗與晚期試驗之變異性的產量分析。
對於早期試驗與晚期試驗有顯著(P=0.05)名稱效果。由於各優良大豆品系係經過來自不同基因背景的導入情事而為所預期的。
對於早期試驗測量為顯著處理效果顯示噴灑與未噴灑造成產量不同。對於晚期試驗沒有顯著處理效果顯示噴灑與未噴灑不造成產量不同。
對於早期試驗與晚期試驗來自處理交叉效果的名稱不顯著的結果顯示於特定試驗中對於各品項的處理的效果(或缺乏效果)為相同。
表43顯示於早期試驗中對於各品項藉由處理組合的平均產量，其中HOMO表示同型合子(homozygous)。數值後之相同字母(於規定的變種內)根據Student’ st於P=0.05沒有不同。當於V3與R3以2185g ae/ha+AMS依序噴灑2,4-D膽鹼+嘉磷塞(預混物)時，有四個品項顯示較高產量。
表44顯示由處理組合對於各品項的平均產量。數值之後的相同字母(於規定的變種內)根據Student’ st於P=0.05沒 有不同。如上述報導，對於晚期試驗由品項效果沒有顯著的處理效果而意味沒有實施分別。表中文字顯示在晚期測試中噴灑與未噴灑沒有差異。
由此實施例中田間試驗的結果再一次顯示在某些環境下對於某些大豆基因型在施用2,4-D後可能增加產量。過去二年中，該等產量增加已在MG2生長區域運作的田間試驗中觀察 到。
實施例24
大豆與棉花的比較
由包含AAD-12轉殖基因的大豆田間試驗的產量結果顯示2,4-D的施用於某些環境中對於某些大豆基因型可增加產量。當相較於包含AAD-1轉殖基因的轉殖玉米情況時，這些結果令人驚訝。AAD-1轉殖玉米植物的產量不一致性地顯示在噴2,4-D之後統計上顯著地增加產量。這些AAD-1轉殖玉米植物為生物上均等於於傳統玉米。自2010年至2012年對於雜交玉米種完成多岐性地理區域額外的田間研究。這些田間研究中，噴灑2 2,4-D(2,185g ae/ha與4,370g ae/ha)的玉米種的產量與未處理的對照育米種(例如，未噴灑2,4-D)相比較。這些試驗的結果進一步證實含有AAD-1轉殖基因的玉米植物不因2,4-D噴灑處理的結果而顯著增加產量。相對地，在某些大豆基因型中顯示2,4-D施用後產量增加。於大豆基因型所觀察到的在2,4-D施用後的產量增加為意外的改良而起可應用於增加玉米植物的產量。所揭示的方法可施展用於使用2,4-D處理以增加轉職玉米植物的產量，例如表現AAD-12基因。
雖然前述發明已藉由某些說明與實例詳細敘述用以清楚了解其目的，其顯而易見地在隨附的申請專利範圍的範疇中可進行某些改變與修改。
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<223> AAD-12(v2)之大腸桿菌最適化核苷酸序列
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Claims (32)

  1. 一種用以改良2,4-D抗性作物產量的方法，包含以刺激量之包含芳基氧基烷酸酯部份的除草劑處理該植物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該2,4-D抗性作物係經以芳基氧基烷酸酯二氧酶(AAD)轉形之基因轉殖植物。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的方法，其中該芳基氧基烷酸酯二氧酶(AAD)為AAD-12。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該包含芳基氧基烷酸酯部份的除草劑為苯氧基除草劑或苯氧基乙酸除草劑。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該包含芳基氧基烷酸酯部份的除草劑為2,4-D。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中該2,4-D包含2,4-D膽鹼或2,4-D二甲基胺(DMA)。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該處理係以如同2,4-D亦應用以雜草防治的施用率實施至少一次。
  8. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該處理係以如同2,4-D亦應用以雜草防治的施用率實施二次。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中該2,4-D係於具有2,4-D耐受性的大豆之V3及R2生長期施用。
  10. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該處理係以如同2,4-D亦應用以雜草防治的施用率實施至少三次。
  11. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該2,4-D抗性作物係處於壓力下。
  12. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該2,4-D抗性作物亦 使用不同於2,4-D的除草劑進行雜草防治。
  13. 如申請專利範圍第12項所述的方法，其中該不同於2,4-D的除草劑為磷除草劑或芳基氧基苯氧基丙酸除草劑。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的方法，其中該磷除草劑為嘉磷塞(glyphosate)、草丁膦(glufosinate)、其等之衍生物、或其組合。
  15. 如申請專利範圍第13項所述的方法，其中該磷除草劑為銨鹽形式、異丙基銨鹽形式或鉀鹽形式。
  16. 如申請專利範圍第13項所述的方法，其中該芳基氧基苯氧基丙酸除草劑包含比氯禾草靈(chlorazifop)、噁唑禾草靈(fenoxaprop)、吡氟禾草靈(fluazifop)、吡氟氯禾草靈(haloxyfop)、喹禾草靈(quizalofop)、其等之衍生物、或其組合。
  17. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該2,4-D抗性作物係以25g ae/ha至5000g ae/ha 2,4-D處理至少一次。
  18. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該2,4-D抗性作物係以100g ae/ha至2500g ae/ha 2,4-D處理至少一次。
  19. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該包含芳基氧基烷酸酯部份的除草劑經由根吸收達到該2,4-D抗性作物。
  20. 如申請專利範圍第13項所述的方法，其中該磷-除草劑經由根吸收達到該2,4-D抗性作物。
  21. 如申請專利範圍第13項所述的方法，其中該芳基氧基苯氧基丙酸除草劑經由根吸收達到該2,4-D抗性作物。
  22. 如申請專利範圍第2項所述的方法，其中該經芳基氧基烷酸酯二氧酶(AAD)轉形之基因轉殖植物係選自棉花、大豆及油菜。
  23. 一種改良2,4-D抗性作物的產量的方法，包含： (a)以包含編碼芳基氧基烷酸酯二氧酶(AAD)的核苷酸序列的核酸分子轉形植物細胞；(b)選擇經轉形的細胞；(c)自經轉形的細胞再生該植物；以及(d)以刺激量之包含芳基氧基烷酸酯部份的除草劑處理該植物。
  24. 如申請專利範圍第23項所述的方法，其中該芳基氧基烷酸酯二氧酶(AAD)為AAD-12。
  25. 如申請專利範圍第23項所述的方法，其中該核酸分子包含不為芳基氧基烷酸酯二氧酶(AAD)之選擇性標記。
  26. 如申請專利範圍第25項所述的方法，其中該選擇性標記為草丁膦乙烯轉移酶基因(pat)或畢拉草(bialaphos)抗性基因(bar)。
  27. 如申請專利範圍第23項所述的方法，其中核酸分子係經植物最適化。
  28. 一種2,4-D的用途，係用於製造具有2,4-D抗性之轉殖植物相較於其非轉殖親代植物具有增加的產量。
  29. 如申請專利範圍第28項所述的用途，其中該2,4-D係以25g ae/ha至5000g/ha 2,4-D施用至少一次。
  30. 如申請專利範圍第28項所述的用途，其中該2,4-D係以100g ae/ha至2500g ae/ha 2,4-D施用至少一次。
  31. 如申請專利範圍第28項所述的用途，其中2,4-D包含2,4-D膽鹼或2,4-D二甲基胺(DMA)。
  32. 如申請專利範圍第28項所述的用途，其中該2,4-D抗性作物係於開花前以2,4-D處理至少二次。
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