CN110607323A - 一种农杆菌介导水稻遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，包括如下步骤：制备MS培养基，选取水稻种子，除菌后将种子均匀播种到MS培养基上；进行22‑24℃的无光照培养，培养时间8‑10天至种子发芽，然后剪取新鲜的子叶备用；活化农杆菌；侵染；转入共培养基进行共培养，同时在光照下培养2‑3d；将共培养后的愈伤组织收入培养瓶中，加入羧苄水进行清洗，同时不断摇晃培养瓶，清洗不再浑浊后倒去羧苄水，将愈伤通过无菌滤纸干燥；进行筛选培养；进行分化培养，直至愈伤组织出现绿芽。通过用无光照培养来替代现有技术愈伤组织的诱导培养、继代培养，免去预培养过程，提高了愈伤组织分化能力，进而增加了出苗率。

Description

一种农杆菌介导水稻遗传转化方法
技术领域
本发明涉及生物遗传转化领域，具体是一种农杆菌介导水稻遗传转化方法。
背景技术
随着人们对转基因方法的研究越来越多，其中，对农杆菌介导的转化方法研究较多，应用最广。而目前农杆菌介导的转化方法包括愈伤组织的诱导培养，愈伤组织的继代培养，侵染，共培养，农杆菌的去除，筛选培养，抗性愈伤组织的分化培养。存在周期较长，愈伤分化能力不强，导致出苗率低的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，以至少达到减少预培养过程，提高愈伤分化能力，进而增加出苗率的目的。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，包括如下步骤：
S1.制备MS培养基，在选用基础培养基后，加入蔗糖、甘露醇、琼脂、1％的马尿酸钠溶液，将培养基的pH调整至6，灭菌后制备出MS培养基，备用；
S2.选取水稻种子，去颖壳；
S3.将去颖壳后的种子放入超净工作台上，用酒精浸泡1min后，再用次氯酸钠对种子进行消毒，之后用灭菌水将种子清洗10次，并将其置于无菌滤纸上吹干，最后将种子均匀播种到S1中的MS培养基上；
S4.将S3中的MS培养基进行22-24℃的无光照培养，培养时间8-10天至种子发芽，然后剪取新鲜的子叶备用；
S5.活化农杆菌；
S6.侵染，将S5中活化后的农杆菌的单菌落接种到天然液体培养基中，振荡培养24h，至对数生长期时将S4中培养好的子叶浸泡到天然液体培养基中进行侵染；
S7.去除农杆菌液后，将侵染好后的组织放在无菌滤纸上吸去过多的菌液，然后转入共培养基进行共培养，同时在光照下培养2-3d；
S8.将共培养后的愈伤组织收入培养瓶中，加入羧苄水进行清洗，同时不断摇晃培养瓶，清洗不再浑浊后倒去羧苄水，将愈伤通过无菌滤纸干燥；
S9.将S8中干燥后的愈伤组织接种在筛选培养基上进行筛选培养；
S10.将筛选培养出的抗性愈伤转入分化培养基进行分化培养，直至愈伤组织出现绿芽。
优选的，在所述S1中，所述基础培养基包括1L蒸馏水、1g/L的硝酸铵、0.5g/L磷酸二氢钾、1.5g/L磷酸氢二钠、1g/L氯化钠、0.2g/L七水硫酸镁，基础培养基的pH调整至7.2。
优选的，在所述S4中，备用的新鲜子叶放置在22-24℃的无光照条件下。
优选的，在所述S5中，活化后的农杆菌含有目标基因。
优选的，在所述S10中，所述分化培养基9-10d更换一次，直至愈伤组织出现绿芽
本发明的有益效果是：
本发明通过用无光照培养来替代现有技术愈伤组织的诱导培养、继代培养，免去预培养过程，提高了愈伤组织分化能力，进而增加了出苗率。
具体实施方式
下面结合实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，包括如下步骤：
S1.基础培养基包括1L蒸馏水、1g/L的硝酸铵、0.5g/L磷酸二氢钾、1.5g/L磷酸氢二钠、1g/L氯化钠、0.2g/L七水硫酸镁，基础培养基的pH调整至7.2。在基础培养基中加入蔗糖、甘露醇、琼脂、1％的马尿酸钠溶液，将培养基的pH调整至6，灭菌后制备出MS培养基，备用；
S2.选取水稻种子，去颖壳；
S3.将去颖壳后的种子放入超净工作台上，用酒精浸泡1min后，再用次氯酸钠对种子进行消毒，之后用灭菌水将种子清洗10次，并将其置于无菌滤纸上吹干，最后将种子均匀播种到S1中的MS培养基上；
S4.将S3中的MS培养基进行22℃的无光照培养，培养时间8天至种子发芽，然后剪取新鲜的子叶备用；其中备用的新鲜子叶放置在22℃的无光照条件下。
S5.将含有目标基因的农杆菌活化；目标基因可以是抗旱基因、抗干旱诱导基因等。
S6.侵染，将S5中活化后的农杆菌的单菌落接种到天然液体培养基中，振荡培养24h，至对数生长期时将S4中培养好的子叶浸泡到天然液体培养基中进行侵染；
S7.去除农杆菌液后，将侵染好后的组织放在无菌滤纸上吸去过多的菌液，然后转入共培养基进行共培养，同时在光照下培养2d；
S8.将共培养后的愈伤组织收入培养瓶中，加入羧苄水进行清洗，同时不断摇晃培养瓶，清洗不再浑浊后倒去羧苄水，将愈伤通过无菌滤纸干燥；
S9.将S8中干燥后的愈伤组织接种在筛选培养基上进行筛选培养；
S10.将筛选培养出的抗性愈伤转入分化培养基进行分化培养，化培养基9d更换一次，直至愈伤组织出现绿芽。
愈伤组织分化能力测定
在24℃，4000lx，16hr光周期的条件下培养22-26d，统计绿色芽点；
相比现有技术绿色芽点率为76％左右，本发明的绿色芽点率为82％左右。其绿色芽点越多，证明其愈伤组织分化能力越强。
实施例2
一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，包括如下步骤：
S1.基础培养基包括1L蒸馏水、1g/L的硝酸铵、0.5g/L磷酸二氢钾、1.5g/L磷酸氢二钠、1g/L氯化钠、0.2g/L七水硫酸镁，基础培养基的pH调整至7.2。在基础培养基中加入蔗糖、甘露醇、琼脂、1％的马尿酸钠溶液，将培养基的pH调整至6，灭菌后制备出MS培养基，备用；
S2.选取水稻种子，去颖壳；
S3.将去颖壳后的种子放入超净工作台上，用酒精浸泡1min后，再用次氯酸钠对种子进行消毒，之后用灭菌水将种子清洗10次，并将其置于无菌滤纸上吹干，最后将种子均匀播种到S1中的MS培养基上；
S4.将S3中的MS培养基进行24℃的无光照培养，培养时间8天至种子发芽，然后剪取新鲜的子叶备用；其中备用的新鲜子叶放置在24℃的无光照条件下。
S5.将含有目标基因的农杆菌活化；目标基因可以是抗旱基因、抗干旱诱导基因等。
S6.侵染，将S5中活化后的农杆菌的单菌落接种到天然液体培养基中，振荡培养24h，至对数生长期时将S4中培养好的子叶浸泡到天然液体培养基中进行侵染；
S7.去除农杆菌液后，将侵染好后的组织放在无菌滤纸上吸去过多的菌液，然后转入共培养基进行共培养，同时在光照下培养3d；
S8.将共培养后的愈伤组织收入培养瓶中，加入羧苄水进行清洗，同时不断摇晃培养瓶，清洗不再浑浊后倒去羧苄水，将愈伤通过无菌滤纸干燥；
S9.将S8中干燥后的愈伤组织接种在筛选培养基上进行筛选培养；
S10.将筛选培养出的抗性愈伤转入分化培养基进行分化培养，化培养基10d更换一次，直至愈伤组织出现绿芽。
愈伤组织分化能力测定
在24℃，4000lx，16hr光周期的条件下培养22-26d，统计绿色芽点；
相比现有技术绿色芽点率为76％左右，本发明的绿色芽点率为81％左右。其绿色芽点越多，证明其愈伤组织分化能力越强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (5)

1.一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，其特征在于：
包括如下步骤：
S1.制备MS培养基，在选用基础培养基后，加入蔗糖、甘露醇、琼脂、1％的马尿酸钠溶液，将培养基的pH调整至6，灭菌后制备出MS培养基，备用；
S2.选取水稻种子，去颖壳；
S3.将去颖壳后的种子放入超净工作台上，用酒精浸泡1min后，再用次氯酸钠对种子进行消毒，之后用灭菌水将种子清洗10次，并将其置于无菌滤纸上吹干，最后将种子均匀播种到S1中的MS培养基上；
S4.将S3中的MS培养基进行22-24℃的无光照培养，培养时间8-10天至种子发芽，然后剪取新鲜的子叶备用；
S5.活化农杆菌；
S6.侵染，将S5中活化后的农杆菌的单菌落接种到天然液体培养基中，振荡培养24h，至对数生长期时将S4中培养好的子叶浸泡到天然液体培养基中进行侵染；
S7.去除农杆菌液后，将侵染好后的组织放在无菌滤纸上吸去过多的菌液，然后转入共培养基进行共培养，同时在光照下培养2-3d；
S8.将共培养后的愈伤组织收入培养瓶中，加入羧苄水进行清洗，同时不断摇晃培养瓶，清洗不再浑浊后倒去羧苄水，将愈伤通过无菌滤纸干燥；
S9.将S8中干燥后的愈伤组织接种在筛选培养基上进行筛选培养；
S10.将筛选培养出的抗性愈伤转入分化培养基进行分化培养，直至愈伤组织出现绿芽。
2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，其特征在于：在所述S1中，所述基础培养基包括1L蒸馏水、1g/L的硝酸铵、0.5g/L磷酸二氢钾、1.5g/L磷酸氢二钠、1g/L氯化钠、0.2g/L七水硫酸镁，基础培养基的pH调整至7.2。
3.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，其特征在于：在所述S4中，备用的新鲜子叶放置在22-24℃的无光照条件下。
4.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，其特征在于：在所述S5中，活化后的农杆菌含有目标基因。
5.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，其特征在于：在所述S10中，所述分化培养基9-10d更换一次，直至愈伤组织出现绿芽。
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