JP5907657B2 - 新規な除草剤抵抗性遺伝子 - Google Patents
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Description
配列番号1は、スフィンゴビウム ハービシドボランスからのAAD−13の本来のヌクレオチド配列である。
Tm=81.5℃+16.6 Log[Na+]+0.41(%G+C)−0.61(%ホルムアミド)−600/二重鎖の塩基対の長さ
(1)1×SSPE、0.1% SDS中、15分間、室温で2回(低ストリンジェンシー洗浄)。
(2)0.2×SSPE、0.1% SDS中、15分間、Tm−20℃で1回(中ストリンジェンシー洗浄)。
Tm(℃)=2(T/A塩基対の数)+4(G/C塩基対の数)(Suggsら、1981)。
(1)1×SSPE、0.1% SDS、15分間、室温で2回(低ストリンジェンシー洗浄)。
(2)1×SSPE、0.1% SDS中、15分間、ハイブリダイゼーション温度で1回(中ストリンジェンシー洗浄)。
低:1または2×SSPE、室温
低:1または2×SSPE、42℃
中:0.2×または1×SSPE、65℃
高:0.1×SSPE、65℃。
植物体において除草剤分解活性を持つ遺伝子を同定する方法として、NCBI(National Center for Biotechnology Information)などの最新の公的データベースを調べることが可能である。処理を開始するために、所望の特徴(つまりα−ケトグルタル酸ジオキシゲナーゼ活性)を有するタンパク質をコードする既に同定された機能遺伝子配列を有していることが必要である。次いで、このタンパク質配列は、入手可能な、委託されたNCBIタンパク質配列と比較するために、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Altschulら、1997)アルゴリズムの入力として使用される。デフォルト設定を使用すると、この検索は、種々のレベルで100以上の相同タンパク質配列を返す。これらは、アミノ酸レベルで、高度に同一(85〜98%)〜非常に低度の相同性(23〜35%)の範囲である。伝統的に、高度な相同性を有する配列だけが、入力配列に対する類似の特性を保持することが予期されると思われる。この場合において、≦50%の相同性を有する配列だけを選んだ。本明細書において例示されるように、35%ほどのアミノ酸保存を有する(ラルストニア ユートロファからのtfdAと比較して)クローニング組換え発現相同体は、意図した除草剤に対してだけではなく、これらの酵素を用いて以前に試験されていない基質に対しても商業的なレベルの抵抗性を付与するために使用することができる。
2.1−背景
植物において異種遺伝子のより高度なレベルの発現を得るために、それらが植物細胞においてより効率的に発現されるように、遺伝子の配列をコードするタンパク質を再構築することは好ましい可能性がある。トウモロコシは、植物中で遺伝子の発現レベルおよびコードされるタンパク質のレベルを増加させるために、形質転換前に、異種タンパク質コード領域を再設計することが好ましい可能性のある1つのそのような植物である。したがって、細菌タンパク質をコードする遺伝子の設計におけるさらなるステップは、最適な発現のための異種遺伝子の再構築である。
AAD−13(配列番号1)の本来のDNA配列のコード領域の861の塩基対(bp)の大規模な分析は、最適な植物発現に不利益であると考えられるいくつかの配列モチーフおよび最適ではないコドン組成の存在を明らかにした。配列番号1(AAD−13)によってコードされるタンパク質は、配列番号2として示される。トウモロコシおよび双子葉植物における組換えタンパク質の産生を改善するために、第2の位置(配列番号4において下線を引いた)でのアラニン残基の追加を除いて配列番号2に示される本来のタンパク質と同じであるタンパク質(配列番号4)をコードする「植物最適化」DNA配列(AAD−13 v1)(配列番号3)を開発した。さらなるアラニンコドン(GCT;配列番号3において下線を引く)は、ATG翻訳開始コドンに及ぶNco I制限酵素認識部位(CCATGG)の部分をコードする。したがって、それは、翻訳開始を最適化するためのATG開始コドンを囲む配列構成を改善しながら、続くクローニング作業を容易にする2重の目的に役立つ。本来のコード領域および植物最適化(v1)コード領域によってコードされるタンパク質は99.3%同一であり、アミノ酸番号2でのみ異なる。対照的に、コード領域の本来のDNA配列および植物最適化(v1)DNA配列はわずか77.3%同一である。表Ex2−3は、本来の配列(列AおよびD)ならびに植物最適化配列(列BおよびE)のコドン組成における差異を示し、表Ex2−2の列FおよびLによって決定されるコドン組成を正確に有すると思われる理論的な植物最適化配列(列CおよびF)に対する比較を可能にする。
大腸菌の特別に操作された株および関連するベクター系は、生化学的および分析的研究のために、相対的に大量のタンパク質を産生するために使用されることが多い。所望のタンパク質をコードする本来の遺伝子は、たとえ、遺伝子の供給源生物が他の細菌生物である可能性があっても、大腸菌における高レベル発現に十分に適していないことが時に見つけられる。そのような場合において、それを大腸菌における発現により適しているようにするために、遺伝子のタンパク質コード領域を再構築することは可能であり、かつ望ましい。大腸菌クラスII遺伝子は、大腸菌細胞の指数増殖期の間に高度に継続的に発現されるものとして定義される。[REF:Henaut,A.およびDanchin,A.(1996)Escherichia coli and Salmonella typhimurium cellular and molecular biology、vol.2、2047〜2066ページ。Neidhardt,F.、Curtiss III,R.、Ingraham,J.、Lin,E.、Low,B.、Magasanik,B.、Reznikoff,W.、Riley,M.、Schaechter,M.、およびUmbarger,H.(編)American Society for Microbiology、Washington,DC]。大腸菌クラスII遺伝子のコード領域のコドン組成の検査を通して、これらの大腸菌クラスII遺伝子コード領域の平均コドン組成を考案することができる。クラスII遺伝子に似ている平均コドン組成を有するタンパク質コード領域は、大腸菌の指数増殖期の間の発現に有利であろうと考えられる。これらのガイドラインを使用して、AAD−13タンパク質(配列番号4;上記に述べられるように、第2の位置にさらなるアラニンを含む)をコードする、新しいDNA配列を、大腸菌クラスII遺伝子コード領域の平均コドン組成に従って設計した。設計をコドン組成にのみ基づくものとした最初の配列は、大腸菌発現ベクターの中にクローニングするのに適したある種の制限酵素認識配列を含むようにさらに操作した。16SリボソームRNAの3’末端に対して相同性の遺伝子内の配列(つまりシャイン ダルガルノ配列)のような、高度に安定性のステムループ構造などの不利益な配列の特徴は避けた。大腸菌に最適化された配列(v2)は、配列番号5として開示され、配列番号4において示されるタンパク質をコードする。
3.1 大腸菌、pET発現ベクターの構築物
さらなるクローニングリンカーを用いて追加された部位に対応する制限酵素を使用して(Xba 1、Xho 1)、AAD−13(v2)は、Picoscriptベクターから切り取り、pET280ストレプトマイシン/スペクチノマイシン抵抗性ベクターの中にライゲーションした。ライゲーションした産物は、次いで、TOP10F’大腸菌に形質転換し、ルリアブロス+50μg/mlストレプトマイシン&スペクチノマイシン(LB S/S)寒天平板上に平板培養した。
植物最適化遺伝子AAD−13(v1)は、Picoscriptからもらった(遺伝子再構築設計を終え(上記を参照されたい)、構築のためにPicoscriptに外注した)。AAD−13(v1)遺伝子は、Nco I−Sac I断片としてpDAB4055の中にクローニングした。結果として生じる構築物は、pDAB4113と命名し、[AtUbi10プロモーター:AAD−13(v1):AtuORF1 3’UTR]を含有した(Nco IおよびSac Iの制限消化を用いて確証)。次いで、記載されるカセットを含有するNot I−Not I断片を、バイナリーベクターpDAB3038のNot I部位の中にクローニングした。以下のカセット[AtUbi10プロモーター:AAD−13(v1):AtuORF1 3’UTR:CsVMVプロモーター:PAT:ORF25/26 3’UTR]を含有する、結果として生じるバイナリーベクター、pDAB4114は、正確な配向の確証のために制限消化した(SacIを用いて)。確証した、完成した構築物(pDAB4114)は、アグロバクテリウムの中への形質転換に使用した(実施例6を参照されたい)。
4.1−シュードモナス フルオレッセンス発酵
振盪フラスコ実験については、AAD−13(v1)構築物(sec3.2)を運ぶシュードモナス フルオレッセンス株グリセロールストックの200μlを、30μg/mlテトラサイクリン/HClを補足した50mlの新鮮LB培地に接種するために使用する。培養物(250mlバッフルエルレンマイヤーフラスコ中)は、16時間、300rpmおよび30℃で、振盪機(New Brunswick Scientific Model Innova 44)上でインキュベートする。20mlの種培養物を、2.8Lバッフルエルレンマイヤーフラスコ中の、20μg/mlテトラサイクリン/HClおよび250μlのプルロニックL61(消泡剤)を補足した1Lシュードモナス フルオレッセンス培地(酵母抽出物、5g/L;K2HPO4 5g/L;(NH4)2PO4、7.5g/L;(NH4)2SO4;MgSO4−7H2O、1g/L;KCl、0.5g/L;CaCl2−2H2O、0.5g/L;クエン酸Na−2H2O、15g/L;グリセロール、95g/L;微量元素溶液、10ml/L;微量元素溶液:FeCl3−6H2O、5.4g/L;MnCl2−4H2O、1g/L;ZnSO4−7H2O、1.45g/L;CuSO4−5H2O、0.25g/L;H3BO3、0.1g/L;(NH4)6MO7O24、0.1g/L;濃縮HCl、13ml/L)の中に移入する。培養物は、24時間、30℃および300rpmでインキュベートされることになる。イソプロピルβ−D−1−チオガラクト−ピラノシド(IPTG)は、培養物における1mM最終物に追加し、25℃で約48時間、インキュベートし続ける。細胞は、15分間、4℃で、7krpmで、遠心分離によって採取し、細胞ペーストは、−80℃で保存するまたは精製のために直ちに処理する。
約100〜200gの凍結(または新鮮)シュードモナス細胞は、解凍し、20mM Tris−HCl、pH8.5および25mlのプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigmaカタログ#P8465)を含有する1〜2Lの抽出緩衝液中に再懸濁する。細胞は、11,000〜12,000psiで1回のパスで、氷上で、Microfluidizer(モデルM110Lまたは110Y)(Microfluidics、Newton、MA)を使用して破壊する。溶解物は、20分間、24,000rpmで遠心分離する。上清を、移入し、4℃で、一晩、20mM Tris−HCl、pH8.5の10容量に対して透析しまたはこの緩衝液を用いて透析濾過し、カラム分離にかける前に0.45μm膜を通して濾過する。続くタンパク質分離はすべて、Pharmacia AKTA Explorer 100を使用して行い、4℃で操作する。添加前に、Q Sepharose Fast Flowカラム(Pharmacia XK 50/00、500mlベッドサイズ)を、20mM Tris−HCl、pH8.5緩衝液を用いて平衡化する。サンプルは、15ml/分でカラムにかけ、次いで、溶出液OD280がベースラインに戻るまでこの緩衝液を用いて洗浄する。タンパク質は、15ml/分の流速で、0〜0.3Mの直線勾配の2LのNaClを用いて溶出し、一方、45mlの画分を収集する。比色定量酵素アッセイによって決定されるAAD−13活性を含有し、AAD−13タンパク質の予測される分子量(SDS−PAGE上で約32kDaのバンド)にも対応する画分は、プールされることになる。最終0.5Mまでの固体硫酸アンモニウムをサンプルに追加し、次いで、20mM Tris−HCl、pH8.0中の0.5M硫酸アンモニウム中で平衡化した、フェニルHPカラム(Pharmacia XK 50/20、250mlベッドサイズ)にかける。このカラムは、溶出液のOD280がベースラインに戻るまで、10ml/分で結合緩衝液を用いて洗浄し、タンパク質は、20mM Tris−HCl、pH8.0中の0.5M〜0の直線勾配の硫酸アンモニウムによって10ml/分で、2カラム容量内で溶出し、12.5ml画分を収集する。AAD−13を含有する主ピーク画分は、プールし、必要であれば、MWCO 10kDaカットオフ膜遠心濾過機装置(Millipore)を使用して濃縮する。いくつかの場合において、サンプルは、1ml/分の流速で、PBS緩衝液を用いて、Superdex75ゲル濾過カラム(Pharmacia XK 16/60、110mlベッドサイズ)にさらにかける。純粋なAAD−13を含有するピーク画分は、プールし、今後の使用のために−80℃で保存する。
5.1−比色定量フェノール検出を介してのアッセイ
酵素活性は、FukumoriおよびHausinger(1993)(J.Biol.Chem.268:24311〜24317ページ)から改変されたプロトコールを使用して、産物フェノールの比色定量検出によって測定し、96ウェルマイクロプレートフォーマットにおける展開を可能にする。比色定量アッセイは、2,4−Dおよびジクロルプロップを切断して、産物2,4−ジクロロフェノールを放出するジオキシゲナーゼの活性を測定する際の使用について記載された。いくつかのフェノールからのカラーイールドは、どのフェノール産物を容易に検出することができたかを確認するために、以前に記載された検出法を使用して2,4−ジクロロフェノールと比較した。フェノールおよびフェノール類似体は、200μM NH4(FeSO4)2、200μMアスコルビン酸ナトリウムを含有する0.15ml 20mM MOPS pH6.75中で100μMの最終濃度で試験した。フルロキシピルおよびトリクロピルに由来するピリジノールは、有意なカラーをもたらさなかった。2,4−ジクロロフェノールのカラーイールドは、アッセイにおいて、約500μMまでフェノールの濃度に直線的であり、比例した。標準的なアッセイ条件(160μl最終アッセイ容量)下で行われた検量線は、510nmでの0.1の吸光度が17.2μMフェノールから得られたことを示した。
置換ピリジン(ベンゼン環以外)を含有する除草剤トリクロピルなどの潜在的な基質に対するAAD−13作用は、アリールオキシアルカノエート結合の切断と同時にピリジノールを放出するであろう。ピリジノールは、前の部において記載されるアミノアンチピリン/フェリシアニドフェノール検出を使用して検出されなかった。しかしながら、産物クロロピリジノールは、pH7で、325nmのλmaxで近紫外線で強く吸収することが分かった(吸光係数約8,400M−1.cm−1)。これは、継続的なマイクロプレートベースの分光光度アッセイを作り出すために使用した。アッセイは、200μM NH4FeSO4、200μMアスコルビン酸ナトリウム、1mMα−ケトグルタル酸、適切な基質(DMSO中で作製した100mMストックから追加)、および酵素を含有する0.2ml 20mM MOPS pH6.75の全容量中で行う。アッセイは、時間ゼロの時点で、アリールオキシアルカノエート基質、酵素、またはα−ケトグルタル酸の追加によって開始し、吸光度の増加が、マイクロプレートリーダーにおいて325nmで10分間、続いた。反応の最初の2分間は、初速度を決定するために使用する。
AAD−13の便利なアッセイを、基質として2−(2−クロロ,4−ニトロフェノキシ)プロピオン酸(CNPP)を使用して考案した。AAD−13によるCNPPの切断により、2−クロロ,4−ニトロフェノールが放出されるであろう。このフェノールは、pH7で410nmで明るい黄色の吸光度を有し、反応が、継続的にまたは終点分析によって続くことを可能にする。AAD−13活性の存在は、さらなる試薬の追加の必要を伴わないで視覚的にモニターすることができる。マイクロプレートベースの分光光度アッセイは、200μM NH4FeSO4、200μMアスコルビン酸ナトリウム、1mM α−ケトグルタル酸、適切な量のCNPP(DMSO中で作製した10mMストックから追加)、および酵素を含有する0.2ml 20mM MOPS pH6.75の全容量中で行った。アッセイは、時間ゼロの時点で、CNPP、酵素、またはα−ケトグルタル酸の追加によって開始し、吸光度の増加が、マイクロプレートリーダーにおいて410nmで10分間、続いた。反応の最初の2分間は、初速度を決定するために使用する。標準的なアッセイ条件(200μl最終アッセイ容量)下で行われた検量線は、0.1の410nmの吸光度が25.1μM 2−クロロ,4−ニトロフェノールから得られたことを示した。このアッセイを使用して、基質としてのCNPPの反応速度定数は、Km=31±5.5μMおよびkcat=16.2±0.79分−1であることが決定された。
広範囲の基質を試験するために、α−ケトグルタル酸の分解からのコハク酸の産生は、Luoら(2006)(Anal.Biochem.353:69〜74)の方法に基づくプロトコールを使用して分光光度的に検出した。図3に示されるように、AAD−13を介してのα−ケトグルタル酸および対象とする基質の同時の分解は、コハク酸の産生に帰着する。コハク酸は、ATPを消費し、ADPを産生するスクシニル−CoAシンセターゼによってさらに修飾されてスクシニル−CoAになる。ADPは、次いで、共通して用いられるピルビン酸キナーゼ/乳酸デヒドロゲナーゼ酵素共役系(Sigma P0294)によって消費される。NADへのNADHの結果として生じる変換は、340nmで分光光度的にモニターする。
シンセターゼ、sucCおよびsucDをコードする2つの大腸菌遺伝子は、単一の単位複製配列として、Invitrogenからの大腸菌のTop10株から増幅した。ゲノムDNAは、10分間、細胞の一定分量を煮沸し、次いで、遠心分離し、DNAを含有する上清を保持することによって得た。AAD−13(v2)の鋳型として、以前に作り出したpETクローンpDAB4115を使用した。sucCD遺伝子を増幅するために、以下のプライマーを使用した:suc−Nde(配列番号9)5’CATATGAACTTACATGAATATCAGGCAAAAC3’およびsuc−Xho(配列番号10)5’CTCGAGTTTCAGAACAGTTTTCAGTGCTTC’3。AAD−13(v2)については、以下のプライマーを使用した:aad−13F(配列番号11)5’CATATGGCGAGCCCGGCG3’およびaad−13R(配列番号12)5’CTCGAGGTGTGCCAGTGCGGTCTC’3。これらは、下流のクローニングのために適した制限部位を追加し、Hisタグ付けを可能にするために終止コドンを除去する。反応については、サーマルサイクラー条件は:96℃2分間、次いで、96℃30秒間、53℃30秒間、72℃1.5分間の35サイクル、その後、72℃5分間の1回の最終サイクルとした。結果として生じる単位複製配列は、正確な配列を確証するためにサブクローニングした。正確な挿入物を含有するそれぞれのクローンは、Nde1/Xho1を用いて消化し、挿入物は、次いで、pET−26b(+)発現ベクターの中にクローニングした。発現については、形質転換BL−21大腸菌の菌叢は、50mlのLB+Kan(50μg/ml)の中に削り取り、2時間、37℃で増殖させた。この2ミリリットルの培養物を100mlのLB+Kanの中に移入した。これらのフラスコを、4時間、37℃で増殖させた。細胞は、50μM IPTGを用いて誘発し、25℃で一晩増殖させた。培養物は遠心分離し、細胞ペレットは、タンパク質精製に使用した。
Hisタグ付きAAD−13は、カラムメーカーの指示に基づいて、金属アフィニティークロマトグラフィープロトコールを使用して精製した。1Lの培養物から採取し、−80℃で保存した細胞ペレットは、解凍し、20mLの抽出緩衝液(100mM Tris−HCl、pH8;200〜300μLプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma P8849)、1mg/mLリゾチーム、および1mM MgCl2)中に再懸濁させた。再懸濁させた細胞は、粘性を低下させるためにDNアーゼを用いて処理する前に、10〜15分間、室温でインキュベートした。続くステップは、すべて4℃で実行した。抽出物は、20,000×gで20分間遠心分離して、透明にした。1mL/分の流速を使用して、結果として生じる上清は、緩衝液A(25mM Tris pH8.0、0.5M NaCl)を用いてあらかじめ平衡化した、2回の連続的な1mL Co−MAC(商標)カートリッジ(EMD/Novagen 71650)にかけた。抽出物が添加された後、カラムは、OD280がベースラインに戻るまで、緩衝液A中の5mMイミダゾールを用いて洗浄した。タンパク質は、緩衝液A中の50mMイミダゾールを用いて溶出した。SDS−PAGE上の約30kDaのバンドによって示されるAAD−13を優勢的に含有する画分は、BG−10脱塩カラム(Bio−Rad)を使用して、緩衝液C(20mM Tris pH8.0、100mM NaCl、2mM DTT)の中に取り替えた。次いで、緩衝液C中のAAD−13は、インビトロ共役アッセイに従って分光光度的にアッセイした。
インビトロでのAAD−13(v2)基質の同定は、96ウェルマイクロタイタープレートにおける0.2mL反応容量の継続的な分光光度モニタリングの間に検出される酵素活性に基づいた。反応条件は以下のとおりとした:100mM MOPS pH7.0、0.4mM NADH、0.4mM ATP、0.4mM CoA、1mM PEP、10mM MgCl2、0.1mM FeSO4(HCl中で可溶化)、および0.1mMアスコルビン酸、1mM α−ケトグルタル酸、ならびに2,4−Dの存在下で観察可能な速度をもたらすのに十分なAAD−13(v2)。共役酵素(SCS/PK/LDH)は、適切な共役を確実にするためにバッチごとに調整し、潜在的な基質は、一般に、1mMでアッセイした。基質濃度の変更は、溶解性を調整するために必要に応じて行った。反応は、AAD−13(v2)または潜在的な基質のいずれかの追加によって開始した。AADによるコハク酸へのα−ケトグルタル酸の基質非依存的変換の速度は、上記のアッセイ条件下でモニターし、観察された反応速度から引き算した。プロピオン酸基質を用いて観察された反応速度は、2で割り、AADを介してのこれらの化合物の切断から結果として生じるピルビン酸の産生について調整した。さらに、プロピオン酸化合物は、化合物およびPK/LDHの存在下で分光光度的にNADHの消費をモニターすることによって、ピルビン酸混入について確かめた。
表Ex5は、インビトロ共役アッセイを介しての複数の化学物質を用いて観察されたAAD−13(v2)反応速度を示す。反応速度は、同じサンプルセットにおいて得られた2,4−D反応速度の割合として報告する。このデータは、非基質から基質を質的に分けるためにおよび基質効率における傾向を同定するために使用することができる。速度が速くなるほど、消費された利用可能な基質の割合に依存して正確に比較することが困難になり得ることに留意されたい。これは、等価な数の酵素ターンオーバーについて非プロピオン酸化合物の2倍の速度を示すプロピオン酸化合物に特に該当する。その結果として、高度に効率的な基質は、低効率基質と比較した場合に、正しくグループ化されるであろう。しかしながら、高度に効率的な基質のグループ化の範囲内で、化合物は、基質およびAADの単一の速度を使用するスクリーニングによって量的に分離されなくてもよい。アスタリスクで示された化合物は、より高濃度での吸光度干渉のために1mMの代わりに0.5mMで試験した。
6.1−シロイヌナズナ成長条件
野生型シロイヌナズナ種子は、0.1%アガロース(Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)溶液中に懸濁させた。休眠要求量を満たし、かつ同調的種子発芽を確実にするために、懸濁させた種子は、2日間、4℃で保存した(層積貯蔵)。
画線培養をしたDH5αコロニーを含有する、エリスロマイシン(Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)(200mg/L)またはスペクチノマイシン(100mg/L)を有するLB+寒天平板を、4mlのミニプレップ培養物(液体LB+エリスロマイシン)に接種するためのコロニーを提供するために使用した。培養物は、持続的に攪拌しながら37℃で一晩インキュベートした。メーカーの指示に従って行われるQiagen(Valencia、CA)スピンミニプレップは、プラスミドDNAを精製するために使用した。
シロイヌナズナは、花浸漬法を使用して形質転換した。選択されたコロニーは、エリスロマイシン(200mg/L)またはスペクチノマイシン(100mg/L)およびストレプトマイシン(250mg/L)を含有するYEPブロスの1つまたは複数の15〜30mlの前培養物に接種するために使用した。(1つまたは複数の)培養物は、220rpmで持続的に攪拌しながら28℃で一晩インキュベートした。それぞれの前培養物は、エリスロマイシン(200mg/L)またはスペクチノマイシン(100mg/L)およびストレプトマイシン(250mg/L)を含有するYEPブロスの2つの500ml培養物に接種するために使用した。培養物は、持続的に攪拌しながら、28℃で一晩インキュベートした。次いで、細胞は、室温で10分間、約8700×gでペレットにし、結果として生じる上清は捨てた。細胞ペレットは、1/2×Murashige and Skoog塩/Gamborg B5ビタミン、10%(重量/容量)スクロース、0.044μMベンジルアミノプリン(DMSO中の1mg/mlストックの10μl/リットル)、および300μl/リットルSilwet L−77を含有する500mlの浸潤培地中に穏やかに再懸濁させた。約1月齢の植物を15秒間培地の中に浸漬し、新しい花序を確実に浸した。次いで、植物は、横向きに植え、24時間覆い(透明または不透明)、次いで、水を用いて洗浄し、まっすぐに配置させた。植物は、16時間明/8時間暗の光周期を用いて22℃で成長させた。浸漬の約4週間後に、種子を採取した。
新たに採取したT1種子[AAD−13(v1)遺伝子]を室温で7日間乾燥させた。T1種子は、26.5×51cm発芽トレー(T.O.Plastics Inc.、Clearwater、MN)中にまき、それぞれに、休眠要求量を満たし、同調的種子発芽を確実にするためにあらかじめ40mlの0.1%アガロース溶液中に懸濁させ、2日間、4℃で保存した、層積貯蔵したT1種子の200mgの一定分量(約10,000種子)をまいた。
最初のシロイヌナズナ形質転換は、AAD−13(v1)(植物最適化遺伝子)を使用して行った。T1形質転換体は、グルホシネート選択計画を使用して、非形質転換種子のバックグラウンドから最初に選択した。160,000を超えるT1種子をスクリーニングし、238のグルホシネート抵抗性の植物を同定し(PAT遺伝子)、PAT+Libertyを選択に使用した構築物の選択頻度の正常範囲にある0.15%の形質転換/選択頻度に匹敵した。上記に選択されたT1植物は、続いて、個々の鉢に移植し、様々な率の市販のアリールオキシアルカノエート除草剤を散布した。表11は、AAD−13(v1)およびシロイヌナズナT1形質転換体に対して2,4−D抵抗性を付与するためのコントロール遺伝子の応答を比較する。応答は、%視覚的損傷2 WATに関して示す。データは、ほとんどまたはまったく損傷を示さない(<20%)、中程度の損傷を示す(20〜40%)、または重い損傷を示す(>40%)個体のヒストグラムとして示す。算術平均および標準偏差はそれぞれの処理について示す。個々の応答における範囲もまた、それぞれの率および形質転換について最後の列に示す。PAT/Cry1F形質転換シロイヌナズナは、オーキシン感受性の形質転換コントロールとして役立った。AAD−13(v1)遺伝子は、個々のT1シロイヌナズナ植物に除草剤抵抗性を付与した。所与の処理内で、植物応答のレベルは、大幅に変わり、それぞれの植物が、非依存的な形質転換イベントを示すという事実に起因し得る。重要な留意点として、試験したそれぞれの2,4−D率で、影響されない個体がある一方で、いくつかが極度に影響された。AAD−13(v1)を用いて形質転換した植物対AAD−12(v1)またはPAT/Cry1F形質転換コントロールの間の有意差を単純に実証するための率による全集団損傷平均を表11に示す。高度な率で、散布溶液は、緩衝されない限り、高度に酸性になり、したがって、損傷のうちのいくらかは、散布溶液の酸性度に起因する可能性がある。ほとんどグロースチャンバー中で成長させたシロイヌナズナは、非常に薄い表皮を有し、重い燃焼の影響は、高い率で試験を複雑にし得る。それにもかかわらず、多くの個体が、ほとんどまたはまったく損傷なく、2,240g ae/ha 2,4−Dに耐えた。
選択物質として2,4−Dを使用する、選択可能マーカーとしてAAD−13(v1)を使用する能力は、上記に記載されるように形質転換シロイヌナズナを用いて分析した。約50のT4世代シロイヌナズナ種子(AAD−13(v1)についてホモ接合性)を混入させて、約5,000の野生型(感受性)種子にする。いくつかの処理を比較し、植物のトレーはそれぞれ、以下の処理計画のうちの1つにおいて、2,4−Dの1回または2回のいずれかの適用タイミングを適用する:7DAP、11DAP、または7、その後11DAP。すべての個体がまた同じ形質転換ベクターにおいてPAT遺伝子をも含有するので、2,4−Dを用いて選択されたAAD−13は、グルホシネートを用いて選択されたPATと直接比較することができる。
種々様々のT1のイベントはT2種子を産生するために自家受粉した。これらの種子は、100のランダムなT2同胞に対してLiberty(280g ae/ha)を適用することによって試験した子孫であった。個々のT2植物はそれぞれ、散布適用(187L/ha適用率でのトラックの散布器)前に7.5cmの正方形の鉢に移植した。T1ファミリー(T2植物)の50パーセントは、カイ2乗分析(P>0.05)によって決定されるように、メンデル遺伝を有する優性遺伝単一座についての予期される3抵抗性:1感受性のモデルに分離した。
AAD−13(v1)がトランスジェニックシロイヌナズナにおける他のアリールオキシアルカノエートオーキシン除草剤に対する抵抗性を提供する能力は、様々な基質の葉面適用によって決定された。T2世代シロイヌナズナ種子は層積貯蔵し、シロイヌナズナ(実施例6.4)に似た選択トレーの中にまいた。PATおよび昆虫抵抗性遺伝子Cry1Fを含有する形質転換コントロール系は、類似の方法で植え付けた。実生は、温室中の個々の3インチ鉢に移入した。植物はすべて、187L/haに設定したトラックの散布器を使用して散布した。植物は、一連のピリジルオキシ酢酸除草剤を散布した:200〜800g ae/haトリクロピル(Garlon 3A、Dow AgroSciences)および200〜800g ae/haフルロキシピル(Starane、Dow AgroSciences)。AAD−13活性から結果として生じる2,4−D代謝物質、2,4−ジクロロフェノール(DCP、Sigma)(2,4−Dの280〜2240g ae/haに対して等価なモルで、テクニカルグレードも試験する。適用物はすべて、水中で調合した。処理はそれぞれ、3〜4回繰り返した。植物は、処理の3および14日後に評価した。
トウモロコシは、国際公開第2007/053482号(PCT/US2006/042133(Wrightら))の実施例#8において以前に記載された同じ技術を利用することによって、2,4−Dおよびフルロキシピルに対する高レベル抵抗性を提供するために形質転換することができる。
抗体および続くELISAアッセイは、例えば、国際公開第2007/053482号(Wrightら)の実施例9において記載されるように開発し、実施することができる。
アグロバクテリウム ツメファシエンスを用いるタバコ形質転換は、公開された方法(Horschら、1988)に類似しているが、同一ではない方法によって実行した。形質転換の供給源組織を得るために、タバコ種子(Nicotiana tabacum品種KY160)は、表面殺菌し、寒天を用いて凝固させたホルモンなしのMurashigeおよびSkoogの培地(MurashigeおよびSkoog、1962)であるTOB培地の表面に植え付けた。植物は、28〜30℃で、明かりのついたインキュベーター室において6〜8週間成長させ、葉は、形質転換プロトコールにおいて使用するために無菌で収集した。約1平方センチメートルの片を葉から無菌で切り取り、中肋を除外した。28℃、250rpmに設定した振盪機上のフラスコ中で一晩増殖させたアグロバクテリウム系統(pDAB3278、aka pDAS1580、AAD−13(v1)+PATを含有するEHA101S)の培養物を、遠心分離機においてペレットにし、無菌Murashige & Skoog塩中に再懸濁させ、600nmで0.5の最終光学密度に調整した。葉片は、約30秒間、この細菌懸濁液中に浸漬し、次いで、無菌ペーパータオル上でふき取って乾燥させ、TOB+培地(1mg/Lインドール酢酸および2.5mg/Lベンジルアデニンを含有するMurashigeおよびSkoog培地)上で表を上にして配置させ、28℃の暗中でインキュベートした。2日後に、葉片を、250mg/Lセフォタキシム(Agri−Bio、North Miami、Florida)および5mg/Lのグルホシネートアンモニウム(Basta中の有効成分、Bayer Crop Sciences)を含有するTOB+培地に移動させ、明中で28〜30℃でインキュベートした。葉片は、最初の2週間は1週間当たり2回、およびその後は1週間当たり1回、セフォタキシムおよびBastaを有する新鮮なTOB+培地に移動させた。その葉片を、4〜6週間後に、アグロバクテリウムを用いて処理した;形質転換巣から生じる小さな植物は、この組織調製物から除去し、Phytatray(商標)II管(Sigma)中で、250mg/Lセフォタキシムおよび10mg/L Bastaを含有する培地TOBの中に植え付けた。これらの小植物は、明かりのついたインキュベーター室中で成長させた。3週間後に、茎を切り取り、同じ培地中に根付かせた。植物は、さらに2〜3週間後に、温室に送る準備ができた。
温室中での順化に続いて、次いで、T0植物は、4倍の増分で、140〜2240g ae/haの範囲の2,4−D DMAの様々な率にランダムに割り当てた。タバコについては、140gのae/ha 2,4−Dは、感受性の植物を有意なレベルの抵抗性を有する植物と区別するための有効用量である。表14は、グルホシネート除草剤抵抗性遺伝子(PAT/Cry1F形質転換タバコ)を用いて形質転換されたT0植物に対して示される比較を示す。データは、AAD−13(v1)が、タバコ植物において形質転換された場合、少なくとも2240g ae/haで2,4−D DMAに対する強い耐性を提供することを実証した。
T1形質転換体は、2,4−D選択計画を使用して、非形質転換植物のバックグラウンドから最初に選択した。表15は、AAD−13(v1)およびタバコT1形質転換体に対して2,4−D抵抗性を付与するためのコントロール遺伝子の応答を比較する。応答は、%視覚的損傷2 WATに関して示す。データは、ほとんどまたはまったく損傷を示さない(<20%)、中程度の損傷を示す(20〜40%)、または重い損傷を示す(>40%)個体のヒストグラムとして示す。算術平均および標準偏差はそれぞれの処理について示す。個々の応答における範囲もまた、それぞれの率および形質転換について最後の列に示す。KY160非形質転換タバコは、オーキシン感受性のコントロールとして役立った。AAD−13(v1)遺伝子は、個々のT1タバコ植物に除草剤抵抗性を付与した。
AAD−13(v1)がトランスジェニックタバコにおける他のアリールオキシアルカノエートオーキシン除草剤に対する抵抗性を提供する能力は、様々な基質の葉面適用によって決定された。T1後代試験に続く余りのT1世代植物に、187L/haに設定したトラックの散布器を使用して散布した。植物は、一連のピリジルオキシ酢酸除草剤を散布した:140〜1120g ae/haトリクロピル(Garlon 3A、Dow AgroSciences)および280〜1120g ae/haフルロキシピル(Starane、Dow AgroSciences)。適用物はすべて、水中で調合した。処理はそれぞれ、3回繰り返した。植物は、処理の3および14日後に評価した。
10.1−キャノーラ形質転換
2,4−Dに対する抵抗性を付与するAAD−13(v1)遺伝子は、選択可能マーカーとしてPATを使用するアグロバクテリウム媒介性の形質転換を用いて、セイヨウアブラナを形質転換するために使用することができる。
本開示を考慮して、さらなる作物を、当技術分野において知られている技術を使用して、本発明に従って形質転換することができる。ライムギのアグロバクテリウム媒介性の形質転換については、例えば、PopelkaおよびAltpeter(2003)を参照されたい。例えば、Hincheeら、1988を参照されたい。モロコシのアグロバクテリウム媒介性の形質転換については、例えば、Zhaoら、2000を参照されたい。オオムギのアグロバクテリウム媒介性の形質転換については、例えば、Tingayら、1997を参照されたい。コムギのアグロバクテリウム媒介性の形質転換については、例えば、Chengら、1997を参照されたい。イネのアグロバクテリウム媒介性の形質転換については、例えば、Hieiら、1997を参照されたい。
植物最適化AAD−13(v1)または本来のAAD−2(v1)遺伝子(PCT/US2005/014737を参照されたい)を用いて形質転換された、新たに採取されたT1シロイヌナズナ種子は、植え付け、以前に記載されたようにグルホシネートに対する抵抗性について選択した。次いで、植物を、様々な率の2,4−D(50〜3200g ae/ha)にランダムに割り当てた。除草剤適用は、187L/ha散布容量でトラックの散布器によって適用した。使用する2,4−Dは、200mM Tris緩衝液(pH9.0)または200mM HEPES緩衝液(pH7.5)中で混合した市販のジメチルアミン塩調合物(456g ae/L、NuFarm、St Joseph、MO)とした。
本実施例および以下の実施例は、主題となるAAD−13の発明によって可能になった新規な除草剤使用の特定の例である。
AAD−13(v1)は、直接、2,4−Dに対して通常感受性である作物において、広範囲の広葉雑草の防除のために、フェノキシオーキシン除草剤(例えば2,4−DおよびMCPA)ならびにピリジルオキシオーキシン(フルロキシピル)の使用を可能にすることができる。280〜2240g ae/haでの2,4−Dの適用は、農業環境において存在するほとんどの広葉雑草種を防除すると思われる。より典型的に、560〜1120g ae/haが使用される。フルロキシピルについては、適用率は、典型的に35〜560g ae/ha、より典型的に70〜280 ae/haの範囲であると思われる。
類似した様式において、AAD−13(v1)を用いるイネ科草本種(これらに限定されないが、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、または芝生および牧草など)の形質転換は、通常、選択性が確かではない作物における、高度に効果的なフェノキシオーキシンおよびピリジルオキシオーキシンの使用を可能にするであろう。ほとんどのイネ科草本種は、フェノキシオーキシン(つまり2,4−D)などのオーキシン除草剤に対して生来の耐性を有する。しかしながら、相対的に低レベルの作物選択性は、適用タイミングの期間が短く、または許容できない被害リスクのために、これらの作物における有用性の低減に帰着した。AAD−13(v1)形質転換単子葉作物は、したがって、ほとんどの広葉雑草種を防除するために、280〜2240g ae/haの2,4−Dの適用などの、双子葉作物について記載される処理の類似の組合せの使用を可能にするであろう。より典型的に、560〜1120g ae/haが使用される。フルロキシピルについては、適用率は、典型的に35〜560g ae/ha、より典型的に70〜280 ae/haの範囲であると思われる。
北米において植え付けられたワタ、キャノーラ、トウモロコシ、およびダイズの田畑の大部分は、グリホサート耐性(GT)形質を含有し、GTトウモロコシの採用は上昇中である。さらなるGT作物(例えばコムギ、イネ、サトウダイコン、および芝生)は、開発中であるが、現在まで商業的に発表されていない。他の多くのグリホサート抵抗性種は、実験段階〜開発段階にある(例えばアルファルファ、サトウキビ、ヒマワリ、テンサイ、エンドウマメ、ニンジン、キュウリ、レタス、タマネギ、イチゴ、トマト、およびタバコ;ポプラとモミジバフウのような森林種;ならびにキンセンカ、ペチュニア、およびベゴニアのような園芸種;ワールドワイドウェブ上のisb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm,2005)。GTCは、途方もない広さの防除される雑草ならびにこの系によって提供される利便性および費用効果のために大切なツールとなる。しかしながら、今や標準的なベース処理としてのグリホサートの有用性は、グリホサート抵抗性雑草を選択している。さらに、グリホサートが固有にそれほど効果的でない雑草は、グリホサートのみの化学的計画が実施されている生育地において優性種に変遷している。GT形質とAAD−13(v1)を積み重ねることによって、従来の育種を通してまたは共同で新規な形質転換イベントを通して、雑草の変遷および除草剤抵抗性発達を管理するための雑草防除の有効性、柔軟性、ならびに能力は、改善することができる。前の実施例において述べられるように、AAD−13(v1)を用いて作物を形質転換することによって、単子葉作物は、フェノキシオーキシンまたはピリジルオキシオーキシンの安全性のより高度な限度を有し、またフェノキシオーキシンは、双子葉作物において選択的に用することができる。AAD−13(v1)およびGT形質が任意の単子葉作物種または双子葉作物種において積み重ねられる場合、改善された雑草防除の選択肢についてのいくつかのシナリオを想到することができる。
a)グリホサートは、ほとんどのイネ科雑草種および広葉雑草種の防除のために、標準的な出芽後適用率(420〜2160g ae/ha、好ましくは、560〜840g ae/ha)で適用することができる。コニザ カナデンシスのようなグリホサート抵抗性広葉雑草またはグリホサートを用いて防除することが固有に困難な雑草(例えばツユクサ属種、サツマイモ属種など)の防除については、280〜2240g ae/ha(好ましくは560〜1120g ae/ha)2,4−Dは、有効な防除を提供するために、順次、タンク混合して、またはグリホサートとの予混合物として適用することができる。フルロキシピルについては、適用率は、典型的に35〜560g ae/ha、より典型的に70〜280 ae/haの範囲であると思われる。
b)目下、GTCにおいて一般に適用されるグリホサート率は、適用タイミング当たり560〜2240g ae/haの範囲である。グリホサートは、広葉雑草種よりもイネ科草本種に対してはるかに効果的である。AAD−13(v1)+GTの積み重ね形質は、グリホサートのイネ科草本の有効な率を可能にするであろう(105〜840g ae/ha、より好ましくは210〜420g ae/ha )。2,4−D(280〜2240g ae/ha、より好ましくは560〜1120g ae/haで)は、次いで、必要な広葉雑草防除を提供するために、順次、タンク混合して、またはグリホサートのイネ科草本の有効な率との予混合物として適用することができる。上記に述べられる率でのフルロキシピルは、処理計画における許容できる成分となると思われる。低率のグリホサートはまた、広葉雑草防除に対するいくらかの有益性を提供するとも思われるが、しかしながら、一次防除は、2,4−Dまたはフルロキシピルからのものと思われる。
グルホシネート耐性(PAT、bar)はまた、昆虫抵抗性タンパク質のような入力形質の選択可能マーカーとしてまたは特にHTC形質として、北米において植え付けられた多くの作物において目下存在している。作物は、グルホシネート耐性のキャノーラ、トウモロコシ、およびワタを含むが、これらに限定されない。さらなるグルホシネート耐性作物(例えばイネ、サトウダイコン、ダイズ、および芝生)は、開発中であるが、現在まで商業的に発表されていない。グルホシネートは、グリホサートのように、相対的に非選択的で広い範囲のイネ科草本除草剤および広葉除草剤である。グルホシネートの作用は、グリホサートと異なる。それは、より速く作用し、除草剤適用の24〜48時間後に、処理された葉の乾燥および「燃焼」に帰着する。これは、迅速な雑草防除の出現に関して有利である。しかしながら、これはまた、標的植物の成長点の領域へのグルホシネートの移動を制限し、多くの種における2つの化合物の相対的な雑草防除性能評価によって証拠付けられるように、見込みの少ない雑草防除に帰着する(Agriliance、2005)。
a)グルホシネートは、多くのイネ科雑草種および広葉雑草種の防除のために、標準的な出芽後適用率(200〜1700g ae/ha、好ましくは、350〜500g ae/ha)で適用することができる。現在まで、グルホシネート抵抗性の雑草は確認されていないが、グルホシネートは、グリホサートよりも、固有に耐性がある多くの雑草を有する。
i)固有に耐性の広葉雑草種(例えばシルシウム アルベンシス(Cirsium arvensis)アポシナム カナビナム(Apocynum cannabinum)、およびコニザ カンデンシス(Conyza candensis))は、これらのより防除困難な多年生種の有効な防除のためにおよび一年生広葉雑草種に対する防除の堅調性を改善するために、280〜2240g ae/ha、より好ましくは560〜2240g ae/ha 2,4−Dをタンク混合することによって防除することができる。フルロキシピルは、雑草防除計画において考慮するべき許容できる成分となると思われる。フルロキシピルについては、適用率は、典型的に35〜560g ae/ha、より典型的に70〜280 ae/haの範囲であると思われる。
b)グルホシネート(200〜500g ae/ha)+/−2,4−D(280〜1120g ae/ha)+/−フルロキシピル(上記に挙げられる率で)の複数の組合せは、例えば、より強い、重複する雑草防除スペクトルを提供することができる。さらに、重複するスペクトルは、除草剤抵抗性の雑草の維持または遅延のためのさらなるメカニズムを提供する。
ホモ接合性のAAD−13(v1)植物およびAAD−1(v3)植物(後者についてはPCT/US2005/014737を参照されたい)は共に相互に交雑させることができ、F1種子を収集することができる。それぞれの遺伝子の2つの逆交雑からのF1種子は、層積貯蔵し、処理し、それぞれの交雑の4つの代表的なものを以下の処理のうちの1つを用いる他の試験に使用した計画と同じ散布計画下で処理した:70、140、および280g ae/haフルロキシピル(AAD−12(v1)遺伝子に対して選択的);280、560、および1120g ae/ha R−ジクロルプロップ(AAD−1(v3)遺伝子に対して選択的);または560、1120、および2240g ae/ha 2,4−D DMA(2,4−D耐性を確認するため)。それぞれの遺伝子のホモ接合性のT2植物もまたコントロールとしての使用のために植え付けた。植物は、3および14DATで判定した。散布結果は、表24に示す。
ホモ接合性のAAD−13(v1)植物およびAAD−12(v1)植物(後者については国際公開第2007/053482号を参照されたい)は交雑させることができ、F1種子を収集した。それぞれの遺伝子の2つの逆交雑からのF1種子は、まくことができ、F1植物は、以下の処理のうちの1つを用いる他の試験に使用した計画と同じ散布計画下で処理した:70、280、および1120g ae/haフルロキシピル(AAD−12(v1)遺伝子に対して選択的);70、280、および1120g ae/haトリクロピル(AAD−13(v1)遺伝子に対して選択的);または560、1120、および2240g ae/ha 2,4−D DMA(2,4−D耐性を確認するため)。
イミダゾリノン除草剤耐性(AHASなど)は、トウモロコシ、イネ、およびコムギを含むが、これらに限定されない、北米において植え付けられた多くの作物において目下存在する。さらなるイミダゾリノン耐性の作物(例えばワタおよびサトウダイコン)は、開発中であるが、現在まで商業的に発表されていない。多くのイミダゾリノン除草剤(例えばイマザモックス、イマゼタピル、イマザキン、およびイマザピク)は、様々な従来の作物において選択的に、目下使用されている。イマゼタピル、イマザモックス、および非選択的なイマザピルの使用は、AHASなどのイミダゾリノン耐性形質を通して可能になった。この化学物質クラスはまた有意な土壌残存活性を有し、したがって、グリホサートまたはグルホシネートに基づく系と異なり、適用タイミング以上に広げられた雑草防除を提供することができる。しかしながら、イミダゾリノン除草剤によって防除される雑草のスペクトルはグリホサートほど広くない(Agriliance、2005年)。さらに、イミダゾリノン除草剤は、多くの雑草が抵抗性を発達させた作用機序(アセト乳酸シンターゼ、ALSの阻害)を有する(Heap、2007年)。イミダゾリノン耐性形質とAAD−13(v1)を積み重ねることによって、従来の育種を通してまたは共同で新規な形質転換イベントを通して、雑草の変遷および除草剤抵抗性発達を管理するための雑草防除の有効性、柔軟性、ならびに能力は、改善することができる。前の実施例において述べられるように、AAD−13(v1)を用いて作物を形質転換することによって、単子葉作物は、フェノキシオーキシンまたはピリジルオキシオーキシンの安全性のより高度な限度を有し、またこれらのオーキシンは、双子葉作物において選択的に用することができる。AAD−13(v1)およびイミダゾリノン耐性形質が任意の単子葉作物種または双子葉作物種において積み重ねられる場合、改善された雑草防除の選択肢についてのいくつかのシナリオを想到することができる。
a)イマゼタピルは、多くのイネ科雑草種および広葉雑草種の防除のために、標準的な出芽後適用率(35〜280g ae/ha、好ましくは、70〜140g ae/ha)で適用することができる。
i)アマランサス ラディス、アンブロシア トリフィダ(Ambrosia trifida)、シロザ(特に、Heap、2005年)のようなALS阻害剤抵抗性の広葉雑草は、280〜2240g ae/ha、より好ましくは560〜1120g ae/ha 2,4−Dをタンク混合することによって防除することができる。フルロキシピルについては、適用率は、典型的に35〜560g ae/ha、より典型的に70〜280 ae/haの範囲であると思われる。
ii)サツマイモ属種のような、イミダゾリノン除草剤に対して固有に、より耐性の広葉種もまた、280〜2240g ae/ha、より好ましくは560〜1120g ae/ha 2,4−Dをタンク混合することによって防除することができる。トリクロピルまたはフルロキシピルについては、上記の率を参照されたい。
b)イマゼタピル(35〜280g ae/ha、好ましくは70〜140g ae/ha)+/−2,4−D(280〜1120g ae/ha)+/−フルロキシピル(上記に挙げられる率で)の複数の組合せは、例えば、より強い、重複する雑草防除スペクトルを提供することができる。さらに、重複するスペクトルは、除草剤抵抗性の雑草の維持または遅延のためのさらなるメカニズムを提供する。
トランスジェニック形質によって供給される、作物における昆虫抵抗性は、北米においておよび世界にわたってトウモロコシおよびワタの生産において流行している。組み合わせられたIRおよびHTの形質を有する商品は、複数の種子会社によって開発されてきた。これらは、バチルス チューリンゲンシスIR形質(例えばウェブサイトlifesci.sussex.ac.uk、2006に挙げられるバチルス チューリンゲンシス毒素)および上記に述べられるHTC形質のいずれかまたはすべてを含む。この商品がもたらす価値は、単一の商品において遺伝学的な手段を通して複数の害虫問題を防除する能力である。雑草防除および昆虫防除が互い独立して遂行される場合、この商品の利便性は制限されるであろう。単独または1つもしくは複数のさらなるHTC形質と積み重ねられたAAD−13は、従来の育種を通してまたは共同で新規な形質転換イベントを通して、1つまたは複数のさらなる入力形質(例えば昆虫抵抗性、真菌抵抗性、またはストレス耐性など)(isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm,2005)と積み重ねることができる。有益性は、AAD−13によって与えられる改善された雑草防除および関連する除草剤耐性に加えて、害虫および/または他の農業のストレスを制御する能力と共に、前の実施例において記載される利便性および柔軟性を含む。したがって、本発明は、柔軟にかつ費用効果的に多くの農業の問題を防除するために能力を有する、作物の質が改善された完成農業パッケージを提供するために使用することができる。
植物細胞、組織、器官、および植物または色素体などの細胞小器官の遺伝子操作は、適した送達方法を使用して、植物細胞の中に対象とする遺伝子を挿入するプロセスで始まる。しかしながら、遺伝子が植物細胞に送達される場合、非常に低い割合の細胞だけがそれらのゲノムの中に異種遺伝子を統合する。対象とする遺伝子を組み込んだ少数の細胞を選択するために、研究者らは、ベクターにおいて、選択可能なまたはスクリーニングすることができる「マーカー遺伝子」を対象とする遺伝子(GOI)に連結する。これらのマーカーを含有する細胞は、DNAプラスミドベクターが送達された細胞/組織の集団から同定される。マーカー遺伝子を発現するそれらの細胞を選択することによって、研究者らは、ゲノムの中にGOIを組み込んでいる可能性のある少数の細胞を同定することができる。AAD−13(v1)は、特許出願国際公開第2007/053482号(Wrightら)の実施例#24と同様に使用される場合、選択可能マーカーとして機能することができる。
Claims (22)
- 植物細胞中で機能するプロモーターと、それに作動可能に連結した、アリールオキシアルカノエート除草剤のアリールオキシアルカノエート化学的基礎構造を酵素的に分解するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む単離ポリヌクレオチドであって、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、植物中の前記ポリヌクレオチドの発現を増加するための植物コドン使用に対しバイアスを有する異種コドン組成を含み、前記タンパク質をコードする核酸分子が、配列番号1、配列番号3、および配列番号5からなる群から選択される配列の完全相補体とストリンジェントな条件下(0.1×SSPE、65℃)でハイブリダイズするものである、単離ポリヌクレオチド。
- 前記タンパク質が、配列番号2および配列番号4からなる群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記コドン組成は、双子葉植物コドン使用に対しバイアスがかけられ、および/または、前記プロモーターが植物プロモーターまたは植物ウィルスプロモーターである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1のポリヌクレオチドを含む植物細胞。
- 請求項4に記載の植物細胞を含む植物。
- 前記植物が、双子葉植物であり、大豆植物であってもよい、請求項5の植物。
- 生育地の雑草を防除する方法であって、
前記方法は、前記生育地の土壌に種子を蒔くことを含み、
前記種子は、アリールオキシアルカノエート除草剤のアリールオキシアルカノエート化学的基礎構造を酵素的に分解するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、
前記方法は、前記生育地に前記アリールオキシアルカノエート除草剤を適用することをさらに含み、
前記タンパク質をコードする核酸分子が、配列番号1、配列番号3、および配列番号5からなる群から選択される配列の完全相補体とストリンジェントな条件下(0.1×SSPE、65℃)でハイブリダイズする、方法。 - 前記タンパク質が、配列番号2および配列番号4からなる群から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項7に記載の方法。
- 前記種子が、第二の除草剤を酵素的に分解する第二のタンパク質をコードする第二のポリヌクレオチドを含み、前記方法は、前記生育地に前記第二の除草剤を適用することを含み、そして、
前記種子は、第三の除草剤を酵素的に分解する第三のタンパク質をコードする第三のポリヌクレオチドを含んでいてもよく、前記方法は、前記生育地に前記第三の除草剤を適用することを含んでいてもよい、請求項7の方法。 - 前記除草剤が、2,4−Dであり、前記第二の除草剤がグリホサート、および/または、前記第三の除草剤がグルホシネートおよびジカンバからなる群から選択され、前記除草剤が2,4−Dおよび前記第二の除草剤がグリホサートであってもよく、そして前記2,4−Dと前記グリホサートがタンク混合物から適用されてもよい、請求項9の方法。
- 前記種子が作物植物の種子であり、前記植物が双子葉植物であってもよく、前記植物が大豆植物であってもよい、請求項7の方法。
- 前記アリールオキシアルカノエート除草剤が、(a)フェノキシアセテートまたはフェノキシ酢酸除草剤;(b)フェノキシプロピオン酸除草剤;(c)ピリジルオキシアルカン酸除草剤;および(d)前記除草剤の活性成分の酸、塩、またはエステル体、から選択される、請求項7の方法。
- 前記ピリジルオキシアルカン酸除草剤が、ピリジルオキシ酢酸除草剤である請求項12の方法。
- 請求項12の方法において、(a)前記フェノキシ酢酸除草剤が、2,4−DおよびMCPAからなる群より選択され;および(b)前記フェノキシプロピオン酸除草剤が、ジクロルプロップ、メコプロップおよびそれらのエナンチオマーからなる群より選択される、方法。
- 前記ピリジルオキシ酢酸除草剤が、トリクロピルおよびフルロキシピルなどからなる群より選択される、請求項13の方法。
- フェノキシアセテート除草剤およびピリジルオキシアセテート除草剤が前記生育地に適用される、請求項7の方法。
- 前記方法が、前記生育地において前記種子から作物植物を生育させることを含む、請求項7の方法。
- 前記種子を蒔く前に、前記アリールオキシアルカノエート除草剤の前記適用が行われる、請求項7の方法。
- 前記種子を蒔いた後に、前記アリールオキシアルカノエート除草剤の前記適用が行われる、請求項7の方法。
- 作物植物の成長後に、前記アリールオキシアルカノエート除草剤の前記適用が行われる、請求項7の方法。
- 前記アリールオキシアルカノエート除草剤がフェノキシオーキシンである、請求項7の方法。
- 前記フェノキシオーキシンが、2,4−DBである請求項21の方法。
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