KR20150023643A - 2,4-d 저항성 작물의 수확량 개선 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물에 해롭지 않은 시용 비율의 2,4-D로 식물을 처리함으로써 제초제 2,4-D에 대해 저항성인 작물의 식물 높이 및/또는 수확량을 개선하는 방법에 관한 것이다. 특히, 2,4-D 저항성에 대한 AAD-12 유전자를 발현하는 작물의 수확량을 증가시키기 위해 2,4-D 시용을 사용하는 방법이 제공된다. 제공되는 방법은 메이즈, 대두, 봄 및 겨울 평지유(카놀라), 사탕무, 밀, 해바라기, 보리, 및 벼를 포함하는 작물의 처리에 특히 흥미롭다.

Description

2,4-D 저항성 작물의 수확량 개선 방법{METHODS OF IMPROVING THE YIELD OF 2,4-D RESISTANT CROP PLANTS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2012년 6월 7일자로 출원된 미국 가출원 번호 61/656,546에 대해 우선권을 주장하며, 그 개시는 전체가 인용에 의해 본원에 분명히 포함된다.

전자적으로 제출된 물질의 인용에 의한 포함

본원과 동시에 제출되었으며 다음과 같이 식별되는 컴퓨터-판독가능한 서열 목록은 그 전체가 인용에 의해 포함된다: 2013년 5월 13일자로 생성된 하나의 11,342 바이트 ASCII(텍스트) 파일명 "72747_ST25.txt"

잡초는 작물 및 기타 바람직한 식물에 필요한 중요한 영양소의 토양을 급속히 고갈시킬 수 있다. 현재 잡초의 방제에 사용되는 많은 다양한 종류의 제초제들이 있다. 하나의 매우 인기있는 제초제는 글리포세이트다.

글리포세이트에 대해 저항성인 옥수수, 대두, 카놀라, 목화, 사탕무, 밀, 터프(turf), 및 벼 등의 작물들이 개발되어 왔다. 따라서, 예를 들면 활발히 성장하는 글리포세이트 저항성 옥수수가 있는 재배지는 옥수수 식물을 현저하게 손상하지 않으면서 잡초를 제어하기 위하여 분무될 수 있다.

1990년대 중반에 유전자 조작된 글리포세이트 내성 작물(GTC)의 도입으로, 재배자들은 농업에서 비할 데 없는, 활엽 및 잔디 잡초의 넓은 스펙트럼을 방제하기 위한 간단하고, 편리하며, 유연하고 저렴한 도구를 사용할 수 있었다. 결과적으로, 생산자는 GTC를 신속하게 채택하여 많은 경우는 윤작, 액션 로테이션의 제초제 모드, 탱크 혼합, 화학적 및 재배적인 잡초 방제와 기계의 결합과 같이, 다양한 허용되는 가장 작물학적인 관행을 포기했다. 현재 글리포세이트 내성 대두, 목화, 옥수수, 및 카놀라는 미국 및 다른 서반구에서 시판된다. 더 많은 GTC(예를 들어, 밀, 벼, 사탕무, 터프 등)가 세계 시장 승인 계류 중으로 도입을 준비하고 있다. 다른 많은 글리포세이트 저항성 종은 개발 단계에 대한 실험 중이다(예를 들어, 알팔파, 사탕 수수, 해바라기, 사탕무, 완두, 당근, 오이, 상추, 양파, 딸기, 토마토, 및 담배; 포플러 및 스위트검 같은 임업 종; 및 메리골드, 페투니아, 및 베고니아 같은 원예 종; "isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm, 2005" 웹사이트 참조). 또한, 글리포세이트의 비용은 몇몇 종래의 잡초 방제 프로그램이 글리포세이트 GTC 시스템과 가격 및 성능에 대해 효과적으로 경쟁할 수 있는 지점까지 최근 몇 년 동안 극적으로 하락했다.

글리포세이트는 15 년 넘게 전소(burndown) 및 전체 식물 방제를 위한 다른 비작물 영역에서 성공적으로 사용되어 왔다. 많은 경우에, GTC와 같이, 글리포세이트는 열(row)에서 3, 5, 10에서 15 년 동안 연간 1-3 회 사용되었다. 이러한 상황은 글리포세이트와 GTC 기술에 대한 과도한 의존으로 이어졌고 자연적으로 글리포세이트에 더욱 내성이거나 또는 글리포세이트의 제초제 활성에 저항하는 메커니즘이 발달한 식물에 대한 천연 잡초 종에 심한 선별 압박을 받고 있다.

글리포세이트 전용 잡초 방제 프로그램의 광범위한 사용은 글리포세이트 저항성 잡초의 선별로 이어지며, 대부분의 표적 종보다 글리포세이트에 유전적으로 더 내성인 잡초 종의 번식을 위해 선별하고 있다(즉, 잡초 시프트(shift)). (문헌[Ng et al., 2003; Simarmata et al., 2003; Lorraine-Colwill et al., 2003; Sfiligoj, 2004; Miller et al., 2003; Heap, 2005; Murphy et al., 2002; Martin et al., 2002].) 글리포세이트가 15 년 넘게 세계적으로 널리 사용되었지만, 글리포세이트에 대해 발달된 저항성을 갖는 오직 소수의 잡초만이 보고되었으며(문헌[Heap, 2005]); 그러나, 이들 중 대부분은 지난 3-5 년간 확인되었다. 저항성 잡초는 모두 잔디 및 활엽 종-롤리움 리지덤(Lolium rigidum), 롤리움 멀티플로럼(Lolium multiflorum), 엘류신 인디카(Eleusine indica), 암브로시아 아르테미시이폴리아(Ambrosia artemisiifolia), 코니자 카나덴시스(Conyza Canadensis), 코니자 보나리엔시스(Conyza bonariensis), 및 플란타고 란세올라타(Plantago lanceolata)-을 포함한다. 또한, GTC가 광범위하게 사용되기 전 앞서 작물학적 문제가 되지 않았던 잡초가 이제는 더 널리 퍼지고 GTC의 측면에서 방제하기가 어려워지고 있으며, 이는 80 & 초과의 미국 목화 및 대두 에이커, 및 20 % 초과의 미국 옥수수 에이커(문헌[Gianessi, 2005])를 포함한다. 이 잡초 시프트는 방제하기 어려운 광엽 잡초에서 (전적으로는 아니지만) 주로 발생한다. 일부 예는 이포뫼아(Ipomoea), 아마란투스(Amaranthus), 케노포디움(Chenopodium), 타락사쿰(Taraxacum), 및 콤멜리나(Commelina) 종을 포함한다.

재배자가 글리포세이트 저항성 잡초 또는 더 방제하기 어려운 잡초 종으로의 시프트에 직면하는 지역에서, 재배자는 놓친 잡초를 방제할 다른 제초제와 탱크 혼합 또는 교대시킴으로써 글리포세이트의 약점을 보완할 수 있다. 많은 경우에 활엽이 야생으로 돌아가는 것(escape)을 방제하기 위한 하나의 인기있고 효과적인 탱크 혼합 파트너는 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D)이었다. 2,4-D는 60년 넘게 넓은 스펙트럼의 활엽 잡초 방제를 위해 작물학적으로, 그리고 비작물 상황에서 사용되어 왔다. 보다 내성인 종의 개별 사례가 보고되어 왔지만, 2,4-D는 세계적으로 가장 널리 사용되는 제초제의 하나로 남아있다. 2,4-D의 추가 사용에 대한 제한은 대두 또는 목화와 같은 쌍떡잎 작물에서의 선별성이 매우 열등하고, 따라서 2,4-D는 민감성 쌍떡잎 작물에 통상적으로 (그리고 일반적으로 거의) 사용되지 않는다. 또한, 잔디 작물에서 2,4-D의 사용은 발생할 수 있는 작물 손상의 성질에 의해 다소 제한된다. 무경운(no-till) 대두 및 목화를 식재하기 전에 더 강한 번다운 처리를 제공하기 위해 2,4-D는 글리포세이트와 함께 사용되어 왔지만; 2,4-D 에 대한 이 쌍떡잎 종의 민감성으로 인해, 이 번다운 처리는 식재 전 적어도 14~30 일에는 발생해야 한다(문헌[Agriliance, 2003]).

2,4-D는 MCPA와 같은 페녹시 산 종류 제초제이다. 2,4-D는 원하는 작물을 심하게 손상시키지 않으면서 활엽 잡초의 선별적 방제를 위해 많은 외떡잎 작물(예컨대 옥수수, 밀, 및 벼)에 사용되어 왔다. 2,4-D는 정상 세포 호르몬 항상성을 탈조절하며 균형되고 제어된 성장을 방해하는 작용을 하는 합성 옥신 유도체이지만; 작용의 정확한 모드는 아직 알려져 있지 않다. 또한 트리클로피르 및 플루록시피르는 이들의 작용 모드가 합성 옥신과 같은 피리딜옥시아세트산 제초제이다.

이 제초제는 특정 식물에 대해 상이한 수준의 선별도를 갖는다(예를 들어, 쌍떡잎식물은 잔디보다 더 민감성임). 상이한 식물에 의한 차등 대사는 다양한 수준의 선별도에 대한 하나의 이유이다. 일반적으로, 식물은 2,4-D를 서서히 대사시키고 따라서 2,4-D에 대한 다양한 식물 반응은 표적 부위(들)에서의 상이한 활성에 의해 보다 그럴듯하게 설명될 수 있다(문헌[WSSA, 2002]). 2,4-D의 식물 대사는 통상적으로 2 단계 메커니즘, 통상적으로는 히드록실화, 그 다음 아미노산 또는 글루코스와의 결합을 통해 일어난다(문헌[WSSA, 2002]).

시간이 지남에 따라, 미생물 집단은 이 특정 생체이물의 분해에 대한 대안적이고 효율적인 경로를 발달시켰으며, 이는 2,4-D의 완전한 광물화를 가져온다. 제초제의 연속적 시용은 성장을 위한 탄소원으로서 제초제를 이용할 수 있는 미생물에 대해 선별하고, 이는 토양에서 경쟁 우위를 제공한다. 이러한 이유로, 현재 제형화된 2,4-D는 비교적 짧은 토양 반감기를 가지고 있으며, 후대 작물에 의미있는 잔여 효과를 발생시키지 않는다. 이는 2,4-D의 제초제 유용성에 추가된다.

2,4-D를 분해하는 능력에 대해 광범위하게 연구된 한 생물은 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)이다(문헌[Streber et al., 1987]). 광물화 경로에서의 첫 번째 효소 단계를 코딩하는 유전자는 tfdA이다. 미국 특허 번호 6,153,401및 진뱅크 수탁번호 M16730 참조. tfdA는 α-케토글루타레이트-의존 디옥시게나제 반응을 통해 2,4-D 산을 디클로로페놀(DCP)로 변환시키는 것에 촉매작용을 한다(문헌[Smejkal et al., 2001]). DCP는 2,4-D에 비해 작은 제초제 활성을 갖는다. tfdA는 2,4-D에 정상적으로 민감성인 쌍떡잎 식물(예를 들면, 목화 및 담배)의 2,4-D 저항성을 부여하는 트랜스제닉 식물에서 사용되었다(문헌[Streber et al. (1989), Lyon et al. (1989), Lyon (1993)], 및 미국 특허 번호 5,608,147).

2,4-D를 분해할 수 있는 단백질을 코딩하는 다수의 tfdA형 유전자는 환경으로부터 동정되어 진뱅크 데이터베이스에 기탁되었다. 많은 동족체는 tfdA(85 % 초과의 아미노산 동일성)와 유사하며 tfdA와 유사한 효소 특성을 갖는다. 그러나 tfdA(25-50 %)에 상당히 낮은 동일성을 갖지만 α-케토글루타레이트 디옥시게나제 Fe⁺² 디옥시게나제와 관련된 특징적 잔기를 갖는 다수의 동족체가 있다. 따라서 이러한 분기성(divergent) 디옥시게나제의 기질 특이성이 무엇인지는 분명하지 않다.

tfdA에 대해 낮은 상동성(31 %의 아미노산 동일성)을 갖는 하나의 고유한 예는 델프티아 아시도보란스(Delftia acidovorans)로부터의 sdpA이다(문헌[Kohler et al., 1999, Westendorf et al., 2002, Westendorf et al., 2003]). 이 효소는 (S)-디클로르프로프(및 다른 (S)-페녹시프로피온산)에서의 첫 번째 단계뿐만 아니라 2,4-D(페녹시아세트산) 광물화에도 촉매작용하는 것으로 나타났다(문헌[Westendorf et al., 2003]). 이 유전자의 식물로의 형질전환은 지금까지 보고되지 않았다.

새로운 제초제 내성 작물(HTC) 기술의 개발은 GTC의 효과, 낮은 비용, 및 편리함 때문에 매우 성공이 제한되어 왔다. 따라서, GTC에 대한 매우 높은 채택 비율이 생산자들 사이에서 발생했다. 이는 새로운 HTC 기술을 개발하는 데 있어 작은 동기를 만들었다.

아릴옥시알카노에이트 화학 하부구조는 페녹시아세테이트 옥신(예컨대 2,4-D 및 디클로르프로프), 피리딜옥시아세테이트 옥신(예컨대, 플루록시피르 및 트리클로피르), 아릴옥시페녹시프로피오네이트(AOPP) 아세틸-조효소 A 카르복실라제(ACCase) 저해제(예컨대, 할록시포프, 퀴잘로포프, 및 디클로포프), 및 5-치환된 페녹시아세테이트 프로토포르피리노겐 옥시다제 IX 저해제(예컨대, 피라플루펜 및 플루미클로락)를 포함하는 많은 상용화된 제초제의 공통적 존재이다. 그러나, 이러한 종류의 제초제는 모두 뚜렷이 구별되며, 이러한 화학 종류들 간의 공통 분해 경로에 대한 증거가 현재의 문헌에는 없다. 다수의 작용 모드를 포함하는 제초제의 분해를 위한 다기능 효소가 최근 설명되었다(2005년 5월 2일자로 출원된 PCT US/2005/014737).

본 발명은 식물에 해롭지 않은 시용 비율의 2,4-D로 식물을 처리함으로써 제초제 2,4-D에 대해 저항성인 작물의 식물 높이 및/또는 수확량을 개선하는 방법에 관한 것이다. 특히, 2,4-D 저항성에 대한 AAD-12 유전자를 발현하는 작물의 수확량을 증가시키기 위해 2,4-D 시용을 사용하는 방법이 제공된다. 본 발명은 또한 2,4-D 저항성인 작물의 수확량을 개선하기 위한 2,4-D의 용도에 관한 것이다. 제공되는 방법은 메이즈, 대두, 봄 및 겨울 평지유(카놀라), 사탕무, 밀, 해바라기, 보리, 및 벼를 포함하는 작물의 처리에 특히 흥미롭다.

일부 실시양태에서, 2,4-D 저항성 작물은 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제(AAD)로 형질전환된 트랜스제닉 작물이다. 추가 실시양태에서, 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제(AAD)는 AAD-1 또는 AAD-12이다. AAD-1는 이전에 US 2009/0093366에 개시되었으며, AAD-12는 WO 2007/053482에 개시되었고, 이들의 내용은 그 전체가 인용에 의해 포함된다.

2,4-D 처리의 수확량 개선 효과는 25 g ae/ha 내지 5000 g ae/ha, 또는 100 g ae/ha 내지 2500 g ae/ha, 또는 특히 1000 g ae/ha 내지 2000 g ae/ha의 시용 비율에서 관찰될 수 있다. 일 실시양태에서, 1000 g ae/ha 내지 1500 g ae/ha의 2,4-D가 사용된다. 다른 실시양태에서, 2000 g ae/ha 내지 2500 g ae/ha가 사용된다. 또한, 2,4-D 처리의 수확량 개선 효과는 개화 전 작물의 2- 내지 8- 엽기에서 2,4-D가 시용될 때 특히 현저하다. 그러나 요구되는 시용 비율 및/또는 작물의 엽기는 식물, 그 높이 및 기후 조건의 함수로서 변화한다.

용어, 수확량의 증가는 식물이 50 % 이상까지 수확하는 것을 말한다. 일 실시양태에서, 수확량의 증가는 10 % 이상이다. 다른 실시양태에서, 수확량의 증가는 20 % 이상이다. 다른 실시양태에서, 수확량의 증가는 10 % 내지 60 %이다. 다른 실시양태에서, 수확량의 증가는 20 % 내지 50 %이다. 다른 실시양태에서, 수확량의 증가는 통계적으로 중요하다. 2,4-D에서 2,4-D 저항성 작물로의 성장 촉진 활성은 야외 시험 또는 화분 시험에서 측정할 수 있다. 상이한 작용 모드를 갖는 제초제는 일반적으로 수확량에 악영향을 미치거나 또는 수확량에 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 알려져 있다.

일 측면에서, 아릴옥시알카노에이트 잔기를 포함하는 제초제의 자극량으로 식물을 처리하는 것을 포함하는, 2,4-D 저항성 작물의 수확량을 개선하는 방법이 제공된다.

일 실시양태에서, 2,4-D 저항성 작물은 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제(AAD)로 형질전환된 트랜스제닉 식물이다. 추가 실시양태에서, 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제(AAD)는 AAD-1 또는 AAD-12이다. 다른 실시양태에서, 아릴옥시알카노에이트 잔기를 포함하는 제초제는 페녹시 제초제 또는 페녹시아세트산 제초제이다. 추가 실시양태에서, 아릴옥시알카노에이트 잔기를 포함하는 제초제는 2,4-D이다. 추가 실시양태에서, 2,4-D는 2,4-D 콜린 또는 2,4-D 디메틸아민(DMA)을 포함한다.

일 실시양태에서, 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제(AAD)로 형질전환된 트랜스제닉 식물은 목화, 대두, 및 카놀라로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 처리는 잡초 방제를 위해서도 사용되는 2,4-D의 시용 비율로 적어도 한 번 수행된다. 다른 실시양태에서, 처리는 잡초 방제를 위해서도 사용되는 2,4-D의 시용 비율로 두 번 수행된다. 추가 실시양태에서, 2,4-D는 2,4-D 내성을 갖는 대두 V3 및 R2 성장 단계에서 시용된다. 다른 실시양태에서, 처리는 잡초 방제를 위해서도 사용되는 2,4-D의 시용량으로 적어도 세 번 수행된다. 다른 실시양태에서, 아릴옥시알카노에이트 잔기를 포함하는 제초제는 뿌리 흡수를 통해 2,4-D 저항성 작물에 도달한다.

다른 실시양태에서, 2,4-D 저항성 작물은 또한 잡초 방제를 위해 2,4-D와 상이한 제초제로 처리된다. 추가 실시양태에서, 2,4-D와 상이한 제초제는 포스포르-제초제 또는 아릴옥시페녹시프로피온산 제초제이다. 추가 실시양태에서, 포스포르-제초제는 글리포세이트, 글루포시네이트, 그의 유도체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 추가 실시양태에서, 포스포르-제초제는 암모늄 염, 이소프로필암모늄 염, 이소프로필아민 염 또는 포타슘 염의 형태이다. 다른 실시양태에서, 포스포르-제초제는 뿌리 흡수 통해 2,4-D 저항성 작물에 도달한다. 다른 실시양태에서, 아릴옥시페녹시프로피온산 제초제는 클로라지포프, 페녹사프로프, 플루아지포프, 할록시포프, 퀴잘로포프, 그의 유도체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 추가 실시양태에서, 아릴옥시페녹시프로피온산 제초제는 뿌리 흡수 통해 2,4-D 저항성 작물에 도달한다.

일 실시양태에서, 2,4-D 저항성 작물은 25 g ae/ha 내지 5000 g ae/ha 2,4-D로 적어도 한번 처리된다. 다른 실시양태에서, 2,4-D 저항성 작물은 100 g ae/ha 내지 2000 g ae/ha 2,4-D로 적어도 한번 처리된다. 다른 실시양태에서, 2,4-D 저항성 작물은 100 g ae/ha 내지 2500 g ae/ha 2,4-D로 적어도 한번 처리된다. 다른 실시양태에서, 2,4-D 저항성 작물은 1000 g ae/ha 내지 2000 g ae/ha 2,4-D로 적어도 한번 처리된다. 추가 실시양태에서, 2,4-D는 2,4-D 콜린 또는 2,4-D 디메틸아민(DMA)을 포함한다.

일 실시양태에서, 2,4-D 저항성 작물의 수확량을 개선하는 방법이 제공된다. 방법은

(a) 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제(AAD)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 식물 세포를 형질전환하는 것;

(b) 형질전환된 세포를 선별하는 것;

(c) 형질전환 세포로부터 식물을 재생하는 것; 및

(d) 아릴옥시알카노에이트 잔기를 포함하는 제초제 자극량으로 식물을 처리하는 것

을 포함한다.

일 실시양태에서, 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제(AAD)는 AAD-1 또는AAD-12이다. 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제(AAD)가 아닌 선별가능한 마커를 포함한다. 다른 실시양태 또는 대안적인 실시양태에서, 선별가능한 마커는 포스피노트리신 아세틸트랜스페라제 유전자(pat) 또는 바이알라포스 저항성 유전자(bar)이다. 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 식물-최적화된다.

다른 측면에서, 2,4-D 저항성을 갖는 트랜스제닉 식물을 그의 비트랜스제닉 부모 식물에 비해 증가된 수확량으로 제조함에 있어서, 아릴옥시알카노에이트 잔기를 포함하는 제초제의 사용이 제공된다. 일 실시양태에서, 아릴옥시알카노에이트 잔기를 포함하는 제초제는 2,4-D이다. 추가 실시양태에서, 2,4-D는 25 g ae/ha 내지 5000 g ae/ha 2,4-D로 적어도 한 번 시용된다. 다른 실시양태에서, 2,4-D는 100 g ae/ha 내지 2000 g ae/ha 2,4-D로 적어도 한 번 시용된다. 다른 실시양태에서 2,4-D는 100 g ae/ha 내지 2500 g ae/ha 2,4-D로 적어도 한 번 시용된다. 다른 실시양태에서 2,4-D는 1000 g ae/ha 내지 2000 g ae/ha 2,4-D로 적어도 한 번 시용된다. 추가 실시양태에서, 2,4-D는 2,4-D 콜린 또는 2,4-D 디메틸아민(DMA)을 포함한다. 추가 실시양태에서, 2,4-D 저항성 작물은 개화 전에 2,4-D로 2 번 이상 처리된다. 다른 실시양태에서, 2,4-D 저항성 작물은 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제(AAD)로 형질전환된 트랜스제닉 식물이다. 추가 실시양태에서, 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제(AAD)는 AAD-1 또는 AAD-12이다.

도면과 서열의 간단한 설명
도 1은 본 발명의 AAD-12 효소에 의해 촉매작용된 일반적인 화학 반응을 도시한다. 도 2는 플라스미드 pDAB4468에 대한 대표적인 지도를 나타낸다. 도 3은 플라스미드 pDAS1740에 대한 대표적인 지도를 나타낸다.
서열 1은 델프티아 아시도보란스로부터의 AAD-12의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 2는 서열 1에 의해 코딩된 번역된 단백질 서열이다.
서열 3은 AAD-12(v1)의 식물 최적화된 뉴클레오티드 서열이다.
서열 4는 서열 3에 의해 코딩된 번역된 단백질 서열이다.
서열 5는 AAD-12(v2)의 E. 콜라이 최적화된 뉴클레오티드 서열이다.
서열 6은 M13 포워드 프라이머의 서열이다.
서열 7은 M13 리버스 프라이머의 서열이다.
서열 8은 포워드 AAD-12(v1) PTU 프라이머의 서열이다.
서열 9는 리버스 AAD-12(v1) PTU 프라이머의 서열이다.
서열 10은 포워드 AAD-12(v1) 코딩 PCR 프라이머의 서열이다.
서열 11은 리버스 AAD-12(v1) 코딩 PCR 프라이머의 서열이다.
서열 12는 "sdpacodF" AAD-12(v1) 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열 13은 "sdpacodR" AAD-12(v1) 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열 14는 "브래디의 Nco1(Nco1 of Brady)" 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열 15는 "브래디의 Sac1" 프라이머의 서열을 나타낸다.

본원에서 사용된 문구 "형질전환된" 또는 "형질전환"은 DNA의 세포 내로의 도입을 말한다. 문구 "형질전환체" 또는 "트랜스제닉"은 형질전환되거나 또는 형질전환 과정을 거친 식물 세포, 식물 등을 말한다. 도입된 DNA는 보통 DNA의 삽입 편을 포함하는 벡터의 형태이다.

본원에서 사용된 문구 "선별가능한 마커" 또는 "선별가능한 마커 유전자"는 예를 들어, 선별제로부터 식물 세포를 보호하기 위해 또는 선별제에 대한 저항성/내성을 제공하기 위해 식물 형질전환에 임의로 사용되는 유전자를 말한다. 기능성 선별가능한 마커를 수용하는 이러한 세포 또는 식물만이 선별제를 갖는 조건 하에서 분할 또는 성장할 수 있다. 선별제의 예는 예를 들면 스펙티노마이신, 네오마이신, 카나마이신, 파로모마이신, 겐타마이신 및 하이그로마이신을 포함하는 항생제를 포함할 수 있다. 이 선별가능한 마커는 항생제 카나마이신에 대한 저항성을 부여하는 효소를 발현하는 네오마이신 포스포트랜스페라제(npt II)에 대한 유전자 및 관련 항생제 네오마이신, 파로모마이신, 겐타마이신, 및 G418에 대한 유전자, 또는 하이그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 효소를 발현하는 하이그로마이신 포스포트랜스페라제(hpt)에 대한 유전자를 포함한다. 다른 선별가능한 마커 유전자는 Bar(바스타(BASTA)^®에 대한 저항성(글루포시네이트 암모늄), 또는 포스피노트리신(PPT)), 아세토락테이트 신타제(ALS, 분지형-사슬 아미노산의 합성에서 첫 번째 단계를 방지하는 저해제, 예컨대 술포닐우레아(SU), 이미다졸리논(IMI), 트리아졸로피리미딘(TP), 피리미디닐 옥시벤조에이트(POB), 및 술포닐아미노 카르보닐 트리아졸리논에 대한 저항성), 글리포세이트, 2,4-D, 및 금속 저항성 또는 민감성을 포함하는 제초제 저항성을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 문구 "마커-양성"은 선별가능한 마커 유전자를 포함하도록 형질전환된 식물을 말한다.

다양한 선별가능한 또는 검출가능한 마커는 형질전환된 식물, 또는 형질전환체의 식별 및 선별을 가능하게 하기 위해 선택된 발현 벡터 내로 혼입될 수 있다. 예를 들어 DNA 서열화 및 PCR(폴리머라제 연쇄 반응), 써던 블롯팅, RNA 블롯팅, 벡터로부터 발현된 단백질, 예를 들면 포스피노트리신 저항성을 조정하는 침전 단백질, 또는 다른 단백질, 예컨대 리포터 유전자 β-글루쿠로니다제(GUS), 루시페라제, 녹색 형광 단백질(GFP), DsRed, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제(CAT), 알칼리성 포스파타제 등의 검출을 위한 면역학적 방법을 포함하는 많은 방법들에 의해 형질전환된 식물에서의 선별 마커의 발현을 확인할 수 있다(문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001] 참조, 이 내용은 그 전체가 인용에 의해 본원에 포함됨).

선별가능한 마커 유전자는 형질전환된 세포 또는 조직의 선별을 위해 이용된다. 선별가능한 마커 유전자는 네오마이신 포스포트랜스페라제 II(NEO) 및 하이그로마이신 포스포트랜스페라제(HPT)를 코딩하는 것과 같은, 항생제 저항성을 코딩하는 유전자뿐만 아니라 제초제 화합물에 저항성을 부여하는 유전자를 포함한다. 제초제 저항성 유전자는 일반적으로 제초제에 비민감성인 개질된 표적 단백질, 또는 작용할 수 있기 전에 식물 내에서 제초제를 분해하거나 해독시키는 효소를 코딩한다. 문헌[DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513-2518; DeBlock et al. (1989) Plant Physiol., 91:691-704; Fromm et al. (1990) 8:833-839; Gordon-Kamm et al. (1990) 2:603-618)] 참조. 예를 들어, 글리포세이트 또는 술포닐우레아 제초제에 대한 저항성은 돌연변이 표적 효소, 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(EPSPS) 및 아세토락테이트 신타제(ALS)를 코딩하는 유전자를 사용함으로써 얻어졌다. 글루포시네이트 암모늄, 브로목시닐, 및 2,4-디클로로페녹시아세테이트(2,4-D)에 대한 저항성은 각각의 제초제를 해독하는 포스피노트리신 아세틸트랜스페라제, 니트릴라제, 또는 2,4-디클로로페녹시아세테이트 모노옥시게나제를 코딩하는 박테리아 유전자를 사용함으로써 얻어졌다. 2,4-D 저항성에 대한 효소/유전자는 이전에 US 2009/0093366 및 WO 2007/053482에 개시되었으며, 이들의 내용은 전체가 인용에 의해 본원에 포함된다.

이미다졸리논 또는 술포닐우레아를 포함하는 다른 제초제는 성장점 또는 분열조직을 억제할 수 있다. 이 카테고리 내의 예시적인 유전자는 예를 들면 문헌[Lee et al., EMBO J. 7:1241 (1988); 및 Miki et al., Theon. Appl. Genet. 80:449 (1990)]에 각각 설명되어 있는 바와 같이 돌연변이 ALS 및 AHAS 효소를 코딩한다.

글리포세이트 저항성 유전자는 (재조합 핵산의 도입 및/또는 천연 EPSP 유전자의 체내 돌연변이유발의 다양한 형태를 통한) 돌연변이 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(EPSPs) 유전자, aroA 유전자, 및 글리포세이트 아세틸 트랜스페라제(GAT) 유전자 각각을 포함한다. 다른 포스포노 화합물에 대한 저항성 유전자는 글루포시네이트(스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 및 스트렙토마이세스 비리디크로모게네스를 포함하는 스트렙토마이세스 종에서 나온 포스피노트리신 아세틸 트랜스페라제(PAT) 유전자), 및 피리디녹시 또는 페녹시 프로피온산 및 시클로헥손(ACCase 저해제-코딩 유전자)를 포함하고, 예를 들어, 샤(Shah) 등의 미국 특허 번호 4,940,835 및 배리(Barry) 등의 미국 특허 번호 6,248,876을 참조하며, 이들은 식물에 글리포세이트 저항성을 부여할 수 있는 EPSPs의 형태의 뉴클레오티드 서열을 개시한다. 돌연변이 aroA 유전자를 코딩하는 DNA 분자를 ATCC 수탁 번호 39256하에 얻을 수 있으며, 돌연변이 유전자의 뉴클레오티드 서열은 코마이(Comai)의 미국 특허 번호 4,769,061, 쿠마다(Kumada) 등의 유럽 특허 출원 번호 0 333 033, 및 굿맨(Goodman) 등의 미국 특허 번호 4,975,374에 개시되어 있고, 이는 예컨대 L-포스피노트리신 같은 제초제에 저항성을 부여하는 글루타민 신테타제 유전자의 뉴클레오티드 서열을 개시한다. PAT 유전자의 뉴클레오티드 서열은 리만스(Leemans) 등의 유럽 출원 번호 0 242 246에 제공된다. 또한 문헌[DeGreef et al., Bio/Technology 7:61 (1989)]은 PAT 활성을 코딩하는 키메라 bar 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물의 생산을 설명한다. 세톡시딤 및 할록시포프를 포함하는 페녹시 프로피온산 및 시클로헥손에 대해 저항성을 부여하는 유전자의 예는 문헌[Marshall et al., Theon. Appl. Genet. 83:435 (1992)]에 설명되어 있는 Acc1-S1, Acc1-S2 및 Acc1-S3 유전자이다. 글리포세이트 저항성을 부여할 수 있는 GAT 유전자는 캐슬(Castle) 등의 WO 2005012515에 설명되어 있다. 2,4-D, 포프 및 피리딜옥시 옥신 제초제에 대한 저항성을 부여하는 유전자는 WO 2005107437 및 미국 특허 출원 일련번호 11/587,893에 설명되어 있다.

트리아진(psbA 및 1s+ 유전자) 또는 벤조니트릴(니트릴라제 유전자)를 포함하는 다른 제초제는 광합성을 억제할 수 있다. 문헌[Przibila et al., Plant Cell 3:169 (1991)]은 돌연변이 psbA 유전자를 코딩하는 플라스미드로 클라미도모나스를 형질전환하는 것을 설명한다. 니트릴라제 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열은 스토커(Stalker)의 미국 특허 번호 4,810,648에 개시되어 있고, 이러한 유전자를 포함하는 DNA 분자는 ATCC 수탁 번호 53435, 67441 및 67442 하에서 입수가능하다. 글루타티온 S-트랜스페라제를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 발현은 문헌[Hayes et al., Biochem. J. 285:173 (1992)]에 설명되어 있다.

본 발명의 목적을 위해, 선별가능한 마커 유전자는 비제한적으로 네오마이신 포스포트랜스페라제 II(문헌[Fraley et al. (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science, 4:1-25]); 시안아미드 히드라타제(문헌[Maier-Greiner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4250-4264]); 아스파르테이트 키나제; 디히드로디피콜리네이트 신타제(문헌[Perl et al. (1993) Bio/Technology, 11:715-718]); 트립토판 데카르복실라제(문헌[Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Bio., 22:907-912]); 디히드로디피콜리네이트 신타제 및 탈감각된(desensitized) 아스파르테이드 키나제(문헌[Perl et al. (1993) Bio/Technology, 11:715-718]); bar 유전자(문헌[Toki et al. (1992) Plant Physiol., 100:1503-1507 and Meagher et al. (1996) and Crop Sci., 36:1367]); 트립토판 데카르복실라제(문헌[Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Biol., 22:907-912]); 네오마이신 포스포트랜스페라제(NEO)(문헌[Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen., 1:327]); 하이그로마이신 포스포트랜스페라제(HPT 또는 HYG)(문헌[Shimizu et al. (1986) Mol. Cell Biol., 6:1074]); 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)(문헌[Kwok et al. (1986) PNAS USA 4552]); 포스피노트리신 아세틸트랜스페라제(문헌[DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513]); 2,2-디클로로프로피온산 데할로게나제(문헌[Buchanan-Wollatron et al. (1989) J. Cell. Biochem. 13D:330]); 아세토히드록시산 신타제(앤더슨(Anderson) 등의 미국 특허 번호 4,761,373; 문헌[Haughn et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 221:266]); 5-에놀피루빌-시키메이트-포스페이트 신타제(aroA)(문헌[Comai et al. (1985) Nature 317:741]); 할로아릴니트릴라제(스토커 등의 PCT 출원 공개공보 WO87/04181); 아세틸-조효소 A 카르복실라제(문헌[Parker et al. (1990) Plant Physiol. 92:1220]); 디히드로프테로에이트 신타제(sul I)(문헌[Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127]); 및 32 kD 광계 II 폴리펩티드(psbA)(문헌[Hirschberg et al. (1983) Science, 222:1346])를 코딩하는 유전자를 포함한다.

또한 클로람페니콜(문헌[Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J., 2:987-992]); 메토트렉세이트(문헌[Herrera-Estrella et al. (1983) Nature, 303:209-213; Meijer et al. (1991) Plant Mol Bio., 16:807-820 (1991)]); 하이그로마이신(문헌[Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol., 5:103-108; Zhijian et al. (1995) Plant Science, 108:219-227 and Meijer et al. (1991) Plant Mol. Bio. 16:807-820]); 스트렙토마이신(문헌[Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet., 210:86-91]); 스펙티노마이신(문헌[Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res., 5:131-137]); 블레오마이신(문헌[Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol., 7:171-176]); 술폰아미드(문헌[Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Bio., 15:127-136]); 브롬옥시닐(문헌[Stalker et al. (1988) Science, 242:419-423]); 2,4-D (문헌[Streber et al. (1989) Bio/Technology, 7:811-816]); 글리포세이트(문헌[Shaw et al. (1986) Science, 233:478-481]); 및 포스피노트리신(문헌[DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513-2518])에 대한 저항성을 코딩하는 유전자가 포함된다. 본 개시에서 인용되는 모든 참고문헌은 달리 언급하지 않는 한 그 전체가 인용에 의해 본원에 포함된다.

선별가능한 마커 및 리포터 유전자의 상기 나열은 제한하는 것을 의미하지는 않는다. 임의의 리포터 또는 선별가능한 마커 유전자가 본 발명에 포함된다. 필요에 따라 이러한 유전자는 본 기술분야에서 알려진 방법에 의해 서열화될 수 있다.

리포터 및 선별가능한 마커 유전자는 식물에서 최적의 발현을 위해 합성된다. 즉, 유전자의 코딩 서열은 식물에서의 발현을 증강시키기 위해 변형되었다. 합성 마커 유전자는 더 높은 수준으로 식물에서 발현되도록 설계되어 더 높은 형질전환 효율을 가져온다. 유전자의 합성 최적화 방법은 본 기술분야에서 이용가능하다. 사실, 몇몇 유전자는 식물에서의 유전자 생성물의 발현을 증가시키기 위해 최적화되었다.

마커 유전자 서열은 특정 식물 종에서의 발현을 위해 최적화될 수 있거나, 또는 대안으로서 식물 패밀리에서 최적의 발현을 위해 변형될 수 있다. 식물 적합 코돈은 특정 관심 식물 종에서 최다량으로 발현된 단백질에서의 최고 빈도의 코돈으로부터 결정될 수 있다. 예를 들어, 인용에 의해 본원에 포함된 EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432; 문헌[Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3324-3328]; 및 문헌[Murray et al. (1989) Nucleic Acids Research, 17: 477-498]; 미국 특허 번호 5,380,831; 및 미국 특허 번호 5,436,391를 참조한다. 이러한 방식으로, 뉴클레오티드 서열은 임의의 식물에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 유전자 서열의 전부 또는 임의의 부분은 최적화되거나 또는 합성될 수 있다는 것이 알려져 있다. 즉, 완전히 최적화되거나, 또는 부분적으로 최적화된 서열이 또한 사용될 수 있다.

또한, 아그로박테리움-매개 형질전환 시스템을 이용한 몇몇 형질전환 방법이 개발되었다. 예를 들어, 이원 벡터 방법은 T-DNA가 Ti 플라스미드의 나머지와는 상이한 플라스미드 내에 있는 2-플라스미드 시스템에 기반한다. 공동-통합 방법에서, T-DNA의 작은 부분은 외래 유전자와 동일한 벡터 내에 위치하며, 이 벡터는 후속적으로 Ti 플라스미드와 재조합된다.

본원에서 사용된 문구 "식물"은 쌍떡잎 식물 및 외떡잎 식물을 포함한다. 쌍떡잎 식물의 예는 담배, 아라비돕시스, 대두, 토마토, 파파야, 카놀라, 해바라기, 목화, 알팔파, 감자, 포도나무, 나무콩, 완두, 브라시카, 병아리콩, 사탕무, 유채, 수박, 멜론, 후추, 땅콩, 호박, 무, 시금치, 스쿼시, 브로콜리, 양배추, 당근, 컬리플라워, 셀러리, 배추, 오이, 가지, 및 양상추를 포함한다. 외떡잎 식물의 예는 옥수수, 벼, 밀, 사탕 수수, 보리, 호밀, 수수, 난초, 대나무, 바나나, 부들, 백합, 귀리, 양파, 기장 및 라이밀을 포함한다.

2,4-D 저항성 유전자 및 후대 저항성 작물에 대한 본 발명의 개발은 작물 내 시용을 위한 활엽 글리포세이트-저항성(또는 고도로 내성이고 시프팅됨) 잡초 종을 방제하기 위한 뛰어난 옵션을 제공한다. 2,4-D는 쌍떡잎 및 외떡잎 작물 둘 다에서 더 큰 작물 내성이 제공될 수 있는 경우 재배자에게 뛰어난 유용성을 제공할 수 있는 넓은 스펙트럼의 비교적 저렴하고 강력한 활엽 제초제이다. 2,4-D-내성 트랜스제닉 쌍떡잎 작물은 또한 시용의 시기 및 비율에서 더 큰 유연성을 가질 것이다. 2,4-D에 대한 본 발명의 제초제 내성 형질의 추가적인 유용성은 2,4-D 드리프트, 휘발, 반전(또는 다른 오프-사이트 이동 현상), 오용, 반달리즘 등으로부터 보통의 민감성인 작물에 대한 파손을 방지하는 그의 유용성이다. AAD-12 유전자의 추가의 이점은 현재까지 특징화된 모든 tfdA 동족체와 달리, AAD-12는 비키랄 페녹시 옥신(예를 들어, 2,4-D, MCPA, 4-클로로페녹시아세트산) 외에 피리딜옥시아세테이트 옥신(예를 들어, 트리클로피르, 플루오록시피르)를 분해할 수 있다는 것이다. 표 1을 참조한다. 본 발명의 AAD-12 효소에 의해 촉매작용된 화학 반응의 일반적인 도시를 도 1에 도시한다. (O.sub.2의 추가는 입체특이적이고; 페놀과 글리옥실레이트의 중간체의 분해는 자발적이다.) 도 1의 화학 구조가 분자 주쇄를 도시하며 다양한 R기 등(예컨대 표 1에 도시한 것)이 포함되지만 반드시 도 1에 구체적으로 도시된 것은 아니라는 것을 이해해야 한다. 상이한 페녹시 옥신 조합의 다수의 혼합물이 다양한 지역에서의 특정 잡초 스펙트럼 및 환경적 조건을 다루기 위하여 세계적으로 사용되었다. 식물에서의 AAD-12 유전자의 사용은 옥신 제초제의 보다 넓은 스펙트럼에 대한 보호를 제공하여, 이로 인해 방제될 수 있는 잡초의 유연성 및 스펙트럼이 증가된다.

식물 내에서의 발현을 위해 유전자 조작될 때, 선천적 내성이 전혀 존재하지 않거나 또는 페녹시 옥신 제초제의 사용이 허용되기에 충분히 높지 않은 식물에서 페녹시 옥신 제초제의 사용이 가능하도록 하는 성질을 갖는 단일 유전자(AAD-12)가 현재 확인되었다. 또한, AAD-12는 선별을 가능하게 하기에 천연의 내성이 또한 충분하지 않은 식물에서의 피리딜옥시아세테이트 제초제에 대한 보호를 제공할 수 있고, 이는 이러한 제초제의 잠재적인 유용성을 확장한다. AAD-12를 단독으로 함유하는 식물은 후속적으로 처리될 수 있거나, 또는 몇몇 페녹시 옥신 제초제 중 1 개, 2 개, 또는 이들의 조합과 탱크 혼합될 수 있다. 각 페녹시 옥신 제초제에 대한 비율은 쌍떡잎 잡초의 넓은 스펙트럼을 방제하기 위해 25 내지 4000 g ae/ha, 및 더 통상적으로는 100 내지 2000 g ae/ha의 범위일 수 있다. 마찬가지로, 상기 제초제로부터의 손상의 위험을 감소시키면서 몇몇 피리딜옥시아세테이트 옥신 화합물 중 1 개, 2 개, 또는 이들의 혼합물을 AAD-12를 발현하는 식물에 시용할 수 있다. 각 피리딜옥시아세테이트 제초제에 대한 비율은 추가의 쌍떡잎 잡초의 방제를 위하여 25 내지 2000 g ae/ha, 및 보다 통상적으로는 35-840 g ae/ha의 범위일 수 있다.

글리포세이트는 매우 넓은 스펙트럼의 활엽 및 잔디 잡초 종을 방제하기 때문에 폭넓게 사용된다. 그러나, GTC 및 비작물 시용에서의 글리포세이트의 반복적 사용은 자연적으로 더 내성인 종 또는 글리포세이트-저항성 생물형으로의 잡초 시프트를 위한 선별을 계속해왔으며 계속될 것이다. 동일한 종의 방제를 제공하지만 상이한 작용 모드를 갖는 효과적인 비율로 사용된 탱크혼합 제초제 파트너는 저항성 잡초의 출현을 지연하기 위한 방법으로서 가장 제초제 저항적인 관리 방법으로 처방된다. AAD-12를 글리포세이트 내성 형질로(및/또는 다른 제초제-내성 형질로) 스택킹(stacking)하는 것은 동일한 작물에서 선택적으로 글리포세이트, 페녹시 옥신(들)(예를 들어 2,4-D) 및 피리딜옥시아세테이트 옥신 제초제(예를 들어, 트리클로피르)의 사용을 가능하게 함으로써 GTC 내의 글리포세이트 저항성 쌍떡잎 잡초 종의 방제를 고려한 메커니즘을 제공할 수 있다. 이러한 제초제의 시용은 상이한 작용 모드의 2 개 이상의 제초제를 포함하는 탱크 혼합물에서 동시적으로; 식재전, 발아전, 또는 발아후의 순차적인 시용 및 약 2 시간 내지 약 3 개월 범위의 시용의 스플릿 시기로 단일 제초제 조성물의 개별적 시용일 수 있고; 또는 대안으로서 각각의 화학약품 종류를 나타내는 임의의 수의 제초제들의 임의의 조합을 작물을 식재할 때부터 작물을 수확하기까지 약 7 개월 내의 임의의 시기(또는 각각의 제초제에 대한 수확전 간격 중 어느 것이든 가장 짧은 것)에 시용할 수 있다.

시용의 시기, 각각의 제초제의 비율, 및 까다로운 또는 저항성인 잡초를 방제하는 능력에 있어서 잔디 및 활엽 잡초의 넓은 스펙트럼을 방제하는 것에 유연성을 갖는 것이 중요하다. 글리포세이트 저항성 유전자/AAD-12 스택을 사용한 작물 내 글리포세이트의 시용은 약 250-2500 g ae/ha의 범위일 수 있고; 페녹시 옥신 제초제(들)(하나 이상)는 약 25-4000 g ae/ha로 시용될 수 있고; 피리딜옥시아세테이트 옥신 제초제(들)(하나 이상)는 25-2000 g ae/ha로 시용될 수 있다. 이러한 시용(들)의 최적의 조합(들) 및 시기는 특정 상황, 종, 및 환경에 의존할 것이며 본 개시의 이익을 갖는 잡초 방제의 통상의 기술자에 의해 가장 잘 결정될 것이다.

묘목은 통상적으로 전체 성장 사이클에 걸쳐 저항성이다. 형질전환된 식물은 통상적으로는 유전자가 발현되는 임의의 시기에 새로운 제초제 시용에 대해 저항성일 것이다. 여기에서 내성은 이제까지 시험된 구성 프로모터(constitutive promoter)를 사용하여 수명 사이클에 걸친 2,4-D로 나타난다(일차적으로는 CsVMV 및 AtUbi 10). 통상적으로 이를 예상할 수 있지만, 예를 들어 내성이 저항의 작용 메커니즘의 부위의 감소된 발현에 의해 현저하게 영향을 받을 수 있는 다른 비-대사 작용에 비해서는 개선된 것이다. 일 예는 라운드업 레디 목화이며, 여기서 식물은 조기에 분무되는 경우 내성이었지만, 너무 늦게 분무된 경우 글리포세이트는 분열조직 내에 집중되며(이는 대사되지 않고 전위되기 때문임); 사용된 바이러스성 프로모터 몬산토는 꽃에서 잘 발현되지 않는다. 본 발명은 이와 관련하여 개선을 제공한다.

제초제 제형(예를 들어, 에스테르, 산, 또는 염 제형; 또는 가용성 농축물, 유화성 농축물, 또는 가용성 액체), 및 탱크혼합 첨가제(예를 들어, 아쥬반트, 계면활성제, 드리프트 지연제, 또는 혼화제)는 소정의 제초제 또는 하나 이상의 제초제의 조합으로부터의 잡초 방제에 현저하게 영향을 줄 수 있다. 이들과 상술한 제초제 화학물질 중 임의의 것과의 임의의 조합은 본 발명의 범위 내에 있다.

통상의 기술자는 또한 방제되는 잡초의 스펙트럼을 증가시키기 위해 및/또는 천연적으로 더 내성인 또는 저항성인 잡초 종의 방제를 위해 2 개 이상의 작용 모드를 결합하는 이점을 알 것이다. 이는 또한 제초제 내성이 GTC 외에 인간의 개입(트랜스제닉하게 또는 비트랜스제닉하게)을 통해 작물에서 가능해진 화학물질까지 확장될 수 있다. 실제로, 글리포세이트 저항성(예를 들면, 저항성 식물 또는 박테리아 EPSPS, 글리포세이트 옥시도리덕타제(GOX), GAT), 글루포시네이트 저항성(예를 들면, Pat, bar), 아세토락테이트 신타제(ALS)-억제 제초제 저항성(예를 들면, 이미다졸리논, 술포닐우레아, 트리아졸로피리미딘 술폰아닐리드, 피르미디닐티오벤조에이트, 및 다른 화학물질=AHAS, Csr1, SurA 등), 브롬옥시닐 저항성(예를 들면, Bxn), HPPD(4-히드록시페닐-피루베이트-디옥시게나제) 효소의 저해제에 대한 저항성, 피토엔 디새튜라제(PDS)의 저해제에 대한 저항성, 광계 II 저해 제초제(예를 들면, psbA)에 대한 저항성, 광계 I 저해 제초제에 대한 저항성, 프로토포르피리노겐 옥시다제 IX(PPO)-저해 제초제(예를 들어 PPO-1)에 대한 저항성, 페닐우레아 제초제(예를 들어, CYP76B1)에 대한 저항성, 디캄바-분해 효소(예를 들면 US 20030135879 참조), 및 다른 것을 코딩하는 형질이 단독으로 또는 다수의 조합으로 스택킹되어 잡초 시프트를 효과적으로 방제 또는 방지하는 능력 및/또는 상술한 종류의 임의의 제초제에 대한 저항성을 제공할 수 있다. 생체 내에서 변형된 EPSPS는 일부 바람직한 실시양태에서뿐만 아니라, 클래스 I, 클래스 II, 및 클래스 III 글리포세이트 저항성 유전자에서 사용될 수 있다.

추가의 제초제에 관해서, 일부 추가의 바람직한 ALS 저해제는 술포닐우레아(예컨대 클로르술푸론, 할로술푸론, 니코술푸론, 술포메투론, 술포술푸론, 트리플록시술푸론), 이미다졸로니논(예컨대, 이마자목스, 이마제타피르, 이마자퀸), 트리아졸로피리미딘 술폰아닐리드(예컨대 클로란술람-메틸, 디클로술람, 플로라술람, 플루메트술람, 메토술람, 및 페녹스술람), 피리미디닐티오벤조에이트(예컨대, 비스피리박 및 피리티오박), 및 플루카르바존을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 바람직한 HPPD 저해제는 메소트리온, 이속사플루톨, 및 술코트리온을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 바람직한 PPO 저해제는 플루미클로락, 플루미옥사진, 플루펜피르, 피라플루펜, 플루티아세트, 부타페나실, 카르펜트라존, 술펜트라존, 및 디페닐에테르(예컨대 아시플루오르펜, 포메사펜, 락토펜, 및 옥시플루오르펜)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

추가로, 단독의 또는 하나 이상의 추가의 HTC 형질과 스택킹된 AAD-12는 하나 이상의 추가 투입(예를 들어, 곤충 저항성, 진균 저항성, 또는 스트레스 내성 등), 또는 산출(예를 들면 증가된 수확량, 개선된 오일 프로파일, 개선된 섬유 품질 등) 형질과 스택킹될 수 있다. 따라서, 본 발명은 임의의 수의 작물학적 해충을 유연하게 그리고 비용 효과적으로 방제하는 능력으로 개선된 작물 품질의 완전한 작물학적 패키지를 제공하는 데 사용될 수 있다.

본 발명은 2,4-D를 분해하는 것이 가능할 뿐만 아니라 놀랍게도 본 발명의 효소를 예를 들면 이미 알려진 tfdA 단백질과 구별하는 신규한 특징을 가지는 효소의 확인에 일부 관련된다. 이러한 효소가 tfdA에 대해 매우 낮은 상동성을 갖지만, 본 발명의 유전자는 여전히 α-케토글루타레이트-의존 디옥시게나제의 동일한 전체 종류로 일반적으로 분류될 수 있다. 이러한 단백질의 종류는 활성 부위를 포함하는 "HX(D/E)X23-26(T/S)X114-183HX10-13R" 모티프 내의 3 개의 보존된 히스티딘 잔기를 특징으로 한다. 히스티딘은 촉매 활성에 필수적인 활성 부위에 Fe+2 이온을 배위한다(문헌[Hogan et al., 2000]). 본원에서 논의된 예비 시험관 내 발현 실험은 신규한 속성을 선별하는 것을 돕기 위해 맞춤화되었다. 이러한 실험은 또한 AAD-12 효소가 앞서 출원된 특허 출원(2005년 5월 2일자로 출원된 PCT US/2005/014737)에 개시된 동일한 클래스의 다른 이종 효소에 비해 독특하다는 것을 나타낸다. 이 출원의 AAD-1 효소는 본 발명의 AAD-12 단백질과는 오직 약 25 %의 서열 동일성만이 공통된다.

보다 구체적으로, 본 발명은 2,4-D뿐만 아니라, 피리딜옥시아세테이트 제초제도 분해할 수 있는 효소의 사용에 부분적으로 관련된다. 상이한 화학약품 종류 및 작용 모드의 제초제를 분해하는 능력을 갖는 α-케토글루타레이트-의존 디옥시게나제 효소는 앞서 보고되지 않았다. 본 발명에 따른 사용을 위한 바람직한 효소 및 유전자는 본원에서 AAD-12(아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제) 유전자 및 단백질로 칭한다.

본 발명의 단백질은 분석적 검정법에서 2,4-디클로로페놀("DCP"; 제초적으로 불활성)로의 2,4-D 전환에 대해 양성으로 시험되었다. 본 발명의 부분적으로 정제된 단백질은 시험관 내에서 2,4-D에서 DCP로 급속히 전환될 수 있다. AAD-12 형질전환된 식물이 제공하는 추가의 이점은 부모 제초제(들)이 불활성 형태로 대사되어, 곡물 또는 여물 내의 제초제 잔여물이 수확되는 잠재성을 감소시킨다는 것이다.

본 발명은 또한 잡초 방제 방법을 포함하며, 상기 방법은 AAD-12 유전자를 포함하는 식물에 피리딜옥시아세테이트 및/또는 페녹시 옥신 제초제를 시용하는 것을 포함한다.

이러한 발견에 비추어, 이러한 유형의 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 신규한 식물이 이제 제공된다. 지금까지는 이러한 식물을 생산하기 위한 동기가 없었고, 식물을 페녹시산 제초제(예컨대 2,4-D)뿐만 아니라 피리딜옥시아세테이트 제초제에 대해 저항성이도록 하는 이 효소를 이러한 식물이 효과적으로 생산할 수 있다는 기대가 없었다. 따라서, 본 발명은 지금까지 본 기술분야에서 가능할 것으로 생각하지 못했던 많은 이점을 제공한다.

공적으로 이용가능한 균주(strain)(ATCC 또는 DSMZ와 같은 배양물 수집에 기탁됨)는 신규한 유전자에 대하여 본원에 개시된 기술을 사용하여 획득되며 스크리닝될 수 있다. 본원에 개시된 서열은 본 발명에 따라 더 스크리닝하고 시험하기 위한 재조합 발현 시스템으로 상동성 유전자를 증폭시키고 클로닝하는 데 사용될 수 있다.

배경기술 부분에서 상기 논의한 바와 같이, 2,4-D를 분해하는 능력에 대해 광범위하게 연구된 하나의 생물은 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)(문헌[Streber et al., 1987])이다. 분해 경로에서 제1 효소를 코딩하는 유전자는 tfdA이다. 미국 특허 번호 6,153,401 및 진뱅크 수탁번호 M16730를 참조한다. tfdA는 α-케토글루타레이트-의존 디옥시게나제 반응(문헌[Smejkal et al., 2001])을 통해 2,4-D 산을 제초적 비활성 DCP로 전환하는 것에 촉매작용한다. tfdA는 2,4-D에 보통으로 민감성인 쌍떡잎 식물(예를 들면, 목화 및 담배)에 2,4-D 저항성을 부여하기 위하여 트랜스제닉 식물에서 사용되었다(문헌[Streber et al., 1989; Lyon et al., 1989; Lyon et al., 1993]). 2,4-D를 분해할 수 있는 단백질을 코딩하는 다수의 tfdA-형 유전자는 환경으로부터 식별되었고 진뱅크 데이터베이스에 기탁되었다. 많은 동족체는 tfdA와 거의 유사하고(85 % 초과의 아미노산 동일성), tfdA와 유사한 효소 특성을 갖는다. 그러나, α-케토글루타레이트-의존 디옥시게나제 동족체의 작은 콜렉션은 tfdA에 대해 낮은 수준의 상동성을 갖는 것으로 현재 확인되었다.

본 발명은 tfdA에 대해 낮은 상동성(31 % 아미노산 동일성)을 갖는, 델프티아 아시디보란스(문헌[Westendorf et al., 2002, 2003])로부터 먼 친척인 효소, sdpA의 신규한 용도 및 기능의 놀라운 발견에 부분적으로 관련된다. 그의 천연의 형태로 정제된 이러한 α-케토글루타레이트-의존 디옥시게나제 효소는 앞서 2,4-D 및 S-디클로르프로프를 분해하는 것으로 나타났다(문헌[Westendorf et al., 2002 및 2003]). 그러나, 피리딜옥시아세테이트 화학약품 종류의 제초제를 분해하는 능력을 갖는 α-케토글루타레이트-의존 디옥시게나제 효소는 이전에 보고되지 않았다. sdpA는 식물에서 발현된 적이 없고, 또는 어느 정도는 GTC의 효율, 저비용 및 편의성으로 인하여 신규한 HTC 기술의 발전이 부분적으로 제한되었기 때문에 그러하기 위한 어떤 동기도 없었다(문헌[Devine, 2005]).

신규한 활성의 관점에서, 본 발명의 단백질 및 유전자는 본원에서 AAD-12 단백질 및 유전자로 칭한다. AAD-12는 시험관 내에서 다양한 페녹시아세테이트 옥신 제초제를 분해하는 것으로 현재 확인되었다. 그러나, 본원에서 처음으로 보고한 바와 같이 이 효소는 놀랍게도 아릴옥시알카노에이트 분자 종류의 추가적인 기질을 분해할 수도 있는 것으로 발견되었다. 상당히 작물학적으로 중요한 기질은 피리딜옥시아세테이트 옥신 제초제를 포함한다. 이 고도로 신규한 발견은 상당히 제초제 내성인 작물(HTC) 및 선별가능한 마커 형질 기회를 기초로 한다. 이 효소는 넓은 스펙트럼의 활엽 제초제(페녹시아세테이트 및 피리딜옥시아세테이트 옥신)의 범위에 제초제 분해성 활성을 전달하는 그의 능력의 면에서 유일하다.

따라서, 본 발명은 재조합으로 발현된 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제 효소(AAD-12)에 의한 2,4-디클로로페녹시아세트산, 다른 페녹시아세트산 옥신 제초제, 및 피리딜옥시아세테이트 제초제의 분해에 부분적으로 관련된다. 본 발명은 또한 페녹시 및/또는 피리딜옥시 옥신 제초제를 분해할 수 있는 효소(AAD-12)를 분해하는 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제를 코딩하는 유전자의 확인 및 사용에 부분적으로 관련된다.

본 발명의 효소는 트랜스제닉 발현을 가능하게 하고 이는 거의 모든 활엽 잡초를 방제할 수 있는 제초제들의 조합에 대한 내성을 가져온다. AAD-12는 예를 들어 다른 HTC 형질[예를 들면 글리포세이트 저항성, 글루포시네이트 저항성, ALS-저해제(예를 들면, 이미다졸리논, 술포닐우레아, 트리아졸로피리미딘 술폰아닐리드) 저항성, 브롬옥시닐 저항성, HPPD-저해제 저항성, PPO-저해제 저항성 등] 및 곤충 저항성 형질(Cry1F, Cry1Ab, Cry 34/45, 다른 Bt. 단백질, 또는 비-바실리스 기원의 살충 단백질 등)과 스택킹하기 위한 뛰어난 제초제 내성 작물(HTC) 형질로서 기능할 수 있다. 또한, AAD-12는 제2 유전자 또는 유전자들의 그룹으로 유전자조작된 식물의 일차 형질전환체의 선별을 돕기 위한 선별가능한 마커로서 기능할 수 있다.

또한, 본 발명의 미생물 유전자는 단백질이 외떡잎 및 쌍떡잎 식물 사용 모두(헤미코트(hemicot)) 쪽으로의 바이어스(bias)를 갖는 코돈에 의해 코딩되도록 재설계되었다. 아라비돕시스, 옥수수, 담배, 목화, 대두, 카놀라, 및 벼는 AAD-12-함유 구축물로 형질전환되었고, 페녹시 및 피리딜옥시 옥신 제초제 모두에 대하여 높은 수준의 저항성을 나타냈다. 따라서 본 발명은 또한 본 발명의 단백질을 코딩하는 "식물 최적화된" 유전자에 관한 것이다.

옥시알카노에이트기는 안정한 산 관능기를 제초제 내로 도입하는 데 유용하다. 산기는 제초제 작용에 바람직한 속성인, "산 트랩핑"에 의해 체관부 이동성을 부여할 수 있고, 따라서 이동성 목적을 위하여 새로운 제초제 내에 포함될 수 있다. 본 발명의 측면은 또한 HTC를 생성하는 메커니즘을 제공한다. AAD-12에 대한 기질로서 기능할 수 있는 많은 잠재적인 상용 및 실험용 제초제들이 존재한다. 따라서, 본 발명의 유전자의 사용은 또한 다른 제초제에도 마찬가지로 제초제 내성을 가지게 할 수 있다.

본 발명의 HTC 형질은 다른 HTC 형질(글리포세이트 내성을 포함하나 이에 제한되지 않음)과 신규한 조합으로 사용될 수 있다. 형질들의 이러한 조합은 제초제(예를 들면 글리포세이트)에 대해 신규하게 획득한 저항성 또는 선척전 내성 때문에, 잡초(등) 종의 신규한 방제 방법을 만든다. 따라서, HTC 형질 외에, 트랜스제닉 작물에서 상기 효소에 의해 제초제 내성이 생기는, 제초제를 사용한 신규한 잡초 방제 방법이 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명은 예를 들면 대두에서 현재 글리포세이트 저항성 형질로 스택킹된 2,4-D 저항성 형질을 상용화하는 면에서 시용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 다양한 작물에 있어서 잡초 방제를 위한 글리포세이트에 대한 재배자의 극도로 높은 의존으로부터 생긴, 활엽 잡초 종 시프트를 방지하기 위한 도구 및/또는 제초제 저항성 활엽 잡초의 선별을 제공한다.

본 발명의 AAD-12 유전자의 트랜스제닉 발현은 예를 들면 아라비돕시스, 담배, 대두, 목화, 벼, 옥수수 및 카놀라로 예시된다. 대두는 본 발명에 따른 형질전환을 위해 바람직한 작물이다. 그러나, 본 발명은 다수의 다른 외떡잎(예컨대 목초 또는 터프 잔디) 및 쌍떡잎 작물, 예컨대 알팔파, 클로버, 나무 종 등에서 이용될 수 있다. 마찬가지로, 2,4-D(또는 다른 AAD-12-기질)는 내성이 보통인 잔디 작물에서 더 긍정적으로 이용될 수 있고, 이러한 형질을 통해 증가된 내성은 재배자들에게 작물 손상에 대한 위험 없이 보다 효과적인 비율로 그리고 더 넓은 시용 시기에 걸쳐 이러한 제초제를 사용하는 기회를 제공할 것이다.

더 추가로, 본 발명은 활엽 잡초를 방제하는 제초제에 대한 저항성을 제공할 수 있는 단일 유전자를 제공한다. 이러한 유전자는 넓은 스펙트럼의 제초제 조합의 사용을 가능하게 하도록 다수의 작물에서 이용될 수 있다. 본 발명은 또한 현재 작물학적 실시에서 생긴 잡초 스펙트럼의 시프트를 제어하기 위한 현재 화학약품 및 조제에 대한 잡초 저항성을 제어할 수 있다. 본 발명의 AAD-12는 또한 추가의 제초제 기질을 비제초제 형태로 효과적으로 해독하기 위한 노력으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가의 HTC 형질 및/또는 선별가능한 마커 기술의 발달을 제공한다.

HTC를 생산하기 위하여 본 발명의 유전자를 사용하는 것과 별개로, 또는 그에 덧붙여, 본 발명의 유전자는 또한 세포 배양, 온실, 및 재배지에서 형질전환체를 성공적으로 선별하기 위한 선별가능한 마커로서 사용될 수 있다. 단순히 생명공학 프로젝트를 위한 선별가능한 마커로서, 본 발명의 유전자에는 높은 유전적 가치가 있다. 다른 아릴옥시알카노에이트 옥신 제초제에 대한 AAD-12의 혼합(promiscuity)은 이러한 유전자를 HTC 및/또는 선별가능한 마커 목적으로 이용하는 많은 기회를 제공한다.

용어 "저항성"을 쉽게 논의할 수 없고, 동사 "내성이 있다" 또는 형용사 "내성인"을 사용할 수 없다. 산업은 제초제 내성 작물(HTC) 대 제초제 저항성 작물(HRC)를 토의하면서 무수한 시간들을 보냈다. HTC는 산업에서 바람직한 용어이다. 그러나, 공식적인 미국 잡초 학회의 저항성의 정의는 "야생형에 보통 치명적인 제초제의 양에 노출된 후에 생존하고 번식할 수 있는 식물의 선천적 능력. 식물에서, 저항성은 자연적으로 발생하거나 유전 공학과 같은 기술, 또는 조직 배양 또는 돌연변이유발에 의해 생성된 변이체의 선별에 의해 유도될 수 있음"이다. 달리 언급하지 않는 한, 본원에서 사용된 제초제 "저항성"은, 본 개시의 출원시의 제초제 핸드북의 현재 판에 의해 논의되는 바와 같이, 유전성이며, 소정의 식물에 제초제로 통상적인 제초 효과적 처리를 했을 때 식물이 성장하고 번식하게 한다. 통상의 기술자가 인지하는 바와 같이, 제초제 노출로부터 식물 손상이 어느 정도 분명하더라도 식물은 여전히 "저항성"으로 생각될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "내성"은 용어 "저항성"보다 더 넓고, 본원에서 정의된 "저항성"뿐만 아니라 통상적으로 동일한 제초제 양에서 동일한 유전자형의 야생형 식물을 생성하는 제초제로 유도된 손상의 다양한 정도를 견디기 위한 특정 식물의 향상된 능력을 포함한다.

식물 또는 박테리아 시스템으로의 기능적 활성의 전달은 본 발명의 단백질에 대한 아미노산 서열을 코딩하고, 벡터가 존재하는 숙주에 적절한 단백질 발현 벡터 내로 통합된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 기능적 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 하나의 방법은 본원에 개시된 바와 같이, 단백질의 아미노산 서열에서 추론된 정보를 사용하여 관심 단백질을 생산하는 박테리아 종으로부터 선척적 유전 물질을 분리하는 것이다. 선천적 서열은 예를 들면 이하에서 더 상세하게 논의되는 바와 같이 식물에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 최적화된 폴리뉴클레오티드는 또한 단백질 서열에 기초하여 설계될 수 있다.

본 발명에 따른 사용을 위한 단백질을 얻은 많은 방법들이 있다. 예를 들면, 본원에 개시된 단백질에 대한 항체는 다른 단백질을 단백질들의 혼합물으로부터 식별하고 분리하는 데 사용될 수 있다. 구체적으로 항체는 다른 관련 단백질과 비교하여 가장 보존되거나 또는 가장 구별되는 단백질의 일부에 대해 증가할 수 있다. 따라서 이 항체는 면역침강법, 효소결합면역흡착검사(ELISA), 또는 면역-블롯팅에 의해 특징적 활성을 갖는 동등 단백질을 구체적으로 식별하는 데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 단백질에 대한, 또는 동등 단백질에 대한, 또는 이러한 단백질의 단편에 대한 항체는 표준 과정을 사용하여 쉽게 제조될 수 있다. 이러한 항체는 본 발명의 한 측면이다. 본 발명의 항체는 바람직하게는 예시적인 또는 제시된 단백질에 반응하여 생산된 단일클론 및 다중클론 항체를 포함한다.

통상의 기술자는 본 발명의 단백질(및 유전자)이 다양한 기원으로부터 얻을 수 있다는 것을 쉽게 인지할 것이다. 전체 제초제 분해 오페론이 전이성 요소, 예컨대 플라스미드 상에 코딩될 뿐만 아니라 유전적으로 통합된(genomically integrated) 것으로 알려져 있기 때문에, 본 발명의 단백질은 예를 들면 재조합 및/또는 야생형 박테리아를 포함하는 다양한 미생물로부터 얻을 수 있다.

박테리아 분리주의 돌연변이는 본 기술분야에서 잘 알려진 과정에 의해 만들어질 수 있다. 예를 들어, 무포자 돌연변이는 분리주의 에틸메탄 술포네이트(EMS) 돌연변이유발을 통해 얻을 수 있다. 돌연변이 균주는 또한 본 기술분야에서 잘 알려진 과정에 의해 자외선 광 및 니트로소구아니딘을 사용하여 만들어질 수 있다.

본원에서 칭하거나 또는 제시한 본 발명의 분리주 중 임의의 것"으로부터의" 또는 "으로부터 얻을 수 있는" 단백질은 분리주 또는 일부 다른 기원, 예컨대 다른 박테리아 균주 또는 식물로부터 단백질(또는 유사 단백질)을 얻을 수 있음을 의미한다. "으로부터 유래된"은 또한 이를 내포하며, 예를 들면 식물에서의 발현을 위해 변형된 소정의 유형의 박테리아로부터 얻을 수 있는 단백질을 포함한다. 통상의 기술자는 박테리아 유전자 및 단백질의 개시를 고려하면, 식물이 단백질을 생산하기 위하여 유전자조작될 수 있다는 것을 쉽게 인지할 것이다. 항체 제조, 핵산 프로브(예를 들어, DNA, RNA, 또는 PNA) 등은 본원에 개시되고 스크리닝을 위해 사용된 폴리뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열을 사용하여 제조될 수 있고, 다른 (천연) 기원으로부터 다른 관련 유전자를 회수할 수 있다.

표준 분자 생물학 기술은 본원에 설명된 단백질 및 유전자를 클로닝하고 서열화하는 데 사용할 수 있다. 추가의 정보는 문헌[Sambrook et al., 1989]에서 찾을 수 있고, 이는 인용에 의해 본원에 포함된다.

폴리뉴클레오티드 및 프로브: 본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용을 위한 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 본 발명은 또한 원하는 제초제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 식별하고 특징화하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명은 PCR 기술을 위한 하이브리드화 프로브 및/또는 프라이머로서 유용한 고유한 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 프라이머는 특정 관심 유전자의 식별, 특징화, 및/또는 분리에 사용될 수 있는 특성 유전자 단편을 생산한다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 앞서 설명한 단백질과는 구별되는 단백질을 코딩한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 원하는 숙주 세포 내의 단백질 또는 펩티드를 코딩하기 위하여 완전한 "유전자"를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 통상의 기술자가 쉽게 인지할 수 있듯이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 기술분야에서 쉽게 알려진 바와 같이, 관심 숙주 내의 프로모터를 제어하여 적절하게 위치할 수 있다. 유전자 발현 및 일시적/조직 특이적 발현의 수준은 본 발명의 유용성에 크게 영향을 줄 수 있다. 일반적으로, 분해성 유전자의 단백질 발현의 더 높은 수준은 기질(이 경우에는 표적 제초제)의 더 빠르고 더 완전한 분해를 가져올 것이다. 프로모터는 높은 발현이 식물의 건강상에 결과적으로 부정적인 영향을 주지 않는 한 높은 수준으로 표적 유전자를 발현하는 데 바람직할 것이다. 통상적으로, AAD-12 유전자가 모든 성장-단계에서 식물의 완전한 보호를 위하여 모든 조직에서 구성적으로 발현되는 것을 바랄 것이다. 그러나 대안적으로, 생장하여 발현된 저항성 유전자를 사용할 수 있으며; 이는 잡초 방제를 위한 작물 내 표적 제초제의 사용을 가능하게 할 수 있고, 후속적으로는 개화 단계 동안 시용함으로써 표적 작물의 유성 생식을 제어할 수 있다. 추가로, 원하는 발현의 수준 및 시간은 또한 원하는 식물의 유형 및 내성의 수준에 의존할 수 있다. 일부 바람직한 실시양태는 발현 수준을 증가시키고 원하는 수준으로 내성을 증강시키기 위하여 전사 인핸서 등과 조합된 강한 구성 프로모터를 사용한다. 일부 이러한 시용은 하기에서, 실시예 부분 전에 더 상세하게 논의한다.

통상의 기술자는, DNA가 통상적으로 이중 가닥 형태로 존재한다는 것을 알고 있다. 이러한 배열에서, 하나의 가닥은 다른 가닥과 상보적이고, 그 반대로도 그렇다. DNA가 식물(예를 들어)에서 복제되면, 추가의 상보적인 DNA 가닥이 생산된다. "코딩 가닥"은 흔히 본 기술분야에서 안티-센스 가닥과 결합하는 가닥을 칭하도록 사용된다. mRNA는 DNA의 "안티-센스" 가닥으로부터 전사된다. "센스" 또는 "코딩" 가닥은 관심 단백질 또는 펩티드를 형성하기 위하여 오픈 리딩 프레임(ORF)으로서 해독될 수 있는 일련의 코돈(코돈은 특정 아미노산을 명시하기 위하여 3-잔기 유닛으로서 해독될 수 있는 3 개의 뉴클레오티드임)을 갖는다. 체내에서 단백질을 생산하기 위하여, DNA 가닥은 통상적으로는 단백질을 위한 템플릿으로서 사용되는 상보적인 mRNA 가닥으로 전사된다. 따라서, 본 발명은 첨부한 서열목록에 나타난 예시적인 폴리뉴클레오티드 및/또는 상보적인 가닥을 포함하는 동등물의 사용을 포함한다. 예시적인 DNA 분자와 기능적으로 동등한 RNA 및 PNA(펩티드 핵산)는 본 발명에 포함된다.

본 발명에 따른 사용을 위한 단백질 및 유전자는 예를 들어 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써 식별되고 얻어질 수 있다. 이러한 프로브는 적절한 라벨에 의해 검출할 수 있거나, 또는 국제 출원 번호 WO 93/16094에서 설명된 선천적으로 형광으로 만들어질 수 있는 검출가능한 뉴클레오티드 서열이다. 프로브(및 본 발명의 폴리뉴클레오티드)는 DNA, RNA, 또는 PNA일 수 있다. 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 및 우라실(U; RNA 분자에 대해) 외에, 본 발명의 합성 프로브(및 폴리뉴클레오티드)는 또한 이노신(모든 4 개 염기와 페어링이 가능한 중성 염기; ?로는 합성 프로브에서 모든 4 개 염기의 혼합물 대신에 사용됨) 및/또는 다른 합성(비천연) 염기를 가질 수 있다. 따라서, 합성 축중(degenerate) 올리고뉴클레오티드가 본원에서 언급되고 "N" 또는 "n"이 총칭하여 사용되는 경우, "N" 또는 "n"은 G, A, T, C, 또는 이노신일 수 있다. 본원에서 사용된 모호한 코드는 본 출원의 출원시의 표준 IUPAC 명명 규칙을 따른다(예를 들어, R은 A 또는 G를 의미하고, Y는 C 또는 T를 의미하는 등).

본 기술분야에서 알려진 바와 같이, 프로브 분자가 핵산 샘플과 하이브리드화되는 경우, 프로브와 샘플은 실질적으로 상동성/유사성/동일성을 갖는 것으로 타당하게 가정될 수 있다. 바람직하게는, 예를 들면 문헌[Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170]에 설명된 바와 같이 본 기술분야에서 잘 알려진 기술에 의해 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화가 먼저 수행되고 이어서, 낮은, 중간의, 또는 높은 가혹 조건 하에서 세척된다. 예를 들어, 이들에서 언급된 바와 같이, 낮은 가혹 조건은 2 x SSC(표준 살린 시트레이트)/0.1 % SDS(소듐 도데실 술페이트)로 15 분 동안 실온에서 우선 세척함으로써 달성될 수 있다. 2 회의 세척을 통상적으로 수행한다. 더 높은 가혹함은 이어서 염 농도를 낮춤으로써 ?/또는 온도를 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 상술한 세척 다음에 0.1 x SSC/0.1 % SDS로 15 분 동안 각각 실온에서 2 회 세척하고난 후, 이어서 0.1 x SSC/0.1 % SDS로 30 분 동안 각각 55 ℃에서 세척했다. 이 온도는 본원에서 제시되었으며 통상의 기술자에게 잘 알려진 바와 같은 다른 하이브리드화 및 세척 프로토콜과 함께 사용될 수 있다(예를 들면 SSC 대신 염으로서 SSPE가 사용될 수 있음). 2 x SSC/0.1 % SDS는 50 ml의 20 x SSC 및 5 ml의 10 % SDS를 445 ml의 물에 첨가함으로써 제조될 수 있다. 20 x SSC는 NaCl(175.3 g/0.150 M), 소듐 시트레이트(88.2 g/0.015 M), 및 물을 배합하고, 10 N NaOH으로 pH를 7.0으로 조정하고, 다음으로 부피를 1 리터로 조정함으로써 제조될 수 있다. 10 % SDS는 10 g의 SDS를 50 ml의 오토클레이빙된 물에 용해시킨 후 100 ml로 희석시킴으로써 제조될 수 있다.

프로브의 검출은 하이브리드화가 유지되었는지를 공지의 방식으로 결정하는 수단을 제공한다. 이러한 프로브 분석은 본 발명의 유전자를 식별하는 신속한 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 프로브로서 사용되는 뉴클레오티드 세그먼트는 DNA 합성기 및 표준 과정을 사용하여 합성될 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 또한 본 발명의 유전자를 증폭하기 위한 PCR 프라이머로서 사용될 수 있다.

분자의 하이브리드화 특징은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 정의하는 데 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 본원에서 예시된 폴리뉴클레오티드와 함께 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드(및/또는 이들의 보체, 바람직하게는 이들의 완전한 보체)를 포함한다. 즉, 유전자(및 유전자가 코딩하는 단백질)를 정의하는 한가지 방법은 예를 들면 공지된 또는 구체적으로 예시된 유전자와 하이브리드화(본원에서 구체적으로 개시된 조건 중 임의의 것에서)하는 이들의 능력에 의해서이다.

본원에서 사용된 하이브리드화를 위한 "가혹한" 조건은 현재 출원인이 사용한 것과 동일한 또는 대략 동일한 정도의 하이브리드화의 특이성을 달성하는 조건을 말한다. 구체적으로, 32P-라벨링된 유전자-특이적 프로브로 써던 블롯 상에 고정된 DNA의 하이브리드화는 표준 방법(예를 들면 문헌[Maniatis et al. 1982] 참조)에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로, 하이브리드화 및 후속의 세척은 표적 서열의 검출을 고려한 조건 하에서 수행될 수 있다. 이중-가닥 DNA 유전자 프로브에 있어서, 하이브리드화는 DNA 하이브리드의 융점(Tm) 아래 20-25 ℃로, 6 x SSPE, 5 x 덴하르트(Denhardt) 용액, 0.1 % SDS, 0.1 mg/ml 변성 DNA에서 밤새 수행될 수 있다.

세척은 통상적으로 다음과 같이 수행될 수 있다: (1) 1 x SSPE, 0.1 % SDS에서 15 분간 실온에서 2 회(낮은 가혹도의 세척); 및 (2) 0.2 x SSPE, 0.1 % SDS에서 15 분간 Tm-20 ℃에서 1 회(중간 가혹도의 세척).

올리고뉴클레오티드 프로브에 있어서, 하이브리드화는 하이브리드의 융점(Tm) 아래 10-20 ℃로, 6 x SSPE, 5 x 덴하르트 용액, 0.1 % SDS, 0.1 mg/ml 변성 DNA에서 밤새 수행될 수 있다.

세척은 통상적으로 다음과 같이 수행될 수 있다: (1) 1 x SSPE, 0.1 % SDS에서 15 분간 실온에서 2 회(낮은 가혹도의 세척); 및 (2) 1 x SSPE, 0.1 % SDS에서 15 분간 하이브리드화 온도에서 1 회(중간 가혹도의 세척).

일반적으로, 염 및/또는 온도는 가혹도를 변화시키기 위해 변경될 수 있다. 길이가 70 정도 염기 초과인 라벨링된 DNA 단편에 있어서, 다음의 조건을 사용할 수 있다: (1) 낮음: 1 또는 2 x SSPE, 실온; (2) 낮음: 1 또는 2 x SSPE, 42 ^oC.; (3) 중간: 0.2 x 또는 1 x SSPE, 65 ^oC. 또는 (4) 높음: 0.1 x SSPE, 65 ^oC.

듀플렉스 형성 및 안정성은 하이브리드의 2 개의 가닥들 간 실질적인 보체성에 의존하며 상기에서 언급한 바와 같이 어느 정도의 불일치는 용인될 수 있다. 따라서, 본 발명의 프로브 서열은 설명한 서열의 돌연변이(단일 및 다중 모두), 결실, 삽입 및 이들의 조합을 포함하며, 상기 돌연변이, 삽입 및 결실은 관심 표적 폴리뉴클레오티드와 안정한 하이브리드의 형성을 가능하게 한다. 돌연변이, 삽입, 및 결실은 다양한 방식으로 소정의 폴리뉴클레오티드 서열에서 생산될 수 있으며, 이 방법들은 통상의 기술자에게 알려져 있다. 다른 방법은 이후에 알려지게 될 수 있다.

PCR 기술: 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)은 핵산 서열의 반복적, 효소적, 프라이밍된 합성이다. 이 과정은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며 통상적으로 사용된다(물리스(Mullis)의 미국 특허 번호 4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159; 문헌[Saiki et al., 1985] 참조). PCR은 표적 서열의 반대 가닥으로 하이브리드화하는 2 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머가 측면에 배치된 관심 DNA 단편의 효소적 증폭에 기초한다. 프라이머는 바람직하게는 3' 말단들이 서로를 향하게 배향된다. 템플릿의 열 변성, 이들의 상보적 서열에 대한 프라이머의 어닐링, 및 DNA 폴리머라제로 어닐링된 프라이머의 연장의 반복적 사이클은 PCR 프라이머의 5' 말단에 의해 정의된 세그먼트의 증폭을 가져온다. 각 프라이머의 연장 생성물은 다른 프라이머에 대한 템플릿으로서 기능할 수 있고, 따라서 각 사이클은 본질적으로 이전 사이클에서 생산된 DNA 단편의 양을 두배로 만든다. 이는 몇 시간 안에 특이 표적 단편을 몇백만-배까지 기하급수적으로 축적시킨다. 호열성 박테리아 써머스 아쿠아티커스(Thermus aquaticus)로부터 분리된 열안정성 DNA 폴리머라제, 예컨대 태그(Tag) 폴리머라제를 사용함으로써, 증폭 과정은 완전히 자동화될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 효소는 통상의 기술자에게 알려져 있다.

예시적인 DNA 서열, 또는 이들의 단편은 PCR 증폭을 위한 프라이머로서 사용될 수 있다. PCR 증폭을 수행함에 있어서, 프라이머와 템플릿 간의 어느 정도의 불일치는 용인될 수 있다. 따라서, 예시적인 프라이머의 돌연변이, 결실, 및 삽입(특히 뉴클레오티드의 5' 말단으로의 첨가)는 본 발명의 범위에 포함된다. 돌연변이, 삽입 및 결실은 통상의 기술자에게 알려진 방법에 의해 소정의 프라이머에서 생산될 수 있다.

유전자 및 단백질의 변형: 본 발명의 유전자 및 단백질은 키메라 또는 융합 단백질을 생산하기 위하여 다른 유전자 및 단백질에 융합될 수 있다. 본 발명에 따른 유용한 유전자 및 단백질은 구체적으로 예시된 전장(full-length) 서열뿐만 아니라, 이 서열의 부분, 세그먼트, 및/또는 단편(전장 분자와 비교하여 인접 단편 및 내부 및/또는 말단 결실을 포함함), 이들의 변이체, 돌연변이, 키메라, 및 융합을 포함한다. 본 발명의 단백질은 원하는 기능성 활성을 보유하는 한 치환된 아미노산을 가질 수 있다. "변이체" 유전자는 예시된 단백질과 동등한 또는 유사한 활성을 갖는 동일 단백질 또는 동등 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

고유의 aad-12 뉴클레오티드 서열로 BLAST 연구한 최상의 2 개 결과는 서열의 120 개 초과의 염기쌍에서 타당한 수준의 상동성(약 85 %)을 나타낸다. 특정 조건 하의 하이브리드화는 이러한 2 개의 서열을 포함하는 것으로 예상될 수 있다. 진뱅크 수탁번호 DQ406818.1(89329742; 로도페락스(Rhodoferax)) 및 AJ6288601.1(44903451; 스핀고모나스(Sphingomonas))를 참조한다. 로도페락스는 델프티아(Delftia)와 매우 유사하지만 스핀고모나스는 계통발생적으로 완전히 다른 클래스이다.

용어 "변이체 단백질" 및 "동등 단백질"은 표적 기질에 대해 동일 또는 실질적으로 동일한 생물학적/기능적 활성을 갖는 단백질 및 예시된 단백질과 동등 서열을 말한다. 본원에서 사용된 "동등" 서열의 언급은 상당한 정도로 활성을 개선하거나 또는 활성에 악영향을 미치지 않는 아미노산 치환, 결실, 첨가, 또는 삽입을 갖는 서열을 말한다. 활성을 보유하는 단편이 또한 이러한 정의에 포함된다. 예시적인 단백질의 대응 단편과 동일 또는 유사한 기능 또는 활성을 보유하는 단편 및 다른 동등물은 본 발명의 범위 내에 있다. 변화, 예컨대 아미노산 치환 또는 첨가는 다양한 목적, 예컨대 단백질의 프로테아제 안정성의 증가(또는 감소)(단백질의 기능적 활성을 실질적으로/현저히 감소시키지 않으면서), 제한 부위의 제거 또는 첨가 등을 위해 이루어질 수 있다. 유전자의 변이는 예를 들면 점 돌연변이를 만드는 표준 기술을 사용하여 쉽게 구성될 수 있다.

또한, 예를 들어 미국 특허 번호 5,605,793는 무작위 또는 집중된 단편화 후에 DNA 재조립을 사용함으로써 추가의 분자 다양성을 발생시키는 방법을 설명한다. 이는 유전자 "셔플링"이라고 칭할 수 있으며, 이는 통상적으로 2 개 이상의 상이한 DNA 분자의 (원하는 크기의) 단편을 혼합하고, 이어서 복원의 라운드를 반복하는 것을 포함한다. 이는 출발 유전자에 의해 코딩된 단백질의 활성을 개선할 수 있다. 결과는 개선된 활성, 변경된 기질 특이성, 증가된 효소 안정성, 변경된 스테레오특이성, 또는 다른 특성을 갖는 키메라 단백질이다.

"셔플링"은 관심 단백질의 원자 3D(3 차원) 배위 및 결정 구조를 얻고 시험한 후 설계되고 표적화될 수 있다. 따라서, "집중된 셔플링"은 변형에 이상적인 단백질의 특정 세그먼트, 예컨대 표면이 노출된 세그먼트에 관한 것일 수 있으며, 바람직하게는 단백질 폴딩과 관련되고 3D 구조적 통합에 필수적인 내부 세그먼트에 관한 것은 아니다.

효소의 "활성 부위"에 대한 특이적 변화는 활성 또는 스테레오특이성에 대한 선천적 기능성에 영향을 주도록 이루어질 수 있다. 문헌[Muller et. al. (2006)]. 알려진 tauD 결정 구조는 그의 선천적 기질 타우린에 결합하는 동안 활성 부위 잔기를 결정하기 위해 모델 디옥시게나제로서 사용되었다. 문헌[Elkins et al. (2002) "X-ray crystal structure of Escerichia coli taurine/alpha-ketoglutarate dioxygenase complexed to ferrous iron and substrates," Biochemistry 41(16):5185-5192]. 효소 활성 부위의 서열 최적화 및 설계가능성(designability)과 관련하여 문헌[Chakrabarti et al., PNAS, (Aug. 23, 2005), 102(34):12035-12040] 참조.

전장 유전자의 단편은 표준 과정에 따른 시판되는 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제를 사용하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 효소, 예컨대 Bal31 또는 부위-지정 돌연변이유발이 이 유전자의 말단으로부터 뉴클레오티드를 체계적으로 절단하는 데 사용될 수 있다. 또한 활성 단편을 코딩하는 유전자는 다양한 제한효소를 사용하여 얻어질 수 있다. 프로테아제는 이 단백질의 활성 단편을 직접 얻기 위해 사용될 수 있다.

단백질이 절두되고(truncated) 여전히 기능적 활성을 보유할 수 있다는 것은 본원에 개시된 본 발명의 범위 내에 있다. "절두된 단백질"에 있어서, 이는 단백질의 일부가 분할될 수 있지만 분할 후 남은 절두된 단백질이 원하는 활성을 보유하고 나타내는 것을 의미한다. 분할은 다양한 프로테아제에 의해 달성될 수 있다. 또한, 효과적으로 분할된 단백질은, 제한 엔도뉴클레아제를 사용한 소화를 통해 상기 단백질을 코딩하는 DNA 염기가 제거되는 분자 생물 기술, 또는 통상의 기술자가 이용가능한 다른 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 절두 후에, 상기 단백질은 비상동 시스템, 예컨대 E. 콜라이, 바큘로바이러스, 식물계 바이러스 시스템, 효모 등에서 발현되고, 활성을 결정하기 위하여 본원에 개시된 곤충 분석법에 놓일 수 있다. 본 기술분야에서 절두된 단백질이 완전한 전장 서열보다 적게 가지면서 기능적 활성을 보유하도록 성공적으로 생산될 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 예를 들어, B.t. 단백질은 절두된(핵 단백질) 형태로 사용될 수 있다(예를 들어 문헌[Hofte et al. (1989), 및 Adang et al. (1985)] 참조). 본원에서 사용된 용어 "단백질"은 기능적으로 활성인 절두를 포함할 수 있다.

달리 명시하지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, 2 개의 핵산의 백분율 서열 동일성 및/또는 유사성은 문헌[Karlin and Altschul 1993]에서 변형된 바와 같은 문헌[Karlin and Altschul, 1990]의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul et al., 1990]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 포함된다. BLAST 뉴클레오티드 연구는 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 워드길이=12로 수행된다. 갭이 있는(gapped) BLAST는 문헌[Altschul et al., 1997]에 설명된 바와 같이 사용될 수 있다. BLAST 및 갭이 있는 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램(NBLAST 및 XBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용한다. NCBI/NIH 웹사이트 참조. 비교의 목적으로 갭이 있는 정렬을 얻기 위하여, 벡터 NTI 수이트 8(Vector NTI Suite 8)(미국 메릴랜드주 노스 베데스다 소재의 인포맥스, 인크.(InforMax, Inc.))의 AlignX 기능이, 디폴트 파라미터를 이용하여 사용된다. 이는 갭 개방 패널티가 15, 갭 연장 패널티가 6.66, 그리고 갭 분리 패널티 범위가 8이다.

단백질의 다양한 성질 및 3차원 특징은 또한 단백질의 활성/기능에 악영향을 주지 않고 변경될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 분자의 활성 및/또는 3차원 구조에 악영향을 주지 않도록 용인될/이루어질 수 있다. 아미노산은 다음의 클래스에 속할 수 있다: 비극성, 대전되지 않은 극성, 염기성, 및 산성. 하나의 클래스의 아미노산이 동일한 유형의 다른 아미노산으로 대체되는 보존적 치환은, 치환이 화합물의 생물학적 활성에 불리하지 않은 한 본 발명의 범위 내에 있다. 표 1은 각 클래스에 속하는 아미노산의 예의 목록을 제공한다. 일부 예에서, 비보존적 치환이 또한 이루어질 수 있다. 그러나, 바람직한 치환은 단백질의 기능적/생물학적 활성을 현저히 손상시키지 않는다.

본원에서 사용된 "분리된" 폴리뉴클레오티드 및/또는 "정제된" 단백질의 언급은 이들이 자연에서 함께 발견될 수 있는 다른 분자와 관련되지 않을 때의 이 분자를 말한다. 따라서, "분리된" 및/또는 "정제된"의 언급은 본원에서 설명된 "인간의 손"의 개입을 의미한다. 예를 들어, 발현을 위하여 식물 내에 투입된 본 발명의 박테리아 "유전자"는 "분리된 폴리뉴클레오티드"이다. 마찬가지로, 박테리아 단백질에서 유래되고 식물에 의해 생성된 단백질은 "분리된 단백질"이다.

유전자 코드의 축중/반복에 의해, 많은 상이한 DNA 서열이 본원에 개시된 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 동일 또는 본질적으로 동일한 단백질을 코딩하는 대안적인 DNA 서열을 생성하는 것은 통상의 기술자의 기술에 충분히 속한다. 이 변이체 DNA 서열은 본 발명의 범위 내에 있다. 이는 또한 "식물에서의 발현을 위한 서열의 최적화"라는 제목의 부분에서 하기에 더 상세하게 논의한다.

식물에서의 발현을 위한 서열의 최적화: 식물에서의 비상동성 유전자의 높은 발현을 얻기 위하여, 일반적으로는 유전자가 식물 세포(의 세포질)에서 보다 효율적으로 발현되도록 개량하는 것이 바람직하다. 메이즈는 식물에서의 그의 발현 수준을 증가시키기 위해 형질전환 전에 비상동성 유전자(들)을 재설계하는 것이 바람직할 수 있는 식물 중 하나이다. 따라서, 박테리아 단백질을 코딩하는 유전자의 설계에서의 추가 단계는 쌍떡잎 또는 외떡잎 종에 상관없이 표적 식물 서열로 보다 가까이 정렬된 코돈 바이어스를 사용하여, 최적의 발현을 위한 비상동성 유전자를 개량하는 것이다. 서열은 또한 본원의 다른 부분에서 논의된 보다 특정한 유형의 식물 중 임의의 것에서의 발현에 최적화될 수 있다.

트랜스제닉 숙주: 본 발명의 단백질-코딩 유전자는 매우 다양한 미생물 또는 식물 숙주 내로 도입될 수 있다. 본 발명은 트랜스제닉 식물 세포 및 트랜스제닉 식물을 포함한다. 바람직한 식물(및 식물 세포)는 옥수수, 아라비돕시스, 담배, 대두, 목화, 카놀라, 벼, 밀, 터프, 대두과의 식물 사료(예를 들어 알팔파 및 클로버), 목초 등이다. 다른 유형의 트랜스제닉 식물, 예컨대 과일, 채소, 관상용 식물, 및 나무가 또한 본 발명에 따라 만들어질 수 있다. 보다 일반적으로, 쌍떡잎 및/또는 외떡잎이 본 발명의 다양한 측면에서 사용될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 유전자의 발현은 직접적으로 또는 간접적으로 관심 단백질(들)의 세포 내 생산(및 유지)을 가져온다. 식물은 이러한 방식으로 제초제-저항성이 될 수 있다. 이러한 숙주는 트랜스제닉, 재조합, 형질전환된 및/또는 형질감염된 숙주 및/또는 세포를 말할 수 있다. 본 발명의 일부 측면에서(예를 들어 관심 유전자를 클로닝 및 제조할 때), 미생물(바람직하게는 박테리아) 세포는 본 개시의 이익과 함께, 표준 기술에 따라 생산되고 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 식물 세포는 전체 식물 내로 재생될 수 있다. 본 발명은 조직 세포 배양, 액체 배양, 및 평판 배양을 포함하는 세포 배양을 포함한다. 본 발명의 식물에 의해 생산된 및/또는 이를 생성하기 위해 사용된 종자는 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 다른 식물 조직 및 부분이 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 마찬가지로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 또는 세포를 생산하는 방법을 포함한다. 이러한 식물을 생산하기 위한 하나의 바람직한 방법은 본 발명의 종자를 식재하는 것이다.

식물이 바람직할 수 있지만, 본 발명은 또한 예를 들어 슈도모나스 플루오레센스(Pf) 숙주 균주 내의 고도로 활성인 재조합 AAD-12의 생산을 포함한다. 본 발명은 또한 이러한 숙주 내에서 가용성 활성 AAD-12를 유지하기 위한 바람직한 성장 온도; AAD-12가 40 % 초과의 총 세포 단백질, 또는 적어도 10 g/L로 생산되는 발효 조건; Pf 숙주로부터 활성 재조합 AAD-12의 높은 회수를 가져오는 정제 과정; 세포 kg당 적어도 10 g의 활성 AAD-12를 수확하는 정제 방식; 세포 kg당 적어도 20 g의 활성 AAD-12를 수확할 수 있는 정제 방식; 용액에 AAD-12 활성을 저장하고 재저장할 수 있는 제형화 과정; 및 장기 저장 및 유통 기한을 위한 AAD-12 활성을 보유할 수 있는 동결 건조 과정을 포함한다.

트랜스제닉 숙주를 형성하기 위한 유전자의 삽입: 본 발명의 일 측면은 본 발명의 단백질을 발현하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 식물, 식물 세포, 및 다른 숙주 세포를 형질전환/형질감염하는 것이다. 이러한 방식으로 형질전환된 식물은 상이한 작용 모드를 갖는 다양한 제초제에 대해 저항성이게 될 수 있다.

유전자의 안정한 유지 및 발현을 고려한 조건 하에서 표적 숙주 내로, 원하는 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하기 위한 매우 다양한 방법이 이용가능하다. 이러한 방법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고 예를 들면 미국 특허 번호 5,135,867에 설명되어 있다.

AAD-12 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어 E. 콜라이 내의 복제 시스템을 포함하는 다수의 클로닝 벡터 및 형질전환된 세포의 선별을 가능하게 하는 마커가 외래 유전자의 고등 식물로의 삽입을 위한 제조에 이용가능하다. 벡터는 예를 들면 pBR322, pUC 시리즈, M13 mp 시리즈, pACYC184 등을 포함한다. 따라서, 단백질을 코딩하는 서열은 적합한 제한 부위에서 벡터 내로 삽입될 수 있다. 얻어진 플라스미드는 E. 콜라이로의 형질전환에 사용된다. E. 콜라이 세포는 적합한 영양 배지에서 배양된 후, 수확되고 용해된다(lysed). 플라스미드는 게놈 DNA로부터의 정제에 의해 회수된다. 서열 분석, 제한 분석, 전기영동, 및 다른 생화학-분자 생물학적 방법이 일반적으로 분석 방법으로 수행된다. 각 조작 후, 사용된 DNA 서열은 제한 소화되어 다음 DNA 서열에 결합될 수 있다. 각 플라스미드 서열은 동일 또는 다른 플라스미드 내에서 클로닝될 수 있다. 원하는 유전자를 식물 내로 삽입하는 방법에 따라, 다른 DNA 서열이 필요할 수 있다. 예를 들어, Ti 또는 Ri 플라스미드가 식물 세포의 형질전환에 사용되는 경우, Ti 또는 Ri 플라스미드 T-DNA의 적어도 우측 경계, 그러나 흔히는 우측과 좌측 경계가, 삽입될 유전자의 측면배치(flanking) 영역으로서 결합되어야 한다. 식물 세포의 형질전환을 위한 T-DNA의 사용이 집중적으로 연구되었으며, 문헌[EP 120 516; Hoekema (1985); Fraley et al. (1986); 및 An et al. (1985)]에 설명되어 있다.

식물 숙주 세포 내로의 DNA의 삽입을 위해 다수의 기술을 이용가능하다. 이러한 기술은 형질전환 시약으로서 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조게네스를 사용하여 T-DNA로 형질전환하는 것, 융합, 주입, 바이올리스틱(biolistics)(미세입자 충돌), 탄화 규소 휘스커, 에어로졸 비밍(beaming), PEG, 또는 전기천공법뿐만 아니라 다른 가능한 방법을 포함한다. 아그로박테리아를 형질전환을 위해 사용하는 경우, 삽입될 DNA는 특수 플라스미드 내로, 즉 중간 벡터 내로, 또는 이원 벡터 내로 클로닝되어야 한다. T-DNA에서 서열에 상동성인 서열에 의한 상동성 재조합에 의해 중간 벡터는 Ti 또는 Ri 플라스미드 내로 통합될 수 있다. 또한 Ti 또는 Ri 플라스미드는 T-DNA의 전달을 위해 필요한 vir 영역을 포함한다. 중간 벡터는 아그로박테리아에서 스스로를 복제할 수 없다. 중간 벡터는 헬퍼 플라스미드(접합)에 의해 아그로박테리움 투메파시엔스 내로 전달될 수 있다. 이원 벡터는 E. 콜라이와 아그로박테리아 모두에서 스스로를 복제할 수 있다. 이는 선별 마커 유전자 및 우측 및 좌측 T-DNA 경계 영역으로 프레이밍된 링커 또는 폴리링커를 포함한다. 이는 아그로박테리아로 직접 형질전환될 수 있다(문헌[Holsters, 1978]). 숙주 세포로 사용된 아그로박테리움은 vir 영역을 운반하는 플라스미드를 포함할 것이다. vir 영역은 T-DNA를 식물 세포 내로 전달하기 위해 필요하다. 추가의 T-DNA가 포함될 수 있다. 이렇게 형질전환된 박테리아는 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 식물 외식편은 식물 세포 내로의 DNA의 전달을 위해 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조게네스로 유리하게 배양될 수 있다. 따라서 모든 식물은 선별을 위한 항생제 또는 살생물제를 함유할 수 있는 적합한 배지에서 감염된 식물 물질(예를 들면, 잎의 조각, 줄기의 세그먼트, 뿌리뿐만 아니라 원형질체 또는 현탁-배양된 세포)로부터 재생될 수 있다. 이어서 이렇게 얻어진 식물은 삽입된 DNA의 존재여부에 대해 시험될 수 있다. 주입 및 전기천공법의 경우 플라스미드에 대해 특별히 요구되는 것은 없다. 예를 들면 pUC 유도체와 같은 보통의 플라스미드를 사용할 수 있다.

형질전환된 세포는 보통의 방식으로 식물 내부에서 성장한다. 이는 생식 세포를 형성하고 형질전환된 형질(들)을 자손 식물에 물려줄 수 있다. 이러한 식물은 보통의 방식으로 성장하고 동일한 형질전환된 유전적 요인 또는 다른 유전적 요인을 갖는 식물과 교잡될 수 있다. 얻은 하이브리드 개체는 대응하는 표현형 특성을 갖는다. 본 발명의 일부 바람직한 실시양태에서, 박테리아 단백질을 코딩하는 유전자는 식물 게놈 내로 삽입된 전사 유닛으로부터 발현된다. 바람직하게는, 상기 전사 유닛은 식물 게놈 내로의 안정한 통합을 가능하게 하는 재조합 벡터이며 단백질을 코딩하는 mRNA를 발현하는 형질전환된 식물 계통의 선별을 가능하게 한다.

일단 삽입된 DNA가 게놈 내에 통합되면, 거기에서는 비교적 안정하다(그리고 다시 나오지 않는다). 이는 보통 형질전환된 식물 세포에 살생물제 또는 항생제, 예컨대 그 중에서도 카나마이신, G418, 블레오마이신, 하이그로마이신, 또는 클로람페니콜에 대한 저항성을 부여하는 선별 마커를 포함한다. 식물 선별가능한 마커는 또한 통상적으로 다양한 제초제, 예컨대 글루포시네이트(예를 들어, PAT/bar), 글리포세이트(EPSPS), ALS-저해제(예를 들면, 이미다졸리논, 술포닐우레아, 트리아졸로피리미딘 술폰아닐리드 등), 브롬옥시닐, HPPD-저해제 저항성, PPO-저해제, ACC-ase 저해제 및 많은 다른 것들에 대한 저항성을 제공할 수 있다. 따라서 개별적으로 사용된 마커는 삽입된 DNA를 포함하지 않는 세포보다는 형질전환된 세포의 선별을 허용해야 한다. 관심 유전자(들)는 바람직하게는 식물 세포에서 구성적 또는 유도성 프로모터에 의해 발현된다. 일단 발현되면, mRNA는 단백질 내로 번역되어, 관심 아미노산을 단백질 내로 통합시킨다. 식물 세포에서 발현된 단백질을 코딩하는 유전자는 구성적 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 또는 유도성 프로모터의 제어하에 있을 수 있다.

몇몇 기술은 외래 재조합 벡터를 식물 세포 내로 도입하기 위해, 그리고 도입된 유전자를 안정하게 유지하고 발현하는 식물을 얻기 위해 존재한다. 이러한 기술은 미세입자 상에 코팅된 유전자 물질을 세포 내로 바로 도입하는 것을 포함한다(코넬(Cornell)의 미국 특허 번호 4,945,050 및 다우엘란코(DowElanco), 현재 다우 아그로사이언시즈, 엘엘씨(Dow AgroSciences, LLC)의 5,141,131). 또한, 식물은 아그로박테리움 기술을 사용하여 형질전환될 수 있으며, 톨레도 대학교의 미국 특허 번호 5,177,010; 텍사스 에이앤드엠(Texas A&M)의 5,104,310; 유럽 특허 출원 0131624B1; 쉴페루트(Schilperoot)의 유럽 특허 출원 120516, 159418B1 및 176,112; 쉴페루트의 미국 특허 번호 5,149,645, 5,469,976, 5,464,763 및 4,940,838 및 4,693,976; 유럽 특허 출원 116718, 290799, 320500(모두 막스 플랑크(Max Planck); 재팬 토바코(Japan Tobacco)의 유럽 특허 출원 604662 및 627752, 및 미국 특허 번호 5,591,616; 유럽 특허 출원 0267159 및 0292435, 및 미국 특허 번호 5,231,019(모두 시바 가이기(Ciba Geigy), 현재 신젠타(Syngenta)); 미국 특허 번호 5,463,174 및 4,762,785(모두 칼젠(Calgene)); 및 미국 특허 번호 5,004,863 및 5,159,135(모두 아그라세투스(Agracetus))를 참조한다. 다른 형질전환 기술은 휘스커 기술을 포함한다. 미국 특허 번호 5,302,523 및 5,464,765(모두 제네카(Zeneca), 현재 신젠타) 참조. 다른 직접 DNA 전달 형질전환 기술은 에어로졸 빔 기술을 포함한다. 미국 특허 번호 6,809,232 참조. 전기천공 기술이 또한 식물을 형질전환하는 데 사용되었다. 보이스 톰슨 인스티튜트(Boyce Thompson Institute)의 WO 87/06614; 미국 특허 번호 5,472,869 및 5,384,253(모두 데칼브(Dekalb)); 및 WO 92/09696 및 WO 93/21335(모두 플랜드 제네틱 시스템즈(Plant Genetic Systems)) 참조. 또한, 바이러스 벡터는 또한 관심 단백질을 발현하는 트랜스제닉 식물을 생산하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어 외떡잎 식물은 미코겐 플랜트 사이언스(Mycogen Plant Science) 및 시바-가이기(현재 신젠타)의 미국 특허 번호 5,569,597뿐만 아니라, 미국 특허 번호 5,589,367 및 5,316,931(모두 바이오소스(Biosource), 현재 라지 스케일 바이올로지(Large Scale Biology))에 설명된 방법을 사용하여 바이러스 벡터를 사용하여 형질전환될 수 있다.

앞서 언급한 바와 같이, DNA 구축물이 식물 숙주 내로 도입되는 방식은 본 발명에서 중요하지 않다. 효율적인 형질전환을 제공하는 임의의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 식물 세포 형질전환을 위한 다양한 방법이 본원에서 설명되고 있으며, 아그로박테리움 매개 형질전환을 수행하기 위한 Ti 또는 Ri-플라스미드 등의 사용을 포함한다. 많은 경우에, T-DNA 경계, 보다 구체적으로는 우측 경계에 의해 하나 또는 두 면 상에서 경계된, 형질전환에 사용된 구축물을 갖는 것이 바람직할 것이다. 이는 구축물이 형질전환을 위한 모드로서 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조게네스를 사용할 때 특히 유용하지만, T-DNA 경계는 다른 형질전환 모드와 함께 사용하는 것을 찾을 수 있다. 아그로박테리움이 식물 세포 형질전환에 사용되는 경우, 숙주 내에 존재하는 T-DNA 또는 Ti 또는 Ri 플라스미드와의 상동성 재조합을 위해 숙주 내로 도입될 수 있는 벡터가 사용될 수 있다. 벡터의 도입은 전기천공, 삼친 교배 및 통상의 기술자에게 알려져 있는 그램-음성의 박테리아를 형질전환하기 위한 다른 기술을 통하여 수행될 수 있다. 아그로박테리움 숙주 내로의 벡터 형질전환의 방식은 본 발명에서 중요하지 않다. 재조합을 위한 T-DNA를 포함하는 Ti 또는 Ri 플라스미드는 갤(gall) 형성을 일으키는 것이 가능 또는 불가능할 수 있고, vir 유전자가 상기 숙주에 존재하는 한 본 발명에서 중요하지 않다.

아그로박테리움이 형질전환에 사용되는 일부 경우에, T-DNA 경계 내에 있는 발현 구축물은 문헌[Ditta et al. (1980)] 및 EPO 0 120 515에서 설명된 바와 같이 넓은 스펙트럼 벡터, 예컨대 pRK2 또는 그의 유도체 내로 삽입될 것이다. 발현 구축물 내에 포함된 것과 T-DNA는 형질전환된 아그로박테리움 및 형질전환된 식물 세포의 선별을 고려한, 본원에서 설명된 바와 같은 하나 이상의 마커일 것이다. 사용된 특정 마커는 본 발명에서 필수적이지 않고, 바람직한 마커는 사용된 숙주 및 구조에 의존한다.

아그로박테리움을 사용하는 식물 세포의 형질전환에 대해, 외식편은 그의 형질전환이 가능하도록 충분한 시간 동안 형질전환된 아그로박테리움과 조합되고 인큐베이팅될 수 있다. 형질전환 후, 아그로박테리아는 적절한 항생제를 사용하여 선별에 의해 죽고, 식물 세포는 적절한 선별적 배지로 배양된다. 캘리(Calli)가 형성되면, 싹 형성은 식물 조직 배양 및 식물 재생의 기술분야에서 잘 알려진 방법에 따라 적절한 식물 호르몬을 사용함으로써 촉진될 수 있다. 그러나 캘러스 중간 단계가 항상 필요한 것은 아니다. 싹 형성 후, 상기 식물 세포는 뿌리 형성을 촉진하는 배지로 옮겨져 식물 재생을 완료할 수 있다. 이어서 식물은 종자로 성장할 수 있고, 상기 종자는 후대를 정착시키기 위해 사용될 수 있다. 형질전환 기술에 관계 없이, 박테리아 단백질을 코딩하는 유전자는 바람직하게는 벡터 내에 식물 프로모터 조절 요소뿐만 아니라 3' 비-번역된 전사 말단 영역, 예컨대 Nos 등을 포함함으로써 식물 세포에서 상기 유전자를 발현하기 위한 유전자 전달 벡터 내로 혼입된다.

식물을 형질전환하기 위한 많은 기술 외에, 외래 유전자와 접촉하는 조직의 유형도 마찬가지로 변할 수 있다. 이러한 조직은 배발생 조직, 캘러스 조직 유형 I, II, 및 III, 히포코틸, 분열조직, 뿌리 조직, 체관부에서의 발현을 위한 조직 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 대부분의 모든 식물 조직은 본원에서 설명된 적절한 기술을 사용하여 탈분화 동안 형질전환될 수 있다.

상술한 바와 같이, 다양한 선별가능한 마커를 원하는 경우 사용할 수 있다. 특정 마커에 대한 선호는 통상의 기술자의 재량이지만, 다음의 선별가능한 마커 중 임의의 것이 선별가능한 마커로서 기능할 수 있는, 본원에서 나열되지 않은 임의의 다른 유전자와 함께 사용될 수 있다. 이러한 선별가능한 마커는 항생제 카나마이신, 네오마이신 및 G41에 대한 저항성; 하이그로마이신 저항성; 메토트렉세이트 저항성을 코딩하는 트랜스포손 Tn5(Aph II)의 아미노글리코시드 포스포트랜스페라제 유전자뿐만 아니라 글리포세이트; 포스피노트리신(바이알라포스 또는 글루포시네이트); ALS-저해 제초제(이미다졸리논, 술포닐우레아, 및 트리아졸로피리미딘 제초제), ACC-ase 저해제(예를 들어, 아이릴옥시프로피오네이트 또는 시클로헥산디온), 및 다른 것들, 예컨대 브롬옥시닐, 및 HPPD-저해제(예를 들면 메조트리온) 등에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

선별가능한 마커 외에, 리포터 유전자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 경우에서, 리포터 유전자는 선별가능한 마커와 또는 선별가능한 마커 없이 사용될 수 있다. 리포터 유전자는 통상적으로 양친 생물체 또는 조직에 존재하지 않고 통상적으로 단백질을 코딩하여 일부 표현형 변화 또는 효소 성질을 가져오는 유전자이다. 이러한 유전자의 예는 문헌[Weising et al., 1988]에서 제공된다. 바람직한 리포터 유전자는 E. 콜라이의 uidA 유전자좌의 베타-글루쿠로니다제(GUS), E. 콜라이의 Tn9로부터의 클로람페니콜 아세틸 트랜스페라제 유전자, 생물발광 해파리 에쿼레아 빅토리아로부터의 녹색 형광 단백질, 및 반딧불이 포티너스 피랄리스(Photinus pyralis)로부터의 루시페라제 유전자를 포함한다. 따라서 리포터 유전자 발현을 검출하는 분석법은 상기 유전자가 양친 세포 내로 도입된 후 적절한 때에 수행될 수 있다. 이러한 바람직한 분석법은 형질전환된 세포를 식별하기 위하여 문헌[Jefferson et al., (1987)]에 설명된 바와 같은 E. 콜라이의 uidA 유전자좌의 베타-글루쿠로니다제(GUS)를 코딩하는 유전자의 사용을 수반한다.

식물 프로모터 조절 요소 외에, 다양한 기원으로부터의 프로모터 조절 요소가 외래 유전자를 발현하기 위해 식물 세포에서 효율적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 기원의 프로모터 조절 요소, 예컨대 옥토핀 신타제 프로모터, 노팔린 신타제 프로모터, 만노핀 신타제 프로모터; 바이러스 기원의 프로모터, 예컨대 컬리플라워 모자이크 바이러스(35S 및 19S), 35T(이는 개량된 35S 프로모터임, 미국 특허 번호 6,166,302, 특히 실시예 7E 참조) 등을 사용할 수 있다. 식물 프로모터 조절 요소는 리불로스-1,6-비스포스페이트(RUBP) 카르복실라제 작은 서브유닛(ssu), 베타-콘글리시닌 프로모터, 베타-파세올린 프로모터, ADH 프로모터, 열-충격 프로모터 및 조직 특이적 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 요소, 예컨대 매트릭스 부착 영역, 스캐폴드 부착 영역, 인트론, 인핸서, 폴리아데닐화 서열 등이 존재할 수 있고, 따라서 전사 효율 또는 DNA 통합을 개선할 수 있다. 이러한 요소는 DNA 기능에 필요할 수 있거나 그렇지 않을 수 있지만, 이는 전사, mRNA 안정성 등에 영향을 미침으로써 DNA의 더 나은 발현 또는 기능을 제공할 수 있다. 이러한 요소는 식물에서 형질전환된 DNA의 최적의 성능을 얻기 위하여 원하는 경우 DNA에 포함될 수 있다. 통상적인 요소는 Adh-인트론 1, Adh-인트론 6, 알팔파 모자이크 바이러스 코트 단백질 리더 서열, 오스모틴 UTR 서열, 메이즈 줄무늬(streak) 바이러스 코트 단백질 리더 서열뿐만 아니라 통상의 기술자가 이용가능한 다른 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 구성적 프로모터 조절 요소가 또한 사용될 수 있고, 이로 인해 모든 세포 유형에서 언제나 연속적 유전자 발현으로 이어진다(예를 들면, 액틴, 유비퀴틴, CaMV 35S 등). 조직 특이적 프로모터 조절 요소는 특정 세포 또는 조직 유형, 예컨대 잎 또는 종자(예를 들면, 제인, 올레오신, 내핀, ACP, 글로불린 등)에서의 유전자 발현의 원인이며, 또한 이들을 사용할 수 있다.

또한 프로모터 조절 요소는 식물의 발달의 특정 단계 동안 활성(또는 비활성)일 수 있을 뿐만 아니라 식물 조직 및 기관에서 활성일 수 있다. 이러한 것의 예는 화분-특이적, 배-특이적, 옥수수-실크-특이적, 목화-섬유-특이적, 뿌리-특이적, 종자-내배유-특이적, 또는 영양기-특이적 프로모터 조절 요소 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 환경 하에서, 유도성 프로모터 조절 요소를 사용하는 것이 바람직할 수 있고, 이는 특이적 신호, 예컨대: 물리적 자극(열 충격 유전자), 빛(RUBP 카르복실라제), 호르몬(Em), 대사산물, 화학약품(테트라시클린 반응성) 및 스트레스에 반응하여 유전자의 발현의 원인이 된다. 식물에서 기능하는 다른 바람직한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다. 많은 식물-특이적 유전자 전달 벡터가 본 기술분야에서 알려져 있다.

식물 RNA 바이러스계 시스템은 또한 박테리아 단백질을 발현하는 데 사용될 수 있다. 이렇게 함에 있어서, 단백질을 코딩하는 유전자는 관심 숙주 식물을 감염시킬 적합한 식물 바이러스의 코트 프로모터 영역 내로 삽입될 수 있다. 이어서 단백질은 발현될 수 있어 식물을 제초제 손상으로부터 보호하는 것을 제공한다. 식물 RNA 바이러스계 시스템은 마이코겐 플랜트 사이언시즈, 인크.(Mycogen Plant Sciences, Inc.)의 미국 특허 번호 5,500,360, 및 바이오소스, 현재 라지 스케일 바이올로지의 미국 특허 번호 5,316,931 및 5,589,367에 설명되어 있다.

내성 또는 저항성 수준을 보다 증가시키는 수단. 본원에서는 수확량을 포함하여 표현형에 관찰가능한 악영향을 주지 않으면서 본 발명의 식물에 신규한 제조체 저항성이 부여될 수 있음을 나타낸다. 이러한 식물은 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 예시되고 제시된 식물은 예를 들면 적어도 하나의 본 발명의 제초제의 2 x, 3 x, 4 x, 및 5 x의 통상적 시용 수준을 견딜 수 있다. 이러한 내성 수준의 개선은 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어, 소정의 유전자의 발현을 증가시키기 위하여 다양한 기술이 본 기술분야에서 알려져 있으며, 예측가능하게 최적화되고 더 개발될 수 있다.

이러한 방법 하나는 (발현 카세트 등에서) 본 발명의 AAD-12 유전자의 카피 수를 증가시키는 것을 포함한다. 형질전환 이벤트는 또한 다수의 유전자 카피를 갖는 것에 대해 선별될 수 있다.

강한 프로모터 및 인핸서는 발현을 "수퍼차지(supercharge)"하는 데 사용될 수 있다. 이러한 프로모터의 예는 35S 인핸서를 사용하는 바람직한 35T 프로모터를 포함한다. 35S, 메이즈 유비퀴틴, 아라비돕시스 유비퀴틴, A.t. 액틴, 및 CSMV 프로모터가 이러한 사용을 위해 포함된다. 또한 다른 강한 바이러스 프로모터도 바람직하다. 인핸서는 4 OCS 및 35S 이중 인핸서를 포함한다. 매트릭스 부착 영역(MAR)은 또한 형질전환 효율 및 트랜스진 발현을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

셔플링(방향적 진화) 및 전사 요인은 또한 본 발명에 따른 실시양태에 사용될 수 있다.

서열 수준은 다르지만 동일한 또는 유사한 전체 본질적 3차원 구조, 표면 전하 분포 등을 보유하는 변이체 단백질이 또한 설계될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 7,058,515; 문헌[Larson et al., Protein Sci. 2002 11: 2804-2813, "Thoroughly sampling sequence space: Large-scale protein design of structural ensembles"; Crameri et al., Nature Biotechnology 15, 436-438 (1997), "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling"; Stemmer, W. P. C. 1994. "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751; Stemmer, W. P. C. 1994. "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370: 389-391; Stemmer, W. P. C. 1995. Searching sequence space. Bio/Technology 13: 549-553; Crameri, A., et al. 1996. "Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling" Nature Medicine 2: 100-103; 및 Crameri, A., et al. 1996. "Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling" Nature Biotechnology 14: 315-319] 참조.

식물 세포 내로 삽입된 재조합 폴리뉴클레오티드의 활성은 삽입부에 인접한 내인성 식물 DNA의 영향에 의존할 수 있다. 따라서, 다른 옵션은 삽입을 위한 식물 게놈에서 뛰어난 위치로 알려진 이벤트의 장점을 갖는다. 예를 들어 cry1F 및 cry1Ac 목화 이벤트에 관련된 WO 2005/103266 A1를 참조하고; 본 발명의 AAD-12 유전자는 cry1F 및/또는 cry1Ac 삽입부 대신에 게놈 유전자좌에서 치환될 수 있다. 따라서, 예를 들어 표적된 상동성 재조합이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 이러한 유형의 기술은 예를 들면, 표적된 재조합을 위한 아연 집게의 사용에 관련된 WO 03/080809 A2 및 대응되는 공개된 미국 출원 20030232410의 대상이다. 재조합효소(예를 들면 cre-10 x 및 flp-frt)의 사용이 또한 알려져 있다.

AAD-12 무독화는 세포질에서 일어나는 것으로 여겨진다. 따라서, 이러한 단백질 및 mRNA를 더 안정화하기 위한 수단(mRNA 분해를 차단하는 것을 포함함)이 본 발명의 측면에 포함되며, 따라서 본 기술분야에서 알려진 기술이 적용될 수 있다. 본 발명의 단백질은 프로테아제 등에 의한 분해를 방지하도록 설계될 수 있다(프로테아제 분할 부위는 단백질의 아미노산 서열을 개량함으로써 효과적으로 제거될 수 있음). 이러한 실시양태는 5' 및 3' 스템 루프 구조, 예컨대 오스모틴으로부터의 UTRs 및 per5(AU-풍부 비번역 5' 서열)을 포함한다. 5' 캡, 예컨대 7-메틸 또는 2'-O-메틸기, 예를 들면 7-메틸구아닐산 잔기를 또한 사용할 수 있다. 예를 들어 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 74, No. 7, pp. 2734-2738 (July 1977) Importance of 5'-terminal blocking structure to stabilize mRNA in eukaryotic protein synthesis] 참조. 단백질 복합체 또는 리간드 블록킹기를 또한 사용할 수 있다.

AAD-12(합성 헤어핀)에 가장 적합한 5' 또는 3' UTR의 컴퓨터조작 설계는 또한 본 발명의 범위 내에서 수행될 수 있다. 일반적으로 컴퓨터 모델뿐만 아니라 유전자 셔플링 및 방향적 진화가 본원의 다른 부분에서 논의된다. 컴퓨터 모델링 및 UTR에 보다 구체적으로 관련하여, 본 발명의 5' 및 3' UTR 유도체를 예측/평가하는 데 사용되는 컴퓨터 모델링 기술은 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 코포레이션 그룹(Genetics Corporation Group)으로부터 입수가능한 엠폴드(MFold) 버전 3.1(문헌[Zucker et al., Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide. In RNA Biochemistry and Biotechnology, 11-43, J. Barciszewski & B. F. C. Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, (1999); Zucker et al., Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure. J. Mol. Biol. 288, 911-940 (1999); Zucker et al., RNA Secondary Structure Prediction. In Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry S. Beaucage, D. E. Bergstrom, G. D. Glick, and R. A. Jones eds., John Wiley & Sons, New York, 11.2.1-11.2.10, (2000)] 참조), COVE(공분산 모델을 사용하는 RNA 구조 분석(확률적 컨텍스트 자유 문법 방법(stochastic context free grammar methods))) v. 2.4.2(문헌[Eddy & Durbin, Nucl. Acids Res. 1994, 22: 2079-2088])(이는 소스 코드로서 자유롭게 배포되며 웹사이트 genetics.wusT1.edu/eddy/software/에 접근함으로써 다운로드할 수 있음), 및 폴드얼라인(FOLDALIGN)(또한 웹사이트 bioinf.au.dk. FOLDALIGN/에서 자유롭게 배포되며 다운로드가능함)(문헌[Finding the most significant common sequence and structure motifs in a set of RNA sequences. J. Gorodkin, L. J. Heyer and G. D. Stormo. Nucleic Acids Research, Vol. 25, no. 18 pp 3724-3732, 1997; Finding Common Sequence and Structure Motifs in a set of RNA Sequences. J. Gorodkin, L. J. Heyer, and G. D. Stormo. ISMB 5;120-123, 1997] 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 실시양태는 자연적으로 진화하거나 화학적으로 유도된 돌연변이와 관련하여 사용될 수 있다(돌연변이는 스크리닝 기술에 의해 선별되고 이어서 AAD-12 및 가능한 다른 유전자로 형질전환될 수 있음). 본 발명의 식물은 ALS 저항성 및/또는 진화된 글리포세이트 저항성과 조합될 수 있다. 예를 들어 아미노피랄리드 저항성이 또한 AAD-12 유전자와 조합 또는 "스택킹"될 수 있다.

종래의 육종 기술은 또한 강력하게 조합하고 유전자이입하며 원하는 형질을 개선하기 위하여 본 발명과 조합될 수 있다.

추가의 개선은 또한 식물을 더 보호하기 위하여 및/또는 더 많은 제초제에 대한 교차 저항성을 부가하기 위하여 적절한 완화제와 함께 사용하는 것을 포함한다. 완화제는 통상적으로 cP450을 활성화/발현함으로써 식물 면역 시스템을 증가시키는 작용을 한다. 완화제는 잡초 방제 효력을 약화시키지 않으면서 생리적 또는 분자적 메커니즘에 의해 작물에 대한 제초제의 약해를 감소시키는 화학약품이다.

제초제 완화제는 베녹사코르, 클로퀸토세트, 시오메트리닐, 디클로르미드, 디시클로논, 디에톨레이트, 펜클로라졸, 펜클로림, 플루라졸, 플룩소페님, 푸릴라졸, 이속사디펜, 메펜피르, 메페네이트, 나프탈산 무수물 및 옥사베트리닐을 포함한다. 식물 활성제(이들의 방어 메커니즘을 활성화시킴으로써 식물을 보호하는 화합물의 신규한 클래스)가 또한 본 발명의 실시양태에서 사용될 수 있다. 이는 애시벤졸라 및 프로베나졸을 포함한다.

상용 완화제는 티오카르바메이트 및 클로로아세트아닐리드 패밀리의 식재전 혼입된(preplant-incorporated) 또는 발아전 시용된(preemergence-applied) 제초제에 대한 대립종(large-seeded) 잔디 작물, 예컨대 옥수수, 곡식용 수수 및 습식-파종된(wet-sown) 벼의 보호에 사용될 수 있다. 완화제는 또한 아릴옥시페녹시프로피오네이트 및 술포닐우레아 제초제의 발아후 시용에 대해 겨울 곡물, 예컨대 밀을 보호하기 위해 개발되었다. 술포닐우레아, 이미다졸리논, 시클로헥산디온, 이속사졸, 및 트리케톤 제초제에 대한 옥수수 및 벼의 보호를 위한 완화제의 사용이 또한 정착되어 있다. 완화된 식물에서 제초제 무독화의 완화제-유도 증강은 완화제 작용에 관련된 주요 메커니즘으로서 널리 받아들여지고 있다. 완화제는 공동인자, 예컨대 글루타티온 및 제초제-무독화 효소, 예컨대 글루타티온 S-트랜스페라제, 시토크롬 P450 모노옥시게나제, 및 글루코실 트랜스페라제를 유도한다. 문헌[Hatzios K K, Burgos N (2004) "Metabolism-based herbicide resistance: regulation by safeners," Weed Science: Vol. 52, No. 3 pp. 454-467].

AAD-12와 스택킹된 시토크롬 p450 모노옥시게나제 유전자의 사용은 하나의 바람직한 실시양태이다. 제초제 대사에 관여하는 P450가 있고; cP450은 예를 들어 포유류 또는 식물 기원일 수 있다. 고등 식물에서, 시토크롬 P450 모노옥시게나제(P450)는 이차 대사를 수행하는 것으로 알려져 있다. 이는 또한 NADPH-시토크롬 P450 옥시도리덕타제(리덕타제)와 협동하여 생체이물의 산화 대사에서 중요한 역할을 한다. 일부 제초제에 대한 저항성은 P450뿐만 아니라 글루타티온 S-트랜스페라제에 의한 대사의 결과로서 보고되었다. 포유류의 생체이물 대사에 관여된 다수의 마이크로솜 P450 종은 분자 클로닝에 의해 특징화되었다. 이들 중 일부는 몇몇 제초제를 효율적으로 대사하는 것으로 보고되었다. 따라서 식물 또는 포유류 P450을 갖는 트랜스제닉 식물은 몇몇 제초제에 대하여 저항성을 나타낼 수 있다.

상기의 하나의 바람직한 실시양태는 아세토클로르(아세토클로르계 제품은 설패스(Surpass)® 키스톤(Keystone)®, 키스톤 LA, 풀타임(FulTime)® 및 탑놋치(TopNotch)® 제초제를 포함) 및/또는 트리플루랄린(예컨대 트레플란(Treflan)®)에 대한 저항성을 위한 cP450의 사용이다. 대두 및/또는 옥수수에서의 이러한 저항성은 일부 바람직한 실시양태에 포함된다. 이러한 실시양태와 관련하여 추가의 안내를 위해, 예를 들어 문헌[Inui et al., "A selectable marker using cytochrome P450 monooxygenases for Arabidopsis transformation," Plant Biotechnology 22, 281-286 (2005)](제초제를 대사하는 인간 시토크롬 P450 모노옥시게나제를 사용하는 아그로박테리움 투메파시엔스를 통한 아라비돕시스 탈리아나의 형질전환을 위한 선별 시스템에 관한 것; 제초제 내성 묘목이 제초제 아세토클로르, 아미프로포스-메틸, 클로르프로팜, 클로르술푸론, 노르플루라존, 및 펜디메탈린을 사용하여 형질전환되고 선별되었음); 문헌[Siminszky et al., "Expression of a soybean cytochrome P450 monooxygenase cDNA in yeast and tobacco enhances the metabolism of phenylurea herbicides," PNAS Vol. 96, Issue 4, 1750-1755, Feb. 16, 1999; Sheldon et al, Weed Science: Vol. 48, No. 3, pp. 291-295, "A cytochrome P450 monooxygenase cDNA (CYP71A10) confers resistance to linuron in transgenic Nicotiana tabacum"; 및 "Phytoremediation of the herbicides atrazine and metolachlor by transgenic rice plants expressing human CYP1A1, CYP2B6, and CYP2C19," J Agric Food Chem. 2006 Apr. 19; 54(8):2985-91](보고된 바에 의하면 벼 식물이 클로로아세토미드(아세토클로르, 알라클로르, 메토아클로르, 프레틸아클로르, 및 테닐클로르), 옥시아세트아미드(메페나세트), 피리다지논(노르플루라존), 2,6-디니트로아날린(트리플루랄린 및 펜디메탈린), 포스파미데이트(아미프로포스-메틸, 티오카르바메이트(피리부티카르브), 및 우레아(클로르톨루론))에 높은 내성을 나타낸 벼에서의 인간 시토크롬 p450 모노옥시게나제를 시험하는 것과 관련됨)을 참조한다.

또한 본 발명의 AAD-12 유전자를 더 효율적이게 하는 상이한 2,4-D 화학물질을 변경 또는 사용하는 것이 가능하다. 이러한 가능한 변화는 더 나은 기질 및 더 나은 이탈기(더 높은 전기음성도)를 생성하는 것을 포함한다. 옥신 수송 저해제(예를 들어 디플루펜조피르)는 또한 2,4-D로 제초제 활성을 증가시키는 데 사용될 수 있다.

구체적으로 언급하거나 암시하지 않는 한, 용어 "한", "하나의", 및 "그"는 본원에서 사용된 "적어도 하나"를 의미한다. 본원에서 참조되거나 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원 및 공개공보는, 이들이 본 명세서의 분명한 교시와 모순되지 않는 데까지는 그 전체 내용이 인용에 의해 포함된다.

다음은 본 발명의 실시를 위한 과정을 도시하는 실시예이다. 이 실시예가 제한으로 해석되어서는 안 된다. 달리 언급하지 않는 한 모든 백분율은 중량에 의한 것이며 모든 용매 혼합 비율은 부피에 의한 것이다.

실시예

실시예 1

식물체 내 2,4-D에 대한 저항성을 부여하는 유전자의 확인 방법

식물체 내에서 제초제를 분해하는 활성을 보유하는 유전자를 확인하는 방법으로서, 현재 공용인 데이터베이스, 예컨대 NCBI(미국 국가생물공학센터)를 찾는 것이 가능하다. 과정을 시작하기 위해서는, 원하는 특징(즉, α-케토글루타레이트 디옥시게나제 활성)을 갖는 단백질을 코딩하는, 이미 확인된 기능성 유전자 서열을 갖는 것이 필요하다. 이어서 이 단백질 서열은 기탁된 입수가능한 NCBI 단백질 서열과 비교하기 위하여 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(문헌[Altschul et al., 1997]) 알고리즘에 대한 입력으로 사용된다. 디폴트 설정을 사용하여, 이 연구는 100 개 이상의 상동성 단백질 서열을 다양한 수준으로 복귀시켰다. 이는 아미노산 수준에서 높은 동일성(85-98 %) 내지 매우 낮은 동일성(23-32 %)의 범위이다. 종래에는, 오직 높은 상동성을 갖는 서열만이 입력 서열과 유사한 성질을 보유하는 것으로 기대될 수 있었다. 이 경우에 .gtoreq. 50 % 상동성을 갖는 서열만이 선택되었다. 본원에서 예시한 바와 같이, 31 % 정도로 적은 아미노산 보존(랄스토니아 유트로파로부터의 tfdA에 비해)으로 상동성을 클로닝하고 재조합 발현하는 것은 의도한 제초제에 대해서뿐만 아니라 이 효소로 이전에 시험된 적이 없는 기질에 대해서도 상용 수준의 저항성을 부여하기 위해 사용될 수 있다.

단일 유전자(sdpA)는 tfdA에 대하여 오직 31 %의 아미노산 동일성을 갖는 상동체로서, NCBI 데이터베이스(ncbi.nlm.nih.gov 웹사이트; accession #AF516752 참조)로부터 확인되었다. 퍼센트 동일성은 먼저 데이터베이스에 기탁된 sdpA 및 tfdA DNA 서열 모두를 단백질로 번역한 후, VectorNTI 소프트웨어 패키지의 ClustalW를 사용하여 다중 서열 정렬을 수행함으로써 결정되었다.

실시예 2

식물 및 박테리아에서의 발현을 위한 서열의 최적화

식물에서 비상동성 유전자의 더 높은 수준의 발현을 얻기 위하여, 식물 세포에서 더 효율적으로 발현되도록 유전자의 서열을 코딩하는 단백질을 개량하는 것이 바람직할 수 있다. 메이즈는 식물에서의 유전자의 발현 수준 및 코딩된 단백질의 수준을 증가시키기 위해 형질전환 전에 비상동성 단백질 코딩 영역을 재설계하는 것이 바람직할 수 있는 식물 중 하나이다. 따라서, 박테리아 단백질을 코딩하는 유전자의 설계에서의 추가적인 단계는 최적 발현을 위한 비상동성 유전자의 개량이다.

메이즈에서의 발현을 위한 박테리아 단백질의 개량의 한가지 이유는 천연 유전자의 비최적 G+C 함량에 의한 것이다. 예를 들어, 많은 천연 박테리아 유전자(들)의 매우 낮은 G+C 함량(및 높은 A+T 함량 쪽으로의 결과적 스큐잉(skewing))은 매우 A+T가 풍부하다고 알려진 식물 유전자 제어 서열을 모방 또는 복제하는 서열의 세대를 가져온다. 식물(예를 들어, 유전자 프로모터에서 보통 발견되는 TATA 박스 영역) 내로 도입된 유전자(들)의 DNA 내의 일부 A+T-풍부 서열의 존재는 유전자(들)의 비정상 전사를 일으킬 수 있다. 한편, 전사된 mRNA(예를 들어, 폴리아데닐화 신호 서열(AAUAAA), 또는 pre-mRNA 스플라이싱에 관여한 작은 핵 RNA에 상보적인 서열) 내에 존재하는 다른 조절 서열의 존재는 RNA 불안정성을 초래할 수 있다. 따라서, 보다 바람직하게는 식물 최적화 유전자(들)로 칭하는, 메이즈 발현을 위한 박테리아 단백질을 코딩하는 유전자의 설계에서 하나의 목표는 더 높은 G+C 함량을 갖는 DNA 서열, 및 바람직하게는 대사 효소를 코딩하는 메이즈 유전자와 근접한 것을 생성하는 것이다. 박테리아 단백질을 코딩하는 식물 최적화 유전자(들)의 설계에서의 다른 목표는 서열 변형이 번역을 저해하지 않는 DNA 서열을 생성하는 것이다.

표 2는 메이즈에서 G+C 함량이 얼마나 높은지를 나타낸다. 표 2의 데이터에 있어서, 유전자의 코딩 영역은 진뱅크(방출 71) 엔트리로부터 추출될 수 있고, 염기 조성은 맥벡터(MacVector)™ 프로그램(캘리포니아주 샌디에고 소재의 액셀러리즈(Accelerys))을 사용하여 계산되었다. 인트론 서열은 계산에서 무시되었다.

유전자 코드의 반복/축중에 의해 제공된 가소성에 의해(즉, 일부 아미노산이 하나 초과의 코돈에 의해 구체화됨), 상이한 생물체 또는 생물체의 클래스에서의 게놈의 진화는 반복 코돈의 차이가 나는 사용을 가져왔다. 이 "코돈 바이어스"는 단백질 코딩 영역의 평균 염기 조성에 반영된다. 예를 들어, 비교적 낮은 G+C 함량을 갖는 생물체는 반복 코돈의 제3 위치에 A 또는 T를 갖는 코돈을 이용하지만, 더 높은 G+C 함량을 갖는 것은 제3 위치에 G 또는 C를 갖는 코돈을 이용한다. mRNA 내의 "마이너" 코돈의 존재는 특히 마이너 코돈에 대응하는 대전된 tRNA의 상대적인 풍부도가 낮을 때, 그 mRNA의 절대 번역 속도를 감소시킬 수 있는 것으로 생각된다. 이의 연장은 개별적인 마이너 코돈에 의한 번역 속도의 감소가 다수의 마이너 코돈에 대해 적어도 부가적일 수 있다는 것이다. 따라서, 비교적 높은 함량의 마이너 코돈을 갖는 mRNA는 그에 맞게 낮은 번역 속도를 가질 것이다. 이 속도는 이후의 낮은 수준의 코딩된 단백질로 반영될 것이다.

메이즈(또는 다른 식물, 예컨대 목화 또는 대두) 발현을 위해 박테리아 단백질을 코딩하는 유전자를 조작함에 있어서, 식물의 코돈 바이어스가 결정되었다. 메이즈에 대한 코돈 바이어스는 식물이 그의 단백질을 코딩하기 위해 사용하는 통계적 코돈 분포이며, 바람직한 코돈 사용은 표 3에 나타나 있다. 바이어스를 결정한 후, 관심 유전자(들)에서의 코돈의 퍼센트 빈도가 결정된다. 식물에서 바람직한 일차 코돈뿐만 아니라 복수의 선택이 존재할 때는 바람직한 코돈의 제2, 제3, 및 제4 선택도 결정되어야 한다. 따라서 박테리아 단백질의 아미노 서열을 코딩하는 신규한 DNA 서열이 설계될 수 있지만, 신규한 DNA 서열은 단백질 아미노산 서열 내의 각 위치에 아미노산을 열거하기 위하여 식물(첫번째로 바람직한, 두번째로 바람직한, 세번째로 바람직한, 또는 네번째로 바람직한) 코돈의 치환에 의해 (단백질을 코딩하는) 천연 박테리아 DNA 서열과는 다르다. 따라서 신규한 서열은 변형에 의해 생성되었을 수 있는 제한 효소 부위에 대해 분석된다. 확인된 자리는 코돈을 제1, 제2, 제3, 또는 제4의 바람직한 선택 코돈으로 교체함으로써 더 변형된다. 관심 유전자의 전사 또는 번역에 영향을 줄 수 있는 서열 내의 다른 부위는 엑손:인트론 접합(5' 또는 3'), 폴리 A 첨가 신호, 또는 RNA 폴리머라제 종결 신호이다. 서열은 더 분석되고 변형되어 TA 또는 GC 더블렛의 빈도를 감소시킨다. 더블렛 외에, 동일한 약 4 개 초과의 잔기를 갖는 G 또는 C 서열 블록이 서열의 전사에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 이 블록은 또한 제1 또는 제2 선택의 코돈 등을 그 다음 바람직한 선택의 코돈으로 교체함으로써 변형된다.

박테리아 단백질을 코딩하는 식물 최적화 유전자(들)는 약 63 %의 제1 선택 코돈, 약 22 % 내지 약 37 %의 제2 선택 코돈, 및 약 15 % 내지 약 0 %의 제3 또는 제4 선택 코돈을 포함하는 것이 바람직하며, 여기서 전체 백분율은 100 %이다. 가장 바람직한 식물 최적화 유전자(들)는 약 63 %의 제1 선택 코돈, 적어도 약 22 %의 제2 선택 코돈, 약 7.5 %의 제3 선택 코돈, 및 약 7.5 %의 제4 선택 코돈을 포함하고, 여기서 전체 백분율은 100 %이다. 상술한 방법은 통상의 기술자가 특정 식물에 대해 외래의 것인 유전자(들)를 변형할 수 있게 하여, 유전자는 식물에서 최적으로 발현된다. 방법은 또한 PCT 출원 WO 97/13402에 더 나타나있다.

따라서, 박테리아 단백질을 코딩하는 식물 최적화 유전자를 설계하기 위하여, DNA 서열은 특정 식물 또는 식물들에 대한 유전자 서열에서 만든 코돈 바이어스 표로부터 확립된 반복 유전자 코드를 이용하여 상기 단백질의 아미노산 서열을 코딩하도록 설계된다. 얻은 DNA 서열은 더 높은 코돈 다양성 정도, 바람직한 염기 조성을 가지며, 전략적으로 위치한 제한 효소 인식 부위를 포함할 수 있고, 유전자의 전사 또는 생성물 mRNA의 번역에 간섭할 수 있는 서열이 결핍될 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질/유전자와 기능적으로 동등한 합성 유전자가 식물을 포함하여, 숙주를 형질전환하는 데 사용될 수 있다. 합성 유전자의 생산에 관한 추가의 안내를 예를 들면 미국 특허 번호 5,380,831에서 찾을 수 있다.

AAD-12 식물 재조립(Rebuild) 분석: 천연 AAD-12 코딩 영역의 DNA 서열(서열 1)의 876 개의 염기 쌍(bp)의 집중적인 분석은 최적의 식물 발현에 치명적인 것으로 생각되는 몇몇의 서열 모티프뿐만 아니라 비최적의 코돈 조성의 존재를 밝혀냈다. 서열 1에 의해 코딩된 단백질(AAD-12)은 서열 2로 나타냈다. 외떡잎뿐만 아니라 쌍떡잎에서의 재조합 단백질의 생산을 개선하기 위하여, 단백질(서열 4)을 코딩하는 "식물-최적화" DNA 서열 AAD-12(v1)(서열 3)을 개발했으며, 이는 제2 위치(서열 4에서 밑줄처리함)에 알라닌 잔기를 첨가한 것을 제외하고는 천연 서열 2와 동일하다. 추가의 알라닌 코돈(GCT; 서열 3에서 밑줄처리함)은 ATG 번역 출발 코돈을 스패닝(spanning)하는 NcoI 제한 효소 인식 부위(CCATGG)의 일부를 코딩한다. 따라서, 이는 번역 개시를 최적화하기 위하여 ATG 출발 코돈을 둘러싸는 서열 컨텍스트를 개선하면서 후속적인 클로닝 조작을 촉진하는 두가지 목적을 수행한다. 천연 및 식물-최적화(v1) 코딩 영역에 의해 코딩된 단백질은 아미노산 번호 2에서만 차이가 나고 99.3 % 동일하다. 반면, 코딩 영역의 천연 및 식물-최적화(v1) DNA 서열은 단지 79.7 %만이 동일하다.

표 4는 천연(열 A 및 D) 및 식물-최적화 서열(열 B 및 E)의 코돈 조성물들의 차이를 나타내며 이론적인 식물-최적화 서열(열 C 및 F)에 대한 비교를 가능하게 한다.

표 4의 시험으로부터, 천연 및 식물-최적화 코딩 영역은, 거의 동일한 단백질을 코딩하지만 서로 상당히 다르다는 것이 분명하다. 식물-최적화 버전(v1)은 AAD-12 단백질을 코딩하는 이론적인 식물-최적화 코딩 영역의 코돈 조성을 거의 모방한다.

E. 콜라이 발현을 위한 재조립: 에스캐리키아 콜라이의 특별히 유전자조작된 균주 및 관련된 벡터 시스템은 흔히 생화학 및 분석적 연구를 위한 비교적 다량의 단백질을 생산하기 위해 사용된다. 때로, 원하는 단백질을 코딩하는 천연 유전자는 E. 콜라이에서 높은 수준의 발현에 잘 맞지는 않지만, 유전자를 위한 기원 생물체는 다른 박테리아 속일 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 경우, E. 콜라이에서의 발현에 더 적합하게 하기 위하여 유전자의 단백질 코딩 영역을 개량하는 것이 가능하고 바람직하다. E. 콜라이 클래스 II 유전자는 E. 콜라이 세포의 기하급수적 성장 단계 동안 고도로 및 계속적으로 발현된 것으로 정의된다(문헌[Henaut, A. and Danchin, A. (1996) in Escherichia coli and Salmonella typhimurium cellular and molecular biology, vol. 2, pp. 2047-2066. Neidhardt, F., Curtiss III, R., Ingraham, J., Lin, E., Low, B., Magasanik, B., Reznikoff, W., Riley, M., Schaechter, M. and Umbarger, H. (eds.) American Society for Microbiology, Washington, D.C.]). E. 콜라이 클래스 II 유전자의 코딩 영역의 코돈 조성의 시험을 통하여, 이러한 E. 콜라이-클래스 II 유전자 코딩 영역에 대한 평균 코돈 조성을 고안할 수 있다.

클래스 II 유전자의 것을 모방하는 평균 코돈 조성을 갖는 단백질 코딩 영역은 E. 콜라이의 기하급수적 성장 단계 동안 발현에서 선호될 것이라고 생각된다. 이러한 지침을 사용하여, AAD-12 단백질(서열 4)을 코딩하는 신규한 DNA 서열(상술한 바와 같이 제2 위치에 추가의 알라닌을 포함)은 E. 콜라이 클래스 II 유전자 코딩 영역의 평균 코돈 조성에 따라 설계되었다. 설계가 오직 코돈 조성에만 기초한 초기 서열은 E. 콜라이 발현 벡터 내로 클로닝하기에 적합한 특정 제한 효소 인식 서열을 포함하도록 더 유전자조작되었다. 16S 리보솜 RNA(L e. 샤인 달가르노(Shine Dalgarno) 서열)의 3' 말단에 상동성인 인트라제닉 서열과 같이, 유해한 서열 특징, 예컨대 매우 안정한 스템루프 구조는 피했다. E. 콜라이-최적화 서열(v2)은 서열 5로 개시되어 있으며 서열 4에서 개시된 단백질을 코딩한다.

천연 및 E. 콜라이-최적화(v2) DNA 서열은 84.0 % 동일하지만, 식물-최적화 (v1) 및 E. 콜라이-최적화(v2) DNA 서열은 76.0 % 동일하다. 표 5는 천연 AAD-12 코딩 영역(열 A 및 D), E. 콜라이에서의 발현에 최적화된 AAD-12 코딩 영역(v2; 열 B 및 E)의 코돈 조성, 및 E. 콜라이 클래스 II 유전자의 최적 코돈 조성을 갖는 AAD-12 단백질에 대한 이론적 코딩 영역(열 C 및 F)의 코돈 조성을 나타낸다.

표 6의 시험으로부터, 천연 및 E. 콜라이-최적화 코딩 영역은, 거의 동일한 단백질을 코딩하지만 서로 상당히 다르다는 것이 분명하다. E. 콜라이-최적화 버전(v2)은 AAD-12 단백질을 코딩하는 이론적인 E. 콜라이-최적화 코딩 영역의 코돈 조성을 거의 모방한다.

글리포세이트 내성을 부여하는 돌연변이를 갖는 대두 EPSPS를 코딩하는 대두-코돈-바이어스된 DNA 서열의 설계. 이 실시예는 돌연변이된 대두 5-에놀피루보일시키메이트 3-포스페이트 신타제(EPSPS)를 코딩하지만 대두 세포에서의 발현에 최적화된 신규한 DNA 서열의 설계를 교시한다. 삼중으로 돌연변이된 대두 EPSPS의 아미노산 서열은 WO 2004/009761의 서열 5에 개시되어 있다. 이렇게 개시된 서열에서의 돌연변이된 아미노산은 잔기 183(이소류신으로 대체된 천연 단백질의 트레오닌), 잔기 186(리신으로 대체된 천연 단백질의 아르기닌), 및 잔기 187(세린으로 대체된 천연 단백질의 프롤린)에 있다. 따라서, WO 2004/009761의 서열 5의 치환된 아미노산을 적절한 위치에서 천연 아미노산으로 대체함으로써 천연 대두 EPSPS 단백질의 아미노산 서열을 도출할 수 있다. 이러한 천연 단백질 서열은 PCT/US2005/014737(2005년 5월 2일자로 출원됨)의 서열 20에 개시되어 있다. 잔기 183(이소류신으로 대체된 천연 단백질의 트레오닌), 및 잔기 187(세린으로 대체된 천연 단백질의 프롤린)에서 돌연변이를 포함하는 이중으로 돌연변이된 대두 EPSPS 단백질 서열은 PCT/US2005/014737의 서열 21로서 개시되어 있다.

362,096 개의 코돈(약 870 개의 코딩 서열)으로부터 계산된 대두(글리신 맥스) 단백질 코딩 서열에 대한 코돈 사용 표는 "kazusa.or.jp/codon" 월드 와이드 웹 사이트에서 얻었다. 이 데이터는 표 6에 나타낸 바와 같이 재구성되었다. 표 6의 열 D 및 H는 대두 유전자의 단백질 코딩 영역에서 발견되는 바와 같이 각 아미노산에 대한 동의 코돈의 분포(아미노산에 대한 모든 코돈에 대한 사용 %로 나타냄)를 나타낸다. 일부 아미노산(아미노산은 1, 2, 3, 4, 또는 6 개의 코돈에 의해 열거될 수 있음)에 대한 일부 동의 코돈이 대두 단백질 코딩 영역에서 비교적 드물게 존재한다는 것은 분명하다(예를 들어 알라닌을 열거하기 위한 GCG와 GCT 코돈의 사용을 비교).

바이어스된 대두 코돈 사용 표는 표 6의 데이터로부터 계산되었다. 특정 아미노산에 대한 총 발생의 약 10 % 미만의 대두 유전자에서 발견된 코돈은 무시되었다. 아미노산에 대한, 나머지 코돈 선택의 분포를 균형시키기 위하여, 각 코돈에 대해 가중 평균 표현을, 식

C1의 가중 % =1/(%C1 + %C2 + %C3 + 기타 등등) x %C1 x 100

을 사용하여 계산했고, 여기서 C1은 문제의 코돈이고, C2, C3, 기타 등등은 나머지 동의 코돈을 나타내고 관련 코돈에 대한 % 값은 표 6의 열 D 및 H로부터 취한다(굵은 글자의 드문 코돈 값은 무시).

각 코돈에 대한 가중 % 값은 표 6의 열 C 및 G에 주어진다. TGA는 번역 터미네이터로서 임의 선택되었다. 따라서 바이어스된 코돈 사용 빈도는 옵트진(OptGene)™ 유전자 설계 프로그램(인디애나주 인디애나폴리스 소재의 오시멈 바이오솔루션스 엘엘씨(Ocimum Biosolutions LLC))에 의한 사용을 위해 특수 유전자 코드 표에 입력되었다.

이중으로 돌연변이된 EPSPS 단백질을 코딩하는 대두-최적화 DNA 서열을 유도하기 위하여, PCT/US2005/014737의 서열 21의 단백질 서열이 상기에서 유래된 대두-바이어스된 유전자 코드를 사용한 옵트진™ 프로그램에 의해 역-번역되었다. 이렇게 하여 유래된 초기 DNA 서열은 코돈 변화를 상쇄시킴으로써(코돈에 대한 전체 가중 평균 표현을 유지하면서) 변형되어, 인접한 코돈들 간의 CG 및 TA 더블렛의 수를 감소시키고, 인접한 코돈들 간의 CT 및 TG 더블렛의 수를 증가시키고, 매우 안정된 가닥내(intrastrand) 이차 구조를 제거하고, 제한 효소 인식 부위를 제거 또는 첨가하고, 유전자조작된 유전자의 발현 또는 클로닝 조작에 해로울 수 있는 다른 서열을 제거했다. 서열의 추가 정제는 잠재적 식물 인트론 스플라이스 부위, A/T 또는 C/G 잔기의 롱 런, 및 식물 세포의 코딩 영역의 RNA 안정성, 전사, 또는 번역을 방해할 수 있는 다른 모티프를 제거하기 위해 이루어졌다. 다른 변화는 긴 내부 오픈 리딩 프레임(+1 외의 프레임)을 제거하기 위하여 이루어졌다. 이러한 변화는 모두 상술한 대두-바이어스된 코돈 조성을 보유하는 제약 내에서, 그리고 PCT/US2005/014737의 서열 21에 개시된 아미노산 서열을 보존하면서 이루어졌다.

서열 21의 EPSPS 단백질을 코딩하는 대두-바이어스된 DNA 서열은 PCT/US2005/014737의 서열 22의 염기 1-1575로 개시되어 있다. PCT/US2005/014737의 서열 22를 포함하는 DNA 단편의 합성은 상용 공급자(텍사스주 휴스톤 소재의 피코스크립트(PicoScript))에 의해 수행되었다.

실시예 3

발현 및 형질전환 벡터의 클로닝

E. 콜라이 pET 발현 벡터의 구축: 추가 클로닝 링커(Xba 1, Xho 1)가 첨가된 부위에 대응하는 제한 효소를 사용하여, AAD-12(v2)는 피코스크립트 벡터에서 절단되었고 pET280 스트렙토마이신/스펙티노마이신 저항성 벡터 내로 결찰되었다. 결찰된 생성물은 이어서 TOP10F' E. 콜라이로 형질전환되었고, 루리아 브로스 +50 ㎍/ml 스트렙토마이신 & 스펙티노마이신(LB S/S) 한천 플레이트 상에서 평판배양되었다.

AAD-12(v2): pET280와 pCR2.1: pET280 결찰을 구별하기 위하여 약 20 개의 분리된 콜로니를 6 ml의 LB-S/S로 선발했고 교반하면서 4 시간 동안 37 ℃에서 성장시켰다. 이어서 각 배양물을 LB + 카나마이신 50 ㎍/ml 플레이트 상으로 뿌리고(spotted), 이를 37 ℃에서 밤새 인큐베이팅했다. LB-K 상에서 성장한 콜로니는 결찰된 pCR2.1 벡터를 갖는 것으로 가정되었고 폐기되었다. 플라스미드는 앞서와 같이 나머지 배양물로부터 분리되었고, XbaI/XhoI에 의한 소화에 있어 정확성을 확인하였다. 최종 발현 구축물에 명칭 pDAB3222을 부여했다.

슈도모나스 발현 벡터의 구축: AAD-12(v2) 오픈 리딩 프레임은 XbaI-XhoI 단편으로서, 변형된 pET 발현 벡터(노바겐) "pET280 S/S"로 초기에 클로닝되었다. 얻은 플라스미드 pDAB725를 제한 효소 소화 및 서열화 반응으로 확인하였다. pDAB725로부터의 AAD-12(v2) 오픈 리딩 프레임은 XbaI-XhoI 단편으로서 슈도모나스 발현 벡터, pMYC1803로 전달되었다. 양성의 콜로니는 제한 효소 소화를 통하여 확인되었다. 완성된 구축물 pDAB739는 MB217 및 MB324 슈도모나스 발현 균주로 형질전환되었다.

이원 벡터의 완성: 식물 최적화 유전자 AAD-12(v1)를 피코스크립트로부터 받았고(유전자 재조립 설계가 완료되었고(상기 참조) 구축을 위해 피코스크립트로 아웃소싱되었음), 서열(서열 3)은 예상된 서열 중 변질이 존재하지 않음을 확인하기 위하여 내부적으로 확인되었다. 서열화 반응은 앞서와 같이 베크만 쿨터(Beckman Coulter) "Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit" 시약을 사용하여 M13 포워드(서열 6) 및 M13 리버스(서열 7) 프라이머에 의해 수행되었다. 서열 데이터를 분석했고, 결과는 식물 최적화 AAD-12(v1) DNA 서열에 이형이 존재하지 않음을 나타냈다. AAD-12(v1) 유전자는 Nco I-Sac I 단편으로서 pDAB726으로 클로닝되었다. 얻은 구축물은 pDAB723로 명명되며, 이는 [AtUbi10 프로모터: Nt OSM 5'UTR: AAD-12(v1): Nt OSM3'UTR: ORF1 폴리A 3'UTR](PvuII 및 Not I 제한 소화로 확인됨)를 포함한다. 이어서, 설명된 카세트를 포함하는 Not I-Not I 단편이 이원 벡터 pDAB3038의 Not I 부위로 클로닝되었다. 얻은 이원 벡터, pDAB724는(다음의 카세트를 포함:[AtUbi10 프로모터: Nt OSM5'UTR: AAD-12(v1): Nt OSM 3'UTR: ORF1 polyA 3'UTR: CsVMV 프로모터: PAT: ORF25/26 3'UTR])는 정확한 배향의 확인을 위하여 제한 소화(Bam HI, Nco I, Not I, SacI, 및 Xmn I를 사용)되었다. 확인된 완성된 구축물(pDAB724)는 아그로박테리움으로의 형질전환에 사용되었다.

추가적인 형질전환 구축물의 클로닝: 적절한 식물 종으로의 형질전환을 위해 생성된 모든 다른 구축물은 본원에서 앞서 설명한 것과 유사한 과정 및 다른 표준 분자 클로닝 방법(문헌[Maniatis et al., 1982])을 사용하여 구축되었다.

실시예 4

아라비돕시스로의 형질전환 및 선별

아라비돕시스 탈리아나 성장 조건: 야생형 아라비돕시스 종자를 0.1 % 아가로오스(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 코.(Sigma Chemical Co.)) 용액에 현탁시켰다. 현탁된 종자를 휴면 요건을 완료하고 동시발생 종자 발아(계층화)를 보장하기 위하여 4 ℃에서 2 일간 저장했다.

선샤인 믹스(Sunshine Mix) LP5(워싱톤주 벨뷰 소재의 선 그로 홀티컬쳐(Sun Gro Horticulture))를 미세한 질석으로 덮었고 젖을 때까지 호아글랜드(Hoagland) 용액으로 지하관개했다. 토양 혼합물을 24 시간 동안 배수되도록 했다. 계층화된 종자를 질석에 파종하고 습도 유지용 돔(캐나다 온타리오 브라말레아 소재의 코드 프로덕츠(KORD Products))으로 7 일간 덮었다.

종자가 발아했으며, 식물은 콘비론(Conviron)(모델 CMP4030 및 CMP3244, 캐나다 마니토바 위니페그 소재의 콘트롤드 엔바이런먼츠 리미티드(Controlled Environments Limited))에서 장일 조건(16 시간 명기/8 시간 암기)으로 빛 세기 120-150 μmol/m²초에서 일정 온도(22 ℃) 및 습도(40-50 %) 하에서 성장했다. 식물을 초기에 호아글랜드 용액으로 적셨고 그 다음에는 토양을 촉촉하지만 젖지 않게 유지하기 위하여 탈이온수로 적셨다.

아그로박테리움 형질전환: 스트리킹된 DH5α 콜로니를 포함하는 에리트로마이신(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 코.)(200 mg/L) 또는 스펙티노마이신(100 mg/L)이 있는 LB + 한천 플레이트를 사용하여 4 ml 미니 프렙 배양물(액체 LB + 에리트로마이신)에 접종하기 위한 콜로니를 제공하였다. 배양물을 일정하게 교반하면서 밤새 37 ℃에서 인큐베이팅했다. 제조사의 지시에 따라 수행된 퀴아젠(Qiagen)(캘리포니아 발렌시아) 스핀 미니 프렙을 사용하여 플라스미드 DNA를 정제했다.

일렉트로-컴피턴트(Electro-competent) 아그로박테리움 투메파시엔스(균주 Z707, EHA101, 및 LBA4404) 세포를 문헌[Weigel and Glazebrook (2002)]의 프로토콜을 사용하여 제조했다. 컴피턴트 아그로박테리움 세포를 문헌[Weigel and Glazebrook (2002)]에서 채택한 전기천공법을 사용하여 형질전환했다. 50 μl의 컴피턴트 아그로 세포를 얼음 상에서 해동시켰고 10-25 ng의 원하는 플라스미드를 세포에 첨가했다. DNA와 세포 혼합물을 사전 냉각된 전기천공 큐벳(2 mm)에 첨가했다. 에펜도르프(Eppendorf) 전기천공기 2510을 다음의 조건으로 형질전환에 사용했다, 전압: 2.4 kV, 펄스 길이: 5 msec.

전기천공 후, 1 ml의 YEP 브로스(리터당: 10 g의 효모 추출물, 10 g의 박토-펩톤, 5 g의 NaCl)을 큐벳에 첨가했고, 세포-YEP 현탁액을 15 ml 배양 튜브로 옮겼다. 세포를 4 시간 동안 일정하게 교반하면서 수조에서 28 ℃로 인큐베이팅했다. 인큐베이션 후, 배양물을 에리트로마이신(200 mg/L) 또는 스펙티노마이신(100 mg/L) 및 스트렙토마이신(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 코.)(250 mg/L)가 있는 YEP + 한천 상에서 평판배양했다. 플레이트를 2-4 일간 28 ℃에서 인큐베이팅했다.

콜로니를 선별하고 에리트로마이신(200 mg/L) 또는 스펙티노마이신(100 mg/L) 및 스트렙토마이신(250 mg/L) 플레이트가 있는 새로운 YEP + 한천 상으로 스트리킹하고 28 ℃에서 1-3 일간 인큐베이팅했다. 벡터 특이적 프라이머를 사용함으로써 유전자 삽입의 존재를 확인하기 위한 PCR 분석을 위해 콜로니를 선별했다. 제조사의 지시에 따라 수행된 퀴아젠 스핀 미니 프렙을 사용하여 다음 예외사항으로, 선별된 아그로박테리움 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 정제했다: 15 ml 밤샘 미니 프렙 배양물(액체 YEP + 에리트로마이신(200 ㎎/L) 또는 스펙티노마이신(100 ㎎/L) 및 스트렙토마이신(250 ㎎/L))의 4 ml의 분취량을 DNA 정제에 사용했음. 퀴아젠 스핀 미니 프렙 DNA의 사용에 대한 대안은 10 μl의 물에 현탁된 형질전환된 아그로박테리움 세포를 100 ℃에서 5 분간 용해하는 것이다. 아그로박테리움 형질전환에 사용된 이원 벡터로부터의 플라스미드 DNA는 대조군으로서 포함되었다. PCR 반응을 타카라 마이러스 바이오 인크.(Takara Mirus Bio Inc.)(위스콘신주 매디슨)의 Taq DNA 폴리머라제를, 제조사의 지시에 따라 0.5 x 농도로 사용하여 완료하였다. PCR 반응은 다음의 조건으로 프로그래밍된 MJ 리서치 펠티에 써멀 사이클러(MJ Research Peltier Thermal Cycler)에서 수행되었다; 1) 94 ℃, 3 분간, 2) 94 ℃, 45 초간, 3) 55 ℃, 30 초간, 4) 72 ℃, 1 분간, 29 사이클, 이어서 72 ℃로 10 분간 1 사이클. 반응은 사이클링 후 4 ℃로 유지되었다. 증폭은 1 % 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분석되었고 에티듐 브로미드 염색에 의해 시각화되었다. 그의 PCR 생성물이 플라스미드 대조군과 동일한 콜로니가 선별되었다.

아라비돕시스 형질전환: 아라비돕시스는 플로랄 담금법(floral dip method)을 사용하여 형질전환되었다. 에리트로마이신(200 ㎎/L) 또는 스펙티노마이신(100 ㎎/L) 및 스트렙토마이신(250 ㎎/L)를 포함하는 YEP 브로스의 하나 이상의 15-30 ml 사전 배양물에 접종하기 위하여 선별된 콜로니가 사용되었다. 배양물(들)은 220 rpm으로 일정하게 교반하면서 28 ℃에서 밤새 인큐베이팅되었다. 에리트로마이신(200 ㎎/L) 또는 스펙티노마이신(100 ㎎/L) 및 스트렙토마이신(250 ㎎/L)을 포함하는 YEP 브로스의 2 개의 500 ml 배양물에 접종하기 위하여 각 사전 배양물이 사용되었고, 배양물은 일정하게 교반하면서 28 ℃에서 밤새 인큐베이팅되었다. 이어서 세포는 실온에서 10 분간 약 8700 x g으로 펠릿화되었고, 얻은 상청액을 폐기했다. ½ x 무라시게(Murashige) 및 스쿠그(Skoog) 염/갬보르그(Gamborg) B5 비타민, 10 %(w/v) 수크로오스, 0.044 μM 벤질아미노 푸린(10 μl/DMSO 내의 1 ㎎/ml 스톡의 리터) 및 300 μl/실웨트(Silwet) L-77 리터를 포함하는 500 ml 침투 배지에서 세포 펠릿이 온화하게 재현탁되었다. 생후 약 1 개월의 식물을 15 초 동안 배지에 담궈, 최신 꽃이 확실히 잠기게 했다. 이어서 식물을 옆으로 눕히고 24 시간 동안 덮고(투명 또는 불투명하게), 이어서 물로 세척하고 세워 두었다. 식물은 22 ℃에서, 16-시간 명기/8-시간 암기 광주기로 성장했다. 담금 후 약 4 주째, 종자가 수확되었다.

형질전환된 식물의 선별: 새로 수확된 T1 종자[AAD-12(v1) 유전자]를 7 일간 실온에서 건조되도록 했다. T1 종자를 26.5 x 51-cm 발아 트레이에 파종했고(미네소타주 클리어워터 소재의 티.오. 플라스틱스 인크.(T.O. Plastics Inc.)), 각각은 40 ml의 0.1 % 아가로오스 용액에 미리 현탁되었고 휴면 요건을 완료하고 동시발생 종자 발아를 보장하기 위하여 4 ℃에서 2 일간 저장된 계층화된 T1 종자(약 10,000 개의 종자)의 200 mg 분취량을 받았다.

선샤인 믹스 LP5(워싱턴주 벨뷰 소재의 선 그로 홀티컬쳐 인크.)를 미세한 질석으로 덮었고 젖을 때까지 호아글랜드 용액으로 지하관개한 후, 중력 배수되도록 했다. 계층화된 종자의 각각의 40 ml 분취량을 피펫으로 질석 상에 골고루 파종했고, 습도 유지용 돔(캐나다 온타리오 브라말레아 소재의 코드 프로덕츠)으로 4-5 일간 덮었다. 발아후 글루포시네이트 분무를 사용한 초기 형질전환체 선별(동시형질전환된 PAT 유전자에 대한 선별) 1 일 전에 돔을 제거했다.

식재 후 7 일째(DAP: days after planting) 및 다시 11 DAP에, T1 식물(각각 자엽 및 2-4-1f 단계)에 0.2 % 리버티(Liberty) 제초제 용액 (200 g ai/L 글루포시네이트, 미주리주 캔자스 시티 소재의 바이엘 크롭 사이언시즈(Bayer Crop Sciences))을 10 ml/트레이(703 L/ha)의 분무 부피로 데빌비스(DeVilbiss) 압축 공기 분무 팁을 이용하여 분무함으로써 시용당 유효 비율 280 g ai/ha의 글루포시네이트를 전달하였다. 최종 분무 후 4-7 일째 생존식물(활발하게 성장하는 식물)을 확인하고, 화분용 배지(메트로 믹스(Metro Mix) 360)로 제조된 3 인치 화분으로 개별적으로 이식시켰다. 이식시킨 식물을 3-4 일 동안 습도 유지용 돔으로 덮어 놓고, 상기와 같이 22 ℃ 성장 챔버에 놓거나, 또는 온실로 직접 옮겨 놓았다. 이어서, 페녹시 옥신 제초제 저항성을 제공하는 AAD-12(v1)(식물 최적화 유전자)의 능력에 대한 시험의 적어도 1 일 전에 돔을 제거하고, 식물을 온실(22±5 ℃, 50±30 % RH, 14 h 명기: 10 암기, 최소 500 μE/m²s¹ 자연광 + 보충광)에서 재배하였다.

이어서 T1 식물을 다양한 비율의 2,4-D에 무작위로 배정하였다. 아라비돕시스에 대해, 민감성 식물을 의미있는 수준의 저항성을 갖는 것과 구별하기 위한 유효 시용량은 50 g ae/ha 2,4-D이다. 또한 증가된 비율을 시용하여 상대적인 저항성 수준을 결정했다(50, 200, 800, 또는 3200 g ae/ha).

모든 옥신 제초제 시용은 703 L/ha 분무 부피(0.4 ml 용액/3-인치 화분)를 시용하기 위하여 상기에 설명한 데빌비스 분무기를 사용하여 이루어졌거나, 또는 187 L/ha 분무 부피로 트랙 분무기로 시용되었다. 사용된 2,4-D는 DMSO에 용해되고 물에 희석된(1 % 미만의 DMSO 최종 농도) 공업용(미주리주 세인트 루이스의 시그마(Sigma)) 또는 상용 디메틸아민 염 제형(456 g ae/L, 미주리주 세인트 조셉 소재의 누팜(NuFarm))이었다. 사용된 디클로르프로프는 R-디클로르프로프(600 g ai/L, 에이에이치 마크스(AH Marks))의 칼륨 염으로서 상용으로 제형화되었다. 제초제 비율이 800 g ae/ha 이상으로 증가됨에 따라, 분무 용액의 pH는 과도하게 산성이 되어, 어리고 부드러운 아라비돕시스 식물의 잎을 태우고 제초제의 일차 영향의 평가를 복잡하게 한다. 200 mM HEPES 버퍼(pH 7.5) 내의 이러한 높은 비율의 제초제를 시용하는 것이 관행이 되었다.

일부 T1 개체는 페녹시 옥신 대신에 대안적인 상용 제초제를 겪었다. 관심있는 것 중 하나는 피리딜옥시아세테이트 옥신 제초제, 트리클로피르 및 플루오록시피르가 식물체 내에서 효과적으로 분해될 수 있는지 결정하는 것이었다. 제초제는 트랙 분무기를 사용하여 187 L/ha 분무 부피로 T1 식물에 시용되었다. 2,4-D DMA에 대해 내성을 나타낸 T1 식물은 T2 세대에서 더 입수되었다.

형질전환된 식물의 선별 결과: 제1 아라비돕시스 형질전환은 AAD-12(v1)(식물 최적화 유전자)를 사용하여 수행되었다. T1 형질전환체는 먼저 글루포시네이트 선별 방식을 사용하여 형질전환되지 않은 종자의 백그라운드로부터 선별되었다. 300,000 초과의 T1 종자가 스크리닝되고 316 개의 글루포시네이트 저항성 식물이 확인되었고(PAT 유전자), 이는 0.10 %의 형질전환/선별 빈도와 같았고, 이는 PAT +리버티가 선별에 사용된 구축물의 선별 빈도의 정상 범위 내에 있었다. 상기에서 선별된 T1 식물은 이어서 개별 화분으로 이식되었고 다양한 비율의 상용 아릴옥시알카노에이트 제초제로 분무되었다.

표 7은 아라비돕시스 T1 형질전환체에 2,4-D 저항성을 부여하기 위한 AAD-12(v1)과 대조군 유전자의 반응을 비교한다. 처리 후 2주째(WAT)의 시각적 손상률(%)로 반응을 나타낸다. 데이터는 손상을 거의 보이지 않거나, 전혀 보이지 않거나(< 20 %), 중간 정도의 손상을 보이거나(20-40 %), 심각한 손상을 보이는(> 40 %) 개체의 히스토그램으로서 제시되어 있다. 각 T1은 독립적인 형질전환 이벤트이기 때문에, 소정의 비율 내의 개별 T1 반응의 상당한 변화를 기대할 수 있다. 각 처리에 대한 산술 평균 및 표준 편차가 제공되어 있다. 개별 반응의 범위 또한 각 비율 및 형질전환에 대한 마지막 열에 표시되어 있다. PAT/Cry1F-형질전환된 아라비돕시스는 옥신-민감성 형질전환된 대조군의 역할을 했다. AAD-12(v1) 유전자는 개별 T1 아라비돕시스 식물에 대해 제초제 저항성을 부여했다. 소정의 처리 내에서 식물 반응 수준은 상당히 변했으며 각 식물이 독립적인 형질전환 이벤트를 나타낸다는 사실을 원인으로 할 수 있다.

중요한 점 가운데, 시험된 각각의 2,4-D 비율에서, 일부가 심하게 영향을 받는 동안 영향을 받지 않는 개체가 있었다. AAD-12(v1)으로 형질전환된 식물 대 야생형 또는 PAT/Cry1F-형질전환된 대조군 간의 상당한 차이를 간단히 입증하기 위한 비율에 따른 전체 집단 손상률 평균이 표 7에 제시되어 있다. 3,200 g ae/ha(또는 ~6 x 재배지 비율)까지의 상승된 비율에서, 손상률 수준이 더 크고 손상되지 않은 식물의 빈도가 더 낮은 경향이 있다. 또한 이러한 높은 비율에서, 분무 용액은 버퍼링되지 않는 한 매우 산성이 된다. 성장 챔버 내에서 대부분 성장한 아라비돕시스는 매우 얇은 큐티클을 가지며, 심하게 탄 효과는 이러한 상승된 비율에서 시험을 복잡하게 할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 많은 개체가 3,200 g ae/ha 2,4-D에서 거의 또는 전혀 손상되지 않고 생존했다.

표 8은 페녹시프로피온산, 디클로르프로프에 대한 T1 아라비돕시스의 유사하게 수행된 시용량 반응을 나타낸다. 데이터는 디클로르프로프의 제초제 활성(R-) 이성질체가 AAD-12(v1)에 적합한 기질로서 역할하지 않는 것을 보여준다. AAD-1이 상용으로 허용가능한 내성을 부여하기에 매우 충분하게 R-디클로르프로프를 대사할 것이라는 사실은 2 개의 유전자들을 나누는 한가지 구별되는 특징이다. (표 8). AAD-1 및 AAD-12는 각각 R- 및 S-특이적 α-케토글루타레이트 디옥시게나제로 여겨진다.

선별가능한 마커로서 AAD-12(v1): 선별제로서 2,4-D를 사용하여 선별가능한 마커로서 AAD-12(v1)를 사용하는 능력을 상기에서 설명한 바와 같이 형질전환된 아라비돕시스로 초기에 분석하였다. 약 50 개의 T₄ 세대 아라비돕시스 종자(AAD-12(v1)에 대해 동형접합성)를 약 5,000 개의 야생형(민감성) 종자에 스파이킹하였다. 여러 처리를 비교하였고, 각각의 트레이의 식물은 다음 처리 방식 중 하나로 1 또는 2 회의 시용 시기에 2,4-D를 받았다: 7 DAP, 11 DAP, 또는 7 이어서, 11 DAP. 모든 개체는 또한 동일한 형질전환 벡터 중에 PAT 유전자를 포함하기 때문에, 2,4-D로 선별되는 AAD-12를 글루포시네이트로 선별되는 PAT와 직접 비교할 수 있다.

상술한 바와 같이 데빌비스 분무 팁을 이용하여 처리를 시용시켰다. 식물은 17 DAP에서 저항성 또는 민감성인 것으로 확인되었다. 최적의 처리는 식재 후 7 및 11 일째(DAP) 75 g ae/ha 2,4-D로 시용되었고, 선별 빈도에 동일하게 효과적이었으며, 리버티 선별 방식보다 형질전환된 개체에 덜 제초제 손상을 일으켰다. 이 결과는 AAD-12(v1)가 형질전환된 아라비돕시스 집단에 대한 대안적 선별가능한 마커로서 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

유전가능성: 다양한 T1 이벤트를 자가 수분시켜 T2 종자를 생산하였다. 이 종자는 100 개의 무작위 T2 형제에 2,4-D(200 g ae/ha)를 시용함으로써 시험된 자손이었다. (187 L/ha의 시용 비율로 트랙 분무기를 이용하여) 분무 시용하기 이전에 각각의 개별 T2 식물을 7.5 cm² 화분에 이식시켰다. T1 패밀리(T2 식물) 중 75 %는 카이 제곱 분석에 의해 결정된 것과 같이(P > 0.05), 멘델의 유전 법칙(Mendelian inheritance)에 따라 우성으로 유전되는 단일 유전자좌에 대해, 예상된 3 개의 저항성:1 개의 민감성 모델로 분리되었다.

12 내지 20 개의 T2 개체(T3 종자)로부터 종자를 수집하였다. 8 개의 무작위로 선별던 T2 패밀리 각각으로부터의 25 개의 T3 형제는 상술한 바와 같이 시험된 자손이었다. 동형접합성(비분리 집단)으로 예상되는 T2 패밀리 중 약 1/3은 각 계통에서 확인되었다. 이 데이터는 AAD-12(v1)이 안정하게 통합되어 있으며, 멘델 방식으로 3 세대 이상으로까지 유전된다는 것을 나타낸다.

AAD-12 아라비돕시스에서의 추가적인 엽면 시용 제초제 저항성: 트랜스제닉 아라비돕시스에서 다른 아릴옥시알카노에이트 옥신 제초제에 대한 저항성을 제공하는 AAD-12(v1)의 능력은 다양한 기질의 엽면 시용에 의해 결정되었다. T2 세대 아라비돕시스 종자를 계층화했고 아라비돕시스와 매우 흡사하게 선별 트레이에 파종했다. PAT 및 곤충 저항성 유전자 Cry1F를 포함하는 형질전환된-대조군 계통을 유사한 방식으로 식재했다. 묘목을 온실 내의 개별적 3-인치 화분으로 옮겼다. 모든 식물은 트랙 분무기를 사용하여 187 L/ha로 분무되었다. 식물을 다양한 피리딜옥시아세테이트 제초제로 분무했다: 280-2240 g ae/ha 트리클로피르(갈론(Garlon) 3A, 다우 아그로사이언시즈) 및 2800-2240 g ae/ha 플루오록시피르(스타래인(Starane), 다우 아그로사이언시즈); 및 AAD-12 활성, 2,4-디클로로페놀(DCP, 시그마)로부터 생긴 2,4-D 대사물질(280-2240 g ae/ha의 2,4-D에 대한 몰당량으로, 공업용 DCP를 사용했음). 모든 시용은 수중에서 제형화되었다. 각각의 처리는 3-4 회 반복되었다. 식물을 처리 후 3 및 14 일째 평가했다.

트랜스제닉 비-AAD-12 대조군 아라비돕시스(Pat/Cry1F)에 대해서 2,4-D 대사물질, 2,4-디클로로페놀(DCP)는 영향을 미치지 않았다. 또한 AAD-12-형질전환된 식물은 형질전환된 비저항성 대조군에서 본 트리클로피르 및 플루오록시피르 제초제 손상으로부터 분명하게 보호되었다(표 9 참조). 이러한 결과는 아라비돕시스 내의 AAD-12(v1)가 시험된 피리딜옥시아세트산 옥신에 대한 저항성을 제공한다는 것을 확인시켜준다. 이는 피리딜옥시아세트산 제초제에 대해 상당한 활성을 갖는 효소에 대한 첫번째 보고이다. 유사한 활성을 갖는 다른 2,4-D 분해 효소는 보고된 적이 없다.

AAD-12(v1) 아라비돕시스의 분자 분석: PAT 유전자 카피 수 분석을 위한 인베이더 분석법(Invader Assay)(제3 웨이브 아그비오 키트 과정(Third Wave Agbio Kit Procedures)의 방법)을 다수의 AAD-12(v1) 동형접합성 계통에 대해 퀴아젠 DNeasy 키트에서 얻은 전체 DNA로 수행하여 PAT 및 AAD-12(v1)를 포함하는 식물 형질전환 유닛의 안정한 통합을 결정했다. 분석은 이러한 유전자가 동일한 플라스미드 상에 포함된 것과 같이 이러한 유전자의 직접 물리적 연결을 가정했다.

결과는 분석된 모든 2,4-D 저항성 식물이 PAT(그리고 이에 의해 추론하면 AAD-12(v1))를 포함한다는 것을 보여주었다. 카피 수 분석은 1 내지 5 카피 범위의 총 삽입을 나타냈다. 이는 역시 효소의 존재가 모든 시판되는 페녹시아세트산 및 피리딜옥시아세트산에 대한 상당히 높은 수준의 저항성을 가져온다는 것을 나타내는 AAD-12(v1) 단백질 발현 데이터와 연관성이 있다.

AAD-12(v1) 및 글리포세이트 저항성 유전자의 분자 스택으로 형질전환된 아라비돕시스: 추정(putative) 글리포세이트 저항성 형질을 코딩하는 pDAB3759 플라스미드(AAD-12(v1) + EPSPS)를 포함하는 상술한 바와 같은 T1 아라비돕시스 종자가 생산되었다. T1 형질전환체는 설명한 바와 같이 선별가능한 마커로서 AAD-12(v1)를 사용하여 선별되었다. T1 식물(개별적으로 형질전환된 이벤트)은 제1 선별 시도로부터 회수되었고 앞서 설명한 바와 같이 온실 내의 3-인치 화분으로 옮겨졌다. 또한 3 개의 상이한 대조군 아라비돕시스 계통을 시험하였다: 야생형 콜럼비아-0, AAD-12(v1) + PAT T4 동형접합성 계통(pDAB724-형질전환됨), 및 PAT + Cry1F 동형접합성 계통(형질전환된 대조군). pDAB3759 및 pDAB724 형질전환된 식물을 2,4-D 내성을 위한 묘? 단계에서 사전 선별하였다. 이식 후 4 일째, 앞서 설명한 바와 같이 트랙 분무기를 사용하여 수중의 0, 26.25, 105, 420, 또는 1680 g ae/ha 글리포세이트(글리포맥스 플러스(Glyphomax Plus), 다우 아그로사이언시즈)로 엽면 처리를 하기 위해 식물을 골고루 나누었다. 모든 처리를 5 내지 20 회 반복하였다. 식물을 처리 후 7 및 14 일째 평가했다.

초기 저항성 평가는 2,4-D에 대해 내성인 식물이 3 개의 대조군 계통의 반응과 비교하여 글리포세이트에 다음으로 내성이었다는 것을 나타내었다. 이러한 결과는 상이한 작용 모드를 갖는 2 개의 제초제에 대한 저항성을 식물에 부여할 수 있다는 것을 나타내며, 이는 2,4-D 및 글리포세이트 내성을 포함하고, 이는 발아후 두 제초제의 시용을 가능하게 한다. 추가적으로, AAD-12 + 2,4-D는 진정 저항성 선별을 위한 선별가능한 마커로서 효과적으로 사용되었다.

제초제 내성의 더 넓은 스펙트럼을 제공하기 위하여 AAD-1과 유전적으로 스택킹된 AAD-12 아라비돕시스: AAD-12(v1)(pDAB724) 및 AAD-1(v3)(pDAB721) 식물을 상반교잡했으며 F1 종자를 수집했다. 8 개의 F1 종자를 식재하고 종자를 생산하기 위하여 성장하도록 했다. 조직 샘플을 8 개의 F1 식물로부터 취했으며 둘 모두의 유전자의 존재를 확인하기 위하여 웨스턴 분석을 거쳤다. 시험한 모든 8 개의 식물이 AAD-1 및 AAD-12 단백질 모두를 발현한 것으로 결론되었다. 종자는 벌크화되었고(bulked) 식재 전 일주일 동안 건조되도록 했다.

100 개의 F2 종자를 파종했고 280 g ai/ha 글루포시네이트를 시용했다. 96 개의 F2 식물은 글루포시네이트 저항성에 대해 2 개의 독립적으로 분류한 유전자좌에 대한 예상되는 분리 양을 피팅하는 글루포시네이트 선별에서 생존했다(15 R:1 S). 글루포시네이트 저항성 식물은 이어서 다른 시험을 위해 사용된 것과 동일한 분무 요법 하에서 식물에 시용된 560 g ae/ha R-디클로르프로프 + 560 g ae/ha 트리클로피르로 처리되었다. 식물을 3 및 14 DAT에 평가했다. 글루포시네이트 선별에서 생존한 96 개의 식물 중 63 개가 또한 제초제 시용에서 생존했다. 이러한 데이터는 각 유전자가 옥신 제초제(R-디클로프로프 또는 트리클로피르) 중 오직 하나에 대한 저항성을 제공하는 2 개의 독립적으로 분류되는 우성 형질의 예상되는 분리 패턴(9R:6S)과 일치한다. 결과는 AAD-12(pDAB724)가 AAD-1(pDAB721)가 성공적으로 스택킹될 수 있고, 따라서 관심 작물에 시용될 수 있는 제초제의 스펙트럼을 증가시킨다는 것을 나타낸다[각각 (2,4-D+R-디클로르프로프) 및 (2,4-D+플루오록시피르+트리클로피르)]. 이는 2 개의 개별 2,4-D 저항성 유전자의 종래 스택킹을 통하여 매우 민감성인 종에 2,4-D 내성을 부여하는 데 유용할 수 있다. 추가적으로, 어느 하나의 유전자가 독립 형질전환 활성을 통하여 제3 및 제4 관심 유전자를 위한 선별가능한 마커로서 사용되었을 경우, 각 유전자 쌍은 종래의 육종 활동을 통하여 합쳐질 수 있고, 이어서 AAD-1와 AAD-12 효소 간에 배타적인 제초제를 사용한 쌍의 분무를 통하여 F1 세대에서 선별될 수 있다(각각 AAD-1 및 AAD-12에 대한 R-디클로르프로프 및 트리클로피르에서 나타난 바와 같음).

또한 다른 AAD 스택은 본 발명의 범위 내이다. 본원의 다른 부분에서 논의한 tfdA 단백질(문헌[Streber et al.])은 예를 들면 본 발명의 트랜스제닉 식물에 제초제 저항성의 스펙트럼을 부여하기 위하여 본 발명의 AAD-12 유전자와 함께 사용될 수 있다.

실시예 5

이마제타피르 선별을 사용한 옥수수의 휘스커-매개 형질전환

AAD-12(v1)의 클로닝: AAD-12(v1) 유전자는 Nco1/Sac1 단편으로서 중간 백터 pDAB3283으로부터 절단되었다. 이는 ZmUbi1 외떡잎식물 프로모터를 포함하는 유사하게 절단된 pDAB3403 벡터 내로 방향성있게 결찰되었다. 2 개의 단편은 T4 DNA 리가제를 사용하여 함께 결찰되었고 DH5α 세포로 형질전환되었다. 미니프렙(miniprep)은 퀴아젠의 QIA 스핀 미니 프렙 키트를 사용하여 얻은 콜로니에 대하여 수행되었고, 배향을 확인하기 위해 콜로니를 소화시켰다. 이러한 제1 중간 구축물(pDAB4100)은 ZmUbi1:AAD-12(v1) 카세트를 포함한다. 이러한 구축물은 Not1 및 Pvu1로 소화되어 유전자 카세트를 유리시키고 원치않는 주쇄를 소화했다. 이는 벼 액틴 프로모터 OsAct1에 의해 구동되는 AHAS 선별가능한 마커를 포함하는 Not1 절단 pDAB2212에 결찰되었다. 최종 구축물을 pDAB4101 또는 pDAS1863으로 명명했으며, ZmUbi1/AAD-12(v1)/ZmPer5::OsAct1/AHAS/LZmLip를 포함한다.

캘러스/현탁액 개시: 캘러스 배양 개시를 위한 미성숙 배를 얻기 위하여, 온실-성장한 Hi-II 부모 A와 B 간의 F1 교잡(문헌[Armstrong et al. 1991])을 수행하였다. 배의 크기가 1.0-1.2 mm였을 때(수분후 약 9-10 일), 이삭을 수확하고 리퀴-녹스(Liqui-Nox)® 비누를 문질러 표면 살균하고, 70 % 에탄올에 2-3 분간 침지시킨 후 20 % 상용 표백제(0.1 % 소듐 히포클로라이트)에 30 분간 침지시켰다.

이삭을 살균한 증류수에서 세척했고, 미성숙 접합성 배를 무균으로 잘라내고 15Ag10 배지(N6 배지(문헌[Chu et al., 1975]), 1.0 mg/L 2,4-D, 20 g/L 수크로오스, 100 mg/L 카제인 가수분해물(효소 소화), 25 mM L-프롤린, 10 mg/L AgNO₃, 2.5 g/L 겔라이트(Gelrite), pH 5.8) 상에서 2-3 주간, 배반이 배지로부터 반대쪽을 향하게 배양했다. 적절한 모폴로지를 나타내는 조직(문헌[Welter et al., 1995])을 약 6 주 동안 새로운 15Ag10 배지 상에 격주 간격으로 선별적으로 옮긴 후, 4 배지(N6 배지, 1.0 mg/L 2,4-D, 20 g/L 수크로오스, 100 mg/L 카제인 가수분해물(효소 소화), 6 mM L-프롤린, 2.5 g/L 겔라이트, pH 5.8)로 약 2 달간 격주 간격으로 옮겼다.

배발생 현탁 배양을 개시하기 위하여, 단일 배에서 발생한 캘러스 조직의 약 3 ml의 팩킹된 세포 부피(PCV)를 약 30 ml의 H9CP + 액체 배지(MS 기초 염 혼합물(문헌[Murashige and Skoog, 1962]), 10-배 미만의 니코틴산 및 5-배 초과의 티아민-HCl을 포함하는 변형된 MS 비타민, 2.0 mg/L 2,4-D, 2.0 mg/L α-나프탈렌아세트산(NAA), 30 g/L 수크로오스, 200 mg/L 카제인 가수분해물(산 소화), 100 mg/L 미오-이노시톨, 6 mM L-프롤린, 5 % v/v 코코넛 워터(계대배양 직전에 첨가함), pH 6.0)에 첨가했다. 현탁 배양은 125 rpm에서 28 ℃로 설정된 온도-제어 교반기 내의 125 ml 삼각 플라스크에서 암조건 하에 유지되었다. 세포 계통은 통상적으로 개시 후 2 내지 3 달 내에 정착되었다. 정착 동안, 현탁은 와이드-보어 피펫을 사용하여 20 ml의 새로운 H9CP+ 액체 배지에 세포 3 ml PCV 및 컨디셔닝된 배지 7 ml를 첨가함으로써 3.5 일마다 계대배양되었다. 조직이 성장시 두배가 되기 시작하면, 현탁액은 스케일링-업되고 500 ml 플라스크에서 유지되며 이에 의해 12 ml PCV의 셀 및 28 ml의 컨디셔닝된 배지가 80 ml H9CP+ 배지로 옮겨졌다. 현탁액이 완전히 정착되면, 이후 사용을 위하여 저온보존되었다.

현탁액의 저온보존 및 해동: 계대배양후 2 일째, 4 ml PCV의 현탁 세포 및 4 ml의 컨디셔닝된 배지가 8 ml의 저온보호물질(코코넛 워터, 1 M 글리세롤, 1 M DMSO, 2 M 수크로오스 없이 H9CP+ 배지 내에 용해되고, 필터 살균됨)에 첨가되었고, 125 ml 플라스크에서 125 rpm으로 4 ℃에서 1 시간 동안 진탕되도록 했다. 1 시간 후, 4.5 ml를 냉각된 5.0 ml 코닝 저온 바이알에 첨가했다. 한번 채워진 개별 바이알이 제어된 속도의 냉동고에서 15 분 동안 4 ℃로 유지되었고, 이어서 -40 ℃의 최종 온도에 도달할 때까지 -0.5 ℃/분의 속도로 냉동되게 하였다. 최종 온도에 도달한 후, 바이알을 액체 질소 증기로 채워진 크라이오플러스(Cryoplus) 4 저장 유닛(사이언티픽 제조) 내부의 선반 내의 상자로 옮겼다.

해동을 위하여, 바이알을 저장 유닛으로부터 제거했고, 폐쇄된 드라이 아이스 용기 내에 위치시켰으며, 이어서 "끓음"이 가라앉을 때까지 40-45 ℃로 유지된 수조 내로 넣었다. 해동되었을 때, 내용물을 덮여진 100 x 25 mm 페트리 접시의 ~8 살균된 70 mm 왓맨 필터 종이(번호 4)의 스택 위로 부었다. 액체를 몇 분간 필터 내로 흡수되게 하였으며, 이어서 세포를 포함하는 상부 필터를 GN6 배지(N6 배지, 2.0 mg/L 2,4-D, 30 g/L 수크로오스, 2.5 g/L 겔라이트, pH 5.8)로 1 주일간 옮겼다. 1 주 후, 오직 기대되는 모폴로지를 갖는 조직만이 필터 종이로부터 새로운 GN6 배지 상으로 직접 옮겨졌다. 125 ml 삼각 플라스크 내의 약 30 ml H9CP+ 배지 내로의 현탁 개시에 1 내지 3 g이 이용가능할 때까지 이러한 조직을 7-14 일마다 계대배양했다. 3 ml PCV를 총 12 ml의 PCV가 얻어질 때, 즉 계대배양이 상술한 바와 같이 발생할 때까지 3.5 일마다 새로운 H9CP+ 배지 내로 계대배양했다.

안정한 형질전환: 형질전환의 약 24 시간 전, 12 ml PCV의 앞서 저온보존된 배발생 메이즈 현탁 세포 + 28 ml의 컨디셔닝된 배지를 500 ml 삼각 플라스크 내의 80 ml의 GN6 액체 배지(겔라이트 결핍 GN6 배지)로 계대배양했고, 125 rpm으로 28 ℃에서 교반기에 두었다. 전체 36 ml PCV가 3 개의 플라스크에 걸쳐 분포되도록 동일한 세포 계통을 사용하여 이를 2 회 반복했다. 24 시간 후, GN6 액체 배지를 제거하고, 세포를 원형질분리하기 위하여 플라스크당 72 ml GN6 S/M 삼투성 배지(N6 배지, 2.0 mg/L 2,4-D, 30 g/L 수크로오스, 45.5 g/L 솔비톨, 45.5 g/L 만니톨, 100 mg/L 미오-이노시톨, pH 6.0)로 교체했다. 플라스크를 125 RPM으로 어둠에서 30-35 분 동안 28 ℃에서 진탕되는 진탕기에 두었고, 이 시간 동안 적절한 부피 8.1 ml의 GN6 S/M 액체 배지를 ~405 ㎎의 사전-오토클레이빙된 살균 탄화규소 휘스커(어드밴스드 콤포지트 매터리얼스, 인크.(Advanced Composite Materials, Inc.))에 첨가함으로써 탄화규소 휘스커의 50 ㎎/ml 현탁액이 제조되었다.

GN6 S/M에서의 인큐베이션 후, 각 플라스크의 내용물이 250 ml 원심분리용 병으로 풀링되었다(pooled). 모든 세포가 바닥에 가라앉으면, 모든 그러나 ~44 ml의 GN6 S/M 액체를 덜어냈고, 다음의 사용을 위하여 살균 1-L 플라스크 내에 수집했다. 휘스커의 프리?팅된(pre-wetted) 현탁액을 최대 속도에서 60 초 동안 소용돌이치게 했고, 이어서 8.1 ml를 병에 첨가하고, 여기에 마지막 단계로서 170 ㎍ DNA를 첨가했다. 병을 개조된 레드 데빌 5400 상용 페인트 혼합기에 즉시 놓았으며, 10 초 동안 교반했다. 교반 후, 세포, 배지, 휘스커 및 DNA의 칵테일이 125 ml의 새로운 GN6 액체 배지와 함께 1-L 플라스크의 내용물에 첨가되어 삼투압을 감소시켰다. 세포는 125 RPM으로 2 시간 동안 28 ℃에서 진탕기 상에서 회수되도록 했으며, 이후 하우스 진공 라인에 연결된 유리 세포 수집기 유닛을 사용하여 왓맨 #4 필터 종이(5.5 cm) 상으로 여과되었다.

약 2 ml의 분산된 현탁액을 진공 처리된 필터의 표면 상으로 피펫에 의해 옮겼다. 필터를 GN6 배지의 60 x 20 mm 플레이트 상으로 옮겼다. 플레이트는 어두운 상자에서 1 주 동안 28 ℃에서 배양되었다.

1 주 후, 필터 종이를 GN6(3P) 배지(N6 배지, 2.0 mg/L 2,4-D, 30 g/L 수크로오스, 100 mg/L 미오-이노시톨, 펄수트(Pursuit)® DG의 3 μM 이마제타피르, 2.5 g/L 겔라이트, pH 5.8)의 60 x 20 mm 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 박스 내에 놓고 추가의 1 주일 동안 배양했다.

형질전환 후 2 주째, 플레이트 상의 모든 세포를 펄수트® DG의 이마제타피르 3 μM을 포함하는 3.0 ml의 용융된 GN6 아가로오스 배지(N6 배지, 2.0 mg/L 2,4-D, 30 g/L 수크로오스, 100 mg/L 미오-이노시톨, 7 g/L 씨 플라크(Sea Plaque) 아가로오스, pH 5.8, 121 ℃에서 오직 10 분간만 오토클레이빙됨) 내로 스크레이핑함으로써 매립했다. 조직이 부서졌고 3 ml의 아가로오스 및 조직을 GN6(3P)의 100 x 15 mm 플레이트의 표면 상으로 골고루 부었다. 이를 모든 나머지 플레이트에 대해 반복했다. 일단 매립되면, 플레이트는 네스코필름(Nescofilm)® 또는 파라필름 M(Parafilm M)®으로 개별적으로 밀봉된 후 추정상 분리주가 나타날 때까지 배양했다.

분리주 회복 및 재생을 위한 프로토콜: 추정적으로 형질전환된 이벤트는, 60 x 20 mm 플레이트 내의 동일한 농도의 새로운 선별 배지로 옮김으로써 형질전환 후 약 9 주째 펄수트®-함유 매립된 플레이트로부터 분리되었다. 유지된 성장이 약 2-3 주 후 분명한 경우, 이벤트는 저항성인 것으로 여겨졌으며 분자 분석을 위하여 제출되었다.

캘러스 조직을, 펄수트.RTM. DG의 3 μM 이마제타피르, MS 염 및 비타민, 30.0 g/L 수크로오스, 5 mg/L BAP, 0.25 mg/L 2,4-D, 2.5 g/L 겔라이트(pH 5.7)를 포함하는 시토키닌계 도입 배지, 28(3P)로 옮김으로써 재생이 개시되었다. 세포는 1 주 동안 낮은 조도(13 μEm^-2s^-1)에서 이후 한주 동안 더 높은 조도(40 μEm^-2s^-1)에서 성장하도록 했으며, 그 다음에는 식물 성장 조절제가 없는 것을 제외하고는 28(3P)와 동일한, 재생 배지 36(3P)로 옮겨졌다. 작은(3-5 cm) 묘목을 제거했고 선별-없는(selection-free) SHGA 배지(문헌[Schenk and Hildebrandt basal salts and vitamins, 1972]; 1 g/L 미오-이노시톨, 10 g/L 수크로오스, 2.0 g/L 겔라이트, pH 5.8)를 포함하는 150 x 25-mm 배양 튜브 안에 놓았다. 묘목이 충분한 뿌리 및 싹 시스템을 발달시키면, 이들은 온실의 토양으로 이식되었다.

4 개의 실험으로부터, 싹 및 뿌리로 구성된 완전한 묘목이 종래의 캘러스 단계를 겪지 않고 암조건 하에서 매립된 선별 플레이트 상의 생체 외에서 형성되었다. 이러한 "초기 재생체" 9 개로부터의 잎 조직은 각각 AAD-12 유전자 및 유전자 카세트에 대한 코딩 영역 PCR 및 식물 전사 유닛(PTU) PCR을 위해 제출되었다. 모두는 온전한 AAD-12 코딩 영역을 가졌지만 3 개는 전장 PTU(표 11)를 가지지 못했다. 이러한 "초기 재생체"는 "1283" 이벤트로 식별되는 종래에 유래된 이벤트로부터 구별되는 4101 이벤트로서 식별되었다. 표준 선별 및 재생을 통해 얻은 19 개의 추가 이벤트로부터의 식물은 온실로 보내져 성숙기까지 성장했고 T1 종자를 생산하기 위하여 적절한 근계교배(inbred) 계통으로 교잡-수분되었다. 이벤트들 중 일부는 써던 블롯 후 유사한 밴딩 패턴에 의해 서로의 클론으로 나타났고, 따라서 오직 14 개의 고유한 이벤트만이 나타났다. 이벤트로부터의 T0 식물은 70 g/ha 이마제타피르에 대해 내성이었다. 인베이더 분석(AHAS 유전자)은 1 내지 >10 카피 범위의 삽입 복잡도를 나타냈다. 13 개의 이벤트는 AAD-12에 대한 컴피트 코딩 영역을 포함했지만; 또한 분석은 완전한 식물 형질전환 유닛이 9 개의 이벤트에 대하여 포함되지 않았음을 나타냈다. 저하된 1863 개의 이벤트 중 어느 것도 T1 단계 이후에 발전하지 못했고, 추가의 특징화는 4101 이벤트를 이용했다.

분자 분석 - 메이즈 물질 및 방법: 조직 수확 DNA 분리 및 정량화. 새로운 조직을 튜브 내에 놓고 4 ℃로 2 일간 동결건조했다. 조직이 완전히 건조된 후, 텅스텐 비드(발레나이트(Valenite))를 튜브에 넣고 샘플을 켈코(Kelco) 비드 밀을 사용하여 1 분 동안 건조 분쇄시켰다. 표준 DNeasy DNA 분리 과정이 이어졌다(퀴아젠, DNeasy 69109). 다음으로, 추출된 DNA의 분취량을 피코 그린(몰리큘러 프로브스(Molecular Probes) P7589)으로 염색했고, ng/μl 단위의 농도를 얻기 위하여 공지의 표준으로 형광광도계(바이오테크(BioTek))에서 판독했다.

인베이더 분석법 분석: DNA 샘플을 20 ng/μl로 희석한 후, 써모사이클러에서 95 ℃로 10 분 동안 인큐베이션함으로써 변성시켰다. 이어서 신호 프로브 혼합물을 제공된 올리고 혼합물 및 MgCl₂(써드 웨이브 테크놀로지스(Third Wave Technologies))를 사용하여 제조했다. 7.5 μl의 분취량을 인베이더 분석법 플레이트의 각 웰에 넣은 후, 7.5 μl의 대조군, 표준 및 20 ng/μl의 희석된 미지의 샘플의 분취량을 넣었다. 각 웰은 15 μl의 미네랄 오일(시그마)과 중첩되었다. 이어서 플레이트를 63 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이팅하고 형광광도계(바이오테크)에서 판독했다. 표적 프로브에 대한 % 신호 대 배경을 % 신호 대 배경 내부 제어 프로브로 나눈 계산은 비율을 산출해낼 것이다. 써던 블롯 분석에 의해 개발되고 승인된 공지의 카피 표준의 비는 미지의 이벤트의 추정되는 카피를 확인하는 데 사용된다.

폴리머라제 연쇄 반응: 총 100 ng의 전체 DNA를 템플릿으로 사용했다. 각 프라이머의 20 mM를 타카라(Takara) Ex Taq PCR 폴리머라제 키트(미루스(Mirus) TAKRR001A)와 함께 사용했다. AAD-12(v1) PTU에 대한 프라이머는 포워드-GAACAGTTAG ACATGGTCTA AAGG(서열 8) 및 리버스-GCTGCAACAC TGATAAATGC CAACTGG (서열 9)였다. PCR 반응은 샘플을 94 ℃에서 3 분, 및 94 ℃에서 30 초 동안, 63 ℃에서 30 초 동안, 및 72 ℃에서 1 분 45 초 동안, 다음으로 72 ℃에서 10 분 동안의 사이클 35 회를 거치게 함으로써 9700 진앰프(Geneamp) 써모사이클러(어플라이드 바이오시스템즈)에서 수행되었다.

AAD-12(v1) 코딩 영역 PCR에 대한 프라이머는 포워드-ATGGCTCAGA CCACTCTCCA AA(서열 10) 및 리버스-AGCTGCATCC ATGCCAGGGA(서열 11)였다. PCR 반응은 샘플을 94 ℃에서 3 분, 및 94 ℃에서 30 초 동안, 65 ℃에서 30 초 동안, 및 72 ℃에서 1 분 45 초 동안, 다음으로 72 ℃에서 10 분 동안의 사이클 35 회를 거치게 함으로써 9700 진앰프 써모사이클러(어플라이드 바이오시스템즈)에서 수행되었다. PCR 생성물은 EtBr로 염색된 1 % 아가로오스 겔 상에서 전기영동함으로써 분석되었다.

써던 블롯 분석: 써던 블롯 분석을 퀴아젠 DNeasy 키트에서 얻은 게놈 DNA로 수행하였다. 총 2 ㎍의 게놈 잎 DNA 또는 10 ㎍의 게놈 캘러스 DNA를 PTU 데이터를 얻기 위하여 BSM I 및 SWA I 제한 효소를 사용하여 밤새 소화시켰다.

밤샘 소화 후, 완전한 소화를 확인하기 위하여 ~100 ng의 분취량을 1 % 겔에 흘렸다. 이러한 확인 후, 샘플을 40 볼트에서 밤새 대량의 0.85 % 아가로오스 겔 위에 흘렸다. 이어서 겔은 0.2 M NaOH, 0.6 M NaCl에서 30 분 동안 변성되었다. 이어서 겔은 0.5 M Tris HCl, 1.5 M NaCl(pH 7.5)에서 30 분간 중화되었다. 이어서 20 x SSC를 포함하는 겔 장치가 밤새 나일론 멤브래인(밀리포어(Millipore) INYC00010) 이동을 위한 중력 겔을 얻기 위하여 설치되었다. 밤샘 이동 후, 이어서 멤브래인은 1200 x 100 μJ로 가교제(스트라타진 UV 스트라타링커 1800(Stratagene UV stratalinker 1800))를 통해 UV 광에 놓였다. 이어서 멤브래인은 0.1 % SDS, 0.1 SSC에서 45 분간 세척되었다. 45 분의 세척 후, 멤브래인은 3 시간 동안 80 ℃로 가열건조된 후 하이브리드화될 때까지 4 ℃에서 저장되었다. 하이브리드화 템플릿 단편은 플라스미드 DNA를 사용한 상기의 코딩 영역 PCR을 사용하여 제조되었다. 생성물을 1 % 아가로오스 겔에 흘리고 잘라낸 후 퀴아젠(28706) 겔 추출 과정을 사용하여 겔을 추출했다. 이어서 멤브래인을 퍼펙트 히브 버퍼(Perfect Hyb buffer)(시그마 H7033)에서 60 ℃ 단계로 1 시간 동안 사전-하이브리드화시켰다. p32계 프로브(펄킨 엘머(Perkin Elmer))를 현상하기 위하여 프라임 it RmT dCTP-라벨링 rxn(스트라타진 300392) 과정을 사용했다. 프로브 콴트. G50 칼럼(아메르샴(Amersham) 27-5335-01)을 사용하여 프로브를 세척했다. 밤새 2백만 카운트 CPM을 써던 블롯을 하이브리드화하는 데 사용했다. 이어서 밤샘 하이브리드화 후, 블롯을 65 ℃에서 0.1 % SDS, 0.1 SSC에서 2 회 20 분 동안 세척시켰다. 이어서 블롯을 밤새 필름에 노출시켰고, - 80 ℃에서 인큐베이팅했다.

AAD-12 형질전환된 T0 옥수수의 발아후 제초제 내성: 4 개의 T0 이벤트를 온실에서 적응하도록 했고, 2-4 개의 새로운 정상으로 보이는 잎이 윤생으로부터 발아할 때까지 성장시켰다(즉, 식물을 조직 배양으로부터 온실 성장 조건까지 변이시킴). 식물은 온실에서 27 ℃에서 16 시간 명기: 8 시간 암기 조건으로 성장했다. 이어서 식물을 펄수트®(이마제타피르) 또는 2,4-D 아민 4의 상용 제형으로 처리했다. 펄수트®를 분무하여 시험된 이벤트 내에 존재하는 선별가능한 마커 유전자의 기능을 증명했다. 제초제 시용은 187 L/ha의 분무 부피로, 50-cm 분무 높이에서 트랙 분무기로 이루어졌다. 식물을 치사량의 이마제타피르(70 g ae/ha) 또는 비형질전환된 옥수수 계통에 상당한 손상을 줄 수 있는 비율의 2,4-D DMA 염(2240 g ae/ha)으로 분무했다. 치사량은 Hi-II 근계교배에 95 % 초과의 손상률을 초래하는 비율로 정의된다. Hi-II는 본 발명의 형질전환체의 유전적 배경이다.

몇몇 개체는 제초제로부터 보호되었으며, 각각의 유전자가 제초제에 대한 저항성을 제공한다. 그러나 이벤트 "001"로부터의 개별 클론 '001'(4101(0)-001-001로도 알려짐)이 조금의 손상을 일으켰지만 14 DAT에 의해 회복되었다. 4 개의 이벤트들 중 3 개는 전방으로 이동했고, 개체는 5XH751와 교잡되어 다른 세대에 선택되었다. 각 제초제 내성 식물은 2,4-D 및 이마제타피르-내성 식물 각각에 대한 AAD-12 코딩 영역(PCR 분석법)의 존재 또는 AHAS 유전자(인베이더 분석법)의 존재에 대해 양성이었다. AAD-12 단백질은 온전한 코딩 영역을 포함하는 모든 2,4-D 내성 T0 식물 이벤트에서 검출되었다. 트랜스진(들)(AHAS, 그리고 추론하면 AAD-12)의 카피 수는 1 내지 15 카피로 현저하게 변했다. 개별 T0 식물은 T1 종자를 생산하기 위하여 성숙하게 자랐고 소유(proprietary) 근계교배 계통으로 교잡-수분되었다.

T1 옥수수에서 높은 2,4-D 내성의 검증: T1 AAD-12(v1) 종자를 메트로 믹스(Metro Mix) 배지를 포함하는 3-인치 화분에 식재했고 2 엽기에서 널(null)을 제거하기 위하여 70 g ae/ha 이마제타피르를 분무하였다. 생존한 식물을 메트로 믹스 배지를 포함하는 1-갤론 화분으로 이식했고 이전과 동일한 성장 조건에 두었다. V3-V4 단계에서, 식물은 560 또는 2240 g ae/ha 2,4 D DMA로, 187 L/ha로 설정된 트랙 분무기에서 분무되었다. 식물을 3 및 14 DAT에 평가했고 5XH751 x Hi II 대조군 식물과 비교했다. 0-10의 평가 스케일(손상 없음부터 극도의 옥신 손상까지)을 곁뿌리 손상을 구별하기 위하여 개발하였다. 곁뿌리 평가는 2,4-D 내성을 나타내기 위하여 14DAT에 취하였다. 2,4-D는 곁뿌리 기형을 초래했고 옥수수에서 옥신 제초제 손상의 일관된 지표이다. 곁뿌리 데이터(하기의 표에서 보는 바와 같음)는 시험된 3 개의 이벤트들 중 2 개가 2240 g ae/ha 2,4-D DMA에 대해 강력하게 내성이라는 것을 증명한다. 이벤트 "pDAB4101(0)001.001"는 분명히 불안정하지만; 다른 2 개의 이벤트는 2,4-D 및 2,4-D + 이마제타피르 또는 2,4-D + 글리포세이트에 대해 강력하게 내성이다(표 12 참조).

옥수수에서의 AAD-12(v1) 유전가능성: 또한 5XH751와 교차된 7 개의 AAD-12(v1) T1 패밀리에 대해 자손 시험을 수행하였다. 종자는 상술한 바와 같은 3-인치 화분에 식재되었다. 3 엽기에서 모든 식물은 앞서 설명한 바와 같이 트랙 분무기에서 70 g ae/ha 이마제타피르로 분무되었다. 14 DAT 후, 저항성 및 민감성 식물을 계수하였다. 카이 제곱 분석에 의해 결정된 바와 같이, 시험된 6 개의 계통 중 4 개가 단일 유전자좌로서 멘델의 우성 형질(1R:1S)로 분리되었다. 생존한 식물은 이어서 2,4-D로 분무되었고 모든 식물은 2,4-D에 대해 내성인 것으로 여겨졌다(비율 ≥ 560 g ae/ha). AAD-12는 상용 하이브리드에 대하여 상반교잡될 때 다수의 종에서 강력한 아릴옥시알카노에이트 옥신 저항성 유전자로서 유전가능하다.

제초제 스펙트럼을 증가하기 위한 AAD-12(v1)의 스택킹: AAD-12(v1)(pDAB4101) 및 엘리트 라운드업 레디 근계교배(BE1146RR)가 상반교잡되었고 F1 종자가 수집되었다. 2 개의 F1 계통으로부터의 종자가 식재되었고 널을 제거하기 위하여 V2 단계에서 70 g ae/ha 이마제타피르로 처리되었다. 생존 식물에 대하여, 레프(rep)가 분리되었고 187 L/ha로 교정된 트랙 분무기에서 1120 g ae/ha 2,4-D DMA+70 g ae/ha 이마제타피르(AHAS 유전자의 존재를 확인하기 위함) 또는 1120 g ae/ha 2,4-D DMA+1680 g ae/ha 글리포세이트(라운드 업 레디 유전자의 존재를 확인하기 위함)로 처리되었다. 식물을 3 및 16 DAT에 평가했다. 분무 데이터는 AAD-12(v1)가 글리포세이트 내성 유전자(예컨대 라운드업 CP4-EPSPS 유전자) 또는 다른 제초제 내성 유전자와 통상적으로 스택킹되어 옥수수에 안전하게 시용될 수 있는 제초제의 증가된 스펙트럼을 제공할 수 있다는 것을 나타냈다. 마찬가지로, 이미다졸리논 + 2,4-D + 글리포세이트 내성은 F1 식물에서 관찰되었으며, 이러한 다수의 트랜스진의 분자 또는 육종 스택 조합에 의한 음성 표현형을 나타내지 않았다.

2,4-D, 트리클로피르 및 플루오록시피르 제초제에 대한 pDAB4101 형질전환된 옥수수 식물의 재배지 내성: 재배지 수준 내성 시험을 인디애나주 파울러 및 미시시피주 웨이사이드에서 2 개의 AAD-12(v1) pDAB4101 이벤트(4101(0)003.R.003.AF 및 4101(0)005.R001.AF) 및 1 개의 라운드업 레디(RR) 대조군 하이브리드(2P782)에 대해 수행했다. 종자는 웨이사이드에서 40-인치 열 간격으로, 그리고 파울러에서 30 인치 간격으로 콘 파종기로 식재되었다. 실험 설계는 3 회의 반복으로 무작위된 완전한 블록 설계였다. 제초제 처리는 2,4-D(디메틸아민 염)을 1120, 2240 및 4480 g ae/ha으로, 트리클로피르를 840 g ae/ha으로, 플루오록시피르를 280 g ae/ha으로, 그리고 처리하지 않은 대조군이었다. AAD-12(v1) 이벤트는 선별가능한 마커로서 AHAS 유전자를 포함했다. F2 옥수수 이벤트는 분리되어, 널 식물을 제거하기 위하여 AAD-12(v1) 식물을 이마제타피르로 70 g ae/ha로 처리되었다. 제초제 처리는 130-200 kpa 압력에서 187 L/ha 캐리어 부피를 전달하는 압축 공기 백팩 분무기를 사용하여 옥수수가 V6 단계에 도달할 때까지 시용되었다. 시각적 손상률 평가는 처리 후 7, 14, 및 21 일에 했다. 곁뿌리 손상 등급은 28 DAT에 0-10의 스케일로서 행해졌고, 0-1은 약간의 곁뿌리 녹음(fusing), 1-3은 중간의 곁뿌리 팽창/원더링(wandering) 및 뿌리 증식, 3-5는 중간의 곁뿌리 녹음, 5-9는 심각한 곁뿌리 녹음 및 기형 및 10은 곁뿌리의 전체 저해를 나타낸다.

처리 후 14 일째의 2,4-D, 트리클로피르, 및 플루오록시피르에 대한 AAD-12(v1) 이벤트 반응을 표 14에 나타냈다. 작물 손상은 14 DAT에 대부분 심각했다. RR 대조군 옥수수(2P782)는 4480 g ae/ha에서의 2,4-D에 의해 심하게 손상되었고(14 DAT에서 44 %), 이는 정상 재배지 사용 비율의 8 배(8 x)였다. AAD-12(v1) 이벤트는 14 DAT에서 모두 1, 2, 및 4 x 비율에서 각각 0 %의 손상률로, 2,4-D에 대한 뛰어난 내성을 보여주었다. 대조군 옥수수(2P782)는 트리클로피르의 2 x 비율(840 g ae/ha)에 의해 심하게 손상되었다(14 DAT에 31 %). AAD-12(v1) 이벤트는 2 x 비율의 트리클로피르에서 2 개의 이벤트들에 걸쳐 14 DAT에 평균 3 %의 손상률로 내성을 나타냈다. 280 g ae/ha에서의 플루오록시피르는 14 DAT에 야생형 옥수수에 대하여 11 %의 시각적 손상률을 초래했다. AAD-12(v1) 이벤트는 5 DAT에 평균 8 %의 손상률로, 증가된 내성을 나타냈다.

V6 성장 단계에서의 옥수수에 대한 옥신 제초제의 시용은 곁뿌리의 기형을 초래할 수 있다. 표 15는 2,4-D, 트리클로피르 및 플루오록시피르에 의해 초래되는 곁뿌리 손상의 심각성을 나타낸다. 840 g ae/ha에서의 트리클로피르는 가장 심각한 곁뿌리 녹음 및 기형을 초래하여, 이는 2P782 대조군형 옥수수에서 평균 곁뿌리 손상률 점수 7을 가져왔다.

둘 모두의 AAD-12(v1) 옥수수 이벤트는 트리클로피르 처리로부터의 곁뿌리 손상이 없었음을 나타낸다. 2P782 옥수수에서의 곁뿌리 손상률은 2,4-D의 비율이 증가함에 따라 증가했다. 4480 g ae/ha의 2,4-D에서, AAD-12 이벤트는 곁뿌리 손상이 없음을 나타냈지만; 2P782 하이브리드에서 심각한 곁뿌리 녹음 및 기형이 나타났다. 플루오록시피르는 야생형 옥수수에서 오직 중간의 곁뿌리 팽창 및 원더링을 초래했고, AAD-12(v1) 이벤트는 곁뿌리 손상을 나타내지 않았다.

이러한 데이터는 AAD-12(v1)가 옥수수에서 상용으로 사용되는 것을 훨씬 초과하는 비율에서 2,4-D, 트리클로피르 및 플루오록시피르에 대한 높은 수준의 내성을 전달하고, 비-AAD-12(v1) 옥수수가 심각한 시각적 곁뿌리 손상을 입게 한다는 것을 분명하게 보여준다.

실시예 6

담배 형질전환

아그로박테리움 투메파시엔스를 이용한 담배 형질전환을 공지된 방법(문헌[Horsch et al., 1988])과 유사하지만 동일하지는 않은 방법으로 수행하였다. 형질전환을 위한 소스 조직을 제공하기 위하여, 담배 종자(니코티아나 타바쿰 cv. KY160)을 표면 살균하고, 한천으로 고화된 무-호르몬 무라시게 및 스쿠그 배지(문헌[Murashige and Skoog, 1962])인 TOB-배지의 표면에 식재하였다. 식물은 조명된 인큐베이터실에서 28-30 ℃로 6-8 주간 성장했고, 잎은 형질전환 프로토콜에서의 사용을 위하여 살균적으로 수집되었다. 주맥을 제외하고 약 1 cm²의 조각을 이 잎으로부터 살균적으로 절단했다. 250 rpm으로 28 ℃에 설정된 진탕기 상의 플라스크 내에서 밤새 성장한 아그로박테리움 균주(pDAS1580로도 알려진 pDAB3278, AAD-12(v1)+PAT를 포함하는 EHA101S)의 배양물을 원심분리기에서 펠릿화하고 살균 무라시게 & 스쿠그 염에서 재현탁하고 600 nm에서 0.5의 최종 광 밀도로 조정했다. 잎 조각을 약 30 초 동안 이러한 박테리아 현탁액에 담근 후, 살균 종이 타월 상에 건조하게 블롯팅하고, TOB+ 배지(1 ㎎/L 인돌 아세트산 및 2.5 ㎎/L 벤질아데닌을 포함하는 무라시게 및 스쿠그 배지) 상에 우측이 위로 가도록 놓고, 28 ℃로 어둠에서 인큐베이팅했다. 2 일 후, 잎 조각은, 250 ㎎/L 세포탁심(아그리-바이오(Agri-Bio), 플로리다주 노스 마이애미) 및 5 ㎎/L 글루포시네이트 암모늄(바스타 내의 유효 성분, 바이엘 크롭 사이언시즈(Bayer Crop Sciences))을 포함하는 TOB+ 배지로 이동했고 조명에서 28-30 ℃로 인큐베이팅했다. 처음 2 주에는 주당 2 회, 그리고 그 이후에는 주당 1회로, 세포탁심 및 바스타를 갖는 새로운 TOB+ 배지로 잎 조각을 이동했다. 잎 조각을 박테리아로 처리한 후 4 내지 6 주째, 형질전환된 부위(foci)에서 생긴 작은 식물을 이러한 조직 제조로부터 제거하고 피타트레이(Phytatray)™ II 그릇(시그마)에서 250 ㎎/L 세포탁심 및 10 ㎎/L 바스타를 포함하는 배지 TOB 내로 식재했다. 이러한 묘목은 조명된 인큐베이터실에서 성장했다. 3 주 후, 줄기 절단을 행하고 동일한 배지에서 다시 뿌리내렸다. 추가의 2-3 주 후 식물을 온실로 보낼 준비를 갖추었다.

식물은, 뿌리로부터 한천을 세척하고, 13.75 cm²의 화분 내의 토양으로 이식하고, 화분을 지프락(Ziploc)® 백(에스시 존슨 앤 손, 인크.(SC Johnson & Son, Inc.)) 내에 넣고, 수돗물을 백의 바닥에 채우고, 1 주 동안 30 ℃의 온실에서 간접광 속에 놓음으로써 온실로 옮겨졌다. 3-7 일 후, 백을 개방했고; 식물에 비료를 주고 식물이 온실-적응할 때까지(이때 백을 제거했음) 개방된 백에서 성장하도록 했다. 식물은 보통의 따뜻한 온실 조건(30 ℃, 16 시간 낮, 8 시간 밤, 최소의 자연광 + 보충광 = 500 μE/m²s¹) 하에서 성장했다.

번식 전에, 삽입 카피 수를 결정하기 위한 DNA 분석을 위해 T0 식물을 샘플링했다. AAD-12(v1)와 분자적으로 연결된 PAT 유전자를 편의를 위해 분석했다. 새로운 조직을 튜브에 넣고 4 ℃에서 2 일간 동결건조했다. 조직이 완전히 건조된 후, 텅스텐 비드(발레나이트)를 튜브에 넣고 샘플을 켈코 비드 밀을 사용하여 1 분 동안 건조 분쇄시켰다. 표준 DNeasy DNA 분리 과정이 이어졌다(퀴아젠, DNeasy 69109). 다음으로, 추출된 DNA의 분취량을 피코 그린(몰리큘러 프로브스 P7589)으로 염색했고, ng/μl 단위의 농도를 얻기 위하여 공지의 표준으로 형광광도계(바이오테크)에서 판독했다.

DNA 샘플을 9 ng/μl로 희석한 후, 써모사이클러에서 95 ℃로 10 분 동안 인큐베이션함으로써 변성시켰다. 이어서 제공된 올리고 혼합물 및 MgCl₂(써드 웨이브 테크놀로지스)를 사용하여 신호 프로브 혼합물을 제조했다. 7.5 μl의 분취량을 인베이더 분석법 플레이트의 각 웰에 넣은 후, 7.5 μl의 대조군, 표준 및 20 ng/μl의 희석된 미지의 샘플의 분취량을 넣었다. 각 웰은 15 μl의 미네랄 오일(시그마)과 중첩되었다. 이어서 플레이트를 63 ℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이팅하고 형광광도계(바이오테크)에서 판독했다. 표적 프로브에 대한 % 신호 대 배경을 % 신호 대 배경 내부 제어 프로브로 나눈 계산은 비율을 산출할 것이다. 써던 블롯 분석에 의해 개발되고 승인된 공지의 카피 표준의 비는 미지의 이벤트의 추정되는 카피를 확인하는 데 사용되었다.

또한 모든 이벤트는 동일한 추출된 DNA 샘플을 사용하는 PCR에 의해 AAD-12(v1) 유전자의 존재에 대해 분석되었다. 총 100 ng의 전체 DNA를 템플릿으로 사용했다. 각 프라이머의 20 mM가 타카라 Ex Taq PCR 폴리머라제 키트와 함께 사용되었다. 식물 전사 유닛(PTU) PCR AAD-12에 대한 프라이머는 (SdpacodF: ATGGCTCATG CTGCCCTCAG CC)(서열 12) 및 (SdpacodR: CGGGCAGGCC TAACTCCACC AA)(서열 13)이었다. PCR 반응은 샘플을 94 ℃에서 3 분, 및 94 ℃에서 30 초 동안, 64 ℃에서 30 초 동안, 및 72 ℃에서 1 분 45 초 동안, 다음으로 72 ℃에서 10 분 동안의 사이클 35 회를 거치게 함으로써 9700 진앰프 써모사이클러(어플라이드 바이오시스템즈)에서 수행되었다. PCR 생성물은 EtBr로 염색된 1 % 아가로오스 겔 상에서 전기영동함으로써 분석되었다. PAT 유전자의 1-3 카피를 갖는 18 PCR 양성 이벤트의 각각으로부터의 4 내지 12 클론 혈통(및 이러한 유전자들이 물리적으로 연결되어 있기 때문에 아마 AAD-12(v1))이 재생되었고 온실로 이동되었다.

AAD-12(v1) 형질전환된 T0 담배에서의 발아후 제초제 내성: 19 개의 이벤트 각각으로부터의 T0 식물은 3-4 인치 높이인 식물에 분무된 다양한 범위의 2,4-D, 트리클로피르, 또는 플루오록시피르의 도전을 받았다. 분무 시용은 187 L/ha의 분무 부피로 트랙 분무기를 사용하여 앞서 설명한 바와 같이 이루어졌다. 2,4-D 디메틸아민 염(리버사이드 코프)은 탈이온수에서 혼합된 각 이벤트로부터의 대표적인 클론에 대해 0, 140, 560, 또는 2240 g ae/ha로 시용되었다. 마찬가지로 플루오록시피르가 35, 140, 또는 560 g ae/ha로 시용되었다. 트리클로피르는 70, 280, 또는 1120 g ae/ha으로 시용되었다. 각 처리는 1-3 회 반복되었다. 손상 평가는 3 및 14 DAT에 기록되었다. 시험된 모든 이벤트는 형질전환되지 않은 대조군 계통 KY160보다 2,4-D에 대해 더 내성이었다. 몇몇 이벤트에서, 일부 초기 옥신 제초제-관련 상편생장이 560 g ae/ha 2,4-D 이하의 시용량에서 일어났다. 일부 이벤트는 2240 g ae/ha(4 x 재배지 비율과 동등)로 시용된 2,4-D에서 손상되지 않았다. 전체적으로, AAD-12(v1) 이벤트는 플루오록시피르에 보다 민감성이고, 그 다음이 트리클로피르이고, 2,4-D에는 최소로 영향을 받았다. 저항성의 크기에 대한 이벤트의 질은 560 g ae/ha 플루오록시피르에 대한 T0 식물 반응을 사용하여 파악되었다. 이벤트는 "낮음"(14 DAT에서의 40 % 초과의 손상률), "중간"(20-40 % 손상률), "높음"(20 % 미만의 손상률)으로 분류되었다. 일부 이벤트는 반복들 간의 반응에서 일관되지 않았고 "가변적"인 것으로 여겨졌다.

T1 담배에서 높은 2,4-D 내성의 확인: 높은 비율의 2,4-D 및 플루오록시피르에서 생존한 2 내지 4 개의 T0 개체는 각 이벤트로부터 살아남았고, T1 종자를 발생시키기 위하여 온실에서 자가 수분되도록 했다. T1 종자가 계층화되었고 아라비돕시스와 같이 선별 트레이에 파종되었으며, 그 다음에 560 g ai/ha 글루포시네이트로 이 분리 집단에서 비형질전환된 널을 선별적으로 제거했다(PAT 유전자 선별). 생존식물은 온실 안의 개별적인 3-인치 화분으로 옮겨졌다. 이 계통은 T0 세대에서 2,4-D에 대한 높은 수준의 저항성을 제공했다. 반응의 개선된 일관성은 조직 배양에서 직접 발생하지 않은 T1 식물에서 기대되었다. 이러한 식물은 야생형 KY160 담배와 비교되었다. 모든 식물은 187 L/ha로 설정된 트랙 분무기로 분무되었다. 식물은 140-2240 g ae/ha 2,4-D 디메틸아민 염(DMA), 70-1120 g ae/ha 트리클로피르 또는 35-560 g ae/ha 플루오록시피르의 범위로 분무되었다. 모든 시용은 수중에서 제형화되었다. 각 처리는 2-4 회 반복되었다. 식물은 처리 후 3 및 14 일째 평가되었다. 식물은 발육저지, 백화현상, 및 괴사에 대한 손상률 평가를 받았다. T1 세대는 분리되고, 따라서 일부 가변적인 반응은 접합성의 차이 때문인 것으로 예상된다.

2,4-D에 대해 4 x 재배지 비율(2240 g ae/ha) 이하에서는 손상이 관찰되지 않았다. 일부 손상은 한 이벤트 계통에서의 트리클로피르 처리에서 관찰되었으나, 최대 손상은 플루오록시피르에서 관찰되었다. 플루오록시피르 손상은 단수명이고, 한 이벤트에 대한 새로운 성장은 14 DAT에 의해 처리되지 않은 대조군과 거의 구별이 불가능하다(표 17). 형질전환되지 않은 담배가 플루오록시피르에 대단히 민감성이라는 것에 주의하는 것이 중요하다. 이 결과는 상용 수준의 2,4-D 내성이 매우 옥신-민감성인 쌍떡잎 작물, 예컨대 담배에서조차도 AAD-12(v1)에 의해 제공될 수 있다는 것을 나타낸다. 이 결과는 또한 저항성이 피리딜옥시아세트산 제초제, 트리클로피르 및 플루오록시피르에 부여될 수 있다는 것을 보여준다. 다양한 스펙트럼의 잡초 방제를 하는 다양한 유효 성분을 갖는 AAD-12에 의해 보호되는 제초제 내성 작물에서의 처리를 처방하는 능력을 갖는 것은 재배자들에게 매우 유용하다.

담배에서의 AAD-12(v1) 유전가능성: 또한 AAD-12(v1) 계통의 7 개의 T1 계통에 대해 100 개 식물의 자손 시험을 수행하였다. 종자는 계층화되고, 파종되고, 널 식물이 리버티 선별에 의해 제거되지 않았다는 것을 제외하고는 상기의 과정으로 식재되었다. 이어서 모든 식물은 상술한 바와 같이 560 g ae/ha 2,4-D DMA로 분무되었다. 14 DAT 후, 저항성 및 민감성 식물을 계수하였다. 카이 제곱 분석에 의해 결정된 바와 같이, 시험된 7 개의 계통 중 5 개가 단일 유전자좌로서 멘델의 우성 형질(3R:1S)로 분리되었다. AAD-12는 다수의 종에서 강력한 아릴옥시알카노에이트 옥신 저항성 유전자로서 유전가능하다.

2,4-D, 디클로프로프, 트리클로피르, 및 플루오록시피르 제초제에 대한 pDAS1580 담배 식물의 재배지 내성: 재배지 수준 내성 시험을 인디애나주 및 미시시피주의 재배지 스테이션에서 3 개의 AAD-12(v1) 계통(이벤트 pDAS1580-[1]-018.001, pDAS1580-[1]-004.001 및 pDAS1580-[1]-020.016) 및 1 개의 야생형 계통(KY160)에 대하여 수행하였다. 담배 이식은 상기에 나타낸 성장 조건에 따라 메트로 360 배지를 포함하는 72 웰 이식 플랫(험멀트 인터네셔널(Hummert International))에 T1 종자를 식재함으로써 온실 내에서 성장했다. 널 식물은 상술한 바와 같이 리버티 선별에 의해 선별적으로 제거되었다. 이식 식물은 재배지 스테이션으로 수송되었고 산업용 채소 파종기를 사용하여 14 또는 24 인치 띄워서 식재되었다. 미시시피 위치에서의 점적 관개 및 인디애나 위치에서의 두상관수가 힘찬 식물 성장을 유지하도록 사용되었다.

실험 설계는 4 회의 반복을 갖는 스플릿 플롯 설계였다. 주요 플롯은 제초제 처리였고 보조 플롯은 담배 계통이었다. 제초제 처리는 2,4-D(디메틸아민 염)을 280, 560, 1120, 2240 및 4480 g ae/ha으로, 트리클로피르를 840 g ae/ha으로, 플루오록시피르를 280 g ae/ha으로 한 것 그리고 처리하지 않은 대조군이었다. 플롯은 25-30 피트당 1 열이었다. 제초제 처리는 이식 후 3-4 주째에 130-200 kpa 압력에서 187 L/ha 캐리어 부피를 전달하는 압축 공기 백팩 분무기를 사용하여 시용되었다. 손상률, 성장 저해 및 상편생장의 시각적 평가는 처리 후 7, 14, 및 21 일에 했다.

2,4-D, 트리클로피르, 및 플루오록시피르에 대한 AAD-12(v1) 이벤트 반응을 표 18에 나타냈다. 비형질전환된 담배 계통은, 재배지 시용 비율의 1 배로 생각되는 560 g ae/ha의 2,4-D에 의해 심하게 손상되었다(14 DAT에 63 %). AAD-12(v1) 계통은 모두 14 DAT에서 2,4-D에 대해 평균 손상률 1, 4의 뛰어난 내성을 나타냈고, 4 %의 손상률은 2, 4, 및 8 배의 비율에서 각각 관찰되었다. 비형질전환된 담배 계통은 2 x 비율의 트리클로피르(840 g ae/ha)로 심하게 손상되었지만(14 DAT에 53 %); AAD-12(v1) 계통은 3 개의 계통에 걸쳐 14 DAT에 평균 5 %의 손상률의 내성을 나타냈다. 280 g ae/ha의 플루오록시피르는 14 DAT에 비형질전환된 계통에 대해 심각한 손상률(99 %)을 초래했다. AAD-12(v1) 계통은 14 DAT에 평균 11 %의 손상률을 갖는 증가된 내성을 나타냈다.

이 결과는 AAD-12(v1) 형질전환된 이벤트 계통이 대표적인 재배지 조건 하에서 치명적이거나 또는 비형질전환된 담배에 대하여 심각한 상편생장 기형을 초래하는 다수의 상용 사용 비율에서, 2,4-D, 트리클로피르 및 플루오록시피르에 대한 높은 수준의 내성을 보여준다는 것을 나타낸다.

증가된 2,4-D 비율에 대한 AAD-12(v1) 보호: 온실에서 2,4-D DMA의 증가된 비율에 대한 AAD-12(v1) 보호를 나타내는 결과를 표 19에 나타냈다. 이벤트로부터의 T1 AAD-12(v1) 식물은 상술한 바와 동일한 프로토콜을 사용하여 560 g ai/ha로 리버티 선별했을 때 3R:1S로 분리되었다. T1 AAD-1(v3) 종자는 또한 형질전환된 담배 대조군에 대해 식재되었다(PCT/US2005/014737 참조). 비형질전환된 KY160은 민감성 대조군으로서 역할했다. 식물은 187 L/ha로 설정된 트랙 분무기를 사용하여 140, 560, 2240, 8960, 및 35840 g ae/ha 2,4-D DMA로 분무되었고 3 및 14 DAT에 평가되었다.

AAD-12(v1) 및 AAD-1(v3) 모두는 4 x 상용 사용 비율까지의 시용량에서 2,4-D 손상에 대해 담배를 효과적으로 보호했다. 그러나, AAD-12(v1)는 64 x 표준 재배지 비율까지 보호함으로써 AAD-1(v3)에 대한 눈에 띄는 장점을 분명히 나타냈다.

제초제 스펙트럼 증가를 위한 AAD-12의 스택킹: 동형접합성 AAD-12(v1)(pDAS1580) 및 AAD-1(v3)(pDAB721) 식물(상기에 대해서 PCT/US2005/014737 참조) 모두가 상반교잡되었고 F1 종자가 수집되었다. 각 유전자의 2 번의 상반교잡으로부터 F1 종자가 계층화되었고 각 교잡의 처리된 4 개의 레프는 다음의 처리들 중 하나로, 다른 시험을 위하여 사용된 것과 동일한 분무 요법 하에서 처리되었다: 70, 140, 280 g ae/ha 플루오록시피르(AAD-12(v1) 유전자에 대해 선별적); 280, 560, 1120 g ae/ha R-디클로로프로프(AAD-1(v3) 유전자에 대해 선별적); 또는 560, 1120, 2240 g ae/ha 2,4-D DMA(2,4-D 내성을 확인하기 위해). 각 유전자의 동형접합성 T2 식물은 또한 대조군으로서 사용을 위해 식재되었다. 식물은 3 및 14 DAT에 평가되었다. 분무 결과는 표 20에 나타내었다.

결과는 AAD-12(v1)가 AAD-1(v3)와 성공적으로 스택킹될 수 있어서, 관심 작물에 시용될 수 있는 제초제의 스펙트럼을 증가시킬 수 있다는 것을 확인시켜주었다(AAD-1 및 AAD-12 각각에 대하여 페녹시아세트산 + 페녹시프로피온산 대 페녹시아세트산 + 피리딜옥시아세트산). 제초제 교잡 저항성 패턴의 상보적인 성질은 상보적이고 스택킹가능한 재배지-선별가능한 마커로서 이러한 2 개의 유전자의 편리한 사용을 가능하게 한다. 단일 유전자를 갖는 내성이 미미할 수 있는 작물에서, 통상의 기술자는 동일한 제초제에 대하여 제2 내성 유전자를 스택킹함으로써 내성을 증가시킬 수 있다는 것을 인식한다. 이러한 것은 동일 또는 상이한 프로모터와 동일한 유전자를 사용하여 행할 수 있지만; 여기서 관찰되는 바와 같이, 2 개의 상보적인 형질을 스택킹하고 트랙킹하는 것은 페녹시프로피온산[AAD-1(v3)으로부터] 또는 피리딜옥시아세트산[AAD-12(v1)]에 대해 구별되는 교잡 보호에 의해 촉진될 수 있다.

실시예 7

대두 형질전환

유전자 전달 기술을 통한 대두 개선은 제초제 내성(문헌[Padgette et al., 1995]), 아미노산 변형(문헌[Falco et al., 1995]), 및 곤충 저항성(문헌[Parrott et al., 1994])과 같은 형질을 위해 달성되어 왔다. 작물 종에 외래 형질을 도입하는 것은 단순 삽입을 포함하여, 선별가능한 마커 서열을 사용하여 트랜스제닉 계통의 일상적 생산을 가능하게 할 방법을 필요로 한다. 트랜스진은 육종을 단순화하기 위하여 단일의 기능적 유전자좌로서 유전되어야 한다. 접합성 배 축의 미세투사물 충돌(문헌[McCabe et al., 1988]), 또는 체세포 배발생 배양(문헌[Finer and McMullen, 1991]), 및 자엽 외식편(문헌[Hinchee et al., 1988]) 또는 접합성 배(문헌[Chee et al., 1989])의 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 외래 유전자를 배양된 대두로 전달하는 것이 보고되었다.

아그로박테리움-매개 형질전환으로부터 유래한 형질전환체는 낮은 카피 수를 갖는 단순한 삽입을 보유하는 경향이 있다(문헌[Birch, 1991]). 대두로의 유전자 전달을 위해 연구된 3 개의 표적 조직, 접합성 배 축(문헌[Chee et al., 1989; McCabe et al., 1988]), 자엽(문헌[Hinchee et al., 1988]), 및 체세포 배발생 배양(문헌[Finer and McMullen, 1991]) 각각과 관련된 이점과 단점이 존재한다. 상기의 것들은 직접 유전자 전달을 위한 표적 조직으로서 광범위하게 연구되어 왔다. 배발생 배양은 완전히 다작되는 경향이 있고 장기간에 걸쳐 유지될 수 있다. 그러나, 일차 형질전환체의 불임성 및 염색체 이상이 배발생 현탁의 시기(문헌[Singh et al., 1998])와 관련되었고, 따라서 새로운 배양의 계속적인 개시가 이러한 조직을 이용하는 대두 형질전환 시스템에 필요한 것으로 나타난다. 이러한 시스템은 배발생 캘러스를 개시하기 위하여 높은 수준의 2,4-D, 40 ㎎/L 농도를 필요로 하며, 이는 형질전환된 유전자좌가 배지에서 2,4-D로 더욱 발달되지 않을 수 있기 때문에 AAD-12(v1) 유전자를 사용하는 것에 근본적인 문제를 갖는다. 따라서, 분열조직 기반 형질전환은 AAD-12(v1)를 사용한 2,4-D 저항성 식물의 발달에 이상적이다.

이원 구축물의 게이트웨이 클로닝: AAD-12(v1) 코딩 서열은 상이한 식물 프로모터를 포함하는 5 개의 상이한 게이트웨이 도너 벡터 내로 클로닝되었다. 얻은 AAD-12(v1) 식물 발현 카세트는 이어서 LR 클로나제 반응(캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corporation), Cat #11791-019)을 통해 게이트웨이 데스티네이션 이원 벡터 내로 클로닝되었다.

AAD-12(v1) 코딩 서열을 포함하는 NcoI-SacI 단편은 DASPICO12로부터 소화되었고 다음의 게이트웨이 도너 벡터 내의 상응하는 NcoI-SacI 제한 부위에 결찰되었다: pDAB3912(attL1//CsVMV 프로모터//AtuORF23 3'UTR//attL2); pDAB3916(attL1//AtUbi10 프로모터//AtuORF23 3'UTR//attL2); pDAB4458(attL1//AtUbi3 프로모터//AtuORF23 3'UTR//attL2); pDAB4459(attL1//ZmUbi1 프로모터//AtuORF23 3'UTR//attL2); 및 pDAB4460(attL1//AtAct2 프로모터//AtuORF23 3'UTR//attL2). 다음의 식물 발현 카세트를 포함하는 얻어진 구축물이 명명되었다: pDAB4463(attL1//CsVMV 프로모터//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//attL2); pDAB4467(attL1//AtUbi10 프로모터//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//attL2); pDAB4471(attL1//AtUbi3 프로모터//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//attL2); pDAB4475(attL1//ZmUbi1 프로모터//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//attL2); 및 pDAB4479(attL1//AtAct2 프로모터//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//attL2). 이러한 구축물은 제한 효소 소화 및 서열화를 통하여 확인되었다.

식물 발현 카세트는 게이트웨이 LR 클로나제 반응을 통하여 게이트웨이 데스티네이션 이원 벡터 pDAB4484(RB7 MARv3//attR1-ccdB-클로람페니콜 저항성-attR2//CsVMV 프로모터//PATv6//AtuORF1 3'UTR) 내로 재조합되었다. 게이트웨이 기술은 관심 유전자를 발현 벡터 내로 삽입하기 위하여 제한 엔도뉴클레아제 및 리가제 대신 람다 파지-계 부위-특이적 재조합을 사용한다. 인비트로젠 코포레이션, 게이트웨이 기술: 문헌[A Universal Technology to Clone DNA Sequences for Functional Analysis and Expression in multiple Systems, Technical Manual, Catalog #'s 12535-019 and 12535-027, Gateway Technology Version E, Sep. 22, 2003, #25-022]. DNA 재조합 서열(attL, 및 attR) 및 LR 클로나제 효소 혼합물은 대응 부위를 포함하는 임의의 벡터 내로 전달되는 재조합 부위가 측면에 배치된 임의의 DNA 단편을 허용한다. 도너 벡터의 attL1 부위는 이원 벡터의 attR1에 대응한다. 마찬가지로 도너 벡터의 attL2 부위는 이원 벡터의 attR2에 대응한다. 게이트웨이 기술을 사용하여, attL 부위가 측면에 배치된 식물 발현 카세트(도너 벡터로부터)가 이원 벡터의 attR 부위 내로 재조합될 수 있다. 다음의 식물 발현 카세트를 포함하는 얻어진 구축물은 다음과 같이 라벨링되었다: pDAB4464(RB7 MARv3//CsVMV 프로모터//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//CsVMV 프로모터//PATv6 AtuORF1 3'UTR); pDAB4468(RB7 MARv3//AtUbi10 프로모터//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//CsVMV 프로모터//PATv6//AtuORF1 3'UTR); pDAB4472(RB7 MARv3//AtUbi3 프로모터//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//CsVMV 프로모터//PATv6//AtuORF1 3'UTR); pDAB4476(RB7 MARv3//ZmUbi1 프로모터//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//CsVMV 프로모터//PATv6 AtuORF1 3'UTR); 및 pDAB4480(RB7 MARv3//AtAct2 프로모터//AAD-12(v1)//AtuORF23 3'UTR//CsVMV 프로모터//PATv6//AtuORF1 3'UTR). 이러한 구축물은 제한 효소 소화 및 서열화를 통하여 확인되었다.

형질전환 방법 1 - 아그로박테리움-매개 형질전환: 자엽 노드 영역에서의 대두 형질전환 표적된 분열조직 세포(문헌[Hinchee et al., 1988]) 및 정점의 분열조직으로부터의 싹 증식(문헌[McCabe et al., 1988])에 대한 최초의 보고. A. 투메파시엔스-기반 자엽 노드 방법에서, 외식체 제조 및 배양 배지 조성은 노드에서 예비적 분열조직의 증식을 자극한다. 이러한 처리에 의해 진정으로 탈분화되었지만 분화전능성인 캘러스 배양이 개시되는지는 불명확하게 남아있다. 단일 외식체로부터의 형질전환 이벤트의 다수의 클론의 회수 및 키메라 식물의 드문 회수(문헌[Clemente et al., 2000; Olhoft et al., 2003])는 단일 세포 기원, 다음의 트랜스제닉 분열조직 배지의 증식 또는 추가적인 싹의 증식을 겪는 균일하게 형질전환된 싹을 생산하기 위한 트랜스제닉 세포의 증식을 나타낸다. 원래는 미세투사물 충돌(문헌[McCabe et al., 1988])에 기초하지만 보다 최근에는 아그로박테리움-매개 형질전환(문헌[Martinell et al., 2002])에 적합한 대두 싹 증식 방법은 분명하게는 자엽 노드 방법과 동일한 수준 또는 유형의 탈분화를 겪지 않고, 이는 시스템이 발생 계통 키메라의 성공적인 확인에 기반하기 때문이다. 또한, 이는 2,4-D 선별 시스템에 이상적일 수 있는 비 2,4-D 기반 프로토콜이다. 따라서, 자엽 노드 방법은 2,4-D 저항성 대두 품종을 개발하기 위한 선택 방법일 수 있다.

AAD-12(v1) 내성 표현형의 식물 형질전환 생산. "마베릭(Maverick)" 및 아그로박테리움 매개 자엽 노드 형질전환 프로토콜의 종자 유래 외식체는 AAD-12(v1) 트랜스제닉 식물을 생산하는 데 사용되었다.

아그로박테리움 제조 및 접종: 5 개의 이원 pDAB 벡터 각각을 전달하는 아그로박테리움 균주 EHA101(문헌[Hood et al. 1986])(표 8)을 형질전환의 개시에 사용했다. 각각의 이원 벡터는 T-DNA 영역 내의 AAD-12(v1) 유전자 및 식물-선별가능한 유전자(PAT) 카세트를 포함한다. 플라스미드는 전기천공에 의하여 아그로박테리움의 EHA101 균주 내로 이동되었다. 이어서 선별된 콜로니는 대두 외식체의 아그로박테리움 처리 전 유전자의 통합에 대해 분석되었다. 마베릭 종자는 모든 형질전환 실험에서 사용되었고, 종자는 미주리주 컬럼비아 소재의 미주리 대학교에서 얻었다.

선별제로서 제초제 글루포시네이트와 결합된, 선별가능한 마커로서 PAT 유전자를 사용하는 대두(글리신 맥스)의 아그로박테리움-매개 형질전환을 수행하였다. 종자는 3 g/L 피타겔(시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재)로 고화된 B5 염기성 배지(문헌[Gamborg et al. 1968]) 상에서 발아되었다. 이어서 선별된 싹을 발근 배지로 옮겼다. 최적의 선별 방식은 글루포시네이트를 배지에서 제1 및 제2 싹 개시 단계에 걸쳐 8 mg/L로, 그리고 배지에서 싹 신장 동안 3-4 mg/L로 사용하는 것이었다.

신장된 싹(3-5 cm)을 발근 배지로 옮기기 전에, 절간의 잘라진 말단을 발근을 촉진하기 위하여 1 mg/L 인돌 3-부티르산에 1-3 분 동안 담그었다(문헌[Khan et al. 1994]). 싹은 발근 배지를 포함하는 25 x 100 mm 유리 배양 튜브에서 뿌리를 내렸고, 이후 이들은 콘비론스(Convirons)의 개방된 마젠타 상자 내의 메트로-믹스 200(험머트 인터네셔널, 미주리주 얼쓰 시티 소재)에서의 묘목의 적응을 위해 토양 혼합물로 옮겨졌다. 리버티 제초제(바이엘 크롭 사이언스)의 유효 성분인 글루포시네이트는 싹 개시 및 신장 동안 선별에 사용되었다. 뿌리내린 묘목을 이후의 적응 및 정착을 위하여 스크리닝되고 온실로 옮겨지기 전에 몇 주 동안 개방된 마젠타 상자 내에서 적응시켰다.

추정적으로 형질전환된 묘목의 분석법, 및 온실 내에서 정착한 T0 식물의 분석: 이 묘목의 선별된 잎의 말단 소엽은 결과를 관찰하여 추정적 형질전환체에 대해 스크리닝하기 위하여 1 주 2 회 간격으로 50 mg/L의 글루포시네이트가 페인팅된 잎이었다. 이어서 스크리닝된 묘목은 온실로 옮겨졌고, 적응 이후, 잎은 글루포시네이트로 다시 페인팅되어 GH에서 이러한 묘목의 내성 상태를 확인하였고 추정적 형질전환체로 여겨졌다.

온실로 옮겨진 식물은 T0 일차 형질전환체 또는 이들의 자손의 잎의 섹션을 글루포시네이트 용액[0.05-2% v/v 리버티 제초제, 바람직하게는 0.25-1.0 % (v/v),=500-2000 ppm 글루포시네이트, 바이엘 크롭 사이언스]으로 페인팅하는 비파괴적인 방식으로, 활성 PAT 유전자의 존재에 대해 더 분석될 수 있다. 사용한 농도에 따라, 글루포시네이트 손상에 대한 평가를 처리 후 1-7 일째에 할 수 있다. 식물은 또한 발생한 가장 어린 삼출엽 아래의 새롭게 확장된 삼출엽 하나 또는 2 개, 바람직하게는 2 개의 노드의 말단 소엽에 수중의 2,4-D 용액(0.25-1 % v/v 상용 2,4-D 디메틸아민 염 제형, 바람직하게는 0.5 % v/v=2280 ppm 2,4-D ae)의 선별적인 시용에 의한 비파괴적인 방식으로 2,4-D 내성에 대해 시험될 수 있다. 이러한 분석법은 인접한 소엽의 면으로부터 90 도 초과의 잎 회전 또는 플리핑(flipping)의 평가에 의해, 시용 후 6 시간 내지 며칠 째의 2,4-D 민감성 식물의 평가를 가능하게 한다. 2,4-D에 대해 내성인 식물은 2,4-D에 반응하지 않을 것이다. T0 식물은 T1 종자를 생성하기 위하여 온실 내에서 자가 수분하게 될 것이다. T1 식물(및 T0 식물 클론이 생산되기에 충분한 정도로)은 트랜스제닉 대두 내 AAD-12(v1) 및 PAT 유전자에 의한 제초제 보호의 수준을 결정하기 위한 제초제 시용량의 범위로 분무될 것이다. T0 식물에 사용된 2,4-D의 비율은 통상적으로는 상술한 바와 같은 트랙 분무기를 사용한 100-1120 g ae/ha의 범위 내의 1 또는 2 가지 선별적 비율을 포함할 것이다. T1 식물은 50-3200 g ae/ha 2,4-D 범위의 더 넓은 제초제 시용량으로 처리될 것이다. 마찬가지로, T0 및 T1 식물은 200-800 및 50-3200 g ae/ha 글루포시네이트로 각각 발아후 처리하여 글루포시네이트 저항성에 대해 스크리닝될 수 있다. 280-2240 g ae/ha 글리포세이트 범위의 시용량으로 글리포세이트를 발아후 시용함으로써 글리포세이트 저항성(EPSPS를 포함하는 구축물로 형질전환된 식물에서) 또는 다른 글리포세이트 내성 유전자가 T1 세대에서 평가될 수 있다. 개별 T0 식물은 관심 유전자(AAD-12(v1) 또는 PAT v6)의 코딩 영역의 존재 및 카피 수에 대해 평가되었다. AAD-12(v1)의 유전의 결정은 상기의 실시예에서 설명한 바와 같은 제초제 내성에 대한 T1 및 T2 자손 분리를 사용하여 이루어질 것이다.

초기 형질전환체의 서브셋을 상기 방법에 따라 T0 세대에서 평가했다. AAD-12(v1) 코딩 영역을 갖는 것으로 확인된 어떤 식물도 유전자를 구동하는 프로모터에 관계없이 2,4-D 잎 페인팅에 반응하지 않았고, 반면에 야생형 마베릭 대두는 반응했다. PAT만이 형질전환된 식물은 야생형 식물에서와 동일하게 2,4-D의 잎 페인트 시용에 반응했다.

2,4-D는 야생형 대조군 식물과 유사한 크기인 식물의 서브셋에 560 또는 1120 g ae 2,4-D으로 시용되었다. 모든 AAD-12(v1)-포함 식물은 야생형 마베릭 대두에 비해 제초제 시용에 분명히 저항성이었다. 낮은 수준의 손상(2 DAT)이 2 개의 AAD-12(v1) 식물에 대해 관찰되었으나, 손상은 일시적이고 7 DAT에는 손상이 관찰되지 않았다. 야생형 대조군 식물은 560 g ae/ha 2,4-D에서 7-14 DAT에 심각하게 손상되었고 1120 g ae/ha에서 사망했다. 이러한 데이터는 AAD-12(v1)가 대두와 같은 민감성 작물에 높은 내성(재배지 비율의 2 배 초과)을 부여할 수 있다는 사실과 일치한다. 이어서 스크리닝된 식물은 AAD12(v1) 유전자 통합, 카피 수 및 유전자 발현 수준의 확인을 위한 분자 및 생화학 분석을 위해 샘플링되었다.

분자 분석 - 대두: 조직 수확 DNA 분리 및 정량화. 새로운 조직을 튜브에 넣고 4 ℃에서 2 일간 동결건조했다. 조직이 완전히 건조된 후, 텅스텐 비드(발레나이트)를 튜브에 넣고 샘플을 켈코 비드 밀을 사용하여 1 분 동안 건조 분쇄시켰다. 표준 DNeasy DNA 분리 과정이 이어졌다(퀴아젠, DNeasy 69109). 다음으로 추출된 DNA의 분취량을 피코 그린(몰리큘러 프로브스 P7589)으로 염색했고, ng/μl 단위의 농도를 얻기 위하여 공지의 표준으로 형광광도계(바이오테크)에서 판독했다.

폴리머라제 연쇄 반응: 총 100 ng의 전체 DNA를 템플릿으로 사용했다. 각 프라이머의 20 mM가 타카라 Ex Taq PCR 폴리머라제 키트(미루스 TAKRR001A)와 함께 사용되었다. AAD-12(v1) PTU에 대한 프라이머는 (포워드-ATAATGCCAG CCTGTTAAAC GCC)(서열 8) 및 (리버스-CTCAAGCATA TGAATGACCT CGA)(서열 9)였다. PCR 반응은 샘플을 94 ℃에서 3 분, 및 94 ℃에서 30 초 동안, 63 ℃에서 30 초 동안, 및 72 ℃에서 1 분 45 초 동안, 다음으로 72 ℃에서 10 분 동안의 사이클 35 회를 거치게 함으로써 9700 진앰프 써모사이클러(어플라이드 바이오시스템즈)에서 수행되었다. AAD-12(v1) 코딩 영역 PCR에 대한 프라이머는 (포워드-ATGGCTCATG CTGCCCTCAG CC)(서열 10) 및 (리버스-CGGGCAGGCC TAACTCCACC AA)(서열 11)였다. PCR 반응은 샘플을 94 ℃에서 3 분, 및 94 ℃에서 30 초 동안, 65 ℃에서 30 초 동안, 및 72 ℃에서 1 분 45 초 동안, 다음으로 72 ℃에서 10 분 동안의 사이클 35 회를 거치게 함으로써 9700 진앰프 써모사이클러(어플라이드 바이오시스템즈)에서 수행되었다. PCR 생성물은 EtBr로 염색된 1 % 아가로오스 겔 상에서 전기영동함으로써 분석되었다.

써던 블롯 분석: 써던 블롯 분석을 퀴아젠 DNeasy 키트에서 얻은 전체 DNA로 수행하였다. 총 10 ㎍의 게놈 DNA를 통합 데이터를 얻기 위하여 밤새 소화시켰다. 밤샘 소화 후, ~100 ng의 분취량을 완전한 소화를 확인하기 위하여 1 % 겔에 흘렸다. 이러한 확인 후, 샘플을 40 볼트에서 밤새 대량의 0.85 % 아가로오스 겔 위에 흘렸다. 이어서 겔은 0.2 M NaOH, 0.6 M NaCl에서 30 분 동안 변성되었다. 이어서 겔은 0.5 M Tris HCl, 1.5 M NaCl(pH 7.5)에서 30 분간 중화되었다. 이어서 20 x SSC를 포함하는 겔 장치가 밤새 나일론 멤브래인(밀리포어 INYC00010) 이동을 위한 중력 겔을 얻기 위하여 설치되었다. 밤샘 이동 후, 이어서 멤브래인은 1200 x 100 μJ로 가교제(스트라타진 UV 스트라타링커 1800)를 통해 UV 광에 놓였다. 이어서 멤브래인은 0.1 % SDS, 0.1 SSC에서 45 분간 세척되었다. 45 분의 세척 후, 멤브래인은 3 시간 동안 80 ℃로 가열건조된 후 하이브리드화될 때까지 4 ℃에서 저장되었다. 하이브리드화 템플릿 단편은 플라스미드 DNA를 사용한 상기의 코딩 영역 PCR을 사용하여 제조되었다. 생성물을 1 % 아가로오스 겔에 흘리고 잘라낸 후 퀴아젠(28706) 겔 추출 과정을 사용하여 겔을 추출했다. 이어서 멤브래인을 퍼펙트 히브 버퍼(시그마 H7033)에서 60 ℃ 단계로 1 시간 동안 사전-하이브리드화시켰다. p32계 프로브(펄킨 엘머)를 현상하기 위하여 프라임 it RmT dCTP-라벨링 rxn(스트라타진 300392) 과정을 사용했다. 프로브 콴트. G50 칼럼(아메르샴 27-5335-01)을 사용하여 프로브를 세척했다. 밤새 써던 블롯을 하이브리드화하는 데 2백만 카운트 CPM을 사용했다. 이어서 밤샘 하이브리드화 후, 블롯을 65 ℃에서 0.1 % SDS, 0.1 SSC에서 2 회 20 분 동안 세척시켰다. 이어서 블롯을 밤새 필름에 노출시켰고, - 80 ℃에서 인큐베이팅했다.

생화학 분석 - 대두: 대두 잎으로부터의 조직 샘플링 및 AAD-12(v1) 단백질 추출. 잎 조직의 약 50 내지 100 mg를 페인팅된 2,4-D 잎인 N-2 잎으로부터, 그러나 1 DAT 후에 샘플링했다. 말단의 N-2 소엽을 제거했고 작은 조각 또는 2-단일-구멍-펀칭된 잎 디스크(직경이 ~0.5 cm)로 절단되었으며 즉시 드라이 아이스에서 동결되었다. 이에 따라 단백질 분석(ELISA 및 웨스턴 분석)을 완료했다.

T1 자손 평가: T1 패밀리를 얻기 위하여 T0 식물이 자가 수분되도록 할 것이다. 자손 시험(분리 분석)은 V1-V2 성장 단계에서 시용된 선별제로서 글루포시네이트를 560 g ai/ha로 사용하여 분석될 것이다. 생존한 식물은 또한 V2-V6으로부터의 하나 이상의 성장 단계에서 2,4-D 내성에 대해 분석될 것이다. 종자는 트랜스제닉 대두에 대한 광범위한 제초제 시험을 가능하게 하도록 자가 수분을 통해 생산될 것이다.

AAD-12(v1) 트랜스제닉 마베릭 대두 식물은 아그로박테리움-매개 형질전환 시스템을 통해 생성되었다. 얻어진 T0 식물은 2,4-D 재배지 시용의 2 x 수준까지 내성이 생겼으며 번식가능한 종자를 만들었다. 번식가능한 트랜스제닉 대두 식물의 빈도는 5.9 % 이하였다. 대두 게놈으로의 AAD1-12(v1) 유전자의 통합은 써던 블롯 분석에 의해 확인되었다. 이 분석은 대부분의 트랜스제닉 식물이 낮은 카피수를 포함한다는 것을 나타냈다. AAD-12(v1) 항체로 스크리닝된 식물은 ELISA에서 양성을, 그리고 웨스턴 분석에서 적절한 밴드를 나타냈다.

형질전환 방법 2 - 배발생 대두 캘러스 조직의 에어로졸-빔 매개 형질전환: 배발생 대두 캘러스 조직의 배양 및 후속 비밍이 미국 특허 번호 6,809,232(헬드(Held) 등)에서 설명된 바와 같이 달성되어 본원에서 제공된 구축물을 사용하여 형질전환체를 생성할 수 있었다.

형질전환 방법 3 - 대두의 바이올리스틱 충돌: 이는 배 축 분열조직에서 유래된 성숙한 종자를 사용하여 달성될 수 있다(문헌[McCabe et al. (1988)]). 확립된 바이올리스틱 충돌 방법에 따라, 형질전환된 대두 식물의 회수를 기대할 수 있다.

형질전환 방법 4 - 휘스커 매개 형질전환: 문헌[Terakawa et al. (2005)]에 의해 앞서 설명된 방법에 따라 휘스커 제조 및 휘스커 형질전환을 수행할 수 있다. 확립된 바이올리스틱 충돌 방법에 따라 형질전환된 대두 식물의 회복을 기대할 수 있다.

마베릭 종자를 70 % 에탄올에서 1 분 동안 표면-살균한 후 1 % 차아염소산나트륨에 20 분간 침지시키고 이어서 살균 증류수에서 3 회 헹궜다. 종자를 증류수에 18-20 시간 동안 담그었다. 배 축을 종자로부터 잘라냈고 일차 잎을 제거함으로써 정단 분열조직을 노출시켰다. 배 축을 충돌 배지[BM: MS(무라시게 및 스쿠그 1962) 기초 염 배지, 3 % 수크로오스 및 0.8 % 피타겔 시그마, pH 5.7] 내에 위치시켜, 12 ml 배양 배지를 포함하는 5-cm 배양 접시 위로 정단 영역이 향하게 했다.

형질전환 방법 5 - 배발생 캘러스 조직에 대한 입자 충돌-매개 형질전환은 상기의 방법에 따라 최적화될 수 있다(문헌[Khalafalla et al., 2005; El-Shemy et al., 2004, 2006]).

실시예 8

목화에서의 AAD-12(v1)

목화 형질전환 프로토콜: 목화 종자(Co310 유전자형)를 95 % 에탄올에서 1 분간 표면-살균하고 헹구고, 50 % 상용 표백제로 20 분간 살균하고, 이어서 살균 증류수로 3회 헹구고, 이후에 마젠타 GA-7 용기 내의 G-배지(표 21) 상에서 발아시키고 40-60 μE/m²의 높은 빛 세기 하에서 광주기를 16 시간의 명기 및 8 시간의 암기로 설정하고 28 ℃에서 유지했다.

정사각형 자엽 세그먼트(~ 5 mm)를 7-10 일생 묘목으로부터 페트리 플레이트(Nunc, 아이템 #0875728) 내의 액체 M 액체 배지(표 21)로 분리했다. 절단된 세그먼트를 아그로박테리움 용액(30 분간)으로 처리하고 이어서 반-고체 M-배지(표 21)로 옮기고 2-3 일간 공동배양했다. 공동배양 후, 세그먼트를 MG 배지(표 21)로 옮겼다. 칼베니실린은 아그로박테리움을 죽이기 위한 항생제이고 글루포시네이트-암모늄은 전달된 유전자를 포함하는 세포만의 성장을 가능하게 하는 선별제이다.

아그로박테리움 제조: 35 ml의 Y 배지(표 21)(스트렙토마이신(100 mg/ml 스톡) 및 에리트로마이신(100 mg/ml 스톡))에 한 루프의 박테리아를 접종하여 150 rpm으로 진탕하면서 28 ℃에서 어둠 속에 밤새 성장하게 했다. 다음날, 아그로박테리움 용액을 살균 오크리지(oakridge) 튜브(Nalge-Nunc, 3139-0050) 내로 붓고, 베크만 J2-21에서 8,000 rpm으로 5 분간 원심분리시켰다. 상청액을 붓고 25 ml의 M 액체(표 21)에 펠릿을 재현탁하고 볼텍싱하였다. 클레트 리딩(Klett reading)(클레트-섬머슨(Klett-Summerson), 모델 800-3)에 대해 분취량을 유리 배지 튜브(피셔(Fisher), 14-961-27)에 넣었다. M 액체 배지를 사용하여 새로운 현탁액을 총 부피 40 ml로 ml당 10⁸ 콜로니 형성 유닛의 클레트-미터 리딩으로 희석했다.

3 주 후, 자엽 세그먼트로부터의 캘러스를 분리하고 새로운 MG 배지로 옮겼다. 캘러스를 추가의 3 주 동안 MG 배지에 옮겼다. 나란히 비교했을 때, MG 배지는 2,4-D의 분해를 위한 보충으로 디클로르프로프(배지에 0.01 및 0.05 mg/L의 농도로 첨가됨)로 보충될 수 있고, 이는 디클로르프로프가 AAD-12 효소에 대한 기질이 아니지만 디클로르프로프는 2,4-D보다 목화에 대해 더 활성이기 때문이다. 각각의 비교에서 표준 MG 배지와 비교하여 성장 조절제를 포함하지 않는 MG 배지 상에 플레이팅된 세그먼트는 감소된 캘러싱을 나타냈지만, 여전히 캘러스 성장은 있었다. 이어서 캘러스를 CG-배지(표 21)로 옮겼고, 3 주 후에 다시 새로운 선별 배지로 옮겼다. 또 3 주 후, 캘러스 조직은 배발생 캘러스 유도를 위한 식물 성장 조절제가 결핍된 D 배지(표 21)로 옮겨졌다. 이러한 배지 상에서의 4-8 주 후, 배발생 캘러스가 형성되었고, 황백색 및 과립 세포에 의해 비배발생 캘러스와 구별할 수 있었다. 배는 직후에 재생되기 시작했고 뚜렷하게 색깔이 녹색이었다. 목화는 재생하고 배를 형성하는 데 시간이 걸릴 수 있고, 이러한 과정을 빠르게 하기 위한 방법 중 하나는 조직에 스트레스를 주는 것이다. 건조는 이를 달성하기 위한 일반적인 방법이며 더 적은 배양 배지를 사용하고/하거나 다양한 플레이트 밀봉 모드(테이핑 대 파라필름)를 채택함으로써, 조직 및 플레이트의 미세 환경의 변화를 통하는 것이다.

더 크고 잘 발달된 배를 분리하고 배 발달을 위해 DK 배지(표 21)로 옮겼다. 3 주 후(또는 배가 발달했을 때), 발아된 배를 싹 및 뿌리 발달을 위해 새로운 배지로 옮겼다. 4-8 주 후, 임의의 잘-발달된 식물을 토양으로 옮기고 성숙할 때까지 성장시켰다. 몇 달 후, 식물은 2,4-D에 저항성을 가지고 있는지 결정하기 위해 분무될 수 있을 정도로 성장했다.

세포 형질전환: 몇 가지 실험을 개시했으며 여기서 자엽 세그먼트는 pDAB724을 포함하는 아그로박테리움으로 처리되었다. 얻어진 세그먼트들 중 2000 개 초과가 pDAB724 목화 캘러스의 증식을 위한 다양한 옥신 옵션, 0.1 또는 0.5 mg/L R-디클로르프로프, 표준 2,4-D 농도 및 옥신 처리하지 않음을 사용하여 처리되었다. 캘러스는 구축물 내에 PAT 유전자를 포함하고 있기 때문에 글루포시네이트-암모늄 상에서 선별되었다. PCR 및 인베이더 형태의 캘러스 계통 분석은 유전자가 캘러스 단계에서 존재하는지; 따라서 배발생적인 캘러스 계통이 웨스턴 분석을 위해 보내질 것인지를 결정 및 확인하기 위하여 사용될 것이다. 배발생 목화 캘러스는 회수된 조직의 질 및 양을 개선하기 위하여 건조 기술을 사용하여 스트레스를 받았다. 거의 200 개의 캘러스 이벤트가 AAD-12(v1) 유전자에 대한 웨스턴 분석을 사용하여 온전한 PTU 및 발현에 대해 스크리닝되었다.

식물 재생: 상기 프로토콜에 따라 식물을 생산한 AAD-12(v1) 목화 계통은 온실로 보내질 것이다. AAD-12(v1) 유전자가 목화에서 2,4-D에 저항성을 제공한다는 것을 증명하기 위하여 AAD-12(v1) 목화 식물 및 야생형 목화 식물 모두는 분무 부피 187 L/ha로 560 g ae/ha 2,4-D를 전달하는 트랙 분무기로 분무될 것이다. 식물을 처리 후 3 및 14 일째 평가할 것이다. 2,4-D의 선별적 비율에서 생존한 식물은 자가 수분하여 T1 종자를 생성하거나 F1 종자를 생산하기 위하여 엘리트 목화 계통으로 이종교배될 것이다. 생산된 후대 종자는 상술한 바와 같이 식재되고 제초제 저항성에 대해 평가될 것이다. AAD-12(v1) 이벤트는 다른 원하는 HT 또는 IR 트랜츠(trants)와 조합될 수 있다.

실시예 9

다른 작물의 아그로박테리움 형질전환

본 개시에 비추어, 추가적인 작물이 본 기술분야에서 알려진 기술을 사용하여 본 발명에 따라 형질전환될 수 있다. 호밀의 아그로박테리움-매개 형질전환에 대해서 예를 들면 문헌[Popelka and Altpeter(2003)]을 참조한다. 대두의 아그로박테리움-매개 형질전환에 대해서 예를 들면 문헌[Hinchee et al., 1988]을 참조한다. 수수의 아그로박테리움-매개 형질전환에 대해서 예를 들면 문헌[Zhao et al., 2000]을 참조한다. 보리의 아그로박테리움-매개 형질전환에 대해서 예를 들면 문헌[Tingay et al., 1997]을 참조한다. 밀의 아그로박테리움-매개 형질전환에 대해서 예를 들면 문헌[Cheng et al., 1997]을 참조한다. 벼의 아그로박테리움-매개 형질전환에 대해서 예를 들면 문헌[Hiei et al., 1997]을 참조한다.

이러한 및 다른 식물에 대한 라틴 이름을 하기에 제시한다. 이러한 및 다른 (비 아그로박테리움) 형질전환 기술이 AAD-12(v1)를 예를 들면 메이즈(제아 메이스), 밀(트리티쿰 종), 벼(오리자 종 및 지자니아 종), 보리(호르데움 종), 목화(아브로마 아우구스타 및 고씨피움 종), 대두(글리신 맥스), 설탕 및 테이블 비트(베타 종), 사탕수수(아렌가 핀나타), 토마토(리코페르시콘 에스큘렌툼 및 다른 종, 피살리스 익소카르파, 솔라넘 인카넘 및 다른 종, 및 시포맨드라 베타세아), 감자(솔라넘 투베르소엄), 고구마(이포모에아 페타타스), 호밀(세칼레 종), 후추(카프시쿰 안눔, 시넨제, 및 프루테스켄스), 상추(락투카 사비타, 페렌니스, 및 풀첼라), 배추(브라시카 종), 셀러리(아피움 그라베올렌스), 가지(솔라넘 멜론게나), 땅콩(아라키스 히포게아), 수수(모든 소르검 종), 알팔파(메디카고 사티부아), 당근(다우쿠스 카로타), 콩(파세올러스 종 및 다른 속), 귀리(아베나 사티바 및 스트리고사), 완두콩(피섬, 비그나, 및 테트라고놀로버스 종), 해바라기(헬리안투스 안누스), 스쿼시(쿠쿠르비타 종), 오이(쿠쿠미스 사티바), 담배(니코티아나 종), 아라비돕시스(아라비돕시스 탈리아나), 터프그래스(롤리움, 아그로스티스, 포아, 시나돈, 및 다른 속), 클로버(티폴리움), 벳치(비시아)를 비제한적으로 포함하는 이러한 및 다른 식물로 형질전환하는 데 사용될 수 있다는 것을 분명히 해야 한다. 예를 들면 AAD-12(v1) 유전자를 갖는 이러한 식물은 본 발명에 포함된다.

AAD-12(v1)는 많은 낙엽성의 상록수 목재 경작 시스템에서의 제철 사용을 위한 주요 옥신 제초제의 시용가능성을 증가시키기 위한 잠재력을 갖는다. 트리클로피르, 2,4-D, 및/또는 플루오록시피르 저항성 목재 종은 손상의 우려 없이 이러한 제초제의, 정도를 지나친 사용의 유연성을 증가시킬 것이다. 이러한 종은 비제한적으로 앨더(앨너스 종), 애쉬(프락시너스 종), 백양나무 및 포플러 나무 종(포풀러스 종), 너도밤나무(파거스 종), 자작나무(베툴라 종), 체리(프루너스 종), 유칼립투스(유칼립투스 종), 히코리(카랴 종), 단풍나무(에이서 종), 오크(퀘르커스 종) 및 잣나무(파이너스 종)을 포함할 수 있다. 장식용 및 열매가 열리는 종에서의 선별적 잡초 방제를 위한 옥신 저항성의 사용은 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 예는 비제한적으로 장미(로사 종), 버닝 부시(유오니머스 종), 페투니아(페투니아 종), 베고니아(베고니아 종), 진달래(로도덴드론 종), 크랩애플 또는 사과(맬러스 종), 배(피러스 종), 복숭아(프루너스 종), 및 매리골드(타게테스 종)를 포함할 수 있다.

실시예 10

놀라운 결과의 추가 증거 : AAD-12 vs. AAD-2

AAD-2(v1) 초기 클로닝: NCBI 데이터베이스(ncbi.nlm.nih.gov 웹사이트; accession #AP005940 참조)로부터 tfdA와 오직 44 %의 아미노산 동일성을 갖는 동족체로서 또 다른 유전자가 확인되었다. 이러한 유전자는 본원에서 일관성을 위해 AAD-2(v1)로 지칭된다. AAD-2 및 tfdA DNA 서열(각각 PCT/US2005/014737의 서열 12 및 진뱅크 수탁번호 M16730) 둘 모두를 단백질(각각 PCT/US2005/014737의 서열 13 및 진뱅크 수탁번호 M16730)로 우선 번역한 다음, 벡터NTI(VectorNTI) 소프트웨어 패키지의 클러스탈W(ClustalW)를 사용하여 다중 서열 정렬을 수행함으로써 퍼센트 동일성을 결정하였다.

AAD-2(v1) 유전자를 함유한 브라디리조비움 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum)의 균주를 노던 리저널 리서치 래보러토리(Northern Regional Research Laboratory)(NRRL, 균주 #B4450)로부터 얻었다. 동결건조된 균주가 NRRL 프로토콜에 따라 회복되었고, 다우 박테리얼(Dow Bacterial) 균주 DB 663으로서 내복용(internal use) 20 % 글리세롤에서 -80 ℃로 저장하였다. 이러한 냉동고 스톡으로부터, 분리를 위한 세포의 루프풀(loopful)로 트립틱 소이 아가(Tryptic Soy Agar)의 플레이트로 독립하며, 3 일 동안 28 ℃에서 인큐베이팅되었다. 단일 콜로니를 사용하여 500 ml 세-격실 플라스크 내에 트립틱 소이 브로쓰 100 ml에 접종하고, 이는 150 rpm에서 플로어 진탕기 상에서 28 ℃로 밤새 인큐베이팅하였다. 이로부터, 총 DNA가 퀴아젠 DNeasy 키트(퀴아젠 cat.#69504)의 그램 음성 프로토콜로 분리되었다. 다음의 프라이머가 게놈 DNA로부터 표적 유전자를 증폭시키도록 설계되었다, 포워드: 5' ACT AGT AAC AAA GAA GGA GAT ATA CCA TGA CGA T 3'[(brjap 5'(speI) PCT/US2005/014737의 서열 14(Spe I 제한 부위 및 리보솜 결합 부위(RBS)를 첨가했음)] 및 리버스: 5' TTC TCG AGC TAT CAC TCC GCC GCC TGC TGC TGC 3'[(br jap 3'(xhoI) PCT/US2005/014737의 서열 15(Xho I 부위를 첨가했음)].

다음에 따라 50 μl 반응을 설정하였다: 페일 세이프 버퍼(Fail Safe Buffer) 25 ㎕, ea. 프라이머 1 ㎕(50 ng/㎕), gDNA 1 ㎕(200 ng/㎕), H.sub.2O 21 ㎕, Taq 폴리머라제 1 ㎕(2.5 유닛/㎕). 3 개의 페일 세이프 버퍼-A, B, 및 C를 3 개의 별개의 반응에 사용하였다. 이어서 PCR을 다음의 조건 하에서 수행하였다: 95 ℃. 3.0 분 가열 변성 사이클; 30 사이클의 경우, 95 ℃. 1.0 분, 50 ℃. 1.0 분, 72 ℃. 1.5 분; 페일세이프 PCR 시스템(에피센터(Epicenter) cat. #F599100)을 사용하여 72 ℃. 5 분의 최종 사이클. 얻은 ~1 kb PCR 생성물을 뉴클레오티드 서열의 검증을 위한, 숙주 균주로서 화학적으로 컴피턴트 TOP10F' E. 콜라이를 사용하여, 포함된 프로토콜에 따라 pCR2.1(인비트로겐 cat. #K4550-40)로 클로닝하였다.

얻어진 백색 콜로니 10 개를 3 ㎕ 루리아 브로쓰(Luria Broth) + 1000 ㎍/ml 암피실린(LB Amp)으로 고르고, 37 ℃에서 교반하면서 밤새 성장시켰다. 뉴클레오스핀 플러스 플라스미드 미니프렙 키트(Nucleospin Plus Plasmid Miniprep Kit)(BD 바이오사이언시즈(Biosciences) cat. #K3063-2)를 사용하여 포함된 프로토콜에 따라 각각의 배양물에서 플라스미드를 정제하였다. 분리된 DNA의 제한 소화를 완료하여 pCR2.1 벡터에서 PCR 생성물의 존재를 확인하였다. 제한 효소 EcoRI(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) cat. #R0101S)로 플라스미드 DNA를 소화하였다. 제조사의 지시에 따라, M13 포워드[5' GTA AAA CGA CGG CCA G 3'](서열 6) 및 리버스[5' CAG GAA ACA GCT ATG AC 3'](서열 7) 프라이머를 사용하여 베크만 CEQ 퀵 스타트 키트(Beckman CEQ Quick Start Kit)(베크만 쿨터 cat. #608120)로 서열화를 수행하였다. 내부 일관성을 위해 이러한 유전자 서열 및 그의 대응하는 단백질이 새로운 일반 명칭 AAD-2(v1)으로 주어졌다.

AAD-2(v1) 이원 벡터의 완성: AAD-2(v1) 유전자를 pDAB3202로부터 PCR 증폭하였다. PCR 반응 동안 프라이머 내에서 변이가 행해지며, 5' 프라이머 및 3' 프라이머 각각에 AflIII 및 SacI 제한 부위가 도입된다. PCT/US2005/014737를 참조한다. 프라이머 "NcoI of Brady"[5' TAT ACC ACA TGT CGA TCG CCA TCC GGC AGC TT 3'](서열 14) 및 "SacI of Brady"[5' GAG CTC CTA TCA CTC CGC CGC CTG CTG CTG CAC 3'](서열 15)는 페일 세이프 PCR 시스템(에피센트레)을 사용하여 DNA 단편을 증폭하는데 사용하였다. PCR 생성물을 pCR2.1 TOPO TA 클로닝 벡터(인비트로겐)로 클로닝하였고, 베크만 쿨터 "다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 위드 퀵 스타트 키트(Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit)" 서열화 시약을 사용하여 서열을 M13 포워드 및 M13 리버스 프라이머로 확인하였다. 서열 데이터는 올바른 서열(pDAB716)을 갖는 클론을 확인하였다. 이어서 AflIII/SacI AAD-2(v1) 유전자 단편을 NcoI/SacI pDAB726 벡터로 클로닝하였다. 얻은 구축물(pDAB717); AtUbi10 프로모터: Nt OSM 5'UTR: AAD-2(v1): Nt OSM3'UTR: ORF1 폴리A 3'UTR가 제한 소화(NcoI/SacI에 의해)로 확인되었다. 이러한 구축물은 NotI-NotI DNA 단편으로서 이원성 pDAB3038로 클로닝하였다. 얻은 구축물(pDAB767); AtUbi10 프로모터: Nt OSM5'UTR: AAD-2(v1): Nt OSM 3'UTR: ORF1 폴리A 3'UTR: CsVMV 프로모터: PAT: ORF25/26 3'UTR는 올바른 배향의 확인을 위해 제한 소화(Nod, EcoRI, HinDIII, NcoI, PvuII, 및 SalI에 의해)되었다. 이어서 완성된 구축물(pDAB767)이 아그로박테리움으로의 형질전환을 위해 사용되었다.

형질전환된 아라비돕시스의 평가: 식물 최적화된 AAD-12(v1) 또는 천연 AAD-2(v1) 유전자로 형질전환된 새로 수확된 T1 종자를 심고, 상술한 식물이 다양한 비율의 2,4-D(50-3200 g ae/ha)로 무작위로 할당되었기 때문에 글루포시네이트에 대한 저항성을 위해 선별하였다. 187 L/ha 분무 부피로 트랙 분무기로 제초제 시용이 시용되었다. 사용된 2,4-D는 200 mM 트리스 버퍼(pH 9.0) 또는 200 mM 헤페스(HEPES) 버퍼(pH7.5)에 혼합된 상용 디메틸아민 염 제형(456 g ae/L, 미주리주, 세인트 조셉 소재의 누팜(NuFarm))이었다.

AAD-12(v1) 및 AAD-2(v1)은 형질전환된 및 비형질전환된 대조군 계통에 비해 검출가능한 2,4-D 저항성을 제공하였으나; 개별적인 구축물은 개별적인 T1 아라비돕시스 식물에 2,4-D 저항성을 부여하는 그들의 능력이 매우 다양하였다. 놀랍게도, AAD-2(v1) 및 AAD-2(v2) 형질전환체는 매우 내성인 식물의 빈도뿐만 아니라 전체적인 평균 손상률 둘 다로부터, AAD-12(v1) 유전자보다 2,4-D에 매우 덜 저항성이었다. AAD-2(v1)로 형질전환된 식물은 200 g ae/ha 2,4-D 상대적 비손상(<20 % 시각적 손상률)으로 생존하지 못하였고, 전체적인 집단 손상률은 약 83 %였다(PCT/US2005/014737 참조). 대조적으로, AAD-12(v1)는 3,200 g ae/ha 2,4-D로 처리될 때, 약 6 %의 집단 손상률 평균을 가졌다. 내성은 천연 유전자에 비해 식물-최적화된 AAD-2(v2)에 대해 약간 향상되었으나, AAD-12 및 AAD-2 식물 최적화된 유전자의 비교는 식물 내 AAD-12(v1)에 대한 상당한 이점을 나타낸다.

나타낸 AAD-2(v1)(PCT/US2005/014737 참조) 및 AAD-12(v2)의 시험관 내 비교 모두가 2,4-D 저하에 매우 효과적이며, 둘 다 키랄 아릴옥시알카노에이트 기질에 대해 S-유형 특이성을 공유하는 것을 고려할 때, 이러한 결과는 예상하지 못한 것이다. AAD-2(v1)는 다양한 수준으로 개별적인 T1 식물에서 발현되지만, 이러한 발현된 단백질에 의한 2,4-D 손상으로부터의 보호는 거의 제공되지 않는다. 천연 및 식물 최적화된 AAD-2 유전자에 대한 단백질 발현 수준(식물 내)의 실질적인 차이는 분명하지 않다(PCT/US2005/014737 참조). 이러한 데이터는 식물에서 AAD-12(v1)의 기능적 발현, 및 얻은 2,4-D 및 피리딜옥시아세테이트 제초제에 대한 제조체 저항성을 예상하지 못하게 하는 조기 발견을 제공한다.

실시예 11

AAD-12(v1)만으로 형질전환된 대두, 목화 및 다른 쌍떡잎 작물에서 페녹시 옥신 제초제의 작물 내 사용

AAD-12(v1)은 보통 2,4-D에 민감성인 작물에 직접적으로 넓은 스펙트럼의 활엽 잡초의 방제를 위해 페녹시 옥신 제초제(예컨대, 2,4-D 및 MCPA) 및 피리딜옥시 옥신(트리클로피르 및 플루오록시피르)의 사용을 가능하게 할 수 있다. 280 내지 2240 g ae/ha로 2,4-D의 시용은 작물학적 환경에 존재하는 가장 활엽인 잡초 종을 방제할 것이다. 보다 통상적으로, 560-1120 g ae/ha가 사용된다. 트리클로피르의 경우, 시용 비율은 통상적으로 70-1120 g ae/ha, 보다 통상적으로 140-420 g ae/ha의 범위일 것이다. 플루오록시피르의 경우, 시용 비율은 통상적으로 35-560 g ae/ha, 보다 통상적으로 70-280 ae/ha의 범위일 것이다.

이러한 추가적인 도구에 대한 이점은 보다 높은 비율로 사용될 때, 2,4-D, 트리클로피르, 및 플루오록시피르의 보다 높은 비율에 의해 제공되는 잠재적인 단명 잔여 잡초 방제 및 활엽 제초제 성분의 매우 낮은 비용이며, 반면에 글리포세이트와 같은 비-잔여 제초제는 보다 늦게 발아하는 잡초의 방제를 제공하지 않는다. 이러한 도구는 또한 통합된 제초제 저항성 및 잡초 시프트 관리 방법으로써 HTC의 편리함과 제초제 작용 모드를 조합하는 메커니즘을 제공한다.

이러한 도구가 제공하는 추가 이점은 일반적으로 사용되는 잔여 잡초 방제 제초제와 넓은 스펙트럼의 활엽 잡초 방제 제초제(예컨대, 2,4-D, 트리클로피르 및 플루오록시피르)의 탱크혼합 능력이다. 이러한 제초제는 통상적으로 식재 전 또는 식재시 시용되나, 식재 전에 재배지에 존재할 수 있는 발아된, 정착한 잡초에는 흔히 덜 효과적이다. 식재시, 발아전, 또는 식재전 시용을 포함하도록 이러한 아릴옥시 옥신 제초제의 유용성의 확대함으로써, 잔여 잡초 방제 프로그램의 유연성이 증가한다. 통상의 기술자는 잔여 제초제 프로그램이 관심 작물에 기초하여 상이할 것이나, 전형적인 프로그램은 클로르아세트미드의 제초제, 및 디니트로아닐린 제초제 족, 또한 예컨대 클로마존, 술펜트라존 및 다양한 ALS-억제, PPO-억제, 및 HPPD-억제 제초제를 포함하는 제초제를 포함할 것임을 인식할 것이다.

추가 이점은 아릴옥시아세트산 옥신 제초제 시용(이전의 실시예 참조) 이후 식재 전에 요구되는 2,4-D, 트리클로피르 또는 플루오록시피르에 대한 내성을 포함할 수 있으며, 2,4-D, 트리클로피르 또는 플루오록시피르를 함유한 불완전하게 세척된 벌크 탱크로부터 유발되는 쌍떡잎 작물에 대한 오염 손상의 문제가 보다 적다. 디캄바(및 다수의 다른 제초제)는 AAD-12(v1)-형질전환된 쌍떡잎 자생 작물의 차후의 방제를 위해 여전히 사용될 수 있다.

통상의 기술자는 또한 상기의 실시예가 안정하게 형질전환된 경우 AAD-12(v1) 유전자에 의해 보호되는 임의의 2,4-D 민감성(또는 다른 아릴옥시 옥신 제초제) 작물에 시용될 수 있음을 인식할 것이다. 잡초 방제의 분야의 통상의 기술자는 이제 다양한 상용 페녹시 또는 피리딜옥시 옥신 제초제의 단독 또는 제초제와의 조합 사용이 AAD-12(v1) 형질전환에 의해 가능해짐을 인식할 것이다. 이러한 화학을 대표하는 다른 제초제의 특이적 비율은 CPR(작물 보호 참고문헌) 책 또는 유사한 편집 또는 임의의 상용 또는 학문적 작물 보호 참고문헌, 예컨대 아그릴리언스(Agriliance)의 작물 보호 가이드(Crop Protection Guide)(2005)에 따른 제초제 표지로 측정될 수 있다. 단독으로, 탱크 혼합으로, 또는 연속해서, AAD-12(v1)에 의해 HTC에 사용될 수 있는 각각의 대안적인 제초제는 본 발명의 범위 내로 고려된다.

실시예 12

AAD-12(v1)만으로 형질전환된 옥수수, 벼, 및 다른 외떡잎 종에서 페녹시 옥신 및 피리딜옥시 옥신 제초제의 작물 내 사용

유사한 방식에서, 잔디 종(예컨대, 비제한적으로, 옥수수, 벼, 밀, 보리 또는 터프 및 목초)의 AAD-12(v1)로의 형질전환은 일반적으로 선별성이 확실하지 않은 작물에서 매우 효과적인 페녹시 및 피리딜옥시 옥신의 사용을 허용할 것이다. 대부분의 잔디 종은 옥신 제초제, 예컨대 페녹시 옥신(즉, 2,4-D)에 대한 자연적인 내성을 가진다. 그러나, 허용될 수 없는 손상 위험 또는 시용 시기의 단축된 기회로 인해 비교적 낮은 수준의 작물 선별성이 이러한 작물에서 약화된 유용성을 초래한다. 따라서, AAD-12(v1)-형질전환된 외떡잎 작물은 쌍떡잎 작물에 대해 기술된 처리의 유사한 조합의 사용, 예컨대, 가장 활엽인 잡초 종을 방제하기 위한 280 내지 2240 g ae/ha의 2,4-D의 시용을 가능하게 한다. 보다 통상적으로, 560-1120 g ae/ha가 사용된다. 트리클로피르의 경우, 시용 비율은 통상적으로 70-1120 g ae/ha, 보다 통상적으로 140-420 g ae/ha의 범위일 것이다. 플루오록시피르의 경우, 시용 비율은 통상적으로 35-560 g ae/ha, 보다 통상적으로 70-280 ae/ha의 범위일 것이다.

이러한 추가적인 도구에 대한 이점은 2,4-D, 트리클로피르, 및 플루오록시피르의 보다 높은 비율에 의해 제공되는 잠재적인 단명 잔여 잡초 방제 및 활엽 제초제 성분의 매우 낮은 비용이다. 대조적으로, 글리포세이트와 같은 비-잔여 제초제는 보다 늦게 발아하는 잡초의 방제를 제공하지 않는다. 이러한 도구는 또한 1회 윤작 작물 종이든 아니든, 글리포세이트 내성 작물/AAD-12(v1) HTC 조합 방법에서 통합된 제초제 저항성 및 잡초 시프트 관리 방법으로써 HTC의 편리함과 제초제 작용 모드를 교대하는 메커니즘을 제공한다.

이러한 도구가 제공하는 추가 이점은 일반적으로 사용되는 잔여 잡초 방제 제초제와 넓은 스펙트럼의 활엽 잡초 방제 제초제(예컨대, 2,4-D, 트리클로피르 및 플루오록시피르)의 탱크혼합 능력이다. 이러한 제초제는 통상적으로 식재 전 또는 식재시 시용되나, 식재 전에 재배지에 존재할 수 있는 발아된, 확립된 잡초에는 흔히 덜 효과적이다. 이러한 아릴옥시 옥신 제초제의 유용성을 식재시, 발아 전 또는 식재 전 시용을 포함하도록 확대함으로써, 잔여 잡초 방제 프로그램의 유연성이 증가한다. 통상의 기술자는 잔여 제초제 프로그램이 관심 작물에 기초하여 상이할 것이나, 전형적인 프로그램은 클로르아세트미드의 제초제, 및 디니트로아닐린 제초제 족, 또한 예컨대 클로마존, 술펜트라존 및 다양한 ALS-억제, PPO-억제, 및 HPPD-억제 제초제를 포함하는 제초제를 포함할 것임을 인식할 것이다.

페녹시 또는 피리딜옥시 옥신에 대한 옥수수, 벼 및 다른 외떡잎의 증가된 내성은 성장 단계 제한 또는 작물 기울어짐, 펼쳐짐 현상, 예컨대 "렛-테일링(rat-tailing)"에 대한 잠재성, 옥수수 또는 변형된 곁뿌리에서 작물 기울어짐, 성장 조절자-유도된 줄기 취성 없이 작물에서 이러한 제초제의 사용을 가능하게 할 것이다. 단독으로, 탱크혼합으로 또는 연속해서 사용되는, AAD-12(v1)에 의한 HTC에서 사용될 수 있는 각각의 대안적인 제초제는 본 발명의 범위 내로 고려된다.

실시예 13

벼에서 AAD-12(v1)

배지 설명: 사용되는 배양 배지는 1 M KOH를 사용하여 pH 5.8로 조정하고 2.5 g/L 피타겔(시그마)로 고화시켰다. 배발생 캘러스를 40 ml 반-고체 배지가 담긴 100 x 20 mm 페트리 접시에서 배양하였다. 벼 묘목을 마젠타 상자 내의 50 ml 배지에서 성장시켰다. 세포 현탁액을 35 ml 액체 배지가 담긴 125 ml 원뿔형 플라스크에서 유지하고, 125 rpm에서 회전시켰다. 배발생 배양물의 유도 및 유지는 25-26 ℃의 어둠 속에서 시행하고, 식물 재생 및 전체-식물 배양은 16 시간 광주기에서 실시하였다(문헌[Zhang et al. 1996]).

배발생 캘러스의 유도 및 유지는 이미 기술한 NB 기초 배지 상에서 수행하였지만(문헌[Li et al. 1993]), 여기서 배지는 500 mg/L 글루타민을 함유하도록 조정되었다. 현탁 배양을 개시하고, 말토오스 대신에 30 g/L 수크로오스가 포함된 SZ 액체 배지(문헌[Zhang et al. 1998])에서 유지하였다. 삼투성 배지(NBO)는 0.256 몰의 만니톨 및 소르비톨이 첨가된 NB 배지로 이루어졌다. 하이그로마이신-B-저항성 캘러스는 50 mg/L 하이그로마이신 B가 보충된 NB 배지 상에서 3-4주 동안 선별하였다. 예비-재생은 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D)은 없으나, 2 mg/L 6-벤질아미노푸린(BAP), 1 mg/L α-나프탈렌아세트산(NAA), 5 mg/L 아브시스산(ABA) 및 50 mg/L 하이그로마이신 B가 첨가된 NB 배지로 이루어진 배지(PRH50) 상에서 1 주 동안 수행하였다. 묘목의 재생은 싹이 재생될 때까지, 2,4-D는 없으며, 3 mg/L BAP, 0.5 mg/L NAA, 및 50 mg/L 하이그로마이신 B가 보충된 NB 배지를 포함하는 재생 배지(RNH50) 상에서의 배양을 통해 이루어졌다. 싹을 1 % 수크로오스 및 50 mg/L 하이그로마이신 B(1/2MSH50)가 보충된, 1/2-강도 무라시게 및 스쿠그 기초 염 및 감보르그(Gamborg)의 B5 비타민이 존재하는 발근 배지로 옮겼다.

조직 배양물 발달: 오리자 사티바 엘. 자포니카 cv. 타이페이 309(Oryza sativa L. japonica cv. Taipei 309)의 성숙 건조 종자를 문헌[Zhang et al. 1996]에서 설명된 바와 같이 살균하였다. 살균한 성숙 벼 종자를 어둠 속에서 NB 배지에 배양함으로써 배발생 조직을 유도하였다. 약 1 mm 직경의 제1 캘러스를 배반으로부터 제거하고, SZ 액체 배지 내에 세포 현탁을 개시하기 위해 사용하였다. 이어서 현탁액을 문헌[Zhang 1995]에 설명된 바와 같이 유지하였다. 현탁-유도 배발생 조직을 선행 계대배양 3-5일 후에 액체 배양물으로부터 제거하고, 페트리 접시에 약 2.5 cm의 원을 형성하도록 NBO 삼투성 배지에 올려두고, 충돌 이전에 4 시간 동안 배양하였다. 충돌 16 내지 20 시간 후에, 충돌된 표면이 위로 향하도록 보장하면서, 조직을 NBO 배지로부터 NBH50 하이그로마이신 B 선별 배지로 옮기고, 14-17 일 동안 어둠 속에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 새로 형성된 캘러스를 본래 충돌된 외식편으로부터 분리하고 동일한 배지 부근에 두었다. 추가의 8-12 일 이후, 비교적 치밀한, 불투명한 캘러스가 가시적으로 확인되며, 어둠 속에서 7 일 동안 PRH50 예비-재생 배지로 옮겼다. 이어서 보다 치밀하고 불투명해진 성장하는 캘러스를 14-21 일의 기간 동안 16 시간의 광주기 하에서 RNH50 재생 배지 상에서 계대배양하였다. 재생하는 싹을 1/2 MSH50 배지를 함유하는 마젠타 상자로 옮겼다. 단일 외식편으로부터 재생된 다수의 식물은 형제로 간주되고, 하나의 독립적 식물 계통으로서 처리하였다. 식물은 두껍고 흰 뿌리를 생성하고 1/2 MSH50 배지에서 왕성하게 성장하면, 식물을 hph 유전자에 대해 양성으로 평가하였다. 묘목이 마젠타 상자의 상부에 도달하면, 그들을 1주일 동안 100 % 습도 하의 6 cm 화분 내의 토양으로 옮긴 후, 2-3 주 동안 21 ℃의 어둠 및 30 ℃에서 14 시간 광주기를 갖는 성장 챔버로 보낸 후, 온실 내의 13 cm 화분에 이식하였다. 종자를 수집하고 1주일 동안 37 ℃에서 건조한 후, 저장하였다.

미세투사물 충돌: 모든 충돌은 바이올리스틱 PDS-1000/He™ 시스템(바이오-라드, 래버러토리즈 인크.(Bio-Rad, Laboratories, Inc.))으로 수행하였다. 1.0 마이크로미터 직경의 금 입자 3 mg을 100 % 에탄올로 한번, 살균 증류수로 2번 세척하고 실리콘 처리된 에펜도르프 튜브 내의 50 ㎕ 물에 재현탁하였다. 1:6 몰 비의 pDOW3303(Hpt-포함 벡터) 대 pDAB4101(AAD-12(v1)+AHAS)을 나타내는 플라스미드 DNA 5 ㎍, 20 ㎕ 스페르미딘(0.1 M) 및 50 ㎕ 염화칼슘(2.5 M)을 금 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 10 분 동안 실온에서 인큐베이팅하고, 10 초 동안 10000 rpm에서 펠릿화하였고, 100 % 차가운 에탄올 60 ㎕에 재현탁하였고, 8-9 ㎕를 각각의 매크로캐리어(macrocarrier) 상에 분배하였다. 조직 샘플은 문헌[Zhang et al. (1996)]에 설명된 바와 같이 1100 psi 및 27 in의 Hg 진공에서 충돌하였다.

AAD-12(v1) 형질전환된 T0 벼에서 발아후 제초제 내성: 187 L/ha로 조정된 트랙 분무기를 사용하여 1 % Sunit II(v/v) 및 1.25 % UAN(v/v)를 포함한 퍼수트의 0.16 %(v/v) 용액(AHAS 유전자의 존재를 확인하기 위해) 치사량을 3-5 엽기에서 벼 묘목에 분무하였다. 처리 후(DAT) 36 일에서 민감성 또는 저항성 평가를 수행하였다. 온실로 보낸 33 개의 이벤트 중 10 개가 퍼수트에 강력하게 내성이 있었고, 나머지는 다양한 수준의 제초제 손상을 겪었다. 식물의 샘플을 취하고 분자 특징화를 수행하여 AAD-12(v1) PTU 및 전체적인 AHAS 코딩 영역 둘 다를 포함하는 이러한 10 개의 이벤트 중 7 개를 확인하였다.

T1 벼에서 AAD-12(v1)의 유전가능성: AAD-12(v1) PTU 및 AHAS 코딩 영역 둘 다를 포함한 AAD-12(v1) 계통의 T1 계통 5 개에서 100 개의 식물 자손 시험을 수행하였다. 상기 과정에 있어 종자를 심고 이전에 기술한 바와 같이 트랙 분무기를 사용하여 140 g ae/ha의 이마제타피르를 분무하였다. 14 DAT 이후, 저항성 및 민감성 식물을 계수하였다. 시험된 5 개의 계통 중 2 개가 카이 제곱 분석으로 측정하여 단일 유전자좌, 우성 멘델 형질(3R:1S)로서 분리되었다. 아래의 2,4-D 내성 시험에 의해 측정된 AHAS 선별가능한 마커와 함께 AAD-12가 동시 분리되었다.

T1 벼에서 높은 2,4-D 내성의 입증: 다음의 T1 AAD-12(v1) 단일 분리 유전자좌 계통을 메트로 믹스 배지 : pDAB4101(20)003 및 pDAB4101(27)002를 포함한 3-인치 화분에 심었다. 2-3 엽기에서 140 g ae/ha 이마제타피르를 분무하였다. 널을 제거하고, V3-V4 단계에서 1120, 2240 또는 4480 g ae/ha 2,4-D DMA에서 187 L/ha로 설정된 트랙 분무기로 각각에 분무하였다(각각 2x, 4x 및 8x 전형적인 상용 사용 비율). 식물을 7 및 14 DAT에서 평가하였고, 음성 대조군 식물로서 비형질전환된 상용 벼 품종, '라몬트(Lamont)'와 비교하였다.

손상률 데이터(표 22)는 AAD-12(v1)-형질전환된 계통이 비형질전환된 대조군보다 높은 비율의 2,4-D DMA에 더 내성이 있음을 나타낸다. 계통 pDAB4101(20)003는 계통 pDAB4101(27)002보다 높은 수준의 2,4-D에 더 내성이 있었다. 데이터는 또한 두 세대 이상 동안 2,4-D의 내성이 안정함을 증명한다.

조직 수확, DNA 분리 및 정량화: 새로운 조직을 튜브 내로 옮기고 2 일 동안 4 ℃에서 동결건조하였다. 조직을 완전히 건조한 후, 텅스텐 비드(발레나이트)를 튜브로 옮기고, 켈코 비드 밀을 사용하여 샘플을 1 분 동안 건조 분쇄하였다. 표준 DNeasy DNA 분리 절차가 이어진다(퀴아젠, DNeasy 69109). 이어서, 추출된 DNA의 분취량을 피코 그린(Pico Green)(몰리큘러 프로브스 P7589)으로 염색하고 공지된 표준을 사용하여 플로로미터(바이오 텍)로 스캔하여 ng/㎕ 단위의 농도를 얻었다.

AAD-12(v1) 발현: 모든 33 T0 트랜스제닉 벼 계통 및 1 비-트랜스제닉 대조군을 ELISA 블롯을 사용하여 AAD-12 발현에 대해 분석하였다. AAD-12는 20 개의 계통의 클론에서 검출되었으나, 계통 타이페이 309 대조군 식물에서는 아니었다. 이마제타피르에 내성이 있는 클론 일부를 갖는 20 개의 계통 중 12 개가 AAD-12 단백질을 발현하였고, AAD-12 PCR PTU 양성 및 AHAS 코딩 영역 양성이었다. 발현 수준은 총 가용성 단백질의 2.3 내지 1092.4 ppm 범위였다.

2,4-D 및 트리클로피르 제초제에 대한 pDAB4101 벼 식물의 재배지 내성: AAD-12(v1) 이벤트 pDAB4101[20] 및 한 야생형 벼(클리어필드(Clearfield) 131)로 미시시피주 웨이사이드(Wayside, Miss)(비-트랜스제닉 이미다졸리논-저항성 품종)에서 재배지 수준 내성 시험을 수행하였다. 실험 설계는 1회 반복을 사용한 무작위된 완전 블록 설계였다. 제초제 처리는 2 x 비율의 2240 g ae/ha에서의 2,4-D(디메틸아민 염) 및 560 g ae/ha에서의 트리클로피르 + 처리되지 않은 대조군이었다. 각각의 제초제 처리 내에서, 2 개 열의 T1 세대 pDAB4101[20] 및 2 개 열의 클리어필드 벼를 8 인치 줄 간격의 작은 구획지 드릴을 사용하여 심었다. pDAB4101[20] 벼는 AAD-12(v1) 유전자에 대한 선별가능한 마커로서 AHAS 유전자를 포함하였다. 선별제로서 1 엽기에서 이마제타피르를 시용하여 구획지로부터 임의의 AAD-12(v1) 널 식물을 제거하였다. 벼가 2 엽기에 도달할 때, 130-200 kpa 압력에서 187 L/ha 캐리어 부피를 전달하는 압축 공기 백팩 분무기를 사용하여 제초제 처리를 시용하였다. 시용 후 7, 14, 및 21 일에 손상의 시각적 등급을 매겼다.

2,4-D 및 트리클로피르에 대한 AAD-12(v1) 이벤트 반응이 표 23에 나타난다. 비-형질전환된 벼 계통(클리어필드)는 4x 상용 사용률로 간주되는 2240 g ae/ha에서의 2,4-D에 의해 심하게 손상되었다(7 DAT에서 30 % 및 15 DAT에서 35 %). AAD-12(v1) 이벤트는 7 또는 15 DAT에서 관찰된 손상이 없이 2,4-D에 대한 뛰어난 내성을 입증하였다. 비-형질전환된 벼는 2x 비율의 트리클로피르(560 g ae/ha)에 의해 상당히 손상되었다(7 DAT에서 15 % 및 15 DAT에서 25 %). AAD-12(v1) 이벤트는 7 또는 15 DAT에서 관찰된 손상이 없이 2x 비율의 트리클로피르에 대한 뛰어난 내성을 입증하였다.

이러한 결과는 AAD-12(v1) 형질전환된 벼가 클리어필드 벼에 심각한 시각적 손상을 유발하는 비율에서 2,4-D 및 트리클로피르에 대한 높은 수준의 저항성을 보여줌을 나타낸다. 또한 보다 넓은 스펙트럼의 효과적인 화학에 대한 저항성을 제공하는 AAD-12 I 다수 종과 다수 제초제 내성 유전자를 스택킹하는 능력을 입증한다.

실시예 14

카놀라에서의 AAD-12(v1)

카놀라 형질전환: 2,4-D에 저항성을 부여하는 AAD-12(v1) 유전자를 사용하여 브라시카 나푸스 var. 넥세라*710를 아그로박테리움-매개 형질전환 및 플라스미드 pDAB3759로 형질전환하였다. 구축물은 CsVMV 프로모터에 의해 구동되는 AAD-12(v1) 유전자 및 AtUbi10 프로모터로 구동되는 Pat 유전자 및 AtUbi10 프로모터에 의해 구동되는 EPSPS 글리포세이트 저항성 형질을 포함하였다.

종자를 10 분 동안 10 % 상용 표백제로 표면-살균하고 살균 증류수로 3 회 헹구었다. 이어서, 종자를 1/2 농도의 MS 기초 배지(무라시게 및 스쿠그, 1962) 위에 놓고 25 ℃ 및 16 시간 명기/8 시간 암기의 광주기로 설정된 성장 체제 하에서 유지하였다.

배축 세그먼트(3-5 mm)를 5-7 일된 묘목으로부터 잘라내고 전처리로서 3일 동안 캘러스 유도 배지 K1D1(1 mg/L 키네틴 및 1 mg/L 2,4-D 갖는 MS 배지)로 옮겼다. 이어서 상기 부분을 페트리 접시로 옮기고 pDAB3759을 포함한 아그로박테리움 Z707S 또는 LBA4404 균주로 처리하였다. 아그로박테리움을 150 rpm의 진탕기 위, 어둠 속에서 28 ℃에서 밤새 성장시켰고, 그 이후에 배양물 배지에 재현탁하였다.

배축 세그먼트를 아그로박테리움으로 30 분 처리 후, 이들을 다시 3일 동안 캘러스 유도 배지 위에 두었다. 공동-배양에 따라, 상기 세그먼트를 회복의 1 주 또는 2주 동안 K1D1TC(250 mg/L 카르베니실린 및 300 mg/L 티멘틴을 포함한 캘러스 유도 배지)에 두었다. 다르게는, 상기 세그먼트를 선별 배지 K1D1H1(1 mg/L 헤르비아스를 갖는 상기 배지)에 직접 두었다. 카르베니실린 및 티멘틴은 아그로박테리움을 죽이는 데 사용되는 항생제이다. 선별제 헤르비아스는 형질전환된 세포의 성장을 허용한다.

이어서, 캘러싱된 배축 세그먼트를 B3Z1H1(MS 배지, 3 mg/L 벤질아미노 푸린, 1 mg/L 제아틴, 0.5 gm/L MES [2-(N-모르폴리노) 에탄 술폰산], 5 mg/L 질산 은, 1 mg/L 헤르비아스, 카르베니실린 및 티멘틴) 싹 재생 배지에 두었다. 2-3 주 후 싹이 재생하기 시작하였다. 싹과 함께 배축 세그먼트를 또 다른 2-3 주 동안 B3Z1H3 배지(MS 배지, 3 mg/L 벤질아미노 푸린, 1 mg/L 제아틴, 0.5 gm/L MES [2-(N-모르폴리노) 에탄 술폰산], 5 mg/L 질산 은, 3 mg/L 헤르비아스, 카르베니실린 및 티멘틴)로 이동시킨다.

싹을 배축 세그먼트로부터 잘라내고 2-4 주 동안 싹 신장 배지 MESH5 또는 MES10(MS, 0.5 gm/L MES, 5 또는 10 mg/L 헤르비아스, 카르베니실린, 티멘틴)으로 이동시켰다. 신장된 싹을 MSI.1(0.1 mg/L 인돌부티르산을 갖는 MS) 상에서 뿌리 유도를 위해 배양한다. 식물이 잘 정착된 뿌리 시스템을 가졌다면, 이들을 토양에 옮겨심었다. 식물을 1-2 주 동안 콘비론에서 제어된 환경적 조건 하에서 적응시킨 다음 온실로 이동시켰다.

분자 분석 - 카놀라 물질 및 방법: 조직 수확 DNA 분리 및 정량화. 새로운 조직을 튜브 내로 옮기고 2 일 동안 4 ℃에서 동결건조하였다. 조직을 완전히 건조한 후, 텅스텐 비드(발레나이트)를 튜브로 옮기고, 켈코 비드 밀을 사용하여 샘플을 1 분 동안 건조 분쇄하였다. 표준 DNeasy DNA 분리 절차가 이어진다(퀴아젠, DNeasy 69109). 이어서, 추출된 DNA의 분취량을 피코 그린(몰리큘러 프로브스 P7589)으로 염색하고 공지된 표준을 사용하여 플루오로미터(바이오 텍)에서 판독하여 ng/㎕ 단위의 농도를 얻었다.

폴리머라제 연쇄 반응: 템플릿으로서 총 100 ng의 총 DNA를 사용하였다. 각각의 프라이머 20 mM을 타카라 익스 Taq PCR 폴리머라제 키트(미루스 TAKRR001A)와 사용하였다. 코딩 영역 PCR AAD-12(v1)을 위한 프라이머는 (서열 10)(포워드) 및 (서열 11)(리버스)였다. 9700 진엠프 써모사이클러(어플라이드 바이오시스템즈)에서 샘플을 94 ℃에서 3 분, 및 94 ℃에서 30 초 동안, 65 ℃에서 30 초 동안, 및 72 ℃에서 2 분 동안, 다음으로 72 ℃에서 10 분 동안의 사이클 35 회를 수행하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 생성물을 EtBr로 염색된 1 % 아가로오스 겔에서 전기영동으로 분석하였다. AAD-12(v1) 이벤트를 갖는 35 개의 식물로부터 35 개의 샘플이 양성으로 시험되었다. 3 개의 음성 대조군 샘플이 음성으로 시험되었다.

ELISA: 선행 부분에서 기술된 정착된 ELISA를 사용하여, 5 개의 상이한 카놀라 형질전환 식물 이벤트에서 AAD-12 단백질을 검출하였다. 발현 수준은 14 내지 700 ppm 초과의 총 가용성 단백질(TSP)의 범위였다. 세 개의 상이한 비형질전환된 식물 샘플을 검출된 신호 없이 동시에 시험하였고, 검사에 사용된 항체가 카놀라 세포 매트릭스에 대한 최소 교잡 반응성을 가짐을 나타낸다. 이러한 샘플은 또한 웨스턴 분석에 의해 양성으로 확인되었다. 결과의 요약이 표 24에 나타난다.

AAD-12(v1) 형질전환된 T0 카놀라에서 발아후 제초제 내성: 구축물 pDAB3759로 형질전환된 것으로부터 45 개의 T0 이벤트가 시간의 기간에 걸쳐 온실로 보내졌고 온실에서 적응되도록 하였다. 2-4 개의 새롭고 보통 외양의 잎이 발아될 때 까지(즉, 식물이 조직 배양물로부터 온실 성장 조건으로 변화됨) 식물이 성장되었다. 이어서, 식물을 560 g ae/ha의 비율의 2,4-D 아민 4의 상용 제형의 치사량으로 처리하였다. 50-cm 분무 높이, 187 L/ha의 분무 부피에서 트랙 분무기로 제초제 시용을 행하였다. 치사량은 비형질전환된 대조군에 >95 % 손상률을 초래하는 비율로 정의된다.

24 개의 이벤트가 2,4-D DMA 제초제 시용에 내성이 있었다. 일부 이벤트는 작은 손상을 초래하였으나, 14 DAT에 회복되었다. 이벤트는 제어되고, 배깅된 조건 하에서 자가수분으로 T1(및 T2 세대)로 진행되었다.

카놀라에서 AAD-12(v1) 유전가능성 : AAD-12(v1)의 11 개의 T1 계통 상에서 100 개의 식물 자손 시험을 수행하였다. 종자를 뿌리고 메트로 믹스 배지로 채워진 3-인치 화분에 심었다. 이어서 모든 식물을 이전에 기술한 바와 같이 560 g ae/ha의 2,4-D DMA를 분무하였다. 14 DAT 이후, 저항성 및 민감성 식물을 계수하였다. 시험된 11 개의 계통 중 7 개가 카이 제곱 분석으로 측정하여 단일 유전자좌, 우성 멘델 형질(3R:1S)로서 분리되었다. AAD-12는 다수 종에서 강력한 아릴옥시알카노에이트 옥신 저항성 유전자로서 유전가능하며 하나 이상의 추가적인 제초제 저항성 유전자로 스택킹될 수 있다.

카놀라에서 AAD-12(v1) 유전가능성 : AAD-12(v1)의 11 개의 T1 계통 상에서 100 개의 식물 자손 시험을 수행하였다. 종자를 뿌리고 메트로 믹스 배지로 채워진 3-인치 화분에 심었다. 이어서 모든 식물을 이전에 기술한 바와 같이 560 g ae/ha의 2,4-D DMA를 분무하였다. 14 DAT 이후, 저항성 및 민감성 식물을 계수하였다. 시험된 11 개의 계통 중 7 개가 카이 제곱 분석으로 측정하여 단일 유전자좌, 우성 멘델 형질(3R:1S)로서 분리되었다. AAD-12는 다수 종에서 강력한 아릴옥시알카노에이트 옥신 저항성 유전자로서 유전가능하며 하나 이상의 추가적인 제초제 저항성 유전자로 스택킹될 수 있다.

T1 카놀라에서 높은 2,4-D 내성의 입증: T1 AAD-12(v1)의 경우, 5-6 mg의 종자를 계층화하고, 파종하고, 선샤인 믹스 #5 배지의 미세 층을 토양의 상부층으로서 추가하였다. 발아하는 식물을 식재 후 7 및 13 일에서 560 g ae/ha 2,4-D로 선별되었다.

생존한 식물을 메트로 믹스 배지가 담긴 3-인치 화분 내로 옮겨 심었다. 560 g ae/ha 2,4-D로부터 선별된, T1 후대로부터 생존한 식물을 또한 메트로 믹스 토양이 담긴 3-인치 화분에 옮겨 심었다. 2-4 엽기에서 식물에 280, 560, 1120, 또는 2240 g ae/ha 2,4-D DMA를 분무하였다. 식물을 3 및 14 DAT에 평가하였고, 비형질전환된 대조군 식물과 비교하였다. T1 이벤트 손상 데이터 14 DAT의 샘플링은 표 25에서 볼 수 있다. 데이터는 다수 이벤트가 2240 g ae/ha 2,4-D에 강력하게 저항성인 반면에, 다른 이벤트는 최대 1120 g ae/ha 2,4-D로 덜 강력한 내성을 나타냄을 시사한다. 생존한 식물을 메트로 믹스 배지가 담긴 51/4" 화분에 옮겨 심었고 선행한 동일한 성장 조건에 두고 자가수분하여 오직 동형접합성 종자만 생산하였다.

2,4-D, 디클로프로프, 트리클로피르 및 플루오록시피르 제초제에 대한 pDAB3759 카놀라 식물의 재배지 내성: 두 개의 AAD-12(v1) 이벤트 3759(20)018.001 및 3759(18)030.001 및 인디애나주 파울러(Fowler, Ind)의 야생형 카놀라(Nex710) 상에서 재배지 수준 내성 시험을 수행하였다. 실험 설계는 3 번 반복의 무작위된 완전 블록 설계였다. 제초제 처리는 280, 560, 1120, 2240 및 4480 g ae/ha에서 2,4-D(디메틸아민 염), 840 g ae/ha에서 트리클로피르, 280 g ae/ha에서 플루오록시피르 및 처리되지 않은 대조군이었다. 각각의 제초제 처리 내에서, 이벤트 3759(18)030.0011, 3759(18)018.001 및 야생형 계통(Nex710)에 대한 단일 20 ft 열/이벤트를 8 인치 열 간격으로 4 열 드릴로 심었다. 카놀라가 4-6 엽기에 도달할 때, 130-200 kpa 압력에서 187 L/ha 캐리어 부피를 전달하는 압축 공기 백팩 분무기를 사용하여 제초제 처리를 시용하였다. 시각적 손상률 평가는 시용 후 7, 14 및 21일에 행하였다.

2,4-D, 트리클로피르 및 플루오록시피르에 대한 카놀라 반응이 표 26에 나타난다. 야생형 카놀라(넥스 710)은 4 x 비율로 간주되는 2240 g ae/ha에서의 2,4-D에 의해 심각하게 손상되었다(14 DAT에서 72 %). AAD-12(v1) 이벤트 전부는 각각 1, 2 및 4 x 비율에서 관찰된 2, 3 및 2 %의 평균 손상률을 갖는 14 DAT에서 2,4-D에 대한 뛰어난 내성을 입증하였다. 야생형 카놀라는 2x 비율의 트리클로피르(840 g ae/ha)에 의해 심각하게 손상되었다(14 DAT에서 25 %). AAD-12(v1) 이벤트는 두 이벤트에 걸쳐 14 DAT에서 6 % 손상률의 평균을 갖는 2 x 비율의 트리클로피르에서 내성을 입증하였다. 280 g ae/ha에서 플루오록시피르는 14DAA에서 비-형질전환된 계통에 심각한 손상률(37 %)을 초래하였다. AAD-12(v1) 이벤트는 5 DAT에서 8 % 손상률의 평균을 갖는 증가된 내성을 입증하였다.

이러한 결과는 AAD-12(v1) 형질전환된 이벤트가 비-형질전환된 카놀라에 심각한 상편생장 기형을 초래하거나 치명적인 비율에서 2,4-D, 트리클로피르 및 플루오록시피르에 높은 수준의 저항성을 보임을 나타낸다. AAD-12는 2,4-D > 트리클로피르 > 플루오록시피르의 상대 효능을 가짐을 나타낸다.

실시예 15

AAD-12 대두 이벤트 DAS-68416-4의 형질전환 및 선별

트렌스제닉 대두(글리신 맥스) 이벤트 DAS-68416-4가 대두 자엽 노드 외식편의 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 생성되었다. T-가닥 DNA 영역 내의 관심 유전자(AAD-12) 및 선별가능한 마커(pat)를 갖는 이원 벡터 pDAB4468(도 2)를 전달하는, 디스암(disarm) 아그로박테리움 균주 EHA101(문헌[Hood et al., 2006])을 사용하여 형질전환을 개시하였다.

아그로박테리움-매개 형질전환이 수행되었다. 간단하게, 대두 종자(cv 마베릭)를 기초 배지 상에 발아시키고, 자엽 노드를 분리하고 아그로박테리움으로 감염시켰다. 싹 개시, 싹 신장 및 발근 배지에 아그로박테리움의 제거를 위해 세포탁심, 티멘틴 및 반코마이신을 보충하였다. 글루포시네이트 선별을 사용하여 비-형질전환된 싹의 성장을 억제하였다. 선별된 싹은 뿌리 발달을 위해 발근 배지로 옮긴 다음, 묘목의 적응을 위해 토양 혼합물로 옮겼다.

추정 형질전환체를 스크리닝하기 위해 선별된 묘목의 말단 소엽은 글루포시네이트로 페인팅한 잎이었다. 스크리닝된 묘목을 온실로 옮기고, 적응시킨 후, 내성을 재확인하기 위해 글루포시네이트로 잎을 페인팅하고, 추정 형질전환체로 간주하였다. 스크리닝된 식물의 샘플을 취하고 선별가능한 마커 유전자 및/또는 관심 유전자의 확인을 위해 분자 분석을 수행하였다. T0 식물을 온실에서 자가 수정시켜 T1 종자를 생성시켰다.

T1 식물을 역교배하고 엘리트 생식질(마베릭) 내로 이입하였다. 이러한 이벤트, 대두 이벤트 DAS-68416-4가 독립적인 형질전환된 분리체로부터 발생되었다. 이벤트를 그의 독특한 특성, 예컨대 단일 삽입 부위, 정상적 멘델 분리 및 안정적 발현 및 넓은 유전자형 배경 및 전체 다중 환경 위치의 작물학적 성능 및 제초제 내성을 포함하는 효능의 우수한 조합을 기초로 선별하였다. 대두 이벤트 DAS-68416-4의 추가적인 설명은 전체 내용이 인용에 의해 포함되는 WO 2011/066384에 설명되어 있다.

실시예 16

2008 작물학 데이터의 생성

이벤트 DAS-68416-4 대두 및 비-트랜스제닉 대조군(var. 마베릭)에 관한 작물학적 연구가 아이오와, 일리노이, 인디애나, 네브라스카 및 온타리오, 캐나다(2 곳)에 위치한 6 곳에서 2008년에 수행되었다. 스탠드/집단 계수, 묘목/식물 활기, 식물 높이, 도복(lodging), 질병 발생, 곤충 피해, 및 개화일수를 포함하여 작물학적 결정 요인을 평가하여 대조군 계통 마베릭과 비교하여 대두 이벤트 DAS-68416-4(제초제 처리 유무)의 동등성을 조사하였다. 이러한 연구는 작물학적 실험 S1로 지칭된다.

시험 및 대조군 대두 종자를 25 ft 열 당 약 112 개의 종자 파종률로 심었고, 열 내의 간격은 약 30 인치(75 cm)였다. 각각의 부위에서, 각각의 처리에 대한 3 개의 반복 구획지를 확립하였고, 각각의 구획지는 2-25 ft 열로 이루어졌다. 각각의 부위에서 특유하게 무작위로, 무작위된 완전 블록(RCB) 설계로 구획지가 배열되었다. 각각의 대두 구획지에는 유사한 성숙도의 비-트랜스제닉 대두의 2 개의 열이 인접하였다. 전체 시험 부위는 유사한 상대 성숙도의 비-트랜스제닉 대두의 10 ft의 최소량으로 둘러싸였다.

제초제 처리는 약 20 갤런/에이커(187　L/ha)의 분무 부피로 시용하였다. 이러한 시용은 최대 표지율의 상용인 시용을 반복하기 위해 설계되었다. 2,4-D가 재배 시기 동안 총 3 lb ae/A의 3회의 표면 살포 시용으로 시용하였다. 개별적인 시용은 1.0 lb ae A(1,120 g/ha)으로 발아 전 및 약 V4 및 R2 성장 단계에서 행해졌다. 재배 시기 동안 총 0.74 lb ai/A(828 g ai/ha)로 2 회의 표면 살포 시용으로 글루포시네이트를 시용하였다. 0.33 lb ai/A 및 0.41 lb ai/A(374 및 454 g ai/ha)의 개별적인 시용이 약 V6 및 R1 성장 단계에서 행해졌다.

혼합 모델(SAS 버전 8; SAS 인스티튜트 1999)을 사용하여 작물학적 데이터에 대해 재배지 부위에 걸쳐 분산 분석을 수행하였다. 시험체는 고정된 효과로 간주되고, 위치, 위치 내의 블록, 시험체에 의한 위치, 및 위치 내의 블록에 의한 시험체는 무작위 효과로 지정된다. 전체적인 처리 효과의 유의성은 F-검정을 사용하여 평가하였다. 대조군과 비분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4(비분무), 글루포시네이트가 분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4(대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트), 2,4-D가 분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4(대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D), 및 글루포시네이트와 2,4-D 둘 다가 분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4(대두 이벤트 DAS-68416-4 + 둘 다) 트랜스제닉 시험체를 t-검정을 사용하여 쌍 대조를 행하였다. 조정된 P-값은 또한 잘못 선별된 비율(False Discovery Rate)(FDR)을 사용하여 계산되어 다중도를 제어하였다(문헌[Benjamini and Hochberg, 1995]).

대조군, 비분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트, 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 둘 다의 제초제로부터 수집된 작물학적 데이터의 분석을 수행하였다. 스탠드 수, 초기 집단, 묘목 활기, 시용 이후 손상, 도복, 최종 스탠드 수 또는 개화까지의 일수에 대해 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다(표 28). 높이의 경우, 대조군과 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D 분무 사이에 유의한 쌍 t-검정이 관찰되었다. 그러나, 유의한 전체적인 처리 효과는 관찰되지 않았고, 대두 이벤트 DAS-68416-4 처리와 대조군 간의 차이는 매우 작았으며, 상이한 대두 이벤트 DAS-68416-4 처리 중에서 차이가 공유되지 않았다. 이러한 결과에 기초하여, 대두 이벤트 DAS-68416-4는 근동질유전자 비-트랜스제닉 대조군과 작물학적으로 동등하였다.

^a F-검정을 사용하여 평가된 전체적인 처리 효과.

^b t-검정을 사용한, 대조군에 대한 분무된 및 비분무된 처리의 비교.

^c 잘못 선별될 비율(FDR) 절차를 사용하여 조정된 P-값

^d 0-100 % 등급; (스탠드 수 나누기 심은 종자의 수)*100

^e 1-10 등급의 시각적 추정치; 10 = 비-형질전환된 식물과 동등한 성장

^f 0-100 % 등급의 시각적 추정치; 0 % = 손상 없음

^f 식재시로부터 개화할 때까지의 일수

굵은 P 값이 중요하다(<0.05)

실시예 17

2009년 작물학 데이터의 생성

대두 이벤트 DAS-68416-4 및 비-트랜스제닉 대조군(var. 마베릭)에 관한 작물학적 연구가 알칸사스, 아이오와, 일리노이, 인디애나, 미주리, 및 네브라스카에 위치한 8 곳에서 2009년에 수행되었다. 스탠드/집단 계수, 묘목/식물 활기, 식물 높이, 질병 발생, 곤충 피해, 및 개화일수를 포함하여 작물학 결정 요인을 평가하여 대조군에 대한 대두 이벤트 DAS-68416-4(제초제 처리 유무)의 동등성을 조사하였다(표 29).

*B- 분무된 및 비분무된 시험, S- 분무된 시험만

무작위된-완전-블록 설계를 실험에 사용하였다. 시험체는 대두 이벤트 DAS-68416-4, 마베릭 대조군 계통, 및 상용 비-트랜스제닉 대두 계통이었다. 시험용, 대조군 및 참조용 대두 종자를 약 30 인치(75 cm)의 열 간격으로 열 당 약 112 개의 종자의 파종 비율로 심었다. 각각의 부위에서, 각각의 처리의 4 개의 반복된 구획지를 확립하였고, 각각의 구획지는 2-25 ft 열로 구성되었다. 각각의 대두 구획지는 2 개 열의 비-트랜스제닉 대두(마베릭)와 인접하였다. 전체 실험 부위는 최소 4 개 열(또는 10 ft)의 비-트랜스제닉 대두(마베릭)로 둘러싸였다. 적절한 곤충, 잡초 및 병 방제 실시가 시용되어 작물학적으로 허용가능한 작물을 생산하였다.

제초제 처리를 시용하여 최대 표지율의 상용인 실시를 반복하였다. 처리는 비-분무된 대조군 및 특정된 성장 단계에서 시용되는 2,4-D, 글루포시네이트, 2,4-D/글루포시네이트의 제초제 시용으로 이루어졌다. 2,4-D 시용의 경우, 제초제를 V4 및 R2 성장 단계에서 1.0 lb ae /A(1,120 g ae/ha)의 비율로 시용하였다. 글루포시네이트 처리의 경우, V4 및 V6-R2 성장 단계에서 식물에 시용하였다. 둘 다 시용하는 경우, 글루포시네이트를 각각 V4 및 V6-R2 시용 동안 0.33 lb ai/A(374 g ai/ha) 및 0.41 lb ai/A(454 g ai/ha)의 비율로 시용하였다. 두 제초제 시용을 위한 시험체는 대두 이벤트 DAS-68416-4 및 비-트랜스제닉 마베릭을 포함하는 대조군이었다. 마베릭 구획지는 제초제 시용 이후 죽을 것으로 예상되었다.

혼합 모델(SAS 버전 8; SAS 인스티튜트 1999)을 사용하여 작물학적 데이터에 대해 재배지 부위에 걸쳐 분산 분석을 수행하였다. 시험체는 고정된 효과로 간주되고, 위치, 위치 내의 블록, 시험체에 의한 위치, 및 위치 내의 블록에 의한 시험체는 무작위 효과로 지정된다. 개별 위치에서 분석은 고정된 효과로서 시험체, 및 무작위 효과로서 블록 및 블록에 의한 시험체의 유사한 방식으로 행하였다. 데이터는 통계적 분석을 위해 반올림되지 않았다. 95 % 신뢰도 수준으로 상당한 차이가 밝혀졌고, 전체적인 처리 효과의 유의성은 F-검정을 사용하여 평가하였다. 비분무된 AAD-12(비분무), 글루포시네이트로 분무된 AAD-12 (AAD-12 + 글루포시네이트), 2,4-D로 분무된 AAD-12 (AAD-12 + 2,4-D), 및 글루포시네이트와 2,4-D 둘 다로 분무된 AAD-12 (AAD-12 + 2,4-D + 글루포시네이트) 트랜스제닉 시험체와 대조군 시험체를 t-검정을 사용하여 쌍 대조를 행하였다.

본 연구에서 행해지는 대량의 대조로 인해, 다중도가 문제였다. 예상하지 못한 효과를 찾기 위해 단일 연구에서 대량의 비교가 행해질 때 다중도가 문제이다. 이러한 조건하에서, 비교-별 p-값에 기초하여 차이가 잘못 밝혀질 확률이 매우 높다(1-0.95^{nuber of comparisoils}). 본 연구에서 분석물 당 4 개의 비교(작물학을 위한 16 개의 분석된 관찰 유형)가 존재하며, 이는 작물학을 위한 64 개의 비교를 가져왔다. 따라서, 비조정된 p-값에 기초하여 하나 이상의 잘못된 차이가 밝혀질 확률은 작물학당 99 %였다(1-0.95⁶⁴).

대조군, 비분무된 AAD-12, AAD-12 + 글루포시네이트, AAD-12 + 2,4-D, 및 AAD-12 + 2,4-D + 글루포시네이트 시험체에서 수집한 작물학 데이터의 분석을 수행하였다. 전체-부위 분석의 경우, 묘목 활력, 최종 집단, 식물 활력/손상(V4, Rl), 도복, 질병 발생, 곤충 피해, 개화까지의 일수, 성숙까지의 일수, 꼬투리 수, 종자 수, 수확량 및 식물 높이에 대해 통계학적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 스탠드 수 및 초기 집단의 경우, 대조군과 AAD-12 + 글루포시네이트 시험체 사이에서 유의한 쌍 t-검정이 관찰되었으나, 유의한 전체적인 처리 효과 또는 FDR 조정된 p-값에 의해 수반되지 않았다. 식물 활력/손상(R2)의 경우, 대조군과 AAD-12 + 글루포시네이트 및 AAD-12 + 2,4-D + 글루포시네이트 시험체 둘 다 사이에서 유의한 쌍 t-검정 및 유의한 전체적인 처리 효과가 관찰되었으나, 유의한 FDR 조정된 p-값에 의해 수반되지 않았다. 이러한 변수 전체에 대한 평균 결과는 또한 본 연구에서 시험된 참조 계통에 대해 발견된 범위 내에 있었다.

실시예 18

AADl 이벤트 pDAS 1740-278의 형질전환 및 선별

AADl 이벤트, pDAS 1740-278가 메이즈 계통 Hi-II의 휘스커(WHISKER)-매개된 형질전환에 의해 생성되었다. 사용된 형질전환 방법은 미국 특허 출원 제 20090093366호에 기술되어 있다. pDAB3812로도 지칭되는 플라스미드 pDAS1740의 Fspl 단편(도 3)이 메이즈 계통 내로 형질전환되었다. 상기 플라스미드 구축물은 RB7 MARv3 : : 제아 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터 v2 // AADl v3 // 제아 메이즈 PER5 3'UTR :: RB 7 MARv4 식물 전사 유닛(PTU)을 포함하는 식물 발현 카세트를 포함한다.

수많은 이벤트가 생성되었다. 생존하고 건강하게 생성된 이러한 이벤트, 할록시포프-저항성 캘러스 조직은 추정 형질전환 이벤트를 나타내는 독특한 식별 코드를 할당받았으며, 연속해서 새로운 선별 배지로 옮겨졌다. 각각의 독특한 이벤트로부터 유래된 조직으로부터 식물이 재생되었고, 온실로 옮겼다.

분자 분석을 위해 잎 샘플을 취하여 써던 블롯, DNA 경계부 확인, 및 게놈 마커 보조 확인에 의해 AAD-I 트랜스진의 존재를 확인하였다. 양성 TO 식물을 근계교배로 수분하여 T1 종자를 얻었다. 이벤트 pDAS 1470-278-9 (DAS-40278-9)의 T1 식물이 선별되고 자가-수분되고 5 개의 세대로 특징화되었다. 한편, T1 식물을 역교배하고 몇몇의 세대를 위한 마커-보조 선별을 통해 엘리트 생식질(XHH 13) 내로 이입되었다. 이러한 이벤트를 독립적인 형질전환된 분리물로부터 발생시켰다. 이벤트를 그의 독특한 특성, 예컨대 단일 삽입 부위, 보통 멘델 분리 및 안정한 발현 및 넓은 유전자형 배경 및 전체 다중 환경 위치의 작물학적 성능 및 제초제 내성을 포함하는 효능의 우수한 조합을 기초로 선별하였다. 옥수수 이벤트 pDAS-1740-278-9의 추가적인 설명은 전체 내용이 인용에 의해 포함되는 WO 2011/022469에 설명되어 있다.

실시예 19

제초제 시용 및 작물학적 데이터

제초제 처리는 약 20 갤런/에이커(187 L/ha)의 분무 부피로 시용하였다.

이러한 시용은 최대 표지율의 상용인 시용을 반복하기 위해 설계되었다. 농도 39 %, 3,76 lb ae/gal, 451 g ae/l의 위다(Weedar) 64 (026491-0006) 및 농도 10.2 %, 0.87 lb ai/gal, 104 g ai/g의 아슈어(Assure) II (106155)를 사용하였다.

시험체 4 및 5에 대한 3회의 표면 살포 시용으로서 2,4-D(위다 64)를 시용하였다(재배 시기 동안 총 3 Ib ae/A). 발아 전 및 약 V4 및 V8-V8.5 단계에서 개별 시용하였다. 개별적인 표적 시용 비율은 위다 64의 경우 1.0 lb ae/A, 또는 1120 g ae/ha이었다. 실제 시용 비율은 1096 - 1231 g ae/A의 범위였다.

퀴잘로포프(아슈어 II)을 시험체 3 및 5에 1회의 표면 살포 시용으로서 시용하였다. 시용 시기는 약 V6 성장 단계였다. 표적 시용 비율은 아슈어 II의 경우 0.0825 lb ai/A 또는 92 g ai/ha였다. 실제 시용 비율은 90.8 - 103 g ai/ha의 범위였다. 각각의 위치에서 블록 2, 3 및 4 내의 모든 시험체에 대해 작물학적 특성을 기록하였다. 표 30은 측정된 특성을 나열한다.

대조군, 비분무된 aad-l, aad-l + 2,4-D, aad-＼ + 퀴잘로포프, 및 aad-＼ + 두 시험체 모두로부터 수집한 작물학적 데이터의 분석을 수행하였다. 부위 전역(across-site) 분석의 경우, 전체 위치 요약 분석에서 초기 집단(V1 및 V4), 활력, 최종 집단, 작물 손상, 출사(silking)까지의 기간, 꽃가루 방사까지의 기간, 줄기 도복, 뿌리 도복, 질병 발생률, 곤충 피해, 성숙까지의 일수, 식물 높이 및 꽃가루 생존력(형태 및 색상) 값에 대한 통계상 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 녹색 지속(stay green) 및 이삭 높이의 경우, 대조군과 aad-l + 퀴잘로포프 시험체 사이에 유의한 쌍 t-검정이 관찰되었으나, 유의한 전체적인 처리 효과 또는 잘못 선별될 비율(FDR) 조정된 p-값이 수반되지 않았다(표 31).

^a F-검정을 사용하여 추정된 전체적인 처리 효과.

^b t-검정을 사용한, 분무된 및 비분무된 처리의 비교.

^c 잘못 선별될 비율(FDR) 절차를 사용하여 조정된 P-값.

^d 1-9 등급에 대한 시각적 추정치; 9 = 큰 활력있는 잎이 있는 큰 식물.

^e 0-100 % 등급; 0 = 손상 없음 및 100 = 죽은 식물.

^f 식재시로부터 축적된 히트 단위의 수

^g 0-100 % 등급; 벽이 손상된 꽃가루 알갱이 %

^h 0-100 % 등급; 진황색의 꽃가루 알갱이 %

ⁱ 1-9 등급의 시각적 추정치로 1은 가시적 녹색 조직 없음.

^j 1-9 등급의 시각적 추정치로 1은 불량한 질병 저항성.

^k 1-9 등급의 시각적 추정치로 1은 불량한 곤충 저항성.

^l NA= 반복 또는 처리에 변화가 없기 때문에 통계 분석을 실시하지 않음.

^m P-값 < 0.05로 표시된 통계적 차이.

실시예 20

추가적인 작물 실험

근동질유전자(near-isoline) 옥수수 계통과 비교하여 옥수수 계통 40278의 작물학적 특성을 다양한 환경에 걸쳐 평가하였다. 처리는 총 21 개의 위치에 걸쳐서 시험된, 4 개의 유전적으로 별개의 하이브리드 및 그의 적절한 근동질유전자 대조군 하이브리드를 포함하였다.

4 개의 시험 하이브리드는 99일 내지 113일 상대 성숙도 범위의 중기 내지 후기 성숙 하이브리드였다. 실험 A는 유전적 배경 근계교배 C x BC3S1 전환에서 이벤트 DAS-40278-9를 시험하였다. 이러한 하이브리드는 상대 성숙도가 109 일이었고, 16 개의 위치에서 시험되었다(표 32). 실험 B는 하이브리드 배경 근계교배 E x BC3S1 전환, 113일의 상대 성숙도 하이브리드를 시험하였다. 이러한 하이브리드는 14 개의 위치에서, 실험 A와 약간 상이한 위치 세트를 사용하여 시험되었다. 실험 C 및 D는 하이브리드 배경 BC2S1 전환 x 근계교배 D 및 BC2S1 전환 x 근계교배 F를 각각 시험하였다. 이들 하이브리드는 모두 상대 성숙도가 99일이었고, 동일한 10 개의 위치에서 시험되었다.

각각의 실험의 경우, 위치당 2 개의 반복시험 및 2 개의 열 구획지를 사용하는 무작위 완전 블록 설계를 사용하였다. 열 길이는 20 피트이고, 각각의 열에는 열당 34 개의 종자로 파종하였다. 표준 영역 작물학적 실행을 시험 관리에 사용하였다.

8 개의 작물학적 특성; 식물 높이, 이삭 높이, 줄기 도복, 뿌리 도복, 최종 집단, 알곡 수분, 시험 중량 및 수확량에 대해 데이터를 수집하고, 분석하였다. 파라미터 식물 높이 및 이삭 높이는 하이브리드의 외형에 대한 정보를 제공한다. % 줄기 도복 및 뿌리 도복이라는 작물학적 특성은 하이브리드의 수확가능성을 결정한다. 최종 집단수는 종자 품질 및 수확량에 영향을 미치는 계절적 성장 조건을 평가한다. 수확시 알곡 수분 %는 하이브리드의 성숙도를 규정하고, 수확량(수분에 대해 조정된 부셀/에이커) 및 시험 중량(15.5 % 수분으로 조정된 옥수수 부셀의 파운드 중량)은 하이브리드의 생식능력을 설명한다.

선형 모델을 사용하여 재배지 부위에 걸쳐 분산 분석을 수행하였다. 시험체 및 위치는 고정된 효과로서 모델에 포함되었다. 무작위 효과로서 위치 및 시험체에 의한 위치를 포함하는 혼합 모델을 탐구하였지만, 시험체에 의한 위치는 분산의 일부만을 설명하고, 그의 분산 성분은 흔히 0과 유의하게 상이하지 않았다. 줄기 및 뿌리 도복의 경우, 분산을 안정화하기 위해 로그 변환을 사용하였지만, 평균 및 범위는 본래의 척도로 보고한다. 유의한 차이는 95 % 신뢰도 수준으로 표시된다. 전체적인 처리 효과의 유의성은 t-검정을 사용하여 추정되었다.

이러한 작물학적 특성 실험의 결과는 표 32에서 볼 수 있다. 이삭 높이, 줄기 도복, 뿌리 도복, 알곡 수분, 시험 중량 및 수확량의 파라미터에 대해, 동질유전자 대조군과 비교하여 4 개의 40278 하이브리드 중 어느 것에서도 통계상 유의한 차이는 발견되지 않았다(p<0.05에서). 최종 집단수 및 식물 높이는 각각 실험 A 및 B에서 통계상 상이하였으나, 시험된 다른 40278 하이브리드와 비교하여 유사한 차이가 관찰되지 않았다. 관찰된 몇몇의 변화는 DAS-40278-9 이벤트의 엘리트 근계교배 계통 내로의 역교배로부터 유지되는 낮은 수준의 유전적 변이성때문에 발생할 수 있다. 측정된 파라미터에 대한 값의 전체 범위는 모두 전통적인 옥수수 하이브리드에 대해 얻은 값의 범위 내에 포함되고, 잡초 증가라는 결론에 이르지 않을 것이다. 요약하면, 작물학적 특성 결정 데이터는 40278 옥수수가 통상적인 옥수수와 생물학적으로 동등함을 나타낸다.

근동질유전자 옥수수와 비교하여 이벤트 DAS-40278-9를 포함한 하이브리드 옥수수의 작물학적 특성을 성장기 동안 다양한 지리적 환경에 걸쳐 다수 재배지 시험으로부터 수집하였다. 널 식물과 비교하여 이벤트 DAS-40278-9를 포함한 하이브리드 옥수수 계통의 결과는 표 33에 나열된다.

발달의 V3 단계에서 제초제 퀴잘로포프가 분무되고(280 g ae/ha), 발달의 V6 단계에서 2,4-D(2,240 g ae/ha)가 분무된 널 식물 및 이벤트 DAS-40278-9를 포함한 하이브리드 옥수수 계통의 작물학적 특성이 표 34에 있다.

실시예 21

2,4-D가 2,4-D 저항성 대두의 성장을 증가시킴

AAD-12 트랜스진을 갖는 트랜스제닉 대두는 2,4-D의 시용에 의해 잡초가 박멸되는 동안 대두 식물을 보호한다. 2,4-D가 또한 2,4-D 내성 대두에서 성장을 증가시키는 것이 예상치 않게 관찰되었다. 이러한 증가된 성장은 비-분무된 구획지와 비교하여 식물 높이 및/또는 분무된 구획지의 수확량의 증가를 가져온다.

2,4-D의 시용에 기인한 식물 성장 및/또는 수확량의 증가가 2,4-D에 대한 내성으로 유전자 조작된 대두 식물에 대해 기술된다. 북아메리카 대두 성장 영역을 포함하는 다수 위치에 걸쳐 실험을 진행하였다. 시험체는 이벤트 DAS-68416-4(2,4-D에 대한 내성 조절)가 이입된 엘리트 계통을 포함하였다. 비-분무 및 2,4-D 분무 처리로 이루어진 처리가 V3 및 R2 성장 단계 둘 다에서 시용되었다. 식물 높이 및 알곡 수확량을 포함하여, 시기를 통틀어 다양한 작물학적 특성에 대해 구획지를 측정하였다. 분무 및 비-분무 구획지에서 시기를 통틀어 잡초를 방제하여 임의의 경쟁 효과를 제거하였다. 시험의 결과로, 데이터 분석은 처리되지 않은 것과 비교하여 2,4-D로 분무된 시험체에 대해 높이 및 수확량 둘 다에서 상당한 증가를 관찰하였다. 수확량 증가는 2,4-D 저항성 대두 상에 2,4-D에 의해 전해지는 잡초 방제의 추가적인 이점이다.

2,4-D가 분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4(국제 특허 출원 제2011/066384호)의 작물학적 특성과 비분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4의 작물학적 특성을 비교하기 위해 재배지 실험이 2011년에 진행되었다. 재배지 실험은 대두 이벤트 DAS-68416-4가 이입된 4 개의 엘리트 대두 계통의 시험체, 및 대두 이벤트 DAS-68416-4를 포함하지 않은 4 개의 엘리트 대두 계통의 각각의 널 동질유전자를 포함하였다. 상이한 지리적 위치(총 10 개의 위치)에 걸쳐 시험을 심었다. 위치당 두 개의 반복을 갖는 변형된 분할 구획지로서 실험을 설정하였다. 전체 구획지가 처리되었고 서브구획지는 시험체였다. 각각의 구획지는 두 개의 열, 12.5 피트 길이로 이루어졌으며 30 인치 떨어져 심었다. 분무된 구획지는 V3 및 R2 성장 단계에서 분무된 2,4-D (1120 g ae/ha)로 처리되었다. 시기를 통틀어, 재배지 구획지를 보통의 작물학적 실시 하에서 유지하고 잡초가 없게 유지하였다. 다양한 작물학적 특성을 대두 식물에 대해 측정하여 2,4-D의 시용이 어떻게 대두 작물학적 특성의 성능에 영향을 미치는지를 결정하였다. 시험된 작물학적 특성 및 데이터가 수집될 때의 성장 단계가 표 35에 나열되어 있다.

대두 성장 시기의 끝 무렵, 모든 위치에서의 데이터가 합쳐졌고 전체 위치 분석을 수행하였다. 데이터 분석은 JMP®프로 9.0.3 (SAS, Cary, NC)를 사용하여 진행하였다. 분석에서 최소 제곱 평균이 표 28에 보고된다. AAD-12 트랜스진을 포함한 대두 이벤트 DAS-68416-4에 대한 2,4-D의 시용은 증가된 성장의 컨디셔닝 효과를 유발하였다. 증가된 성장이 2,4-D로 분무되지 않은 재배지 구획지과 비교하여 2,4-D로 분무된 재배지 구획지에서 결국 상당히 더 많은 수확량과 식물 높이 측정을 가져왔다. 이러한 증가는 데이터가 모든 장소에 걸쳐 점증적으로 분석될 때, 확인할 수 있다. 대조적으로, 2,4-D로 분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4에 대한 증가된 수확량은 처리 상호작용에 의한 위치에 의해 약화되었다. 평균 높이 및 수확량 모두는 표 36에서 2,4-D의 시용에 의해 약 5 % 증가되었다.

표 37에서 나타낸 바와 같이, 10 개의 위치 중 하나 이상(장소 #a3)은 2,4-D 분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4 식물과 비교하여 비분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4 식물에 대해 상당히 더 높은 수확량 수확을 보고하였다. 모든 위치에 대한 결과가 축적될 때 AAD-12 트랜스진을 포함한 대두 이벤트 DAS-68416-4 상에 2,4-D의 시용이 증가된 성장을 유발하는 컨디셔닝 효과를 나타냈다. 예컨대, 2,4-D로 분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4 식물의 수확량은 53.7 bu/에이커였던 비분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4 식물의 수확량보다 현저히 더 많은 56.4 bu/에이커였다. 마찬가지로, 2,4-D로 분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4 식물의 높이는 77 cm인 비분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4 식물의 높이 보다 현저히 큰 81 cm였다.

실시예 22

2,4-D가 2,4-D/글리포세이트 조합에서 2,4-D 저항성 대두의 성장을 증가시킴

선행 실시예에서와 같이 유사한 재배지 실험이 2010년에 진행되었으나, 글리포세이트와 조합하여 2,4-D의 두 시용으로 진행되었다. 결과는 비-분무된 구획지와 비교하여 분무된 구획지의 식물 높이 및/또는 수확량에서 2,4-D 저항성 대두의 증가된 성장이 2,4-D의 시용에 기인한 것임을 나타낸다.

측정된 다수의 파라미터에 대해 유의한 처리 효과가 관찰되었다. 2,4-D 및 글리포세이트 둘 다는 V3 및 R2 성장 단계에서 분무되었다. 실험은 상이한 지리적 위치(총 6 개의 위치)에 걸쳐 심었다. 시험된 작물학적 특성 및 데이터가 수집된 성장 단계가 표 30에 나열되어 있다. 평균 높이는 6 % 증가하였고, 평균 수확량은 표 38의 분무된 대두의 경우 17 % 증가하였다. 또한, 평균 종자 중량은 분무된 대두의 경우 6 % 증가하였다.

표 39에 나타낸 바와 같이, 본 실시예에서 특정 지리적 변동성이 또한 관찰되었다. 평균 수확량은 표 39의 분무된 대두의 경우 21.6 % 증가하였다.

실시예 23

분무 및 비분무 처리를 비교한 수확량 시험 결과

아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제(AAD)로 형질전환된 2,4-D 저항성 트랜스제닉 작물은 아릴옥시알카노에이트 잔기를 포함하는 제초제의 자극량으로 처리될 때 증가된 수확량을 가져왔다. AAD-12 유전자 발현 카세트를 포함하는 대두 이벤트를 분무 및 비분무 조건 하에서 반복된 수확량 실험으로 실험하였다. 북부 위도에 적응된 초기 대두를 포함한 한 시리즈의 실험 및 보다 남부 위도에 적응된 후기 대두를 포함한 또 다른 시리즈의 실험이 있었다. 선행 실험에서, 성장기 동안 2,4-D로 처리된, AAD-12 유전자 발현 카세트를 포함하는 대두 시험체의 경우 비분무된 체크에 비해 증가된 수확량을 보였다.

2회 반복을 갖는 변형된 분할 구획지 설계가 실험을 위해 사용되었다. 각각의 구획지는 30 인치 열 간격을 갖는 2 개의 열 너비이며 12.5 피트 길이였다. 시기 동안 실험 내에서 이동을 위해, 심어진 말단 대 말단 구획지 사이에 2.5 내지 3 피트의 좁은 길이 있었다. 분무된 블록은 성장기 동안 중량당 2 % 중량으로 2185 g ae/ha + AMS의 2,4-D 콜린 +글리포세이트(사전혼합)로 연속하여(2 회) 분무되었다.

첫 번째 시용은 V3 성장 단계에서였고, 두 번째 시용은 R2 성장 단계에서 였다. 실험용 및 대조군 재배지 실험 둘 다는 통상적인 제초제의 사용 또는 손 제초에 의해 시기 내내 잡초가 없이 유지되었다. 발아, 묘목 활력, 작물 손상, 개화일수, R2에서 스탠드 수, 질병 발생, 곤충 피해, 식물 높이, 성숙일수, 도복, 탈립한 100 개의 종자 중량 및 수확량에 대한 데이터를 수집하였다. 데이터는 JMP®프로 9.0.3를 사용하여 분석하였다. 표 40은 최종 분석에서 사용된 위치를 나열한다. 심어진 일부 위치는 구획지 변동성으로 인해 분석에 포함되지 않았다.

초기 및 후기 시험 둘 다에 대해 전체 위치에 걸친 분석을 수행하였다. 표 41 및 표 42는 초기 및 후기 시험에 대한 변동성의 수확량 분석을 각각 나타낸다.

초기 및 후기 시험의 경우, 유의한(P=0.05) 이름 효과가 있었다. 이입된 이벤트인 각각의 엘리트 대두가 상이한 유전적 배경에 기인한 것이므로 이러한 것이 예상되었다.

수확량이 상이한 분무 및 비분무 처리를 나타내는 초기 시험에 대한 유의한 처리 효과가 측정되었다. 후기 시험의 경우 분무 및 비분무 구획지의 수확량이 상이하지 않음을 나타내는 유의한 처리 효과가 없었다.

초기 및 후기 시험 둘 다의 경우, 처리 상호작용 효과에 의한 이름은 유의하지 않으며, 처리의 효과(또는 효과 부족)는 특정 시험에서 각각의 시험체에 대해 동일함을 나타냈다.

표 43은 초기 시험에서 처리 조합에 의한 각각의 시험체에 대한 평균 수확량을 나타내며, 여기에서 HOMO는 동형접합성을 나타낸다. 동일한 문자에 따른 값(주어진 품종 내에서)은 P=0.05에서 스튜던트 t(Student's t)에 따라 상이하지 않다. V3 및 R3에서 2185 g ae/ha + AMS로 2,4-D 콜린 + 글리포세이트(사전혼합)이 연속해서 분무될 때 보다 높은 수확량을 보이는 4 개의 시험체가 있었다.

표 44는 처리 조합에 의한 각각의 시험체의 평균 수확량을 나타낸다. 동일한 문자에 따른 값(주어진 품종 내에서)은 P=0.05에서 스튜던트 t에 따라 상이하지 않다. 상기 보고된 바와 같이, 후기 시험의 경우 시험체 효과에 의한 처리 또는 유의한 처리 효과가 없어서 평균치 검정을 수행하지 않았다. 표에서 문자는 후기 시험에서 분무된 및 비-분무된 처리 사이에 차이가 없음을 나타낸다.

다시 한 번 본 실시예에서 수확량 시험의 결과는 일부 대두 유전자형에 대한 일부 환경에서 2,4-D의 시용 이후 수확량이 증가할 수 있음을 나타낸다. 지난 2 년 간, 이러한 수확량 증가는 MG2 성장 영역에서 진행된 수확량 시험에서 관찰되었다.

실시예 24

대두와 옥수수의 비교

AAD-12 트랜스진을 포함하는 대두에서 재배지 시험의 수확량 결과는 2,4-D의 시용이 특정 대두 유전자형에 대해 특정 환경에서 대두의 수확량을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 AAD-1 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 옥수수 이벤트와 비교할 때 놀랍다. AAD-1 트랜스제닉 옥수수 식물의 수확량은 2,4-D가 분무된 후 통계상 유의한 수확량의 증가를 일관되게 나타내지 않았다. 이러한 AAD-1 트랜스제닉 옥수수 식물은 통상적인 옥수수와 생물학적으로 동등하다. 다양한 지리적 위치에서 추가적인 재배지 연구가 2010년부터 2012년까지 하이브리드 옥수수 계통에 대해 완료되었다. 이러한 재배지 연구 내내, 2,4-D(2,185 g ae/ha 및 4,370 g ae/ha) 분무를 한 옥수수 계통의 수확량은 처리되지 않은 대조군 옥수수 계통(예를 들어, 2,4-D가 분무되지 않음)과 비교하였다. 이러한 실험의 결과는 AAD-1 트랜스진을 포함한 옥수수 식물이 2,4-D 분무로의 처리 결과로서 수확량에서 유의한 증가를 유발하지 않음을 입증한다. 비교하여, 수확량 증가는 2,4-D의 시용 이후 일부 대두 유전자형에서 나타났다. 2,4-D의 시용 이후 나타난 대두 유전자형에서 관찰된 수확량 증가는 작물의 수확량 증가를 위해 적용가능한 예상치않은 개선이다. 개시된 방법은 2,4-D 처리를 사용하는데 효율적으로 사용되어 트랜스제닉 작물, 예를 들어 AAD-12 유전자를 발현하는 작물의 수확량을 증가시킬 수 있다.

이해의 명확성을 목적으로, 본 발명이 설명과 예시에 의해 일부 상세하게 설명이 되었지만, 첨부된 청구항의 범위 내에서 특정 변화 및 변형이 실시될 수 있음은 분명할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC Hoffman, Thomas Cui, Yunxing Obourn, Malcolm Parkhurst, Dawn Wiggins, Barry Vercauteren, Michael <120> METHODS OF IMPROVING THE YIELD OF 2,4-D RESISTANT CROP PLANTS <130> 72747-US-NP <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 879 <212> DNA <213> Delftia acidovorans <400> 1 atgcagacga cgctgcagat tacccccaca ggcgccaccc tgggcgccac cgtcaccggc 60 gtgcacctgg ccacgctgga cgacgccggc ttcgccgccc tgcacgccgc ctggctgcag 120 catgcgctgc tgatcttccc cggccagcac ctcagcaacg accagcagat cacttttgcc 180 aaacgcttcg gcgcgatcga gcgcatcggc ggcggcgaca tcgtggccat ctccaatgtc 240 aaggccgatg gcacggtgcg ccagcacagc cccgccgagt gggacgacat gatgaaggtc 300 atcgtcggca acatggcctg gcatgccgac agcacctaca tgccggtgat ggcgcagggc 360 gcggtgttct cggccgaagt ggtgcccgca gtgggcgggc gcacctgctt cgccgacatg 420 cgcgccgcct acgacgcgct ggacgaggcc acccgcgccc tggtgcacca gcgctcggcg 480 cggcattcgc tggtgtattc gcagagcaag ctgggccatg tgcagcaggc cggctcggcc 540 tacatcggct acggcatgga caccaccgcc acgcccctgc gcccgctggt caaggtgcat 600 cccgagaccg gccgcccctc gctgctgatc ggccgccatg cccatgccat cccgggcatg 660 gacgccgccg aatccgagcg cttcctggaa ggcctggtcg actgggcctg ccaggcgccg 720 cgggtgcatg cccaccaatg ggccgccggc gacgtggtgg tgtgggacaa ccgctgcctg 780 ctgcaccgcg ccgagccctg ggatttcaag ctgccgcggg tgatgtggca cagccgcctg 840 gccggccgcc ccgagaccga gggcgccgcc ctggtgtaa 879 <210> 2 <211> 292 <212> PRT <213> Delftia acidovorans <400> 2 Met Gln Thr Thr Leu Gln Ile Thr Pro Thr Gly Ala Thr Leu Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Thr Gly Val His Leu Ala Thr Leu Asp Asp Ala Gly Phe Ala 20 25 30 Ala Leu His Ala Ala Trp Leu Gln His Ala Leu Leu Ile Phe Pro Gly 35 40 45 Gln His Leu Ser Asn Asp Gln Gln Ile Thr Phe Ala Lys Arg Phe Gly 50 55 60 Ala Ile Glu Arg Ile Gly Gly Gly Asp Ile Val Ala Ile Ser Asn Val 65 70 75 80 Lys Ala Asp Gly Thr Val Arg Gln His Ser Pro Ala Glu Trp Asp Asp 85 90 95 Met Met Lys Val Ile Val Gly Asn Met Ala Trp His Ala Asp Ser Thr 100 105 110 Tyr Met Pro Val Met Ala Gln Gly Ala Val Phe Ser Ala Glu Val Val 115 120 125 Pro Ala Val Gly Gly Arg Thr Cys Phe Ala Asp Met Arg Ala Ala Tyr 130 135 140 Asp Ala Leu Asp Glu Ala Thr Arg Ala Leu Val His Gln Arg Ser Ala 145 150 155 160 Arg His Ser Leu Val Tyr Ser Gln Ser Lys Leu Gly His Val Gln Gln 165 170 175 Ala Gly Ser Ala Tyr Ile Gly Tyr Gly Met Asp Thr Thr Ala Thr Pro 180 185 190 Leu Arg Pro Leu Val Lys Val His Pro Glu Thr Gly Arg Pro Ser Leu 195 200 205 Leu Ile Gly Arg His Ala His Ala Ile Pro Gly Met Asp Ala Ala Glu 210 215 220 Ser Glu Arg Phe Leu Glu Gly Leu Val Asp Trp Ala Cys Gln Ala Pro 225 230 235 240 Arg Val His Ala His Gln Trp Ala Ala Gly Asp Val Val Val Trp Asp 245 250 255 Asn Arg Cys Leu Leu His Arg Ala Glu Pro Trp Asp Phe Lys Leu Pro 260 265 270 Arg Val Met Trp His Ser Arg Leu Ala Gly Arg Pro Glu Thr Glu Gly 275 280 285 Ala Ala Leu Val 290 <210> 3 <211> 882 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plant optimized nucleotide sequence of AAD-12 (v1) <400> 3 atggctcaga ccactctcca aatcacaccc actggtgcca ccttgggtgc cacagtcact 60 ggtgttcacc ttgccacact tgacgatgct ggtttcgctg ccctccatgc agcctggctt 120 caacatgcac tcttgatctt ccctgggcaa cacctcagca atgaccaaca gattaccttt 180 gctaaacgct ttggagcaat tgagaggatt ggcggaggtg acattgttgc catatccaat 240 gtcaaggcag atggcacagt gcgccagcac tctcctgctg agtgggatga catgatgaag 300 gtcattgtgg gcaacatggc ctggcacgcc gactcaacct acatgccagt catggctcaa 360 ggagctgtgt tcagcgcaga agttgtccca gcagttgggg gcagaacctg ctttgctgac 420 atgagggcag cctacgatgc ccttgatgag gcaacccgtg ctcttgttca ccaaaggtct 480 gctcgtcact cccttgtgta ttctcagagc aagttgggac atgtccaaca ggccgggtca 540 gcctacatag gttatggcat ggacaccact gcaactcctc tcagaccatt ggtcaaggtg 600 catcctgaga ctggaaggcc cagcctcttg atcggccgcc atgcccatgc catccctggc 660 atggatgcag ctgaatcaga gcgcttcctt gaaggacttg ttgactgggc ctgccaggct 720 cccagagtcc atgctcacca atgggctgct ggagatgtgg ttgtgtggga caaccgctgt 780 ttgctccacc gtgctgagcc ctgggatttc aagttgccac gtgtgatgtg gcactccaga 840 ctcgctggac gcccagaaac tgagggtgct gccttggttt ga 882 <210> 4 <211> 293 <212> PRT <213> Delftia acidovorans <400> 4 Met Ala Gln Thr Thr Leu Gln Ile Thr Pro Thr Gly Ala Thr Leu Gly 1 5 10 15 Ala Thr Val Thr Gly Val His Leu Ala Thr Leu Asp Asp Ala Gly Phe 20 25 30 Ala Ala Leu His Ala Ala Trp Leu Gln His Ala Leu Leu Ile Phe Pro 35 40 45 Gly Gln His Leu Ser Asn Asp Gln Gln Ile Thr Phe Ala Lys Arg Phe 50 55 60 Gly Ala Ile Glu Arg Ile Gly Gly Gly Asp Ile Val Ala Ile Ser Asn 65 70 75 80 Val Lys Ala Asp Gly Thr Val Arg Gln His Ser Pro Ala Glu Trp Asp 85 90 95 Asp Met Met Lys Val Ile Val Gly Asn Met Ala Trp His Ala Asp Ser 100 105 110 Thr Tyr Met Pro Val Met Ala Gln Gly Ala Val Phe Ser Ala Glu Val 115 120 125 Val Pro Ala Val Gly Gly Arg Thr Cys Phe Ala Asp Met Arg Ala Ala 130 135 140 Tyr Asp Ala Leu Asp Glu Ala Thr Arg Ala Leu Val His Gln Arg Ser 145 150 155 160 Ala Arg His Ser Leu Val Tyr Ser Gln Ser Lys Leu Gly His Val Gln 165 170 175 Gln Ala Gly Ser Ala Tyr Ile Gly Tyr Gly Met Asp Thr Thr Ala Thr 180 185 190 Pro Leu Arg Pro Leu Val Lys Val His Pro Glu Thr Gly Arg Pro Ser 195 200 205 Leu Leu Ile Gly Arg His Ala His Ala Ile Pro Gly Met Asp Ala Ala 210 215 220 Glu Ser Glu Arg Phe Leu Glu Gly Leu Val Asp Trp Ala Cys Gln Ala 225 230 235 240 Pro Arg Val His Ala His Gln Trp Ala Ala Gly Asp Val Val Val Trp 245 250 255 Asp Asn Arg Cys Leu Leu His Arg Ala Glu Pro Trp Asp Phe Lys Leu 260 265 270 Pro Arg Val Met Trp His Ser Arg Leu Ala Gly Arg Pro Glu Thr Glu 275 280 285 Gly Ala Ala Leu Val 290 <210> 5 <211> 882 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E. coli optimized nucleotide sequence of AAD-12 (v2) <400> 5 atggctcaga ctaccctgca gattaccccg actggtgcga ccctgggtgc aaccgttacc 60 ggcgttcacc tggcgactct ggatgacgca ggtttcgctg cgctgcacgc ggcttggctg 120 caacatgctc tcctgatttt cccaggtcag cacctgtcca acgaccagca aatcactttt 180 gcaaaacgct tcggtgcgat cgaacgtatc ggtggcggtg atattgtggc gatctccaac 240 gtaaaagcgg atggtactgt acgtcagcac agcccggcgg agtgggacga tatgatgaag 300 gtgatcgtag gcaacatggc atggcatgct gacagcacct acatgccggt tatggcgcag 360 ggtgcggttt tctctgctga agtggttccg gcagtgggcg gtcgcacctg cttcgcagac 420 atgcgtgcag cttacgacgc gttagacgaa gctacccgcg cactggtaca ccagcgctct 480 gcgcgtcact ctctggtgta ttcccagagc aaactgggcc acgttcagca agcgggctcc 540 gcatatatcg gctacggtat ggataccact gcgaccccgc tgcgtccgct ggtaaaagtg 600 catccggaaa ccggccgtcc gtctctcctg atcggccgtc acgctcatgc gattccgggt 660 atggacgcgg cagaatccga gcgtttcctg gaaggtctgg ttgattgggc ttgtcaggcg 720 ccgcgtgtgc atgctcacca gtgggcagct ggcgacgtgg ttgtatggga taaccgctgc 780 ctgcttcacc gtgcagaacc gtgggacttt aagctgccac gtgttatgtg gcacagccgt 840 ctggcaggcc gcccagaaac cgagggcgcg gctctggttt aa 882 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 forward primer <400> 6 gtaaaacgac ggccag 16 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 reverse primer <400> 7 caggaaacag ctatgac 17 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward AAD-12 (v1) PTU primer <400> 8 gaacagttag acatggtcta aagg 24 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse AAD-12 (v1) PTU primer <400> 9 gctgcaacac tgataaatgc caactgg 27 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward AAD-12 (v1) coding PCR primer <400> 10 atggctcaga ccactctcca aa 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse AAD-12 (v1) coding PCR primer <400> 11 agctgcatcc atgccaggga 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> "sdpacodF" AAD-12 (v1) primer <400> 12 atggctcatg ctgccctcag cc 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> "sdpacodR" AAD-12 (v1) primer <400> 13 cgggcaggcc taactccacc aa 22 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> "Nco1 of Brady" primer <400> 14 tataccacat gtcgatcgcc atccggcagc tt 32 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> "Sac1 of Brady" primer <400> 15 gagctcctat cactccgccg cctgctgctg ca 32

Claims (32)

1. 아릴옥시알카노에이트 잔기를 포함하는 제초제의 자극량으로 식물을 처리하는 것을 포함하는, 2,4-D 저항성 작물의 수확량의 개선 방법.
2. 제1항에 있어서, 2,4-D 저항성 작물이 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제(AAD)로 형질전환된 트랜스제닉 식물인, 방법.
3. 제2항에 있어서, 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제(AAD)가 AAD-12인, 방법.
4. 제1항에 있어서, 아릴옥시알카노에이트 잔기를 포함하는 제초제가 페녹시 제초제 또는 페녹시아세트산 제초제인, 방법.
5. 제1항에 있어서, 아릴옥시알카노에이트 잔기를 포함하는 제초제가 2,4-D인 방법.
6. 제5항에 있어서, 2,4-D가 2,4-D 콜린 또는 2,4-D 디메틸아민(DMA)을 포함하는, 방법.
7. 제1항에 있어서, 처리가 잡초 방제를 위해서 또한 사용되는 2,4-D의 시용 비율로 적어도 한번 수행되는, 방법.
8. 제1항에 있어서, 처리가 잡초 방제를 위해서 또한 사용되는 2,4-D의 시용 비율로 두 번 수행되는, 방법.
9. 제8항에 있어서, 2,4-D가 2,4-D 내성을 갖는 대두의 V3 및 R2 성장 단계에서 시용되는, 방법.
10. 제1항에 있어서, 처리가 잡초 방제를 위해서 또한 사용되는 2,4-D의 시용 비율로 적어도 세 번 수행되는, 방법.
11. 제1항에 있어서, 2,4-D 저항성 작물이 스트레스를 받는, 방법.
12. 제1항에 있어서, 2,4-D 저항성 작물이 잡초 방제를 위한 2,4-D와는 상이한 제초제로 또한 처리되는, 방법.
13. 제12항에 있어서, 2,4-D와 상이한 제초제가 포스포르-제초제 또는 아릴옥시페녹시프로피온산 제초제인, 방법.
14. 제13항에 있어서, 포스포르-제초제가 글리포세이트, 글루포시네이트, 그 유도체 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
15. 제13항에 있어서, 포스포르-제초제가 암모늄 염, 이소프로필암모늄 염, 이소프로필아민 염, 또는 포타슘 염의 형태인, 방법.
16. 제13항에 있어서, 아릴옥시페녹시프로피온산 제초제가 클로라지포프, 페녹사프로프, 플루아지포프, 할록시포프, 퀴잘로포프, 그 유도체 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
17. 제1항에 있어서, 2,4-D 저항성 작물이 25 g ae/ha 내지 5000 g ae/ha의 2,4-D로 적어도 한번 처리되는, 방법.
18. 제1항에 있어서, 2,4-D 저항성 작물이 100 g ae/ha 내지 2500 g ae/ha의 2,4-D로 적어도 한번 처리되는, 방법.
19. 제1항에 있어서, 아릴옥시알카노에이트 잔기를 포함하는 제초제가 뿌리 흡수를 통하여 2,4-D 저항성 작물에 도달하는, 방법.
20. 제13항에 있어서, 포스포르-제초제가 뿌리 흡수를 통해 2,4-D 저항성 작물에 도달하는, 방법.
21. 제13항에 있어서, 아릴옥시페녹시프로피온산 제초제가 뿌리 흡수를 통해 2,4-D 저항성 작물에 도달하는, 방법.
22. 제2항에 있어서, 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제(AAD)로 형질전환된 트랜스제닉 식물이 목화, 대두, 및 카놀라로부터 선택되는, 방법.
23. (a) 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제(AAD)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 식물 세포를 형질전환하는 것;
    (b) 형질전환된 세포를 선별하는 것;
    (c) 형질전환된 세포로부터 식물을 재생하는 것; 및
    (d) 아릴옥시알카노에이트 잔기를 포함하는 제초제의 자극량으로 식물을 처리하는 것
    을 포함하는 2,4-D 저항성 작물의 수확량의 개선 방법.
24. 제23항에 있어서, 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제(AAD)가 AAD-12인, 방법.
25. 제23항에 있어서, 핵산 분자가 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제(AAD)가 아닌 선별가능한 마커를 포함하는, 방법.
26. 제25항에 있어서, 선별가능한 마커가 포스피노트리신 아세틸트랜스페라제 유전자(pat) 또는 바이알라포스 저항성 유전자(bar)인, 방법.
27. 제23항에 있어서, 핵산 분자가 식물-최적화된, 방법.
28. 비-트랜스제닉 부모 식물에 비해 증가된 수확량을 갖는, 2,4-D 저항성을 갖는 트랜스제닉 식물의 제조에 있어서의 2,4-D의 용도.
29. 제28항에 있어서, 2,4-D가 25 g ae/ha 내지 5000 g ae/ha의 2,4-D로 적어도 한번 시용되는, 용도.
30. 제28항에 있어서, 2,4-D가 100 g ae/ha 내지 2500 g ae/ha의 2,4-D로 적어도 한번 시용되는, 용도.
31. 제28항에 있어서, 2,4-D가 2,4-D 콜린 또는 2,4-D 디메틸아민(DMA)을 포함하는, 용도.
32. 제28항에 있어서, 2,4-D 저항성 작물이 개화 전에 적어도 두 번 2,4-D로 처리되는, 용도.

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