CN103620040A - 顽固单子叶植物的增强转化 - Google Patents

Abstract

在此提供了用于转化单子叶植物的改进的方法，连同改进的磷酸甘露糖异构酶（PMI）蛋白编码区和包括其的转化载体。

Description

顽固单子叶植物的增强转化

相关申请

本申请要求于2011年4月26日提交的美国临时专利申请序列号61/479,131的权益，其披露通过引用以其全文结合在此。

领域

本发明广泛地涉及植物转化领域。

背景

农杆菌介导的基因转移被广泛地用于转基因双子叶植物的生产。然而，对于农杆菌介导的转化，通常单子叶植物（monocotyledonous plants，monocots）比双子叶植物更不敏感，并且因此直接的DNA转移方法（例如电穿孔转化和基因枪转化）已经被更广泛地使用。此外，直接的DNA转移方法仍有不足，包括作为所希望的基因的多拷贝的DNA向宿主基因组的频繁结合与来自质粒载体的侧翼序列一起重排。这些重排和整合事件可以导致在R₀和子代植物中的异常和不稳定的基因表达。

农杆菌介导的基因转移通常导致分立的、非重排的DNA区段向宿主基因组的插入，并且因此需要用于单子叶植物的农杆菌介导的转化的更好方法。

概述

在此提供了用于增加一种单子叶植物组织的转化频率的方法，包括向该植物组织的一个细胞中引入一个异源核酸，该异源核酸包括具有一个或多个玉米优化密码子的编码区，由此产生一种包括该核酸的转化细胞；由此与在该核酸的编码区不具有玉米优化密码子的转化频率相比，该单子叶植物组织的转化频率增加。

在一些实施例中，该编码区对一种磷酸甘露糖异构酶（PMI）蛋白进行编码。

在一些实施例中，该引入步骤是通过农杆菌介导的转化进行的。在一些实施例中，该单子叶植物对农杆菌介导的转化是顽固的。

在一些实施例中，与在该核酸的编码区中不具有玉米优化密码子的转化频率相比，该单子叶植物组织具有1倍、2倍、或3倍更大的转化频率。

在一些实施例中，与在该核酸的编码区中具有玉米优化密码子的转化频率相比，通过农杆菌介导的转化的、不具有玉米优化密码子的该单子叶植物组织具有小于约20%、15%、10%、或5%的转化频率。

在一些实施例中，该单子叶植物组织是玉米、水稻、小麦或大麦组织。在一些实施例中，该单子叶植物组织是甘蔗的组织。在一些实施例中，该单子叶植物组织是一种水稻的籼稻品种。

进一步提供了一种使用磷酸甘露糖异构酶（PMI）蛋白作为选择标记来转化植物组织（例如，甘蔗）的方法，包括：(a)向该植物组织的一个细胞中引入一个异源核酸，该异源核酸包括一个PMI蛋白编码区，该PMI编码区具有一个或多个玉米优化密码子，以由此产生一个包括该核酸的转化细胞，其中该引入步骤是通过农杆菌介导的转化进行的；以及，可任选地，(b)在选择性针对PMI蛋白表达的条件下，从这一转化的细胞再生一个转化植物；以产生这一转化植物组织。

在一些实施例中，与用包括一个包含SEQ ID NO:2的核酸的表达盒的转化相比，该植物组织具有1倍、2倍、或3倍更大的转化频率。

在一些实施例中，该PMI蛋白包括具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或一个与其有90%一致性的氨基酸序列，由这些序列组成，或基本上由这些序列组成。在一些实施例中，该PMI蛋白包括具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或一个与其有95%一致性的氨基酸序列，由这些序列组成，或基本上由这些序列组成。在一些实施例中，该编码区具有10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、或390个或更多个玉米优化密码子。在一些实施例中，该编码区包括至少500个、700个、或1000个具有SEQ ID NO:2的连续核苷酸，由其组成，或基本上由其组成。在一些实施例中，该编码区包括与SEQ ID NO:2具有90%、95%、97%、98%或99%一致性的核酸序列，由其组成，或基本上由其组成。在一些实施例中，该编码区具有一个在严格条件下与具有SEQ ID NO:2的核酸进行杂交的核酸序列。

在一些实施例中，这些方法进一步包括选择一个包括这一转化的细胞的丛生嫩枝培养株；使该丛生嫩枝培养株在促进嫩枝伸长的条件下生长以产生至少一个转化嫩枝；并且使该至少一个转化嫩枝生长。

还提供了一个通过如在此所提供的方法产生的转化丛生嫩枝培养株，自其再生一个植物，或其一个子代。

进一步提供了一个包括以下核酸序列的重组载体，该核酸序列或其补体包括（由其组成，或基本上由其组成）一个对以下进行编码的编码区：(a)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；或(b)一个与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少90%、95%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列，并且对磷酸甘露糖异构酶（PMI）蛋白进行编码，其中该编码区包括一个或多个玉米优化密码子。

在一些实施例中，该核酸或核苷酸序列可以进一步包括一个Kozak序列。

在某些实施例中，该核苷酸序列包括至少500个、700个、或1000个具有SEQ ID NO:2的核酸序列的连续核苷酸。在一些实施例中，该编码区包括与SEQ ID NO:2具有90%、95%、97%、98%或99%一致性的核酸序列，由其组成，或基本上由其组成。在一些实施例中，该编码区包括一个在严格条件下与具有SEQ ID NO:2的核酸进行杂交的核酸序列，由其组成，或基本上由其组成。

在一些实施例中，该载体可以包括一个T-DNA边界区，或能以另外的方式被配置或构建用于在农杆菌介导的植物或真菌转化中使用。

还提供了以下核酸序列，该核酸序列或其补体包括一个对与具有SEQID NO:3的氨基酸序列具有至少90%一致性的氨基酸序列进行编码并且对磷酸甘露糖异构酶（PMI）蛋白进行编码的编码区，其中所述编码区包括一个或多个玉米优化密码子。在一些实施例中，该编码区对具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或一个与其有95%一致性的氨基酸序列进行编码。

序列表的简要说明

SEQ ID NO:1是一个来自大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶（PMI）基因的对应于Genbank登录号M15380的核苷酸序列。

SEQ ID NO:2是一个来自大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶（PMI）基因的玉蜀黍密码子优化版本的核苷酸序列。

SEQ ID NO:3是一个来自大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶（PMI）基因的对应于EC5.3.1.8的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4是一个包含玉蜀黍泛素启动子和内含子、玉蜀黍密码子优化PMI基因以及根癌农杆菌NOS终止子的核苷酸序列。

SEQ ID NO:5是Kozak共有序列：(gcc)gccRccAUGG（SEQ ID NO:5），其中在起始密码子（AUG）的上游第三个碱基处的R是嘌呤（腺嘌呤或鸟嘌呤），该起始密码子后是另一个G。

发明详述

本发明的不同实施例描述于此。如本领域普通技术人员将理解，本发明的不同实施例的特征可以被组合以创造出旨在本发明的范围之内的额外的实施例。在此引用的所有美国专利文件通过引用结合在此，以达到它们与在此所提供的披露相一致的程度。

如在此使用的，“一种/一个（a/an）”或“该”（the）可以表示一或多于一。例如，“一种”酶包括一种单个的酶连同多种酶。如在此使用，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关的列出项的任何及全部可能组合，连同当以可替代性（“或”）解释时组合的缺少。

如在此使用，“约”意为一种值处于统计学上有意义的范围之内，例如一种说明的浓度、时间范围、重量（例如，一种百分比变化（重量的减少或增加））、体积、温度或pH。这样的范围可以在给定值或给定范围的一种数量级之内，典型地在20%之内，更典型地在10%之内，并且甚至更典型地在5%之内。“约”所涵盖的可允许的变化将取决于研究的具体系统，并且可以易为本领域一个技术人员所理解。

过渡型短语“基本上由……组成”表示一种权利要求的范围是要解释为涵盖该权利要求中所述的指定材料或步骤以及“并不实质上影响要求的发明的一种或多种基本特征或新颖特征的那些”。因此，当用于本发明的权利要求中时，术语“基本上由……组成”并不意在解释为等同于“包括”（comprising）。

“单子叶植物”（monocotyledonous plants或monocot）在本领域是熟知的，并且包括，但不局限于：小麦、草坪草、玉米、水稻、燕麦、大麦、高粱、兰花、鸢尾花、百合花、洋葱、香蕉、甘蔗、以及棕榈。

“转化频率”是指在这些细胞上执行用于引入该核酸的转化方案之后，成功地被异源核酸转化的植物细胞的百分比。在一些实施例中，转化进一步包括一个用于选择那些细胞的选择方案，那些细胞表达一种或多种由感兴趣的异源核酸编码的蛋白。在一些实施例中，转化利用一个“载体”，该载体是一个为转化进入宿主细胞而设计的核酸分子。

如在此所使用，增加的“转化效率”是指任何改进，例如在转化频率和品质事件上的增加，这些改进通过减少需要的资源的量来影响转化过程的总效率。

植物细胞的“再生”（regenerating或regeneration）是从该植物细胞（例如，植物原生质体、愈伤组织或外植体）生长一个植物的过程。

通常，使用在此所传授的这些方法时，转化频率相对于对照的转化频率增加了至少约3%、5%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%或更大，或甚至1倍、2倍或3倍或更多倍。“对照”提供了用于测量受试植物或植物细胞在表型上的变化的参考点，例如，转化频率/效率、愈伤组织的品质或转化过程的时间。对照可以包括例如用不具有玉米优化密码子的对应的核酸（例如，PMI基因）进行转化的植物细胞。

如在此所使用，“顽固”物种、变种或栽培品种是使用典型的转化方法的平均转化频率相对低的，并且典型地小于约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、或30%。相对于一种或多种转化方法（例如，农杆菌介导的转化），与非顽固变种的转化相比，对转化顽固的物种、变种或栽培品种的转化是耗时、费力并且是低效的。对农杆菌介导的转化顽固的物种的实例包括，但不局限于：黑麦草属物种（黑麦草）、玉米的良种变种、水稻的物种（尤其是籼稻）、不同草坪草物种、等。

术语“编码区”或“编码序列”是被转录成mRNA的核酸序列，当被放置于启动子序列的控制之下时该mRNA被翻译成一个多肽。编码序列的边界通常是由位于靠近该核酸的5'端的开放读码框的起点处的ATG起始密码子以及位于靠近该核酸的3'端的编码序列的终点处的一个或多个TAG、TGA或TAA终止密码子来确定的，并且在一些情况下，一个转录终止子序列刚好位于该核酸的3'端的开放读码框的下游。具有一个编码序列的核酸可以包括，但不局限于，基因组DNA、cDNA、RNA，半合成、合成、或重组核酸序列。

“玉米优化”或“玉蜀黍优化”基因或编码区是其中对感兴趣的蛋白进行编码的一个或多个密码子（通过举例，在一些实施例中，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、或甚至100%的天然密码子）已经被从天然核酸序列改变成相对于玉米进行了优化的核酸序列的基因或编码区。参见Koziel（科齐埃尔）等人，美国专利号6,075,185，通过引用以其全文结合在此。确切地，可以使用以下“玉米优化”密码子：Ala，GCC；Arg，CGC；Asn，AAC；Asp，GAC；Cys，TGC；Gln，CAG；Glu，GAG；Gly，GGC；His，CAC；Ilc，ATC；Leu，CTG；Lys，AAG；Met，ATG；Phe，TTC；Pro，CCC；Ser，AGC；Thr，ACC；Trp，TGG；Tyr，TAC；以及Val，GTG。

还考虑的是与在此所提供的核酸序列至少大体上相同的核酸序列。这可以包括在低的、中等的、高的或非常高的严格条件下与原始核酸序列进行杂交的核酸序列。还考虑的是在此所描述的任何多肽的片段或变体（例如，一种大体上相同的变体）的替代用途。如果这些核苷酸序列是至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或更大相同，那么这两个核苷酸序列是“大体上相同的”或享有“大体的一致性”。

如本领域己知，可以使用多个不同数学算法和程序来确定两个核苷酸序列之间的序列一致性的程度。例如，两个核苷酸序列之间的百分比一致性可以使用Needleman（尼德曼）和Wunsch（温施）（1970）J.Mol.Biol（《分子生物学杂志》）.48:444-453的算法来确定，该算法已经被结合进使用Blossum62矩阵亦或PAM250矩阵的GCG软件包的GAP程序中。

在此提供了示例性的“杂交”条件。用于进行杂交反应的指导可以发现于Current Protocols in Molecular Biology（《分子生物学现行方案》）（1989）John Wiley&Sons（约翰威利父子公司），N.Y.,6.3.1-6.3.6。在那个参考中描述了水的和非水的方法，并且可以使用任何一种。例如，“低严格”杂交条件可以包括在约45C、在6x氯化钠/柠檬酸钠（SSC）中的杂交，随后是至少在50℃下、在0.5x SSC、0.1%SDS中的两次洗涤。“中等严格”杂交条件的说明是在约45℃、在6x SSC中的杂交，随后是在55℃下、在0.2x SSC、0.1%SDS中的一次或多次洗涤。“严格”杂交条件的一个实例包括在65℃下的杂交以及在65℃下、用0.25x SSC、0.1%SDS洗涤三次、持续15分钟。额外的示例性的严格杂交条件包括在约50℃至70℃的温度下、在0.02M至0.15M的NaCl中或在65^o℃下、在0.5xSSC、0.25%SDS中杂交15分钟，随后是在65℃下的一次洗涤、持续半小时；或在65℃下杂交14小时，随后是在65℃下的用0.5X SSC，1%SDS的3次洗涤。其他示例性高度选择性的或严格的杂交条件包括在约50℃至70℃的温度下、在0.02M至0.15M的NaCl中或在65^o℃下、在0.5xSSC、0.25%SDS中杂交12-15小时，随后是在65^o℃下的三次洗涤，每次持续15-90分钟。可以凭视觉对探针杂交进行评分以确定一个二元（阳性对阴性）值，或可以基于10分制上的它们杂交的相对强度为这些探针指定一个分数。

“分离的多核苷酸”或“分离的核酸”（以及类似术语）可以指一个核苷酸序列（例如，DNA或RNA），该核苷酸序列不与在其衍生而来的有机体的天然存在的基因组中的与其紧接（位于5'端的以及位于3'端的）的核苷酸序列紧接。因此，在一个实施例中，一个分离的核酸包括一些或全部的5'非编码（例如，启动子）序列，这些序列紧接编码序列。术语“分离的”还可以指大体上不含细胞物质、病毒物质和/或培养基（例如，通过重组DNA技术产生时）或化学前体或其他化学品（例如，化学合成时）的多核苷酸或核酸。“分离的”不必然意指制品在技术上是纯的（同质的），但它充分纯，以提供处于一种可以用于预期目的形式的多核苷酸或核酸。在某些实施例中，这一分离的多核苷酸或核酸至少是约50%纯的，例如，至少约60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%或更纯的（例如，当与在细胞中它的自然状态相比时，相对于其他细胞物质）。

类似地，“分离的”细胞或蛋白是指至少部分地从在其自然状态中正常地相关联的其他组分中分离出来的细胞或蛋白。例如，分离的细胞可以是处于培养基中的细胞。

当在此用于指一种核酸序列（例如，DNA或RNA序列）时，术语“异源的”和“外源的”是以下一个序列，该序列起始于对该具体的宿主细胞而言外来的来源、或，若来自相同的来源则是从其原始形式进行修饰。术语“异源的”和“外源的”还包括一种天然存在的DNA序列的非天然存在的多拷贝。因此，这些术语是指对该细胞而言外来的核酸区段。

除非上下文另外指明，术语“基因”并不旨在局限于以其天然状态存在于有机体或病毒的基因组中的核酸，例如，包括天然内含子和调节序列（例如启动子以及起始和终止序列）。因此，除非由上下文另外指明，如在此所使用，术语“基因”被更广泛地解释为对蛋白或功能性的、未翻译的RNA进行编码的核酸。

还考虑到在此所提供的核酸序列的片段，例如包括该序列的至少100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个、950个、1000个等连续的核苷酸，由其组成，或基本上由其组成。

还包括感兴趣的编码蛋白的功能性片段。例如，对作为选择标记有用的磷酸甘露糖异构酶（PMI）进行编码的manA基因，允许植物利用甘露糖作为碳源。PMI是将甘露糖-6-磷酸分解成果糖-6-磷酸的一种酶，这允许用对PMI进行编码的核酸转染的植物使用甘露糖作为糖源。PMI蛋白的功能性片段是仍然执行将甘露糖-6-磷酸分解成果糖-6-磷酸的功能的片段。PMI蛋白的结构是已知的，并且因此其功能性片段对于本领域普通技术人员是清楚的。参见，例如，Cleasby（克里兹白）等人，“The X-ray crystal structureof _phos_phomannose isomerase from Candida albicans at1.7

resolution,”（在1.7

分辨率处的来自白色念珠菌的磷酸甘露糖异构酶的X-射线晶体结构）Nature Structural Biology（《自然结构生物学》）3:470-479（1996）。

如在此使用，核酸的“表达”是指对蛋白或多肽进行编码的基因或其他核酸的转录，以及可任选地翻译。

这些核酸序列可以存在于核酸构建体（例如表达盒）中。如在此使用，“表达盒”是指能够在适当的宿主细胞中指导一种具体核苷酸序列的表达的一种核酸分子，通常包括与感兴趣核苷酸序列（例如，对感兴趣的蛋白或多肽进行编码的一种核苷酸序列）可操作地相连的一个启动子。它还可以包括正确翻译该核苷酸序列所需的序列。在一些实施例中，该表达盒将包括一种选择性标记基因，用于选择转化的细胞。利用选择标记基因来选择转化的细胞或组织。在一些实施例中，该表达盒的大小在500bp与30,000bp之间，或1000bp与20,000bp之间，或5,000与15,000bp之间。

在一些实施例中，提供了一种包括选择标记基因PMI的表达盒。在一些实施例中，该PMI基因具有一个包括一个或多个玉米优化PMI密码子的编码区。如本领域中己知，该表达盒还可以包括一种感兴趣的异源核酸（例如，对感兴趣的蛋白进行编码的）和/或多个用于感兴趣的异源核酸插入的限制性酶切位点（例如，多克隆位点）。

在该表达盒中核苷酸序列的表达可以是在一个组成型启动子或一个诱导型启动子的控制之下，该启动子主要当该宿主细胞暴露于一些具体外界刺激时才引发转录。该启动子能可任选地是特异性的，或对于具体组织或器官或发育阶段示出优先表达。

在本发明的实践中可以使用任何能够在感兴趣的植物中驱动表达的启动子。该启动子可以是天然的或模拟的、或外来的或与该宿主植物是异源的。有待包括的启动子的选择取决于若干因素，包括但不局限于：效率、可选择性、诱导性、所希望的表达水平、以及细胞优先表达或组织优先表达。在一些实施例中，该启动子是一种单子叶植物启动子（例如，玉米泛素1启动子、水稻泛素启动子或水稻肌纤蛋白1启动子）。对于本领域普通技术人员而言，通过相对于序列来适当地选择并且定位启动子以及其他的调节区而调整该序列的表达是一种惯例。

已经示出不同的内含子序列增强了特别是在单子叶植物细胞中的表达。例如，已经发现玉米Adhl基因的内含子当引入玉米细胞中时显著增强了在其同源启动子下野生型基因的表达。已经发现内含子1是特别有效的，并且增强了在与氯霉素乙酰转移酶基因的融合构建体中的表达（Callis（卡利斯）等人，Genes Develop（《基因发育》）.1:1183-1200（1987））。在同一个实验体系中，来自玉米青铜色1基因（maize bronze1gene）的内含子在增强表达方面具有类似效果。常规地已经将内含子序列结合到植物转化载体中，典型地在非翻译前导序列中。

还可以添加前导序列，例如Kozak序列。Kozak序列具有(gcc)gccRccAUGG共有序列，其中在起始密码子（AUG）的上游第三个碱基处的R是嘌呤（腺嘌呤或鸟嘌呤），该起始密码子后是另一个G（SEQID NO:5）。

此外，可以使用一种转录终止子。许多种用于表达盒中的转录终止子是可获得的。这些转录终止子负责超过该转基因的转录终止以及正确的mRNA多聚腺苷酸化。该终止区可以是与该转录引发区天然在一起的、可以是与感兴趣的可操作地连接的DNA序列天然在一起的、可以是与该宿主植物天然在一起的、或者可以是源自另一种来源（即，对于该启动子、该感兴趣的DNA序列、该宿主植物、或它们的任何组合是外来的或异源的）。适当的转录终止子是已知在植物中发挥作用的那些，并且包括CAMV35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子以及豌豆rbcs E9终止子。如果希望的话，还可以向该天然转录终止子添加额外的终止子。

在此描述的表达构建体能以多种本领域公认的方式引入植物细胞（即，正“被转化的”植物细胞）中。例如，在多核苷酸的语境下，感兴趣的核苷酸构建体以这样一种方式被呈递给该植物，使得该多核苷酸有接近该植物的细胞的内部的机会。其中有待引入多于一个多核苷酸，这些多核苷酸可以作为单个核苷酸构建体的部分而进行组装，或者作为分开的核苷酸构建体，并且可以位于相同的或不同的转化载体上。因此，在一个单一的转化事件中、在分开的转化事件中和/或作为育种方案的一部分可以将这些多核苷酸引入到感兴趣的宿主细胞中。本领域已知的用于将多核苷酸引入到植物中的方法包括但不局限于瞬时转化方法和稳定转化方法。

在多核苷酸的语境下，“瞬时转化”旨在意指将多核苷酸引入该植物中并且它不整合到该植物的基因组中。

在通过“稳定引入”（stably introducing或stably introduced）将多核苷酸引入植物的语境下，这一引入的多核苷酸被稳定地结合进该植物的基因组（核或质体）中，或以另外的方式被稳定地结合在该植物的遗传材料（例如，稳定的游离基因）之中。在代表性方法中，“稳定转化”（stabletransformation或stably transformed）旨在意指被引入到植物中的多核苷酸（例如，在此描述的核苷酸构建体）整合进该植物的基因组中并且能够被一个或多个世代内的其子代所继承。

植物转化领域的普通技术人员已知许多可供植物转化使用的转化载体。载体的选择将取决于优选的转化技术以及用于转化的目标种类。对于某些目标种类，可以使用不同的抗生素或除草剂选择标记。在转化中常规使用的选择标记包括nptll基因，它赋予了对卡那霉素及相关抗生素的抗性（Messing&Vierra（梅辛和维埃拉）.Gene（《基因》）19:259-268（1982）；Bevan（贝文）等人，Nature（《自然》）304:184-187（1983））；bar基因，它赋予了对于除草剂草胺膦的抗性（White（怀特）等人，Nucl.Acids Res（《核酸研究》）18:1062（1990）；Spencer（斯宾塞）等人Theor.Appl.Genet（《理论与应用遗传学》）79:625-631（1990））；hph基因，它赋予了对抗生素潮霉素的抗性（Blochinger&Diggelmann（伯劳施格和迪格尔曼），Mol Cell Biol（《分子细胞生物学杂志》）4:2929-2931）；以及dhfr基因，它赋予了对于甲氨蝶呤的抗性（Bourouis（布劳易斯）等人，EMBOJ（《欧洲分子生物学组织杂志》）.2(7):1099-1104（1983））；以及EPSPS基因，它赋予了对草甘膦的抗性（美国专利号4,940,935和5,188,642））。

选择标记还包括对磷酸甘露糖异构酶（PMI）进行编码的基因，该基因提供了代谢甘露糖的能力（美国专利号5,767,378和5,994,629，将其通过引用结合在此）。用PMI基因转化的植物细胞可以通过在只包含甘露糖或甘露糖加蔗糖的培养基上生长进行选择。

在传统转化方案中，植物细胞被放置于包含盐、激素以及碳源（通常是蔗糖）的培养基上。对于PMI/甘露糖选择系统，植物组织可以在补充有作为唯一碳源的甘露糖或补充有包含蔗糖和甘露糖两者的培养基的类似培养基上培养。虽然甘露糖对植物细胞没有直接不良作用，但是该随后的选择被认为是它被己糖激酶磷酸化成甘露糖6-磷酸的结果。在不存在PMI时，甘露糖6-磷酸累积，并且这些细胞停止生长。Stein&Hansen（斯坦因和汉森）（1999）报道甘露糖6-磷酸本身诱导细胞凋亡（Plant Physiology（《植物生理学》）121:1-9）。作者已经鉴定出对DNA抽丝的发展（细胞凋亡的一个特征）负责的甘露糖6-磷酸诱导核酸酶。

在一些实施例中，可以利用来自农杆菌属的细菌来转化植物细胞。参见，例如，Dong（东）等人的美国专利号6,037,522。通常，使用农杆菌转化植物细胞，并且这些转化的细胞被再生成转基因植物。植物细胞的农杆菌介导的转化包括使用在根瘤菌科中分类的一种或多种细菌菌株，除了其他外，包括农杆菌属物种、根瘤菌属物种、以及中华根瘤菌属物种。取决于植物种类，这些转化细胞可以衍生自叶、根、下胚轴、叶柄、子叶、或种子。

如在本领域已知，对于农杆菌介导的转化有用的载体可以包括边界序列。“边界序列”（例如，右边界（RB）或左边界（LB））是指定义了转化DNA（T-DNA）区的一个末端的直接重复核酸序列，典型地长约24bp。边界序列可以来自农杆菌属物种的Ti质粒或Ri质粒，或可以是发挥类似功能的植物衍生序列。“T-DNA边界区”是指RB序列或LB序列以及相关联的侧翼序列，典型地长约100bp，并且如果希望的话，可以包括一个转化增强子序列。

例如，水稻（亚洲栽培水稻）可以用于产生转基因植物。可以使用不同的水稻栽培品种（Hiei（比睿）等人，1994,Plant Journal（《植物杂志》）6:271-282；Dong（东）等人，1996,Molecular Breeding（《分子育种》）2:267-276；Hiei（比睿）等人，1997,Plant Molecular Biology（《植物分子生物学》），35:205-218）。下面提供了一个示例性方案。然而，本领域普通技术人员应理解在此描述的不同培养基组分可以在量上变化亦或可以被替代。作为一个示例性方案，通过在MS-CIM培养基（MS基础盐，4.3g/升；维生素B5（200X），5ml/升；蔗糖，30g/升；脯氨酸，500mg/升；谷氨酰胺，500mg/升；酪蛋白水解物，300mg/升；2,4-D（1mg/ml），2ml/升；用1N KOH调节pH到5.8；植物凝胶，3g/升）上进行培养而开始胚胎发生的响应和/或从成熟的胚中建立培养物。将在培养物响应的初始阶段的成熟胚亦或已建立的培养系进行接种并且与包含所希望的载体构建的根癌农杆菌菌株LBA4404（农杆菌属）进行共培养。在28℃下，将来自甘油储备的农杆菌在固体YPC培养基上（100mg/L大观霉素以及任何其他适当的抗生素）培养约2天。将农杆菌再悬浮于液体MS-CIM培养基中。将该农杆菌培养物稀释至OD₆₀₀为0.2-0.3，并且添加乙酰丁香酮直到最终浓度为200μM。在将该溶液与这些水稻培养物混合之前添加乙酰丁香酮以诱导农杆菌将DNA转移到植物细胞中。为了接种，将这些植物培养物浸入细菌悬浮液中。去除该液体细菌悬浮液并将接种过的培养物放在共培养培养基上并且在22℃下培养两天。然后将这些培养物转移到具有替卡西林（400mg/升）的MS-CIM培养基中以抑制农杆菌的生长。对于利用PMI选择标记基因的构建体（Reed（瑞德）等人，In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant（《体外细胞与发育生物学-植物》）37:127-132），可以在7天后将培养物转移到包含甘露糖作为碳水化合物来源的选择培养基（具有2%的甘露糖、300mg/升的替卡西林的MS）中，并且在黑暗中培养3-4周。然后将抗性菌落转移到再生诱导培养基（不具有2,4-D、0.5mg/升的IAA、1mg/升的玉米素、200mg/升的特美汀、2%的甘露糖以及3%的山梨糖醇的MS）中并且在黑暗中生长14天。然后将增殖中的菌落转移到另一轮的再生诱导培养基中并且移到光照生长室中。将再生的嫩枝转移到带有GA7-1培养基（不含激素以及2%的山梨糖醇的MS）的GA7容器中持续2周，并且然后在它们足够大并具有足够的根时将其移到温室中。将植物移栽到温室的土壤中（T₀代），生长至成熟，并且收获T₁代种子。

在一些实施例中，籼稻（亚洲栽培水稻品种籼稻）可以用于产生转基因植物。可以使用不同的籼稻栽培品种（Thodsaporn Pipatpanukul等人，Songklanakarin J.Sci.Technol.,(26)1,7,1-13（2004）；Joachim Wünn（约阿希姆伍尼）等人，Nature Biotechnology（《自然生物技术》）14,171-176（1996）；Ming-Tsair Chan（詹明才）等人Plant Cell Physiol.（《植物细胞生理学》）33(5):577-583（1992））。本领域普通技术人员应理解下面描述的不同培养基组分可以在量上变化亦或可以被替代。在一个示例性方案中，通过在愈伤组织诱导培养基（CIM培养基）（MS基础盐，4.3g/升；维生素B5（200X），5ml/升；蔗糖，20g/升；2,4-D（1mg/ml），2ml/升；用1N KOH调节pH到5.8；植物凝胶，7g/升）上进行培养而开始胚胎发生的响应和/或从成熟的种子中建立培养物。将培养物响应的初始阶段或已建立的培养系进行接种并且与例如包含所希望的载体构建的根癌农杆菌菌株EHA101（农杆菌属）进行共培养。可以将来自甘油储备的农杆菌在固体YPC培养基（100mg/L大观霉素以及任何其他适当的抗生素）上在28℃培养约两天，并且将农杆菌重新悬浮于液态MS-D2培养基中。将该农杆菌培养物稀释至OD₆₀₀为0.2-0.3，并且添加乙酰丁香酮直到最终浓度为400μM。在将该溶液与这些甘蔗培养物混合之前添加乙酰丁香酮以诱导农杆菌将DNA转移到植物细胞中。为了接种，将这些植物培养物浸入细菌悬浮液中。去除该液体细菌悬浮液并将接种过的培养物放置在共培养培养基上并且在22℃下、在黑暗中培养两天。然后将这些培养物转移到具有替卡西林（400mg/升）的MS-D2培养基中以抑制农杆菌的生长。对于利用PMI选择标记基因（例如，玉蜀黍优化PMI基因）的构建体（Reed（瑞德）等人，In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant（《体外细胞与发育生物学-植物》）37:127-132），可以将培养物转移到包含甘露糖作为碳水化合物来源的选择培养基（具有1%的甘露糖、400mg/升的替卡西林的MS）中，并且在黑暗中培养3-4周。然后将抗性菌落转移到再生诱导培养基（不具有2,4-D、2mg/L的IAA、玉米素、200mg/升的替卡西林、1%的甘露糖以及2g/升的植物凝胶的MS）中并且在黑暗中生长14天，并且然后移到光照生长室中，持续14天。将带根的再生嫩枝转移到带有维持培养基（不具有激素和2%蔗糖、200mg/升的替卡西林的MS）的GA-7中，持续3-4周，并且然后当它们足够大时移到温室中。将植物移栽到温室的土壤中（T₀代），并且生长至成熟。

作为另一个实例，甘蔗（甘蔗属）可以用于产生转基因植物。可以使用不同的甘蔗栽培品种（Ariel D.Arencibia（阿里尔D.阿伦西维亚）等人，Transgenic Research（《转基因研究》）7,213-222（1998）；Adrian Elliott（阿德里安·埃利奥特）等人，Aust.J.Plant Physiol.（《澳大利亚植物生理学杂志》）25,739-743（1998）；Z Wang（Z王）等人，J.AgriculturalBiotechnology（《农业生物技术杂志》）2002,10(3)237-240；S Zhang（S张）等人，J.Integrative Plant Biology（《植物学报》）2006,48(4):453-459；Basanayake（巴萨纳亚克）等人，Plant Cell Report（《植物细胞报告》）2011,30:439-448）。本领域普通技术人员应理解下面描述的不同培养基组分可以在量上变化亦或可以被替代。在一个示例性方案中，通过在SC-D2培养基（MS基础盐，4.3g/升；维生素B5（200X），5ml/升；蔗糖，30g/升；2,4-D（1mg/ml），2ml/升；用1N KOH调节pH到5.8；植物凝胶（Phytablend），7g/升）上进行培养而开始胚胎发生的响应和/或从甘蔗嫩叶中建立培养物。将在培养物响应的初始阶段的成熟胚或已建立的培养系进行接种并且与包含所希望的载体构建的根癌农杆菌菌株EHA101（农杆菌属）进行共培养。在28℃下，将来自甘油储备的农杆菌在固体YPC培养基上（100mg/L大观霉素以及任何其他适当的抗生素）培养约两天。将农杆菌再悬浮于液体MS-D2培养基中。将该农杆菌培养物稀释至OD₆₀₀为0.3-0.4，并且添加乙酰丁香酮直到最终浓度为400μM。在将该溶液与这些甘蔗培养物混合之前添加乙酰丁香酮以诱导农杆菌将DNA转移到植物细胞中。为了接种，将这些植物培养物浸入细菌悬浮液中。去除该液体细菌悬浮液并将接种的培养物放置用于共培养的空的平板上，然后在22℃下培养两天。然后将这些培养物转移到具有替卡西林（400mg/升）的SC-D2培养基中以抑制农杆菌的生长。对于利用PMI选择标记基因（例如，玉蜀黍优化PMI基因）的构建体（Reed（瑞德）等人,In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant（《体外细胞与发育生物学-植物》）37:127-132），可以将培养物转移到包含甘露糖作为碳水化合物来源的选择培养基（具有0.8%的甘露糖、400mg/升的替卡西林的MS）中，并且在黑暗中培养3-4周。然后将抗性菌落转移到再生诱导培养基（不具有2,4-D、2mg/L的BAP、200mg/升的替卡西林、0.6%的甘露糖的MS）中并且在黑暗中生长7天，并且然后移到光照生长室中，持续14天。将再生嫩枝转移到SC-根-M6-T培养基（不具有激素和0.6%蔗糖、200mg/升的替卡西林的MS）中，持续3-4周，并且然后当它们足够大并且具有足够的根时移到温室中。将植物移栽到温室的土壤中（T₀代），并且生长至成熟。

还参见De Lucca（德卢卡）等人的专利公开号WO/2010/151634，将其通过引用结合在此。

表达盒中的感兴趣的一个或多个核苷酸序列可以是任何一个或多个感兴趣的核苷酸序列并且可以是从原核生物或真核生物（例如，细菌、真菌、酵母、病毒、植物、哺乳动物）中获得的，或这一感兴趣的核苷酸序列可以全部地或部分地合成。此外，这一感兴趣的核苷酸序列可以对感兴趣的多肽进行编码，或者可以被转录以产生功能性RNA。在具体实施例中，可以将该功能性RNA进行表达以改进植物的农艺性状（例如，对干旱、热胁迫、高温、盐的耐受性，或对除草剂疾病、昆虫或其他有害生物[例如，苏云金芽孢杆菌内毒素]的耐受性，以及类似性状），以赋予雄性不育、以改进生育力和/或增强营养品质（例如，增强营养品质的酶）。感兴趣的多肽可以是由感兴趣的核苷酸序列编码的任何多肽。如本领域普通技术人员已知，该核苷酸序列可以进一步用于有义方向以达到对内源性植物基因的抑制（参见，例如，美国专利号5,283,184；5,034,323）。

这一感兴趣的核苷酸序列可以对一种多肽进行编码，该多肽赋予该植物令人希望的农艺性状（如上所描述）、赋予雄性不育、改进生育力和/或改进营养品质。其他适合的多肽包括可以降解有机污染物或去除重金属的酶类。此类植物以及可以自其分离的酶类在环境保护和整治的方法中是有用的。可替代地，异源核苷酸序列可以对治疗学上或药学上有用的多肽或工业多肽（例如，工业酶）进行编码。治疗多肽包括，但不局限于，抗体以及抗体片段、细胞因子、激素、生长因子、受体、酶类以及类似物。

适合与本发明一起使用的感兴趣的多肽（例如，将要以发育阶段特异性或组织特异性的方式进行表达）的额外的非限制性实例包括与营养素摄取（包括有机营养素和无机营养素的转运和同化）相关联的多肽。因此，例如，在氮转运和同化中涉及的多肽包括，但不局限于，亚硝酸盐转运蛋白（NiTR1基因）、高亲和力硝酸盐转运蛋白、硝酸盐和氯化物转运蛋白、硝酸盐还原酶、NADH-依赖性硝酸盐还原酶、寡肽和硝酸盐转运蛋白、铵转运蛋白（Osamt1.1；1.3；2.2；3.1；5.1）、硝酸盐转运蛋白（Atnrtl1）、共生铵转运蛋白、铵转运蛋白、NADH-依赖性谷氨酸合酶、硝酸盐转运蛋白、铵转运蛋白（Osamt1.1；5.2）、高亲和力硝酸盐转运蛋白（nar2.1）、gln4、gl5、硝酸盐转运蛋白（nrt1.1）、氨基酸转运蛋白、NADH-依赖性硝酸盐还原酶（nr1、nia1）、硝酸盐转运蛋白（nrt1-5）、铵转运蛋白（Osamt2.1；2.3；3.3）、高亲和力硝酸盐转运蛋白（nar2.1；nar2.2）、硝酸盐转运蛋白（甘氨酸最大nrt1.2）、铁氧还蛋白-依赖性谷氨酸合酶、高亲和力硝酸盐转运蛋白（nrt2.1）。

感兴趣的多肽的其他非限制性实例包括对昆虫、线虫以及病原性疾病的抗性中涉及的那些。此类多肽可以包括，但不局限于，硫代葡萄糖苷（防御食草动物），破坏寄生虫的细胞壁的几丁质酶或葡聚糖酶以及其他酶类，当植物受到伤害或者被微生物攻击时诱导的、或用化学方法例如通过水杨酸、茉莉酸或乙烯、或来自非植物来源的溶菌酶（例如，像T4-溶菌酶或来自多种哺乳动物的溶菌酶）诱导的植物抗性和应激反应的核糖体灭活蛋白（RIP）以及其他蛋白，杀昆虫蛋白（例如苏云金芽孢杆菌内毒素），a-淀粉酶抑制剂或蛋白酶抑制剂（豇豆胰蛋白酶抑制剂），凝集素（例如小麦胚芽凝集素），RNA酶或核酶。另外的非限制性实例包括对以下进行编码的核酸：哈茨木霉chit42内切几丁质酶（GenBank登陆号：S78423）或来自两色蜀黍的N-羟基化的、多功能细胞色素P-450（CYP79）蛋白（GenBank登陆号：U32624）、或这些的功能性等价物（例如来自豆类的几丁质酶（Brogue（布洛克）等人（1991）Science（《科学》）254：1194-1197）、“多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白”（PGIP）、甜蛋白（thaumatine）、转化酶以及抗微生物肽（例如乳铁蛋白（Lee（李）T J等人（2002）J Amer SocHorticult Sci（美国园艺科学会志）127(2):158-164））（参见，例如美国专利号8,071,749）；连同植物防御基因包括，但不局限于，PR1、BG2、PR5、以及NPR1（或NIM1）。

对本发明也有用的对植物激素生成或信号传递中涉及的多肽进行编码的核苷酸序列包括，但不局限于，植物生长激素、细胞分裂素、赤霉素、独角金内酯、乙烯、茉莉酸、以及油菜素内酯，连同调节或影响根和叶生长和发育的其他核苷酸和多肽序列。此类核苷酸和/或多肽序列的非限制性实例包括GA-缺乏-1（GA1；CPS），赤霉素20-氧化酶（GA20ox，GA5（以At计）），赤霉素2-β-双加氧酶（GA2ox），赤霉素3-氧化酶（GA3ox），GA-迟钝（GAI），GA调节的MYB(GAMYB），由ABA2控制的GCA2生长（GCA2），G-蛋白偶联受体（GCR1），糖基水解酶家族-45（GH45），色氨酸合酶α链（例如，GRMZM2G046163、GRMZM2G015892），植物生长激素结合蛋白1（ABP1），IAA-氨基酸水解酶ILR1（例如，GRMZM2G091540），磷酸核糖邻氨基苯甲酸（phosphoribosylanthranilate）转移酶，吲哚乙酸17/植物生长激素抗性3（IAA17、AXR3），吲哚乙酸3/短的下胚轴（IAA3、SHY2），IAA-赖氨酸合酶（iaaL），色氨酸单加氧酶（iaaM），IAA-天冬氨酸水解酶（IaaspH），IAA-葡萄糖合酶（IAGLU），吲哚乙酰胺水解酶（IAH），吲哚-3-乙醛氧化酶（IAO），IAA-修饰蛋白（IAP1），植物生长激素响应因子（ARF），植物生长激素上调小RNA（small auxin up RNA）（SAUR），由细胞分裂素6诱导的（等同于ARR5）（IBC6），由细胞分裂素7诱导的（等同于ARR4）（IBC7），在母株上萌发的-14（Vp14），PLA₂（Zhu（朱）J-K.Annual Review of Plant Biology（《植物生物学年鉴》）2002,53(1）：247-273），ATPLC2（Benschop（本斯霍普）等人Plant Physiology（《植物生理学》）2007,143(2）:1013-1023），纤维醇多磷酸酯5-磷酸酶（At5PTaseI），钙-依赖性蛋白激酶（CDPK），钙调神经磷酸酶B-样（CBL）钙传感蛋白CBL4/SOS3，CIPK-样蛋白1，ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸酯）合酶，ACC氧化酶，磷酸酶2C ABI1，TINY，玉米脂氧合酶7（GRMZM2G070092），丙二烯氧化物合酶（AOS）（例如，GRMZM2G033098和GRMZM2G376661），短链乙醇脱氢酶（ADH），雄花穗种子2（Tasselseed2）（Ts2），雄花穗种子1（Ts1），超级蜈蚣1（Supercentipede1）（Scn1/GDI1，例如，AT2G44100），RDH2（Carol（卡罗尔）等人Nature（《自然》）2005,438(7070):1013-1016.），G-信号蛋白（signaling protein），根毛的形态发生（MRH），AtAGC2-1（例如，At3g25250），纤维素合酶-样D3（CSLD3），木糖基转移酶2（例如，At4g02500、AtXX2），木葡聚糖内切反式转葡萄糖基酶/水解酶26（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase26）（例如，AtXTH26、At4g28850），木葡聚糖内切反式转葡萄糖基酶（xyloglucanendotransglycosylase），木葡聚糖半乳糖基转移酶（MUR3（例如，AT2G20370），ARP2/3（WURM/DISTORTED1）复合物，以及类萌蛋白（germin-like protein）（例如，AT5G39110）。

适合与本发明一起使用的其他核苷酸序列和多肽包括赋予“持绿”表型的那些（参见，Hortensteiner（豪特尼施泰纳），S.Trends in Plant Science（《植物科学发展趋势》）14:155-162（2009））。此类核苷酸序列的非限制性实例包括MtSGR、MsSGR（Zhou（周）等人Plant Physiol.（《植物生理学》）157：1483-1496（2011））、STAY-GREEN（《持绿》）（SGR或SGN）（Jiang（江）等人，Plant J（《植物学杂志》）52：197-209（2007））、Park（帕克）等人，Plant Cell（《植物细胞》）19：1649-1664（2007））、NONYELLOWING（《不黄化》）（NYE1）（Ren（任）等人，Plant Physiol（《植物生理学》）144：1429-1441（2007））、和/或GREEN-FLESH（GF）或CHLOROPHYLL RETAINER（《叶绿素保留物》）（CL）（Barry（巴里）等人，Plant Physiol（《植物生理学》）147：179-187（2008））。

对本发明也有用的是在灌浆中涉及的多核苷酸并且包括，但不局限于来自水稻的GIF1（籽粒不完全灌浆1）。

适合在植物中生产的感兴趣多肽的其他非限制性实例包括导致农艺学上重要性状的那些，这些性状例如是除草剂抗性（有时也称为“除草剂耐受性”）、病毒抗性、细菌性病原体抗性、昆虫抗性、线虫抗性、和/或真菌抗性。参见，例如，美国专利号5,569,823；5,304,730；5,495,071；6,329,504；和6,337,431。该多肽还可以是提高植物活力或产量（包括允许植物在不同的温度、土壤条件以及日光和沉淀水平下生长的性状）的性状、或是允许对展现感兴趣性状的植物进行鉴定的性状（例如，选择标记、种皮颜色、等）。不同的感兴趣的多肽，以及用于将这些多肽引入植物的方法描述于例如，美国专利号4,761,373；4,769,061；4,810,648；4,940,835；4,975,374；5,013,659；5,162,602；5,276,268；5,304,730；5,495,071；5,554,798；5,561,236；5,569,823；5,767,366；5,879,903；5,928,937；6,084,155；6,329,504与6,337,431；以及美国专利公开号2001/0016956。还参见互联网上lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/。

赋予对抑制生长点或分生组织的除草剂（例如咪唑啉酮或磺酰脲）的抗性/耐受性的核苷酸序列还可以适用于本发明的一些实施例中。对于突变ALS和AHAS酶在这一分类号中的示例性核苷酸序列如描述在例如在美国专利号5,767,366和5,928,937中。美国专利号4,761,373和5,013,659涉及抵抗咪唑啉酮类或磺酰胺除草剂的植物。美国专利号4,975,374涉及包含以下核酸的植物细胞和植物，所述核酸编码突变的谷氨酰胺合酶(GS)，所述突变的谷氨酰胺合酶抵抗已知抑制GS的除草剂（例如，草胺膦和甲硫氨酸磺基肟（methionine sulfoximine））的抑制作用。美国专利号5,162,602公开了抵抗环已二酮类除草剂和芳氧苯氧丙酸类除草剂的抑制作用的植物。这种抗性由改变的乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）赋予。

在本发明的实施例中，该核苷酸序列增加了植物、植物部分和/或植物细胞对热胁迫和/或高温的耐受性。该核苷酸序列可以编码导致对热胁迫和/或高温的增加的耐受性的多肽或抑制性多核苷酸（例如，功能性RNA）。适合的多肽包括但不局限于水胁迫多肽、ABA受体、以及脱水蛋白（例如，脱水素（ERD））。

在代表性实施例中，使用了编码以下多肽的核苷酸序列，这些多肽提供对水胁迫（例如，干旱）的耐受性。提供对水胁迫的耐受性的多肽的非限制性实例包括：在水穿过膜的运动中涉及的水通道蛋白；不同的渗透调节剂（例如，糖、脯氨酸、以及甘氨酸-甜菜碱）的生物合成所需的酶；保护大分子和膜的蛋白（例如，LEA蛋白、渗调蛋白（osmotin）、抗冻蛋白、分子伴侣以及mRNA结合蛋白）；用于蛋白更新（turnover）的蛋白酶（巯基蛋白酶、Clp蛋白酶以及泛素）；以及解毒酶（例如，谷胱甘肽S-转移酶、可溶性环氧化物水解酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶以及抗坏血酸过氧化物酶）。在响应水胁迫的信号转导和基因表达的调节中涉及的蛋白的非限制性实例包括蛋白激酶（MAPK、MAPKKK、S6K、CDPK、双组分His激酶、细菌类型的传感激酶以及SNF1）；转录因子（例如，MYC和bZIP）；磷脂酶C；以及14-3-3蛋白。

对脱落酸（ABA）受体/结合蛋白进行编码的核苷酸序列在本发明的实践中也是有用的。ABA结合蛋白/受体的非限制性实例包括：Mg-螯合酶H亚基；RNA-结合蛋白FCA；G-蛋白偶联受体GCR2；PYR1；PYL5；蛋白磷酸酶2C ABI1和ABI2；以及RCAR（ABA受体调节成分）家族蛋白。

在本发明的实施例中，这一感兴趣的核苷酸序列编码一种脱水蛋白，也被称为脱水素（例如，ERD）。脱水蛋白是已知响应脱水而在植物中累积的一组蛋白。实例包括来自小麦的WCOR410；来自桃的PCA60；来自无梗花栎的DHN3，来自拟南芥的COR47；来自欧洲油菜的Hsp90、BN59、BN115以及Bnerd10；来自小麦（Triticum aestivum）（面包小麦）的COR39和WCS19；以及来自芜菁（Brassica rapa）亚种Pekinensis的COR25。脱水蛋白的其他实例是ERD蛋白，它们包括但不局限于ERD1、ERD2、ERD4、ERD5、ERD6、ERD8、ERD10、ERD11、ERD13、ERD15以及ERD16。

赋予对草甘膦的抗性的、由核苷酸序列编码的多肽也适合与本发明一起使用。参见，例如，美国专利号4,940,835和美国专利号4,769,061。美国专利号5,554,798公开抗草甘膦的转基因玉米植物，所述抗性由改变的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸（EPSP）合酶基因赋予。适合用于赋予对除草剂草甘膦的耐受性的异源核苷酸序列还包括，但不局限于如美国专利号5,633,435中描述的农杆菌菌株CP4草甘膦抗EPSPS基因（aroA：CP4）或如美国专利号5,463,175中描述的草甘膦氧化还原酶基因（GOX）。其他异源核苷酸序列包括赋予对除草剂（特别是磺酰脲-类型的除草剂）抗性的基因，这些除草剂起作用以抑制乙酰乳酸合酶（ALS）的作用（例如，导致这样的抗性的乙酰乳酸合酶（ALS）的突变形式，特别是S4和/或Hra突变）；编码对除草剂抗性的基因（例如，bar基因），这些除草剂（例如草胺膦或巴斯塔（basta））起作用以抑制谷氨酰胺合酶的作用。bar基因编码对除草剂巴斯塔（basta）的抗性，nptII基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，并且ALS基因编码对除草剂氯磺隆的抗性。

编码对磷酰基化合物（例如草铵膦或草胺膦、以及吡啶氧丙酸或苯氧丙酸以及环己酮）的抗性的核苷酸序列也是适合的。参见，欧洲专利申请号0242246。还参见美国专利号5,879,903、5,276,268和5,561,236。

其他适合的感兴趣的核苷酸序列包括编码对抑制光合作用的除草剂（例如三嗪和苯基氰（腈水解酶））的抗性的那些。参见，美国专利号4,810,648。编码用于除草剂抗性的另外的适合的核苷酸序列包括编码对2,2-二氯丙酸、烯禾啶、吡氟氯禾灵、咪唑啉酮除草剂、硫酰脲除草剂、三唑并嘧啶除草剂、均三嗪除草剂以及溴草腈的抗性的那些。同样适合的是赋予对原卟啉原氧化酶的抗性或者提供增强的对植物疾病的抗性、增强的对不利环境条件（非生物胁迫）的耐受性（这些条件包括但不局限于干旱、热胁迫、高温、寒冷、极端的土壤盐度或极端的酸度或碱度）、以及在植物构型或发育中的改变（包括发育时间方面的变化）的核苷酸序列。参见，例如，美国专利公开号2001/0016956和美国专利号6,084,155。

在本发明中有用的杀昆虫蛋白可以按一个足以控制昆虫有害生物的量（即昆虫控制量）进行生产。应认识到，在植物中对控制昆虫有用的杀昆虫蛋白的产量可以变化，这取决于栽培品种、昆虫的类型、环境因素等。赋予昆虫耐受性的适合的异源核苷酸序列包括提供对有害生物（例如，根虫、切根虫、欧洲玉米螟等）的抗性的那些。示例性核苷酸序列包括，但不局限于，编码芽胞杆菌属生物中鉴定出的毒素的那些（参见，例如，WO99/31248；美国专利号5,689,052；5,500,365；5,880,275）；苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因（参见，例如，美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；6,555,655；6,541,448；6,538,109；Geiser（盖泽尔）等人（1986）Gene（《基因》）48:109）；以及凝集素（VanDamme（范达姆）等人（1994）Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）24:825）。已经克隆了编码来自几种亚种的苏云金芽孢杆菌(Baccillusthuringiensis)(Bt)毒素的核苷酸序列，并且已经发现重组克隆毒杀鳞翅类、双翅类和鞘翅类昆虫幼虫（例如，不同的δ-内毒素基因例如Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1Ea、Cry1Fa、Cry3A、Cry9A、Cry9C和Cry9B；以及编码植物性杀昆虫蛋白的基因例如Vip1、Vip2和Vip3）。Bt毒素的完整列表可以在互联网上由Sussex大学维护的Bacillus thuringiensis Toxin Nomenclature Database（苏云金芽孢杆菌毒素命名数据库）处找到(还参见Crickmore（克里克莫）等人，（1998）Microbiol.Mol.Biol.Rev.（《微生物学与分子生物学评论》）62:807-813)。

适合在植物中生产的多肽进一步包括改进或通过其他方式有助于收获的植物和/或植物部分转化成为一种商业上有用的产品（包括例如增加的或改变的碳水化合物含量和/或分布、改进的发酵特性、增加的油含量、增加的蛋白含量、改进的消化率、以及增加的营养成分含量（例如，增加的植物甾醇含量、增加的生育酚含量、增加的甾烷醇含量和/或增加的维生素含量））的那些多肽。感兴趣的多肽还包括，例如在一种收获的作物中导致或促成不需要的成分（例如植酸、或降解糖的酶类）的含量降低的那些多肽。“导致”或“有助于”是指这种感兴趣的多肽可以直接地或间接地有助于一种感兴趣的性状的存在（例如，通过一种异源纤维素酶的使用来增加纤维素的降解）。

在一个实施例中，感兴趣的多肽促成了改进的食品或饲料的可消化度。木聚糖酶是半纤维素分解酶，这些酶改进了植物细胞壁的分解，这导致动物更好地利用这些植物营养素。这导致了改进的生长率和饲料转化。而且，可以通过木聚糖酶降低包含木聚糖的饲料的粘度。在植物细胞内异源产生木聚糖酶也可以促进木质纤维素转化成工业用加工中的可发酵糖。

已经鉴定和表征了来自真菌微生物和细菌微生物的多个木聚糖酶（参见例如，美国专利号5,437,992；Coughlin（库格林）等人，（1993）“Proceedings of the Second TRICEL Symposium on Trichoderma reeseiCellulases and Other Hydrolases”（里氏木霉纤维素酶和其他水解酶的第二三醋酸纤维研讨会论文集），Espoo（埃斯波）；Souminen（索米宁）和Reinikainen（雷尼凯恩），编辑（1993）Foundation for Biotechnical andIndustrial Fermentation Research（生物技术和工业发酵研究基金会）8:125-135；美国专利公开号2005/0208178；以及PCT公开号WO03/16654））。具体而言，已经在里氏木霉(T.reesei)中鉴定到3种特异性木聚糖酶（XYL-I、XYL-II和XYL-III（Tenkanen（坦凯恩）等人，（1992）Enzyme Microb.Technol.（《酶与微生物技术》）14:566；Torronen（特罗恩）等人，（1992）Bio/Technology（《生物技术》）10:1461；和Xu（徐）等人，（1998）Appl.Microbiol.Biotechnol.（《应用微生物学与生物技术》）49:718）

在另一个实施例中，对于本发明有用的多肽可以是多糖降解酶。产生这种酶的植物可以对于产生例如生物加工用发酵原料是有用的。在某些实施例中、对于发酵过程有用的酶包括α淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环糊精糖基转移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶、颗粒淀粉水解酶或其他葡糖淀粉酶。

多糖降解酶包括：淀粉降解酶类，例如，α-淀粉酶类（EC3.2.1.1）、葡萄糖醛酸酶类（E.C.3.2.1.131）；外-1,4-α-D葡聚糖酶类，例如淀粉糖化酶类以及葡糖淀粉酶（EC3.2.1.3）、β-淀粉酶类（EC3.2.1.2）、α-糖苷酶类（EC3.2.1.20）、以及其他外-淀粉酶类；淀粉脱支酶类，例如a)异淀粉酶（EC3.2.1.68）、支链淀粉酶（EC3.2.1.41）、以及类似物；b)纤维素酶类，例如外-1,4-3-纤维素二糖水解酶（EC3.2.1.91）、外-1,3-β-D-葡聚糖酶（EC3.2.1.39）、β-糖苷酶（EC3.2.1.21）；c)L-阿拉伯糖酶类（arabinases），例如内-1,5-α-L-阿拉伯糖酶（EC3.2.1.99）、α-阿拉伯糖苷酶类（EC3.2.1.55）以及类似物；d)半乳聚糖酶类（galactanases），例如内-1,4-β-D-半乳聚糖酶（EC3.2.1.89）、内-1,3-β-D-半乳聚糖酶（EC3.2.1.90）、α-半乳糖苷酶（EC3.2.1.22）、β-半乳糖苷酶（EC3.2.1.23）以及类似物；e)甘露聚糖酶类（mannanases），例如内-1,4-β-D-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78）、β-甘露糖苷酶（EC3.2.1.25）、α-甘露糖苷酶（EC3.2.1.24）以及类似物；f)木聚糖酶类，例如内-1,4-β-木聚糖酶（EC3.2.1.8）、β-D-木糖苷酶(EC3.2.1.37）、1,3-β-D-木聚糖酶、以及类似物；以及g)其他酶类，例如α-L-岩藻糖苷酶（EC3.2.1.51）、α-L-鼠李糖苷酶（EC3.2.1.40）、果聚糖酶（EC3.2.1.65）、菊粉酶（EC3.2.1.7）、以及类似物。

可以与本发明一起使用的另外的酶包括蛋白酶，例如真菌和细菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括，但不局限于，从曲霉属（Aspergillus）、木霉属（Trichoderma）、毛霉属（Mucor）和根霉属（Rhizopus），例如黑曲霉（A.niger）、泡盛曲霉（A.awamori）、米曲霉（A.oryzae）和米黑毛霉（M.miehei）获得的那些。

其他有用的酶类包括，但不局限于：半纤维素酶类，例如甘露聚糖酶类以及阿拉伯呋喃糖酶类（EC 3.2.1.55）；木素酶类；脂肪酶类（例如，E.C.3.1.1.3）、葡萄糖氧化酶类、果胶酶类、木聚糖酶类、转葡萄糖苷酶类、α1,6葡糖苷酶（例如，E.C.3.2.1.20）；纤维二糖水解酶；酯酶例如阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73）以及乙酰基木聚糖酯酶（EC 3.1.1.72）；以及角质酶（例如，E.C.3.1.1.74）。

该核苷酸序列可以编码一种报告基因多肽（例如，酶），包括但不局限于，绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、编码β-葡萄糖醛酸酶的GUS基因、以及氯霉素乙酰转移酶。

适当时，这一感兴趣的核苷酸序列还可以被优化以用于例如通过使用植物偏好密码子在转化植物中的增加的表达。用于合成优化的核酸序列的方法在本领域是可获得的。这一感兴趣的核苷酸序列可以被优化用于在一个具体的宿主植物中表达或可替代地被修饰以用于在单子叶植物中的优化表达。参见，例如，EP 0 359 472，EP 0 385 962，WO 91/16432；Perlak（拉克）等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国科学院院刊》）88,3324（1991），以及Murray（默里）等人，Nuc.Acids Res（《核酸研究》）.17,477（1989）、等。可以从在那个植物中表达的蛋白中具有最高频率的密码子中确定植物偏好密码子。

已知用于增强细胞宿主中的基因表达的额外的序列修饰。这些包括编码假多腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列的消除，以及可能对基因表达有害的其他这样的被良好表征的序列的消除。可以将该序列的G-C含量调整至对于给定的细胞宿主的平均水平，如通过参考在该宿主细胞中表达的已知基因所计算的。可能时，对该序列进行修饰以避免预言的发夹二级mRNA结构。

本发明的一些方面在下面所提供的实例中进行了更加详细地例证。

实例

实例1：PMI基因的转变

通过结合玉米偏好密码子对由大肠杆菌manA基因编码的甘露糖-6-磷酸异构酶（PMI）蛋白进行修饰，该大肠杆菌manA基因被描述于Negrotto（内格罗托）等人Plant Cell Reports（《植物细胞报告》）19:798-803（2000）（下面提供的编码序列为SEQ ID NO:1）。

大肠杆菌PMI（1176bp）（SEQ ID NO:1）

atgcaaaaactcattaactcagtgcaaaactatgcctggggcagcaaaacggcgttgactgaactttatggtatggaaaatccgtccagccagccgatggccgagctgtggatgggcgcacatccgaaaagcagttcacgagtgcagaatgccgccggagatatcgtttcactgcgtgatgtgattgagagtgataaatcgactctgctcggagaggccgttgccaaacgctttggcgaactgcctttcctgttcaaagtattatgcgcagcacagccactctccattcaggttcatccaaacaaacacaattctgaaatcggttttgccaaagaaaatgccgcaggtatcccgatggatgccgccgagcgtaactataaagatcctaaccacaagccggagctggtttttgcgctgacgcctttccttgcgatgaacgcgtttcgtgaattttccgagattgtctccctactccagccggtcgcaggtgcacatccggcgattgctcactttttacaacagcctgatgccgaacgtttaagcgaactgttcgccagcctgttgaatatgcagggtgaagaaaaatcccgcgcgctggcgattttaaaatcggccctcgatagccagcagggtgaaccgtggcaaacgattcgtttaatttctgaattttacccggaagacagcggtctgttctccccgctattgctgaatgtggtgaaattgaaccctggcgaagcgatgttcctgttcgctgaaacaccgcacgcttacctgcaaggcgtggcgctggaagtgatggcaaactccgataacgtgctgcgtgcgggtctgacgcctaaatacattgatattccggaactggttgccaatgtgaaattcgaagccaaaccggctaaccagttgttgacccagccggtgaaacaaggtgcagaactggacttcccgattccagtggatgattttgccttctcgctgcatgaccttagtgataaagaaaccaccattagccagcagagtgccgccattttgttctgcgtcgaaggcgatgcaacgttgtggaaaggttctcagcagttacagcttaaaccgggtgaatcagcgtttattgccgccaacgaatcaccggtgactgtcaaaggccacggccgtttagcgcgtgtttacaacaagctgtaa

通过使用Koziel（科齐埃尔）等人的美国专利号6,075,185中概述的密码子对PMI蛋白序列进行手动反向翻译获得了具有玉米偏好密码子的PMI编码合成DNA序列（以下“SynZmPMI”，SEQ ID NO:2）。确切地，使用以下密码子：Ala，GCC；Arg，CGC；Asn，AAC；Asp，GAC；Cys，TGC；Gln，CAG；Glu，GAG；Gly，GGC；His，CAC；Ilc，ATC；Leu，CTG；Lys，AAG；Met，ATG；Phe，TTC；Pro，CCC；Ser，AGC；Thr，ACC；Trp，TGG；Tyr，TAC；以及Val，GTG。在SynZmPMI基因的ATG起始密码子的上游立即添加Kozak序列（5’-GGCAGCAGCC-3’）。在终止密码子TGA后添加一个额外的终止密码子（TAG）。还向Kozak-SynZmPMI序列的5’-端和3’-端添加两个限制性酶切位点（BamHI和SacI），作为便于DNA操作的克隆位点。最终版本长1179bp。

SEQ ID NO:2SynZmPMI

5’ATGCAGAAGCTGATCAACAGCGTGCAGAACTACGCCTGGGGCAGCAAGACCGCCCTGACCGAGCTGTACGGCATGGAGAACCCCAGCAGCCAGCCCATGGCCGAGCTGTGGATGGGCGCCCACCCCAAGAGCAGCAGCCGCGTGCAGAACGCCGCCGGCGACATCGTGAGCCTGCGCGACGTGATCGAGAGCGACAAGAGCACCCTGCTGGGCGAGGCCGTGGCCAAGCGCTTCGGCGAGCTGCCCTTCCTGTTCAAGGTGCTGTGCGCCGCCCAGCCCCTGAGCATCCAGGTGCACCCCAACAAGCACAACAGCGAGATCGGCTTCGCCAAGGAGAACGCCGCCGGCATCCCCATGGACGCCGCCGAGCGCAACTACAAGGACCCCAACCACAAGCCCGAGCTGGTGTTCGCCCTGACCCCCTTCCTGGCCATGAACGCCTTCCGCGAGTTCAGCGAGATCGTGAGCCTGCTGCAGCCCGTGGCCGGCGCCCACCCCGCCATCGCCCACTTCCTGCAGCAGCCCGACGCCGAGCGCCTGAGCGAGCTGTTCGCCAGCCTGCTGAACATGCAGGGCGAGGAGAAGAGCCGCGCCCTGGCCATCCTGAAGAGCGCCCTGGACAGCCAGCAGGGCGAGCCCTGGCAGACCATCCGCCTGATCAGCGAGTTCTACCCCGAGGACAGCGGCCTGTTCAGCCCCCTGCTGCTGAACGTGGTGAAGCTGAACCCCGGCGAGGCCATGTTCCTGTTCGCCGAGACCCCCCACGCCTACCTGCAGGGCGTGGCCCTGGAGGTGATGGCCAACAGCGACAACGTGCTGCGCGCCGGCCTGACCCCCAAGTACATCGACATCCCCGAGCTGGTGGCCAACGTGAAGTTCGAGGCCAAGCCCGCCAACCAGCTGCTGACCCAGCCCGTGAAGCAGGGCGCCGAGCTGGACTTCCCCATCCCCGTGGACGACTTCGCCTTCAGCCTGCACGACCTGAGCGACAAGGAGACCACCATCAGCCAGCAGAGCGCCGCCATCCTGTTCTGCGTGGAGGGCGACGCCACCCTGTGGAAGGGCAGCCAGCAGCTGCAGCTGAAGCCCGGCGAGAGCGCCTTCATCGCCGCCAACGAGAGCCCCGTGACCGTGAAGGGCCACGGCCGCCTGGCCCGCGTGTACAACAAGCTGTGATAG-3’

尽管转化的DNA序列示出与天然序列76%的一致性，但是由转化的PMI基因编码的氨基酸序列保持和原始大肠杆菌版本（SEQ ID NO:3）相同。

大肠杆菌PMI氨基酸序列（SEQ ID NO:3）

MQKLINSVQNYAWGSKTALTELYGMENPSSQPMAELWMGAHPKSSSRVQNAAGDIVSLRDVIESDKSTLLGEAVAKRFGELPFLFKVLCAAQPLSIQVHPNKHNSEIGFAKENAAGIPMDAAERNYKDPNHKPELVFALTPFLAMNAFREFSEIVSLLQPVAGAHPAIAHFLQQPDAERLSELFASLLNMQGEEKSRALAILKSALDSQQGEPWQTIRLISEFYPEDSGLFSPLLLNVVKLNPGEAMFLFAETPHAYLQGVALEVMANSDNVLRAGLTPKYIDIPELVANVKFEAKPANQLLTQPVKQGAELDFPIPVDDFAFSLHDLSDKETTISQQSAAILFCVEGDATLWKGSQQLQLKPGESAFIAANESPVTVKGHGRLARVYNKL

合成BamHI-Kozak-SynZmPMI-SacI序列并且将其克隆进一个质粒载体中以形成pCR4SynPMI。使用HindIII/BamHI消化将ZmUbi启动子从pNOV2117上切下（参见Lanahan（拉纳汉）等人的美国专利号6,531,648），使用BamHI/SacI消化将合成PMI基因从pCR4SynPMI上切下，并且将这些片段通过三元连接（three-way ligation）而连接至用HindIII/SacI消化的pNOV2804以形成一个表达盒（SEQ ID NO:4）。

prZmUbi-10→cPMI-09→tNOS-05-01（SEQ ID NO:4）

ctgcagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagtactacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattgagtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctcctttttttttgcaaatagcttcacctatataatacttcatccattttattagtacatccatttagggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctattttattctattttagcctctaaattaagaaaactaaaactctattttagtttttttatttaataatttagatataaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaaaactaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgttaaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcgtcgggccaagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccgctccaccgttggacttgctccgctgtcggcatccagaaattgcgtggcggagcggcagacgtgagccggcacggcaggcggcctcctcctcctctcacggcaccggcagctacgggggattcctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccctccacaccctctttccccaacctcgtgttgttcggagcgcacacacacacaaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaaggtacgccgctcgtcctccccccccccccctctctaccttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgattttttttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaattctgtttcaaactacctggtggatttattaattttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagttacgaattgaagatgatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgcgggttttactgatgcatatacagagatgctttttgttcgcttggttgtgatgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgtgtcatacatcttcatagttacgagtttaagatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatatacatgatggcatatgcagcatctattcatatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttataattattttgatcttgatatacttggatgatggcatatgcagcagctatatgtggatttttttagccctgccttcatacgctatttatttgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccctgttgtttggtgttacttctgcagggatccggcagcagccatgcagaagctgatcaacagcgtgcagaactacgcctggggcagcaagaccgccctgaccgagctgtacggcatggagaaccccagcagccagcccatggccgagctgtggatgggcgcccaccccaagagcagcagccgcgtgcagaacgccgccggcgacatcgtgagcctgcgcgacgtgatcgagagcgacaagagcaccctgctgggcgaggccgtggccaagcgcttcggcgagctgcccttcctgttcaaggtgctgtgcgccgcccagcccctgagcatccaggtgcaccccaacaagcacaacagcgagatcggcttcgccaaggagaacgccgccggcatccccatggacgccgccgagcgcaactacaaggaccccaaccacaagcccgagctggtgttcgccctgacccccttcctggccatgaacgccttccgcgagttcagcgagatcgtgagcctgctgcagcccgtggccggcgcccaccccgccatcgcccacttcctgcagcagcccgacgccgagcgcctgagcgagctgttcgccagcctgctgaacatgcagggcgaggagaagagccgcgccctggccatcctgaagagcgccctggacagccagcagggcgagccctggcagaccatccgcctgatcagcgagttctaccccgaggacagcggcctgttcagccccctgctgctgaacgtggtgaagctgaaccccggcgaggccatgttcctgttcgccgagaccccccacgcctacctgcagggcgtggccctggaggtgatggccaacagcgacaacgtgctgcgcgccggcctgacccccaagtacatcgacatccccgagctggtggccaacgtgaagttcgaggccaagcccgccaaccagctgctgacccagcccgtgaagcagggcgccgagctggacttccccatccccgtggacgacttcgccttcagcctgcacgacctgagcgacaaggagaccaccatcagccagcagagcgccgccatcctgttctgcgtggagggcgacgccaccctgtggaagggcagccagcagctgcagctgaagcccggcgagagcgccttcatcgccgccaacgagagccccgtgaccgtgaagggccacggccgcctggcccgcgtgtacaacaagctgtgataggagctctagatccccgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatc

实例2：用转化的PMI基因对单子叶植物的转化

将玉米密码子优化版本的PMI选择标记基因与在玉米、水稻（籼稻和粳稻）、以及甘蔗的转化中的原始细菌PMI基因进行比较。在玉米或在粳稻中没有看到明显的转化效率的增加。

然而，对于农杆菌介导的甘蔗和籼稻的转化而言，转化效率被玉米密码子优化版本的PMI选择标记基因改进。这是出人意料的，因为在甘蔗中，细菌基因作为选择标记已经非常具有功能性，并且当与基因枪介导的转化相比时，没有看到显著差异。在水稻中，在粳稻中没有看到这种改进，但是在籼稻栽培品种上看到了改进。

I.玉米转化

用包括Kozak序列的合成（玉米优化）PMI基因（Koz-syn PMI），并且针对具有Kozak序列的天然PMI基因（Koz-天然PMI）以及不具有Kozak序列的天然PMI基因（pNOV2117-天然PMI）进行了三个独立的玉米转化实验。

通过农杆菌介导的转化近交玉米（玉蜀黍）系A188来产生转基因玉米事件。转化基本上是如描述于Negrotto（内格罗托）等人（Plant CellReports（《植物细胞报告》）19:798-803,2000）中的完成的，通过引用结合在此。从8-12天的耳穗上切下未成熟胚并用新鲜的培养基冲洗，为转化作准备。将胚与容纳转化载体的农杆菌属细胞的悬浮液混合，涡旋30秒，并且允许额外孵育5分钟。抽吸过量的农杆菌属溶液，然后将胚移至包含非选择性培养基的平板上。将胚在22℃、黑暗条件下与剩余的农杆菌属共培养2-3天。将胚被转移至补充有替卡西林（100mg/ml）和硝酸银（1.6mg/1）的培养基中，并且在黑暗条件下孵育10天。将产生胚性愈伤组织的胚转移至包含甘露糖的选择培养基中。

通过分析测试再生的小植株，用于测试天然PMI基因或玉米优化PMI基因的存在、连同抗生素抗性大观霉素（spec）基因的缺乏。将对两种转基因阳性并且对spec基因阴性的植物转移至温室中用于进一步繁殖。

在所有实验中，Koz-天然PMI构建体和Koz-synPMI构建体给出了比不具有Kozak序列的天然PMI更高的转化频率（表1）。PMI的密码子的玉米优化看起来不影响转化频率。

表1

质粒	使用的胚的数目	转化频率*
			pNOV2117-天然PMI	99	29.3
Koz-天然PMI	89	62.9
			Koz-syn PMI	92	55.4

^*转化中使用的胚的百分比。

向天然的或合成的（玉米优化的）PMI基因序列的Kozak序列的添加提供了在转化效率上的增加。

通过确定在转化的玉米植物中的PMI mRNA和蛋白的水平来分析的PMI表达。这个分析的结果表明mRNA水平平行于蛋白水平，其中天然PMI和Kozak-天然PMI约相同，并且Kozak-synPMI显著更高（在玉米叶中的蛋白上6.7倍增加）（表2）。

表2

N=被分析事件的数目

该数据没有提供关于以下的深刻理解：为什么改变的密码子使用会导致在稳定状态的转录和蛋白水平上的增加，或为什么即使其PMI蛋白水平约相同，但是Kozak-天然PMI构建体的转化频率比不具有Kozak的天然PMI的转化频率一致更高。此外，该数据没有表明当在转录和蛋白水平上存在差异时，为什么Kozak-天然PMI与Kozak-synPMI之间的转化频率没有不同。

为了在玉米生产中使用，具有低拷贝数目的、没有载体主链DNA存在的转化基因的植物是令人希望的。因此，确定转化事件的总数目，以及低拷贝数目、无主链事件的数目。在表3中呈现了这个分析的结果。这些结果表明具有低拷贝数目的PMI基因以及不具有载体主链的植物是可以容易地获得的。

表3

^*转化中使用的胚的百分比。

然而，再次地，当与天然PMI相比时，使用玉米优化PMI的转化频率没有明显增加。

II.水稻转化

为了确定在其他单子叶植物中是否存在类似倾向，用包括Kozak序列的合成PMI基因（Koz-synPMI），并且针对具有Kozak序列的天然PMI基因（Koz-天然PMI）以及不具有Kozak序列的天然PMI基因（pNOV2117-天然PMI）进行了水稻转化实验。

通过在MS-CIM培养基（MS基础盐，4.3g/升；维生素B5（200X），5ml/升；蔗糖，30g/升；脯氨酸，500mg/升；谷氨酰胺，500mg/升；酪蛋白水解物，300mg/升；2,4-D（1mg/ml），2ml/升；用1N KOH调节pH到5.8；植物凝胶，3g/升）上进行培养而开始胚胎发生的响应和/或从成熟的胚建立培养物。将在培养物响应的初始阶段的成熟胚或已建立的培养系进行接种并且与包含所希望的载体构建的根癌农杆菌菌株LBA4404（农杆菌属）进行共培养。在28℃下，将来自甘油储备的农杆菌在固体YPC培养基上（100mg/L大观霉素以及任何其他适当的抗生素）培养约2天。将农杆菌再悬浮于液体MS-CIM培养基中。将该农杆菌培养物稀释至OD₆₀₀为0.2-0.3，并且添加乙酰丁香酮直到最终浓度为200uM。在将该溶液与这些水稻培养物混合之前添加乙酰丁香酮以诱导农杆菌将DNA转移到植物细胞中。为了接种，将这些植物培养物浸入细菌悬浮液中。去除该液体细菌悬浮液并将接种过的培养物放在共培养培养基上并且在22℃下培养两天。然后将这些培养物转移到具有替卡西林（400mg/升）的MS-CIM培养基中以抑制农杆菌的生长。

7天后将培养物转移到包含甘露糖作为碳水化合物来源的选择培养基（具有2%的甘露糖、300mg/升的替卡西林的MS）中，并且在黑暗中培养3-4周。然后将抗性菌落转移到再生诱导培养基（不具有2,4-D、0.5mg/升的IAA、1mg/升的玉米素、200mg/升的特美汀、2%的甘露糖以及3%的山梨糖醇的MS）中并且在黑暗中生长14天。然后将增殖中的菌落转移到另一轮的再生诱导培养基中并且移到光照生长室中。将再生的嫩枝转移到带有GA7-1培养基（不含激素以及2%的山梨糖醇的MS）的GA7容器中持续2周，并且然后在它们足够大并具有足够的根时将其移到温室中。将植物移栽到温室的土壤中（T₀代）生长至成熟，并且收获T₁代种子。

当分析粳稻的转化频率时，Kozak序列或密码子优化对转化频率没有可检出的影响（表4）。

表4

^*来自2个独立实验的值。

然而，这些蛋白水平示出与在玉米中相同的倾向，天然PMI和Kozak-天然PMI相对低，并且与Kozak-天然PMI相比，Kozak-synPMI序列提供了在水稻的叶中的PMI蛋白上的13.1倍的增加（表5）。

表5

质粒	使用的胚的数目	平均ng PMI/mg可溶性蛋白*
			pNOV2117，天然PMI	80	7.9
12384，Koz-天然PMI	55	2.8
			12385，Koz-synPMI	49	36.6

^*来自2个独立转化实验的值。

在类似实验中，使用农杆菌菌株LBA4404和EHA101对籼稻（品种IR68897B）进行了转化。简而言之，通过在愈伤组织诱导培养基（CIM培养基）（MS基础盐，4.3g/升；维生素B5（200X），5ml/升；蔗糖，20g/升；2,4-D（1mg/ml），2ml/升；用1N KOH调节pH到5.8；植物凝胶，7g/升）上进行培养而开始胚胎发生的响应和/或从成熟的种子中建立培养物。将培养物响应的初始阶段或已建立的培养系进行接种并且与包含所希望的载体构建的根癌农杆菌菌株EHA101（农杆菌属）进行共培养。在28℃下，将来自甘油储备的农杆菌在固体YPC培养基上（100mg/L大观霉素以及任何其他适当的抗生素）培养约两天。将农杆菌再悬浮于液体MS-D2培养基中。将该农杆菌培养物稀释至OD₆₀₀为0.2-0.3，并且添加乙酰丁香酮直到最终浓度为400uM。在将该溶液与这些甘蔗培养物混合之前添加乙酰丁香酮以诱导农杆菌将DNA转移到植物细胞中。为了接种，将这些植物培养物浸入细菌悬浮液中。去除该液体细菌悬浮液并将接种过的培养物放置在共培养培养基上并且在22℃下、在黑暗中培养两天。然后将这些培养物转移到具有替卡西林（400mg/升）的MS-D2培养基中以抑制农杆菌的生长。对于利用PMI选择标记基因或玉蜀黍优化PMI基因的构建体（Reed（瑞德）等人，In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant（《体外细胞与发育生物学-植物》）37:127-132），可以将培养物转移到包含甘露糖作为碳水化合物来源的选择培养基（具有1%的甘露糖、400mg/升的替卡西林的MS）中，并且在黑暗中培养3-4周。然后将抗性菌落转移到再生诱导培养基（不具有2,4-D、2mg/L的IAA、玉米素、200mg/升的替卡西林、1%的甘露糖以及2g/升的植物凝胶的MS）中并且在黑暗中生长14天，并且然后移到光照生长室中，持续14天。将带根的再生嫩枝转移到带有维持培养基（不具有激素和2%蔗糖、200mg/升的替卡西林的MS）的GA-7中，持续3-4周，并且然后当它们足够大时移到温室中。将植物移栽到温室的土壤中（T₀代），并且生长至成熟。

这些结果表明独立于采用的农杆菌菌株，Kozak-synPMI具有超过Kozak-天然PMI的转化频率的转化频率（表6）。因此，用合成PMI改进了籼稻的转化频率。

表6

结果是个独立实验的平均值。

^*转化中使用的胚的百分比。

^a基于转基因嫩枝的转化频率。

^b基于转基因愈伤组织的转化频率。

III.甘蔗转化

还研究了用玉米优化PMI选择标记对甘蔗的转化。

通过在SC-D2培养基（MS基础盐，4.3g/升；维生素B5（200X），5ml/升；蔗糖，30g/升；2,4-D（1mg/ml），2ml/升；用1N KOH调节pH到5.8；植物凝胶（Phytablend），7g/升）上进行培养而开始胚胎发生的响应和/或从甘蔗嫩叶中建立培养物。将在培养物响应的初始阶段的成熟胚或已建立的培养系进行接种并且与包含所希望的载体构建的根癌农杆菌菌株EHA101（农杆菌属）进行共培养。在28℃下，将来自甘油储备的农杆菌在固体YPC培养基上（100mg/L大观霉素以及任何其他适当的抗生素）培养约两天。将农杆菌再悬浮于液体MS-D2培养基中。将该农杆菌培养物稀释至OD₆₀₀为0.3-0.4，并且添加乙酰丁香酮直到最终浓度为400uM。在将该溶液与这些甘蔗培养物混合之前添加乙酰丁香酮以诱导农杆菌将DNA转移到植物细胞中。为了接种，将这些植物培养物浸入细菌悬浮液中。去除该液体细菌悬浮液并将接种的培养物放置用于共培养的空板上，然后在22℃下培养两天。然后将这些培养物转移到具有替卡西林（400mg/升）的SC-D2培养基中以抑制农杆菌的生长。

将培养物转移到包含甘露糖作为碳水化合物来源的选择培养基（具有0.8%的甘露糖、400mg/升的替卡西林的MS）中，并且在黑暗中培养3-4周。然后将抗性菌落转移到再生诱导培养基（不具有2,4-D、2mg/L的BAP、200mg/升的替卡西林、0.6%的甘露糖的MS）中并且在黑暗中生长7天，并且然后移到光照生长室中，持续14天。将再生嫩枝转移到SC-根-M6-T培养基（不具有激素和0.6%蔗糖、200mg/升的替卡西林的MS）中，持续3-4周，并且然后当它们足够大并且具有足够的根时移到温室中。将植物移栽到温室的土壤中（T₀代），并且生长至成熟。

还用包括Kozak序列的合成PMI基因（Koz-synPMI）并且针对具有Kozak序列的天然PMI基因（Koz-天然PMI）进行了两个独立的甘蔗转化实验。在第一个实验中，对转化频率进行了分析。这个实验的结果表明密码子优化PMI基因改进了甘蔗的转化频率（表7）。

表7

在第二个实验中，确定了用具有Kozak序列的合成PMI基因和天然PMI基因进行转化的愈伤组织的转化频率。如由表达愈伤组织系的氰基荧光蛋白（CFP）的数目所确定的，这个实验的结果表明转化频率被密码子优化PMI基因改进（表8）。

表8

构建体	外植体（g）	CFP愈伤组织系
			Koz-天然PMI	10	33
Koz-synPMI	10	92

随后确定了转基因植物的再生。休眠期（即，恢复期）之后，将外植体转移到选择培养基中并且然后在28℃、在黑暗中培养3周。然后将愈伤组织继代培养到再生培养基中，并且在光照/黑暗周期下额外培养3周。这个分析的结果表明用包括Kozak序列的天然PMI基因进行转化的愈伤组织中25%-30%再生出了嫩枝，然而用包括Kozak序列的优化PMI基因进行转化的愈伤组织中50%-80%再生出了嫩枝。

为了阐述最初的分析，用Koz-syn PMI构建体（6个实验）和Koz-天然PMI构建体（5个实验）进行了额外的转化实验。表9呈现了这个分析的结果，并且这些结果进一步证明在甘蔗栽培品种L-97-128中，密码子优化PMI基因比天然PMI基因产生了2倍至3倍更多的转化事件。

表9

Koz-天然PMI构建体产生了总共330个

阳性事件，具有2.96事件每克组织的平均转化频率。Koz-syn PMI构建体产生了总共898个

阳性事件，具有11.82事件每克组织的平均转化频率。因此，在甘蔗中，使用作为用于甘蔗转化的选择标记的玉米优化PMI构建体产生了超过天然PMI构建体4倍的优势。

蛋白分析表明了与在玉米中相同的倾向，其中在叶中的PMI表达是20倍更高（表10）。

表10

^*大的标准差归因于从约2至大于100ng PMI/mg的总蛋白的蛋白浓度的变化。

尽管已经为了清晰性和理解的目的通过解释和实例详细地描述了以上发明，但是本领域普通技术人员应该清楚的是在所附权利要求的范围内可以实践某些改变和修饰。

Claims (47)

1.一种用于增加单子叶植物组织的转化频率的方法，该方法包括：

向所述植物组织的细胞中引入一个异源核酸，该异源核酸包括一个具有一个或多个玉米优化密码子的编码区，其中所述编码区对一种磷酸甘露糖异构酶（PMI）蛋白进行编码，由此产生一种包括该核酸的转化细胞；

由此与在所述核酸的所述编码区中不具有玉米优化密码子的转化频率相比，所述单子叶植物组织的所述转化频率增加。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述引入步骤是通过农杆菌介导的转化进行的。

3.如权利要求2所述的方法，其中与在所述核酸的所述编码区中不具有玉米优化密码子的转化频率相比，所述单子叶植物组织具有1倍、2倍、或3倍更大的转化频率。

4.如权利要求2或权利要求3所述的方法，其中与在所述核酸的所述编码区中具有玉米优化密码子的转化频率相比，通过农杆菌介导的转化的、不具有玉米优化密码子的所述单子叶植物组织具有小于约20%、15%、10%、或5%的转化频率。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述单子叶植物组织是玉米、水稻、小麦或大麦组织。

6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述单子叶植物组织是甘蔗的组织。

7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述单子叶植物组织是一种水稻的籼稻品种。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述PMI蛋白具有SEQID NO:3的氨基酸序列或具有一个与其有90%一致性的氨基酸序列。

9.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述PMI蛋白具有SEQID NO:3的氨基酸序列或具有一个与其有95%一致性的氨基酸序列。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述编码区包括至少500个、700个、或1000个具有SEQ ID NO:2的连续核苷酸。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述异源核酸进一步包括一个感兴趣的核苷酸序列。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述编码区具有50个或更多个玉米优化密码子。

13.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述编码区具有100个或更多个玉米优化密码子。

14.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述编码区具有150个或更多个玉米优化密码子。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述编码区包括SEQID NO:2或一个具有与SEQ ID NO:2至少95%序列一致性的核苷酸序列。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，进一步包括：选择一个包括这一转化的细胞的丛生嫩枝培养株；使该丛生嫩枝培养株在促进嫩枝伸长的条件下生长以产生至少一个转化嫩枝；并且使该至少一个转化嫩枝生长。

17.通过如权利要求16所述的方法产生的转化丛生嫩枝培养株，一个植物自其再生，或其一个子代。

18.使用磷酸甘露糖异构酶（PMI）蛋白作为选择性标记来转化甘蔗的一种方法，所述方法包括：

(a)向所述植物组织的一个细胞中引入一个异源核酸，该异源核酸包括一个磷酸甘露糖异构酶（PMI）蛋白编码区，所述PMI编码区具有一个或多个玉米优化密码子，以由此产生一个包括该核酸的转化细胞，其中所述引入步骤是通过农杆菌介导的转化进行的；以及

(b)在选择性针对PMI蛋白表达的条件下，从这一转化的细胞中再生一个转化植物；

以产生所述转化甘蔗。

19.如权利要求18所述的方法，其中与具有包括一个包含SEQ ID NO:1的核酸的表达盒的转化相比，所述甘蔗具有1倍、2倍、或3倍更大的转化频率。

20.如权利要求18或权利要求19所述的方法，其中所述PMI蛋白具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或具有一个与其有90%一致性的氨基酸序列。

21.如权利要求18或权利要求19所述的方法，其中所述PMI蛋白具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或具有一个与其有95%一致性的氨基酸序列。

22.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述编码区包括至少500个、700个、或1000个具有SEQ ID NO:2的核酸序列的连续核苷酸。

23.如权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述异源核酸进一步包括一个感兴趣的核苷酸序列。

24.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述编码区具有50个或更多个玉米优化密码子。

25.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述编码区具有100个或更多个玉米优化密码子。

26.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述编码区具有150个或更多个玉米优化密码子。

27.如权利要求18-26中任一项所述的方法，其中所述编码区包括SEQID NO:2或一个具有与SEQ ID NO:2至少95%序列一致性的核苷酸序列。

28.如权利要求18-27中任一项所述的方法，其中该再生步骤包括：选择一个包括转化细胞的丛生嫩枝培养株；使该丛生嫩枝培养株在促进嫩枝伸长的条件下生长以产生至少一个转化嫩枝；并且使该至少一个转化嫩枝生长。

29.通过如权利要求28所述的方法产生的转化丛生嫩枝培养株，一个甘蔗植物自其再生，或其一个子代。

30.一个包括核酸序列的重组载体，所述核酸序列或其补体包括一个对以下进行编码的编码区：

(a)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；或

(b)一个与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列有至少90%一致性的氨基酸序列，并且对磷酸甘露糖异构酶（PMI）蛋白进行编码，

其中所述编码区包括一个或多个玉米优化密码子。

31.如权利要求30所述的载体，其中所述编码区对具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或一个与其有95%一致性的氨基酸序列进行编码。

32.如权利要求30或权利要求31所述的载体，其中所述核苷酸序列包括至少500个、700个、或1000个具有SEQ ID NO:2的核酸序列的连续核苷酸。

33.如权利要求30-32中任一项所述的载体，其中所述编码区具有50个或更多个玉米优化密码子。

34.如权利要求30-32中任一项所述的载体，其中所述编码区具有100个或更多个玉米优化密码子。

35.如权利要求30-32中任一项所述的载体，其中所述编码区具有150个或更多个玉米优化密码子。

36.如权利要求30-35中任一项所述的载体，其中所述编码区包括SEQID NO:2或一个具有与SEQ ID NO:2至少95%序列一致性的核苷酸序列。

37.如权利要求30-36中任一项所述的载体，其中所述核苷酸序列进一步包括一个Kozak序列。

38.如权利要求30-37中任一项所述的载体，其中所述载体包括一个T-DNA边界区。

39.如权利要求30-38中任一项所述的载体，其中所述载体进一步包括一个感兴趣的核苷酸序列。

40.一个核酸序列，所述核酸序列或其补体包括一个对以下进行编码的编码区：

(a)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；或

(b)一个与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少90%一致性的氨基酸序列，并且对磷酸甘露糖异构酶（PMI）蛋白进行编码，

其中所述编码区包括一个或多个玉米优化密码子。

41.如权利要求40所述的核酸序列，其中所述编码区对具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列或与其具有95%一致性的氨基酸序列进行编码。

42.如权利要求40或权利要求41所述的核酸序列，其中所述核苷酸序列包括至少500个、700个、或1000个具有SEQ ID NO:2的核酸序列的连续核苷酸。

43.如权利要求40-42中任一项所述的核酸序列，其中所述编码区具有50个或更多个玉米优化密码子。

44.如权利要求40-42中任一项所述的核酸序列，其中所述编码区具有100个或更多个玉米优化密码子。

45.如权利要求40-42中任一项所述的核酸序列，其中所述编码区具有150个或更多个玉米优化密码子。

46.如权利要求40-45中任一项所述的核酸序列，其中所述编码区包括SEQ ID NO:2或一个具有与SEQ ID NO:2至少95%序列一致性的核苷酸序列。

47.如权利要求40-46中任一项所述的核酸序列，其中所述核酸序列进一步包括一个Kozak序列。