JP6175497B2 - ２，４−ｄ抵抗性作物の収量を改善する方法 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、その開示全体が参照により本明細書に明白に組み込まれている、２０１２年６月７日に出願の米国仮出願第６１／６５６，５４６号の優先権を主張する。
電子提出した試料の参照による組込み
本出願と同時に提出し、以下のように識別されるコンピュータ読取可能な配列表は、その全体が参照により組み込まれている：１１，３４２バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１つ、ファイル名「７２７４７＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、２０１３年５月１３日に作成。
雑草は、作物および他の望ましい植物によって必要とされる貴重な栄養素を土壌から急速に枯渇させることができる。雑草の防除のために現在使用されている多くの種類の除草剤が存在する。人気が非常に高い除草剤の１つはグリホサートである。
グリホサートに対して抵抗性があるトウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、綿、テンサイ、コムギ、芝生、およびコメなどの作物が開発されている。したがって、たとえば、トウモロコシ植物に顕著な被害を与えずに、活発に成長しているグリホサート抵抗性トウモロコシを有する圃場に噴霧して雑草を防除することができる。
１９９０年代半ばの、遺伝子操作したグリホサート耐性作物（ＧＴＣ）の導入に伴って、農業において比類ない、広範囲の広葉およびイネ科雑草を防除するための単純、好都合、柔軟、かつ安価なツールが栽培者に可能となった。その結果、生産者らはＧＴＣを素早く採用し、多くの場合は、輪作、除草剤作用機構回転、タンク混合、機械的雑草防除と化学的および耕種的雑草防除との合体などの、受け入れられている最良の農耕学的実施の多くを放棄した。現在では、グリホサート耐性のダイズ、綿、トウモロコシ、およびキャノーラが米国および西半球の他の箇所において販売されている。さらなるＧＴＣ（たとえば、コムギ、コメ、テンサイ、芝生など）が、世界市場の受け入れを待って導入される態勢にある。多くの他のグリホサート抵抗性の種が実験から開発の段階にある（たとえば、アルファルファ、サトウキビ、ヒマワリ、ビート、エンドウマメ、ニンジン、キュウリ、レタス、タマネギ、イチゴ、トマト、およびタバコ、ポプラおよびモミジバフウなどの森林種、ならびにマリーゴールド、ペチュニア、およびベゴニアなどの園芸種、ウェブサイト「isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm、2005」を参照）。さらに、近年、グリホサートの費用は、少数の慣用の雑草防除プログラムのみが、価格および性能に関してグリホサートＧＴＣシステムと有効に競合することができる程度まで劇的に低下している。
グリホサートは、１５年以上にわたって、全植生管理のために焼畑（burndown）および他の非作物領域において使用が成功している。ＧＴＣと同様、多くの事例において、グリホサートは年に１〜３回、３、５、１０、１５年間まで連続して使用されている。これらの状況はグリホサートおよびＧＴＣ技術に対する過度の依存をもたらしており、グリホサートに対して天然により耐性がある植物、またはグリホサートの除草活性に抵抗する機構を発生した植物に対して、ネイティブ雑草種に重い選択圧を課している。
グリホサートのみの雑草防除プログラムの広範な使用はグリホサート抵抗性雑草の選択をもたらしており、ほとんどの標的種よりもグリホサートに対して本質的に耐性がある雑草種の繁殖が選択されている（すなわち雑草シフト）。（Ngら、2003、Simarmataら、2003、Lorraine-Colwillら、2003、Sfiligoj、2004、Millerら、2003、Heap、2005、Murphyら、2002、Martinら、2002）。グリホサートは１５年以上にわたって世界中で幅広く使用されているが、一握りの雑草のみがグリホサートに対して抵抗性を発生したことが報告されている（Heap、2005）。しかし、これらのほとんどは過去３〜５年間のうちに同定されている。抵抗性雑草には、イネ科および広葉種、ロリウム・リジダム（Lolium rigidum）、ネズミムギ（Lolium multiflorum）、エレウシネ・インディカ（Eleusine indica）、ブタクサ（Ambrosia artemisiifolia）、コニザ・カナデンシス（Conyza canadensis）、コニザ・ボナリエンシス（Conyza bonariensis）、およびヘラオオバコ（Plantago lanceolata）がどちらも含まれる。さらに、ＧＴＣの幅広い使用の前には農耕学的な問題でなかった雑草が、現在ではより蔓延しており、米国の綿およびダイズ面積の８０％超ならびに米国のトウモロコシ面積の２０％超を含むＧＴＣのコンテキストにおいて防除がより困難になりつつある（Gianessi、2005）。これらの雑草シフトは、（排他的ではないが）防除が困難な広葉雑草で主に起こっている。一部の例には、サツマイモ属（Ipomoea）、ヒユ属（Amaranthus）、アカザ属（Chenopodium）、タンポポ属（Taraxacum）、およびツユクサ（Commelina）属の種が含まれる。
栽培者がグリホサート抵抗性雑草または防除がより困難な雑草種へのシフトに直面する地域では、栽培者は、タンク混合または逸した雑草を防除する他の除草剤と交互使用することによって、グリホサートの欠点を補うことができる。多くの事例において広葉の回避を制御するための１つの人気かつ有効なタンク混合パートナーは、２，４−ジクロロ（dicloro）フェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）である。２，４−Ｄは、６０年超にわたって、農耕学および非作物の状況下において、広範囲の広葉雑草防除のために使用されている。より耐性が高い種の個々の事例が報告されているが、２，４−Ｄは依然として、世界中で最も幅広く使用されている除草剤のうちの１つである。２，４−Ｄのさらなる使用に対する制限は、ダイズまたは綿などの双子葉作物におけるその選択性が非常に乏しいことであり、したがって、２，４−Ｄは典型的には感受性の高い双子葉作物に対して（および一般にその付近には）使用しない。さらに、イネ科作物における２，４−Ｄの使用は、起こる可能性がある作物被害の性質によって多少制限される。グリホサートと組み合わせた２，４−Ｄは、無耕農業のダイズおよび綿の植えつけの前により頑強な焼畑処理を提供するために使用されている。しかし、２，４−Ｄに対するこれらの双子葉植物種の感受性が原因で、これらの焼畑処理は植えつけの少なくとも１４〜３０日前に起こらなければならない（Agriliance、2003）。
２，４−Ｄはフェノキシ酸の除草剤クラスに属しており、ＭＣＰＡである。２，４−Ｄは、所望の作物に重度の被害を与えずに広葉雑草の選択的防除を行うために、多くの単子葉作物（トウモロコシ、コムギ、およびコメなど）で使用されている。２，４−Ｄは、正常細胞のホルモン恒常性を調節解除してバランスの取れた制御された成長を妨害するように作用する、合成オーキシン誘導体であるが、正確な作用機構は未だ知られていない。トリクロピルおよびフルロキシピルも、その作用機構が合成オーキシンと同様であるピリジルオキシ酢酸系除草剤である。
これらの除草剤は、特定の植物に対して異なるレベルの選択性を有する（たとえば、双子葉植物はイネ科よりも感受性が高い）。様々な植物によって格差がある代謝が、変動的な選択性レベルの１つの説明である。一般に、植物は２，４−Ｄをゆっくりと代謝するため、２，４−Ｄに対する変動的な植物応答は、標的部位（複数可）での異なる活性によって、よりふさわしく説明され得る（WSSA、2002）。２，４−Ｄの植物代謝は、典型的には二段階の機構、すなわち、典型的にはヒドロキシル化、次いでアミノ酸またはグルコースとのコンジュゲーションを介して起こる（WSSA、2002）。
時間とともに、微生物集団がこの特定の生体異物を分解するための代替かつ効率的な経路を発生し、これは２，４−Ｄの完全なミネラル化をもたらす。除草剤の連続的な施用は除草剤を成長の炭素源として利用することができる微生物を選択し、これらに土壌中における競合的利点が与えられる。そのため、現在配合されている２，４−Ｄは比較的短い土壌半減期を有しており、その後の作物に対する顕著な持ち越し効果には遭遇していない。これにより２，４−Ｄの除草有用性が増加する。
２，４−Ｄを分解するその能力について大規模に研究されている１つの生物はラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）である（Streberら、1987）。ミネラル化経路の最初の酵素ステップをコードしている遺伝子はｔｆｄＡである。米国特許第６，１５３，４０１号およびＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｍ１６７３０を参照されたい。ＴｆｄＡは、α−ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ反応を介した２，４−Ｄ酸からジクロロフェノール（ＤＣＰ）への変換を触媒する（Smejkalら、2001）。ＤＣＰは、２，４−Ｄと比較して除草活性をわずかしか有さない。ＴｆｄＡは、トランスジェニック植物において、通常は２，４−Ｄに対して感受性である双子葉植物（たとえば綿およびタバコ）に２，４−Ｄ抵抗性を与えるために使用されている（Streberら(1989)、Lyonら(1989)、Lyon (1993)、および米国特許第５，６０８，１４７号）。
２，４−Ｄを分解することができるタンパク質をコードしている多数のｔｆｄＡ型遺伝子が環境から同定されており、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに寄託されている。多くの相同体はｔｆｄＡと類似しており（８５％超のアミノ酸同一性）、ｔｆｄＡと類似の酵素特性を有する。しかし、ｔｆｄＡに対して顕著により低い同一性を有するが（２５〜５０％）、それでもα−ケトグルタル酸ジオキシゲナーゼＦｅ＋２ジオキシゲナーゼに関連する特徴的な残基を有する、いくつかの相同体が存在する。したがって、これらの多岐にわたるジオキシゲナーゼの基底にある特異性が何であるかは明白でない。
ｔｆｄＡに対して低い相同性（３１％のアミノ酸同一性）を有するものの１つの独特の例は、デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）からのｓｄｐＡである（Kohlerら、1999、Westendorfら、2002、Westendorfら、2003）。この酵素は、（Ｓ）−ジクロルプロップ（および他の（Ｓ）−フェノキシプロピオン酸）ならびに２，４−Ｄ（フェノキシ酢酸）のミネラル化の最初のステップを触媒することが示されている（Westendorfら、2003）。植物内へのこの遺伝子の形質転換は現在までに報告されていない。
ＧＴＣの有効性、低費用、および利便性が大きな原因となって、新しい除草剤耐性作物（ＨＴＣ）技術の開発の成功が制限されている。その結果、生産者間でＧＴＣの採用率が非常に高くなっている。これにより、新しいＨＴＣ技術を開発するインセンティブがあまり生じなかった。
アリールオキシアルカノエート化学下部構造が、フェノキシ酢酸オーキシン（２，４−Ｄおよびジクロルプロップなど）、ピリジルオキシ酢酸オーキシン（フルロキシピルおよびトリクロピルなど）、アリールオキシフェノキシプロピオン酸（ＡＯＰＰ）アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）阻害剤（ハロキシホップ、キザロホップ、およびジクロホップなど）、ならびに５置換のフェノキシ酢酸プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＩＸ阻害剤（ピラフルフェンおよびフルミクロラックなど）を含めた多くの市販の除草剤の共通部分である。しかし、これらの除草剤クラスはすべて非常に独特であり、現在の文献中には、これらの化学クラス間に共通の分解経路の証拠は存在しない。複数の作用機構に及ぶ、除草剤を分解するための多機能酵素が最近記載されている（ＰＣＴ ＵＳ／２００５／０１４７３７号、２００５年５月２日出願。
本発明は、植物に有害でない施用量の２，４−Ｄで植物を処理することにより、除草剤２，４−Ｄに抵抗性である植物の高さおよび／または作物の収量を改善する方法に関する。より詳細には、２，４−Ｄの施用を使用して、２，４−Ｄ抵抗性のためにＡＡＤ−１２遺伝子を発現する作物の収量を増加させる方法を提供する。本発明はさらに、２，４−Ｄ抵抗性である作物の収量を改善するための、２，４−Ｄの使用に関する。提供する方法は、トウモロコシ、ダイズ、春および冬アブラナ（キャノーラ）、テンサイ、コムギ、ヒマワリ、オオムギ、ならびにコメを含めた作物植物の処理に特に興味深い。
一部の実施形態では、２，４−Ｄ抵抗性作物は、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）で形質転換したトランスジェニック作物である。さらなる実施形態では、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）はＡＡＤ−１またはＡＡＤ−１２である。ＡＡＤ−１は以前にＵＳ２００９／００９３３６６号に開示されており、ＡＡＤ−１２は以前にＷＯ２００７／０５３４８２号に開示されており、その内容全体が参照により組み込まれている。
２，４−Ｄの処理の収量改善効果は、２５ｇ ａｅ／ｈａ〜５０００ｇ／ｈａ、または１００ｇ ａｅ／ｈａ〜２５００ｇ ａｅ／ｈａ、または具体的には１０００ｇ ａｅ／ｈａ〜２０００ｇ ａｅ／ｈａの施用量で観察することができる。一実施形態では、１０００ｇ ａｅ／ｈａ〜１５００ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄを使用する。別の実施形態では、２０００ｇ ａｅ／ｈａ〜２５００ｇ ａｅ／ｈａを使用する。さらに、２，４−Ｄの処理の収量改善効果は、作物が開花する前の２〜８枚葉の段階で２，４−Ｄを施用した場合に特に明白である。しかし、所要の施用量および／または作物の葉段階は、植物、その高さおよび気候条件の関数として変動する。
用語、収量の増加とは、植物収量が５０％以上増えることをいう。一実施形態では、収量の増加は少なくとも１０％である。別の実施形態では、収量の増加は少なくとも２０％である。別の実施形態では、収量の増加は１０％〜６０％である。別の実施形態では、収量の増加は２０％〜５０％である。別の実施形態では、収量の増加は統計的に有意である。２，４−Ｄ抵抗性作物に対する２，４−Ｄの成長増強活性は、圃場試験または鉢試験において測定することができる。異なる作用機構を有する除草剤は、一般に、収量に対して有害作用を有する、または収量に対して効果を有さないかのどちらかであることが知られている。
一態様では、植物を、アリールオキシアルカノエート部分を含む刺激量の除草剤で処理することを含む、２，４−Ｄ抵抗性作物の収量を改善する方法を提供する。
一実施形態では、２，４−Ｄ抵抗性作物は、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）で形質転換したトランスジェニック植物である。さらなる実施形態では、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）はＡＡＤ−１またはＡＡＤ−１２である。別の実施形態では、アリールオキシアルカノエート部分を含む除草剤はフェノキシ除草剤またはフェノキシ酢酸系除草剤である。さらなる実施形態では、アリールオキシアルカノエート部分を含む除草剤は２，４−Ｄである。さらなる実施形態では、２，４−Ｄは２，４−Ｄコリンまたは２，４−Ｄジメチルアミン（ＤＭＡ）を含む。
一実施形態では、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）で形質転換したトランスジェニック植物は、綿、ダイズ、およびキャノーラから選択される。別の実施形態では、処理は、少なくとも１回、雑草防除でも用いられている２，４−Ｄの施用量で行う。別の実施形態では、処理は、２回、雑草防除でも用いられている２，４−Ｄの施用量で行う。さらなる実施形態では、２，４−Ｄは、２，４−Ｄ耐性を有するダイズのＶ３およびＲ２成長段階で施用する。別の実施形態では、処理は、少なくとも３回、雑草防除でも用いられている２，４−Ｄの施用量で行う。別の実施形態では、アリールオキシアルカノエート部分を含む除草剤は経根吸収を介して２，４−Ｄ抵抗性作物に達する。
別の実施形態では、２，４−Ｄ抵抗性作物を、雑草防除のために２，４−Ｄとは異なる除草剤でも処理する。さらなる実施形態では、２，４−Ｄとは異なる除草剤はリン系除草剤またはアリールオキシフェノキシプロピオン酸系除草剤である。さらなる実施形態では、リン系除草剤は、グリホサート、グルホシネート、その誘導体、またはその組合せを含む。さらなる実施形態では、リン系除草剤は、アンモニウム塩、イソプロピルアンモニウム塩、イソプロピルアミン塩、またはカリウム塩の形態である。別の実施形態では、リン系除草剤は経根吸収を介して２，４−Ｄ抵抗性作物に達する。別の実施形態では、アリールオキシフェノキシプロピオン酸系除草剤は、クロラジホップ、フェノキサプロップ、フルアジホップ、ハロキシホップ、キザロホップ、その誘導体、またはその組合せを含む。さらなる実施形態では、アリールオキシフェノキシプロピオン酸系除草剤は経根吸収を介して２，４−Ｄ抵抗性作物に達する。
一実施形態では、２，４−Ｄ抵抗性作物を、少なくとも１回、２５ｇ ａｅ／ｈａ〜５０００ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄで処理する。別の実施形態では、２，４−Ｄ抵抗性作物を、少なくとも１回、１００ｇ ａｅ／ｈａ〜２０００ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄで処理する。別の実施形態では、２，４−Ｄ抵抗性作物を、少なくとも１回、１００ｇ ａｅ／ｈａ〜２５００ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄで処理する。別の実施形態では、２，４−Ｄ抵抗性作物を、少なくとも１回、１０００ｇ ａｅ／ｈａ〜２０００ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄで処理する。さらなる実施形態では、２，４−Ｄは２，４−Ｄコリンまたは２，４−Ｄジメチルアミン（ＤＭＡ）を含む。
一実施形態では、２，４−Ｄ抵抗性作物の収量を改善する方法を提供する。この方法は、
（ａ）植物細胞を、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子で形質転換することと、
（ｂ）形質転換細胞を選択することと、
（ｃ）植物を形質転換細胞から再生することと、
（ｄ）植物を、アリールオキシアルカノエート部分を含む刺激量の除草剤で処理することと
を含む。
一実施形態では、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）はＡＡＤ−１またはＡＡＤ−１２である。別の実施形態では、核酸分子は、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）ではない選択可能マーカーを含む。さらなる実施形態または代替実施形態では、選択可能マーカーは、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｔ）またはビアラホス抵抗性遺伝子（ｂａｒ）である。別の実施形態では、核酸分子は植物に最適化されている。
別の態様では、その非トランスジェニック親植物と比較して収量が増加した、２，４−Ｄ抵抗性を有するトランスジェニック植物の製造における、アリールオキシアルカノエート部分を含む除草剤の使用を提供する。一実施形態では、アリールオキシアルカノエート部分を含む除草剤は２，４−Ｄである。さらなる実施形態では、２，４−Ｄを、少なくとも１回、２５ｇ ａｅ／ｈａ〜５０００ｇ／ｈａの２，４−Ｄで施用する。別の実施形態では、２，４−Ｄを、少なくとも１回、１００ｇ ａｅ／ｈａ〜２０００ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄで施用する。別の実施形態では、２，４−Ｄを、少なくとも１回、１００ｇ ａｅ／ｈａ〜２５００ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄで施用する。別の実施形態では、２，４−Ｄを、少なくとも１回、１０００ｇ ａｅ／ｈａ〜２０００ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄで施用する。さらなる実施形態では、２，４−Ｄは２，４−Ｄコリンまたは２，４−Ｄジメチルアミン（ＤＭＡ）を含む。さらなる実施形態では、２，４−Ｄ抵抗性作物を開花前に少なくとも２回、２，４−Ｄで処理する。別の実施形態では、２，４−Ｄ抵抗性作物は、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）で形質転換したトランスジェニック植物である。さらなる実施形態では、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）はＡＡＤ−１またはＡＡＤ−１２である。
本発明のＡＡＤ−１２酵素によって触媒される一般化学反応を例示する図である。 プラスミドｐＤＡＢ４４６８の代表的なマップを示す図である。 プラスミドｐＤＡＳ１７４０の代表的なマップを示す図である。
配列の簡単な説明
配列番号１は、デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）からのＡＡＤ−１２のヌクレオチド配列である。
配列番号２は、配列番号１によってコードされている翻訳されたタンパク質の配列である。
配列番号３は、ＡＡＤ−１２の植物に最適化されたヌクレオチド配列である（ｖ１）。
配列番号４は、配列番号３によってコードされている翻訳されたタンパク質の配列である。
配列番号５は、ＡＡＤ−１２の大腸菌（E. coli）に最適化されたヌクレオチド配列である（ｖ２）。
配列番号６は、Ｍ１３順方向プライマーの配列である。
配列番号７は、Ｍ１３逆方向プライマーの配列である。
配列番号８は、順方向ＡＡＤ−１２（ｖ１）ＰＴＵプライマーの配列である。
配列番号９は、逆方向ＡＡＤ−１２（ｖ１）ＰＴＵプライマーの配列である。
配列番号１０は、順方向ＡＡＤ−１２（ｖ１）をコードしているＰＣＲプライマーの配列である。
配列番号１１は、逆方向ＡＡＤ−１２（ｖ１）をコードしているＰＣＲプライマーの配列である。
配列番号１２は、「ｓｄｐａｃｏｄＦ」ＡＡＤ−１２（ｖ１）プライマーの配列を示す。
配列番号１３は、「ｓｄｐａｃｏｄＲ」ＡＡＤ−１２（ｖ１）プライマーの配列を示す。
配列番号１４は、「ＢｒａｄｙのＮｃｏ１」プライマーの配列を示す。
配列番号１５は、「ＢｒａｄｙのＳａｃ１」プライマーの配列を示す。
発明の詳細な説明
本明細書中で使用する語句「形質転換した」または「形質転換」とは、細胞内へのＤＮＡの導入をいう。語句「形質転換体」または「トランスジェニック」とは、形質転換した、または形質転換手順を受けた植物細胞、植物などをいう。通常、導入されたＤＮＡは、挿入されたＤＮＡ片を含有するベクターの形態である。
本明細書中で使用する語句「選択可能マーカー」または「選択可能マーカー遺伝子」とは、たとえば、植物細胞を選択剤から保護する、または選択剤に対する抵抗性／耐性を提供するために、植物の形質転換において任意選択で使用される遺伝子をいう。機能的選択可能マーカーを受けた細胞または植物のみが、選択剤を有する条件下で分裂または成長することができる。選択剤の例には、たとえば、スペクチノマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン、およびハイグロマイシンを含めた抗生物質を含むことができる。これらの選択可能マーカーには、抗生物質カナマイシンに対する抵抗性を与える酵素を発現するネオマイシンホスホトランスフェラーゼの遺伝子（ｎｐｔ ＩＩ）、ならびに関連抗生物質であるネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン、およびＧ４１８用の遺伝子、またはハイグロマイシンに対する抵抗性を与える酵素を発現するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼの遺伝子（ｈｐｔ）が含まれる。他の選択可能マーカー遺伝子には、Ｂａｒ（ＢＡＳＴＡ（登録商標）（グルホシネートアンモニウム）、またはフォスフィノスリシン（ＰＰＴ）に対する抵抗性）、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ、分枝鎖アミノ酸の合成の最初のステップを妨げる、スルホニル尿素（ＳＵ）、イミダゾリノン（ＩＭＩ）、トリアゾロピリミジン（ＴＰ）、ピリミジニルオキシ安息香酸（ＰＯＢ）、およびスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンなどの阻害剤に対する抵抗性）、グリホサート、２，４−Ｄ、ならびに金属抵抗性または感受性を含めた、除草剤抵抗性をコードしている遺伝子が含まれ得る。語句「マーカー陽性」とは、選択可能マーカー遺伝子を含むように形質転換した植物をいう。
形質転換した植物、または形質転換体の同定および選択を可能にするために、様々な選択可能または検出可能マーカーを選ばれた発現ベクター内に取り込ませることができる。たとえば、ＤＮＡシーケンシングおよびＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、サザンブロッティング、ＲＮＡブロッティング、ベクターから発現されたタンパク質、たとえば、フォスフィノスリシン抵抗性を媒介する沈殿タンパク質、またはレポーター遺伝子であるβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼなどの他のタンパク質を検出するための免疫学的方法を含めて、形質転換した植物中での選択マーカーの発現を確認するために多くの方法が利用可能である（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれているSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Press、N.Y.、2001を参照）。
選択可能マーカー遺伝子は、形質転換細胞または組織を選択するために利用される。選択可能マーカー遺伝子には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードしているものなどの、抗生物質抵抗性をコードしている遺伝子、ならびに除草性化合物に対する抵抗性を与える遺伝子が含まれる。除草剤抵抗性遺伝子は、一般に、除草剤に対して非感受性である改変標的タンパク質、または植物中の除草剤が作用できる前にそれを分解もしくは解毒する酵素をコードしている。DeBlockら(1987) EMBO J.、6:2513-2518、DeBlockら(1989) Plant Physiol.、91:691-704、Frommら(1990) 8:833-839、Gordon-Kammら(1990) 2:603-618を参照）。たとえば、グリホサートまたはスルホニル尿素除草剤に対する抵抗性は、突然変異標的酵素、５−エノールピルビルシキミ酸−３リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）およびアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）をコードしている遺伝子を使用することによって得られる。グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、および２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）に対する抵抗性は、それぞれの除草剤を解毒するフォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、ニトリラーゼ、または２，４−ジクロロフェノキシ酢酸モノオキシゲナーゼをコードしている細菌遺伝子を使用することによって得られる。２，４−Ｄ抵抗性のための酵素／遺伝子は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれているＵＳ２００９／００９３３６６号およびＷＯ２００７／０５３４８２号に以前に開示されている。
イミダゾリノンまたはスルホニル尿素を含めた他の除草剤は成長点または分裂組織を阻害することができる。この分類中の例示的な遺伝子は、たとえばそれぞれLeeら、EMBO J. 7:1241 (1988)およびMikiら、Theon. Appl. Genet. 80:449 (1990)によって記載されているように、突然変異ＡＬＳおよびＡＨＡＳ酵素をコードしている。
グリホサート抵抗性遺伝子には、突然変異５−エノールピルビルシキミ酸−３リン酸合成酵素（ＥＰＳＰｓ）遺伝子（組換え核酸の導入および／またはネイティブＥＰＳＰｓ遺伝子の様々な形態のｉｎ ｖｉｖｏ突然変異誘発を介する）、ａｒｏＡ遺伝子、ならびにグリホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子のそれぞれが含まれる）。他のホスホノ化合物の抵抗性遺伝子には、グルホシネート（ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）およびストレプトマイセス・ビリジクロモゲネス（Streptomyces viridichromogenes）を含めたストレプトマイセス属（Streptomyces）の種からのフォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子）、ならびにピリジンオキシまたはフェノキシプロプリオン（proprionic）酸およびシクロヘクソン（ＡＣＣａｓｅ阻害剤をコードしている遺伝子）が含まれ、たとえば、植物に対してグリホサートに対する抵抗性を与えることができるＥＰＳＰｓの形態のヌクレオチド配列を開示している、Ｓｈａｈらの米国特許第４，９４０，８３５号およびＢａｒｒｙらの米国特許第６，２４８，８７６号を参照されたい。突然変異ａｒｏＡ遺伝子をコードしているＤＮＡ分子はＡＴＣＣ受託番号３９２５６の下で得ることができ、突然変異遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｌ−フォスフィノスリシンなどの除草剤に対する抵抗性を与えるグルタミン合成酵素遺伝子のヌクレオチド配列を開示している、Ｃｏｍａｉの米国特許第４，７６９，０６１号、Ｋｕｍａｄａらの欧州特許出願第０ ３３３ ０３３号、およびＧｏｏｄｍａｎらの米国特許第４，９７５，３７４号に開示されている。ＰＡＴ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｌｅｅｍａｎｓらの欧州特許出願第０ ２４２ ２４６号に提供されている。また、DeGreefら、Bio/Technology 7:61 (1989)は、ＰＡＴ活性をコードしているキメラｂａｒ遺伝子を発現するトランスジェニック植物の生成を記載している。セトキシジムおよびハロキシホップを含めたフェノキシプロプリオン（proprionic）酸およびシクロヘクソンに対する抵抗性を与える遺伝子の例は、Marshallら、Theon. Appl. Genet. 83:435 (1992)によって記載されているＡｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２およびＡｃｃ１−Ｓ３遺伝子である。グリホサート抵抗性を与えることができるＧＡＴ遺伝子は、ＣａｓｔｌｅらのＷＯ２００５０１２５１５号に記載されている。２，４−Ｄ、ｆｏｐおよびピリジルオキシオーキシン除草剤に対する抵抗性を与える遺伝子は、ＷＯ２００５１０７４３７号および米国特許出願第１１／５８７，８９３号に記載されている。
トリアジン（ｐｓｂＡおよび１ｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）を含めた他の除草剤は光合成を阻害することができる。Przibilaら、Plant Cell 3:169 (1991)は、突然変異ｐｓｂＡ遺伝子をコードしているプラスミドを用いた、クラミドモナス属（Chlamydomonas）の形質転換を記載している。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列はＳｔａｌｋｅｒの米国特許第４，８１０，６４８号に開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子はＡＴＣＣ受託番号５３４３５、６７４４１、および６７４４２の下で利用可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードしているＤＮＡのクローニングおよび発現はHayesら、Biochem. J. 285:173 (1992)によって記載されている。
本発明の目的のために、選択可能マーカー遺伝子には、それだけには限定されないが、以下をコードしている遺伝子が含まれる：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（Fraleyら(1986) CRC Critical Reviews in Plant Science、4:1-25）、シアナミド加水酵素（Maier-Greinerら(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88:4250-4264）、アスパラギン酸キナーゼ、ジヒドロジピコリン酸合成酵素（Perlら(1993) Bio/Technology、11:715-718）、トリプトファン脱炭酸酵素（Goddijnら(1993) Plant Mol. Bio.、22:907-912）、ジヒドロジピコリン酸合成酵素および脱感作アスパルテード（aspartade）キナーゼ（Perlら(1993) Bio/Technology、11:715-718）、ｂａｒ遺伝子（Tokiら(1992) Plant Physiol.、100:1503-1507およびMeagherら(1996) and Crop Sci.、36:1367）、トリプトファン脱炭酸酵素（Goddijnら(1993) Plant Mol. Biol.、22:907-912）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ）（Southernら(1982) J. Mol. Appl. Gen.、1:327、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴまたはＨＹＧ）（Shimizuら(1986) Mol. Cell Biol.、6:1074）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）（Kwokら(1986) PNAS USA 4552）、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（DeBlockら(1987) EMBO J.、6:2513）、２，２−ジクロロプロピオン酸脱ハロゲン酵素（Buchanan-Wollatronら(1989) J. Cell. Biochem. 13D:330）、アセトヒドロキシ酸合成酵素（Andersonら、米国特許第４，７６１，３７３号、Haughnら(1988) Mol. Gen. Genet. 221:266）、５−エノールピルビル−シキミ酸−リン酸合成酵素（ａｒｏＡ）（Comaiら(1985) Nature 317:741）、ハロアリールニトリラーゼ（Stalkerら、公開ＰＣＴ出願ＷＯ８７／０４１８１号）、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（Parkerら(1990) Plant Physiol. 92:1220）、ジヒドロプテロイン酸合成酵素（ｓｕｌ Ｉ）（Guerineauら(1990) Plant Mol. Biol. 15:127）、ならびに３２ｋＤ光化学系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ）（Hirschbergら(1983) Science、222:1346）。
また、クロラムフェニコール（Herrera-Estrellaら(1983) EMBO J.、2:987-992）、メトトレキサート（Herrera-Estrellaら(1983) Nature、303:209-213、Meijerら(1991) Plant Mol Bio.、16:807-820 (1991)、ハイグロマイシン（Waldronら(1985) Plant Mol. Biol.、5:103-108、Zhijianら(1995) Plant Science、108:219-227およびMeijerら(1991) Plant Mol. Bio. 16:807-820）、ストレプトマイシン（Jonesら(1987) Mol. Gen. Genet.、210:86-91）、スペクチノマイシン（Bretagne-Sagnardら(1996) Transgenic Res.、5:131-137）、ブレオマイシン（Hilleら(1986) Plant Mol. Biol.、7:171-176）、スルホンアミド（Guerineauら(1990) Plant Mol. Bio.、15:127-136）、ブロモキシニル（Stalkerら(1988) Science、242:419-423）、２，４−Ｄ（Streberら(1989) Bio/Technology、7:811-816）、グリホサート（Shawら(1986) Science、233:478-481）、ならびにフォスフィノスリシン（DeBlockら(1987) EMBO J.、6:2513-2518）に対する抵抗性をコードしている遺伝子も含まれる。別段に記述しない限りは、本開示中に引用されているすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
選択可能マーカーおよびレポーター遺伝子の上記リストは限定することを意図しない。任意のレポーターまたは選択可能マーカー遺伝子が本発明によって包含されている。必要な場合は、そのような遺伝子は当分野で知られている方法によって配列決定することができる。
レポーターおよび選択可能マーカー遺伝子は、植物中での最適な発現のために合成される。すなわち、遺伝子のコード配列は、植物中での発現を増強させるために改変されている。合成マーカー遺伝子は、植物中にてより高いレベルで発現され、その結果より高い形質転換効率をもたらすように設計されている。遺伝子の合成最適化の方法は当分野で利用可能である。実際、いくつかの遺伝子が、植物中での遺伝子産物の発現を増加させるために最適化されている。
マーカー遺伝子配列は、特定の植物種中での発現のために最適化することができる、または植物ファミリー中での最適な発現のために改変することができる。植物の好ましいコドンは、特定の目的植物種において最も大量に発現されるタンパク質中の最も高頻度のコドンから決定し得る。たとえば、参照により本明細書に組み込まれている、ＥＰＡ０３５９４７２号、ＥＰＡ０３８５９６２号、ＷＯ９１／１６４３２号、Perlakら(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88:3324-3328、およびMurrayら(1989) Nucleic Acids Research、17:477-498、米国特許第５，３８０，８３１号、および米国特許第５，４３６，３９１号を参照されたい。このようにして、ヌクレオチド配列を任意の植物中での発現のために最適化することができる。遺伝子配列の全体または任意の一部が最適化されている、または合成であってよいことを理解されたい。すなわち、完全に最適化されたまたは部分的に最適化された配列も使用し得る。
さらに、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）媒介性の形質転換系を利用したいくつかの形質転換戦略が開発されている。たとえば、バイナリーベクター戦略は２つのプラスミドの系に基づいており、Ｔ−ＤＮＡはＴｉプラスミドの残りとは異なるプラスミド中にある。同時組込み戦略では、Ｔ−ＤＮＡのほんの一部分を外来遺伝子と同じベクター内に配置し、続いてこのベクターがＴｉプラスミドと組み換えられる。
本明細書中で使用する語句「植物」には双子葉植物および単子葉植物が含まれる。双子葉植物の例には、タバコ、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、ダイズ、トマト、パパイヤ、キャノーラ、ヒマワリ、綿、アルファルファ、ジャガイモ、ブドウ、キマメ、エンドウマメ、アブラナ属（Brassica）、ヒヨコマメ、テンサイ、ナタネ、スイカ、メロン、コショウ、ピーナッツ、パンプキン、ダイコン、ホウレンソウ、カボチャ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、キュウリ、ナス、およびレタスが含まれる。単子葉植物の例には、トウモロコシ、コメ、コムギ、サトウキビ、オオムギ、ライムギ、モロコシ、ラン、タケ、バナナ、ガマ、ユリ、カラスムギ、タマネギ、キビ、およびライコムギが含まれる。
２，４−Ｄ抵抗性遺伝子および続く抵抗性作物の対象開発は、作物内施用のための、広葉のグリホサート抵抗性の（または高耐性かつシフトした）雑草種を防除するための優れた選択肢を提供する。２，４−Ｄは、広範囲、比較的安価、かつ頑強な広葉除草剤であり、双子葉植物および単子葉作物において同様により高い作物耐性を提供することができれば、栽培者に優れた有用性が提供される。また、２，４−Ｄ耐性トランスジェニック双子葉作物は、施用のタイミングおよび量においてより高い柔軟性も有する。２，４−Ｄの対象除草剤耐性形質さらなる有用性は、通常は感受性である作物に対する、２，４−Ｄドリフト、揮発、逆転（または他のオフサイト移動現象）、誤施用、破壊行為などからの被害を防止するその有用性である。ＡＡＤ−１２遺伝子のさらなる利点は、現在までに特徴づけられているすべてのｔｆｄＡ相同体とは異なり、ＡＡＤ−１２は、アキラルフェノキシオーキシン（たとえば、２，４−Ｄ、ＭＣＰＡ、４−クロロフェノキシ酢酸）に加えてピリジルオキシ酢酸系オーキシン（たとえば、トリクロピル、フルオロキシピル）を分解できることである。表１を参照されたい。対象ＡＡＤ−１２酵素によって触媒される化学反応の一般的な例示を図１中に示す。（Ｏ２の付加は立体特異的であり、中間体からフェノールおよびグリオキシル酸への分解は自発性である）。図１中の化学構造は分子主鎖を例示しており、様々なＲ基など（表１中に示すものなど）が含まれていても、必ずしも図１中に具体的に例示されていないことを理解されたい。様々なフェノキシオーキシンの組合せの複数の混合物が、様々な地域において具体的な雑草範囲および環境条件に対処するために世界中で使用されている。植物中でのＡＡＤ−１２遺伝子の使用は、はるかにより広範囲のオーキシン除草剤に対する保護を提供し、それにより、防除することができる雑草の柔軟性および範囲が増加する。
単一遺伝子（ＡＡＤ−１２）が現在では同定されており、これは、植物中での発現のために遺伝子操作した場合に、先天的な耐性が一度も存在したことがない、またはこれらの除草剤の使用を許容するには十分に高くなかった植物において、フェノキシオーキシン除草剤の使用を可能にする特性を有する。さらに、ＡＡＤ−１２は、天然の耐性が選択性を許容するには十分でなかった植物体において、ピリジルオキシ酢酸系除草剤に対する保護も提供することができ、これらの除草剤の潜在的な有用性が拡大している。現在では、ＡＡＤ−１２を単独で含有する植物を、順次、または１つ、２つ、もしくはいくつかのフェノキシオーキシン除草剤の組合せと混合したタンクで処理し得る。それぞれのフェノキシオーキシン除草剤の量は、広範囲の双子葉植物雑草を防除するために、２５〜４０００ｇ ａｅ／ｈａ、より典型的には１００〜２０００ｇ ａｅ／ｈａの範囲であり得る。同様に、１つ、２つ、またはいくつかのピリジルオキシ酢酸オーキシン化合物の混合物を、ＡＡＤ−１２を発現する植物に施用してよく、前記除草剤からの損傷の危険性は低下している。それぞれのピリジルオキシ酢酸系除草剤の量は、さらなる双子葉植物雑草を防除するために、２５〜２０００ｇ ａｅ／ｈａ、より典型的には３５〜８４０ｇ ａｅ／ｈａの範囲であり得る。
グリホサートは、非常に広範囲の広葉およびイネ科雑草種を防除するため、大規模に使用されている。しかし、ＧＴＣおよび非作物施用におけるグリホサートの反復使用は、天然により耐性がある種またはグリホサート抵抗性の生物型への雑草シフトを選択し、また選択し続ける。同じ種の防除を提供するが異なる作用機構を有する、有効な量で使用するタンク混合除草剤パートナーが、抵抗性雑草の出現を遅延させるための方法としてほとんどの除草剤抵抗管理戦略によって処方されている。ＡＡＤ−１２をグリホサート耐性形質（および／または他の除草剤耐性形質）とスタッキングすることは、グリホサート、フェノキシオーキシン（たとえば２，４−Ｄ）およびピリジルオキシ酢酸系オーキシン除草剤（たとえばトリクロピル）の使用を、選択的に同じ作物中で可能にすることによって、ＧＴＣにおけるグリホサート抵抗性の双子葉植物雑草種の防除を許容するための機構を提供できる可能性がある。これらの除草剤の施用は、異なる作用機構の２つ以上の除草剤を含むタンク混合物中で同時であることができる、植えつけ前、出芽前、もしくは出芽後としての順次施用および約２時間から約３カ月の分割施用タイミングにおける単一の除草剤組成物の個々の施用であることができる、または、それぞれの化学クラスを表す任意の数の除草剤の任意の組合せを作物の植えつけの約７カ月から作物の収穫まで（もしくは個々の除草剤の収穫前間隔、いずれか短い方）の任意のタイミングで施用することができる。
施用のタイミング、個々の除草剤の量、および困難なまたは抵抗性の雑草を防除する能力に関して、広範囲のイネ科および広葉雑草の防除において柔軟性を有することが重要である。グリホサート抵抗性遺伝子／ＡＡＤ−１２のスタッキングを有する作物におけるグリホサートの施用は、約２５０〜２５００ｇ ａｅ／ｈａの範囲であることができ、フェノキシオーキシン除草剤（１つまたは複数）は約２５〜４０００ｇ ａｅ／ｈａで施用することができ、ピリジルオキシ酢酸系オーキシン除草剤（１つまたは複数）は２５〜２０００ｇ ａｅ／ｈａで施用することができる。これらの施用の最適な組合せ（複数可）およびタイミングは、具体的な状況、種、および環境に依存し、本開示の利点をもって、雑草防除分野の技術者によって最善に決定される。
小植物は、典型的には成長サイクル全体にわたって抵抗性である。形質転換した植物は、典型的には、遺伝子が発現される任意の時点で、新しい除草剤施用に対して抵抗性となる。ここでは、これまで試験された構成的プロモーター（主にＣｓＶＭＶおよびＡｔＵｂｉ １０）を使用して、生活環全体にわたって２，４−Ｄに対する耐性が示される。このことは典型的に予想されるが、これは、たとえば、耐性が抵抗性の作用機構の部位での低下した発現によって顕著な影響を受ける場合がある他の非代謝活性の際には改善である。一例はＲｏｕｎｄｕｐ Ｒｅａｄｙの綿であり、初期に噴霧した場合は、植物は耐性であったが、噴霧が遅すぎた場合は、グリホサートは分裂組織中に濃縮された（代謝されず移動されるため）。使用したウイルスプロモーターＭｏｎｓａｎｔｏは花中では良好に発現されない。本発明はこれらに関する改善を提供する。
除草剤配合物（たとえば、エステル、酸、もしくは塩配合物、または可溶性濃縮物、乳剤濃縮物、もしくは可溶性液体）およびタンク混合添加剤（たとえば、アジュバント、界面活性剤、ドリフト遅延剤、または適合化剤）は、所定の除草剤または１つもしくは複数の除草剤の組合せからの雑草防除に顕著な影響を与える場合がある。これらと前述の除草剤化学のうちのいずれかとの任意の組合せが本発明の範囲内にある。
また、当業者には、防除される雑草の範囲および／または天然により耐性があるもしくは抵抗性の雑草種の防除を増加させるために、２つ以上の作用機構を組み合わせることの利点が見える。このことは、ヒトの関与（トランスジェニックまたは非トランスジェニックのどちらか）によって、ＧＴＣを越えて作物において除草剤耐性を可能とした化学まで拡大することもできる。実際、グリホサート抵抗性（たとえば、抵抗性植物または細菌ＥＰＳＰＳ、グリホサート酸化還元酵素（ＧＯＸ）、ＧＡＴ）、グルホシネート抵抗性（たとえば、Ｐａｔ、ｂａｒ）、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）阻害性除草剤抵抗性（たとえば、イミダゾリノン、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド、ピルミジニル（pyrmidinyl）チオベンゾエート、および他の化合物＝ＡＨＡＳ、Ｃｓｒ１、ＳｕｒＡなど）、ブロモキシニル抵抗性（たとえばＢｘｎ）、ＨＰＰＤ（４−ヒドロキシル（hydroxl）フェニル−ピルビン酸ジオキシゲナーゼ）酵素の阻害剤に対する抵抗性、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）の阻害剤に対する抵抗性、光化学系ＩＩ阻害性除草剤（たとえばｐｓｂＡ）に対する抵抗性、光化学系Ｉ阻害性除草剤に対する抵抗性、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＩＸ（ＰＰＯ）阻害性除草剤（たとえばＰＰＯ−１）に対する抵抗性、フェニル尿素除草剤（たとえばＣＹＰ７６Ｂ１）に対する抵抗性、ジカンバ分解酵素（たとえばＵＳ２００３０１３５８７９号を参照）などをコードしている形質を、単独または複数の組合せでスタッキングして、雑草シフトを有効に防除もしくは防止する能力および／または前述のクラスの任意の除草剤に対する抵抗性をもたらすことができる。Ｉｎ ｖｉｖｏで改変したＥＰＳＰＳならびにクラスＩ、クラスＩＩ、およびクラスＩＩＩグリホサート抵抗性遺伝子を一部の好ましい実施形態で使用することができる。
追加の除草剤に関して、一部の追加の好ましいＡＬＳ阻害剤には、それだけには限定されないが、スルホニル尿素（クロルスルフロン、ハロスルフロン、ニコスルフロン、スルホメツロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロンなど）、イミダゾロニノン（イマザモックス、イマゼタピル、イマザキンなど）、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド（クロランスラムメチル、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、メトスラム、およびペノキススラムなど）、ピリミジニルチオベンゾエート（ビスピリバックおよびピリチオバックなど）、ならびにフルカルバゾンが含まれる。一部の好ましいＨＰＰＤ阻害剤には、それだけには限定されないが、メソトリオン、イソキサフルトール、およびスルコトリオンが含まれる。一部の好ましいＰＰＯ阻害剤には、それだけには限定されないが、フルミクロラック、フルミオキサジン、フルフェンピル、ピラフルフェン、フルチアセト、ブタフェナシル、カルフェントラゾン、スルフェントラゾン、ならびにジフェニルエーテル（アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、およびオキシフルオルフェンなど）が含まれる。
さらに、ＡＡＤ−１２単独、または１つもしくは複数の追加のＨＴＣ形質とスタッキングしたＡＡＤ−１２は、１つまたは複数の追加の入力（たとえば、昆虫抵抗性、真菌抵抗性、もしくはストレス耐性など）または出力（たとえば、増加した収量、改善された油プロフィール、改善された繊維品質など）の形質とスタッキングすることができる。したがって、本発明を使用して、柔軟かつ高い対費用効果で任意の数の農耕学的な悪疫を防除する能力を有する、改善された作物品質の完全な農耕学的パッケージを提供することができる。
本発明は、部分的に、２，４−Ｄを分解することができるだけでなく、驚くべきことに、たとえば本発明の酵素を以前に知られているｔｆｄＡタンパク質から識別する新規特性も保有する酵素の同定に関する。この酵素はｔｆｄＡに対して非常に低い相同性を有するが、それでも本発明の遺伝子を同じα−ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼの全体的ファミリーに一般的に分類することができる。このタンパク質ファミリーは、活性部位を含む「ＨＸ（Ｄ／Ｅ）Ｘ２３−２６（Ｔ／Ｓ）Ｘ１１４−１８３ＨＸ１０−１３Ｒ」モチーフ中の３つの保存的なヒスチジン残基によって特徴づけられている。ヒスチジンは触媒活性に必須の活性部位中のＦｅ＋２イオンを配位する（Hoganら、2000）。本明細書中に記述した予備ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現実験は、新規属性の選択を助けるように仕立てられている。また、これらの実験は、ＡＡＤ−１２酵素が、以前に出願された特許出願（２００５年５月２日出願のＰＣＴ ＵＳ／２００５／０１４７３７号）中に開示されている、同じクラスの別の本質的に異なる酵素と比べ独特である。その出願のＡＡＤ−１酵素は、対象ＡＡＤ−１２タンパク質と約２５％の配列同一性しか共有しない。
より詳細には、本発明は、部分的に、２，４−Ｄだけでなく、ピリジルオキシ酢酸系除草剤も分解することができる酵素の使用に関する。現在までに、異なる化学クラスおよび作用様式の除草剤を分解する能力を有することが報告されているα−ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ酵素は存在しない。本発明に従って使用するための好ましい酵素および遺伝子は、本明細書中でＡＡＤ−１２（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ）遺伝子およびタンパク質と呼ぶ。
対象タンパク質は、分析アッセイにおいて２，４−Ｄから２，４−ジクロロフェノール（「ＤＣＰ」、除草性が不活性）への変換について陽性の試験結果となった。本発明の部分精製タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ２，４−ＤをＤＣＰへと迅速に変換することができる。ＡＡＤ−１２で形質転換した植物が提供するさらなる利点は、親除草剤（複数可）が不活性型へと代謝され、それにより、穀粒または飼い葉中に除草剤残留物が収穫される潜在性が低下することである
また、本発明には、ピリジルオキシ酢酸系除草剤および／またはフェノキシオーキシン除草剤を、ＡＡＤ−１２遺伝子を含む植物に施用することを含む、雑草を防除する方法も含まれる。
これらの発見に鑑みて、この種の酵素をコードしているポリヌクレオチドを含む新規植物が現在提供されている。これまでは、そのような植物を生成する動機は存在せず、そのような植物がこの酵素を有効に産生して、植物にフェノキシ酸除草剤（２，４−Ｄなど）だけでなくピリジルオキシ酢酸系除草剤に対する抵抗性を与えることができるという予想は存在しなかった。したがって、本発明は、これまでは当分野において可能であると考えられなかった多くの利点を提供する。
公的に利用可能な株（ＡＴＣＣまたはＤＳＭＺなどの培養物コレクションに寄託されている）を獲得し、本明細書中に開示した技法を使用して、新規遺伝子についてスクリーニングすることができる。本発明によるさらなるスクリーニングおよび試験のために、本明細書中に開示した配列を使用して、相同的な遺伝子を増幅して組換え発現系内にクローニングすることができる。
背景技術のセクション中で上述したように、２，４−Ｄを分解するその能力について大規模に研究されている１つの生物はラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）である（Streberら、1987）。分解経路内の最初の酵素をコードしている遺伝子はｔｆｄＡである。米国特許第６，１５３，４０１号およびＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｍ１６７３０を参照されたい。ＴｆｄＡは、α−ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ反応を介した２，４−Ｄ酸から除草性が不活性のＤＣＰへの変換を触媒する（Smejkalら、2001）。ＴｆｄＡは、トランスジェニック植物において、通常は２，４−Ｄに対して感受性である双子葉植物（たとえば綿およびタバコ）に２，４−Ｄ抵抗性を与えるために使用されている（Streberら、1989、Lyonら、1989、Lyonら、1993）。２，４−Ｄを分解することができるタンパク質をコードしている多数のｔｆｄＡ型遺伝子が環境から同定されており、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに寄託されている。多くの相同体はｔｆｄＡと非常に類似しており（８５％超のアミノ酸同一性）、ｔｆｄＡと類似の酵素特性を有する。しかし、ｔｆｄＡに対して低レベルの相同性を有するα−ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ相同体の小さなコレクションが現在同定されている。
本発明は、部分的に、ｔｆｄＡに対して低い相同性を有する（３１％のアミノ酸同一性）、デルフチア・アシジボランス（Delftia acidivorans）からの遠縁の酵素ｓｄｐＡ（Westendorfら、2002、2003）の新規使用および機能の驚くべき発見に関する。そのネイティブ形態で精製されたこのα−ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ酵素は、２，４−ＤおよびＳ−ジクロルプロップを分解することが以前に示されている（Westendorfら、2002および2003）。しかし、現在までに、ピリジルオキシ酢酸系化学クラスの除草剤を分解する能力を有することが報告されているα−ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ酵素は存在しない。ＳｄｐＡは植物中で発現されたことが一度もなく、また、ＧＴＣの有効性、低費用、および利便性が大きな原因となって、新しいＨＴＣ技術の開発が制限されていることが部分的に原因で、それを行う動機もまったく存在しなかった（Devine、2005）。
新規活性に鑑みて、本発明のタンパク質および遺伝子を、本明細書中でＡＡＤ−１２タンパク質および遺伝子と呼ぶ。ＡＡＤ−１２は、様々なフェノキシ酢酸オーキシン除草剤をｉｎ ｖｉｔｒｏで分解することが現在確認されている。しかし、この酵素は、本明細書中で初めて報告されるように、驚くべきことに、アリールオキシアルカノエート分子のクラスのさらなる基質も分解できることが判明した。顕著な農耕学的重要性の基質にはピリジルオキシ酢酸オーキシン除草剤が含まれる。この高度に新規な発見は、顕著な除草剤耐性作物（ＨＴＣ）および選択可能マーカー形質の好機の基となっている。この酵素は、除草剤分解活性を広範囲の様々な広葉除草剤（フェノキシ酢酸およびピリジルオキシ酢酸オーキシン）に送達するその能力が独特である。
したがって、本発明は、部分的に、組換えによって発現させたアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ酵素（ＡＡＤ−１２）による、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、他のフェノキシ酢酸系オーキシン除草剤、およびピリジルオキシ酢酸系除草剤の分解に関する。また、本発明は、部分的に、フェノキシおよび／またはピリジルオキシオーキシン除草剤を分解することができるアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ分解酵素をコードしている遺伝子（ＡＡＤ−１２）の同定および使用にも関する。
対象酵素はトランスジェニック発現を可能にして、ほぼすべての広葉雑草を防除する除草剤の組合せに対する耐性をもたらす。ＡＡＤ−１２は、たとえば、他のＨＴＣ形質［たとえば、グリホサート抵抗性、グルホシネート抵抗性、ＡＬＳ阻害剤（たとえば、イミダゾリノン、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド）抵抗性、ブロモキシニル抵抗性、ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性、ＰＰＯ阻害剤抵抗など］、および昆虫抵抗形質（Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ３４／４５、他のＢｔタンパク質、または非桿菌起源の殺昆虫タンパク質など）とスタッキングするための優れた除草剤耐性作物（ＨＴＣ）形質として役割を果たすことができる。さらに、ＡＡＤ−１２は、第２の遺伝子または遺伝子群で遺伝子操作した植物の一次形質転換体の選択を助けるための選択可能マーカーとして役割を果たすことができる。
さらに、対象微生物遺伝子は、タンパク質が、単子葉植物および双子葉植物の両方（ヘミコット（hemicot））での使用頻度にも偏りを有するコドンによってコードされているように再設計されている。シロイヌナズナ（Arabidopsis）、トウモロコシ、タバコ、綿、ダイズ、キャノーラ、およびコメがＡＡＤ−１２含有構築物で形質転換されており、フェノキシおよびピリジルオキシオーキシン除草剤のどちらに対しても高レベルの抵抗性を実証している。したがって、また、本発明は、本発明のタンパク質をコードしている「植物に最適化された」遺伝子にも関する。
オキシアルカノエート基は、安定な酸官能基を除草剤内に導入するために有用である。酸性基は、除草剤作用の望ましい属性であり、したがって移動性目的のために新規除草剤内に取り込ませることができる「酸トラッピング」によって、師部移動性を与えることができる。また、本発明の態様はＨＴＣを作成する機構も提供する。ＡＡＤ−１２の基質として役割を果たすことができる多くの潜在的な市販および実験用の除草剤が存在する。したがって、対象遺伝子の使用は、これら他の除草剤に対する除草剤耐性ももたらす場合がある。
本発明のＨＴＣ形質は、他のＨＴＣ形質（それだけには限定されないがグリホサート耐性が含まれる）との新規組合せで使用することができる。これらの形質の組合せは、除草剤（たとえばグリホサート）に対する新しく獲得された抵抗性または先天的な耐性により、雑草（など）の種を防除するための新規方法を生じる。したがって、ＨＴＣ形質に加えて、その除草剤耐性がトランスジェニック作物中で前記酵素によって作成された、除草剤を使用した雑草を防除する新規方法が、本発明の範囲内にある。
本発明は、たとえば、ダイズにおける現在のグリホサート抵抗形質とスタッキングした２，４−Ｄ抵抗形質を商業化するコンテキストにおいて応用することができる。したがって、本発明は、栽培者による、様々な作物の雑草防除のためのグリホサートに対する非常に高い依存から達する、広葉雑草種シフトおよび／または除草剤抵抗性広葉雑草の選択と闘うためのツールを提供する。
対象ＡＡＤ−１２遺伝子のトランスジェニック発現は、たとえば、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、タバコ、ダイズ、綿、コメ、トウモロコシおよびキャノーラに例示される。ダイズが本発明による形質転換に好ましい作物である。しかし、本発明は複数の他の単子葉植物（牧草または芝生など）およびアルファルファ、クローバー、樹種などの双子葉作物で利用することができる。同様に、２，４−Ｄ（または他のＡＡＤ−１２−基質）を、耐性が中等度であるイネ科作物により積極的に使用することができ、この形質による増加した耐性は、作物被害の危険性なしにこれらの除草剤をより有効な量かつより広い施用タイミングにわたって使用する好機を栽培者に提供する。
さらに、本発明は、広葉雑草を防除する除草剤に対する抵抗性を提供することができる単一遺伝子を提供する。広範囲の除草剤組合せの使用を可能にするために、この遺伝子を複数の作物で利用し得る。また、本発明は、現在の化学薬品に抵抗性である雑草を防除することもでき、また、現在の農耕学的実施から生じている、シフトする雑草範囲の防除を助ける。また、対象ＡＡＤ−１２は、さらなる除草剤基質を非除草性形態へと有効に解毒する試みにおいても使用することができる。したがって、本発明は、さらなるＨＴＣ形質および／または選択可能マーカー技術の開発を提供する。
ＨＴＣを生じるために対象遺伝子を使用することとは別に、またはそれに加えて、対象遺伝子は、細胞培養物、温室、および圃場における形質転換体の選択を成功させるための選択可能マーカーとしても使用することができる。生命工学プロジェクトでは、対象遺伝子の単に選択可能マーカーとしての高い固有の価値が存在する。他のアリールオキシアルカノエートオーキシン系除草剤におけるＡＡＤ−１２の乱交雑は、この遺伝子をＨＴＣおよび／または選択可能マーカー目的に利用する多くの好機を提供する。
動詞「耐性がある」または形容詞「耐性（tolerant）」を使用せずに用語「抵抗性（resistance）」を議論することは容易ではない。この業界では、除草剤耐性作物（ＨＴＣ）対除草剤抵抗性作物（ＨＲＣ）を論議するために無数の時間がかけられてきた。ＨＴＣがこの業界において好ましい用語である。しかし、米国雑草学学会（Weed Science Society of America）の抵抗性の正式な定義は、「野生型に対して通常は致死的である用量の除草剤への曝露後に生存および繁殖する、植物の遺伝性の能力。植物において、抵抗性は、天然に存在し得る、あるいは遺伝子操作または組織培養もしくは突然変異誘発によって生じた変異体の選択などの技法によって誘導され得る」。別段に指定しない限りは、本明細書中で使用する除草剤「抵抗性」とは、本開示の出願時点での除草剤ハンドブック（The Herbicide Handbook）の現行版によって示唆されるように、遺伝性であり、所定の植物の除草剤による典型的な有効な除草性の処理の存在下で植物が成長および繁殖することを許容する。当業者によって理解されるように、除草性曝露からのある程度の植物損傷が明らかであっても、それでも植物は「抵抗性」であるとみなされ得る。本明細書中で使用する用語「耐性」は用語「抵抗性」よりも広義であり、本明細書中に定義した「抵抗性」、および同じ遺伝子型の野生型植物において同じ除草性用量で典型的にはもたらされる、様々な度合の除草剤に誘導される損傷に耐える、特定の植物の改善された能力が含まれる。
植物または細菌系への機能的活性の伝達は、ベクターが滞在する宿主に適切なタンパク質発現ベクター内に組み込ませた、本発明のタンパク質のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含むことができる。機能的活性を有するタンパク質をコードしている核酸配列を得るための１つの方法は、本明細書中に開示したように、タンパク質のアミノ酸配列から推定された情報を使用して、ネイティブ遺伝物質を、目的タンパク質を産生する細菌種から単離することである。ネイティブ配列は、たとえば以下にさらに詳細に記述するように、植物中での発現のために最適化することができる。また、最適化されたポリヌクレオチドはタンパク質配列に基づいて設計することもできる。
本発明に従って使用するためのタンパク質を得る方法がいくつか存在する。たとえば、本明細書中に開示したタンパク質に対する抗体を使用して、他のタンパク質をタンパク質の混合物から同定および単離することができる。具体的には、抗体を、他の関連タンパク質と比較して最も保存的または最も明白に異なるタンパク質の一部分に対して産生し得る。その後、これらの抗体を使用して、特徴的な活性を有する等価タンパク質を免疫沈降、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、または免疫ブロッティングによって具体的に同定することができる。本明細書中に開示したタンパク質もしくは等価タンパク質、またはこれらのタンパク質の断片に対する抗体は、標準の手順を使用して容易に調製することができる。そのような抗体は本発明の一態様である。本発明の抗体には、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、好ましくは例示または示唆したタンパク質に応答して産生されたものが含まれる。
当業者には、本発明のタンパク質（および遺伝子）を様々な供給源から得ることができることが容易に理解される。除草剤分解オペロンの全体がプラスミドなどの転位因子上にコードされている、および遺伝子組み込みされていることが知られているため、本発明のタンパク質は、たとえば組換えおよび／または野生型細菌を含めた様々な微生物から得ることができる。
細菌単離体の突然変異体は当分野で周知の手順によって作製することができる。たとえば、胞子無形性突然変異体は、単離体のエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）突然変異誘発によって得ることができる。また、突然変異株は、紫外光およびニトロソグアニジンを使用して、当分野で周知の手順によって作製することもできる。
本明細書中で言及または示唆した対象単離体のうちのいずれか「からの」または「から得ることができる」タンパク質とは、タンパク質（または同様のタンパク質）を、単離体または別の細菌株もしくは植物などの何らかの他の供給源から得ることができることを意味する。また、「に由来する」もこの暗示的意味を有しており、たとえば植物中での発現のために改変されている所定の種類の細菌から得ることができるタンパク質が含まれる。当業者には、細菌遺伝子およびタンパク質の開示が与えられた際、植物を操作してタンパク質を産生することができることが容易に理解される。本明細書中に開示したポリヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を使用して抗体調製物、核酸プローブ（たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡ）などを調製し、他の（天然）供給源から他の関連遺伝子をスクリーニングおよび回収するために使用することができる。
標準の分子生物学的技法を使用して、本明細書中に記載のタンパク質および遺伝子をクローニングおよび配列決定し得る。さらなる情報は、参照により本明細書に組み込まれているSambrookら、1989中に見つけ得る。
ポリヌクレオチドおよびプローブ：本発明はさらに、本発明に従って使用するためのタンパク質をコードしている核酸配列を提供する。本発明はさらに、所望の除草活性を有するタンパク質をコードしている遺伝子を同定および特徴づける方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ＰＣＲ技法用のハイブリダイゼーションプローブおよび／またはプライマーとして有用である独特なヌクレオチド配列を提供する。プライマーは、目的の具体的な遺伝子の同定、特徴づけ、および／または単離に使用することができる、特徴的な遺伝子断片を生成する。本発明のヌクレオチド配列は、以前に記載されているタンパク質とは明白に異なるタンパク質をコードしている。
本発明のポリヌクレオチドを使用して、所望の宿主細胞中でタンパク質またはペプチドをコードするための完全「遺伝子」を形成することができる。たとえば、当業者には容易に理解されるように、対象ポリヌクレオチドを、当分野で容易に知られているように、目的宿主中でプロモーターの制御下に適切に置くことができる。遺伝子発現および時間的／組織特異的発現のレベルは本発明の有用性に大きく影響を与える場合がある。一般に、分解遺伝子のタンパク質発現がより高いレベルであれば、基質（この場合は標的除草剤）のより素早く完全な分解がもたらされる。高い発現が植物の健康に結果的な負の影響を与えない限りは、標的遺伝子を高レベルで発現させるためにプロモーターが所望される。典型的には、すべての成長段階において植物を完全に保護するために、すべての組織中でＡＡＤ−１２遺伝子が構成的に発現されることが望まれる。しかし、その代わりに植物発現させた抵抗性遺伝子を使用することができる。このことは、雑草防除のために標的除草剤を作物内で使用し、続いて、開花段階中の施用によって標的作物の有性生殖の制御を行うことを可能にする。さらに、発現の所望のレベルおよび時期は、植物の種類および所望する耐性のレベルにも依存する場合がある。一部の好ましい実施形態では、発現レベルを増加させ、耐性を所望のレベルまで増強させるために、転写エンハンサーと組み合わせた強力な構成的プロモーターなどを使用する。一部のそのような応用は、実施例セクションの前に以下により詳細に記述されている。
当業者には知られているように、ＤＮＡは典型的には二本鎖形態で存在する。この配置では、一方の鎖は他方の鎖に相補的であり、逆もそうである。ＤＮＡが植物（たとえば）中で複製されることに伴って、ＤＮＡのさらなる相補鎖が生成される。「コード鎖」は、当分野において、しばしば、アンチセンス鎖と結合する鎖をいうために使用される。ｍＲＮＡはＤＮＡの「アンチセンス」鎖から転写される。「センス」または「コード」鎖は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として読み取られて目的のタンパク質またはペプチドを形成することができる、一連のコドン（コドンとは、３個の残基の単位として読み取られて特定のアミノ酸を指定することができる、３個のヌクレオチドである）を有する。タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで生成するためには、典型的にはＤＮＡの鎖がｍＲＮＡの相補鎖へと転写され、これがタンパク質の鋳型として使用される。したがって、本発明には、相補鎖を含めた、添付の配列表および／または均等物中に示す例示したポリヌクレオチドの使用が含まれる。例示したＤＮＡ分子と機能的に等価であるＲＮＡおよびＰＮＡ（ペプチド核酸）が本発明に含まれる。
本発明に従って使用するためのタンパク質および遺伝子は、たとえばオリゴヌクレオチドプローブを使用して同定および入手することができる。これらのプローブは、適切な標識によって検出可能な検出可能なヌクレオチド配列であるか、国際出願ＷＯ９３／１６０９４号に記載のように本質的に蛍光であるようにし得る。プローブ（および本発明のポリヌクレオチド）はＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡであり得る。アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ、ＲＮＡ分子用）に加えて、本発明の合成プローブ（およびポリヌクレオチド）は、イノシン（４つすべての塩基と対合することができる中性塩基であり、合成プローブ中で４つすべての塩基の混合物の代わりに使用される場合がある）および／または他の合成（非天然）塩基も有することができる。したがって、本明細書中で合成の縮重オリゴヌクレオチドに言及し、「Ｎ」または「ｎ」を一般的に使用する場合、「Ｎ」または「ｎ」はＧ、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはイノシンであることができる。本明細書中で使用するコードのあいまい性は、本出願の出願時での標準のＩＵＰＡＣ命名法に準拠している（たとえば、ＲはＡまたはＧを意味し、ＹはＣまたはＴを意味するなど）。
当分野で周知のように、プローブ分子が核酸試料とハイブリダイズする場合、プローブおよび試料は実質的な相同性／類似度／同一性を有することが合理的に仮定される。好ましくは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションが最初に実施され、次いで、たとえばKeller, G. H.、M. M. Manak (1987) DNA Probes、Stockton Press、New York、N.Y.、169〜170ページに記載の当分野で周知の技法による低、中等度、または高いストリンジェンシー条件下での洗浄を実施する。たとえば、その中に記述されているように、低ストリンジェンシー条件は、２×ＳＳＣ（標準クエン酸添加生理食塩水）／０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を用いて１５分間、室温で最初に洗浄することによって達成することができる。典型的には２回の洗浄が行われる。その後、塩濃度を下げるおよび／または温度を上げることによって、高ストリンジェンシーを達成することができる。たとえば、上述の洗浄に次いで、０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳを用いて、それぞれ１５分間、室温で２回洗浄し、続いて、０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳを用いてそれぞれ３０分間、５５℃で洗浄することができる。これらの温度は、本明細書中に記載のもの、および当業者に知られている他のハイブリダイゼーションおよび洗浄プロトコルと共に使用することができる（たとえば、塩としてＳＳＣの代わりにＳＳＰＥを使用することができる）。２×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳは、５０ｍｌの２０×ＳＳＣおよび５ｍｌの１０％のＳＤＳを４４５ｍｌの水に加えることによって調製することができる。２０×ＳＳＣは、ＮａＣｌ（１７５．３ｇ／０．１５０Ｍ）、クエン酸ナトリウム（８８．２ｇ／０．０１５Ｍ）、および水を合わせ、１０ＮのＮａＯＨでｐＨを７．０に調節し、その後、体積を１リットルに調節することによって調製することができる。１０％のＳＤＳは、１０ｇのＳＤＳを５０ｍｌのオートクレーブ水に溶かし、その後、１００ｍｌまで希釈することによって調製することができる。
プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが維持されたかどうかを既知の様式で決定するための手段を提供する。そのようなプローブ分析は、本発明の遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明によるプローブとして使用するヌクレオチドセグメントは、ＤＮＡ合成器および標準の手順を使用して合成することができる。また、これらのヌクレオチド配列は、本発明の遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーとしても使用することができる。
分子のハイブリダイゼーション特徴を使用して本発明のポリヌクレオチドを定義することができる。したがって、本発明には、本明細書中に例示したポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド（および／またはその補体、好ましくはその完全補体）が含まれる。すなわち、遺伝子（およびそれがコードしているタンパク質）を定義するための一方法は、たとえば、既知または具体的に例示した遺伝子とハイブリダイズする（本明細書中に具体的に開示した条件のうちの任意の条件下で）その能力によるものである。
本明細書中で使用するハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」条件とは、本出願人らによって用いられた条件と同じ、またはほぼ同じ度合のハイブリダイゼーションの特異性を達成する条件をいう。具体的には、３２Ｐで標識した遺伝子に特異的なプローブを用いたサザンブロット上の固定ＤＮＡのハイブリダイゼーションを、標準の方法によって行うことができる（たとえばManiatisら、1982を参照）。一般に、ハイブリダイゼーションおよび続く洗浄は、標的配列の検出を可能にする条件下で実施することができる。二本鎖ＤＮＡ遺伝子プローブには、ハイブリダイゼーションは、終夜、ＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の２０〜２５℃低い温度で、６×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．１％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌの変性ＤＮＡ中で実施することができる。
洗浄は、典型的には以下のように実施することができる：（１）２回、室温で１５分間、１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ中（低ストリンジェンシーの洗浄）、および（２）１回、Ｔｍ−２０℃で１５分間、０．２×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ中（中等度ストリンジェンシーの洗浄）。
オリゴヌクレオチドプローブでは、ハイブリダイゼーションは、終夜、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の１０〜２０℃低い温度で、６×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．１％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌの変性ＤＮＡ中で実施することができる。
洗浄は、典型的には以下のように実施することができる：（１）２回、室温で１５分間、１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ（低ストリンジェンシーの洗浄）、（２）１回、ハイブリダイゼーション温度で１５分間、１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ中（中等度ストリンジェンシーの洗浄）。
一般に、塩および／または温度を変更してストリンジェンシーを変化させることができる。長さが約７０個の塩基より長い標識ＤＮＡ断片では、以下の条件を使用することができる：（１）低：１もしくは２×ＳＳＰＥ、室温、（２）低：１もしくは２×ＳＳＰＥ、４２℃、（３）中等度：０．２×もしくは１×ＳＳＰＥ、６５℃、または（４）高：０．１×ＳＳＰＥ、６５℃。
二重鎖の形成および安定性はハイブリッドの２本の鎖間の実質的な相補性に依存し、上述のように、特定の度合のミスマッチは耐容される。したがって、本発明のプローブ配列には、突然変異（単一および複数の両方）、記載した配列の欠失、挿入、ならびにその組合せが含まれ、前記突然変異、挿入および欠失は、目的の標的ポリヌクレオチドとの安定なハイブリッドの形成を許容する。多くの方法で所定のポリヌクレオチド配列中に突然変異、挿入、および欠失を生じさせることができ、これらの方法は当業者に知られている。他の方法も将来知られることとなり得る。
ＰＣＲ技術：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸配列の反復性の、酵素的な、プライミングされた合成である。この手順は周知であり、当分野の技術者によって一般的に使用されている（Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号、Saikiら、1985を参照）。ＰＣＲは、標的配列の逆の鎖とハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドプライマーに隣接された、目的ＤＮＡ断片の酵素増幅に基づく。プライマーは、好ましくは、３’末端が互いの方を指しているように配向されている。鋳型の熱変性、プライマーとその相補配列とのアニーリング、およびアニーリングしたプライマーのＤＮＡポリメラーゼを用いた伸長の反復サイクルが、ＰＣＲプライマーの５’末端によって定義されるセグメントの増幅をもたらす。それぞれのプライマーの伸長産物が他のプライマーの鋳型として役割を果たすことができるため、各サイクルにおいて、その前のサイクルで生成されたＤＮＡ断片の量が本質的に２倍となる。これにより、数時間以内で数百万倍までの、特異的標的断片の指数関数的な蓄積がもたらされる。好熱細菌サーマス・アクアチクス（Thermus aquaticus）から単離したＴａｇポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、増幅プロセスを完全に自動にすることができる。使用することができる他の酵素が当業者に知られている。
例示したＤＮＡ配列またはそのセグメントは、ＰＣＲ増幅のプライマーとして使用することができる。ＰＣＲ増幅を行うにあたって、プライマーと鋳型との間で特定の度合のミスマッチは耐容することができる。したがって、例示したプライマーの突然変異、欠失、および挿入（特に５’末端へのヌクレオチドの付加）は本発明の範囲内にある。突然変異、挿入、および欠失は、当業者に知られている方法によって、所定のプライマー中に生成することができる。
遺伝子およびタンパク質の修飾：対象遺伝子およびタンパク質を他の遺伝子およびタンパク質と融合させて、キメラまたは融合タンパク質を生成することができる。本発明に従って有用な遺伝子およびタンパク質には、具体的に例示した完全長配列だけでなく、これらの配列、変異体、突然変異体、キメラ、ならびにその融合体の一部分、セグメントならびに／または断片（連続断片や完全長分子と比較した内部および／または末端欠失が含まれる）も含まれる。本発明のタンパク質は、所望の機能的活性を保持している限りは、置換されたアミノ酸を有することができる。「変異」遺伝子は、例示したタンパク質と同じタンパク質、または等価もしくは同様の活性を有する等価タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を有する。
ネイティブａａｄ−１２ヌクレオチド配列を用いたＢＬＡＳＴ検索の上位２件の結果は、１２０塩基対の配列にわたって合理的なレベルの相同性（約８５％）を示す。特定の条件下でのハイブリダイゼーションには、これら２つの配列が含まれることが予想される。ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＤＱ４０６８１８．１（８９３２９７４２、ロドフェラックス属（Rhodoferax））およびＡＪ６２８８６０１．１（４４９０３４５１、スフィンゴモナス属（Sphingomonas））を参照されたい。ロドフェラックス属（Rhodoferax）はデルフチア属（Delftia）に非常に似ているが、スフィンゴモナス属（Sphingomonas）は系統学的に完全に異なるクラスである。
用語「変異タンパク質」および「等価タンパク質」とは、標的基質および等価配列に対して、例示したタンパク質と同じまたは本質的に同じ生物学的／機能的活性を有するタンパク質をいう。本明細書中で使用する「等価」配列への言及は、活性を改善する、または顕著な程度まで有害な影響を与えない、アミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入を有する配列をいう。また、活性を保持する断片もこの定義に含まれる。例示したタンパク質の対応する断片と同じまたは同様の機能または活性を保持する断片および他の等価物は本発明の範囲内にある。アミノ酸の置換または付加などの変化は、タンパク質のプロテアーゼ安定性を増加（または減少）させるため（タンパク質の機能的活性を相当に／実質的に減少させずに）、制限部位を除去または付加するためなどの、様々な目的のために行うことができる。遺伝子の変種は、たとえば点突然変異を作製するための標準の技法を使用して容易に構築し得る。
さらに、たとえば米国特許第５，６０５，７９３号は、ランダムまたは集中断片化の後のＤＮＡ再構築を使用することによってさらなる分子多様性を生じさせる方法を記載している。これは遺伝子「シャフリング」と呼ぶことができ、典型的には、２つ以上の異なるＤＮＡ分子の断片（所望の大きさのもの）を混合し、次いで反復回数の再生を行うことを含む。これにより、開始遺伝子によってコードされているタンパク質の活性を改善することができる。その結果は、改善された活性、変更された基質特異性、増加した酵素安定性、変更された立体特異性、または他の特徴を有するキメラタンパク質である。
「シャフリング」は、目的タンパク質の原子３Ｄ（三次元）座標および結晶構造を得て検査した後に、設計および標的とすることができる。したがって、「集中シャフリング」は、好ましくは、タンパク質の折り畳みおよび必須の３Ｄ構造的完全性に関与している内部セグメントではなく、表面に曝露されるセグメントなどの、修飾に理想的なタンパク質の特定のセグメントに向けることができる。
酵素の「活性部位」への具体的な変化は、活性または立体特異性に関する固有の機能に影響を与えるために行うことができる。Mullerら(2006). The known tauD crystal structure was used as a model dioxygenase to determine active site residues while bound to its inherent substrate taurine.、Elkinsら(2002) 「X-ray crystal structure of Escerichia coli taurine/alpha-ketoglutarate dioxygenase complexed to ferrous iron and substrates」、Biochemistry 41(16):5185-5192。酵素活性部位の配列の最適化および設計可能性に関しては、Chakrabartiら、PNAS、(2005年8月23日)、102(34):12035-12040を参照されたい。
完全長遺伝子の断片は、市販のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを使用して、標準の手順に従って作製することができる。たとえば、Ｂａｌ３１などの酵素または部位特異的突然変異誘発を使用して、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを系統的に切り離すことができる。また、活性断片をコードしている遺伝子は、様々な制限酵素を使用して得てもよい。プロテアーゼを使用してこれらのタンパク質の活性断片を直接得てもよい。
タンパク質を切断しても、依然として機能的活性を保持できることは、本明細書中に開示した本発明の範囲内にある。「切断タンパク質」とは、タンパク質の一部分を切り離しても、残りの切断タンパク質が切断後に所望の活性を保持し、示し得ることを意味する。切断は様々なプロテアーゼによって達成することができる。さらに、有効に切断されたタンパク質は、前記タンパク質をコードしているＤＮＡ塩基を、制限エンドヌクレアーゼを用いた消化または当業者が利用可能な他の技法のいずれかによって除去する、分子生物学的技法を使用して生成することができる。切断後、前記タンパク質を大腸菌（E. coli）、バキュロウイルス、植物に基づくウイルス系、酵母などの異種系中で発現させ、その後、本明細書中に開示した昆虫アッセイ内に配置して活性を決定することができる。全長の完全長配列未満を有する一方で機能的活性を保持するように切断タンパク質を生成することが成功していることは、当分野で周知である。たとえば、Ｂ．ｔ．タンパク質を切断（コアタンパク質）形態で使用することができる（たとえば、Hofteら(1989)、およびAdangら(1985)を参照）。本明細書中で使用する用語「タンパク質」には、機能的に活性のある切断片を含めることができる。
別段に指定しない限りは、本明細書中で使用する２つの核酸のパーセント配列同一性および／または類似度は、KarlinおよびAltschul 1993に記載のように改変したKarlinおよびAltschul、1990のアルゴリズムを使用して決定する。そのようなアルゴリズムは、Altschulら、1990のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行う。ギャップ付ＢＬＡＳＴはAltschulら、1997に記載のように使用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用する。ＮＣＢＩ／ＮＩＨウェブサイトを参照されたい。比較目的のためにギャップ付アラインメントを得るためには、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ ８（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．、米国メリーランド州Ｎｏｒｔｈ Ｂｅｔｈｅｓｄａ）のＡｌｉｇｎＸ機能を、初期設定パラメータを用いて使用した。これらは、ギャップ開きペナルティが１５、ギャップ伸長ペナルティが６．６６、およびギャップ分離ペナルティ範囲が８であった。
また、タンパク質の様々な特性および三次元特長を、タンパク質の活性／機能性に有害な影響を与えずに変化させることもできる。保存的アミノ酸置換を耐容することができる／分子の活性および／または三次元立体配置に有害な影響を与えないように行うことができる。アミノ酸は以下のクラスに位置づけることができる：非極性、非荷電極性、塩基性、および酸性。１つのクラスのアミノ酸を同じ種類の別のアミノ酸で置き換える保存的置換は、置換が化合物の生物活性に有害でない限りは、本発明の範囲内にある。表１は各クラスに属するアミノ酸の例のリストを提供する。一部の例では、非保存的置換を行うこともできる。しかし、好ましい置換はタンパク質の機能活性／生物活性を顕著に損なわせない。
本明細書中で使用する「単離」ポリヌクレオチドおよび／または「精製」タンパク質への言及は、それらが自然では共に見つかる他の分子と会合していない場合の、これらの分子をいう。したがって、「単離した」および／または「精製した」への言及は、本明細書中に記載の「人の手」の関与を意味する。たとえば、発現のために植物内に入れられた本発明の細菌「遺伝子」は「単離ポリヌクレオチド」である。同様に、細菌タンパク質に由来し、植物によって産生されるタンパク質は「単離タンパク質」である。
遺伝暗号の縮重／冗長が原因で、様々な異なるＤＮＡ配列が本明細書中に開示したアミノ酸配列をコードすることができる。同じまたは本質的に同じタンパク質をコードしている代替ＤＮＡ配列を作製することは、当分野の技術者の技術範囲内に十分ある。これらの変異ＤＮＡ配列は本発明の範囲内にある。このことは、以下の表題「植物中で発現させるための配列の最適化」のセクション中でもより詳細に記述されている。
植物中で発現させるための配列の最適化：植物中で異種遺伝子の高い発現を得るためには、遺伝子を、植物細胞（の細胞質）中でより効率的に発現されるように操作することが一般に好ましい。トウモロコシが、前記植物中でのその発現レベルを増加させるために、形質転換の前に異種遺伝子（複数可）を再設計することが好ましい場合があり得るそのような植物の１つである。したがって、細菌タンパク質をコードしている遺伝子の設計における追加のステップは、双子葉植物であるか単子葉植物種であるかにかかわらず、標的植物配列により密に合わせられたコドンの偏りを使用して、最適な発現のために異種遺伝子を再操作することである。また、配列を、本明細書中の他の箇所で記述したより具体的な種類の植物のうちのいずれかの中での発現のために最適化することもできる。
トランスジェニック宿主：本発明のタンパク質をコードしている遺伝子は、様々な微生物または植物宿主内に導入することができる。本発明にはトランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物が含まれる。好ましい植物（および植物細胞）は、トウモロコシ、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、タバコ、ダイズ、綿、キャノーラ、コメ、コムギ、芝生、マメ科植物飼料（たとえばアルファルファおよびクローバー）、牧草などである。また、果実、野菜、観賞植物、および樹などの、他の種類のトランスジェニック植物も本発明に従って作製することができる。より一般には、双子葉植物および／または単子葉植物を本発明の様々な態様で使用することができる。
好ましい実施形態では、遺伝子の発現は、直接または間接的に、目的タンパク質（複数可）の細胞内産生（および維持）をもたらす。このような様式で植物に除草剤抵抗性を与えることができる。そのような宿主は、トランスジェニック、組換え、形質転換した、および／または形質移入した宿主および／または細胞と呼ぶことができる。本発明の一部の態様では（たとえば目的遺伝子をクローニングおよび調製する場合）、本開示の利点をもって、標準の技法に従って、微生物（好ましくは細菌）細胞を生成して使用することができる。
本発明のポリヌクレオチドで形質移入した植物細胞を全植物へと再生させることができる。本発明には、組織細胞培養物、液体培養物、および平板培養物を含めた細胞培養物が含まれる。また、本発明の植物によって生産された、および／またはそれを作製するために使用した種子も本発明の範囲内に含まれる。また、他の植物組織および部分も本発明に含まれる。同様に、本発明には、本発明のポリヌクレオチドを含む植物または細胞を生成する方法が含まれる。そのような植物を生成する好ましい一方法は、本発明の種子を植えつけることによる。
植物が好ましい場合があるが、本発明には、たとえば蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）（Ｐｆ）宿主株中での高活性の組換えＡＡＤ−１２の産生も含まれる。本発明には、この宿主中で可溶性の活性ＡＡＤ−１２を維持するための好ましい成長温度、ＡＡＤ−１２が全細胞タンパク質の４０％より高くとして、または少なくとも１０ｇ／Ｌ産生される発酵条件、Ｐｆ宿主からの活性組換えＡＡＤ−１２の高い回収率をもたらす精製プロセス、細胞１ｋｇあたり少なくとも１０ｇの活性ＡＡＤ−１２を生じる精製スキーム、細胞１ｋｇあたり２０ｇの活性ＡＡＤ−１２を生じることができる精製スキーム、ＡＡＤ−１２活性を溶液中で保管および再保管することができる配合プロセス、ならびに長期貯蔵および貯蔵寿命のためにＡＡＤ−１２活性を保持することができる凍結乾燥プロセスが含まれる。
トランスジェニック宿主を形成するための遺伝子の挿入：本発明の一態様は、本発明のタンパク質を発現する本発明のポリヌクレオチドを用いた、植物、植物細胞、および他の宿主細胞の形質転換／形質移入である。このようにして形質転換した植物には、様々な作用機構を有する様々な除草剤に対する抵抗性を与えることができる。
遺伝子の安定した維持および発現を可能にする条件下で、所望のタンパク質をコードしている遺伝子を標的宿主内に導入するために、様々な方法が利用可能である。これらの方法は当業者に周知であり、たとえば米国特許第５，１３５，８６７号に記載されている。
ＡＡＤ−１２ポリヌクレオチドを含むベクターが本発明の範囲内に含まれる。たとえば、大腸菌（E. coli）中の複製系および形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含む多数のクローニングベクターが、高等植物内への外来遺伝子の挿入を調製するために利用可能である。ベクターは、たとえば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ ｍｐシリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４などを含む。したがって、タンパク質をコードしている配列をベクター内の適切な制限部位に挿入することができる。生じるプラスミドを大腸菌（E. coli）内への形質転換に使用する。大腸菌（E. coli）細胞を適切な栄養素培地中で培養し、その後、収穫および溶解する。プラスミドは、ゲノムＤＮＡから精製して取り出すことによって回収する。配列解析、制限分析、電気泳動、および他の生化学的−分子生物学的方法が分析方法として一般に実施される。各操作の後、使用したＤＮＡ配列を制限消化し、次のＤＮＡ配列と結合させることができる。それぞれのプラスミド配列を同じまたは別のプラスミド中にクローニングすることができる。所望の遺伝子を植物内に挿入する方法に応じて、他のＤＮＡ配列が必要となり得る。たとえば、ＴｉまたはＲｉプラスミドを植物細胞の形質転換に使用する場合は、ＴｉまたはＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右側の境界（多くの場合は左右の境界）を、挿入する遺伝子のフランキング領域として結合させる必要がある。植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡの使用は集中的に研究されており、ＥＰ１２０ ５１６号、Hoekema (1985)、Fraleyら(1986)、およびAnら(1985)に記載されている。
多数の技法が、ＤＮＡを植物宿主細胞内に挿入するために利用可能である。これらの技法には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）もしくはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を形質転換剤として使用したＴ−ＤＮＡを用いた形質転換、融合、注入、微粒子銃（微粒子照射）、炭化ケイ素髭結晶、エアロゾルビーム、ＰＥＧ、または電気穿孔、および他の可能な方法が含まれる。アグロバクテリウム属（Agrobacterium）を形質転換に使用する場合、挿入するＤＮＡを特殊なプラスミド内、すなわち中間ベクター内またはバイナリーベクター内のどちらかにクローニングしなければならない。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ中の配列に相同的な配列のおかげで、相同組換えによってＴｉまたはＲｉプラスミド内に組み込まれることができる。また、ＴｉまたはＲｉプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡの転移に必要なｖｉｒ領域も含む。中間ベクターはアグロバクテリウム属（Agrobacterium）中で自身を複製することができない。中間ベクターは、ヘルパープラスミド（コンジュゲーション）によってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）内に転移されることができる。バイナリーベクターは大腸菌（E. coli）およびアグロバクテリウム属（Agrobacterium）のどちら中でも自身を複製することができる。これらは、Ｔ−ＤＮＡの左右の境界領域によって囲まれた選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含む。これらはアグロバクテリウム属（Agrobacterium）内に直接形質転換することができる（Holsters、1978）。宿主細胞として使用されるアグロバクテリウム属（Agrobacterium）はｖｉｒ領域を保有するプラスミドを含むべきである。ｖｉｒ領域は、植物細胞内へのＴ−ＤＮＡの転移に必要である。さらなるＴ−ＤＮＡが含有され得る。このように形質転換した細菌を植物細胞の形質転換に使用する。ＤＮＡを植物細胞内に転移させるために、植物外植片をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）と共に有利に培養することができる。その後、全植物を、感染した植物材料（たとえば、葉片、茎のセグメント、根であるが、プロトプラストまたは懸濁培養した細胞も）から、選択のための抗生物質または殺生物剤を含有し得る適切な培地中で再生することができる。その後、このようにして得られた植物を、挿入されたＤＮＡの存在について試験することができる。注入および電気穿孔の場合はプラスミドに特別な要求は行われない。たとえばｐＵＣ誘導体などの通常のプラスミドを使用することが可能である。
形質転換細胞は、通常の様式にて植物内で成長する。これらは、生殖細胞を形成し、形質転換した形質（複数可）を子孫植物へと伝達することができる。そのような植物は、通常の様式にて成長させ、同じ形質転換した遺伝性要因または他の遺伝性要因を有する植物と交雑させることができる。生じるハイブリッド個体は対応する表現型特性を有する。本発明の一部の好ましい実施形態では、細菌タンパク質をコードしている遺伝子は、植物ゲノム内に挿入された転写単位から発現される。好ましくは、前記転写単位は、植物ゲノム内への安定な組込みが可能であり、かつタンパク質をコードしているｍＲＮＡを発現する形質転換した植物系統の選択を可能にする組換えベクターである。
挿入されたＤＮＡがゲノム内に組み込まれた後、これはそこで比較的安定する（かつ再度出ていかない）。これは、通常、形質転換した植物細胞に、とりわけカナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、またはクロラムフェニコールなどの殺生物剤または抗生物質に対する抵抗性を与える選択マーカーを含有する。また、植物選択可能マーカーは、典型的には、グルホシネート（たとえばＰＡＴ／ｂａｒ）、グリホサート（ＥＰＳＰＳ）、ＡＬＳ阻害剤（たとえば、イミダゾリノン、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジンスルホンアニリドなど）、ブロモキシニル、ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性、ＰＰＯ阻害剤、ＡＣＣ−ａｓｅ阻害剤などの様々な除草剤に対する抵抗性も提供することができる。したがって、個々に用いられるマーカーは、挿入されたＤＮＡを含有しない細胞ではなく形質転換細胞の選択を可能にするはずである。目的遺伝子（複数可）は、好ましくは、植物細胞中の構成的または誘導性プロモーターのどちらかによって発現される。発現された後、ｍＲＮＡはタンパク質へと翻訳され、それによって目的アミノ酸がタンパク質内に取り込まれる。植物細胞中で発現されるタンパク質をコードしている遺伝子は、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターの制御下であることができる。
外来組換えベクターを植物細胞内に導入するため、ならびに導入された遺伝子を安定に維持および発現する植物を得るための、いくつかの技法が存在する。そのような技法には、微粒子上にコーティングした遺伝物質を細胞内に直接導入することが含まれる（Ｃｏｒｎｅｌｌの米国特許第４，９４５，０５０号およびＤｏｗＥｌａｎｃｏ、現在はＤｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＬＬＣの第５，１４１，１３１号）。さらに、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）技術を使用して植物を形質転換してもよく、トリード大学の米国特許第５，１７７，０１０号、テキサスＡ＆Ｍ大学の第５，１０４，３１０号、欧州特許出願第０１３１６２４Ｂ１号、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔの欧州特許出願第１２０５１６号、第１５９４１８Ｂ１号および第１７６，１１２号、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔの米国特許第５，１４９，６４５号、第５，４６９，９７６号、第５，４６４，７６３号、第４，９４０，８３８号および第４，６９３，９７６号、すべてＭａｘ Ｐｌａｎｃｋの欧州特許出願第１１６７１８号、第２９０７９９号、第３２０５００号、日本たばこ産業株式会社の欧州特許出願第６０４６６２号、第６２７７５２号、および米国特許第５，５９１，６１６号、すべてＣｉｂａ Ｇｅｉｇｙ、現在はＳｙｎｇｅｎｔａの欧州特許出願第０２６７１５９号、第０２９２４３５号、および米国特許第５，２３１，０１９号、どちらもＣａｌｇｅｎｅの米国特許第５，４６３，１７４号および第４，７６２，７８５号、ならびにどちらもＡｇｒａｃｅｔｕｓの米国特許第５，００４，８６３号および第５，１５９，１３５号を参照されたい。他の形質転換技術には髭結晶技術が含まれる。どちらもＺｅｎｅｃａ、現在はＳｙｎｇｅｎｔａの米国特許第５，３０２，５２３号および第５，４６４，７６５号を参照されたい。他の直接ＤＮＡ送達形質転換技術にはエアロゾルビーム技術が含まれる。米国特許第６，８０９，２３２を参照されたい。また、電気穿孔技術も植物を形質転換するために使用されている。Ｂｏｙｃｅ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＷＯ８７／０６６１４、どちらもＤｅｋａｌｂの米国特許第５，４７２，８６９号および第５，３８４，２５３号、ならびにどちらもＰｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＳｙｓｔｅｍｓのＷＯ９２／０９６９６号およびＷＯ９３／２１３３５号を参照されたい。さらに、ウイルスベクターを使用して目的タンパク質を発現するトランスジェニック植物を生成することもできる。たとえば、Ｍｙｃｏｇｅｎ Ｐｌａｎｔ ＳｃｉｅｎｃｅおよびＣｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ（現在はＳｙｎｇｅｎｔａ）の米国特許第５，５６９，５９７号、ならびにどちらもＢｉｏｓｏｕｒｃｅ、現在はＬａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｙの米国特許第５，５８９，３６７号および第５，３１６，９３１号に記載されている方法を使用して、単子葉植物をウイルスベクターで形質転換することができる。
既に言及したように、ＤＮＡ構築物を植物宿主内に導入する様式は本発明にとって重大ではない。効率的な形質転換をもたらす任意の方法を用い得る。たとえば、植物細胞の形質転換のための様々な方法が本明細書中に記載されており、ＴｉまたはＲｉプラスミドなどを使用してアグロバクテリウム属（Agrobacterium）媒介性の形質転換を行うことが含まれる。多くの事例において、形質転換に使用する構築物の片側または両側、より詳細には右側の境界がＴ−ＤＮＡ境界に境界隣接することが望ましい。このことは、形質転換の様式として構築物がアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を使用する場合に特に有用であるが、Ｔ−ＤＮＡ境界は他の形質転換様式においても使用が見つかり得る。アグロバクテリウム属（Agrobacterium）を植物細胞の形質転換に使用する場合、宿主中に存在するＴ−ＤＮＡまたはＴｉもしくはＲｉプラスミドとの相同組換えのために宿主内に導入し得るベクターを使用し得る。ベクターの導入は、電気穿孔、トリペアレンタルメイティングおよび当業者に知られている、グラム陰性細菌を形質転換する他の技法によって行い得る。アグロバクテリウム属（Agrobacterium）宿主内へのベクター形質転換の様式は本発明にとって重大ではない。組換えのためのＴ−ＤＮＡを含有するＴｉまたはＲｉプラスミドは、ゴール形成を引き起こすことができるまたはできない場合があるが、ｖｉｒ遺伝子が前記宿主中に存在する限りは、本発明にとって重大ではない。
アグロバクテリウム属（Agrobacterium）を形質転換に使用する一部の事例では、Ｔ−ＤＮＡ境界内にある発現構築物を、Dittaら(1980)およびＥＰＯ０ １２０ ５１５号に記載されているｐＲＫ２またはその誘導体などの広範囲のベクター内に挿入する。発現構築物およびＴ−ＤＮＡ内には、形質転換したアグロバクテリウム属（Agrobacterium）および形質転換した植物細胞の選択を可能にする、本明細書中に記載した１つまたは複数のマーカーが含まれる。用いる具体的なマーカーは本発明にとって重要ではなく、好ましいマーカーは使用する宿主および構築物に依存する。
アグロバクテリウム属（Agrobacterium）を使用した植物細胞の形質転換には、外植片を形質転換したアグロバクテリウム属（Agrobacterium）と一緒に合わせて、その形質転換を可能にするために十分な時間の間インキュベーションし得る。形質転換後、適切な抗生物質を用いた選択によってアグロバクテリウム属（Agrobacterium）を死滅させ、適切な選択培地を用いて植物細胞を培養する。カルスが形成された後、植物組織培養および植物再生の分野で周知の方法に従って適切な植物ホルモンを用いることによって、苗条の形成を促進することができる。しかし、カルス中間段階は必ずしも必要ではない。苗条の形成後、前記植物細胞を、根形成を促進する培地に移すことによって植物再生を完了させることができる。その後、植物を種子へと成長させてよく、前記種子を使用して次世代を確立させることができる。形質転換技法にかかわらず、細菌タンパク質をコードしている遺伝子は、好ましくは、ベクター中に植物プロモーター調節エレメント、およびＮｏｓなどの３’非翻訳転写終結領域等を含めることによって、植物細胞中で前記遺伝子を発現するように適応させた遺伝子移入ベクター内に取り込ませる。
植物を形質転換する数々の技術に加えて、外来遺伝子と接触させる組織の種類も変動させ得る。そのような組織には、それだけには限定されないが、胚形成組織、カルス組織型Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ、胚軸、分裂組織、根組織、師部中での発現のための組織などが含まれる。本明細書中に記載の適切な技法を使用して、ほぼすべての植物組織を脱分化中に形質転換し得る。
上述のように、所望する場合は様々な選択可能マーカーを使用することができる。具体的なマーカーの優先度は当業者の自由裁量によるが、以下の選択可能マーカーのうちのいずれかを、選択可能マーカーとして機能することができる、本明細書中に列挙していない任意の他の遺伝子と共に使用し得る。そのような選択可能マーカーには、それだけには限定されないが、抗生物質カナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１に対する抵抗性をコードしている、トランスポゾンＴｎ５のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ａｐｈ ＩＩ）、ハイグロマイシン抵抗性、メトトレキサート抵抗性、グリホサートに対する抵抗性または耐性をコードしている遺伝子、フォスフィノスリシン（ビアラホスまたはグルホシネート）、ＡＬＳ阻害性除草剤（イミダゾリノン、スルホニル尿素およびトリアゾロピリミジン除草剤）、ＡＣＣ−ａｓｅ阻害剤（たとえば、アイリールオキシプロピオネート（ayryloxypropionates）またはシクロヘキサンジオン）、ならびにブロモキシニルおよびＨＰＰＤ阻害剤（たとえばメソトリオン）などが含まれる。
選択可能マーカーに加えて、レポーター遺伝子を使用することが望ましい場合がある。一部の例では、レポーター遺伝子は、選択可能マーカーを用いてまたは用いずに使用し得る。レポーター遺伝子とは、典型的にはレシピエント生物または組織中に存在せず、典型的には何らかの表現型の変化または酵素特性をもたらすタンパク質をコードしている遺伝子である。そのような遺伝子の例はWeisingら、1988中に提供されている。好ましいレポーター遺伝子には、大腸菌（E. coli）のｕｉｄＡ座位のベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、大腸菌（E. coli）のＴｎ９からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、生物発光性クラゲであるオワンクラゲ（Aequorea victoria）からの緑色蛍光タンパク質、ホタルであるフォティナス・ピラリス（Photinus pyralis）からのルシフェラーゼ遺伝子が含まれる。その後、前記遺伝子がレシピエント細胞内に導入された後の適時に、レポーター遺伝子の発現を検出するアッセイを行い得る。好ましいそのようなアッセイは、形質転換細胞を同定するために、Jeffersonら、(1987)に記載のように、大腸菌（E. coli）のｕｉｄＡ座位のベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードしている遺伝子の使用を伴う。
植物プロモーター調節エレメントに加えて、外来遺伝子を発現させるために、様々な供給源からのプロモーター調節エレメントを植物細胞中で効率的に使用することができる。たとえば、オクトピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、マンノピン合成酵素プロモーターなどの細菌起源のプロモーター調節エレメント、ならびにカリフラワーモザイクウイルス（３５Ｓおよび１９Ｓ）、３５Ｔ（これは再操作した３５Ｓプロモーターであり、米国特許第６，１６６，３０２号、特に実施例７Ｅを参照）などのウイルス起源のプロモーター等を使用し得る。植物プロモーター調節エレメントには、それだけには限定されないが、リブロース−１，６−二リン酸（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）、ベータ−コングリシニンプロモーター、ベータ−ファセオリンプロモーター、ＡＤＨプロモーター、熱ショックプロモーター、および組織特異的プロモーターが含まれる。マトリックス付着領域、足場付着領域、イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化配列などの他のエレメントが存在していてもよく、それにより、転写効率またはＤＮＡ組込みが改善される場合がある。そのようなエレメントは、ＤＮＡの機能に必要または不要な場合があるが、これらは、転写、ｍＲＮＡ安定性などに影響を与えることによってＤＮＡのより良好な発現または機能を提供することができる。そのようなエレメントは、形質転換したＤＮＡの植物中での最適な性能を得るために、所望に応じてＤＮＡ中に含め得る。典型的なエレメントには、それだけには限定されないが、Ａｄｈ−イントロン１、Ａｄｈ−イントロン６、アルファルファモザイクウイルスコートタンパク質リーダー配列、オスモチンＵＴＲ配列、トウモロコシ条斑ウイルスコートタンパク質リーダー配列、および当業者が入手可能な他のものが含まれる。また、構成的プロモーター調節エレメントも使用してよく、それにより、あらゆる細胞種中での常時の連続的な遺伝子発現が指示される（たとえば、アクチン、ユビキチン、ＣａＭＶ ３５Ｓなど）。組織特異的プロモーター調節エレメントは葉または種子などの特定の細胞または組織型中での遺伝子発現を司っており（たとえば、ゼイン、オレオシン、ナピン、ＡＣＰ、グロブリンなど）、これらも使用し得る。
また、プロモーター調節エレメントは、植物の発生の特定の段階中で活性（または不活性）、ならびに植物組織および器官中で活性であり得る。そのようなものの例には、それだけには限定されないが、花粉特異的、胚特異的、トウモロコシ絹糸特異的、綿繊維特異的、根特異的、種子−胚乳特異的、または栄養期特異的なプロモーター調節エレメントなどが含まれる。特定の状況下では、物理的刺激（熱ショック遺伝子）、光（ＲＵＢＰカルボキシラーゼ）、ホルモン（Ｅｍ）、代謝物、化合物（テトラサイクリン応答性）、およびストレスなどの特異的なシグナルに応答した遺伝子の発現を司っている、誘導性プロモーター調節エレメントを使用することが望ましい場合がある。植物中で機能する他の望ましい転写および翻訳エレメントを使用し得る。数々の植物特異的遺伝子移入ベクターが当分野で知られている。
また、植物ＲＮＡウイルスに基づく系を使用して細菌タンパク質を発現させることもできる。その際、タンパク質をコードしている遺伝子を、目的宿主植物に感染する適切な植物ウイルスのコートプロモーター領域内に挿入することができる。その後、タンパク質を発現させ、したがって植物の除草剤被害からの保護をもたらすことができる。植物ＲＮＡウイルスに基づく系は、Ｍｙｃｏｇｅｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．の米国特許第５，５００，３６０号ならびにＢｉｏｓｏｕｒｃｅ、現在はＬａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｙの米国特許第５，３１６，９３１号および第５，５８９，３６７号に記載されている。
耐性または抵抗性レベルをさらに増加させる手段。収量を含めた表現型に対して観察可能な有害作用なしに、本発明の植物に新規除草剤抵抗形質を与えることができることが、本明細書中で示されている。そのような植物は本発明の範囲内にある。本明細書中で例示および示唆した植物は、たとえば少なくとも１つの対象除草剤の、典型的な施用レベルの２×、３×、４×、および５×を耐えることができる。これらの耐性レベルの改善は本発明の範囲内にある。たとえば、様々な技法が当分野で知られており、所定の遺伝子の発現を増加させるために最適化およびさらに開発できることが予測される。
１つのそのような方法には、対象ＡＡＤ−１２遺伝子のコピー数（発現カセット中など）を増加させることが含まれる。また、遺伝子の複数コピーを有するものについて形質転換事象を選択することもできる。
強力なプロモーターおよびエンハンサーを使用して発現を「スーパーチャージ」させることができる。そのようなプロモーターの例には、３５Ｓエンハンサーを使用する好ましい３５Ｔプロモーターが含まれる。３５Ｓ、トウモロコシユビキチン、シロイヌナズナ（Arabidopsis）ユビキチン、Ａ．ｔ．アクチン、およびＣＳＭＶプロモーターがそのような使用のために含まれる。他の強力なウイルスプロモーターも好ましい。エンハンサーには４ ＯＣＳおよび３５Ｓ二重エンハンサーが含まれる。また、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）を使用して形質転換の効率および導入遺伝子の発現を増加させることもできる。
また、シャフリング（定向進化）および転写因子も、本発明による実施形態に使用することができる。
また、配列レベルでは異なるが、同じまたは同様の全体的な必須三次元構造、表面荷電分布などを保持する、変異タンパク質を設計することもできる。たとえば、米国特許第７，０５８，５１５号、Larsonら、Protein Sci. 2002 11:2804-2813、「Thoroughly sampling sequence space: Large-scale protein design of structural ensembles」、Crameriら、Nature Biotechnology 15、436-438 (1997)、「Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling」、Stemmer, W. P. C. 1994. 「DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution」 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751、Stemmer, W. P. C. 1994. 「Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling」 Nature 370:389-391、Stemmer, W. P. C. 1995. Searching sequence space. Bio/Technology 13:549-553、Crameri, A.ら、1996. 「Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling」Nature Medicine 2:100-103、およびCrameri, A.ら、1996. 「Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling」 Nature Biotechnology 14:315-319を参照されたい。
植物細胞内に挿入された組換えポリヌクレオチドの活性は、挿入物に隣接する内在植物ＤＮＡの影響に依存する場合がある。したがって、別の選択肢は、植物ゲノム中で挿入に優れた場所であることが知られている事象を活用することである。たとえば、ｃｒｙ１Ｆおよびｃｒｙ１Ａｃ綿事象に関するＷＯ２００５／１０３２６６ Ａ１号を参照されたい。これらのゲノム座位において、対象ＡＡＤ−１２遺伝子をｃｒｙ１Ｆおよび／またはｃｒｙ１Ａｃ挿入物の代わりに置換することができる。したがって、たとえば標的化相同組換えを本発明に従って使用することができる。この種の技術は、たとえば、標的化組換えのためのジンクフィンガーの使用に関する、ＷＯ０３／０８０８０９ Ａ２号および対応する公開米国特許出願第２００３０２３２４１０号の対象である。また、リコンビナーゼ（ｃｒｅ−１０×およびｆｌｐ−ｆｒｔなど）の使用も知られている。
ＡＡＤ−１２解毒は細胞質中で起こると考えられている。したがって、このタンパク質およびｍＲＮＡをさらに安定化させる手段（ｍＲＮＡ分解の遮断が含まれる）が本発明の態様内に含まれ、当分野で知られている技法を相応に適用することができる。対象タンパク質を、プロテアーゼなどによる分解に抵抗するように設計することができる（タンパク質のアミノ酸配列を再操作することによってプロテアーゼ切断部位を有効に取り除くことができる）。そのような実施形態には、オスモチンからのＵＴＲなどの５’および３’ステムループ構造、ならびにｐｅｒ５（ＡＵに富んだ非翻訳５’配列）の使用が含まれる。また、７−メチルまたは２’−Ｏ−メチル基、たとえば７−メチルグアニル酸残基などの５’キャップも使用することができる。たとえば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第74巻、第7号、ページ2734-2738 (1977年7月) Importance of 5'-terminal blocking structure to stabilize mRNA in eukaryotic protein synthesisを参照されたい。また、タンパク質複合体またはリガンド遮断基も使用することができる。
また、ＡＡＤ−１２（合成ヘアピン）に最も適切な５’または３’ＵＴＲのコンピュータ設計も、本発明の範囲内で実施することができる。コンピュータモデリング一般、ならびに遺伝子シャフリングおよび定向進化は、本明細書中の他の箇所で記述されている。より詳細には、コンピュータモデリングおよびＵＴＲに関して、本発明の５’および３’ＵＴＲ誘導体の予測／評価に使用するためのコンピュータモデリング技法には、それだけには限定されないが、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎから入手可能なＭＦｏｌｄバージョン３．１（Zuckerら、Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide. In RNA Biochemistry and Biotechnology、11-43、J. Barciszewski & B. F. C. Clark編、NATO ASI Series、Kluwer Academic Publishers、Dordrecht, NL、(1999)、Zuckerら、Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure. J. Mol. Biol. 288、911-940 (1999)、Zuckerら、RNA Secondary Structure Prediction、Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry、S. Beaucage、D. E. Bergstrom、G. D. Glick、およびR. A. Jones編, John Wiley & Sons、New York、11.2.1-11.2.10、(2000)を参照）、ソースコードとして無償で配布されており、ウェブサイトgenetics.wust1.edu/eddy/software/にアクセスすることによってダウンロードすることができるＣＯＶＥ（共分散モデルを使用したＲＮＡ構造分析（確率論的コンテキストを使用しない文法方法））ｖ．２．４．２（EddyおよびDurbin、Nucl. Acids Res.、1994、22:2079-2088）、および、やはり無償で配布されており、ウェブサイトbioinf.au.dk. FOLDALIGN/からダウンロード可能なＦＯＬＤＡＬＩＧＮ（Finding the most significant common sequence and structure motifs in a set of RNA sequences. J. Gorodkin、L. J. HeyerおよびG. D. Stormo. Nucleic Acids Research、第25巻、第18号、3724〜3732ページ、1997、Finding Common Sequence and Structure Motifs in a set of RNA Sequences. J. Gorodkin、L. J. Heyer、およびG. D. Stormo. ISMB 5;120-123、1997を参照）が含まれる。
本発明の実施形態は、自然に進化したまたは化学的に誘発された突然変異体と併せて使用することができる（突然変異体は、スクリーニング技法によって選択し、その後、ＡＡＤ−１２および場合によっては他の遺伝子で形質転換することができる）。本発明の植物は、ＡＬＳ抵抗性および／または進化したグリホサート抵抗性と組み合わせることができる。また、たとえばアミノピラリド抵抗性を、ＡＡＤ−１２遺伝子と組み合わせる、または「スタッキング」することもできる。
また、伝統的な育種技法を本発明と組み合わせて、所望の形質を強力に組み合わせ、浸透交雑し、改善することもできる。
また、さらなる改善には、植物をさらに保護するおよび／またはさらなる除草剤に対する交差抵抗性を付加するための、適切な緩和剤との使用が含まれる。緩和剤は、典型的には、ｃＰ４５０を活性化／発現させることによって植物の免疫系を増加させるように作用する。緩和剤は、雑草防除の有効性を損なうことなく、生理的または分子的な機構によって作物に対する除草剤の植物毒性を低下させる化学薬品である。
除草緩和剤には、ベノキサコール、クロキントセット、シオメトリニル、ジクロルミド、ジシクロノン、ジエトレート、フェンクロラゾール、フェンクロリム、フルラゾール、フルキソフェニム、フリラゾール、イソキサジフェン、メフェンピル、メフェネート、ナフタル酸無水物、およびオキサベトリニルが含まれる。また、植物活性化剤（その防御機構を活性化させることによって植物を保護する新規化合物クラス）も本発明の実施形態において使用することができる。これらにはアシベンゾラルおよびプロベナゾールが含まれる。
市販の緩和剤は、トウモロコシ、穀実用モロコシ、および水稲などの大型種子のイネ科作物を、植えつけ前に取り込ませたまたは出芽前に施用した、チオカルバメートおよびクロロアセトアニリドファミリーの除草剤に対して保護するために使用することができる。また、コムギなどの冬禾穀類を、アリールオキシフェノキシプロピオン酸およびスルホニル尿素除草剤の出芽後施用に対して保護するための緩和剤も開発されている。また、トウモロコシおよびコメをスルホニル尿素、イミダゾリノン、シクロヘキサンジオン、イソオキサゾール、およびトリケトン除草剤に対して保護するための緩和剤の使用も十分に確立されている。緩和剤処理した植物における除草剤解毒の、緩和剤に誘導された増強は、緩和剤の作用に関与する主要な機構として広く受け入れられている。緩和剤は、グルタチオンなどの補因子ならびにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、およびグルコシルトランスフェラーゼなどの除草剤解毒酵素を誘導する。Hatzios K K、Burgos N (2004) 「Metabolism-based herbicide resistance: regulation by safeners」、Weed Science:第52巻、第3号、454〜467ページ。
ＡＡＤ−１２とスタッキングしたチトクロムｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子の使用は、好ましい一実施形態である。除草剤の代謝にはＰ４５０が関与している。たとえば、ｃＰ４５０は哺乳動物または植物起源のものであり得る。高等植物では、チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（Ｐ４５０）が二次代謝を実施することが知られている。また、これは、ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０酸化還元酵素（レダクターゼ）と協同して、生体異物の酸化代謝においても重要な役割を果たす。一部の除草剤に対する抵抗性が、Ｐ４５０およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼによる代謝の結果として報告されている。哺乳動物における生体異物の代謝に関与しているいくつかのミクロソームＰ４５０種が分子クローニングによって特徴づけられている。これらの一部は、いくつかの除草剤を効率的に代謝することが報告されている。したがって、植物または哺乳動物のＰ４５０を有するトランスジェニック植物はいくつかの除草剤に対する抵抗性を示すことができる。
前述のものの好ましい一実施形態は、アセトクロール（アセトクロールに基づく製品には、Ｓｕｒｐａｓｓ（登録商標）、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ（登録商標）、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ ＬＡ、ＦｕｌＴｉｍｅ（登録商標）およびＴｏｐＮｏｔｃｈ（登録商標）除草剤が含まれる）ならびに／またはトリフルラリン（Ｔｒｅｆｌａｎ（登録商標）など）に対する抵抗性のための、ｃＰ４５０の使用である。ダイズおよび／またはトウモロコシにおけるそのような抵抗性が一部の好ましい実施形態に含まれる。そのような実施形態に関するさらなる指針には、たとえば、Inuiら、「A selectable marker using cytochrome P450 monooxygenases for Arabidopsis transformation」、Plant Biotechnology 22、281-286 (2005)（除草剤を代謝するヒトチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを使用するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を介したシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の形質転換の選択系に関する。除草剤耐性の実生を形質転換し、除草剤アセトクロール、アミプロホス−メチル、クロルプロファム、クロルスルフロン、ノルフルラゾン、およびペンディメタリンを用いて選択した）、Siminszkyら、「Expression of a soybean cytochrome P450 monooxygenase cDNA in yeast and tobacco enhances the metabolism of phenylurea herbicides」、PNAS、第96巻、第4号、1750-1755、1999年2月16日、Sheldonら、Weed Science:第48巻、第3号、291〜295ページ、「A cytochrome P450 monooxygenase cDNA (CYP71A10) confers resistance to linuron in transgenic Nicotiana tabacum」、ならびに「Phytoremediation of the herbicides atrazine and metolachlor by transgenic rice plants expressing human CYP1A1, CYP2B6, and CYP2C19」、J Agric Food Chem. 2006年4月19日; 54(8):2985-91（コメにおけるヒトチトクロムｐ４５０モノオキシゲナーゼの試験に関する。コメ植物は、クロロアセトミド（chloroacetomides）（アセトクロール、アラクロール、メトアクロール（metoachlor）、プレチラクロール、およびテニルクロール）、オキシアセトアミド（メフェナセット）、ピリダジノン（ノルフルラゾン）、２，６−ジニトロアナリン（dinitroanalines）（トリフルラリンおよびペンディメタリン）、ホスフアミデート（phosphamidates）（アミプロホス（amiprofos）−メチル、チオカルバメート（ピリブチカルブ）、および尿素（クロルトルロン）に対して高い耐性を示したと報告されている）を参照されたい。
また、対象ＡＡＤ−１２遺伝子をより効率的にするために、２，４−Ｄ化学を変更するまたは異なる２，４−Ｄ化学を使用する可能性も存在する。そのような可能な変化には、より良好な基質およびより良好な脱離基（より高い電気陰性度）の作製が含まれる。また、オーキシン輸送阻害剤（たとえばジフルフェンゾピル）も、２，４−Ｄを用いた除草活性を増加させるために使用することができる。
具体的に表示または暗示しない限り、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、本明細書中で使用する「少なくとも１つ」を示す。本明細書中で言及または引用したすべての特許、特許出願、仮出願、および出版物は、本明細書の明確な教示と矛盾しない程度に、その全体が参照により組み込まれている。
以下は、本発明を実施するための手順を例示する実施例である。これらの実施例は限定的であると解釈されるべきでない。別段に注記しない限りは、すべてのパーセンテージは重量パーセントであり、すべての溶媒の混合割合は体積割合である。
（実施例）
植物体において２，４−Ｄに対する抵抗性を与える遺伝子を同定する方法
植物体中で除草剤分解活性を保有する遺伝子を同定する一方法として、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などの現在の公開データベースを探索することが可能である。このプロセスを開始するために、所望の特徴（すなわちα−ケトグルタル酸ジオキシゲナーゼ活性）を有するタンパク質をコードしている機能的遺伝子配列が既に同定されていることが必要である。その後、このタンパク質配列をＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）（Altschulら、1997）アルゴリズムへの入力として使用して、寄託されている利用可能なＮＣＢＩタンパク質配列に対して比較する。初期設定を使用して、この検索は１００個以上の相同的なタンパク質配列を変動的なレベルで返す。これらは、アミノ酸レベルで高度な同一性（８５〜９８％）から非常に低い同一性（２３〜３２％）までの範囲である。慣習的には、高い相同性を有する配列のみが入力配列と同様の特性を保持すると予想される。この事例では、ｇｔｏｒｅｑ５０％の相同性を有する配列のみを選んだ。本明細書中に例示するように、３１％と低いアミノ酸保存（ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）からのｔｆｄＡに対して）しか有さない相同体をクローニングし、組換え発現させることを使用して、意図する除草剤だけでなく、以前に一度もこれらの酵素で試験したことがない基質にも、商業的レベルの抵抗性を与えることができる。
単一遺伝子（ｓｄｐＡ）を、ＮＣＢＩデータベース（ncbi.nlm.nih.govウェブサイト、受託番号ＡＦ５１６７５２を参照）から、ｔｆｄＡに対して３１％のアミノ酸同一性しか有さない相同体として同定した。パーセント同一性は、最初に、データベースに寄託されていたｓｄｐＡおよびｔｆｄＡの両方のＤＮＡ配列をタンパク質へと翻訳し、その後、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩソフトウェアパッケージ中のＣｌｕｓｔａｌＷを使用して複数配列アラインメントを行うことによって決定した。
植物および細菌中で発現させるための配列の最適化
植物においてより高い異種遺伝子の発現レベルを得るために、これらが植物細胞中でより効率的に発現されるように、遺伝子のタンパク質コード配列を再操作することが好ましい場合がある。トウモロコシは、遺伝子の発現レベルおよび植物中におけるコードされているタンパク質のレベルを増加させるために形質転換の前に異種タンパク質コード領域を再設計することが好ましい場合があるそのような植物のうちの１つである。したがって、細菌タンパク質をコードしている遺伝子の設計における追加のステップは、最適な発現のために異種遺伝子を再操作することである。
トウモロコシ中での発現のために細菌タンパク質を再操作する１つの理由は、ネイティブ遺伝子の最適でないＧ＋Ｃ含有率によるものである。たとえば、多くのネイティブ細菌遺伝子の非常に低いＧ＋Ｃ含有率（およびその結果としての高いＡ＋Ｔ含有率への傾斜）は、Ａ＋Ｔに非常に富んでいることが知られている植物遺伝子制御配列を模倣または複写する配列の作製をもたらす。植物内に導入された、遺伝子のＤＮＡ内における一部のＡ＋Ｔに富んだ配列の存在（たとえば、通常は遺伝子プロモーター中に見つかるＴＡＴＡボックス領域）は、遺伝子の異常な転写をもたらし得る。他方では、転写されたｍＲＮＡ中に駐在する他の調節配列の存在（たとえば、ポリアデニル化シグナル配列（ＡＡＵＡＡＡ）、またはｍＲＮＡ前駆体スプライシングに関与している核内低分子ＲＮＡに相補的な配列）は、ＲＮＡの不安定性をもたらし得る。したがって、トウモロコシ発現のための細菌タンパク質をコードしている遺伝子の設計、より好ましくは植物に最適化された遺伝子と呼ばれることにおける１つの目標は、より高いＧ＋Ｃ含有率、好ましくは代謝酵素をコードしているトウモロコシ遺伝子のそれに近いものを有するＤＮＡ配列を作製することである。細菌タンパク質をコードしている、植物に最適化された遺伝子の設計における別の目標は、配列の改変が翻訳を妨害しないＤＮＡ配列を作製することである。
表２は、Ｇ＋Ｃ含有率がトウモロコシ中でどれだけ高いかを例示している。表２中のデータでは、遺伝子のコード領域をＧｅｎＢａｎｋ（リリース７１）のエントリーから抽出し、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（商標）プログラム（Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を使用して塩基組成を計算した。イントロン配列は計算中に無視した。
遺伝暗号の冗長／縮重によって与えられた柔軟性が原因で（すなわち、一部のアミノ酸は複数のコドンによって指定される）、異なる生物または生物クラスにおけるゲノムの進化の結果、冗長コドンの使用頻度は異なっている。この「コドンの偏り」はタンパク質コード領域の平均塩基組成に反映されている。たとえば、比較的低いＧ＋Ｃ含有率を有する生物は、冗長コドンの第３位にＡまたはＴを有するコドンを利用する一方で、より高いＧ＋Ｃ含有率を有する生物は、第３位にＧまたはＣを有するコドンを利用する。ｍＲＮＡ内の「マイナー」コドンの存在は、特にマイナーコドンに対応する荷電ｔＲＮＡの相対的存在量が低い場合に、そのｍＲＮＡの絶対的翻訳率を低下させ得ると考えられている。このことの拡張は、個々のマイナーコドンによる翻訳率の減少は、複数のマイナーコドンについて少なくとも相加的であることである。したがって、マイナーコドンの高い相対的含有率を有するｍＲＮＡは、対応して低い翻訳率を有する。この翻訳率は、後の、コードされているタンパク質の低いレベルによって反映される。
トウモロコシ（または綿もしくはダイズなどの他の植物）発現のために細菌タンパク質をコードしている遺伝子を操作するにあたって、植物のコドンの偏りが決定されている。トウモロコシのコドンの偏りは、植物がそのタンパク質をコードするために使用する統計的コドン分布であり、好ましいコドン使用頻度を表３中に示す。偏りを決定した後、目的遺伝子中のコドンのパーセント頻度を決定する。植物によって好まれる第１のコドン、ならびに複数の選択肢が存在する場合は好ましいコドンの第２、第３、および第４の選択肢が決定される。その後、細菌タンパク質のアミノ配列をコードしている新しいＤＮＡ配列を設計することができるが、新しいＤＮＡ配列は、植物の（１番目に好ましい、２番目に好ましい、３番目に好ましい、または４番目に好ましい）コドンの置換によってネイティブ細菌ＤＮＡ配列（タンパク質をコードしている）とは異なって、タンパク質アミノ酸配列内に各位置でのアミノ酸を指定する。その後、新しい配列を、改変によって作製された可能性のある制限酵素部位について分析する。コドンを１番目、２番目、３番目、または４番目の選択肢の好ましいコドンで置き換えることによって、同定された部位をさらに改変する。目的遺伝子の転写または翻訳に影響を与える可能性がある、配列中の他の部位は、エクソン：イントロンの接合部（５’もしくは３’）、ポリＡ付加シグナル、またはＲＮＡポリメラーゼ終止シグナルである。配列をさらに分析し、ＴＡまたはＧＣダブレットの頻度を低下させるために改変する。ダブレットに加えて、約４個より多い同じ残基を有するＧまたはＣ配列ブロックは配列の転写に影響を与える場合がある。したがって、これらのブロックも、第１または第２の選択肢などのコドンを、次に好ましいコドンの選択肢で置き換えることによって改変する。
細菌タンパク質をコードしている植物に最適化された遺伝子が、全パーセンテージが１００％の場合に約６３％の第１選択肢のコドン、約２２％〜約３７％の第２選択肢のコドン、および約１５％〜約０％の第３または第４選択肢のコドンを含有することが好ましい。最も好ましくは、植物に最適化された遺伝子は、全パーセンテージが１００％である場合に約６３％の第１選択肢のコドン、少なくとも約２２％の第２選択肢のコドン、約７．５％の第３選択肢のコドン、および約７．５％の第４選択肢のコドンを含有する。上述の方法は、遺伝子が植物中で最適に発現されるように、特定の植物にとって外来である遺伝子を当業者が改変することを可能にする。この方法は、ＰＣＴ出願ＷＯ９７／１３４０２号にさらに例示されている。
したがって、細菌タンパク質をコードしている、植物に最適化された遺伝子を設計するために、特定の植物または複数の植物の遺伝子配列からコンパイリングしたコドンの偏りの表から確立された冗長遺伝暗号を利用して、前記タンパク質のアミノ酸配列をコードするようにＤＮＡ配列を設計する。生じるＤＮＡ配列は、より高い度合のコドン多様性、望ましい塩基組成を有しており、戦略的に配置された制限酵素認識部位を含有することができ、遺伝子の転写またはｍＲＮＡ産物の翻訳を妨げ得る配列を欠く。したがって、本発明のタンパク質／遺伝子と機能的に等価である合成遺伝子を使用して、植物を含めた宿主を形質転換することができる。合成遺伝子の生成に関するさらなる指針は、たとえば米国特許第５，３８０，８３１号中に見つけることができる。
ＡＡＤ−１２植物再構築分析：ネイティブＡＡＤ−１２コード領域のＤＮＡ配列（配列番号１）の８７６塩基対（ｂｐ）の大規模な分析により、最適な植物発現に有害であると考えられるいくつかの配列モチーフの存在、および最適でないコドン組成が明らかとなった。配列番号１によってコードされているタンパク質（ＡＡＤ−１２）を配列番号２として提示する。単子葉植物および双子葉植物における組換えタンパク質の産生を改善するために、第２位でアラニン残基が付加されている（配列番号４中で下線）以外はネイティブ配列番号２と同じであるタンパク質（配列番号４）をコードしている、「植物に最適化された」ＤＮＡ配列ＡＡＤ−１２（ｖ１）（配列番号３）を開発した。追加のアラニンコドン（ＧＣＴ、配列番号３中で下線）は、ＡＴＧ翻訳開始コドンにかかるＮｃｏＩ制限酵素認識部位（ＣＣＡＴＧＧ）の一部をコードしている。したがって、これは、続くクローニング操作を容易にする一方で、ＡＴＧ開始コドンの周りの配列構成を改善して翻訳開始を最適化するという、二重目的を果たす。ネイティブと植物に最適化された（ｖ１）コード領域によってコードされているタンパク質とは９９．３％同一であり、アミノ酸番号２でのみ異なる。対照的に、ネイティブと植物に最適化された（ｖ１）コード領域のＤＮＡ配列とは７９．７％しか同一でない。
表４は、ネイティブ（列ＡおよびＤ）と植物に最適化された配列（列ＢおよびＥ）とのコドン組成の相違を示しており、理論上の植物に最適化された配列（列ＣおよびＦ）との比較を可能にする。
表４の検査から、ネイティブと植物に最適化されたコード領域とは、ほぼ同一のタンパク質をコードしている一方で、互いに実質的に異なることが明らかである。植物に最適化された型（ｖ１）は、ＡＡＤ−１２タンパク質をコードしている理論上の植物に最適化されたコード領域のコドン組成を密に模倣している。
大腸菌（E. coli）発現のための再構築：生化学および分析の研究のために比較的大量のタンパク質を生成するために、大腸菌（Escherichia coli）の特別に操作した株および関連するベクター系がしばしば使用される。遺伝子の供給生物は別の細菌属であり得る場合でも、所望のタンパク質をコードしているネイティブ遺伝子は大腸菌（E. coli）中での高レベルの発現に十分に適していないことが時折判明する。そのような事例では、遺伝子のタンパク質コード領域を再操作して、大腸菌（E. coli）中での発現のために適したものにすることが可能かつ望ましい。大腸菌（E. coli）クラスＩＩ遺伝子とは、大腸菌（E. coli）細胞の指数関数的増殖期中に高度かつ連続的に発現されるものとして定義される。（Henaut, A.およびDanchin, A. (1996)、Escherichia coli and Salmonella typhimurium cellular and molecular biology、第2巻、2047〜2066ページ。 Neidhardt, F.、Curtiss III, R.、Ingraham, J.、Lin, E.、Low, B.、Magasanik, B.、Reznikoff, W.、Riley, M.、Schaechter, M.およびUmbarger, H.(編) American Society for Microbiology、Washington, D.C.）。大腸菌（E. coli）クラスＩＩ遺伝子のコード領域のコドン組成の検査により、これらの大腸菌（E. coli）クラスＩＩ遺伝子コード領域の平均コドン組成を仮定することができる。
クラスＩＩ遺伝子のそれを模倣する平均コドン組成を有するタンパク質コード領域が、大腸菌（E. coli）の指数関数的増殖期中での発現に好都合であると考えられる。これらの指針を使用して、ＡＡＤ−１２タンパク質（配列番号４）をコードしている新しいＤＮＡ配列（上述のように第２位での追加のアラニンが含まれる）を、大腸菌（E. coli）クラスＩＩ遺伝子コード領域の平均コドン組成に従って設計した。その設計がコドン組成のみに基づいていた初期配列をさらに操作して、大腸菌（E. coli）発現ベクター内へのクローニングに適した特定の制限酵素認識配列を含めた。高度に安定したステムループ構造などの有害な配列特長を回避し、１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端に相同的な遺伝子内配列（Ｌ ｅ．シャインダルガノ配列）も回避した。大腸菌（E. coli）に最適化された配列（ｖ２）は配列番号５として開示されており、配列番号４に開示されているタンパク質をコードしている。
ネイティブと大腸菌（E. coli）に最適化された（ｖ２）ＤＮＡ配列とは８４．０％同一である一方で、植物に最適化された（ｖ１）ＤＮＡ配列と大腸菌（E. coli）に最適化された（ｖ２）ＤＮＡ配列とは７６．０％同一である。表５は、ネイティブＡＡＤ−１２コード領域のコドン組成（列ＡおよびＤ）、大腸菌（E. coli）中での発現に最適化されたＡＡＤ−１２コード領域（ｖ２、列ＢおよびＥ）、ならびに大腸菌（E. coli）クラスＩＩ遺伝子の最適なコドン組成を有するＡＡＤ−１２タンパク質の、理論上のコード領域のコドン組成（列ＣおよびＦ）を表す。
表６の検査から、ネイティブおよび大腸菌（E. coli）に最適化されたコード領域は、ほぼ同一のタンパク質をコードしている一方で、互いに実質的に異なることが明らかである。大腸菌（E. coli）に最適化された型（ｖ２）は、ＡＡＤ−１２タンパク質をコードしている理論上の大腸菌（E. coli）に最適化されたコード領域のコドン組成を密に模倣している。
グリホサート耐性を与える突然変異を有するダイズＥＰＳＰＳをコードしている、ダイズコドンに偏ったＤＮＡ配列の設計。本実施例は、突然変異させたダイズ５−エノールピルボイル（pyruvoyl）シキミ酸３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）をコードしているが、ダイズ細胞中での発現に最適化された、新しいＤＮＡ配列の設計を教示している。三重に突然変異させたダイズＥＰＳＰＳのアミノ酸配列は、ＷＯ２００４／００９７６１号の配列番号５として開示されている。そのように開示された配列中の突然変異したアミノ酸は、残基１８３（ネイティブタンパク質のスレオニンがイソロイシンで置き換えられている）、残基１８６（ネイティブタンパク質中のアルギニンがリシンで置き換えられている）、および残基１８７（ネイティブタンパク質中のプロリンがセリンで置き換えられている）である。したがって、ＷＯ２００４／００９７６１号の配列番号５の置換されたアミノ酸を、適切な位置にてネイティブアミノ酸で置き換えることによって、ネイティブダイズＥＰＳＰＳタンパク質のアミノ酸配列を推定することができる。そのようなネイティブタンパク質配列は、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４７３７号（２００５年５月２日に出願）の配列番号２０として開示されている。残基１８３（ネイティブタンパク質のスレオニンがイソロイシンで置き換えられている）、および残基１８７（ネイティブタンパク質中のプロリンがセリンで置き換えられている）で突然変異を含有する、二重に突然変異したダイズＥＰＳＰＳのタンパク質配列は、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４７３７号の配列番号２１として開示されている。
３６２，０９６個のコドン（約８７０個のコード配列）から計算したダイズ（Glycine max）のタンパク質コード配列のコドン使用頻度の表をワールドワイドウェブサイト「kazusa.or.jp/codon」から入手した。これらのデータを表６中に示すように再フォーマットした。表６の列ＤおよびＨは、ダイズ遺伝子のタンパク質コード領域中に見つかる、各アミノ酸の同義コドンの分布を表す（そのアミノ酸のすべてのコドンの使用頻度の％）。一部のアミノ酸の一部の同義コドン（アミノ酸は１、２、３、４、または６個のコドンによって指定され得る）は、ダイズタンパク質コード領域中に比較的稀にしか存在しないことが明白である（たとえば、アラニンを指定するためのＧＣＧおよびＧＣＴコドンの使用頻度の比較。）
偏ったダイズコドン使用頻度の表を、表６中のデータから計算した。特定のアミノ酸について全出現の約１０％未満のダイズ遺伝子でしか見つからないコドンは無視した。アミノ酸の残りのコドンの選択肢の分布のバランスをとるために、以下の式を使用して各コドンの加重平均表示を計算した：
Ｃ１の重みづけした％＝１／（％Ｃ１＋％Ｃ２＋％Ｃ３＋など）×％Ｃ１×１００
［式中、Ｃ１は照会中のコドンであり、Ｃ２、Ｃ３などは残りの同義コドンを表し、関連コドンの％値は表６の列ＤおよびＨから採用する（太字の稀なコドン値は無視する）］。
各コドンの重みづけした％値を表６の列ＣおよびＧに示す。ＴＧＡを翻訳ターミネーターとして任意で選んだ。その後、偏ったコドン使用頻度を、ＯｐｔＧｅｎｅ（商標）遺伝子設計プログラム（Ｏｃｉｍｕｍ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＬＬＣ、インディアナ州Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）によって使用するための特殊な遺伝暗号表に入力した。
二重に突然変異したＥＰＳＰＳタンパク質をコードしているダイズに最適化されたＤＮＡ配列を誘導するために、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４７３７号からの配列番号２１のタンパク質配列を、ＯｐｔＧｅｎｅ（商標）プログラムによって、上記で誘導したダイズに偏った遺伝暗号を使用して逆翻訳した。その後、そのようにして誘導された初期ＤＮＡ配列を、隣接コドン間のＣＧおよびＴＡダブレットの数を低下させる、隣接コドン間のＣＴおよびＴＧダブレットの数を増加させる、高度に安定した鎖内二次構造を除去する、制限酵素認識部位を除去または付加する、ならびに操作した遺伝子の発現またはクローニング操作に有害となり得る他の配列を除去するために、（コドンの全体的な加重平均表示を保持しつつ）コドンの変化を補償することによって改変した。潜在的な植物イントロンスプライシング部位、Ａ／ＴまたはＣ／Ｇ残基の長いラン、およびＲＮＡの安定性、転写、または植物細胞におけるコード領域の翻訳を妨害し得る他のモチーフを排除するために、配列のさらなる改良を行った。長い内部オープンリーディングフレーム（＋１以外のフレーム）を排除するために他の変化を行った。これらの変化はすべて、上述のダイズに偏ったコドン組成を保持しつつ、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４７３７号の配列番号２１として開示されているアミノ酸配列を保存するという束縛内で行った。
配列番号２１のＥＰＳＰＳタンパク質をコードしているダイズに偏ったＤＮＡ配列は、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４７３７号の配列番号２２の塩基１〜１５７５として開示されている。ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４７３７号の配列番号２２を含むＤＮＡ断片の合成は、商業的供給業者によって行われた（ＰｉｃｏＳｃｒｉｐｔ、テキサス州Ｈｏｕｓｔｏｎ）。
発現および形質転換ベクターのクローニング
大腸菌（E. coli）ｐＥＴ発現ベクターの構築：追加のクローニングリンカーを用いて付加した部位に対応する制限酵素（Ｘｂａ １、Ｘｈｏ １）を使用して、ＡＡＤ−１２（ｖ２）をｐｉｃｏｓｃｒｉｐｔベクターから切り出し、ｐＥＴ２８０ストレプトマイシン／スペクチノマイシン抵抗性ベクター内にライゲーションした。その後、ライゲーション産物をＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌（E. coli）内に形質転換し、ルリアブロス＋５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよびスペクチノマイシン（ＬＢ Ｓ／Ｓ）寒天プレート上にプレートした。
ＡＡＤ−１２（ｖ２）：ｐＥＴ２８０とｐＣＲ２．１：ｐＥＴ２８０のライゲーションを区別するために、約２０個の単離コロニーを６ｍｌのＬＢ−Ｓ／Ｓ中に拾い、３７℃で４時間、攪拌しながら成長させた。その後、それぞれの培養物をＬＢ＋カナマイシンの５０μｇ／ｍｌのプレート上にスポットし、これを３７℃で終夜インキュベーションした。ＬＢ−Ｋ上で成長したコロニーはｐＣＲ２．１ベクターが内部にライゲーションされたと推定し、廃棄した。以前のようにプラスミドを残りの培養物から単離し、ＸｂａＩ／ＸｈｏＩによる消化を用いて正確性を確認した。最終発現構築物をｐＤＡＢ３２２２と命名した。
シュードモナス属（Pseudomonas）発現ベクターの構築：ＡＡＤ−１２（ｖ２）オープンリーディングフレームを、最初に、改変ｐＥＴ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）である「ｐＥＴ２８０ Ｓ／Ｓ」内にＸｂａＩ−ＸｈｏＩ断片としてクローニングした。生じたプラスミドｐＤＡＢ７２５を制限酵素消化およびシーケンシング反応によって確認した。ｐＤＡＢ７２５からのＡＡＤ−１２（ｖ２）オープンリーディングフレームを、シュードモナス属（Pseudomonas）発現ベクターであるｐＭＹＣ１８０３内にＸｂａＩ−ＸｈｏＩ断片として移した。陽性コロニーを制限酵素消化によって確認した。完成した構築物ｐＤＡＢ７３９をＭＢ２１７およびＭＢ３２４シュードモナス属（Pseudomonas）発現株内に形質転換した。
バイナリーベクターの完成：植物に最適化された遺伝子ＡＡＤ−１２（ｖ１）をＰｉｃｏｓｃｒｉｐｔから受け取り（遺伝子再構築設計を完了し（上記参照）、構築のためにＰｉｃｏｓｃｒｉｐｔへアウトソーシングした）、内部で配列を確認して（配列番号３）、予想された配列の改変が存在しないことを確認した。シーケンシング反応は、Ｍ１３順方向（配列番号６）およびＭ１３逆方向（配列番号７）プライマーを用いて、以前のようにＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒの「Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ」試薬を使用して実施した。配列データを分析し、結果により、植物に最適化されたＡＡＤ−１２（ｖ１）ＤＮＡ配列中に異常が存在しないことが示された。ＡＡＤ−１２（ｖ１）遺伝子をｐＤＡＢ７２６内にＮｃｏ Ｉ−Ｓａｃ Ｉ断片としてクローニングした。生じた構築物を、［ＡｔＵｂｉ１０プロモーター：Ｎｔ ＯＳＭ５’ＵＴＲ：ＡＡＤ−１２（ｖ１）：Ｎｔ ＯＳＭ３’ＵＴＲ：ＯＲＦ１ポリＡ ３’ＵＴＲ］を含有するｐＤＡＢ７２３と命名した（ＰｖｕＩＩおよびＮｏｔ Ｉ制限消化を用いて確認）。その後、記載したカセットを含有するＮｏｔ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ断片をバイナリーベクターｐＤＡＢ３０３８のＮｏｔ Ｉ部位内にクローニングした。以下のカセット［ＡｔＵｂｉ１０プロモーター：Ｎｔ ＯＳＭ５’ＵＴＲ：ＡＡＤ−１２（ｖ１）：Ｎｔ ＯＳＭ３’ＵＴＲ：ＯＲＦ１ポリＡ ３’ＵＴＲ：ＣｓＶＭＶプロモーター：ＰＡＴ：ＯＲＦ２５／２６ ３’ＵＴＲ］を含有する、生じたバイナリーベクターｐＤＡＢ７２４を、正しい配向を確認するために制限消化した（Ｂａｍ ＨＩ、Ｎｃｏ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ、ＳａｃＩ、およびＸｍｎ Ｉを用いた）。確認された完成構築物（ｐＤＡＢ７２４）をアグロバクテリウム属（Agrobacterium）内への形質転換に使用した。
さらなる形質転換構築物のクローニング：適切な植物種内への形質転換のために作製されたすべての他の構築物は、本明細書中に既に記載した同様の手順、および他の標準の分子クローニング方法を使用して構築した（Maniatisら、1982）。
シロイヌナズナ（Arabidopsis）内への形質転換および選択
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の成長条件：野生型シロイヌナズナ（Arabidopsis）種子を０．１％のアガロース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）溶液に懸濁させた。懸濁させた種子を４℃で２日間保管し、休眠要件を完成させ、同時に起こる種子発芽（層積貯蔵）を確実にした。
Ｓｕｎｓｈｉｎｅ Ｍｉｘ ＬＰ５（Ｓｕｎ Ｇｒｏ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ、ワシントン州Ｂｅｌｌｖｕｅ）を細かいバーミキュライトで覆い、湿るまでホーグランド液をその下に通した。土壌混合物を２４時間排水させた。層積貯蔵した種子をバーミキュライト上に蒔き、湿度ドーム（ＫＯＲＤ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カナダ、オンタリオ州Ｂｒａｍａｌｅａ）で７日間覆った。
種子を発芽させ、植物をＣｏｎｖｉｒｏｎ（モデルＣＭＰ４０３０およびＣＭＰ３２４４、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ、カナダ、マニトバ州Ｗｉｎｎｉｐｅｇ）中、長日条件下（１６時間の明／８時間の暗）、１２０〜１５０μｍｏｌ／ｍ２秒の光強度、一定の温度（２２℃）および湿度（４０〜５０％）下で成長させた。植物をホーグランド液、続いて脱イオン水で水やりして、土壌が湿っているが濡れていないように保った。
アグロバクテリウム属（Agrobacterium）の形質転換：画線したＤＨ５αコロニーを含有する、エリスロマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）（２００ｍｇ／Ｌ）またはスペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ＋寒天プレートを使用して、４ｍｌのｍｉｎｉ ｐｒｅｐ培養液（液体ＬＢ＋エリスロマイシン）を接種するためのコロニーを提供した。培養物を終夜、３７℃で、常に攪拌しながらインキュベーションした。製造者の指示に従って行ったＱｉａｇｅｎ（カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐｓを使用してプラスミドＤＮＡを精製した。
電気コンピテントなアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（株Ｚ７０７、ＥＨＡ１０１、およびＬＢＡ４４０４）細胞を、WeigelおよびGlazebrook (2002)からのプロトコルを使用して調製した。コンピテントなアグロバクテリウム属（Agrobacterium）細胞を、WeigelおよびGlazebrook (2002)から適応させた電気穿孔方法を使用して形質転換した。５０μｌのコンピテントなａｇｒｏ細胞を氷上で解凍し、１０〜２５ｎｇの所望のプラスミドを細胞に加えた。ＤＮＡおよび細胞の混合物を事前に冷やした電気穿孔キュベット（２ｍｍ）に加えた。エッペンドルフ電気穿孔器２５１０を形質転換のために以下の条件で使用した：電圧：２．４ｋＶ、パルス長さ：５ｍｓｅｃ。
電気穿孔後、１ｍｌのＹＥＰブロス（１リットルあたり：１０ｇの酵母抽出物、１０ｇのバクトペプトン、５ｇのＮａＣｌ）をキュベットに加え、細胞−ＹＥＰの懸濁液を１５ｍｌの培養チューブに移した。細胞を２８℃、水浴中で、常に攪拌しながら４時間インキュベーションした。インキュベーション後、培養物をエリスロマイシン（２００ｍｇ／Ｌ）またはスペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）（２５０ｍｇ／Ｌ）を含むＹＥＰ＋寒天上にプレートした。プレートを２〜４日間、２８℃でインキュベーションした。
コロニーを選択し、エリスロマイシン（２００ｍｇ／Ｌ）またはスペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびストレプトマイシン（２５０ｍｇ／Ｌ）を含む新鮮なＹＥＰ＋寒天のプレート上に画線し、２８℃で１〜３日間インキュベーションした。ベクター特異的プライマーを使用することによって遺伝子挿入物の存在を確認するために、コロニーをＰＣＲ分析のために選択した。以下の例外を用いて、製造者の指示に従って行ったＱｉａｇｅｎ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐｓを使用して、選択されたアグロバクテリウム属（Agrobacterium）コロニーからプラスミドＤＮＡを精製した：１５ｍｌの終夜ｍｉｎｉ ｐｒｅｐ培養物（液体ＹＥＰ＋エリスロマイシン（２００ｍｇ／Ｌ）またはスペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ））およびストレプトマイシン（２５０ｍｇ／Ｌ））の４ｍｌのアリコートをＤＮＡ精製に使用した。Ｑｉａｇｅｎ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ ＤＮＡを使用することの代替方法は、１０μｌの水に懸濁させた、形質転換したアグロバクテリウム属（Agrobacterium）細胞を１００℃で５分間溶解することであった。アグロバクテリウム属（Agrobacterium）の形質転換で使用したバイナリーベクターからのプラスミドＤＮＡを対照として含めた。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．（ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを０．５×濃度で製造者の指示に従って使用して完了した。ＰＣＲ反応は、以下の条件でプログラミングしたＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｅｌｔｉｅｒサーマルサイクラーで実施した：１）９４℃で３分間、２）９４℃で４５秒間、３）５５℃で３０秒間、４）７２℃で１分間を２９サイクル、その後、７２℃で１０分間を１サイクル。サイクリング後は反応を４℃に維持した。増幅を１％アガロースゲル電気泳動によって分析し、臭化エチジウム染色によって可視化した。そのＰＣＲ産物がプラスミド対照と同一であったコロニーを選択した。
シロイヌナズナ（Arabidopsis）の形質転換：フローラルディップ方法を使用してシロイヌナズナ（Arabidopsis）を形質転換した。選択したコロニーを使用して、１つまたは複数の１５〜３０ｍｌの、エリスロマイシン（２００ｍｇ／Ｌ）またはスペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびストレプトマイシン（２５０ｍｇ／Ｌ）を含有するＹＥＰブロスの事前培養物を接種した。培養物を終夜、２８℃で、２２０ｒｐｍ常に攪拌しながらインキュベーションした。それぞれの事前培養物を使用して、エリスロマイシン（２００ｍｇ／Ｌ）またはスペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびストレプトマイシン（２５０ｍｇ／Ｌ）を含有するＹＥＰブロスの２つの５００ｍｌ培養物を接種し、培養物を終夜、２８℃で常に攪拌しながらインキュベーションした。その後、約８７００×ｇ、１０分間、室温で細胞をペレット化し、生じた上清を廃棄した。細胞ペレットを、１／２×ムラシゲ＆スクーグ塩／ガンボーグのＢ５ビタミン、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．０４４μＭのベンジルアミノプリン（１０μｌ／リットルの、ＤＭＳＯ中に１ｍｇ／ｍｌのストック）および３００μｌ／リットルのＳｉｌｗｅｔ Ｌ−７７を含有する５００ｍｌの浸潤培地に穏やかに再懸濁させた。約１カ月齢の植物を培地に１５秒間浸漬し、最も新しい花序を確実に浸した。その後、植物を横にして置き、２４時間覆い（透明または不透明）、その後、水で洗浄し、直立させた。植物を２２℃、１６時間の明／８時間の暗の光周期を用いて成長させた。浸漬の約４週間後、種子を収穫した。
形質転換した植物の選択：新鮮に収穫したＴ１種子［ＡＡＤ−１２（ｖ１）遺伝子］を７日間、室温で乾燥させた。Ｔ１種子を２６．５×５１ｃｍの発芽トレイ（Ｔ．Ｏ．Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、ミネソタ州Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ）内に蒔き、それぞれに、事前に４０ｍｌの０．１％のアガロース溶液に懸濁させ、休眠要件を完全にし、同時に起こる種子発芽を確実にするために４℃で２日間保管した層積貯蔵したＴ１種子（約１０，０００個の種子）の２００ｍｇアリコートを入れた。
Ｓｕｎｓｈｉｎｅ Ｍｉｘ ＬＰ５（Ｓｕｎ Ｇｒｏ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｃ．、ワシントン州Ｂｅｌｌｖｕｅ）を細かいバーミキュライトで覆い、湿るまでホーグランド液をその下に通し、その後、重力によって排水させた。層積貯蔵した種子のそれぞれの４０ｍｌアリコートをバーミキュライト上にピペットで均等に蒔き、湿度ドーム（ＫＯＲＤ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カナダ、オンタリオ州Ｂｒａｍａｌｅａ）で４〜５日間覆った。グルホシネートの出芽後噴霧を使用した最初の形質転換体選択（同時形質転換したＰＡＴ遺伝子の選択）の１日前にドームを取り外した。
植えつけの７日後（ＤＡＰ）および１１ＤＡＰに再度、Ｔ１植物（それぞれ子葉および２−４−１ｆ段階）に、０．２％溶液のＬｉｂｅｒｔｙ除草剤（２００ｇ ａｉ／Ｌのグルホシネート、Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ミズーリ州Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ）を、１０ｍｌ／トレイ（７０３Ｌ／ｈａ）の噴霧体積で、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ圧縮空気噴霧チップを使用して噴霧して、有効量の２８０ｇ ａｉ／ｈａのグルホシネート／施用を送達した。生存者（活発に成長している植物）を最終噴霧の４〜７日後に同定し、鉢植え培地（Ｍｅｔｒｏ Ｍｉｘ ３６０）で調製した３インチの鉢に個別に移植した。移植した植物を湿度ドームで３〜４日間覆い、以前のように２２℃の成長チャンバに入れたか、または温室に直接移動させた。続いて、ドームを取り外し、ＡＡＤ−１２（ｖ１）（植物に最適化された遺伝子）がフェノキシオーキシン除草剤抵抗性をもたらす能力について試験する少なくとも１日前に、植物を温室で栽培した（２２±５℃、５０±３０％のＲＨ、１４時間の明：１０時間の暗、最低５００μＥ／ｍ２ｓ１の自然光＋補助光）。
その後、Ｔ１植物を様々な量の２，４−Ｄにランダムに割り当てた。シロイヌナズナ（Arabidopsis）では、５０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄが、感受性植物を有意義なレベルの抵抗性を有するものから識別するために有効な量である。また、抵抗性の相対的レベルを決定するために、増加した量も施用した（５０、２００、８００、または３２００ｇ ａｅ／ｈａ）。
すべてのオーキシン除草剤施用は、上述のＤｅＶｉｌｂｉｓｓ噴霧器を使用して７０３Ｌ／ｈａの噴霧体積（０．４ｍｌの溶液／３インチの鉢）を施用したか、またはトラック噴霧器によって１８７Ｌ／ｈａの噴霧体積で施用した。使用した２，４−Ｄは、ＤＭＳＯに溶かし、水で希釈した（１％未満のＤＭＳＯの最終濃度）技術グレード（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、または市販のジメチルアミン塩配合物（４５６ｇ ａｅ／Ｌ、ＮｕＦａｒｍ、ミズーリ州Ｓｔ Ｊｏｓｅｐｈ）のどちらかであった。使用したジクロルプロップは、Ｒ−ジクロルプロップのカリウム塩（６００ｇ ａｉ／Ｌ、ＡＨ Ｍａｒｋｓ）として配合された市販グレードであった。除草剤量が８００ｇ ａｅ／ｈａを超えて増加することに伴って、噴霧溶液のｐＨが過剰に酸性となり、若く柔らかいシロイヌナズナ（Arabidopsis）植物の葉を熱傷させ、除草剤の一次効果の評価を複雑にした。これらの多量の２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５中除草剤を施用することが標準の実施となった。
一部のＴ１個体を、フェノキシオーキシンの代わりに代替の市販の除草剤に供した。１つの関心は、ピリジルオキシ酢酸オーキシン除草剤であるトリクロピルおよびフルオロキシピルが植物体中で有効に分解されることができるかどうかを決定することであった。除草剤をＴ１植物にトラック噴霧器（sparyer）を使用して１８７Ｌ／ｈａの噴霧体積で施用した。２，４−Ｄ ＤＭＡに対する耐性を示したＴ１植物をＴ２世代でさらにアクセスした。
形質転換した植物の選択の結果：最初のシロイヌナズナ（Arabidopsis）形質転換はＡＡＤ−１２（ｖ１）（植物に最適化された遺伝子）を使用して実施した。最初に、グルホシネート選択スキームを使用してＴ１形質転換体を非形質転換種子の背景から選択した。３００，０００個を超えるＴ１種子をスクリーニングし、３１６個のグルホシネート抵抗性植物が同定され（ＰＡＴ遺伝子）、これは、０．１０％の形質転換／選択頻度に等しく、ＰＡＴ＋Ｌｉｂｅｒｔｙを選択に使用する場合の構築物の選択頻度の正常範囲内にある。続いて、上記選択されたＴ１植物を個々の鉢に移植し、様々な量の市販のアリールオキシアルカノエート除草剤を噴霧した。
表７は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）Ｔ１形質転換体に２，４−Ｄに対する抵抗性を与える、ＡＡＤ−１２（ｖ１）および対照遺伝子の応答を比較する。応答は％視覚的損傷２ＷＡＴに関して表す。データは、わずかな損傷もしくは損傷なし（２０％未満）、中等度の損傷（２０〜４０％）、または重度の損傷（４０％超）を示す個体のヒストグラムとして提示されている。それぞれのＴ１は独立した形質転換事象であるため、所定の割合内での個々のＴ１応答の顕著な変動を予測することができる。算術平均および標準偏差をそれぞれの処理について提示する。また、個々の応答の範囲も、それぞれの量および形質転換について最終列に示す。ＰＡＴ／Ｃｒｙ１Ｆで形質転換したシロイヌナズナ（Arabidopsis）がオーキシン感受性の形質転換対照として役割を果たした。ＡＡＤ−１２（ｖ１）遺伝子は、個々のＴ１シロイヌナズナ（Arabidopsis）植物に除草剤に対する抵抗性を与えた。所定の処理内で植物応答のレベルは大きく変動し、これはそれぞれの植物が独立した形質転換事象を表すことに起因する可能性がある。
重要なことに、試験したそれぞれの２，４−Ｄ量において、影響を受けなかった個体が存在していた一方で、一部は重度に影響を受けていた。単にＡＡＤ−１２で形質転換した植物（ｖ１）対野生型またはＰＡＴ／Ｃｒｙ１Ｆで形質転換した対照間の有意差を実証するために、量毎の全体的な集団損傷平均を表７中に表す。３，２００ｇ ａｅ／ｈａまでの上昇した量（または約６×圃場量まで）で、損傷レベルはより高く、未損傷植物の頻度はより低い傾向にあった。また、これらの高い量では、噴霧溶液は緩衝しない限りは高度に酸性となる。成長チャンバ内でほとんど成長したシロイヌナズナ（Arabidopsis）は非常に薄いクチクラを有しており、重度の熱傷効果がこれらの上昇した量での試験を複雑にする可能性がある。それにもかかわらず、多くの個体が３，２００ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄでわずかな損傷もしくは損傷なしで生き延びた。
表８は、同様に実施した、フェノキシプロピオン酸、ジクロルプロップに対するＴ１シロイヌナズナ（Arabidopsis）の用量応答を示す。データは、除草性が活性である（Ｒ−）ジクロルプロップ異性体がＡＡＤ−１２（ｖ１）の適切な基質として役割を果たさないことを示している。ＡＡＤ−１が、商業的に許容される耐性を与えるほど十分にＲ−ジクロルプロップを代謝することは、２つの遺伝子を隔てる１つの識別特徴である。（表８）。ＡＡＤ−１およびＡＡＤ−１２は、それぞれＲおよびＳ特異的α−ケトグルタル酸ジオキシゲナーゼとみなされている。
選択可能マーカーとしてのＡＡＤ−１２（ｖ１）：２，４−Ｄを選択剤として使用し、ＡＡＤ−１２（ｖ１）を選択可能マーカーとして使用する能力を、上述のように形質転換したシロイヌナズナ（Arabidopsis）において最初に分析した。約５０個のＴ４世代シロイヌナズナ（Arabidopsis）種子（ＡＡＤ−１２（ｖ１）についてホモ接合性）を約５，０００個の野生型（感受性）種子中にスパイクした。いくつかの処理を比較し、それぞれの植物のトレイは、以下の処理スキームのうちの１つの、２，４−Ｄの１回または２回の施用タイミングのいずれかを受けた：７ＤＡＰ、１１ＤＡＰ、または７、次いで１１ＤＡＰ。すべての個体は同じ形質転換ベクター中にＰＡＴ遺伝子も含有していたため、２，４−Ｄで選択したＡＡＤ−１２をグルホシネートで選択したＰＡＴと直接比較することができた。
処理は、既に記載したようにＤｅＶｉｌｂｉｓｓ噴霧チップを用いて施用した。植物を１７ＤＡＰに抵抗性または感受性として同定した。最適処理は、植えつけの７および１１日後（ＤＡＰ）に施用した７５ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄであり、選択頻度において等しく有効であり、形質転換した個体に対する除草性損傷がＬｉｂｅｒｔｙ選択スキームよりも低かった。これらの結果は、ＡＡＤ−１２（ｖ１）を形質転換したシロイヌナズナ（Arabidopsis）の集団の代替選択可能マーカーとして有効に使用できることを示している。
遺伝率：様々なＴ１事象を自家受粉させてＴ２種子を生成した。２，４−Ｄ（２００ｇ ａｅ／ｈａ）を１００個のランダムなＴ２同胞に施用することによってこれらの種子を後代検定した。それぞれの個々のＴ２植物を、噴霧施用（１８７Ｌ／ｈａの施用量でトラック噴霧器）の前に７．５ｃｍの四角い鉢に移植した。カイ二乗分析によって決定して（Ｐ＞０．０５）、Ｔ１ファミリーの７５パーセント（Ｔ２植物）が、メンデル遺伝を有する優性遺伝の単一座位について予測された抵抗性３：感受性１のモデルで分離された。
１２〜２０個のＴ２個体から種子を採取した（Ｔ３種子）。８個のランダムに選択されたＴ２ファミリーのそれぞれからの２５個のＴ３同胞を、既に記載したように後代検定した。ホモ接合性であると予測されたＴ２ファミリー（非分離集団）の約３分の１がそれぞれの系統において同定された。これらのデータは、ＡＡＤ−１２（ｖ１）が安定に組み込まれ、メンデル様式で少なくとも３世代まで遺伝性であることを示している。
ＡＡＤ−１２シロイヌナズナ（Arabidopsis）における追加の葉面散布の除草剤抵抗性：トランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis）において他のアリールオキシアルカノエートオーキシン除草剤に対する抵抗性をもたらすＡＡＤ−１２（ｖ１）の能力を、様々な基質の葉面散布によって決定した。Ｔ２世代シロイヌナズナ（Arabidopsis）種子を層積貯蔵し、シロイヌナズナ（Arabidopsis）のものに非常に似た選択トレイ内に蒔いた。ＰＡＴおよび昆虫抵抗性遺伝子Ｃｒｙ１Ｆを含有する、形質転換した対照系統を同様の様式で植えつけた。実生を温室内の個々の３インチの鉢に移した。すべての植物を、１８７Ｌ／ｈａに設定したトラック噴霧器を使用することで噴霧した。植物を様々な範囲のピリジルオキシ酢酸系除草剤で噴霧した：２８０〜２２４０ｇ ａｅ／ｈａのトリクロピル（Ｇａｒｌｏｎ ３Ａ、Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）および２８０〜２２４０ｇ ａｅ／ｈａのフルオロキシピル（Ｓｔａｒａｎｅ、Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、ならびにＡＡＤ−１２活性から生じる２，４−Ｄ代謝物である２，４−ジクロロフェノール（ＤＣＰ、Ｓｉｇｍａ）（２８０〜２２４０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄに等価なモル濃度、技術グレードのＤＣＰを使用）。すべての施用は水中で配合した。それぞれの処理を３〜４回繰り返した。植物を処理の３および１４日後に評価した。
２，４−Ｄ代謝物である２，４−ジクロロフェノール（ＤＣＰ）の、トランスジェニック非ＡＡＤ−１２対照シロイヌナズナ（Arabidopsis）（Ｐａｔ／Ｃｒｙ１Ｆ）に対する効果は存在しない。また、ＡＡＤ−１２で形質転換した植物は、形質転換した非抵抗性対照で見られたトリクロピルおよびフルオロキシピル除草剤損傷からも明らかに保護されていた（表９を参照）。これらの結果により、シロイヌナズナ（Arabidopsis）におけるＡＡＤ−１２（ｖ１）が試験したピリジルオキシ酢酸系オーキシンに対する抵抗性をもたらすことが確認される。これは、ピリジルオキシ酢酸系除草剤に対して顕著な活性を有する酵素の最初の報告である。同様の活性を有する他の２，４−Ｄ分解酵素は報告されていない。
ＡＡＤ−１２（ｖ１）シロイヌナズナ（Arabidopsis）の分子分析：ＰＡＴおよびＡＡＤ−１２（ｖ１）を含有する植物の形質転換単位の安定組込みを決定するために、ＰＡＴ遺伝子コピー数分析のためのＩｎｖａｄｅｒアッセイ（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ａｇｂｉｏ Ｋｉｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓの方法）を、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙキットから得られた全ＤＮＡを用いて、複数のＡＡＤ−１２（ｖ１）ホモ接合性系統に対して行った。これらの遺伝子は同じプラスミド上に含有されていたため、分析ではこれらが直接物理的連結されていることを前提とした。
結果は、アッセイしたすべての２，４−Ｄ抵抗性植物がＰＡＴ（したがって推測によってＡＡＤ−１２（ｖ１））を含有していたことを示している。コピー数分析により、挿入物の合計は１〜５個のコピーの範囲であったことが示された。このことも、酵素の存在がすべての市販のフェノキシ酢酸およびピリジルオキシ酢酸に対する顕著に高レベルの抵抗性を与えるということを示すＡＡＤ−１２（ｖ１）タンパク質発現データと相関している。
ＡＡＤ−１２（ｖ１）およびグリホサート抵抗性遺伝子の分子スタッキングを用いて形質転換したシロイヌナズナ（Arabidopsis）：推定上のグリホサート抵抗形質をコードしているｐＤＡＢ３７５９プラスミド（ＡＡＤ−１２（ｖ１）＋ＥＰＳＰＳ）を含有するＴ１シロイヌナズナ（Arabidopsis）種子を既に記載したように生成した。記載のようにＡＡＤ−１２（ｖ１）を選択可能マーカーとして使用してＴ１形質転換体を選択した。Ｔ１植物（個々に形質転換した事象）を最初の選択の試みから回収し、既に記載したように温室内の３インチの鉢に移した。３つの異なる対照シロイヌナズナ（Arabidopsis）系統も試験した：野生型Ｃｏｌｕｍｂｉａ−０、ＡＡＤ−１２（ｖ１）＋ＰＡＴ Ｔ４ホモ接合性系統（ｐＤＡＢ７２４で形質転換）、およびＰＡＴ＋Ｃｒｙ１Ｆホモ接合性系統（形質転換対照）。ｐＤＡＢ３７５９およびｐＤＡＢ７２４で形質転換した植物は、実生段階に２，４−Ｄ耐性について事前に選択した。移植の４日後、植物を、既に記載した、水中に０、２６．２５、１０５、４２０、または１６８０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサート（Ｇｌｙｐｈｏｍａｘ Ｐｌｕｓ、Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたトラック噴霧器による葉面処理のために、均等に分けた。すべての処理を５〜２０回繰り返した。植物を処理の７および１４日後に評価した。
初期抵抗性評価により、３つの対照系統の応答と比較した場合に、２，４−Ｄに対して耐性のある植物は、後にグリホサートに対して耐性であったことが示された。これらの結果は、２，４−Ｄおよびグリホサート耐性を含めた、異なる作用様式を有する２つの除草剤に対する抵抗性を植物に与えることができ、どちらの除草剤の出芽後の施用も可能にすることを示している。さらに、ＡＡＤ−１２＋２，４−Ｄは、真の抵抗性選択のための選択可能マーカーとして有効に使用された。
より広範囲の除草剤耐性を与えるためにＡＡＤ−１と遺伝子スタッキングしたＡＡＤ−１２シロイヌナズナ（Arabidopsis）：ＡＡＤ−１２（ｖ１）（ｐＤＡＢ７２４）およびＡＡＤ−１（ｖ３）（ｐＤＡＢ７２１）植物を相反交雑させ、Ｆ１種子を収集した。８個のＦ１種子を植えつけ、成長させて種子を生成させた。その後、８個のＦ１植物から組織試料を採取し、ウエスタン分析に供して両遺伝子の存在を確認した。試験した８個すべての植物がＡＡＤ−１およびＡＡＤ−１２タンパク質をどちらも発現したと結論づけられた。種子をバルクにし、植えつけの前に１週間乾燥させた。
１００個のＦ２種子を蒔き、２８０ｇ ａｉ／ｈａのグルホシネートを施用した。９６個のＦ２植物がグルホシネート選択を生き延び、グルホシネート抵抗性の２つの独立した類別座位の予想された分離比（１５Ｒ：１Ｓ）に当てはまった。その後、グルホシネート抵抗性植物を、他の試験で使用したものと同じ噴霧レジメン下で植物に施用した５６０ｇ ａｅ／ｈａのＲ−ジクロルプロップ＋５６０ｇ ａｅ／ｈａのトリクロピルで処理した。植物を３および１４ＤＡＴに等級づけした。グルホシネート選択を生き延びた９６個の植物のうちの６３個は、除草剤施用も生き延びた。これらのデータは、それぞれの遺伝子がオーキシン系除草剤のうちの一方のみ（Ｒ−ジクルロプロップ（dichlroprop）またはトリクロピルのどちらか）に対する抵抗性を与える、２つの独立した類別優性形質の予想された分離パターン（９Ｒ：６Ｓ）と一貫している。結果は、ＡＡＤ−１２（ｐＤＡＢ７２４）とＡＡＤ−１（ｐＤＡＢ７２１）とのスタッキングを成功させ、したがって目的作物に施用し得る除草剤の範囲を増加させることができる［それぞれ（２，４−Ｄ＋Ｒ−ジクロルプロップ）および（２，４−Ｄ＋フルオロキシピル＋トリクロピル）］ことを示している。２つの別々の２，４−Ｄ抵抗性遺伝子の慣用のスタッキングによって、非常に感受性の種に２，４−Ｄ耐性をもたらすために有用な可能性がある。さらに、どちらかの遺伝子を、独立した形質転換活動によって目的の第３および第４の遺伝子の選択可能マーカーとして使用した場合は、それぞれの遺伝子の対を慣用の育種活動によって一緒にし、続いて、ＡＡＤ−１およびＡＡＤ−１２酵素の間で排他的な除草剤と対にした噴霧によって、Ｆ１世代にて選択することができる（ＡＡＤ−１およびＡＡＤ−１２についてそれぞれＲ−ジクロルプロップおよびトリクロピルで示されている）。
また、他のＡＡＤスタッキングも本発明の範囲内にある。たとえば、本明細書中の他の箇所で記述したＴｆｄＡタンパク質（Streberら）を対象ＡＡＤ−１２遺伝子と一緒に使用して、本発明のトランスジェニック植物に除草剤抵抗性の範囲を与えることができる。
イマゼタピル選択を使用したトウモロコシの髭結晶媒介性の形質転換
ＡＡＤ−１２（ｖ１）のクローニング：ＡＡＤ−１２（ｖ１）遺伝子を中間ベクターｐＤＡＢ３２８３からＮｃｏ１／Ｓａｃ１断片として切り出した。これを、ＺｍＵｂｉ１単子葉植物プロモーターを含有する同様に切断したｐＤＡＢ３４０３ベクター内に一方向にライゲーションした。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して２つの断片を一緒にライゲーションし、ＤＨ５α細胞内に形質転換した。ＱｉａｇｅｎのＱＩＡ Ｓｐｉｎ ｍｉｎｉ ｐｒｅｐキットを使用して生じたコロニーのＭｉｎｉｐｒｅｐを行い、コロニーを消化して配向を確認した。この最初の中間構築物（ｐＤＡＢ４１００）はＺｍＵｂｉ１：ＡＡＤ−１２（ｖ１）カセットを含有する。この構築物をＮｏｔ１およびＰｖｕ１で消化して遺伝子カセットを開放し、所望しない主鎖を消化した。これを、コメアクチンプロモーターＯｓＡｃｔ１によって駆動されるＡＨＡＳ選択可能マーカーを含有する、Ｎｏｔ１で切断したｐＤＡＢ２２１２とライゲーションした。最終構築物をｐＤＡＢ４１０１またはｐＤＡＳ１８６３と命名し、これはＺｍＵｂｉ１／ＡＡＤ−１２（ｖ１）／ＺｍＰｅｒ５：：ＯｓＡｃｔ１／ＡＨＡＳ／ＬＺｍＬｉｐを含有する。
カルス／懸濁培養の開始：カルス培養を開始するための未成熟胚を得るために、温室で成長させたＨｉ−ＩＩ親ＡおよびＢ（Armstrongら、1991）の間のＦ１交雑を行った。胚の大きさが１．０〜１．２ｍｍとなった際（受粉後約９〜１０日）、穂を収穫し、Ｌｉｑｕｉ−Ｎｏｘ（登録商標）石ケンを用いてこすり洗いすることによって表面を滅菌し、７０％のエタノールに２〜３分間浸漬し、その後、２０％の市販の漂白剤（０．１％の次亜塩素酸ナトリウム）に３０分間浸漬した。
穂を滅菌蒸留水で濯ぎ、未成熟の接合胚を無菌的に切除し、１５Ａｇ１０培地（Ｎ６培地（Chuら、1975）、１．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、２０ｇ／Ｌのスクロース、１００ｍｇ／Ｌのカゼイン加水分解物（酵素消化）、２５ｍＭのＬ−プロリン、１０ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２．５ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅ、ｐＨ５．８）上で２〜３週間、胚盤が培地から離れた方向を向くようにして培養した。正しい形態学（Welterら、1995）を示す組織を隔週の間隔で新鮮な１５Ａｇ１０培地上に約６週間、選択的に移し、その後、４つの培地（Ｎ６培地、１．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、２０ｇ／Ｌのスクロース、１００ｍｇ／Ｌのカゼイン加水分解物（酵素消化）、６ｍＭのＬ−プロリン、２．５ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅ、ｐＨ５．８）に隔週の間隔で約２カ月移した。
胚形成の懸濁培養を開始するために、単一の胚に由来するカルス組織の約３ｍｌの充填細胞体積（ＰＣＶ）を、約３０ｍｌのＨ９ＣＰ＋液体培地（ＭＳ基底塩混合物（MurashigeおよびSkoog、1962）、１０倍少ないニコチン酸および５倍多いチアミン−ＨＣｌを含有する改変ＭＳビタミン、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、２．０ｍｇ／Ｌのα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、３０ｇ／Ｌのスクロース、２００ｍｇ／Ｌのカゼイン加水分解物（酸消化）、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、６ｍＭのＬ−プロリン、５％ｖ／ｖのココナツ水（継代培養の直前に加える）、ｐＨ６．０）に加えた。懸濁培養を暗条件下、１２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で、１２５ｒｐｍ、２８℃に設定した温度制御された振盪器にて維持した。細胞系は、典型的には開始の２〜３カ月以内に確立された。確立中、広口径のピペットを使用して３ｍｌ ＰＣＶの細胞および７ｍｌの馴化培地を２０ｍｌの新鮮なＨ９ＣＰ＋液体培地に加えることによって、懸濁液を３．５日間毎に継代培養した。組織の成長が倍化し始めた時点で、懸濁液をスケールアップし、１２ｍｌ ＰＣＶの細胞および２８ｍｌの馴化培地を８０ｍｌのＨ９ＣＰ＋培地内に移すことによって５００ｍｌのフラスコ中で維持した。懸濁液が完全に確立された後、将来使用するためにこれらを凍結保存した。
懸濁液の冷凍保存および解凍：継代培養の２日後、４ｍｌ ＰＣＶの懸濁細胞および４ｍｌの馴化培地を８ｍｌの凍結保護剤（ココナツ水なしのＨ９ＣＰ＋培地、１Ｍのグリセロール、１ＭのＤＭＳＯ、２Ｍのスクロースに溶解、濾過滅菌）に加え、１２５ｒｐｍ、４℃で１時間、１２５ｍｌのフラスコ中で振盪した。１時間後、４．５ｍｌを冷却した５．０ｍｌのＣｏｒｎｉｎｇクリオバイアルに加えた。充填後、個々のバイアルを１５分間、４℃で制御された冷却速度の冷凍庫内に保ち、その後、最終温度−４０℃に達するまで−０．５℃／分間の速度で凍らせた。最終温度に達した後、バイアルを、液体窒素蒸気を満たしたＣｒｙｏｐｌｕｓ ４貯蔵ユニット（Ｆｏｒｍ ａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内のラック内の箱に移した。
解凍には、バイアルを貯蔵ユニットから取り出し、密閉したドライアイス容器内に入れ、「沸騰」が弱まるまで４０〜４５℃に保った水浴内に沈めた。解凍後、内容物を、蓋をした１００×２５ｍｍのペトリ皿内の、約８枚の滅菌した７０ｍｍのＷｈａｔｍａｎ濾紙（Ｎｏ．４）を重ねたもの上に注いだ。液体を数分間濾紙に吸収させ、その後、細胞を含有する一番上の濾紙をＧＮ６培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌのスクロース、２．５ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅ、ｐＨ５．８）上に１週間移した。１週間後、有望な形態学を有する組織のみを濾紙から取り除いて新鮮なＧＮ６培地上に直接移した。１〜３グラムが懸濁培養の開始に利用可能となるまで、この組織を、約３０ｍｌのＨ９ＣＰ＋培地内、１２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で７〜１４日毎に継代培養した。合計１２ｍｌ ＰＣＶが得られるまで、３ミリリットルＰＣＶを３．５日毎に新鮮なＨ９ＣＰ＋培地内に継代培養し、この時点で、継代培養を既に記載したように行った。
安定形質転換：形質転換の約２４時間前、１２ｍｌ ＰＣＶの以前に凍結保存した胚形成トウモロコシ懸濁細胞＋２８ｍｌの馴化培地を８０ｍｌのＧＮ６液体培地（Ｇｅｌｒｉｔｅを欠くＧＮ６培地）内、５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で継代培養し、１２５ｒｐｍ、２８℃の振盪器上に置いた。合計３６ｍｌ ＰＣＶが３つのフラスコにわたって分配されるように、同じ細胞系を使用してこれを２回繰り返した。２４時間後、ＧＮ６液体培地を除去し、細胞を原形質分離させるために、フラスコ１個あたり７２ｍｌのＧＮ６ Ｓ／Ｍ浸透圧培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌのスクロース、４５．５ｇ／Ｌのソルビトール、４５．５ｇ／Ｌのマンニトール、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、ｐＨ６．０）で置き換えた。フラスコを振盪器上に置き、１２５ＲＰＭ、暗所で３０〜３５分間、２８℃で振盪し、この間に、適切な体積である８．１ｍｌのＧＮ６ Ｓ／Ｍ液体培地を、約４０５ｍｇの事前にオートクレーブした無菌的な炭化ケイ素髭結晶（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．）に加えることによって、５０ｍｇ／ｍｌの炭化ケイ素髭結晶の懸濁液を調製した。
ＧＮ６ Ｓ／Ｍ中でインキュベーションした後、それぞれのフラスコの内容物を２５０ｍｌの遠心分離ボトル内にプールした。すべての細胞が底部に沈んだ後、約４４ｍｌ以外のＧＮ６ Ｓ／Ｍ液体を取り除き、将来使用するために滅菌した１Ｌフラスコに収集した。髭結晶の事前に濡らした懸濁液に６０秒間、最大速度でボルテックスをかけ、その後、８．１ｍｌをボトルに加え、これに、最後のステップとして１７０μｇのＤＮＡを加えた。ボトルをすぐに市販の塗料ミキサーである改良Ｒｅｄ Ｄｅｖｉｌ ５４００に入れ、１０秒間攪拌した。攪拌後、細胞、培地、髭結晶およびＤＮＡのカクテルを、浸透圧調節物質を減らすために１２５ｍｌの新鮮なＧＮ６液体培地と共に、１Ｌフラスコの内容物に加えた。細胞を１２５ＲＰＭ、２時間、２８℃の振盪器上で回復させた後、ハウス真空ラインに接続されたガラス製の細胞収集器ユニットを使用してＷｈａｔｍａｎ＃４濾紙（５．５ｃｍ）上に濾過した。
真空を引きながら約２ｍｌの分散懸濁液を濾紙の表面上にピペットで置いた。濾紙をＧＮ６培地の６０×２０ｍｍのプレート上に置いた。プレートを１週間、２８℃、暗箱中で培養した。
１週間後、濾紙をＧＮ６（３Ｐ）培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌのスクロース、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、３μＭのＰｕｒｓｕｉｔ（登録商標）ＤＧのイマゼタピル、２．５ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅ、ｐＨ５．８）の６０×２０ｍｍのプレートに移した。プレートを箱に入れ、さらに１週間培養した。
形質転換の２週間後、プレート上のすべての細胞を、３μＭのＰｕｒｓｕｉｔ（登録商標）ＤＧのイマゼタピルを含有する、３．０ｍｌの融解ＧＮ６アガロース培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌのスクロース、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、７ｇ／ＬのＳｅａ Ｐｌａｑｕｅアガロース、ｐＨ５．８、１２１℃で１０分間のみオートクレーブ）上に掻き出すことによって、組織を包埋した。組織を砕き、３ｍｌのアガロースおよび組織をＧＮ６の１００×１５ｍｍのプレート（３Ｐ）の表面上に均等に注いだ。これを残りのすべてのプレートについて繰り返した。包埋後プレートをＮｅｓｃｏｆｉｌｍ（登録商標）またはＰａｒａｆｉｌｍ Ｍ（登録商標）で個別に密封し、その後、推定上の単離体が表れるまで培養した。
単離体の回収および再生のプロトコル：形質転換の約９週間後に、推定上形質転換した事象を６０×２０ｍｍのプレート中の同じ濃度の新鮮な選択培地に移すことによって、Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標）含有包埋プレートから単離除去した。約２〜３週間後に成長の維持が明白である場合は、事象は抵抗性であるとみなされ、分子分析に供した。
再生は、カルス組織を、３μＭのＰｕｒｓｕｉｔ（登録商標）ＤＧのイマゼタピル、ＭＳ塩およびビタミン、３０．０ｇ／Ｌのスクロース、５ｍｇ／ＬのＢＡＰ、０．２５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、２．５ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅ、ｐＨ５．７を含有する、サイトカイニンに基づく誘導培地である２８（３Ｐ）に移すことによって開始した。細胞を低光（１３μＥｍ−２ｓ−１）で１週間、その後、より強い光（４０μＥｍ−２ｓ−１）でさらに１週間成長させた後、植物成長調節物質を欠く以外は２８（３Ｐ）と同一である再生培地３６（３Ｐ）に移した。小さな（３〜５ｃｍ）小植物を取り出し、無選択ＳＨＧＡ培地（SchenkおよびHildebrandt basal salts and vitamins、1972、１ｇ／Ｌのミオイノシトール、１０ｇ／Ｌのスクロース、２．０ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅ、ｐＨ５．８）を含有する１５０×２５ｍｍの培養チューブ内に入れた。小植物が十分な根および苗条系を発生した後、これらを温室内の土壌に移した。
４つの実験から、苗条および根からなる完全な小植物が、伝統的なカルス期を経験せずにｉｎ ｖｉｔｒｏにて包埋選択プレート上、暗条件下で形成された。これらの「初期再生体」のうちの９個からの葉組織を、それぞれＡＡＤ−１２遺伝子および遺伝子カセットについてコード領域ＰＣＲおよび植物転写単位（ＰＴＵ）ＰＣＲに供した。すべてがインタクトなＡＡＤ−１２コード領域を有していた一方で、３個が完全長ＰＴＵを有していなかった（表１１）。これらの「初期再生体」は、「１２８３」事象と識別した伝統的に誘導した事象と区別するために、４１０１事象として識別した。標準の選択および再生によって得られた１９個の追加の事象からの植物を温室に送り、成熟するまで成長させ、専有自殖系統と他家受粉させてＴ１種子を生成した。サザンブロット後の類似したバンドパターンにより、一部の事象は互いのクローンであると考えられるため、１４個のユニークな事象のみが表されている。事象からのＴ０植物は７０ｇ／ｈａのイマゼタピルに対して耐性であった。Ｉｎｖａｄｅｒ分析（ＡＨＡＳ遺伝子）により、１個から１０個超のコピーの範囲の挿入複雑度が示された。１３個の事象がＡＡＤ−１２の競合（compete）コード領域を含有していたが、さらなる分析により、９個の事象で完全な植物の形質転換単位が取り込まれていなかったことが示された。傷つけられた（compromised）１８６３事象はいずれもＴ１段階を超えて進まず、さらなる特徴づけでは４１０１事象を利用した。
分子分析−トウモロコシの材料および方法：組織収穫、ＤＮＡの単離および定量。新鮮な組織をチューブに入れ、４℃で２日間凍結乾燥する。組織が完全に乾燥した後、タングステンビーズ（Ｖａｌｅｎｉｔｅ）をチューブ内に入れ、試料を、Ｋｅｌｃｏビーズミルを使用した１分間の乾式粉砕に供する。次いで、標準のＤＮｅａｓｙ ＤＮＡ単離手順を行う（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙ ６９１０９）。その後、抽出されたＤＮＡのアリコートをＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐ７５８９）で染色し、既知の標準物質を用いて蛍光光度計（ＢｉｏＴｅｋ）で読み取って、濃度をｎｇ／μｌで得る。
Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ分析：ＤＮＡ試料を２０ｎｇ／μｌに希釈し、その後、９５℃で１０分間のサーモサイクラー内でのインキュベーションによって変性させる。その後、提供されたオリゴ混合物およびＭｇＣｌ２（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してシグナルプローブ混合物を調製する。７．５μｌのアリコート、次いで７．５μｌの対照、標準物質、および２０ｎｇ／μｌの希釈した未知の試料のアリコートを、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイプレートの各ウェルに入れる。各ウェルに１５μｌの鉱物油（Ｓｉｇｍａ）を載せる。その後、プレートを６３℃で１時間インキュベーションし、蛍光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ）で読み取る。標的プローブのバックグラウンドを超える％シグナルを、バックグラウンド内部対照プローブを超える％シグナルで除算する計算により比が計算される。サザンブロット分析によって展開および妥当性確認された既知のコピー数の標準物質の比を使用して、未知の事象の推定コピー数を同定する。
ポリメラーゼ連鎖反応：合計１００ｎｇの全ＤＮＡを鋳型として使用する。２０ｍＭのそれぞれのプライマーをＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ ＰＣＲポリメラーゼキット（Ｍｉｒｕｓ ＴＡＫＲＲ００１Ａ）と共に使用する。ＡＡＤ−１２（ｖ１）ＰＴＵのプライマーは、順方向−ＧＡＡＣＡＧＴＴＡＧ ＡＣＡＴＧＧＴＣＴＡ ＡＡＧＧ（配列番号８）および逆方向−ＧＣＴＧＣＡＡＣＡＣ ＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣ ＣＡＡＣＴＧＧ（配列番号９）である。ＰＣＲ反応は、９７００ Ｇｅｎｅａｍｐサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で、試料を９４℃で３分間、３５サイクルの９４℃で３０秒間と６３℃で３０秒間と７２℃で１分４５秒間、次いで７２℃で１０分間に供することによって実施する。
ＡＡＤ−１２（ｖ１）コード領域ＰＣＲのプライマーは、順方向−ＡＴＧＧＣＴＣＡＧＡ ＣＣＡＣＴＣＴＣＣＡ ＡＡ（配列番号１０）および逆方向−ＡＧＣＴＧＣＡＴＣＣ ＡＴＧＣＣＡＧＧＧＡ（配列番号１１）である。ＰＣＲ反応は、９７００ Ｇｅｎｅａｍｐサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で、試料を９４℃で３分間、３５サイクルの９４℃で３０秒間と６５℃で３０秒間と７２℃で１分４５秒間、次いで７２℃で１０分間に供することによって実施する。ＰＣＲ産物は、ＥｔＢｒで染色した１％アガロースゲル上の電気泳動によって分析する。
サザンブロット分析：サザンブロット分析は、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙキットから得たゲノムＤＮＡを用いて行う。合計２μｇのゲノム葉ＤＮＡまたは１０μｇのゲノムカルスＤＮＡを、ＢＳＭ ＩおよびＳＷＡ Ｉ制限酵素を使用した終夜の消化に供して、ＰＴＵデータを得る。
終夜の消化後、約１００ｎｇのアリコートを１％のゲル上に流して完全な消化を保証する。この確信後、試料を大きな０．８５％アガロースゲル上に終夜、４０ボルトで流す。その後、ゲルを０．２ＭのＮａＯＨ、０．６ＭのＮａＣｌ中で３０分間変性させる。その後、ゲルを０．５ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、１．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５中で３０分間中和する。その後、２０×ＳＳＣを含有するゲル装置を設定して、重力によるゲルからナイロン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＩＮＹＣ０００１０）への終夜の転写を得る。終夜の転写の後、架橋結合剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＵＶ ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ １８００）を介して１２００×１００マイクロジュールで膜をＵＶ光に供する。その後、膜を０．１％のＳＤＳ、０．１ ＳＳＣで４５分間洗浄する。４５分間の洗浄後、膜を３時間、８０℃でベーキングし、その後、ハイブリダイゼーション時まで４℃で保管する。ハイブリダイゼーション鋳型断片は、プラスミドＤＮＡを使用した上記コード領域ＰＣＲを使用して調製する。生成物を１％アガロースゲル上に流し、切り取り、その後、Ｑｉａｇｅｎ（２８７０６）ゲル抽出手順を使用してゲル抽出する。その後、膜を、Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｈｙｂ緩衝液（Ｓｉｇｍａ Ｈ７０３３）中、６０℃ステップで１時間のプレハイブリダイゼーションに供する。Ｐｒｉｍｅ ｉｔ ＲｍＴ ｄＣＴＰ標識反応（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ３００３９２）手順を使用して、ｐ３２に基づくプローブ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を展開させる。Ｐｒｏｂｅ Ｑｕａｎｔを使用してプローブをクリーンアップする。Ｇ５０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ２７−５３３５−０１）。２００万ＣＰＭを使用してサザンブロットを終夜ハイブリダイズさせる。終夜のハイブリダイゼーションの後、ブロットを６５℃、０．１％のＳＤＳ、０．１ ＳＳＣ中での２回の２０分間の洗浄に供する。その後、−８０℃でインキュベーションしながらブロットを終夜フィルムに露光させる。
ＡＡＤ−１２で形質転換したＴ０トウモロコシにおける出芽後除草剤耐性：４個のＴ０事象を温室内で気候順化させ、２〜４枚の新しい正常に見える葉が輪生から出芽するまで（すなわち、植物が組織培養物から温室成長の条件へと移行するまで）成長させた。植物を２７℃、１６時間の明：８時間の暗条件下、温室内で成長させた。その後、植物をＰｕｒｓｕｉｔ（登録商標）（イマゼタピル）または２，４−Ｄアミン４のどちらかの市販の配合物で処理した。Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標）は、試験した事象内に存在する選択可能マーカー遺伝子の機能を実証するために噴霧した。除草剤施用は、トラック噴霧器を用いて、１８７Ｌ／ｈａの噴霧体積、５０ｃｍの噴霧高で行った。植物に、致死的用量のイマゼタピル（７０ｇ ａｅ／ｈａ）または非形質転換トウモロコシ系統に顕著な損傷を与えることができる２，４−Ｄ ＤＭＡ塩の量（２２４０ｇ ａｅ／ｈａ）のどちらかで噴霧した。致死的用量とは、Ｈｉ−ＩＩ自殖系に９５％超の損傷を与える量として定義される。Ｈｉ−ＩＩは本発明の形質転換体の遺伝的背景である。
いくつかの個体に、それぞれの遺伝子が抵抗性を提供する除草剤からの緩和剤処理を行った。しかし、事象「００１」からの個々のクローン「００１」（すなわち４１０１（０）−００１−００１）は、軽微な損傷を受けたが、１４ＤＡＴまでに回復した。４個の事象のうちの３個を次に進め、個体を５ＸＨ７５１と交雑させ、次世代とした。それぞれの除草剤耐性植物は、それぞれ２，４−Ｄおよびイマゼタピル耐性植物について、ＡＡＤ−１２コード領域の存在（ＰＣＲアッセイ）またはＡＨＡＳ遺伝子の存在（Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ）について陽性であった。ＡＡＤ−１２タンパク質は、インタクトなコード領域を含有するすべての２，４−Ｄ耐性Ｔ０植物の事象において検出された。導入遺伝子のコピー数（ＡＨＡＳ、および推測によってＡＡＤ−１２）は１から１５個までのコピーで顕著に変動した。個々のＴ０植物を成熟するまで成長させ、専有自殖系統と他家受粉させてＴ１種子を生成した。
Ｔ１トウモロコシにおける高い２，４−Ｄ耐性の検証：Ｔ１ ＡＡＤ−１２（ｖ１）種子をＭｅｔｒｏ Ｍｉｘ培地を含有する３インチの鉢に植えつけ、ヌルを排除するために、２枚葉段階の時に７０ｇ ａｅ／ｈａのイマゼタピルを噴霧した。生き延びた植物を、Ｍｅｔｒｏ Ｍｉｘ培地を含有する１ガロンの鉢に移植し、以前と同じ成長条件下においた。Ｖ３〜Ｖ４段階で、植物を、１８７Ｌ／ｈａで、５６０または２２４０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ ＤＭＡのどちらかに設定されたトラック噴霧器にて噴霧した。植物を３および１４ＤＡＴに等級づけし、５ＸＨ７５１×Ｈｉ ＩＩ対照植物と比較した。支柱根損傷を識別するために０〜１０の等級づけスケール（損傷なしから極度のオーキシン損傷）を開発した。支柱根の等級づけは、２，４−Ｄ耐性を示すために１４ＤＡＴに行った。２，４−Ｄは支柱根の形成異常を引き起こし、トウモロコシにおけるオーキシン系除草剤損傷の一貫性のある指示薬である。支柱根のデータ（以下の表中に見られる）は、試験した３個の事象のうちの２個が２２４０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ ＤＭＡに対して頑強に耐性であったことを実証している。事象「ｐＤＡＢ４１０１（０）００１．００１」は明白に不安定であったが、他の２個の事象は２，４−Ｄおよび２，４−Ｄ＋イマゼタピルまたは２，４−Ｄ＋グリホサートに対して頑強に耐性であった（表１２を参照）。
トウモロコシにおけるＡＡＤ−１２（ｖ１）の遺伝率：後代検定を、５ＸＨ７５１と交雑させた７個のＡＡＤ−１２（ｖ１）Ｔ１ファミリーでも実施した。種子を上述のように３インチの鉢に植えつけた。３枚葉段階で、すべての植物に、既に記載したようにトラック噴霧器にて７０ｇ ａｅ／ｈａのイマゼタピルを噴霧した。１４ＤＡＴ後、抵抗性および感受性の植物を計数した。カイ二乗分析によって決定して、試験した６個の系統のうちの４個が単一座位の優性メンデル形質（１Ｒ：１Ｓ）として分離された。生き延びた植物に続いて２，４−Ｄを噴霧し、すべての植物が２，４−Ｄ（５６０ｇ ａｅ／ｈａ以上の量）に対して耐性であるとみなされた。ＡＡＤ−１２は、市販のハイブリッドと相反交雑させた場合に、複数の種において頑強なアリールオキシアルカノエートオーキシン抵抗性遺伝子として遺伝性である。
除草剤範囲を増加させるためのＡＡＤ−１２（ｖ１）のスタッキング：ＡＡＤ−１２（ｖ１）（ｐＤＡＢ４１０１）および優良Ｒｏｕｎｄｕｐ Ｒｅａｄｙ自殖系（ＢＥ１１４６ＲＲ）を相反交雑させ、Ｆ１種子を収集した。２つのＦ１系統からの種子を植えつけ、ヌルを排除するために、Ｖ２段階で７０ｇ ａｅ／ｈａのイマゼタピルを用いて処理した。生き延びた植物に対して、代表的なもの（reps）を分離し、１８７Ｌ／ｈａに較正したトラック噴霧器にて、１１２０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ ＤＭＡ＋７０ｇ ａｅ／ｈａのイマゼタピル（ＡＨＡＳ遺伝子の存在を確認するため）または１１２０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ ＤＭＡ＋１６８０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサート（Ｒｏｕｎｄ Ｕｐ Ｒｅａｄｙ遺伝子の存在を確認するため）のどちらかで処理した。植物を３および１６ＤＡＴに等級づけした。噴霧データは、ＡＡＤ−１２（ｖ１）を、グリホサート耐性遺伝子（Ｒｏｕｎｄｕｐ ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ遺伝子など）または他の除草剤耐性遺伝子と慣習的にスタッキングして、トウモロコシに安全に施用し得る増加した範囲の除草剤を提供できることを示した。同様に、イミダゾリノン＋２，４−Ｄ＋グリホサート耐性がＦ１植物において観察され、これらの複数の導入遺伝子の分子または育種のスタッキングの組合せによる陰性の表現型は示されなかった。
ｐＤＡＢ４１０１で形質転換したトウモロコシ植物の、２，４−Ｄ、トリクロピルおよびフルオロキシピル除草剤に対する圃場耐性：圃場レベル耐性試験を、２つのＡＡＤ−１２（ｖ１）ｐＤＡＢ４１０１事象（４１０１（０）００３．Ｒ．００３．ＡＦおよび４１０１（０）００５．Ｒ００１．ＡＦ）および１つのＲｏｕｎｄｕｐ Ｒｅａｄｙ（ＲＲ）対照ハイブリッド（２Ｐ７８２）に対して、インディアナ州Ｆｏｗｌｅｒおよびミシシッピー州Ｗａｙｓｉｄｅで実施した。コーン播種機を用いて、Ｗａｙｓｉｄｅでは４０インチの列間隔、Ｆｏｗｌｅｒでは３０インチの間隔で種子を植えつけた。実験設計は完全乱塊法であり、３回の反復を行った。除草剤処理は、１１２０、２２４０および４４８０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ（ジメチルアミン塩）、８４０ｇ ａｅ／ｈａのトリクロピル、２８０ｇ ａｅ／ｈａのフルオロキシピル、ならびに未処理の対照であった。ＡＡＤ−１２（ｖ１）事象は、ＡＨＡＳ遺伝子を選択可能マーカーとして含有していた。ヌル植物を除去するためにＡＡＤ−１２（ｖ１）植物が７０ｇ ａｅ／ｈａのイマゼタピルで処理されるように、Ｆ２トウモロコシ事象を分離した。除草剤処理は、トウモロコシがＶ６段階に達した際に、１８７Ｌ／ｈａの担体体積を１３０〜２００ｋｐａの圧力で送達する圧縮空気背負い式噴霧器を使用して施用した。視覚的損傷の評定を処理の７、１４および２１日後に行った。支柱根損傷の評定を２８ＤＡＴに０〜１０のスケールで行い、０〜１はわずかな支柱根融合であり、１〜３は中等度の支柱根の腫脹／遊走（wandering）および根増殖であり、３〜５は中等度の支柱根融合であり、５〜９は重度の支柱根の融合および形成異常であり、１０は支柱根の完全な阻害である。
処理の１４日後での、２，４−Ｄ、トリクロピル、およびフルオロキシピルに対するＡＡＤ−１２（ｖ１）事象の応答を表１４中に示す。作物被害は１４ＤＡＴに最も重度であった。ＲＲ対照トウモロコシ（２Ｐ７８２）は、通常の圃場使用量の８倍（８×）である４４８０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄによって重度の損傷を受けた（１４ＤＡＴに４４％）。ＡＡＤ−１２（ｖ１）事象はすべて、１４ＤＡＴにおいて２，４−Ｄに対して優れた耐性を実証し、それぞれ１、２および４×量で０％の損傷であった。対照トウモロコシ（２Ｐ７８２）は、２×量のトリクロピル（８４０ｇ ａｅ／ｈａ）によって重度の損傷を受けた（１４ＤＡＴに３１％）。ＡＡＤ−１２（ｖ１）事象は、２×量のトリクロピルで耐性を実証し、１４ＤＡＴに２個の事象にわたって平均３％の損傷であった。２８０ｇ ａｅ／ｈａのフルオロキシピルは、１４ＤＡＴに野生型トウモロコシに対して１１％視覚的損傷を引き起こした。ＡＡＤ−１２（ｖ１）事象は、５ＤＡＴに平均８％の損傷を伴う増加した耐性を実証した。
Ｖ６成長段階のトウモロコシへのオーキシン系除草剤の施用は支柱根の形成異常を引き起こす可能性がある。表１５は２，４−Ｄ、トリクロピル、およびフルオロキシピルによって引き起こされる支柱根損傷の重症度を示す。８４０ｇ ａｅ／ｈａのトリクロピルが最も重度の支柱根の融合および形成異常を引き起こし、２Ｐ７８２対照型トウモロコシにおいて平均支柱根損傷スコア７をもたらした。
どちらのＡＡＤ−１２（ｖ１）トウモロコシ事象も、トリクロピル処理からの支柱根損傷を示さなかった。２Ｐ７８２トウモロコシの支柱根損傷は、増加する２，４−Ｄの量に伴って増加した。４４８０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−ＤでＡＡＤ−１２事象は支柱根損傷を示さなかった一方で、２Ｐ７８２ハイブリッドでは重度の支柱根の融合および形成異常が見られた。フルオロキシピルは野生型トウモロコシにおいて中等度の支柱根の腫脹および遊走しか引き起こさず、ＡＡＤ−１２（ｖ１）事象は支柱根損傷を示さなかった。
このデータは、ＡＡＤ−１２（ｖ１）が、トウモロコシにおいて、商業的に使用されている量を超え、非ＡＡＤ−１２（ｖ１）トウモロコシに重度の視覚的および支柱根損傷を引き起こす量の２，４−Ｄ、トリクロピルおよびフルオロキシピルに対して、高レベルの耐性を伝達することを明白に示している。
タバコの形質転換
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用いたタバコの形質転換を、公開されている方法（Horschら、1988）と同様であるが同一ではない方法によって実施した。形質転換の供給源組織を提供するために、タバコ種子（タバコ（Nicotiana tabacum）ｃｖ．ＫＹ１６０）を表面滅菌し、寒天で固化した無ホルモンムラシゲ＆スクーグ培地（MurashigeおよびSkoog、1962）であるＴＯＢ培地の表面上に植えつけた。植物を６〜８週間、点灯したインキュベーター室内、２８〜３０℃で成長させ、形質転換プロトコルで使用するために葉を無菌的に収集した。これらの葉から、中肋を除外して約１平方センチメートルの小片を無菌的に切り出した。終夜フラスコ内で２５０ｒｐｍ、２８℃に設定した振盪器上で成長させた、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）の株（ｐＤＡＢ３２７８を含有するＥＨＡ１０１Ｓ、すなわちｐＤＡＳ１５８０、ＡＡＤ−１２（ｖ１）＋ＰＡＴ）の培養物を遠心分離でペレット化し、無菌的なムラシゲ＆スクーグ塩中に再懸濁させ、６００ｎｍで０．５の最終光学密度に調節した。葉片をこの細菌懸濁液に約３０秒間浸漬し、その後、無菌的なペーパータオル上で吸い取って乾燥させ、正しい方向を上にしてＴＯＢ＋培地（１ｍｇ／Ｌのインドール酢酸および２．５ｍｇ／Ｌのベンジルアデニンを含有するムラシゲ＆スクーグ培地）上に置き、暗所、２８℃でインキュベーションした。２日後、葉片を、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム（Ａｇｒｉ−Ｂｉｏ、フロリダ州Ｎｏｒｔｈ Ｍｉａｍｉ）および５ｍｇ／Ｌのグルホシネートアンモニウム（Ｂａｓｔａ、Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ中の活性成分）を含有するＴＯＢ＋培地に移動させ、２８〜３０℃、光の中でインキュベーションした。葉片を、最初の２週間は週に２回、それ以降は週に１回、セフォタキシムおよびＢａｓｔａを含む新鮮なＴＯＢ＋培地に移動させた。葉片を細菌で処理した４〜６週間後、形質転換したフォーカスから生じた小さな植物をこの組織調製物から取り除き、Ｐｈｙｔａｔｒａｙ（商標）ＩＩ容器（Ｓｉｇｍａ）内の、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムおよび１０ｍｇ／ＬのＢａｓｔａを含有するＴＯＢ培地内に植えつけた。これらの小植物を点灯したインキュベーター室内で成長させた。３週間後、茎挿しをとり、同じ培地中に再度発根させた。植物は、さらに２〜３週間後に温室へと送り出す準備ができていた。
植物は、寒天を根から洗浄し、土壌を１３．７５ｃｍの四角い鉢に移植し、鉢をＺｉｐｌｏｃ（登録商標）バッグ（ＳＣ Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．）に入れ、バッグの底部に水道水を入れ、間接光中、３０℃の温室内に１週間置くことによって、温室内に移動させた。３〜７日後、バッグを開け、植物に肥料をやり、植物が温室に気候順化されるまで開いたバッグ内で成長させ、この時点でバッグを除去した。植物を通常の暖かい温室条件下（３０℃、１６時間の昼、８時間の夜、最低の天然光＋補助光＝５００μＥ／ｍ２ｓ１）で成長させた。
繁殖の前に、挿入物のコピー数を決定するためのＤＮＡ分析のためにＴ０植物をサンプリングした。便宜上、ＡＡＤ−１２（ｖ１）と分子的に連結させたＰＡＴ遺伝子をアッセイした。新鮮な組織をチューブに入れ、４℃で２日間凍結乾燥した。組織が完全に乾燥した後、タングステンビーズ（Ｖａｌｅｎｉｔｅ）をチューブ内に入れ、試料を、Ｋｅｌｃｏビーズミルを使用した１分間の乾式粉砕に供した。その後、標準のＤＮｅａｓｙ ＤＮＡ単離手順を行った（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙ ６９１０９）。その後、抽出されたＤＮＡのアリコートをＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐ７５８９）で染色し、既知の標準物質を用いて蛍光光度計（ＢｉｏＴｅｋ）で読み取って、濃度をｎｇ／μｌで得た。
ＤＮＡ試料を９ｎｇ／μｌに希釈し、その後、９５℃で１０分間のサーモサイクラー内でのインキュベーションによって変性させた。その後、提供されたオリゴ混合物およびＭｇＣｌ２（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してシグナルプローブ混合物を調製した。７．５μｌのアリコート、次いで７．５μｌの対照、標準物質、および２０ｎｇ／μｌの希釈した未知の試料のアリコートを、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイプレートの各ウェルに入れた。各ウェルに１５μｌの鉱物油（Ｓｉｇｍａ）を載せた。その後、プレートを６３℃で１．５時間インキュベーションし、蛍光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ）で読み取った。標的プローブのバックグラウンドを超える％シグナルを、バックグラウンド内部対照プローブを超える％シグナルで除算する計算により比が計算される。サザンブロット分析によって展開および妥当性確認された既知のコピー数の標準物質の比を使用して、未知の事象の推定コピー数を同定した。
また、同じ抽出したＤＮＡ試料を使用したＰＣＲによって、すべての事象をＡＡＤ−１２（ｖ１）遺伝子の存在についてもアッセイした。合計１００ｎｇの全ＤＮＡを鋳型として使用した。２０ｍＭのそれぞれのプライマーをＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ ＰＣＲポリメラーゼキットと共に使用した。植物転写単位（ＰＴＵ）ＰＣＲ ＡＡＤ−１２のプライマーは、（ＳｄｐａｃｏｄＦ：ＡＴＧＧＣＴＣＡＴＧ ＣＴＧＣＣＣＴＣＡＧ ＣＣ）（配列番号１２）および（ＳｄｐａｃｏｄＲ：ＣＧＧＧＣＡＧＧＣＣ ＴＡＡＣＴＣＣＡＣＣ ＡＡ）（配列番号１３）であった。ＰＣＲ反応は、９７００ Ｇｅｎｅａｍｐサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で、試料を９４℃で３分間、３５サイクルの９４℃で３０秒間と６４℃で３０秒間と７２℃で１分４５秒間、次いで７２℃で１０分間に供することによって実施した。ＰＣＲ産物は、ＥｔＢｒで染色した１％アガロースゲル上の電気泳動によって分析した。１〜３個のコピーのＰＡＴ遺伝子（および推定上はＡＡＤ−１２（ｖ１）、これらの遺伝子は物理的に連結されているため）を有する１８個のＰＣＲ陽性事象のそれぞれからの４〜１２個のクローン系統を再生させ、温室に移動させた。
ＡＡＤ−１２（ｖ１）で形質転換したＴ０タバコにおける出芽後除草剤耐性：１９個の事象のそれぞれからのＴ０植物を、高さ３〜４インチであった植物に噴霧した広範囲の２，４−Ｄ、トリクロピル、またはフルオロキシピルでチャレンジした。噴霧施用は、既に記載したように、トラック噴霧器を１８７Ｌ／ｈａの噴霧体積で使用して行った。２，４−Ｄジメチルアミン塩（Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅ Ｃｏｒｐ）を、０、１４０、５６０、または２２４０ｇ ａｅ／ｈａで、脱イオン水と混合して各事象からの代表的なクローンに施用した。フルオロキシピルは３５、１４０、または５６０ｇ ａｅ／ｈａで同様に施用した。トリクロピルは７０、２８０、または１１２０ｇ ａｅ／ｈａで施用した。それぞれの処理を１〜３回繰り返した。損傷の評定を３および１４ＤＡＴに記録した。試験したすべての事象は、２，４−Ｄに対して非形質転換対照系統ＫＹ１６０よりも耐性があった。いくつかの事象では、５６０ｇ ａｅ／ｈａ以下の２，４−Ｄの用量で一部の初期オーキシン系除草剤に関連する上偏生長が起こった。一部の事象は、２２４０ｇ ａｅ／ｈａで施用した２，４−Ｄ（４×圃場量に等価）で未損傷であった。全体的に見ると、ＡＡＤ−１２（ｖ１）事象はフルオロキシピルに対してより感受性であり、次いでトリクロピルであり、２，４−Ｄによる影響を最も受けなかった。抵抗性の規模に関する事象の品質は、５６０ｇ ａｅ／ｈａのフルオロキシピルに対するＴ０植物の応答を使用して識別した。事象を「低」（１４ＤＡＴに４０％超の損傷）、「中等度」（２０〜４０％の損傷）、「高」（２０％未満の損傷）に分類した。一部の事象は繰り返し反復間で応答が一貫しておらず、「可変性」とみなされた。
Ｔ１タバコにおける高い２，４−Ｄ耐性の検証：多量の２，４−Ｄおよびフルオロキシピルを生き延びた２〜４個のＴ０個体を各事象から保存しておき、温室内で自家受粉させてＴ１種子を生じさせた。Ｔ１種子を層積貯蔵し、シロイヌナズナ（Arabidopsis）のものに非常に似た選択トレイ内に蒔き、次いで、５６０ｇ ａｉ／ｈａのグルホシネート（ＰＡＴ遺伝子選択）を用いてこの分離集団中の非形質転換ヌルを選択的除去した。生存者を温室内の個々の３インチの鉢に移した。これらの系統は、Ｔ０世代において２，４−Ｄに対する高レベルの抵抗性をもたらした。組織培養物に直接由来しないため、Ｔ１植物において応答の改善された一貫性が予測される。これらの植物を野生型ＫＹ１６０タバコと比較した。すべての植物を１８７Ｌ／ｈａに設定したトラック噴霧器で噴霧した。植物を１４０〜２２４０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄジメチルアミン塩（ＤＭＡ）、７０〜１１２０ｇ ａｅ／ｈａのトリクロピルまたは３５〜５６０ｇ ａｅ／ｈａのフルオロキシピルの範囲で噴霧した。すべての施用は水中で配合した。それぞれの処理を２〜４回繰り返した。植物を処理の３および１４日後に評価した。植物に、萎縮、白化、および壊死に関して損傷の評定を割り当てた。Ｔ１世代は分離されているため、接合状態の相違が原因で一部の可変性の応答が予想される。
２，４−Ｄで４×圃場量（２２４０ｇ ａｅ／ｈａ）以下において損傷が観察されなかった。１つの事象系統ではトリクロピル処理で一部の損傷が観察されたが、最大の損傷はフルオロキシピルで観察された。フルオロキシピル損傷は短命であり、１４ＤＡＴまでに、１つの事象における新しい成長は未処理の対照からほぼ識別不可能であった（表１７）。重要なことに、非形質転換タバコはフルオロキシピルに対して過剰に感受性であることに注意されたい。これらの結果は、タバコなどの非常にオーキシン感受性である双子葉作物においてでさえも、ＡＡＤ−１２（ｖ１）によって商業的レベルの２，４−Ｄ耐性を提供できることを示している。また、これらの結果は、ピリジルオキシ酢酸系除草剤、トリクロピルおよびフルオロキシピルに対する抵抗性も与えることができることを示している。変動的な範囲の雑草防除を有する様々な活性成分を用いて、ＡＡＤ−１２によって保護されている除草剤耐性作物における処理を処方する能力を有することは、栽培者にとって非常に有用である。
タバコにおけるＡＡＤ−１２（ｖ１）の遺伝率：また、１００個の植物の後代検定も、ＡＡＤ−１２（ｖ１）系統の７個のＴ１系統に対して実施した。Ｌｉｂｅｒｔｙ選択によって除去しなかったことを例外として、上記手順を順守して種子を層積貯蔵し、蒔き、移植した。その後、既に記載したようにすべての植物に５６０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ ＤＭＡを噴霧した。１４ＤＡＴ後、抵抗性および感受性の植物を計数した。カイ二乗分析によって決定して、試験した７個の系統のうちの５個が単一座位の優性メンデル形質（３Ｒ：１Ｓ）として分離された。ＡＡＤ−１２は、複数の種において頑強なアリールオキシアルカノエートオーキシン抵抗性遺伝子として遺伝性である。
２，４−Ｄ、ジクロプロップ（Dichloprop）、トリクロピルおよびフルオロキシピル除草剤に対するｐＤＡＳ１５８０タバコ植物の圃場耐性：圃場レベル耐性試験を、３つのＡＡＤ−１２（ｖ１）系統（事象ｐＤＡＳ１５８０−［１］−０１８．００１、ｐＤＡＳ１５８０−［１］−００４．００１およびｐＤＡＳ１５８０−［１］−０２０．０１６）ならびに１つの野生型系統（ＫＹ１６０）に対して、インディアナ州およびミシシッピー州の圃場ステーションで実施した。タバコ移植体は、Ｔ１種子を、Ｍｅｔｒｏ３６０培地を含有する７２ウェルの移植フラット（Ｈｕｍｍｅｒｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に、上述の成長条件に従って植えつけることによって、温室内で成長させた。ヌル植物を既に記載したようにＬｉｂｅｒｔｙ選択によって選択的に除去した。移植植物を圃場ステーションに輸送し、１４または２４インチ間隔のどちらかで工業用植物播種機を使用して植えつけた。植物の活発な成長を保つために、ミシシッピー州のサイトでは点滴灌漑、インディアナ州のサイトでは頭上灌漑を使用した。
実験設計は分割区法で４回の反復であった。主区画は除草剤処理であり、副区画はタバコ系統であった。除草剤処理は、２８０、５６０、１１２０、２２４０および４４８０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ（ジメチルアミン塩）、８４０ｇ ａｅ／ｈａのトリクロピル、２８０ｇ ａｅ／ｈａのフルオロキシピル、ならびに未処理の対照であった。区画は２５〜３０ｆｔの１列であった。除草剤処理は、移植の３〜４週間後に、１８７Ｌ／ｈａの担体体積を１３０〜２００ｋｐａの圧力で送達する圧縮空気背負い式噴霧器を使用して施用した。損傷、成長阻害、および上偏生長の視覚的評定を処理の７、１４および２１日後に行った。
２，４−Ｄ、トリクロピル、およびフルオロキシピルに対するＡＡＤ−１２（ｖ１）事象の応答を表１８中に示す。形質転換していないタバコ系統は、１×圃場施用量とみなされる５６０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄによって重度の損傷を受けた（１４ＤＡＴに６３％）。ＡＡＤ−１２（ｖ１）系統はすべて、１４ＤＡＴにおいて２，４−Ｄに対して優れた耐性を実証し、２、４および８×量でそれぞれ１、４、および４％損傷の平均損傷が観察された。形質転換していないタバコ系統は、２×量のトリクロピル（８４０ｇ ａｅ／ｈａ）によって重度の損傷を受けた一方で（１４ＤＡＴに５３％）、ＡＡＤ−１２（ｖ１）系統は、１４ＤＡＴに３個の系統にわたって平均５％の損傷を伴う耐性を実証した。２８０ｇ ａｅ／ｈａのフルオロキシピルは、１４ＤＡＴに形質転換していない系統に対して重度の損傷（９９％）を引き起こした。ＡＡＤ−１２（ｖ１）系統は、１４ＤＡＴに平均１１％の損傷を伴う増加した耐性を実証した。
これらの結果は、ＡＡＤ−１２（ｖ１）で形質転換した事象系統が、代表的な圃場条件下で形質転換していないタバコに対して致死的である、または重度の上偏生長性形成異常を引き起こした複数の商業的使用量で、２，４−Ｄ、トリクロピルおよびフルオロキシピルに対して高レベルの耐性を示したことを示している。
上昇した２，４−Ｄ量に対するＡＡＤ−１２（ｖ１）保護：温室内における、上昇した量の２，４−Ｄ ＤＭＡに対するＡＡＤ−１２（ｖ１）の保護を示す結果を表１９中に示す。ある事象からのＴ１ ＡＡＤ−１２（ｖ１）植物は、既に記載したものと同じプロトコルを使用して５６０ｇ ａｉ／ｈａのＬｉｂｅｒｔｙで選択した場合に、３Ｒ：１Ｓに分離した。また、Ｔ１ ＡＡＤ−１（ｖ３）種子も形質転換したタバコ対照について植えつけた（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４７３７号を参照）。非形質転換ＫＹ１６０が感受性対照として役割を果たした。１８７Ｌ／ｈａ、１４０、５６０、２２４０、８９６０、および３５８４０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ ＤＭＡに設定したトラック噴霧器を使用して植物を噴霧し、３および１４ＤＡＴに評定した。
ＡＡＤ−１２（ｖ１）およびＡＡＤ−１（ｖ３）はどちらも、タバコを４×商業的使用量までの用量で２，４−Ｄ損傷に対して有効に保護した。しかし、ＡＡＤ−１２（ｖ１）は、６４×標準の圃場量まで保護することによって、ＡＡＤ−１（ｖ３）を超える著しい利点を明白に実証した。
除草剤範囲を増加させるためのＡＡＤ−１２のスタッキング：ホモ接合性ＡＡＤ−１２（ｖ１）（ｐＤＡＳ１５８０）およびＡＡＤ−１（ｖ３）（ｐＤＡＢ７２１）植物（後者にはＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４７３７号を参照）をどちらも相反交雑させ、Ｆ１種子を収集した。それぞれの遺伝子２つの相反交雑からのＦ１種子を層積貯蔵し、それぞれの交雑の処理した４つの代表的なもの（reps）を、他の試験で使用したものと同じ噴霧レジミン（regimine)下で、以下の処理のうちの１つを用いて処理した：７０、１４０、２８０ｇ ａｅ／ｈａのフルオロキシピル（ＡＡＤ−１２（ｖ１）遺伝子に選択的）、２８０、５６０、１１２０ｇ ａｅ／ｈａのＲ−ジクロロプロップ（dichloroprop）（ＡＡＤ−１（ｖ３）遺伝子に選択的）、または５６０、１１２０、２２４０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ ＤＭＡ（２，４−Ｄ耐性を確認するために）。また、それぞれの遺伝子のホモ接合性Ｔ２植物も、対照として使用するために植えつけた。植物を３および１４ＤＡＴに等級づけした。噴霧の結果を表２０中に示す。
結果は、ＡＡＤ−１２（ｖ１）とＡＡＤ−１（ｖ３）とのスタッキングを成功させ、したがって目的作物に施用し得る除草剤の範囲（ＡＡＤ−１およびＡＡＤ−１２についてそれぞれフェノキシ酢酸（phenoxyactetic acid）＋フェノキシプロピオン酸対ペノキシ酢酸（penoxyacetic acid）＋ピリジルオキシ酢酸）を増加させることができることを裏付けしている。除草剤の交差抵抗性パターンの相補的性質により、これら２つの遺伝子の相補的かつスタッキング可能な圃場選択可能マーカーとしての好都合な使用が可能となる。単一遺伝子を用いた耐性がぎりぎりであり得る作物では、当業者には、同じ除草剤の第２の耐性遺伝子をスタッキングすることによって耐性を増加させることができることが理解される。このようなことは、同じ遺伝子を使用して同じまたは異なるプロモーターを用いて行うことができるが、ここで観察されるように、２つの相補的な形質のスタッキングおよび追跡は、フェノキシプロピオン酸［ＡＡＤ−１（ｖ３）から］またはピジロキシ酢酸（pyidyloxyacetic acid）［ＡＡＤ−１２（ｖ１）］に対する交差保護を識別することによって容易にすることができる。
ダイズの形質転換
遺伝子移入技法を介したダイズの改善が、除草剤耐性（Padgetteら、1995）、アミノ酸修飾（Falcoら、1995）、および昆虫抵抗性（Parrottら、1994）などの形質のために達成されている。作物種内への外来形質の導入は、方法が、単純な挿入物を含有する選択可能マーカー配列を使用したトランスジェニック系統のルーチン的な生成を可能にすることを必要とする。導入遺伝子は、育種を単純にするために、単一の機能的座位として遺伝性であるべきである。接合胚軸（McCabeら、1988）または体性胚形成培養物（FinerおよびMcMullen、1991）の微粒子照射による外来遺伝子の栽培したダイズ内への送達、および子葉外植片（Hincheeら、1988）または接合胚（Cheeら、1989）のアグロバクテリウム属（Agrobacterium）媒介性の形質転換が報告されている。
アグロバクテリウム属（Agrobacterium）媒介性の形質転換に由来する形質転換体は、低いコピー数を有する単純な挿入物を保有する傾向にある（Birch、1991）。ダイズ内への遺伝子移入について調査されている３つの標的組織である接合胚軸（Cheeら、1989、McCabeら、1988）、子葉（Hincheeら、1988）および体性胚形成培養物（FinerおよびMcMullen、1991）のそれぞれに関連して、利点および不利点が存在する。後者は直接遺伝子移入のための標的組織として大規模に調査されている。胚形成培養物は非常に多産である傾向があり、長期間維持することができる。しかし、一次形質転換体の生殖不能および染色体異常は胚形成懸濁液の齢に関連づけられており（Singhら、1998）、したがって、この組織を利用したダイズの形質転換系には、新しい培養の連続的な開始が必要であると考えられる。この系は、胚形成カルスを開始させるために高レベルの２，４−Ｄ、４０ｍｇ／Ｌの濃度を必要とし、これは、培地中に２，４−Ｄが存在しており、形質転換した座位をさらに開発することができないため、ＡＡＤ−１２（ｖ１）遺伝子の使用にあたって根本的な問題をもたらす。したがって、分裂組織に基づく形質転換がＡＡＤ−１２（ｖ１）を使用した２，４−Ｄ抵抗性植物の開発に理想的である。
バイナリー構築物のＧａｔｅｗａｙクローニング：ＡＡＤ−１２（ｖ１）コード配列を、異なる植物プロモーターを含有する５個の異なるＧａｔｅｗａｙドナーベクター内にクローニングした。続いて、生じたＡＡＤ−１２（ｖ１）植物発現カセットを、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ反応を介してＧａｔｅｗａｙ Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎバイナリーベクター内にクローニングした（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ、カタログ＃１１７９１−０１９）。
ＡＡＤ−１２（ｖ１）コード配列を含有するＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片をＤＡＳＰＩＣＯ１２から消化し、以下のＧａｔｅｗａｙドナーベクター内の対応するＮｃｏＩ−ＳａｃＩ制限部位内にライゲーションした：ｐＤＡＢ３９１２（ａｔｔＬ１／／ＣｓＶＭＶプロモーター／／ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ／／ａｔｔＬ２）、ｐＤＡＢ３９１６（ａｔｔＬ１／／ＡｔＵｂｉ１０プロモーター／／ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ／／ａｔｔＬ２）、ｐＤＡＢ４４５８（ａｔｔＬ１／／ＡｔＵｂｉ３プロモーター／／ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ／／ａｔｔＬ２）、ｐＤＡＢ４４５９（ａｔｔＬ１／／ＺｍＵｂｉ１プロモーター／／ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ／／ａｔｔＬ２）、およびｐＤＡＢ４４６０（ａｔｔＬ１／／ＡｔＡｃｔ２プロモーター／／ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ／／ａｔｔＬ２）。以下の植物発現カセットを含有する生じた構築物を命名した：ｐＤＡＢ４４６３（ａｔｔＬ１／／ＣｓＶＭＶプロモーター／／ＡＡＤ−１２（ｖ１）／／ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ／／ａｔｔＬ２）、ｐＤＡＢ４４６７（ａｔｔＬ１／／ＡｔＵｂｉ１０プロモーター／／ＡＡＤ−１２（ｖ１）／／ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ／／ａｔｔＬ２）、ｐＤＡＢ４４７１（ａｔｔＬ１／／ＡｔＵｂｉ３プロモーター／／ＡＡＤ−１２（ｖ１）／／ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ／／ａｔｔＬ２）、ｐＤＡＢ４４７５（ａｔｔＬ１／／ＺｍＵｂｉ１プロモーター／／ＡＡＤ−１２（ｖ１）／／ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ／／ａｔｔＬ２）、およびｐＤＡＢ４４７９（ａｔｔＬ１／／ＡｔＡｃｔ２プロモーター／／ＡＡＤ−１２（ｖ１）／／ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ／／ａｔｔＬ２）。これらの構築物を制限酵素消化およびシーケンシングによって確認した。
植物発現カセットを、Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ反応を介してＧａｔｅｗａｙ ＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎバイナリーベクターｐＤＡＢ４４８４（ＲＢ７ ＭＡＲｖ３／／ａｔｔＲ１−ｃｃｄＢ−クロラムフェニコール抵抗性−ａｔｔＲ２／／ＣｓＶＭＶプロモーター／／ＰＡＴｖ６／／ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ）内に組み換えた。Ｇａｔｅｗａｙ技術は、制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼの代わりにラムダファージに基づく部位特異的組換えを使用して、目的遺伝子を発現ベクター内に挿入する。Invitrogen Corporation、Gateway Technology: A Universal Technology to Clone DNA Sequences for Functional Analysis and Expression in multipe Systems、技術マニュアル、カタログ#12535-019および12535-027、Gateway技術バージョンE、2003年9月22日、#25-022。ＤＮＡ組換え配列（ａｔｔＬおよびａｔｔＲ）ならびにＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ酵素混合物は、組換え部位によって隣接されるすべてのＤＮＡ断片を、対応する部位を含有する任意のベクターに移すことを可能にする。ドナーベクターのａｔｔＬ１部位はバイナリーベクターのａｔｔＲ１に対応する。同様に、ドナーベクターのａｔｔＬ２部位はバイナリーベクターのａｔｔＲ２に対応する。Ｇａｔｅｗａｙ技術を使用して、ａｔｔＬ部位によって隣接される植物発現カセット（ドナーベクターからのもの）をバイナリーベクターのａｔｔＲ部位内に組み換えることができる。以下の植物発現カセットを含有する生じた構築物を以下のように表示した：ｐＤＡＢ４４６４（ＲＢ７ ＭＡＲｖ３／／ＣｓＶＭＶプロモーター／／ＡＡＤ−１２（ｖ１）／／ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ／／ＣｓＶＭＶプロモーター／／ＰＡＴｖ６ ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ）、ｐＤＡＢ４４６８（ＲＢ７ ＭＡＲｖ３／／ＡｔＵｂｉ１０プロモーター／／ＡＡＤ−１２（ｖ１）／／ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ／／ＣｓＶＭＶプロモーター／／ＰＡＴｖ６／／ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ）、ｐＤＡＢ４４７２（ＲＢ７ ＭＡＲｖ３／／ＡｔＵｂｉ３プロモーター／／ＡＡＤ−１２（ｖ１）／／ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ／／ＣｓＶＭＶプロモーター／／ＰＡＴｖ６／／ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ）、ｐＤＡＢ４４７６（ＲＢ７ ＭＡＲｖ３／／ＺｍＵｂｉ１プロモーター／／ＡＡＤ−１２（ｖ１）／／ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ／／ＣｓＶＭＶプロモーター／／ＰＡＴｖ６ ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ）、およびｐＤＡＢ４４８０（ＲＢ７ ＭＡＲｖ３／／ＡｔＡｃｔ２プロモーター／／ＡＡＤ−１２（ｖ１）／／ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ／／ＣｓＶＭＶプロモーター／／ＰＡＴｖ６／／ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ）。これらの構築物を制限酵素消化およびシーケンシングによって確認した。
形質転換方法１−アグロバクテリウム属（Agrobacterium）媒介性の形質転換：ダイズの形質転換の最初の報告は、子葉節領域中の分裂組織細胞（Hincheeら、1988）および頂端分裂組織からの苗条の増殖（McCabeら、1988）を標的としていた。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）に基づく子葉節方法では、外植片の調製および培養培地組成が節中の補助分裂組織の増殖を刺激する（Hincheeら、1988）。真に脱分化しているが全能性であるカルス培養がこれらの処理によって開始されるかどうかは未だ不明確である。単一の外植片からの１つの形質転換事象の複数のクローンの回収およびキメラ植物の稀な回収（Clementeら、2000、Olhoftら、2003）は、単一細胞起源、次いでトランスジェニック細胞の増殖により、増殖トランスジェニック分裂組織培養物またはさらなる苗条増殖を受ける均一に形質転換した苗条のどちらかが生成されることを示している。元々は微粒子照射に基づいており（McCabeら、1988）、より最近ではアグロバクテリウム属（Agrobacterium）媒介性の形質転換（Martinellら、2002）に適応されているダイズ苗条増殖方法は、この系が生殖系列キメラの同定の成功に基づくため、子葉節方法と同じレベルまたは種類の脱分化を受けないと考えられる。また、これは２，４−Ｄに基づかないプロトコルであり、２，４−Ｄ選択系に理想的となる。したがって、子葉節方法が２，４−Ｄ抵抗性ダイズ栽培品種を開発するために最適な方法であり得る。
ＡＡＤ−１２（ｖ１）耐性表現型の植物の形質転換の生成。「Ｍａｖｅｒｉｃｋ」の種子に由来する外植片およびアグロバクテリウム属（Agrobacterium）に媒介される子葉節形質転換プロトコルを使用してＡＡＤ−１２（ｖ１）トランスジェニック植物を生成した。
アグロバクテリウム属（Agrobacterium）の調製および接種：５個のバイナリーｐＤＡＢベクター（表８）のそれぞれを保有するアグロバクテリウム属（Agrobacterium）の株ＥＨＡ１０１（Hoodら、1986）を使用して形質転換を開始した。それぞれのバイナリーベクターは、ＡＡＤ−１２（ｖ１）遺伝子および植物選択可能遺伝子（ＰＡＴ）カセットをＴ−ＤＮＡ領域内に含有する。プラスミドをアグロバクテリウム属（Agrobacterium）のＥＨＡ１０１株内に電気穿孔によって動員した。その後、選択されたコロニーを遺伝子の組込みについて分析し、その後、ダイズ外植片のアグロバクテリウム属（Agrobacterium）処理を行った。Ｍａｖｅｒｉｃｋ種子をすべての形質転換実験で使用し、種子はミズーリ大学、ミズーリ州Ｃｏｌｕｍｂｉａから入手した。
選択剤として除草剤グルホシネートとカップリングさせた選択可能マーカーとしてＰＡＴ遺伝子を使用した、ダイズ（Glycine max）のアグロバクテリウム属（Agrobacterium）媒介性の形質転換を実施した。種子を、３ｇ／ＬのＰｈｙｔａｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）で固化したＢ５基本培地（Gamborgら、1968）上で発芽させた。その後、選択された苗条を発根培地に移した。最適な選択スキームは、培地中での第１および第２の苗条開始段階にわたって８ｍｇ／Ｌ、培地中での苗条伸長の間は３〜４ｍｇ／Ｌのグルホシネートの使用であった。
伸長した苗条（３〜５ｃｍ）を発根培地に移す前に、発根を促進するために節間部の切除した末端を１ｍｇ／Ｌのインドール３−酪酸に１〜３分間浸漬した（Khanら、1994）。苗条は発根培地を含有する２５×１００ｍｍのガラス製培養チューブ内で発根し、その後、これらを、Ｍｅｔｒｏ−ｍｉｘ ２００（Ｈｕｍｍｅｒｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ミズーリ州Ｅａｒｔｈ Ｃｉｔｙ）中で、Ｃｏｎｖｉｒｏｎ内の開口Ｍａｇｅｎｔａボックス内の小植物の気候順化のための土壌混合物に移した。Ｌｉｂｅｒｔｙ除草剤（Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ）の活性成分であるグルホシネートを、苗条の開始および伸長中の選択のために使用した。発根した小植物を開口Ｍａｇｅｎｔａボックス内で数週間気候順化させた後、これらをスクリーニングし、さらなる気候順化および確立にために温室に移した。
推定上形質転換した小植物のアッセイ、および分析で確立された温室内におけるＴ０植物：推定上の形質転換体をスクリーニングするために、これらの小植物の選択された葉の末端小葉に、１週間間隔で２回、５０ｍｇ／Ｌのグルホシネートを葉塗布して、結果を観察した。その後、スクリーニングされた小植物を温室に移し、気候順化後、葉にグルホシネートを再度塗布して、温室内におけるこれらの小植物の耐性状態を確認し、推定上の形質転換体であるとみなされた。
温室に移した植物は、Ｔ０一次形質転換体またはその子孫の葉の一区画にグルホシネート溶液［０．０５〜２％ｖ／ｖのＬｉｂｅｒｔｙ除草剤、好ましくは０．２５〜１．０％（ｖ／ｖ）＝５００〜２０００ｐｐｍのグルホシネート、Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ］を塗布することによって、活性ＰＡＴ遺伝子の存在について非破壊的様式でさらにアッセイすることができる。使用する濃度に応じて、グルホシネート損傷の評価を処理の１〜７日後に行うことができる。また、２，４−Ｄ水溶液（０．２５〜１％ｖ／ｖの市販の２，４−Ｄジメチルアミン塩配合物、好ましくは０．５％ｖ／ｖ＝２２８０ｐｐｍの２，４−Ｄ ａｅ）を、最も若い出芽中の三小葉（trifolioate）の１つまたは２つ、好ましくは２つ下の節の、新しく拡大中の三小葉末端小葉に選択的施用することによって、植物を非破壊的様式で２，４−Ｄ耐性について試験することもできる。このアッセイは、葉の反転または隣接小葉の平面からの９０度超の回転の評価によって、施用の６時間から数日後での２，４−Ｄ感受性植物の評価を可能にする。２，４−Ｄに対して耐性のある植物は２，４−Ｄに対して応答しない。Ｔ０植物を温室内で自家受粉させてＴ１種子を生じさせる。Ｔ１植物（十分なＴ０植物クローンが生成される程度まで）に様々な範囲の除草剤用量を噴霧して、トランスジェニックダイズ中のＡＡＤ−１２（ｖ１）およびＰＡＴ遺伝子によって与えられた除草剤保護のレベルを決定する。Ｔ０植物に対して使用する２，４−Ｄの量は、典型的には、既に記載したようにトラック噴霧器を使用して１００〜１１２０ｇ ａｅ／ｈａの範囲の１つまたは２つの選択的量を含む。Ｔ１植物は、５０〜３２００ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄの範囲のより広い除草剤用量で処理する。同様に、Ｔ０およびＴ１植物は、それぞれ２００〜８００および５０〜３２００ｇ ａｅ／ｈａのグルホシネートを用いた出芽後処理によって、グルホシネート抵抗性についてスクリーニングすることができる。グリホサート抵抗性（ＥＰＳＰＳを含有する構築物で形質転換した植物中）または別のグリホサート耐性遺伝子は、２８０〜２２４０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサートの用量範囲を用いたグリホサートの出芽後施用によって、Ｔ１世代において評価することができる。個々のＴ０植物を、目的遺伝子（ＡＡＤ−１２（ｖ１）またはＰＡＴ ｖ６）のコード領域の存在およびコピー数について評価した。ＡＡＤ−１２（ｖ１）の遺伝の決定は、以前の実施例中に記載したように、除草剤耐性に関してＴ１およびＴ２子孫分離を使用して行う。
初期形質転換体の部分組を、上述の方法に従ってＴ０世代において評価した。ＡＡＤ−１２（ｖ１）コード領域を有すると確認されたすべての植物は、遺伝子を駆動するプロモーターにかかわらず２，４−Ｄ葉塗布に応答しなかった一方で、野生型Ｍａｖｅｒｉｃｋダイズは応答した。ＰＡＴのみで形質転換した植物は２，４−Ｄの葉塗布施用に対して野生型植物と同じように応答した。
２，４−Ｄを、野生型対照植物と同様の大きさであった植物の部分組に、５６０または１１２０ｇ ａｅの２，４−Ｄのどちらかで施用した。すべてのＡＡＤ−１２（ｖ１）含有植物は、野生型Ｍａｖｅｒｉｃｋダイズと対比して、除草剤施用に対して明らかに抵抗性であった。２個のＡＡＤ−１２（ｖ１）植物において軽微なレベルの損傷が観察されたが（２ＤＡＴ）、損傷は一時的であり、７ＤＡＴでは損傷が観察されなかった。野生型対照植物は、７〜１４ＤＡＴにおいて５６０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄで重度の損傷を受け、１１２０ｇ ａｅ／ｈａで死滅した。これらのデータは、ＡＡＤ−１２（ｖ１）がダイズなどの感受性作物に対して高い耐性（２×圃場量超）を与えることができるという事実と一貫している。その後、スクリーニングされた植物を、ＡＡＤ１２（ｖ１）遺伝子の組込み、コピー数、および遺伝子発現レベルを確認するための分子および生化学的分析のためにサンプリングした。
分子分析−ダイズ：組織収穫、ＤＮＡの単離および定量。新鮮な組織をチューブに入れ、４℃で２日間凍結乾燥する。組織が完全に乾燥した後、タングステンビーズ（Ｖａｌｅｎｉｔｅ）をチューブ内に入れ、試料を、Ｋｅｌｃｏビーズミルを使用した１分間の乾式粉砕に供する。次いで、標準のＤＮｅａｓｙ ＤＮＡ単離手順を行う（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙ ６９１０９）。その後、抽出されたＤＮＡのアリコートをＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐ７５８９）で染色し、既知の標準物質を用いて蛍光光度計（ＢｉｏＴｅｋ）で読み取って、濃度をｎｇ／μＬで得る。
ポリメラーゼ連鎖反応：合計１００ｎｇの全ＤＮＡを鋳型として使用する。２０ｍＭのそれぞれのプライマーをＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ ＰＣＲポリメラーゼキット（Ｍｉｒｕｓ ＴＡＫＲＲ００１Ａ）と共に使用する。ＡＡＤ−１２（ｖ１）ＰＴＵのプライマーは、（順方向−ＡＴＡＡＴＧＣＣＡＧ ＣＣＴＧＴＴＡＡＡＣ ＧＣＣ）（配列番号８）および（逆方向−ＣＴＣＡＡＧＣＡＴＡ ＴＧＡＡＴＧＡＣＣＴ ＣＧＡ）（配列番号９）である。ＰＣＲ反応は、９７００ Ｇｅｎｅａｍｐサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で、試料を９４℃で３分間、３５サイクルの９４℃で３０秒間と６３℃で３０秒間と７２℃で１分４５秒間、次いで７２℃で１０分間に供することによって実施する。コード領域ＰＣＲ ＡＡＤ−１２（ｖ１）のプライマーは、（順方向−ＡＴＧＧＣＴＣＡＴＧ ＣＴＧＣＣＣＴＣＡＧ ＣＣ）（配列番号１０）および（逆方向−ＣＧＧＧＣＡＧＧＣＣ ＴＡＡＣＴＣＣＡＣＣ ＡＡ）（配列番号１１）である。ＰＣＲ反応は、９７００ Ｇｅｎｅａｍｐサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で、試料を９４℃で３分間、３５サイクルの９４℃で３０秒間と６５℃で３０秒間と７２℃で１分４５秒間、次いで７２℃で１０分間に供することによって実施する。ＰＣＲ産物は、ＥｔＢｒで染色した１％アガロースゲル上の電気泳動によって分析する。
サザンブロット分析：サザンブロット分析は、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙキットから得られた全ＤＮＡを用いて行う。合計１０μｇのゲノムＤＮＡを終夜の消化に供して組込みデータを得る。終夜の消化後、約１００ｎｇのアリコートを１％のゲル上に流して完全な消化を保証する。この確信後、試料を大きな０．８５％アガロースゲル上に終夜、４０ボルトで流す。その後、ゲルを０．２ＭのＮａＯＨ、０．６ＭのＮａＣｌ中で３０分間変性させる。その後、ゲルを０．５ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、１．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５中で３０分間中和する。その後、２０×ＳＳＣを含有するゲル装置を設定して、重力によるゲルからナイロン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＩＮＹＣ０００１０）への終夜の転写を得る。終夜の転写の後、架橋結合剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＵＶ ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ １８００）を介して１２００×１００マイクロジュールで膜をＵＶ光に供する。その後、膜を０．１％のＳＤＳ、０．１ ＳＳＣで４５分間洗浄する。４５分間の洗浄後、膜を３時間、８０℃でベーキングし、その後、ハイブリダイゼーション時まで４℃で保管。ハイブリダイゼーション鋳型断片は、プラスミドＤＮＡを使用した上記コード領域ＰＣＲを使用して調製する。生成物を１％アガロースゲル上に流し、切り取り、その後、Ｑｉａｇｅｎ（２８７０６）ゲル抽出手順を使用してゲル抽出する。その後、膜を、Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｈｙｂ緩衝液（Ｓｉｇｍａ Ｈ７０３３）中、６０℃ステップで１時間のプリハイブリダイゼーションに供する。Ｐｒｉｍｅ ｉｔ ＲｍＴ ｄＣＴＰ標識反応（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ３００３９２）手順を使用して、ｐ３２に基づくプローブ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を展開させる。Ｐｒｏｂｅ Ｑｕａｎｔを使用してプローブをクリーンアップする。Ｇ５０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ２７−５３３５−０１）。２００万ＣＰＭを使用してサザンブロットを終夜ハイブリダイズさせる。終夜のハイブリダイゼーションの後、ブロットを６５℃、０．１％のＳＤＳ、０．１ ＳＳＣ中での２回の２０分間の洗浄に供する。その後、−８０℃でインキュベーションしながらブロットを終夜フィルムに露光させる。
生化学的分析−ダイズ：組織サンプリングおよびダイズ葉からのＡＡＤ−１２（ｖ１）タンパク質の抽出。約５０〜１００ｍｇの葉組織を、２，４−Ｄを葉塗布したＮ−２葉から、１ＤＡＴより後にサンプリングした。末端Ｎ−２小葉を取り除き、小片または２単一孔パンチの葉片（直径約０．５ｃｍ）のどちらかへと切断し、ドライアイス上で瞬間冷凍した。タンパク質分析（ＥＬＩＳＡおよびウエスタン分析）を適宜完了させた。
Ｔ１子孫評価：Ｔ０植物を自家受粉させてＴ１ファミリーを誘導する。後代検定（分離分析）は、Ｖ１〜Ｖ２成長段階に施用する５６０ｇ ａｉ／ｈａのグルホシネートを選択剤として使用してアッセイする。生き延びた植物を、Ｖ２〜Ｖ６の１つまたは複数の成長段階で２，４−Ｄ耐性についてさらにアッセイする。種子を自家受粉によって生成させて、トランスジェニックダイズに対するより幅広い除草剤試験を可能にする。
ＡＡＤ−１２（ｖ１）トランスジェニックＭａｖｅｒｉｃｋダイズ植物は、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）媒介性の形質転換系によって作製されている。得られたＴ０植物は２×レベルまでの２，４−Ｄ圃場施用量までに耐え、生殖性の種子を発生した。生殖性のトランスジェニックダイズ植物の頻度は５．９％までであった。ＡＡＤ１−１２（ｖ１）遺伝子のダイズゲノム内への組込みをサザンブロット分析によって確認した。この分析により、トランスジェニック植物のほとんどが低いコピー数を含有していたことが示された。ＡＡＤ−１２（ｖ１）抗体を用いてスクリーニングした植物は、ＥＬＩＳＡおよびウエスタン分析における適切なバンドについて陽性を示した。
形質転換方法２−胚形成ダイズカルス組織のエアロゾルビーム媒介性の形質転換：胚形成ダイズカルス組織の培養および続くビーム照射を米国特許第６，８０９，２３２号（Ｈｅｌｄら）に記載のように達成して、本明細書中に提供する構築物を使用した形質転換体を作製することができる。
形質転換方法３−ダイズの微粒子銃照射：これは、成熟種子に由来する胚軸分裂組織を使用して達成することができる（McCabeら(1988)）。微粒子銃照射の確立された方法に従って、形質転換されたダイズ植物の回収を予想することができる。
形質転換方法４−髭結晶媒介性の形質転換：髭結晶の調製および髭結晶の形質転換は、Terakawaら(2005)）によって以前に記載されている方法に従って行うことができる。微粒子銃照射の確立された方法に従って、形質転換したダイズ植物の回収を予想することができる。
Ｍａｖｅｒｉｃｋ種子を７０％のエタノールで１分間表面滅菌し、次いで１％の次亜塩素酸ナトリウムに２０分間浸漬し、その後、滅菌蒸留水で３回濯いだ。種子を蒸留水に１８〜２０時間浸した。胚軸を種子から切除し、初生葉を除去することによって頂端分裂組織を曝露させた。頂端領域を上方向にして、胚軸を、１２ｍｌの培養培地を含有する５ｃｍの培養皿中の照射培地［ＢＭ：ＭＳ（MurashigeおよびSkoog 1962）基底塩培地、３％のスクロースおよび０．８％のｐｈｙｔａｇｅｌ、Ｓｉｇｍａ、ｐＨ５．７］に入れた。
形質転換方法５−胚形成カルス組織の微粒子照射媒介性の形質転換は、以前の方法に従って最適化することができる（Khalafallaら、2005、El-Shemyら、2004、2006）。
綿におけるＡＡＤ−１２（ｖ１）
綿の形質転換プロトコル：綿実（遺伝子型Ｃｏ３１０）を９５％のエタノールで１分間表面滅菌し、濯ぎ、５０％の市販の漂白剤で２０分間滅菌し、その後、滅菌蒸留水で３回濯いだ後、Ｍａｇｅｎｔａ ＧＡ−７容器内のＧ培地（表２１）上で発芽させ、４０〜６０μＥ／ｍ２の高い光強度下、光周期を１６時間の明および８時間の暗に設定して２８℃で維持する。
子葉セグメント（約５ｍｍ）の四角片を、ペトリ皿（Ｎｕｎｃ、アイテム＃０８７５７２８）中の７〜１０日齢の実生から液体Ｍ液体培地（表２１）内へ単離する。切断したセグメントをアグロバクテリウム属（Agrobacterium）溶液で処理し（３０分間）、その後、半固体Ｍ培地（表２１）に移し、２〜３日間同時培養させる。同時培養後、セグメントをＭＧ培地（表２１）に移す。カルベニシリンがアグロバクテリウム属（Agrobacterium）を死滅させるために使用する抗生物質であり、グルホシネート−アンモニウムが転移された遺伝子を含有する細胞のみの成長を許容する選択剤である。
アグロバクテリウム属（Agrobacterium）の調製：３５ｍｌのＹ培地（表２１）（ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌのストック）およびエリスロマイシン（１００ｍｇ／ｍｌのストック）を含有）に白金耳１杯の細菌を接種し、１５０ｒｐｍで振盪しながら終夜、暗所、２８℃で成長させる。翌日、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）溶液を無菌的なオークリッジチューブ（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ、３１３９−００５０）内に注ぎ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１にて８，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を注ぎ出し、ペレットを２５ｍｌのＭ液体（表２１）に再懸濁させ、渦撹拌する。Ｋｌｅｔｔ読取り（Ｋｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ、モデル８００−３）のために１アリコートをガラス製培養チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ、１４−９６１−２７）に入れる。Ｍ液体培地を使用して、新しい懸濁液を、Ｋｌｅｔｔ測定器の読取が１０８個のコロニー形成単位／ｍｌとなり、全体積４０ｍｌになるまで希釈する。
３週間後、子葉セグメントからのカルスを単離し、新鮮なＭＧ培地に移す。カルスをさらに３週間、ＭＧ培地上に移す。ジクロルプロップはＡＡＤ−１２酵素の基質ではないが、ジクロルプロップは綿に対して２，４−Ｄよりも活性が高いため、並列比較では、２，４−Ｄの分解を補うためにＭＧ培地にジクロルプロップ（０．０１および０．０５ｍｇ／Ｌの濃度で培地に加える）を添加することができる。別の比較では、成長調節物質を含有しないＭＧ培地上にプレートしたセグメントは、標準のＭＧ培地と比較した場合に低下したカルス形成を示したが、カルスの成長は依然として存在している。その後、カルスをＣＧ培地（表２１）に移し、３週間後に新鮮な選択培地に再度移す。さらに３週間後、胚形成カルスの誘導のために、カルス組織を植物成長調節物質を欠くＤ培地（表２１）に移す。この培地上で４〜８週間後、胚形成カルスが形成され、これは、その黄色っぽい白色および顆粒細胞によって非胚形成カルスから識別することができる。胚はそのすぐ後に再生し始め、色は明確な緑色である。綿は再生して胚を形成するために時間がかかる場合があり、このプロセスを加速させる一方法は組織にストレスを与えることである。これを達成するための一般的な方法の１つは、より少ない培養培地の使用および／または様々なプレート封入様式の採用（テープ貼り対パラフィルム）を使用することによる組織およびプレートの微小環境の変化を介した乾燥（dessication）である。
より大きな十分に発達した胚を単離し、胚発生のためにＤＫ培地（表２１）に移す。３週間後（または胚が発生した際）、発芽した胚を苗条および根発達のために新鮮な培地に移す。４〜８週間後、すべての十分に発達した植物を土壌に移し、成熟するまで成長させる。数カ月後、植物は、２，４−Ｄに対する抵抗性を有するかどうかを決定するために噴霧できるまで成長している。
細胞の形質転換：子葉セグメントをｐＤＡＢ７２４を含有するアグロバクテリウム属（Agrobacterium）で処理する、いくつかの実験を開始した。２０００個を超える生じたセグメントを、０．１または０．５ｍｇ／ＬのＲ−ジクロルプロップ、標準の２，４−Ｄ濃度およびオーキシン処理なしのいずれかの、ｐＤＡＢ７２４綿カルスの増殖のための様々なオーキシン選択肢を使用して処理した。構築物中にＰＡＴ遺伝子が含まれていたため、カルスはグルホシネート−アンモニウム上で選択した。ＰＣＲおよびＩｎｖａｄｅｒの形態のカルスの系統分析を使用して、カルス段階で遺伝子が存在していたかどうかを決定し、また、存在することを確実にする。その後、胚形成性であるカルス系統をウエスタン分析に供する。回収される組織の品質および量を改善するために、乾燥（dessication）技法を使用して胚形成綿カルスにストレスを与えた。ほぼ２００個のカルス事象が、ＡＡＤ−１２（ｖ１）遺伝子について、ウエスタン分析を使用してインタクトなＰＴＵおよび発現についてスクリーニングされている。
植物再生：上記プロトコルに従って植物を生成したＡＡＤ−１２（ｖ１）綿系統を温室に送る。ＡＡＤ−１２（ｖ１）遺伝子が綿において２，４−Ｄに対する抵抗性をもたらすことを実証するために、ＡＡＤ−１２（ｖ１）綿植物および野生型綿植物をどちらも、５６０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄを１８７Ｌ／ｈａの噴霧体積で送達するトラック噴霧器を用いて噴霧する。植物を処理の３および１４日後に評価する。選択的量の２，４−Ｄを生き延びる植物を自家受粉させてＴ１種子を作製するか、または優良綿系統と外交雑させてＦ１種子を生成する。続いて生じた種子を植えつけ、既に記載したように除草剤抵抗性について評価する。ＡＡＤ−１２（ｖ１）事象を他の所望のＨＴまたはＩＲトラント（trants）と組み合わせることができる。
他の作物のアグロバクテリウム属（Agrobacterium）形質転換
本開示に鑑みて、当分野で知られている技法を使用して、さらなる作物を本発明に従って形質転換することができる。ライムギのアグロバクテリウム属（Agrobacterium）媒介性の形質転換には、たとえばPopelkaおよびAltpeter (2003)を参照されたい。ダイズのアグロバクテリウム属（Agrobacterium）媒介性の形質転換には、たとえばHincheeら、1988を参照されたい。モロコシのアグロバクテリウム属（Agrobacterium）媒介性の形質転換には、たとえばZhaoら、2000を参照されたい。オオムギのアグロバクテリウム属（Agrobacterium）媒介性の形質転換には、たとえばTingayら、1997を参照されたい。コムギのアグロバクテリウム属（Agrobacterium）媒介性の形質転換には、たとえばChengら、1997を参照されたい。コメのアグロバクテリウム属（Agrobacterium）媒介性の形質転換には、たとえばHieiら、1997を参照されたい。
これらおよび他の植物のラテン名を以下に示す。これらおよび他の（非アグロバクテリウム属（Agrobacterium））形質転換技法を使用して、ＡＡＤ−１２（ｖ１）を、たとえば、それだけには限定されないが、トウモロコシ（Zea mays）、コムギ（コムギ属の種（Triticum spp.））、コメ（オリザ属の種（Oryza spp.）およびジザニア属の種（Zizania spp.））、オオムギ（オオムギ属の種（Hordeum spp.））、綿（アブロマ・アウグスタ（Abroma augusta）およびワタ属の種（Gossypium spp.））、ダイズ（Glycine max）、砂糖およびテーブルビート（ベータ属の種（Beta spp.））、サトウキビ（サトウヤシ（Arenga pinnata））、トマト（トマト（Lycopersicon esculentum）および他の種、フィサリス・イクソカルパ（Physalis ixocarpa）、ソラナム・インカナム（Solanum incanum）および他の種、サイフォマンドラ・ベータセア（Cyphomandra betacea））、ジャガイモ（Solanum tubersoum）、サツマイモ（Ipomoea betatas）、ライムギ（ライムギ属の種（Secale spp.））、コショウ（トウガラシ（Capsicum annuum）、カプシカムシネンセ（sinense）、およびキダチトウガラシ（frutescens））、レタス（レタス（Lactuca sativa）、ラクツカ・ペレニス（perennis）、およびアメリカニガナ（pulchella））、キャベツ（アブラナ属の種（Brassica spp））、セロリ（オランダミツバ（Apium graveolens））、ナス（Solanum melongena）、ピーナッツ（ラッカセイ（Arachis hypogea））、モロコシ（すべてのモロコシ属（Sorghum）の種）、アルファルファ（Medicago sativua）、ニンジン（Daucus carota）、豆類（インゲンマメ属の種（Phaseolus spp.）および他の属）、カラスムギ（アカラスムギ（Avena sativa）およびセイヨウチャヒキ（strigosa））、エンドウマメ（エンドウ属（Pisum）、ササゲ属（Vigna）、およびシカクマメ属（Tetragonolobus spp.）属の種）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、カボチャ（カボチャ属の種（Cucurbita spp.））、キュウリ（Cucumis sativa）、タバコ（タバコ属の種（Nicotiana spp.））、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、芝生（ドクムギ属（Lolium）、コヌカグサ属（Agrostis）、イチゴツナギ属（Poa）、ギョウギシバ属（Cynadon）、および他の属）、クローバー（ジャジクソウ属（Tifolium））、カラスノエンドウ（ソラマメ属（Vicia））を含めた、これらおよび他の植物内へと形質転換することができることは明白である。たとえば、ＡＡＤ−１２（ｖ１）遺伝子を有するそのような植物が本発明に含まれる。
ＡＡＤ−１２（ｖ１）は、多くの落葉性および常緑の材木の作付け体系における、シーズン中に使用するための主要なオーキシン系除草剤の施用可能性を増加させる潜在性を有する。トリクロピル、２，４−Ｄ、および／またはフルオロキシピル抵抗性の材木種は、損傷の心配なしに、これらの除草剤の度が過ぎた使用の柔軟性を増加させる。これらの種には、それだけには限定されないが、ハンノキ（ハンノキ属の種（Alnus spp.））、セイヨウトネリコ（トネリコ属の種（Fraxinus spp.））、ハコヤナギおよびポプラ種（ポプルス属の種（Populus spp.））、ブナノキ（ブナ属の種（Fagus spp.））、カバノキ（カバノキ属の種（Betula spp.））、サクラ（サクラ属の種（Prunus spp.））、ユーカリ（ユーカリ属の種（Eucalyptus spp.））、ヒッコリー（ペカン属の種（Carya spp.））、カエデ（カエデ属の種（Acer spp.））、オーク（カシ属の種（Quercus spp））、およびマツ（マツ属の種（Pinus spp））が含まれる。また、装飾用の種および結実種における選択的雑草防除のためのオーキシン抵抗性の使用も本発明の範囲内にある。例には、それだけには限定されないが、バラ（バラ属の種（Rosa spp.））、ホウキギ（ニシキギ属の種（Euonymus spp.））、ペチュニア（ペチュニア属の種（Petunia spp））、ベゴニア（シュウカイドウ属の種（Begonia spp.））、ツツジ（ツツジ属の種（Rhododendron spp））、クラブアップルまたはリンゴ（リンゴ属の種（Malus spp.））、ナシ（ナシ属の種（Pyrus spp.））、モモ（サクラ属の種（））、およびマリーゴールド（タゲテス属の種（Tagetes spp.））を含めることができる。
驚くべき結果のさらなる証拠：ＡＡＤ−１２対ＡＡＤ−２
ＡＡＤ−２（ｖ１）の初期クローニング：別の遺伝子を、ＮＣＢＩデータベース（ncbi.nlm.nih.govのウェブサイト、受託＃ＡＰ００５９４０を参照）から、ｔｆｄＡに対して４４％のアミノ酸同一性しか有さない相同体として同定した。一貫性のためにこの遺伝子を本明細書中でＡＡＤ−２（ｖ１）と呼ぶ。パーセント同一性は、最初に、ＡＡＤ−２およびｔｆｄＡの両方のＤＮＡ配列（それぞれＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４７３７号の配列番号１２およびＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｍ１６７３０）をタンパク質（それぞれＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４７３７の配列番号１３およびＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｍ１６７３０）へと翻訳し、その後、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩソフトウェアパッケージ中のＣｌｕｓｔａｌＷを使用して複数配列アラインメントを行うことによって決定した。
ＡＡＤ−２（ｖ１）遺伝子を含有するブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japonicum）の株をＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＲＲＬ、株＃Ｂ４４５０）から入手した。凍結乾燥された株をＮＲＲＬプロトコルに従って蘇生させ、内部使用のためにＤｏｗ細菌株ＤＢ６６３として−８０℃、２０％のグリセロール中で保管した。その後、この冷凍庫ストックから、単離のために白金耳量の細胞を用いてＴｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ａｇａｒのプレートをストライク（struck out）し、２８℃で３日間インキュベーションした。単一のコロニーを使用して５００ｍｌのトリバッフルフラスコ内の１００ｍｌのＴｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈを接種し、これを終夜、２８℃、フロアシェーカー上、１５０ｒｐｍでインキュベーションした。これから、ＱｉａｇｅｎのＤＮｅａｓｙキットのグラム陰性プロトコル（Ｑｉａｇｅｎカタログ＃６９５０４）を用いて全ＤＮＡを単離した。標的遺伝子をゲノムＤＮＡから増幅するために以下のプライマーを設計した：順方向：５’ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＡＣ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＧＡ ＧＡＴ ＡＴＡ ＣＣＡ ＴＧＡ ＣＧＡ Ｔ ３’［（ｂｒｊａｐ ５’（ｓｐｅＩ）、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４７３７号の配列番号１４（Ｓｐｅ Ｉ制限部位およびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を付加）］ならびに逆方向：５’ ＴＴＣ ＴＣＧ ＡＧＣ ＴＡＴ ＣＡＣ ＴＣＣ ＧＣＣ ＧＣＣ ＴＧＣ ＴＧＣ ＴＧＣ ３’［（ｂｒ ｊａｐ ３’（ｘｈｏＩ）、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４７３７号の配列番号１５（Ｘｈｏ Ｉ部位を付加）］。
５０マイクロリットルの反応を以下のように設定した：Ｆａｉｌ Ｓａｆｅ緩衝液 ２５μｌ、各プライマー １μｌ（５０ｎｇ／μｌ）、ｇＤＮＡ １μｌ（２００ｎｇ／μｌ）、Ｈ２Ｏ ２１μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ １μｌ（２．５ユニット／μｌ）。３つのＦａｉｌ Ｓａｆｅ緩衝液、Ａ、Ｂ、およびＣを３つの個別の反応で使用した。その後、ＰＣＲを以下の条件下で実施した：９５℃で３．０分間の熱変性サイクル、９５℃で１．０分間、５０℃で１．０分間、７２℃で１．５分間を３０サイクル、次いで、７２℃で５分間の最終サイクル、ＦａｉｌＳａｆｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒカタログ＃Ｆ５９９１００）を使用。ヌクレオチド配列を検証するために、生じた約１ｋｂのＰＣＲ産物を、含まれるプロトコルに従って、化学的にコンピテントなＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌（E. coli）を宿主株として用いて、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃Ｋ４５５０−４０）内にクローニングした。
生じた白色コロニーのうちの１０個を３μｌのルリアブロス＋１０００μｇ／ｍｌのアンピシリン（ＬＢ Ａｍｐ）内に拾い、終夜、３７℃で攪拌しながら成長させた。Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ＃Ｋ３０６３−２）を使用して、含まれるプロトコルに従って、プラスミドをそれぞれの培養物から精製した。単離されたＤＮＡの制限消化を完了して、ｐＣＲ２．１ベクター中のＰＣＲ産物の存在を確認した。プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログ＃Ｒ０１０１Ｓ）で消化した。シーケンシングは、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣＥＱ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒカタログ＃６０８１２０）を用いて、Ｍ１３順方向［５’ ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＧＡ ＣＧＧ ＣＣＡ Ｇ ３’］（配列番号６）および逆方向［５’ ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＡＣ ３’］（配列番号７）プライマーを使用して、製造者の指示に従って実施した。内部の一貫性のために、この遺伝子配列およびその対応するタンパク質に新しい一般的名称ＡＡＤ−２（ｖ１）を与えた。
ＡＡＤ−２（ｖ１）バイナリーベクターの完成：ＡＡＤ−２（ｖ１）遺伝子をｐＤＡＢ３２０２からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応中、ＡｆｌＩＩＩおよびＳａｃＩ制限部位をそれぞれ５’プライマーおよび３’プライマー中に導入するために、プライマー内に変更を行った。ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４７３７号を参照されたい。プライマー「ＢｒａｄｙのＮｃｏＩ」［５’ ＴＡＴ ＡＣＣ ＡＣＡ ＴＧＴ ＣＧＡ ＴＣＧ ＣＣＡ ＴＣＣ ＧＧＣ ＡＧＣ ＴＴ ３’］（配列番号１４）および「ＢｒａｄｙのＳａｃＩ」［５’ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＴＡ ＴＣＡ ＣＴＣ ＣＧＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＡＣ ３’］（配列番号１５）を使用し、Ｆａｉｌ Ｓａｆｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用してＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、Ｍ１３順方向およびＭ１３逆方向プライマーを用いて、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ「Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ」シーケンシング試薬を使用して配列を検証した。配列データにより正しい配列を有するクローンが同定された（ｐＤＡＢ７１６）。その後、ＡｆｌＩＩＩ／ＳａｃＩ ＡＡＤ−２（ｖ１）遺伝子断片をＮｃｏＩ／ＳａｃＩ ｐＤＡＢ７２６ベクター内にクローニングした。生じた構築物（ｐＤＡＢ７１７）、ＡｔＵｂｉ１０プロモーター：Ｎｔ ＯＳＭ５’ＵＴＲ：ＡＡＤ−２（ｖ１）：Ｎｔ ＯＳＭ３’ＵＴＲ：ＯＲＦ１ポリＡ ３’ＵＴＲを制限消化（ＮｃｏＩ／ＳａｃＩを用いる）で検証した。この構築物をバイナリーｐＤＡＢ３０３８内にＮｏｔＩ−ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片としてクローニングした。正しい配向を検証するために、生じた構築物（ｐＤＡＢ７６７）、ＡｔＵｂｉ１０プロモーター：Ｎｔ ＯＳＭ５’ＵＴＲ：ＡＡＤ−２（ｖ１）：Ｎｔ ＯＳＭ３’ＵＴＲ：ＯＲＦ１ポリＡ ３’ＵＴＲ：ＣｓＶＭＶプロモーター：ＰＡＴ：ＯＲＦ２５／２６ ３’ＵＴＲを制限消化した（Ｎｏｄ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎＤＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＳａｌＩを用いる）。その後、完成した構築物（ｐＤＡＢ７６７）をアグロバクテリウム属（Agrobacterium）内への形質転換に使用した。
形質転換したシロイヌナズナ（Arabidopsis）の評価：新鮮に収穫したＴ１種子を植物に最適化されたＡＡＤ−１２（ｖ１）で形質転換したか、または、ネイティブＡＡＤ−２（ｖ１）遺伝子を植えつけ、既に記載したようにグルホシネートに対する抵抗性について選択した。その後、植物を様々な量の２，４−Ｄ（５０〜３２００ｇ ａｅ／ｈａ）へとランダムに割り当てた。除草剤施用は、トラック噴霧器によって１８７Ｌ／ｈａの噴霧体積で施用した。使用した２，４−Ｄは、２００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．０）または２００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中で混合した市販のジメチルアミン塩配合物（４５６ｇ ａｅ／Ｌ、ＮｕＦａｒｍ、ミズーリ州Ｓｔ Ｊｏｓｅｐｈ）であった。
ＡＡＤ−１２（ｖ１）およびＡＡＤ−２（ｖ１）は、形質転換および非形質転換対照系統と対比して検出可能な２，４−Ｄ抵抗性をもたらした。しかし、個々の構築物は、個々のＴ１シロイヌナズナ（Arabidopsis）植物に２，４−Ｄに対する抵抗性を与えるその能力が大きく変動していた。驚くべきことに、ＡＡＤ−２（ｖ１）およびＡＡＤ−２（ｖ２）形質転換体は、高耐性植物の頻度および全体的な平均損傷の両方から、２，４−Ｄに対する抵抗性がＡＡＤ−１２（ｖ１）遺伝子よりもはるかに低かった。ＡＡＤ−２（ｖ１）で形質転換したどの植物も、比較的未損傷で（２０％未満視覚的損傷）２００ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄを生き延びることはなく、全体的な集団損傷は約８３％であった（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４７３７号を参照）。逆に、ＡＡＤ−１２（ｖ１）は３，２００ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄで処理した場合に約６％の集団損傷平均を有していた。耐性は植物に最適化されたＡＡＤ−２（ｖ２）対ネイティブ遺伝子でわずかに改善されたが、しかし、ＡＡＤ−１２およびＡＡＤ−２の植物に最適化された遺伝子の両方の比較により、植物体におけるＡＡＤ−１２（ｖ１）の顕著な利点が示されている。
ＡＡＤ−２（ｖ１）（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４７３７号を参照）およびＡＡＤ−１２（ｖ２）のｉｎ ｖｉｔｒｏ比較により、どちらも２，４−Ｄを分解することにおいて高度に有効であり、どちらもキラルアリールオキシアルカノエート基質に関してＳ型の特異性を共有していたことが示されていたことを考慮すると、これらの結果は予想外である。ＡＡＤ−２（ｖ１）は個々のＴ１植物中で変動的なレベルで発現されている。しかし、この発現されたタンパク質によって得られる、２，４−Ｄ損傷からの保護はわずかである。ネイティブおよび植物に最適化されたＡＡＤ−２遺伝子でタンパク質発現レベル（植物体中）の実質的な差異は明白ではなかった（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４７３７号を参照）。これらのデータは、植物体におけるＡＡＤ−１２（ｖ１）の機能的発現、ならびに生じる２，４−Ｄおよびピリジルオキシ酢酸系除草剤に対する除草剤抵抗性を予想外にする初期の発見を裏付ける。
ＡＡＤ−１２（ｖ１）のみで形質転換したダイズ、綿、および他の双子葉作物における、フェノキシオーキシン除草剤の作物内使用
ＡＡＤ−１２（ｖ１）は、通常は２，４−Ｄに対して感受性である作物において、広範囲の広葉雑草を直接防除するための、フェノキシオーキシン除草剤（たとえば２，４−ＤおよびＭＣＰＡ）ならびにピリジルオキシオーキシン（トリクロピルおよびフルオロキシピル）の使用を可能にすることができる。２８０〜２２４０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄの施用で、農耕学的環境に存在するほとんどの広葉雑草種が防除される。より典型的には５６０〜１１２０ｇ ａｅ／ｈａを使用する。トリクロピルでは、施用量は典型的には７０〜１１２０ｇ ａｅ／ｈａ、より典型的には１４０〜４２０ｇ ａｅ／ｈａの範囲となる。フルオロキシピルでは、施用量は典型的には３５〜５６０ｇ ａｅ／ｈａ、より典型的には７０〜２８０ａｅ／ｈａの範囲となる。
この追加のツールの１つの利点は、広葉除草剤成分が非常に低価格であること、ならびに、グリホサートなどの非残留性除草剤は後に発芽する雑草の防除を提供しない一方で、より高い量で使用した場合により高い量の２，４−Ｄ、トリクロピル、およびフルオロキシピルは潜在的な短命の残留性雑草防除をもたらすことである。また、このツールは、統合された除草剤抵抗性および雑草シフト管理戦略として除草剤の作用機構をＨＴＣの利便性と組み合わせる機構も提供する。
このツールが提供するさらなる利点は、広範囲の広葉雑草防除除草剤（たとえば、２，４−Ｄ、トリクロピルおよびフルオロキシピル）を一般的に使用されている残留性雑草防除除草剤とタンク混合する能力である。これらの除草剤は、典型的には植えつけ前または植えつけ時に施用するが、多くの場合、植えつけ前に圃場に存在し得る出芽した、確立した雑草に対しては有効性がより低い。これらのアリールオキシオーキシン除草剤の有用性を、植えつけ時、出芽前、または植えつけ前の施用が含まれるように拡張することによって、残留性雑草防除プログラムの柔軟性が増加する。当業者には、残留性除草剤プログラムが目的作物に基づいて異なることが理解されるが、典型的なプログラムには、クロルアセトミド（chloracetmide）およびジニトロアニリン除草剤ファミリーの除草剤が含まれ、また、クロマゾン、スルフェントラゾン、ならびに様々なＡＬＳ阻害性、ＰＰＯ阻害性、およびＨＰＰＤ阻害性除草剤などの除草剤も含まれる。
さらなる利点には、アリールオキシ酢酸オーキシン除草剤施用の後に、植えつけの前に必要な２，４−Ｄ、トリクロピルまたはフルオロキシピルに対する耐性（以前の実施例を参照）、および以前に２，４−Ｄ、トリクロピルまたはフルオロキシピルを含有していた洗浄が不完全なバルクタンクから生じる、双子葉作物に対する汚染損傷からの問題が減ることが含まれる場合がある。ジカンバ（および多くの他の除草剤）は、ＡＡＤ−１２（ｖ１）で形質転換した双子葉作物の自生植物の引き続く防除に依然として使用することができる。
また、当業者には、上記実施例を、安定に形質転換された際にＡＡＤ−１２（ｖ１）遺伝子によって保護される任意の２，４−Ｄ感受性（または他のアリールオキシオーキシン除草剤）作物に施用できることが理解されよう。ここで、雑草防除分野の技術者には、様々な市販のフェノキシまたはピリジルオキシオーキシン除草剤の、単独または除草剤と組み合わせた使用がＡＡＤ−１２（ｖ１）形質転換によって可能となることが理解されよう。これらの化学に代表的な他の除草剤の具体的な量は、ＣＰＲ（作物保護参考文献）本もしくは同様の編集本またはＡｇｒｉｌｉａｎｃｅからのCrop Protection Guide (2005)などの任意の市販もしくは学術的な作物保護参考文献中に編集されている除草剤の標識によって決定することができる。ＡＡＤ−１２（ｖ１）によってＨＴＣにおける使用が可能となったそれぞれの代替除草剤は、単独で、タンク混合して、または順次使用するかにかかわらず、本発明の範囲内にあるとみなされる。
ＡＡＤ−１２（ｖ１）のみで形質転換したトウモロコシ、コメ、および他の単子葉植物種における、フェノキシオーキシンおよびピリジルオキシオーキシン除草剤の作物内使用
同様の様式で、ＡＡＤ−１２（ｖ１）を用いた草種（それだけには限定されないが、トウモロコシ、コメ、コムギ、オオムギ、または芝生および牧草など）の形質転換は、通常は選択性が不確かである作物において、高度に有効なフェノキシおよびピリジルオキシオーキシンの使用を可能にする。ほとんどの草種は、フェノキシオーキシン（すなわち２，４−Ｄ）などのオーキシン系除草剤に対して天然の耐性を有する。しかし、短縮された施用タイミングのウィンドウまたは許容されない損傷の危険性が原因で、比較的低レベルの作物選択性がこれらの作物における有用性の消失をもたらしている。したがって、ＡＡＤ−１２（ｖ１）で形質転換した単子葉作物は、ほとんどの広葉雑草種を防除するために、２８０〜２２４０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄの施用などの双子葉作物について記載した処理の同様の組合せの使用を可能にする。より典型的には５６０〜１１２０ｇ ａｅ／ｈａを使用する。トリクロピルでは、施用量は典型的には７０〜１１２０ｇ ａｅ／ｈａ、より典型的には１４０〜４２０ｇ ａｅ／ｈａの範囲となる。フルオロキシピルでは、施用量は典型的には３５〜５６０ｇ ａｅ／ｈａ、より典型的には７０〜２８０ａｅ／ｈａの範囲となる。
この追加のツールの１つの利点は、広葉除草剤成分が非常に低価格であること、およびより高い量の２，４−Ｄ、トリクロピル、またはフルオロキシピルは潜在的な短命の残留性雑草防除をもたらすことである。対照的に、グリホサートなどの非残留性除草剤は後に発芽する雑草の防除を提供しない。また、このツールは、作物種を輪作するかどうかにかかわらず、グリホサート耐性作物／ＡＡＤ−１２（ｖ１）ＨＴＣ組合せ戦略において、統合された除草剤抵抗性および雑草シフト管理戦略として除草剤の作用機構をＨＴＣの利便性と循環させる機構も提供する。
このツールが提供するさらなる利点は、広範囲の広葉雑草防除除草剤（たとえば、２，４−Ｄ、トリクロピルおよびフルオロキシピル）を一般的に使用されている残留性雑草防除除草剤とタンク混合する能力である。これらの除草剤は、典型的には植えつけ前または植えつけ時に施用するが、多くの場合、植えつけ前に圃場に存在し得る出芽した、確立した雑草に対しては有効性がより低い。これらのアリールオキシオーキシン除草剤の有用性を、植えつけ時、出芽前、または植えつけ前の施用が含まれるように拡張することによって、残留性雑草防除プログラムの柔軟性が増加する。当業者には、残留性除草剤プログラムが目的作物に基づいて異なることが理解されるが、典型的なプログラムには、クロルアセトミド（chloracetmide）およびジニトロアニリン除草剤ファミリーの除草剤が含まれ、また、クロマゾン、スルフェントラゾン、ならびに様々なＡＬＳ阻害性、ＰＰＯ阻害性、およびＨＰＰＤ阻害性除草剤などの除草剤も含まれる。
フェノキシまたはピリジルオキシオーキシンに対するトウモロコシ、コメ、および他の単子葉植物の耐性の増加は、成長段階の制限または作物傾斜の潜在性、「先細り」などの広がり現象、作物傾斜、トウモロコシにおｋる成長調節物質に誘導される茎の脆性、または奇形支柱根なしに、これらの除草剤の作物中での使用を可能にする。ＡＡＤ−１２（ｖ１）によってＨＴＣにおける使用が可能となったそれぞれの代替除草剤は、単独で、タンク混合して、または順次使用するかにかかわらず、本発明の範囲内にあるとみなされる。
コメにおけるＡＡＤ−１２（ｖ１）
培地の説明：用いた培養培地を１ＭのＫＯＨでｐＨ５．８に調節し、２．５ｇ／ＬのＰｈｙｔａｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）で固化した。胚形成カルスを、４０ｍｌの半固体培地を含有する１００×２０ｍｍのペトリ皿中で培養した。コメ小植物をＭａｇｅｎｔａボックス内の５０ｍｌの培地上で成長させた。細胞懸濁液を３５ｍｌの液体培地を含有する１２５ｍｌの三角フラスコ中に維持し、１２５ｒｐｍで回転した。胚形成培養物の誘導および維持は暗所、２５〜２６℃で行い、植物再生および全植物培養は１６時間の光周期で行った（Zhangら、1996）。
胚形成カルスの誘導および維持は、以前に記載したが（Liら、1993）、５００ｍｇ／Ｌのグルタミンを含有するように適応させたＮＢ基本培地上で行った。懸濁培養を開始し、マルトースの代わりに３０ｇ／Ｌのスクロースを含めたＳＺ液体培地（Zhangら、1998）中で維持した。浸透圧培地（ＮＢＯ）はそれぞれ０．２５６Ｍのマンニトールおよびソルビトールを添加したＮＢ培地からなっていた。ハイグロマイシン−Ｂ抵抗性カルスを５０ｍｇ／ＬのハイグロマイシンＢを添加したＮＢ培地上で３〜４週間選択した。前再生は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を含まないが、２ｍｇ／Ｌの６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、１ｍｇ／Ｌのα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、５ｍｇ／Ｌのアブシシン酸（ＡＢＡ）および５０ｍｇ／ＬのハイグロマイシンＢを添加したＮＢ培地からなる培地（ＰＲＨ５０）上で１週間行った。続いて、２，４−Ｄを含まず、３ｍｇ／ＬのＢＡＰ、０．５ｍｇ／ＬのＮＡＡ、および５０ｍｇ／ＬのハイグロマイシンＢを添加したＮＢ培地を幅う再生培地（ＲＮＨ５０）上での培養によって、苗条が再生されるまで小植物の再生を行った。苗条を、半強度のムラシゲ＆スクーグ基底塩およびガンボーグのＢ５ビタミンを含み、１％のスクロースおよび５０ｍｇ／ＬのハイグロマイシンＢを添加した発根培地（１／２ＭＳＨ５０）に移した。
組織培養物の発生：オリザ・サティバＬ．ジャポニカｃｖ．タイペイ３０９（Oryza sativa L. japonica cv. Taipei 309）の成熟乾燥種子をZhangら、1996に記載のように滅菌した。無菌的な成熟コメ種子をＮＢ培地上、暗所で培養することによって。胚形成組織を誘導した。直径約１ｍｍの一次カルスを胚盤から取り出し、ＳＺ液体培地中での細胞懸濁培養を開始するために使用した。その後、Zhang 1995に記載のように懸濁液を維持した。その前の継代培養の３〜５日後に、懸濁液に由来する胚形成組織を液体培養から取り出し、ＮＢＯ浸透圧培地上に置いてペトリ皿内に直径約２．５ｃｍの丸を形成し、４時間（hous）培養した後に照射した。照射の１６〜２０時間後、照射した表面が上向きであることを確実にして、組織をＮＢＯ培地からＮＢＨ５０ハイグロマイシンＢ選択培地上に移し、暗所で１４〜１７日間インキュベーションした。その後、新しく形成されたカルスを元の照射した外植片から分離し、同じ培地上の近くに置いた。さらに８〜１２日間後、比較的小型の不透明なカルスが視覚的に同定され、ＰＲＨ５０前再生培地に７日間、暗所で移した。その後、より小型かつ不透明となった成長中のカルスをＲＮＨ５０再生培地上、１４〜２１日の期間、１６時間の光周期で継代培養した。再生中の苗条を、１／２ＭＳＨ５０培地を含有するＭａｇｅｎｔａボックスに移した。単一の外植片から再生された複数の植物は同胞であるとみなされ、１つの独立した植物系統として扱った。植物は、太い白色の根を生成し、１／２ＭＳＨ５０培地上で活発に成長した場合に、ｈｐｈ遺伝子について陽性であるとスコアづけした。小植物がＭａｇｅｎｔａボックスの上部に達した後、これらを６ｃｍの鉢中の土壌に１００％の湿度下で１週間移し、その後、１４時間の明期、３０℃および暗所、２１℃を有する成長チャンバに２〜３週間移動させた後、温室内の１３ｃｍの鉢内に移植した。種子を収集し、３７℃で１週間乾燥させた後に貯蔵した。
微粒子照射：すべての照射は微粒子銃ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ（登録商標）システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて実施した。３ミリグラムの直径１．０ミクロンの金粒子を１００％のエタノールで１回（one）、滅菌蒸留水で２回洗浄し、シリコン処理したエッペンドルフチューブ内の５０μｌの水中に再懸濁させた。１：６モル比のｐＤＯＷ３３０３（Ｈｐｔ含有ベクター）対ｐＤＡＢ４１０１（ＡＡＤ−１２（ｖ１）＋ＡＨＡＳ）を表す５マイクログラムのプラスミドＤＮＡ、２０μｌのスペルミジン（０．１Ｍ）および５０μｌの塩化カルシウム（２．５Ｍ）を金懸濁液に加えた。混合物を室温で１０分間インキュベーションし、１００００ｒｐｍで１０秒間ペレット化し、６０μｌの１００％冷エタノール中に再懸濁させ、８〜９μｌをそれぞれのマクロ担体上に分配した。組織試料は、Zhangら(1996)に記載のように１１００ｐｓｉおよび２７ｉｎのＨｇ真空で照射した。
ＡＡＤ−１２（ｖ１）で形質転換したＴ０コメにおける出芽後除草剤耐性：３〜５枚葉段階のコメ小植物に、１８７Ｌ／ｈａに較正したトラック噴霧器を使用して、１％のＳｕｎｉｔ ＩＩ（ｖ／ｖ）および１．２５％のＵＡＮ（ｖ／ｖ）を含有する、致死的用量の０．１６％（ｖ／ｖ）のＰｕｒｓｕｉｔの溶液（ＡＨＡＳ遺伝子の存在を確認するため）を噴霧した。感受性または抵抗性の評定を処理の３６日後（ＤＡＴ）に行った。温室に送った３３個の事象のうちの１０個はＰｕｒｓｕｉｔに対して頑強に耐性であり、他のものは変動的なレベルの除草剤損傷を被った。植物をサンプリングし、分子特徴づけを行い、それによりこれら１０個の事象のうちの７個がＡＡＤ−１２（ｖ１）ＰＴＵおよびＡＨＡＳコード領域全体の両方を含有すると同定された。
Ｔ１コメにおけるＡＡＤ−１２（ｖ１）の遺伝率：１００個植物の後代検定を、ＡＡＤ−１２（ｖ１）ＰＴＵおよびＡＨＡＳコード領域をどちらも含有していたＡＡＤ−１２（ｖ１）系統の５個のＴ１系統に対して実施した。上記手順を順守して種子を植えつけ、既に記載したようにトラック噴霧器を使用して１４０ｇ ａｅ／ｈａのイマゼタピルを噴霧した。１４ＤＡＴ後、抵抗性および感受性の植物を計数した。カイ二乗分析によって決定して、試験した５個の系統のうちの２個が単一座位の優性メンデル形質（３Ｒ：１Ｓ）として分離された。以下の２，４−Ｄ耐性試験によって決定して、ＡＡＤ−１２はＡＨＡＳ選択可能マーカーと一緒に分離された（coseregated）。
Ｔ１コメにおける高い２，４−Ｄ耐性の検証：以下のＴ１ ＡＡＤ−１２（ｖ１）単一分離座位系統をＭｅｔｒｏ Ｍｉｘ培地を含有する３インチの鉢に植えつけた：ｐＤＡＢ４１０１（２０）００３およびｐＤＡＢ４１０１（２７）００２。２〜３枚葉段階で１４０ｇ ａｅ／ｈａのイマゼタピルを噴霧した。ヌルを排除し、個体をＶ３〜Ｖ４段階で、１８７Ｌ／ｈａ、１１２０、２２４０または４４８０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ ＤＭＡ（それぞれ典型的な商業的使用量の２×、４×、および８×）に設定したトラック噴霧器にて噴霧した。植物を７および１４ＤＡＴに等級づけし、陰性対照植物として非形質転換の市販のコメ栽培品種「Ｌａｍｏｎｔ」と比較した。
損傷データ（表２２）は、ＡＡＤ−１２（ｖ１）で形質転換した系統は高い量の２，４−Ｄ ＤＭＡに対して非形質転換対照よりも耐性があることを示している。ｐＤＡＢ４１０１（２０）００３系統は高レベルの２，４−Ｄに対してｐＤＡＢ４１０１（２７）００２系統よりも耐性がある。また、データは、２，４−Ｄの耐性が少なくとも２世代の間安定であることも実証している。
組織収穫、ＤＮＡの単離および定量：新鮮な組織をチューブに入れ、４℃で２日間凍結乾燥した。組織が完全に乾燥した後、タングステンビーズ（Ｖａｌｅｎｉｔｅ）をチューブ内に入れ、試料を、Ｋｅｌｃｏビーズミルを使用した１分間の乾式粉砕に供した。その後、標準のＤＮｅａｓｙ ＤＮＡ単離手順を行った（Ｑｉａｇｅｎ、Ｄｎｅａｓｙ ６９１０９）。その後、抽出されたＤＮＡのアリコートをＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐ７５８９）で染色し、既知の標準物質を用いて蛍光光度計（florometer）（ＢｉｏＴｅｋ）で走査して、濃度をｎｇ／μｌで得た。
ＡＡＤ−１２（ｖ１）の発現：３３個すべてのＴ０トランスジェニックコメ系統および１個の非トランスジェニック対照を、ＥＬＩＳＡブロットを使用してＡＡＤ−１２発現について分析した。ＡＡＤ−１２は２０個の系統のクローン中で検出されたが、Ｔａｉｐａｉ ３０９系統の対照植物では検出されなかった。一部のクローンがイマゼタピルに対して耐性であった２０個の系統のうちの１２個は、ＡＡＤ−１２タンパク質を発現しており、ＡＡＤ−１２ ＰＣＲ ＰＴＵ陽性であり、ＡＨＡＳコード領域が陽性であった。発現レベルは２．３〜１０９２．４ｐｐｍの全可溶性タンパク質の範囲であった。
２，４−Ｄおよびトリクロピル除草剤に対するｐＤＡＢ４１０１コメ植物の圃場耐性：圃場レベル耐性試験を、ＡＡＤ−１２（ｖ１）事象ｐＤＡＢ４１０１［２０］および１つの野生型コメ（Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ１３１）を用いて、ミシシッピー州Ｗａｙｓｉｄｅで実施した（非トランスジェニックイミダゾリノン抵抗性の変種）。実験設計は完全乱塊法であり、単一の反復を行った。除草剤処理は２２４０ｇ ａｅ／ｈａの２×量の２，４−Ｄ（ジメチルアミン塩）および５６０ｇ ａｅ／ｈａのトリクロピルならびに未処理の対照であった。それぞれの除草剤処理内で、小さなプロットドリルを使用して２列のＴ１世代ｐＤＡＢ４１０１［２０］および２列のＣｌｅａｒｆｉｅｌｄのコメを８インチの列間隔で植えつけた。ｐＤＡＢ４１０１［２０］コメは、ＡＡＤ−１２（ｖ１）遺伝子の選択可能マーカーとしてＡＨＡＳ遺伝子を含有していた。イマゼタピルは、１枚葉段階で、すべてのＡＡＤ−１２（ｖ１）ヌル植物を区画から除去するための選択剤として施用した。除草剤処理は、コメが２枚葉段階に達した際に、１８７Ｌ／ｈａの担体体積を１３０〜２００ｋｐａの圧力で送達する圧縮空気背負い式噴霧器を使用して施用した。損傷の視覚的評定を施用の７、１４および２１日後に行った。
２，４−Ｄおよびトリクロピルに対するＡＡＤ−１２（ｖ１）事象の応答を表２３中に示す。形質転換していないコメ系統（Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ）は、４×商業的使用量とみなされる２２４０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄによって重度の損傷を受けた（７ＤＡＴに３０％および１５ＤＡＴに３５％）。ＡＡＤ−１２（ｖ１）事象は、２，４−Ｄに対して優れた耐性を実証し、７または１５ＤＡＴに損傷が観察されなかった。形質転換していないコメは、２×量のトリクロピル（５６０ｇ ａｅ／ｈａ）によって有意に損傷を受けていた（７ＤＡＴに１５％および１５ＤＡＴに２５％）。ＡＡＤ−１２（ｖ１）事象は２×量のトリクロピルに対して優れた耐性を実証し、７または１５ＤＡＴのどちらでも損傷が観察されなかった。
これらの結果は、ＡＡＤ−１２（ｖ１）で形質転換したコメが、Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄのコメに対して重度の視覚的損傷を引き起こした量の２，４−Ｄおよびトリクロピルに対する高レベルの抵抗性を示したことを示している。また、複数の除草剤耐性遺伝子をＡＡＤ−１２ Ｉの複数の種とスタッキングして、より広範囲の有効な化学に対するに対する抵抗性をもたらす能力も実証している。
キャノーラにおけるＡＡＤ−１２（ｖ１）
キャノーラの形質転換：２，４−Ｄに対する抵抗性を与えるＡＡＤ−１２（ｖ１）遺伝子を使用して、セイヨウアブラナ（Brassica napus）変種Ｎｅｘｅｒａ＊７１０を、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）媒介性の形質転換およびプラスミドｐＤＡＢ３７５９で形質転換した。構築物は、ＣｓＶＭＶプロモーターによって駆動されるＡＡＤ−１２（ｖ１）遺伝子およびＡｔＵｂｉ１０プロモーターによって駆動されるＰａｔ遺伝子ＡｔＵｂｉ１０プロモーターによって駆動されるＥＰＳＰＳグリホサート抵抗形質を含有していた。
種子を１０％の市販の漂白剤で１０分間表面滅菌し、滅菌蒸留水で３回濯いだ。その後、種子を半分濃度のＭＳ基本培地（MurashigeおよびSkoog、1962）上に置き、２５℃に設定した成長レジームおよび１６時間の明／８時間の暗の光周期下で維持した。
胚軸セグメント（３〜５ｍｍ）を５〜７日齢の実生から切除し、前処理としてカルス誘導培地Ｋ１Ｄ１（１ｍｇ／Ｌのキネチンおよび１ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含むＭＳ培地）上に３日間置いた。その後、セグメントをペトリ皿内に移し、ｐＤＡＢ３７５９を含有するアグロバクテリウム属（Agrobacterium）Ｚ７０７ＳまたはＬＢＡ４４０４株で処理した。アグロバクテリウム属（Agrobacterium）を終夜、２８℃、暗所で、１５０ｒｐｍの振盪器上で成長させ、続いて培養培地中に再懸濁させた。
胚軸セグメントをアグロバクテリウム属（Agrobacterium）で３０分間処理した後、これらをカルス誘導培地上に戻して３日間置いた。同時培養後、セグメントをＫ１Ｄ１ＴＣ（２５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリンおよび３００ｍｇ／ＬのＴｉｍｅｎｔｉｎを含有するカルス誘導培地）上に置いて１週間または２週間回復させた。あるいは、セグメントを選択培地Ｋ１Ｄ１Ｈ１（１ｍｇ／ＬのＨｅｒｂｉａｃｅを含む上記培地）上に直接置いた。カルベニシリンおよびＴｉｍｅｎｔｉｎがアグロバクテリウム属（Agrobacterium）を死滅させるために使用する抗生物質であった。選択剤Ｈｅｒｂｉａｃｅにより形質転換細胞の成長が許容された。
その後、カルス形成した胚軸セグメントをＢ３Ｚ１Ｈ１（ＭＳ培地、３ｍｇ／Ｌのベンジルアミノプリン、１ｍｇ／Ｌのゼアチン、０．５ｇｍ／ＬのＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］、５ｍｇ／Ｌの硝酸銀、１ｍｇ／ＬのＨｅｒｂｉａｃｅ、カルベニシリンおよびＴｉｍｅｎｔｉｎ）苗条再生培地上に置いた。２〜３週間後に苗条が再生し始めた。胚軸セグメントを苗条と共に、Ｂ３Ｚ１Ｈ３培地（ＭＳ培地、３ｍｇ／Ｌのベンジルアミノプリン、１ｍｇ／Ｌのゼアチン、０．５ｇｍ／ＬのＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］、５ｍｇ／Ｌの硝酸銀、３ｍｇ／ＬのＨｅｒｂｉａｃｅ、カルベニシリンおよびＴｉｍｅｎｔｉｎ）にさらに２〜３週間移した。
苗条を胚軸セグメントから切除し、苗条伸長培地ＭＥＳＨ５またはＭＥＳ１０（ＭＳ、０．５ｇｍ／ＬのＭＥＳ、５または１０ｍｇ／ＬのＨｅｒｂｉａｃｅ、カルベニシリン、Ｔｉｍｅｎｔｉｎ）に２〜４週間移した。根誘導のために伸長した苗条をＭＳＩ．１（０．１ｍｇ／Ｌのインドール酪酸を含むＭＳ）上で培養する。植物が十分に確立された根系を有した後、これらを土壌に移植した。植物をＣｏｎｖｉｒｏｎ内の制御された環境条件下で１〜２週間気候順化させた後、温室に移した。
分子分析−キャノーラの材料および方法：組織収穫、ＤＮＡの単離および定量。新鮮な組織をチューブに入れ、４℃で２日間凍結乾燥した。組織が完全に乾燥した後、タングステンビーズ（Ｖａｌｅｎｉｔｅ）をチューブ内に入れ、試料を、Ｋｅｌｃｏビーズミルを使用した１分間の乾式粉砕に供した。その後、標準のＤＮｅａｓｙ ＤＮＡ単離手順を行った（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙ ６９１０９）。その後、抽出されたＤＮＡのアリコートをＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐ７５８９）で染色し、既知の標準物質を用いて蛍光光度計（ＢｉｏＴｅｋ）で読み取って、濃度をｎｇ／μｌで得た。
ポリメラーゼ連鎖反応：合計１００ｎｇの全ＤＮＡを鋳型として使用した。２０ｍＭのそれぞれのプライマーをＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ ＰＣＲポリメラーゼキット（Ｍｉｒｕｓ ＴＡＫＲＲ００１Ａ）と共に使用した。コード領域ＰＣＲ ＡＡＤ−１２（ｖ１）のプライマーは（配列番号１０）（順方向）および（配列番号１１）（逆方向）であった。ＰＣＲ反応は、９７００ Ｇｅｎｅａｍｐサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で、試料を９４℃で３分間、３５サイクルの９４℃で３０秒間と、６５℃で３０秒間と、７２℃で２分間、次いで７２℃で１０分間に供することによって実施した。ＰＣＲ産物は、ＥｔＢｒで染色した１％アガロースゲル上の電気泳動によって分析した。ＡＡＤ−１２（ｖ１）事象を有する３５個の植物からの３５個の試料が陽性の試験結果となった。３個の陰性対照試料は陰性の試験結果となった。
ＥＬＩＳＡ：以前のセクションに記載した確立されたＥＬＩＳＡを使用して、ＡＡＤ−１２タンパク質が５個の異なるキャノーラ形質転換植物事象において検出された。発現レベルは、１４から７００ｐｐｍを超える全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）の範囲であった。３つの異なる非形質転換植物試料を並行して試験し、シグナルは検出されず、これは、アッセイで使用した抗体がキャノーラ細胞マトリックスと最小限の交差反応性しか有さないことを示している。また、これらの試料はウエスタン分析によって陽性であることが確認された。結果の要約を表２４中に提示する。
ＡＡＤ−１２（ｖ１）で形質転換したＴ０キャノーラにおける出芽後除草剤耐性：構築物ｐＤＡＢ３７５９で形質転換したもののうちの４５個のＴ０事象を一定期間の間に温室に送り、温室内で気候順化させた。２〜４枚の新しい正常に見える葉が出芽するまで（すなわち、植物が組織培養物から温室成長の条件へと移行するまで）植物を成長させた。その後、植物を５６０ｇ ａｅ／ｈａの量の致死的用量の市販の２，４−Ｄアミン４の配合物で処理した。除草剤施用は、トラック噴霧器を用いて、１８７Ｌ／ｈａの噴霧体積、５０ｃｍの噴霧高で行った。致死的用量とは、非形質転換対照に９５％超の損傷を引き起こす量として定義される。
事象のうちの２４個が２，４−Ｄ ＤＭＡ除草剤施用に対して耐性であった。一部の事象は軽微な損傷を受けたが、１４ＤＡＴまでに回復した。事象を制御されたバッグ内の条件下で自家受粉によってＴ１（およびＴ２世代）まで進行させた。
キャノーラにおけるＡＡＤ−１２（ｖ１）の遺伝率：また、１００個植物の後代検定も、ＡＡＤ−１２（ｖ１）の１１個のＴ１系統に対して実施した。種子を蒔き、Ｍｅｔｒｏ Ｍｉｘ培地を満たした３インチの鉢に移植した。その後、既に記載したようにすべての植物に５６０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ ＤＭＡを噴霧した。１４ＤＡＴ後、抵抗性および感受性の植物を計数した。カイ二乗分析によって決定して、試験した１１個の系統のうちの７個が単一座位の優性メンデル形質（３Ｒ：１Ｓ）として分離された。ＡＡＤ−１２は、複数の種において頑強なアリールオキシアルカノエートオーキシン抵抗性遺伝子として遺伝性であり、１つまたは複数の追加の除草剤抵抗性遺伝子とスタッキングすることができる。
キャノーラにおけるＡＡＤ−１２（ｖ１）の遺伝率：また、１００個植物の後代検定も、ＡＡＤ−１２（ｖ１）の１１個のＴ１系統に対して実施した。種子を蒔き、Ｍｅｔｒｏ Ｍｉｘ培地を満たした３インチの鉢に移植した。その後、既に記載したようにすべての植物に５６０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ ＤＭＡを噴霧した。１４ＤＡＴ後、抵抗性および感受性の植物を計数した。カイ二乗分析によって決定して、試験した１１個の系統のうちの７個が単一座位の優性メンデル形質（３Ｒ：１Ｓ）として分離された。ＡＡＤ−１２は、複数の種において頑強なアリールオキシアルカノエートオーキシン抵抗性遺伝子として遺伝性であり、１つまたは複数の追加の除草剤抵抗性遺伝子とスタッキングすることができる。
Ｔ１キャノーラにおける高い２，４−Ｄ耐性の検証：Ｔ１ ＡＡＤ−１２（ｖ１）には、５〜６ｍｇの種子を層積貯蔵し、蒔き、Ｓｕｎｓｈｉｎｅ Ｍｉｘ＃５培地の薄い層を土壌の上層として加えた。５６０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄを用いて出芽中の植物を植えつけの７および１３日後に選択した。
生き延びた植物をＭｅｔｒｏ Ｍｉｘ培地を含有する３インチの鉢内に移植した。また、５６０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄで選択した、Ｔ１子孫からの生き延びた植物も、Ｍｅｔｒｏ Ｍｉｘ土壌を満たした３インチの鉢内に移植した。２〜４枚葉段階で、植物に２８０、５６０、１１２０、または２２４０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ ＤＭＡのいずれかを噴霧した。植物を３および１４ＤＡＴに等級づけし、非形質転換対照植物と比較した。１４ＤＡＴでのＴ１事象の損傷データのサンプリングが表２５中に見られ得る。データは、複数の事象が２２４０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄに対して頑強に抵抗性である一方で、他の事象は１１２０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄまでに対してより弱い耐性を実証したことを示唆している。生き延びた植物を、Ｍｅｔｒｏ Ｍｉｘ培地を含有する５１／４’’の鉢に移植し、以前と同じ成長条件下におき、自家受粉させて、ホモ接合性種子のみを生成させた。
２，４−Ｄ、ジクロプロップ（Dichloprop）、トリクロピルおよびフルオロキシピル除草剤に対するｐＤＡＢ３７５９キャノーラ植物の圃場耐性：圃場レベル耐性試験を、２つのＡＡＤ−１２（ｖ１）事象３７５９（２０）０１８．００１および３７５９（１８）０３０．００１ならびに野生型キャノーラ（Ｎｅｘ７１０）に対して、インディアナ州Ｆｏｗｌｅｒで実施した。実験設計は完全乱塊法であり、３回の反復を行った。除草剤処理は、２８０、５６０、１１２０、２２４０および４４８０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ（ジメチルアミン塩）、８４０ｇ ａｅ／ｈａのトリクロピル、２８０ｇ ａｅ／ｈａのフルオロキシピル、および未処理の対照であった。それぞれの除草剤処理内で、事象３７５９（１８）０３０．００１１、３７５９（１８）０１８．００１、および野生型系統（Ｎｅｘ７１０）の単一の２０ｆｔの列／事象を、４列ドリルを用いて８インチの列間隔で植えつけた。除草剤処理は、キャノーラが４〜６枚葉段階に達した際に、１８７Ｌ／ｈａの担体体積を１３０〜２００ｋｐａの圧力で送達する圧縮空気背負い式噴霧器を使用して施用した。視覚的損傷の評定を施用の７、１４および２１日後に行った。
２，４−Ｄ、トリクロピル、およびフルオロキシピルに対するキャノーラの応答を表２６中に示す。野生型キャノーラ（Ｎｅｘ７１０）は、４×量とみなされる２２４０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄによって重度の損傷を受けた（１４ＤＡＴに７２％）。ＡＡＤ−１２（ｖ１）事象はすべて、１４ＤＡＴにおいて２，４−Ｄに対して優れた耐性を実証し、それぞれ１、２および４×量で２、３および２％の平均損傷が観察された。野生型キャノーラは、２×量のトリクロピル（８４０ｇ ａｅ／ｈａ）によって重度の損傷を受けた（１４ＤＡＴに２５％）。ＡＡＤ−１２（ｖ１）事象は、２×量のトリクロピルで耐性を実証し、１４ＤＡＴに２個の事象にわたって平均６％の損傷であった。２８０ｇ ａｅ／ｈａのフルオロキシピルは、１４ＤＡＡに形質転換していない系統に対して重度の損傷（３７％）を引き起こした。ＡＡＤ−１２（ｖ１）事象は、５ＤＡＴに平均８％の損傷を伴う増加した耐性を実証した。
これらの結果は、ＡＡＤ−１２（ｖ１）で形質転換した事象が、形質転換していないキャノーラに対して致死的である、または重度の上偏生長性形成異常を引き起こした量の２，４−Ｄ、トリクロピルおよびフルオロキシピルに対する高レベルの抵抗性を示したことを示している。ＡＡＤ−１２は２，４−Ｄ＞トリクロピル＞フルオロキシピルの相対的有効性を有することが示されている。
ＡＡＤ−１２ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４の形質転換および選択
トランスジェニックダイズ（Glycine max）事象ＤＡＳ−６８４１６−４を、ダイズ子葉節外植片のアグロバクテリウム属（Agrobacterium）媒介性の形質転換によって作製した。選択可能マーカー（ｐａｔ）および目的遺伝子（ＡＡＤ−１２）をＴ鎖ＤＮＡ領域内に有するバイナリーベクターｐＤＡＢ４４６８（図２）を保有する、防御解除したアグロバクテリウム属（Agrobacterium）の株ＥＨＡ１０１（Hoodら、2006）を使用して形質転換を開始した。
アグロバクテリウム属（Agrobacterium）媒介性の形質転換を実施した。手短に述べると、ダイズ種子（ｃｖ Ｍａｖｅｒｉｃｋ）を基底培地上で発芽させ、子葉節を単離し、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）に感染させた。アグロバクテリウム属（Agrobacterium）を除去するために、苗条開始、苗条伸長、および発根の培地にはセフォタキシム、ｔｉｍｅｎｔｉｎおよびバンコマイシンを添加した。グルホシネート選択を用いて形質転換していない苗条の成長を阻害した。選択された苗条を根発達のために発根培地に移し、その後、小植物の気候順化のための土壌混合物に移した。
選択された小植物の末端小葉にグルホシネートを葉塗布して、推定上の形質転換体についてスクリーニングした。スクリーニングされた小植物を温室に移し、気候順化させ、その後、耐性を再確認するためにグルホシネートを葉塗布し、推定上の形質転換体であるとみなされた。スクリーニングされた植物をサンプリングし、選択可能マーカー遺伝子および／または目的遺伝子を確認するための分子分析を実施した。Ｔ０植物を温室内で自家受粉させてＴ１種子を生じさせた。
Ｔ１植物をを優良な生殖質（Ｍａｖｅｒｉｃｋ）内に戻し交雑および浸透交雑させた。この事象、ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４は、独立した形質転換した単離体から作製された。事象は、単一挿入部位、正常なメンデル分離および安定発現などのその独特の特徴、ならびに、幅広い遺伝子型背景および複数の環境的位置にわたる除草剤耐性および農耕学的性能を含めた、有効性の優れた組合せに基づいて選択した。ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４のさらなる説明は、その全体が参照により組み込まれているＷＯ２０１１／０６６３８４号に開示されている。
２００８年の農耕学的データの作成
事象ＤＡＳ−６８４１６−４のダイズおよび非トランスジェニック対照（変種Ｍａｖｅｒｉｃｋ）を用いた農耕学的研究を、２００８年に、アイオワ州、イリノイ州、インディアナ州、ネブラスカ州およびカナダのオンタリオ州（２箇所）に位置する６箇所で実施した。立毛／集団数、実生／植物の活力、植物の高さ、倒伏、病害の発生率、昆虫被害、および開花までの日数を含めた農耕学的決定要因を評価して、対照系統Ｍａｖｅｒｉｃｋと比較したダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４（除草剤処理ありおよびなし）の等価性を調査した。本研究を農耕学的実験Ｓ１と呼ぶ。
試験および対照ダイズ種子を、２５ｆｔの列あたり約１１２個の種子の種子率、約３０インチ（７５ｃｍ）の列間隔で植えつけた。それぞれの箇所で、それぞれの処理の３つの反復区画を確立し、各区画は２〜２５ｆｔの列からなっていた。区画を完全乱塊法（ＲＣＢ）で配置し、それぞれの箇所で独自にランダム化されていた。各ダイズ区画には同様の成熟の２列の非トランスジェニックダイズが境界隣接していた。試験箇所全体は、最低１０ｆｔの同様の相対的成熟の非トランスジェニックダイズによって囲まれていた。
除草剤処理は約２０ガロン／エーカー（１８７Ｌ／ｈａ）の噴霧体積で施用した。これらの施用は、最大表示率の商業的実施を再現するために設計した。２，４−Ｄは、３ｌｂ ａｅ／Ａのシーズン中の合計の、３回の散布の度が過ぎた施用として施用した。１．０ｌｂ ａｅ Ａ（１，１２０ｇ／ｈａ）の個々の施用を出芽前ならびに約Ｖ４およびＲ２成長段階に行った。グルホシネートは、０．７４ｌｂ ａｉ／Ａ（８２８ｇ ａｉ／ｈａ）のシーズン中の合計の、２回の散布の度が過ぎた施用として施用した。０．３３ｌｂ ａｉ／Ａおよび０．４１ｌｂ ａｉ／Ａ（３７４および４５４ｇ ａｉ／ｈａ）の個々の施用を約Ｖ６およびＲ１成長段階に行った。
混合モデル（ＳＡＳバージョン８、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １９９９年）を使用して、農耕学的データについて圃場箇所にわたる分散分析を実施した。エントリーは固定効果としてみなし、場所、場所内のブロック、エントリーによる場所、および場所内のブロックによるエントリーを変量効果として指定した。全体的な処理効果の有意性はＦ検定を使用して推定した。対応対比を、対照と非噴霧ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４（非噴霧）、グルホシネートを噴霧したダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４（ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート）、２，４−Ｄを噴霧したダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４（ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ）、ならびにグルホシネートおよび２，４−Ｄをどちらも噴霧したダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４（ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４＋両方）のトランスジェニックエントリーとの間で、ｔ検定を使用して行った。また、多重度を制御するために偽発見率（ＦＤＲ）を使用して調整Ｐ値も計算した（BenjaminiおよびHochberg、1995）。
対照、ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４非噴霧、ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ、ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、およびダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤から収集した農耕学的データの分析を実施した。立毛数、初期集団、実生の活力、施用後の損傷、倒伏、最終立毛数、または開花までの日数について統計的に有意な差異は観察されなかった（表２８）。高さでは、対照とダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ噴霧との間で有意な対応有意な対応ｔ検定が観察された。しかし、有意な全体的な処理効果は観察されず、ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４処理と対照との間の差異は非常に小さく、差異は様々なダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４処理間で共通していなかった。これらの結果に基づいて、ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４は準同質遺伝子非トランスジェニック対照と農耕学的に等価であった。
２００９年の農耕学的データの作成
ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４および非トランスジェニック対照（変種Ｍａｖｅｒｉｃｋ）を用いた農耕学的研究を、２００９年に、アーカンソー州、アイオワ州、イリノイ州、インディアナ州、ミズーリ州、およびネブラスカ州に位置する８箇所で実施した。立毛／集団数、実生／植物の活力、植物の高さ、病害の発生率、昆虫被害、および開花までの日数を含めた農耕学的決定要因を評価して、対照と比較したダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４のダイズ（除草剤処理ありおよびなし）の等価性を調査した（表２９）。
完全乱塊法を試験に使用した。エントリーは、ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照系統、および市販の非トランスジェニックダイズ系統であった。試験、対照および参照ダイズ種子を、１列あたり約１１２個の種子の種子率、約３０インチ（７５ｃｍ）の列間隔で植えつけた。それぞれの箇所で、それぞれの処理の４つの反復区画を確立し、各区画は２〜２５ｆｔの列からなっていた。各ダイズ区画には２列の非トランスジェニックダイズ（Ｍａｖｅｒｉｃｋ）が境界隣接していた。試験箇所全体は、最低４列（または１０ｆｔ）の非トランスジェニックダイズ（Ｍａｖｅｒｉｃｋ）によって囲まれていた。農耕学的に許容される作物を生成するために適切な昆虫、雑草、および病害の防除の実施を施用した。
最大表示率の商業的実施を再現するために除草剤処理を施用した。処理は、非噴霧対照ならびに指定された成長段階に施用した２，４−Ｄ、グルホシネート、２，４−Ｄ／グルホシネートの除草剤施用からなっていた。２，４−Ｄの施用には、除草剤を１．０ｌｂ ａｅ／Ａ（１，１２０ｇ ａｅ／ｈａ）の量で、Ｖ４およびＲ２成長段階に施用した。グルホシネート処理には、Ｖ４およびＶ６〜Ｒ２成長段階に植物に施用を行った。両方の施用には、グルホシネートを０．３３ｌｂ ａｉ／Ａ（３７４ｇ ａｉ／ｈａ）および０．４１ｌｂ ａｉ／Ａ（４５４ｇ ａｉ／ｈａ）の量で、それぞれＶ４およびＶ６〜Ｒ２での施用に施用した。どちらの除草剤施用のエントリーも、ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４および非トランスジェニックＭａｖｅｒｉｃｋを含めた対照であった。Ｍａｖｅｒｉｃｋ区画は除草剤施用後に死滅することが予想された。
混合モデル（ＳＡＳバージョン８、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １９９９年）を使用して、農耕学的データについて圃場箇所にわたる分散分析を実施した。エントリーは固定効果としてみなし、場所、場所内のブロック、エントリーによる場所、および場所内のブロックによるエントリーを変量効果として指定した。個々の場所での分析は、エントリーを固定効果とし、ブロックおよびブロックによるエントリーを変量効果として、同様の様式で行った。データは統計分析のために四捨五入しなかった。有意差は９５％の信頼水準で宣言し、全体的な処理効果の有意性はＦ検定を使用して推定した。対応対比を、非噴霧ＡＡＤ−１２（非噴霧）、グルホシネートを噴霧したＡＡＤ−１２（ＡＡＤ−１２＋グルホシネート）、２，４−Ｄを噴霧したＡＡＤ−１２（ＡＡＤ−１２＋２，４−Ｄ）、ならびにグルホシネートおよび２，４−Ｄをどちらも噴霧したＡＡＤ−１２（ＡＡＤ−１２＋２，４−Ｄ＋グルホシネート）のトランスジェニックエントリーと対照エントリーとの間で、ｔ検定を使用して行った。
本研究における多数の対比が原因で、多重度が問題であった。多重度は、予想外の効果を探すために多数の比較を単一の研究で行う場合に問題となる。これらの条件下では、比較ごとのＰ値に基づいて差異を誤って宣言する確率が非常に高い（１−０．９５比較（comparisoils）の数）。本研究では、１つの分析物あたり４つの比較が存在し（１６個の分析された農耕学的観察型）、６４個の農耕学的比較が生じる。したがって、未調整のＰ値に基づいて１つまたは複数の偽の差異を宣言する確率は農耕学的に９９％であった（１−０．９５６４）。
対照、ＡＡＤ−１２非噴霧、ＡＡＤ−１２＋グルホシネート、ＡＡＤ−１２＋２，４−Ｄ、およびＡＡＤ−１２＋２，４−Ｄ＋グルホシネートのエントリーから収集した農耕学的データの分析を実施した。箇所にわたる分析には、実生の活力、最終集団、植物の活力／損傷（Ｖ４、Ｒ１）、倒伏、病害の発生率、昆虫被害、開花までの日数、成熟までの日数、鞘の数、種子の数、収量、および植物の高さについて統計的に有意な差異は観察されなかった。立毛数および初期集団では、対照とＡＡＤ−１２＋グルホシネートエントリーとの間で有意な対応有意な対応ｔ検定が観察されたが、有意な全体的な処理効果またはＦＤＲ調整Ｐ値を伴っていなかった。植物の活力／損傷（Ｒ２）では、有意な対応ｔ検定および有意な全体的な処理効果が対照とＡＡＤ−１２＋グルホシネートおよびＡＡＤ−１２＋２，４−Ｄ＋グルホシネートのエントリーの両方との間で観察されたが、有意なＦＤＲ調整Ｐ値を伴っていなかった。これらすべての変数の平均結果も、本研究において試験した参照系統について見出された範囲内にあった。
ＡＡＤ１事象ｐＤＡＳ１７４０−２７８の形質転換および選択
ＡＡＤ１事象であるｐＤＡＳ１７４０−２７８を、トウモロコシ系統Ｈｉ−ＩＩの髭結晶媒介性の形質転換によって生成した。使用した形質転換方法は米国特許出願第２００９００９３３６６号に記載されている。ｐＤＡＢ３８１２とも呼ばれるプラスミドｐＤＡＳ１７４０（図３）のＦｓｐｌ断片をトウモロコシ系統内に形質転換した。このプラスミド構築物は、ＲＢ７ ＭＡＲｖ３：：トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターｖ２／／ＡＡＤ１ ｖ３／／トウモロコシ（Zea mays）ＰＥＲ５ ３’ＵＴＲ：：ＲＢ７ ＭＡＲｖ４植物転写単位（ＰＴＵ）を含有する発現カセットを含有する。
数々の事象を生成した。生存して健康なハロキシホップ抵抗性のカルス組織を生成した事象に、推定上の形質転換事象を表すユニークな同定コードを割り当て、新鮮な選択培地に連続的に移した。それぞれのユニークな事象に由来する組織から植物を再生し、温室に移した。
葉試料を分子分析のために採取して、サザンブロット、ＤＮＡ境界確認、およびゲノムマーカー支援の確認によってＡＡＤ−１導入遺伝子の存在を検証した。陽性Ｔ０植物を自殖系統と受粉させてＴ１種子を得た。事象ｐＤＡＳ１４７０−２７８−９（ＤＡＳ−４０２７８−９）のＴ１植物を選択し、５世代の間自家受粉させ、特徴づけた。他方で、マーカー支援の選択によって数世代の間、Ｔ１植物を優良な生殖質（ＸＨＨ１３）内に戻し交雑および浸透交雑させた。この事象は、独立した形質転換した単離体から作製された。事象は、単一挿入部位、正常なメンデル分離および安定発現などのその独特の特徴、ならびに、幅広い遺伝子型背景および複数の環境的位置にわたる除草剤耐性および農耕学的性能を含めた、有効性の優れた組合せに基づいて選択した。トウモロコシ事象ｐＤＡＳ−１７４０−２７８−９に関するさらなる説明は、その全体が参照により組み込まれているＷＯ２０１１／０２２４６９号に開示されている。
除草剤の施用および農耕学的データ
除草剤処理は約２０ガロン／エーカー（１８７Ｌ／ｈａ）の噴霧体積で施用した。
これらの施用は、最大表示率の商業的実施を再現するために設計した。濃度３９％、３，７６ｌｂ ａｅ／ｇａｌ、４５１ｇ ａｅ／ｌのＷｅｅｄａｒ ６４（０２６４９１−０００６）、ならびに濃度１０．２％、０．８７ｌｂ ａｉ／ｇａｌ、１０４ｇ ａｉ／ｇのＡｓｓｕｒｅ ＩＩ（１０６１５５）を使用した。
２，４−Ｄ（Ｗｅｅｄａｒ ６４）は、３回の散布の度が過ぎた施用として試験エントリー４および５に施用した（シーズン中の合計は３ｌｂ ａｅ／Ａ）。個々の施用は出芽前ならびに約Ｖ４およびＶ８〜Ｖ８．５段階であった。個々の標的施用量は、Ｗｅｅｄａｒ ６４では１．０ｌｂ ａｅ／Ａ、すなわち１１２０ｇ ａｅ／ｈａであった。実際の施用量は１０９６〜１２３１ｇ ａｅ／Ａの範囲であった。
キザロホップ（Ａｓｓｕｒｅ ＩＩ）は、１回の散布の度が過ぎた施用として試験エントリー３および５に施用した。施用タイミングは約Ｖ６成長段階であった。標的施用量は、Ａｓｓｕｒｅ ＩＩでは０．０８２５ｌｂ ａｉ／Ａ、すなわち９２ｇ ａｉ／ｈａであった。実際の施用量は９０．８〜１０３ｇ ａｉ／ｈａの範囲であった。農耕学的特徴を、それぞれの場所のブロック２、３、および４内のすべての試験エントリーについて記録した。表３０は測定した特長を列挙する。
対照、ａａｄ−１非噴霧、ａａｄ−１＋２，４−Ｄ、ａａｄ−１＋キザロホップ、およびａａｄ−１＋両方のエントリーから収集した農耕学的データの分析を実施した。箇所にわたる分析には、様々な場所にわたる分析の要約における初期集団（Ｖ１およびＶ４）、活力、最終集団、作物被害、絹糸発生までの期間、花粉飛散までの期間、茎の倒伏、根の倒伏、病害の発生率、昆虫被害、成熟までの日数、植物の高さ、ならびに花粉の生存度（形状および色）の値について、統計的に有意な差異は観察されなかった。緑色維持および穂の高さでは、有意な対応ｔ検定が対照とａａｄ−１＋キザロホップのエントリーとの間で観察されたが、有意な全体的な処理効果または偽発見率（ＦＤＲ）調整Ｐ値を伴っていなかった（表３１）。
さらなるアルゴン（Argonomic）試験
準同質遺伝子系統のトウモロコシ系統と比較したトウモロコシ系統４０２７８の農耕学的特徴を多様な環境にわたって評価した。処理には、合計２１箇所にわたって試験した、４個の遺伝子的に明白に異なるハイブリッドおよびその適切な準同質遺伝子系統対照ハイブリッドを含めた。
４個の試験ハイブリッドは、９９〜１１３日の相対的成熟の範囲の、中生から晩熟のハイブリッドであった。実験Ａでは、自殖Ｃ×ＢＣ３Ｓ１転換の遺伝的背景における事象ＤＡＳ−４０２７８−９を試験した。このハイブリッドは１０９日間の相対的成熟を有しており、１６箇所で試験した（表３２）。実験Ｂでは、１１３日の相対的成熟のハイブリッドである自殖Ｅ×ＢＣ３Ｓ１転換のハイブリッド背景を試験した。このハイブリッドは、実験Ａとはわずかに異なる場所の組を使用して、１４箇所で試験した。実験ＣおよびＤでは、それぞれＢＣ２Ｓ１転換×自殖ＤおよびＢＣ２Ｓ１転換×自殖Ｆのハイブリッド背景を試験した。これらのハイブリッドはどちらも９９日の相対的成熟を有しており、同じ１０箇所で試験した。
それぞれの試験について、１箇所あたり２回の反復および２列区画を用いて完全乱塊法を使用した。列の長さは２０フィートであり、それぞれの列に１列あたり３４個の種子を播種した。試験の管理において標準の地域的農耕学的実施を使用した。
８個の農耕学的特徴についてデータを収集および分析した：植物の高さ、穂の高さ、茎の倒伏、根の倒伏、最終集団、穀粒の水分、試験重量、および収量。植物の高さおよび穂の高さのパラメータは、ハイブリッドの外見に関する情報を提供する。パーセント茎の倒伏および根の倒伏の農耕学的特徴は、ハイブリッドの収穫可能性を決定する。最終集団数は、収量に影響を与える種子の品質および季節的成長条件を測定する。収穫時のパーセント穀粒の水分はハイブリッドの成熟度を定義し、収量（ブッシェル／エーカー、水分について調節）および試験重量（１ブッシェルのトウモロコシの重量をポンドで、１５．５％の水分に調節）は、ハイブリッドの生殖能力を説明する。
直線モデルを使用して圃場箇所にわたる分散分析を実施した。エントリーおよび場所をモデル中に固定効果として含めた。場所およびエントリーによる場所が変量効果として含まれる混合モデルを調査したが、エントリーによる場所は分散の小さな一部分しか説明せず、その分散成分は多くの場合ゼロから有意に異なっていなかった。茎および根の倒伏では、分散を安定させるために対数変換を使用したが、平均および範囲は元のスケールで報告されている。有意差は９５％の信頼水準で宣言した。全体的な処理効果の有意性はｔ検定を使用して推定した。
これらの農耕学的特徴づけ試験の結果を表３２中に見つけることができる。穂の高さ、茎の倒伏、根の倒伏、穀粒の水分、試験重量、および収量のパラメータについて、４個の４０２７８ハイブリッドのどれにおいても、同質遺伝子系統対照と比較して統計的に有意な差異は見い出されなかった（ｐ＜０．０５）。最終集団数および植物の高さはそれぞれ実験ＡおよびＢにおいて統計的に異なっていたが、同様の差異は、試験した他の４０２７８ハイブリッドとの比較においては見られなかった。見られた変動の一部は、ＤＡＳ−４０２７８−９事象を優良自殖系統内に戻し交雑した際から残存する低レベルの遺伝子のばらつきが原因であり得る。測定されたパラメータの値の全体的な範囲はすべて伝統的なトウモロコシ ハイブリッドで得られた値の範囲内にあり、雑草性が増加したという結論を導かない。要約すると、農耕学的特徴づけのデータは、４０２７８トウモロコシが慣用のトウモロコシと生物学的に等価であることを示している。
準同質遺伝子系統トウモロコシと比較した、事象ＤＡＳ−４０２７８−９を含有するハイブリッドトウモロコシの農耕学的特徴を、多様な地理的環境にわたる複数の圃場試験から、１回の生育期の間収集した。ヌル植物と比較した、事象ＤＡＳ−４０２７８−９を含有するハイブリッドトウモロコシ系統の結果を表３３中に列挙する。
Ｖ３発達段階で除草剤キザロホップ（２８０ｇ ａｅ／ｈａ）を噴霧し、Ｖ６発達段階で２，４−Ｄ（２，２４０ｇ ａｅ／ｈａ）を噴霧した、事象ＤＡＳ−４０２７８−９を含有するハイブリッドトウモロコシ系統およびヌル植物の農耕学的特徴を表３４中に示す。
２，４−Ｄは２，４−Ｄ抵抗性ダイズの成長増加させる
２，４−Ｄを施用することによって、ＡＡＤ−１２導入遺伝子を有するトランスジェニックダイズはダイズ植物に対して保護を提供する一方で雑草は破壊される。２，４−Ｄは２，４−Ｄ耐性ダイズの成長も増加させることが予想外に観察された。この増加した成長は、非噴霧区画と比較した噴霧区画の植物の高さおよび／または収量の増加をもたらしている。
２，４−Ｄの施用の結果生じる植物成長および／または収量の増加が、２，４−Ｄに耐性となるように遺伝子操作したダイズ植物について記載されている。試験体を、北米のダイズ栽培地域を網羅する複数の場所にわたって成長させた。エントリーには、事象ＤＡＳ−６８４１６−４（２，４−Ｄに対する耐性を調整する）を浸透交雑させた優良系統が含まれていた。処理は、非噴霧処理ならびにＶ３およびＲ２成長段階の両方で施用した２，４−Ｄ噴霧処理からなっていた。区画を、シーズン全体にわたって植物の高さおよび穀粒の収量を含めた様々な農耕学的特徴について測定した。すべての競合効果を排除するために、噴霧および非噴霧区画の両方において雑草をシーズン全体にわたって防除した。試験の終末に、データ分析により、処理を受けなかったものと比較して、２，４−Ｄを噴霧したエントリーで高さおよび収量の両方の有意な増加が測定された。収量の増加は、２，４−Ｄによって２，４−Ｄ抵抗性イズに対して送達される雑草防除に追加する利点である。
２，４−Ｄを噴霧したダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４（国際特許出願第２０１１／０６６３８４号）の農耕学的特徴を非噴霧ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４の農耕学的特徴と比較するために、圃場試験を２０１１年に実行した。圃場試験は、ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４を浸透交雑させた４個の優良ダイズ系統のエントリー、ならびに、ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４を含有しない、４個の優良ダイズ系統のそれぞれのヌル同質遺伝子系統を含有していた。試験体を様々な地理的場所にわたって植えつけた（合計１０箇所）。実験は、１箇所あたり２回の反復を用いて改良分割区法として設定した。全区画を処理し、サブ区画がエントリーであった。各区画は、３０インチ間隔の植えつけた長さ１２．５フィートの２列からなっていた。噴霧区画は、Ｖ３およびＲ２成長段階で噴霧した２，４−Ｄ（１１２０ｇ ａｅ／ｈａ）で処理した。シーズン全体にわたって、圃場区画を通常の農耕学的実施下で維持し、雑草がないように保った。様々な農耕学的特徴をダイズ植物について測定して、２，４−Ｄの施用がダイズ農耕学的特徴の性能にどのように影響を与えたかを決定した。試験した農耕学的特徴およびデータを収集した成長段階を表３５中に列挙する。
ダイズ生育期の終わりに、すべての場所からのデータを合わせ、様々な場所にわたる分析を実施した。データ分析ｈｗＪＭＰ（商標）Ｐｒｏ ９．０．３（ＳＡＳ、ノースカロライナ州Ｃａｒｙ）を使用して実施した。分析からの最小二乗平均を表２８中に報告する。ＡＡＤ−１２導入遺伝子を含有するダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４に対する２，４−Ｄの施用は増加した成長の調整効果をもたらした。増加した成長は、２，４−Ｄを噴霧した圃場区画において２，４−Ｄを噴霧しなかった圃場区画よりも有意に高い収量および植物の高さの測定値という結果となった。これらの増加は、データをすべての場所にわたって累積分析した際に確認できた。対照的に、２，４−Ｄを噴霧したダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４の増加した収量は、処理の相互作用によって１つの場所では減弱していた。表３６中で、平均の高さおよび収量はどちらも２，４−Ｄの施用によって約５％増加した。
表３７中に示すように、１０箇所のうちの少なくとも１つ（場所＃ａ３）で、非噴霧ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４植物において２，４−Ｄを噴霧したダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４植物よりも有意に高い収量の収穫が報告された。すべての場所の結果を累積すると、ＡＡＤ−１２導入遺伝子を含有するダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４に対する２，４−Ｄの施用は、増加した成長をもたらす調整効果を示した。たとえば、２，４−Ｄを噴霧したダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４植物の収量は５６．４ｂｕ／エーカーであり、これは、非噴霧ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４植物の収量である５３．７ｂｕ／エーカーよりも相当高い。同様に、２，４−Ｄを噴霧したダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４植物の高さは８１ｃｍであり、これは、非噴霧ダイズ事象ＤＡＳ−６８４１６−４植物の高さである７７ｃｍよりも相当高い。
２，４−Ｄは２，４−Ｄ／グリホサートの組合せにおいて２，４−Ｄ抵抗性ダイズの成長を増加させる
以前の実施例と同様であるが、グリホサートと組み合わせた２，４−Ｄの２回の施用を用いた圃場試験を２０１０年に実行した。結果は、非噴霧区画と比較した噴霧区画の２，４−Ｄ抵抗性ダイズの成長の増加、植物の高さおよび／または収量が２，４−Ｄの施用によるものであることを示している。
有意な処理効果が測定したいくつかのパラメータで観察された。２，４−ＤおよびグリホサートをどちらもＶ３およびＲ２成長段階で噴霧した。試験体を様々な地理的場所（合計６箇所）にわたって植えつけた。試験した農耕学的特徴およびデータを収集した成長段階を表３０中に列挙する。表３８中で、噴霧したダイズでは平均高さが６％増加し、平均収量が１７％増加した。さらに、噴霧したダイズでは平均種子重量が６％増加した。
表３９中に示すように、特定の地理的変動も本実施例中で観察された。表３９中で、噴霧したダイズでは平均収量が２１．６％増加した。
噴霧および非噴霧処理を比較した収量試験の結果
２，４−Ｄ抵抗性アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）で形質転換したトランスジェニック作物は、アリールオキシアルカノエート部分を含む刺激量の除草剤で処理した場合に増加した収量をもたらした。ＡＡＤ−１２遺伝子発現カセットを含むダイズ事象を噴霧および非噴霧条件下の反復収量試験で試験した。北半球に適応させた早生ダイズを含有していた一連の実験、およびより南の緯度に適応させた晩生ダイズを含有していた別の一連の実験が存在していた。以前の実験では、生育期中に２，４−Ｄで処理した、ＡＡＤ−１２遺伝子発現カセットを含むダイズのエントリーが、非噴霧の調査と比較して増加した収量を示した事例が存在していた。
２回の反復を用いた改良分割区法を試験に使用した。各区画は幅が２列、３０インチの列間隔、および長さが１２．５フィートであった。シーズン中の試験中の移動を可能にするために、端から端まで植えつけた区画の間に２．５〜３フィートの通路が存在していた。噴霧ブロックは、生育期中に２１８５ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄコリン＋グリホサート（プリミックス）＋２％重量／重量のＡＭＳを用いて順次（２回）噴霧した。
１回目の施用はＶ３成長段階であり、２回目の施用はＲ２成長段階であった。実験および対照の圃場試験をどちらも、慣用の除草剤の使用または手取り除草によって、シーズン全体にわたって雑草がないように保った。出芽、実生の活力、作物被害、開花日、Ｒ２での立毛数、病害の発生率、昆虫被害、植物の高さ、成熟日、倒伏、落下、１００個の種子の重量、および収量に関するデータを収集した。ＪＭＰ（商標）Ｐｒｏ ９．０．３を使用してデータを分析した。表４０は最終分析で使用した場所を列挙する。植えつけた一部の場所は、区画内のばらつきが原因で分析に含めなかった。
早生および晩生試験の両方について様々な場所にわたる分析を行った。表４１および４２は、それぞれ早生および晩生試験の収量分散分析を示す。
早生および晩生試験の両方で、有意な（Ｐ＝０．０５）ネーム（name）効果が存在していた。事象を浸透交雑させたそれぞれの優良ダイズ系統は異なる遺伝的背景からのものであったため、これは予想されていた。
有意な処理効果が早生試験で測定され、これは、噴霧および非噴霧処理の収量が異なっていたことを示す。晩生試験では有意な処理効果は存在せず、これは、噴霧および非噴霧区画で収量が異ならなかったことを示す。
早生および晩生試験の両方で、処理の相互作用効果によるネームは有意でなく、これは、処理の効果（または効果の欠如）が特定の試験において各エントリーで同じであったことを示す。
表４３は早生試験における処理の組合せによる各エントリーの平均収量を示し、ＨＯＭＯはホモ接合性を示す。同じ文字に続く値（所定の変種内）は、スチューデントｔ検定に従ってＰ＝０．０５で差異がない。Ｖ３およびＲ３に２１８５ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄコリン＋グリホサート（プリミックス）＋ＡＭＳを順次噴霧した場合により高い収量を示したエントリーが４個存在していた。
表４４は処理の組合せによる各エントリーの平均収量を示す。同じ文字に続く値（所定の変種内）は、スチューデントｔ検定に従ってＰ＝０．０５で差異がない。上記で報告したように、晩生試験について有意な処理効果またはエントリーによる処理の効果が存在しなかったため、平均分離は実施しなかった。表中の文字は、晩生試験において噴霧処理と非噴霧処理との間に差異が存在しなかったことを示す。
本実施例における収量試験からの結果は、ここでも、一部のダイズ遺伝子型の一部の環境において、２，４−Ｄの施用の後に収量が増加し得ることを示している。過去２年間の間、そのような収量の増加はＭＧ２栽培地域で実行した収量試験で観察されている。
ダイズとトウモロコシとの比較
ＡＡＤ−１２導入遺伝子を含むダイズにおける圃場試験の収量結果は、２，４−Ｄの施用が特定の環境において特定のダイズ遺伝子型のダイズの収量を増加させ得ることを示す。これらの結果は、ＡＡＤ−１導入遺伝子を含むトランスジェニックトウモロコシ事象と比較した場合に驚くべきである。ＡＡＤ−１トランスジェニックトウモロコシ植物の収量は、２，４−Ｄを噴霧した後に統計的に有意な収量の増加を一貫しては示さなかった。これらのＡＡＤ−１トランスジェニックトウモロコシ植物は慣用のトウモロコシと生物学的に等価である。多様な地理的場所におけるさらなる圃場研究が、２０１０年から２０１２年の間にハイブリッドトウモロコシ系統に対して完了している。これらの圃場研究全体にわたって、２，４−Ｄ（２，１８５ｇ ａｅ／ｈａおよび４，３７０ｇ ａｅ／ｈａ）を噴霧したトウモロコシ系統の収量を、未処理の対照トウモロコシ系統（たとえば２，４−Ｄを噴霧していないもの）と比較した。これらの実験の結果は、ＡＡＤ−１導入遺伝子を含有するトウモロコシ植物が、２，４−Ｄ噴霧を用いた処理の結果、有意な収量の増加をもたらさないことをさらに実証している。それと比較して、一部のダイズ遺伝子型において、２，４−Ｄの施用後に収量の増加が示されている。２，４−Ｄの施用後に示された、ダイズ遺伝子型において観察された収量の増加は、作物の収量を増加させるために適用可能な予想外の改善である。開示した方法は、たとえばＡＡＤ−１２遺伝子を発現する、トランスジェニック作物の収量を増加させるために２，４−Ｄ処理を使用することに配備することができる。
理解を明確にする目的で前述の発明を例示および実施例によってある程度詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲内で特定の変化および改変を実施し得ることは明らかである。

本発明は、以下の態様を含む。
［１］
植物を、アリールオキシアルカノエート部分を含む刺激量の除草剤で処理することを含む、２，４−Ｄ抵抗性作物の収量を改善する方法。
［２］
２，４−Ｄ抵抗性作物がアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）で形質転換したトランスジェニック植物である、［１］に記載の方法。
［３］
アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）がＡＡＤ−１２である、［２］に記載の方法。
［４］
アリールオキシアルカノエート部分を含む除草剤がフェノキシ除草剤またはフェノキシ酢酸系除草剤である、［１］に記載の方法。
［５］
アリールオキシアルカノエート部分を含む除草剤が２，４−Ｄである、［１］に記載の方法。
［６］
２，４−Ｄが２，４−Ｄコリンまたは２，４−Ｄジメチルアミン（ＤＭＡ）を含む、［５］に記載の方法。
［７］
処理を、少なくとも１回、雑草防除でも用いられている２，４−Ｄの施用量で行う、［１］に記載の方法。
［８］
処理を、２回、雑草防除でも用いられている２，４−Ｄの施用量で行う、［１］に記載の方法。
［９］
２，４−Ｄを、２，４−Ｄ耐性を有するダイズのＶ３およびＲ２成長段階で施用する、［８］に記載の方法。
［１０］
処理を、少なくとも３回、雑草防除でも用いられている２，４−Ｄの施用量で行う、［１］に記載の方法。
［１１］
２，４−Ｄ抵抗性作物がストレス下にある、［１］に記載の方法。
［１２］
２，４−Ｄ抵抗性作物を、雑草防除のために２，４−Ｄとは異なる除草剤でも処理する、［１］に記載の方法。
［１３］
２，４−Ｄとは異なる除草剤がリン系除草剤またはアリールオキシフェノキシプロピオン酸系除草剤である、［１２］に記載の方法。
［１４］
リン系除草剤が、グリホサート、グルホシネート、その誘導体、またはその組合せを含む、［１３］に記載の方法。
［１５］
リン系除草剤が、アンモニウム塩、イソプロピルアンモニウム塩、イソプロピルアミン塩、またはカリウム塩の形態である、［１３］に記載の方法。
［１６］
アリールオキシフェノキシプロピオン酸系除草剤が、クロラジホップ、フェノキサプロップ、フルアジホップ、ハロキシホップ、キザロホップ、その誘導体、またはその組合せを含む、［１３］に記載の方法。
［１７］
２，４−Ｄ抵抗性作物を、少なくとも１回、２５ｇ ａｅ／ｈａ〜５０００ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄで処理する、［１］に記載の方法。
［１８］
２，４−Ｄ抵抗性作物を、少なくとも１回、１００ｇ ａｅ／ｈａ〜２５００ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄで処理する、［１］に記載の方法。
［１９］
アリールオキシアルカノエート部分を含む除草剤が、経根吸収を介して２，４−Ｄ抵抗性作物に達する、［１］に記載の方法。
［２０］
リン系除草剤が、経根吸収を介して２，４−Ｄ抵抗性作物に達する、［１３］に記載の方法。
［２１］
アリールオキシフェノキシプロピオン酸系除草剤が、経根吸収を介して２，４−Ｄ抵抗性作物に達する、［１３］に記載の方法。
［２２］
アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）で形質転換したトランスジェニック植物が、綿、ダイズ、およびキャノーラから選択される、［２］に記載の方法。
［２３］
（ａ）植物細胞を、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子で形質転換することと、 （ｂ）形質転換細胞を選択することと、 （ｃ）植物を形質転換細胞から再生することと、 （ｄ）植物を、アリールオキシアルカノエート部分を含む刺激量の除草剤で処理することとを含む、２，４−Ｄ抵抗性作物の収量を改善する方法。
［２４］
アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）がＡＡＤ−１２である、［２３］に記載の方法。
［２５］
核酸分子が、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）ではない選択可能マーカーを含む、［２３］に記載の方法。
［２６］
選択可能マーカーが、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｔ）またはビアラホス抵抗性遺伝子（ｂａｒ）である、［２５］に記載の方法。
［２７］
核酸分子が植物に最適化されている、［２３］に記載の方法。
［２８］
その非トランスジェニック親植物と比較して収量が増加した、２，４−Ｄ抵抗性を有するトランスジェニック植物の製造における、２，４−Ｄの使用。
［２９］
２，４−Ｄを、少なくとも１回、２５ｇ ａｅ／ｈａ〜５０００ｇ／ｈａの２，４−Ｄで施用する、［２８］に記載の使用。
［３０］
２，４−Ｄを、少なくとも１回、１００ｇ ａｅ／ｈａ〜２５００ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄで施用する、［２８］に記載の使用。
［３１］
２，４−Ｄが２，４−Ｄコリンまたは２，４−Ｄジメチルアミン（ＤＭＡ）を含む、［２８］に記載の使用。
［３２］
２，４−Ｄ抵抗性作物を開花前に少なくとも２回、２，４−Ｄで処理する、［２８］に記載の使用。

Claims (18)

  1. ２，４−Ｄ耐性を有するダイズの収量を改善する方法であって、
    ２，４−Ｄを、２，４−Ｄ耐性を有するダイズのＶ３およびＲ２成長段階で施用し、
    ２，４−Ｄの施用量が１０００ｇ ａｅ／ｈａ〜２０００ｇ ａｅ／ｈａである、方法。
  2. ２，４−Ｄを、少なくとも３回施用する、請求項１に記載の方法。
  3. ２，４−Ｄ耐性を有するダイズがストレス下にある、請求項１に記載の方法。
  4. ２，４−Ｄ耐性を有するダイズを、雑草防除のために２，４−Ｄとは異なる除草剤でも処理する、請求項１に記載の方法。
  5. ２，４−Ｄとは異なる除草剤がリン系除草剤またはアリールオキシフェノキシプロピオン酸系除草剤である、請求項４に記載の方法。
  6. リン系除草剤が、グリホサート、グルホシネート、その誘導体、またはその組合せを含む、請求項５に記載の方法。
  7. リン系除草剤が、アンモニウム塩、イソプロピルアンモニウム塩、イソプロピルアミン塩、またはカリウム塩の形態である、請求項５に記載の方法。
  8. アリールオキシフェノキシプロピオン酸系除草剤が、クロラジホップ、フェノキサプロップ、フルアジホップ、ハロキシホップ、キザロホップ、その誘導体、またはその組合せを含む、請求項５に記載の方法。
  9. ２，４−Ｄが、経根吸収を介して２，４−Ｄ耐性を有するダイズに達する、請求項１に記載の方法。
  10. リン系除草剤が、経根吸収を介して２，４−Ｄ耐性を有するダイズに達する、請求項５に記載の方法。
  11. アリールオキシフェノキシプロピオン酸系除草剤が、経根吸収を介して２，４−Ｄ耐性を有するダイズに達する、請求項５に記載の方法。
  12. （ａ）ダイズ細胞を、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子で形質転換することと、
    （ｂ）形質転換細胞を選択することと、
    （ｃ）ダイズを形質転換細胞から再生することと、
    （ｄ）２，４−ＤをダイズのＶ３およびＲ２成長段階で施用し、２，４−Ｄの施用量が１０００ｇ ａｅ／ｈａ〜２０００ｇ ａｅ／ｈａであることとを含む、２，４−Ｄ耐性を有するダイズの収量を改善する方法。
  13. アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）がＡＡＤ−１２である、請求項１２に記載の方法。
  14. 核酸分子が、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）ではない選択可能マーカーを含む、請求項１２に記載の方法。
  15. 選択可能マーカーが、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｔ）またはビアラホス抵抗性遺伝子（ｂａｒ）である、請求項１４に記載の方法。
  16. 核酸分子がダイズに最適化されている、請求項１２に記載の方法。
  17. その非トランスジェニック親植物と比較して収量が増加した、２，４−Ｄ抵抗性を有するトランスジェニック植物の製造における、２，４−Ｄの使用であって、
    前記２，４−Ｄ抵抗性を有するトランスジェニック植物が２，４−Ｄ耐性を有するダイズであり、
    ２，４−Ｄを、２，４−Ｄ耐性を有するダイズのＶ３およびＲ２成長段階で施用し、
    ２，４−Ｄの施用量が１０００ｇ ａｅ／ｈａ〜２０００ｇ ａｅ／ｈａである、使用。
  18. ２，４−Ｄが２，４−Ｄコリンまたは２，４−Ｄジメチルアミン（ＤＭＡ）を含む、請求項１７に記載の使用。
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