KR20010039484A

KR20010039484A - 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 이용한 작물의수량 또는 바이오매스의 증대 방법

Info

Publication number: KR20010039484A
Application number: KR1019990052478A
Authority: KR
Inventors: 백경환; 이희재; 구자옥; 이성범
Original assignee: 백경환; 구자옥; 이희재
Priority date: 1999-10-11
Filing date: 1999-11-24
Publication date: 2001-05-15

Abstract

본 발명은 프로토포르피리노겐 옥시다아제 (protoporphyrinogen oxidase, 이하 "프로톡스"라고도 부름) 유전자가 포함된 벡터계를 식물 숙주에 도입시켜 광합성 효율을 증대시킴으로써 작물의 수확량 또는 바이오매스를 증대시키는 방법에 관한 것이다.

Description

프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 이용한 작물의 수량 또는 바이오매스의 증대 방법{Process for increasing crop yield or biomass using protoporphyrinogen oxidase gene}

본 발명은 프로토포르피리노겐 옥시다아제(protoporphyrinogen oxidase, 이하 "프로톡스"라고도 부름) 유전자를 이용한 작물의 수량 또는 바이오매스의 증대 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 프로톡스 유전자가 포함된 벡터계를 식물 숙주에 도입시켜 식물의 광합성 효율을 증대시킴으로써 작물 수확량 또는 바이오매스를 증대시키는 방법 및 이에 사용된 발현 벡터, 벡터-식물 숙주계 및 식물의 수확량 또는 바이오매스를 증대시키기 위한 이들 벡터 또는 숙주계의 용도에 관한 것이다.

프로토포르피리노겐 IX(Protogen IX)의 프로토포르피린 IX(Proto IX)으로 산화를 촉매하는 프로토포르피리노겐 옥시다아제(protoporphyrinogen oxidase; 이하, "프로톡스"라고도 한다)는 엽록소 및 헴을 생합성하는 포르피린 경로의 분지점(branch point)의 마지막 단계의 효소이다. 엽록소는 광합성과정의 필수적인 빛 에너지를 수확하는 색소로 엽록소 함량의 증대에 따라 광합성 효율의 증대 및 이에 따른 수량 증대에 관여하는 필수적인 요소이다. 현재까지 광합성 효율의 증대를 위해 이산화탄소의 농도를 높여 주는 방법(Manalo et al., 1994; Jitla et al., 1997)과 포르피린 생합성 과정의 초기 산물인 델타 아미노레불리닉 산(delta-aminolevulinic acid)을 작물에 엽면살포하여 엽록소 함량의 증대를 꾀함으로써 작물의 수량 증대를 시도한 예(Hotta et al., 1997)와 피토크롬을 만드는 유전자를 조작하여 광효율의 질적 향상을 시도한 예(Clough et al., 1995; Thiele et al., 1999)가 있다. 그러나 이러한 방법은 비용과 노동력이 과다하게 소요될 뿐만 아니라 예기치 못한 부작용으로 작물의 생육이 오히려 저해되는 경우가 발생하므로 상업화되지 못하고 있는 실정이다.

지금까지, 대장균, 효모, 인간 및 식물로부터 10여 종의 프로톡스 유전자가 클로닝 및 특성들이 연구되었으며, 이들 각각은 상이한 생물체간의 낮은 아미노산 동일성을 가졌으나, 밀접하게 연관된 집단 사이에는 높은 상동성을 가졌다(Dailey et al., 1996; Lermontova et al., 1997; Corrigall et al., 1998).

바실러스 섭틸리스 프로톡스는 플라빈을 가지는 진핵세포의 효소와 유사한 동력학적인 특성을 가지고 있으며 분자 산소를 전자 수용체로 이용하긴 하지만, 프로토포르피리노겐 IX 및 코프로포르피리노겐 III(coproporphyrinogen III) 등의 다중 기질(multiple substrate)을 산화시킬 수 있다. 이 효소는 진핵생물의 프로톡스에 비해 기질 특이성이 낮으므로 식물에 전이시킨다면 식물의 포르피린 생합성 과정에서의 기질을 이용하여서도 반응을 촉매할 수 있는 특성이 있다(Dailey et al., 1994).

현재까지 프로톡스 효소는 주로 잡초방제 또는 제초제에 대한 작물의 선택성 부여에 초점을 두고 연구되어 왔으나(Matringe et al., 1989; Choi et al., 1998; 미국특허 제 5,767,373호(1998. 6. 16), 및 미국특허 제 5,939,602호(1999. 8. 17)), 식물의 생장 촉진에 관련하여 이것이 논의된 적은 없다.

본 발명자들은 세포질 또는 색소체의 어느 하나에서 바실러스 섭틸리스 프로톡스의 과다발현이 포르피린 생합성을 촉진하여 식물 색소인 엽록소 및 피토크롬의 합성이 증대되어 작물의 광합성 효율 증진을 부여하는지를 확인하기 위하여, 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환을 통하여 바실러스 섭틸리스 프로톡스를 과다발현시키는 트랜스제닉 벼를 육성하고 이들의 생육 특성을 T₀및 T₁세대에서 조사한 결과, 이들 트랜스제닉 벼의 수확량 또는 바이오매스가 본원 발명의 벡터-숙주계에 기인하여 현저히 증가될 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 프로톡스 유전자가 포함된 벡터계를 식물 숙주에 도입시켜 식물의 광합성 효율을 증대시킴으로써 작물 수확량 또는 바이오매스를 증대시키는 방법 및 이에 사용된 발현 벡터, 벡터-식물 숙주계 및 식물의 수확량 또는 바이오매스를 증대시키기 위한 이들 벡터 또는 숙주계의 용도를 제공하는 데 있다.

도 1은 프로톡스 트랜시트(transit) 펩티드의 핵산 서열 (A) 및 추정되는 아미노산 서열 (B)을 나타내는 도면. (C)는 바이너리 벡터(binary vector)에서 T-DNA 영역의 개략도.

도 2는 T₁트랜스제닉 벼의 노던 블롯 분석의 결과를 나타내는 전기영동 사진. C, 대조군; Tc, 트랜스제닉 대조군; C8/C13, 세포질 발현의 트랜스제닉 세포주; P9/P21, 색소체 발현의 트랜스제닉 세포주.

도 3은 트랜스제닉 벼와 대조군에서 벼의 생장 결과를 나타내는 사진.

이하, T₀및 T₁세대에서 바실러스 섭틸리스 프로톡스를 과다발현시키는 일부 트랜스제닉 식물의 육성에 관하여 기술한다. 그러나, 본원 발명은 이들 특정 식물(예, 벼, 보리, 밀, 라이그래스, 콩)에 대해서만 한정된 것은 아니고, 기타의 곡물, 예컨대 기타의 단자엽 식물(예, 평지, 옥수수, 호밀, 귀리, 잔디, 마초, 사탕수수, 기장, 오차드그래스 등) 뿐만 아니라 쌍자엽 식물(예, 담배, 목화)을 포함하는 작물에 적용할 수 있음은 당업자에게 자명하므로, 본 발명의 벡터-숙주계를 이용하는 한 이들에 대한 트랜스제닉 식물은 본원 발명의 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

이하, 본원 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

트랜스제닉 벼과 식물을 아그로박테리움-매개 형질전환 방법을 이용하여 하이그로마이신 내성 칼루스(callus)의 선별하고 재분화된 형질전환벼를 육성하였다.

T₀트랜스제닉 벼에서 바실러스 섭틸리스 프로톡스의 세포질 및 색소체에서 트랜스유전자의 도입(integration), 발현 및 유전성(inheritance)은 DNA 블롯, RNA 블롯, 웨스턴 블롯, 및 기타의 생화학적 분석법에 의해 T₀및 T₁세대에서 더 연구하였다. 본 발명에서 사용된 프로톡스 유전자는 바실러스속 유래의 것을 사용하였으나, 대장균 등의 장내세균속의 것을 사용할 수도 있다. 또 T₁트랜스제닉 식물에서 바실러스 섭틸리스 프로톡스 유전자에 의해 발현된 프로톡스 단백질은 폴리클로날 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 분석한 결과, 세포질에서 발현시킨 식물체에 비하여 색소체에 표적화시킨 식물에서 더 잘 발현되는 것으로 나타났다.

이하, 본 발명에서 실시한 구체적인 방법론에 대하여 설명한다. 그러나, 이들 방법들은 본 명세서에서 인용한 문헌에 교시된 방법 또는 이들 문헌에 기재된 방법을 변형하여 수행하는 것도 가능하다.

담배 프로톡스로부터의 트랜지트 서열의 PCR 클로닝

PCR-제조 트랜지트 서열의 서열 정보는 보고된 담배 프로톡스의 것에 비해 11개의 아미노산이 더 긴 63 아미노산을 코딩하는 189 뉴클레오티드를 나타냈다(Lermontova et al., 1997). 추론된 아미노산 서열들은 PCR-제조 트랜지트 펩티드에서 12개의 연속적인 세린 잔기의 신장부를 제외하고는 거의 동일하였다(도 1). 그러나, 이들 서열 차이(variation)는 사용된 상이한 담배 품종(cultivar)에 기인하는 것으로 보인다. 이 서열은 S/T의 풍부 및 D/E/Y의 결핍 등의 트랜지트 펩티드의 공통 특성을 가진다(von Heijne et al., 1989).

형질전환용 백터의 제조

단자엽 식물, 특히 벼의 형질전환시 널리 사용되는 바이너리 벡터의 종류는 매우 다양하며, 거의 모든 바이너리 벡터가 CAMBIA(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT2601, Australia)와 같은 국제센터 및 대학연구소에서 입수가능하며, 기본적인 바이너리 벡터의 골격은 Ti 플라스미드를 모체로 하여 유전자가 전달되는 좌측 및 우측경계 부위에 형질전환체 선별마커 유전자, 프로모터, 전사종결부위 유전자 등을 다양하게 변형시켜 사용하고 있다.

본 발명의 실시예에서는 바이너리 벡터로서 공지의 pGA1611(Kang et al., 1998)을 사용하였으나, 본 발명의 실시에 적합한 벡터들은 이에 한정되지 않고, 프로톡스 유전자를 효율적으로 발현할 수 있는 것이면 특별한 제한없이 사용할 수 있다. 이러한 벡터의 예로서는 본원 발명의 pGA1611과 그 구조가 극히 유사하고 상기 CAMBIA에서 분양받을 수 있는 바이너리 벡터 pCAMBIA 1380 T-DNA 및 pCAMBIA 1390 T-DNA를 바람직하게 사용할 수 있다.

벼의 형질전환

형질전환은 당업계에 공지된 통상의 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 식물에 대한 형질전환은 아그로박테리움-매개 형질전환을 이용할 수 있으며, 문헌[Paszkowsky et al., EMBO J 3:2717-2722 (1984)]에 예시된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면 벼에 대한 아그로박테리움-매개 형질전환법은 당업계의 문헌[An et al., EMBO J 4:227-288 (1985)] 등에 공지되어 있다. 단자엽 식물의 형질전환은 PEG 또는 전기천공법 등을 사용하여 프로토플라스트 내로 직접 유전자를 이식시키는 방법 또는 칼루스 조직 내로의 입자 투하(particle bombardment)을 사용하는 것이 가능하며, 단일 DNA를 사용하는 형질전환 및 다중 DNA를 사용하는 동시형질전환을 사용하여도 좋다. 적용될 수 있는 쌍자엽 작물로는 담배, 토마토, 해바라기, 목화, 평지, 토마토, 콩 등을 포함한다. 단자엽 식물의 예로서는 벼, 보리, 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 잔디, 마초, 기장, 사탕수수, 라이그래스, 오차드그래스 등을 포함한다. 형질전환된 세포들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 전 식물(whole plant)로 재분화시킨다.

본원 발명에서는 3개의 유전자 구조물(pGA1611 벡터 단독, pGA1611:C 및 pGA1611:P)을 공지의 분자생물학적 기법을 사용하여 추가의 형질전환에 사용하였다. 즉, 본 발명에 유전자를 작물에서 고도로 발현시키는 것으로 알려진 상시발현적 유비퀴틴 프로모터(constitutive ubiquitin promoter), 선별 마커로서 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제(hygromycin phosphotransferase)를 지닌 공지의 바이너리 벡터 pGA1611 내로 서브클로닝시키고, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404에 형질전환시켰다.

벼 (품종: 낙동)로부터 유도한 배반 칼루스(scutellum calli)를 상기 구조물을 지닌 아그로박테리움 투메파시엔스로 공조배양시켰다. 평균, 10-15% 칼루스가 50 μg/ml 하이그로마이신을 함유하는 선별 배지에서 생존하였다. 재분화 배지(regeneration medium) 상으로 옮긴 후, 선별된 칼루스는 1-5%의 비율로 신초(shoot)로 재분화되었다. 재분화의 과정 동안, 색소체에 표적화시킨 세포주(pGA1611:P)로부터 형성된 일부 어린 신초들은 정상 광도하에서 연푸르게 되는 경향을 띄었다. 그러나, 이 현상은 이들을 낮은 광도하에서 1주일 동안 생장시킨 후 정상 광도 조건하에 재위치시키면 극복될 수 있었으며, 신초들은 연푸름 현상(etiolation) 없이 정상적으로 자랐다. 벼 색소체에서 바실러스 섭틸리스 프로톡스의 가능한 과다발현에 기인한 이들 트랜스제닉 세포주가 Protogen IX을 Proto IX로 전환함에 있어서 촉매화 작용을 함으로써, 하류(downstream) 대사 과정에 필요한 Proto IX의 최적 농도를 넘은 효소 생성물이 식물 세포에 광독성을 유발시키는 것으로 설명될 수 있다(데이터에 나타내지 않음). 전체적으로, 세포질 또는 색소체에서 바실러스 섭틸리스 프로톡스를 발현하는 것으로 예상되는 pGA1611:C 및 pGA1611:P 구조물로부터의 6개체 및 58개체의 상이한 트랜스제닉 벼를 각각 육성하였다. 대조군으로서, pGA1611 벡터만을 발현하는 한 트랜스제닉 벼도 역시 생산되었다. 육성된 대부분의 트랜스제닉 세포주(T₀) 정상적인 표현형을 지녔으나, 이들의 볍씨 생산량은 개별 트랜스제닉 세포주에 따라 4개 내지 260개에 걸쳐서 다양하였다.

게놈성 DNA 겔 블롯 분석

바실러스 섭틸리스 프로톡스의 하이그로마이신 선별 배지로부터 재분화된 트랜스제닉 세포주의 벼 게놈으로의 안정한 도입을 평가하기 위하여, 세포질 발현된 세포주(pGA1611:C)의 5개의 T₀식물 및 색소체에 표적화된 세포주(pGA1611:P)의 6개의 T₀식물로부터 별도로 추출한 DNA들을 HindIII로 분해시키고³²P로 표지된 바실러스 섭틸리스 프로톡스와 혼성화시켰다. 프로브 처리된 트랜스유전자 내의 HindIII 부위의 부재로 인하여, 혼성화된 밴드의 수는 트랜스제닉 식물의 게놈에서 트랜스 유전자의 카피수에 대응한다. 세포질에 표적화시킨 트랜스제닉 세포주(C2, C5, 및 C6)는 각각 5kb 이상의 크기인 3개의 혼성화 밴드 주변에 다중 밴드를 나타냈는데 이는 벼 게놈의 상이한 위치에서 트랜스유전자의 다중 삽입을 의미한다(데이터에 나타내지 않음). 이와는 대조적으로, C1 및 C8 세포주는 벼 게놈에서 단일 카피 삽입부를 가졌다. 색소체 표적화 세포주에 대하여는 6개의 색소체 표적화된 세포주 중 3개의 카피 삽입부를 나타내는 세포주 P21를 제외하고는 모두 단일 카피 삽입부를 가졌다(데이터에 나타내지 않음).

T₁세대에서 하이그로마이신 내성의 분리

자가수분 볍씨로부터의 종자량이 많이 확보된 트랜스제닉 벼를 선택하여 T₁세대를 검정하였다. 트랜스유전자의 전달(transmission)은 1개의 트랜스제닉 대조군 (TC), 2개의 세포질 발현 세포주(C8과 C13), 및 2개의 색소체 표적화시킨 세포주(P9와 P21)를 포함하는 5개의 트랜스제닉 벼를 이용하였다. 시험된 모든 트랜스제닉 세포주는 현미를 하이그로마이신 50 μg/mL로 보충한 MS 고형화 배지의 절반 농도에서 발아시켰을 때 하이그로마이신 특성의 분리 패턴을 나타냈다. 이를 하기 표 1에 나타냈다.

T₁세대에서 트랜스제닉 벼에서 하이그로마이신 내성의 분리

트랜스제닉 벼	내성	감수성	분리비	X²
트랜스제닉 대조군(TC)	18	7	3:1	0.12
세포질-8(C8)	19	16	-
세포질-13(C13)	22	13	3:1	2.75
색소체-9(P9)	13	7	3:1	1.07
색소체-21(P21)	16	4	3:1	0.27

C8 세포주를 제외한 모든 세포주는 감수성 파종에 대한 내성비가 3:1에 가까웠음을 나타내며, 이는 벼의 게놈에 삽입된 트랜스유전자가 멘델의 분리, 독립, 우성의 법칙을 따라 발현됨을 볼 수 있다. C8 세포주에서, 분리비율이 멘델의 법칙에 일치하지 않는 감수성 식물들이 높은 비율로 나타났다.

T₁세대에 있어서 RNA 블롯 분석

트랜스제닉 벼로부터 종자량이 많이 확보된 발현주를 이용하여 하이그로마이신 배지에서 유전자가 확인된 개체를 선발하여 (트랜스제닉 대조구 TC; 세포질 발현주 C8 과 C13; 색소체 발현주 P9와 P21) 포장에서 재배하였다. 이들 모두의 잎으로부터 추출한 전체 RNA에서 바실러스 섭틸리스 프로톡스 mRNA의 발현 여부를 조사한 결과 대조구(C) 및 트랜스제닉 대조구(TC)는 바실러스 섭틸리스 프로톡스 mRNA가 발현되지 않았다(도 2). 세포질 발현된 세포주에서 C8 및 C13는 바실러스 섭틸리스 프로톡스 mRNA 발현 정도가 비교적 높은 수율로 발현되었다. 색소체 발현 세포주에 대해서는 바실러스 섭틸리스 프로톡스 mRNA가 상당히 많이 발현됨을 확인할 수 있었으며, 여기서 P21 세포주가 가장 높은 트랜스유전자 발현 정도를 나타냈다.

트랜스 유전자의 카피 수와 상대적인 mRNA 발현 수준 사이의 일부 관련성에 비추어, 바실러스 섭틸리스 프로톡스 mRNA의 수준은 게놈의 트랜스유전자의 카피수에 연관될 수 있다.

바실러스 섭틸리스 프로톡스 폴리펩티드의 검출

재분화된 T₁식물에서 바실러스 섭틸리스 프로톡스 단백질의 생산은 바실러스 섭틸리스 프로톡스에 대한 다클론 항체(입수처: Rohm ＆ Haas Co.)를 사용하여 면역학적으로 검사하였다. 트랜스제닉 대조구(TC), 세포질 발현(C8 및 C13) 또는 색소체(P9 및 P21)로부터 가용성 단백질들을 추출하여, 단백질 겔에 전기영동하여 PVDF 막에 옮긴 후 표준방법에 의해, 바실러스 섭틸리스 프로톡스 항체로 면역반응시켰을 때, 크기에 있어서 바실러스 섭틸리스 프로톡스에 대응하는 단백질들이 대조군을 제외한 모든 트랜스제닉 세포주에서 발현하는 것으로 나타났다.

흥미롭게도, 색소체 발현은 세포질 세포주의 것에 비하여 3-4 배 더 높은 밴드 강도를 나타냈다. 바실러스 섭틸리스 프로톡스의 가능한 분해 산물로 보이는 두 개의 작은 단백질 밴드가 트랜스제닉 세포주에서 발견되었다. 대조적으로, 색소체 발현 세포주에서만 검출된 조금 더 큰 희미한 밴드(바실러스 섭틸리스 프로톡스 보다 큰 약 4-5 kDa)는 트랜지트 서열이 절단되지 않은 바실러스 섭틸리스 프로톡스로부터의 전구단백질일 수 있다. 마이크로솜의 단백질에 대하여는, 항체 반응성 단백질들이 검출되지 않았다(데이터에 나타내지 않음).

결론적으로 형질전환된 세포주에서 검출되는 프로톡스 분해산물과, 색소체 표적화된 세포주에서 바실러스 섭틸리스 프로톡스의 더 높은 발현이 일어났고, 바실러스 섭틸리스 프로톡스의 전구단백질 형태의 존재는 간접적이긴 하지만 형질전환된 세포주에서 바실러스 섭틸리스 프로톡스의 발현에 대한 강력한 증거를 제공하는 것으로 보인다.

이하, 본 발명은 다음의 본 발명의 대표적인 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 벼 형질전환용 벡터의 제조

본 실시예에서는 두 가지 타입의 바실러스 섭틸리스 프로톡스 유전자 구조물을 벼 형질전환에 사용하였다. 출발 바이너리 벡터는 pGA1611으로서 이 벡터 제조과정을 요약해 보면, 코스미드 벡터인 pGA482 벡터를 모체로 하여(An et al., 1988), 항생제 저항성 유전자인 하이그로마이신 유전자(Gritz and Davies., 1983; NCBI 입수번호: K01193)를 우측경계부분의 EcoRI/SacII부위에 삽입하고 이 하이그로마이신 유전자를 조절하는 프로모터는 꽂양배추 모자이크 바이러스에서 가져온 35S 프로모터(Gardner et al., 1981; Odell et al., 1985; NCBI 입수번호: V00140)를 도입하고 전사종결을 위해 옥토파인형 TiA6 플라스미드의 7번 전사체의 전사종결 부위(Greve et al., 1982; NCBI 입수번호: V00088)를 도입하였다. 외부 유전자의 발현을 위해 유비퀴틴 유전자(Christensen et al., 1992; NCBI 입수번호: S94464)를 BamH1/PstI 위치에 도입하고 노파린 합성유전자의 전사종결부위(Bevan et al., 1983; NCBI 입수번호: V00087)를 한 개의 제한효소부위를 가진(HindIII, SacI, HpaI, and KpnI) 클로닝 부위에 두도록 하였다.

플라스미드 pGA1611:C는 벼의 세포질에서 바실러스 섭틸리스 프로톡스를 발현하도록 제작하였다. PCR 증폭시킨 바실러스 섭틸리스 프로톡스 유전자의 전체 길이를 SacI 및 KpnI으로 절단하고, 동일한 효소로 미리 절단시킨 pGA1611 바이너리 벡터내로 연결시켜 옥수수 유비퀴틴 프로모터의 조절하에 위치시켰다. 다른 벡터(pGA1611:P)는 바실러스 섭틸리스 프로톡스를 벼의 색소체 내로 표적화시키도록 설계하였다(도 1). 간편한 서브클로닝을 위해 설계한 SacI 프라이머 부위는 밑줄 그은 부분이다. 담배의 프로톡스(Nicotiana tabacum cv. Samsun)유전자 서열은 GeneBank 데이터 베이스 (입수 번호: Y13465)로부터 입수하였다.

벡터의 제조를 위해 PCR 방법을 담배(N. tabacum cv. Samsun NN) Protox의 서열 데이터에 따라 설계된 특정의 프라이머를 사용하여 수행하였다. 트랜지트 펩티드를 HindIII 부위 (밑줄그음)를 가지는 전방 프라이머, 5-d(TATCAAGCTTATGACAACAACTCCCATC)-3, a SacI 부위 (밑줄그음)를 가지는 역 프라이머 5-d(ATTGGAGCTCGGAGCATCGTGTTCTCCA)-3, 및 주형으로서 담배(N. tabacum cv. KY160) 게놈 DNA를 사용하여 증폭시켰다. 이 PCR 생성물을 HindIII 및 SacI으로 절단하고, 겔 정제시키고, 벡터 pBluescript(상업상 입수 가능함) 내의 동일한 제한 부위 내에 연결시켰다. 염기서열을 확인한 후에, 트랜지트 서열의 HindIII 및 SacI 단편을 pGA1611:P 벡터의 동일한 제한 효소 부위에 연결하여, 바실러스 섭틸리스 프로톡스의 아미노말단에 트랜지트 펩티드를 위치시킨 pGA1611:P를 작제하였다. 도 1의 (C)는 바이너리 벡터(binary vector)에서 T-DNA 영역의 개략도이다. pGA1611, pGA1611:C 및 pGA1611:P를 벼의 형질전환에 사용하였다. Ubi는 옥수수 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터; Tnos는 노팔린(nopaline) 합성의 3' 종결신호(termination signal); P35S는 CaMV 35S 프로모터; HPT는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hygromycin phosphotransferase); Ts는 트랜시트 서열(transit sequence)을 각각 나타낸다.

실시예 2: 형질전환 및 재분화

pGA1611, pGA1611:C 및 pGA1611:P를 가지는 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 균주를 테트라사이클린 5 μg/mL 및 하이그로마이신 40 μg/mL을 보충한 YEP 배지(1% Bacto-peptone, 1% Bacto-yeast extract, 0.5% NaCl)에서 28℃에서 밤새 성장시켰다. 이 배양물을 원심분리시키고 펠릿들을 동일 부피의 아세토시링곤(acetosyringone) 100 μM을 함유하는 AA 배지(Hiei et al., 1997) 중에서 현탁시켰다. 칼루스를 N6 배지에 파종한 벼의 배반(품종: 낙동)으로부터 유도하였다(Rashid et al., 1996; Hiei et al., 1997). 3-4 주령의 밀집한 칼루스를 3 분 동안 세균 현탁액 중에 적시고, 멸균 여과지로 빨아들여 건조시켜 과량의 균을 제거하였다. 이어서 칼루스를 25℃의 암실에서 2-3일 동안 동시 배양 배지상으로 옮겼다. 동시 배양된 칼루스를 세포탁심 250 mg/L을 함유하는 멸균수로 세척하여 세균을 제거하고 이어서 세포탁심 250 mg/L 및 하이그로마이신 50 mg/L을 포함하는 N6 배지로 옮겼다. 3-4 주 동안 선별시킨 후, 칼루스들을 발아 및 뿌리 성장용 재분화 배지로 옮기고 뿌리가 충분히 성장한 후에, 트랜스제닉 식물들을 온실로 옮겨서 성장시켰다.

실시예 3: 콩의 형질전환 및 재분화

pGA1611:C 및 pGA1611:P를 가지는 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 균주를 테트라사이클린 5 μg/mL 및 하이그로마이신 40 μg/mL을 보충한 YEP 배지(1% Bacto-peptone, 1% Bacto-yeast extract, 0.5% NaCl )에서 28℃에서 밤새 성장시켰다. 이 배양물을 원심분리시키고 펠릿들을 동일 부피의 아세토시링곤 (acetosyringone) 100 μM을 함유하는 B5 배지(Gamborg et al., 1968)에서 현탁시켜, 3-4cm 자란 콩의 자엽을 종단하여 상처를 가한 뒤 함께 공조배양한 후 3일 간 24℃에 둔 후 B5 회복 배지 및 재분화배지(Di et al., 1996)를 거쳐 T₀형질전환 콩을 육성하였다.

실시예 4: 보리, 밀, 및 라이그래스 식물형질전환용 벡터의 제조

pGA1611:C 및 pGA1611:P 바이너리 벡터로부터 유비퀴틴 프로모터, 색소체발현 프로톡스 유전자 및 노팔린 합성의 3' 종결신호를 포함하는 유전자를 BamHI/Cla1 으로 절단하여 pBluescript II SK 클로닝 벡터(Strategene, USA)의 같은 위치에 삽입한 후 pBSK-프로톡스를 만들고, pBSK-프로톡스 벡터를 ClaI/SalI으로 단선화시켜, 모자이크 바이러스 35S 프로모터:하이그로마이신 유전자:옥토파인형 TiA6 전사종결 부위를 pGA1611:C 및 pGA1611:P로부터 절단(ClaI/SalI)하여 pBSK-프로톡스 벡터내로 도입하여 pBSK-프로톡스/하이그로마이신 벡터를 최종적으로 제조하여 유전자총을 위한 벡터로 사용하였다.

실시예 5: 밀, 보리, 및 라이그래스의 형질전환 및 재분화

형질전환을 위한 절편은 밀, 보리, 라이그래스의 배반에서 유래한 칼루스를 모두 사용하였다(Spangenberg et al., 1995; Koprek et al., 1996; Takumi and Shimada, 1997). pBSK-프로톡스/하이그로마이신 벡터 DNA을 1.6 μm 지름의 백금에 도포하여 Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System(Bio-Rad)을 이용하여 밀, 보리 및 라이그래스에서 유래한 칼루스에 이전(bombard)하였다. 밀의 경우 이전된 칼루스를 2 mg/L 2,4-D 와 40 mg/L 하이그로마이신을 함유하는 Linsmaier-Skoog (LS) 배지에 치상하여 한달간 배양한 후 선발된 조직을 40 mg/L 하이그로마이MgCl₂, 베타-머캅토에탄올 5 mM 및 10 mL당 한 테블릿의 완전 프로테아제 억제제[Complete, Mini; Boehringer Mannheim]로 이루어진 균질화 완충액 1mL로 4℃에서 추출하였다. 균질화물을 Miracloth(CalBiochem)의 두 층을 통해 여과시키고, 3,000g에서 10분 동안 원심분리시키고, 잔류 상층액을 100,000g에서 60분 동안 원심분리시켜 조 마이크로솜 펠릿을 얻었다. 이 펠릿을 균질화 완충액 100 μL 중에 용해시키고, 마이크로솜의 분획에 대한 면역 블롯팅에 사용하였다(20 μg 단백질). 100,000g 상층액 추출물(15 μg)을 가용성 단백질로서 사용하였다. 가용성 및 막 결합 단백질들을 SDS-PAGE 시켰다. 10%(w/v) 아크릴아마이드/비스 겔에서 전기영동시킨 후, 단백질들을 PVDF 막으로 옮기고 바실러스 섭틸리스 프로톡스 다클론 항체로 면역검출시켰다. 2차 항체의 순응성 및 밴드 검출을 제조자(ECL kit; Boehringer Mannheim)의 사용지침에 따라 증강된 화학발광시스템을 사용하여 수행하였다.

시험예: 1 트랜스제닉 벼 식물의 성장 결과

실시예 2에서 재분화시킨 트랜스제닉 벼 식물의 성장 결과를 각각 하기 표 2 내지 6에 정리하여 나타냈다. 표 2는 각각 성장 단계에 의한 트랜스제닉 벼의 길이를 나타낸다.

생장 단계 별 트랜스제닉 벼의 식물 크기

생장단계(이앙후 주)	식물 길이(cm)(4개체 이상의 벼의 평균값)
생장단계(이앙후 주)	대조군	TC	C8	C13	P9	P21
1	26.0	28.3	28.2	25.5	25.3	26.6
2	43.2	41.7	40.3	45.3	43.0	41.4
3	46.7	46.3	45.3	48.5	43.3	47.6
4	53.0	52.3	49.7	51.3	48.3	55.8
10	82.3	79.0	86.3	89.5	85.8	79.6
16	82.5	79.0	86.5	90.5	86.5	81.5

상기 표의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 세포질 표적화시킨 트랜스제닉 세포주에서 대조구에 비해 10cm정도 벼가 현저하게 성장하였다.

하기 표 3은 성장 단계에 의한 트랜스제닉 벼의 분얼수를 나타내고, 표 4는 식물당 트랜스제닉 벼의 정량적 특성 및 표 5는 식물당 트랜스제닉 벼의 수량 구성요소에 관련하여 얻어진 결과들을 각각 나타낸 것이다.

생장 단계에 의한 트랜스제닉 벼의 분얼수(괄호안의 수는 대조군에 대한 백분율임)

생장단계(이앙후 주)	분얼수(4개체 이상의 벼의 평균값)
생장단계(이앙후 주)	대조군	TC	C8	C13	P9	P21
1	3.6	3.7	3.3	2.8	2.3	4.2
2	6.3	6.0	6.0	7.5	8.0	6.8
3	8.8	9.3	10.3	16.0	14.3	13.6
4	15.7	15.7	18.7	24.3	26.3	18.7
10	15.7	16.2	19.3	26.5	26.3	19.5
16	18.0(100)	18.2(101)	23.0(128)	28.0(156)	35.5(197)	23.5(131)

식물 개체당 트랜스제닉 벼의 정량적 특성

특성	대조군	TC	C8	C13	P9	P21
줄기무게(생체중. g)	131	138	246	252	188	171
뿌리무게(생체중. g)	89	92	140	111	93	68
줄기/뿌리무게 비율	1.5	1.5	1.75	2.27	2.02	2.51
수장(cm)	20.2	18.7	17.3	19.1	19.6	18.3
유효경비율(%)	82.1	76.9	89.1	93.9	80.9	77.9

식물당 트랜스제닉 벼의 수량 구성요소

특성	대조군	TC	C8	C13	P9	P21
곡물 수량(g)(대조군대비 백분율)	35.0(100)	35.2(101)	36.3(104)	58.6(167)	69.8(199)	45.2(129)
1,000 곡물 중량(g)	28.3	30.0	27.7	31.4	29.2	28.2
수수	15.0	14.0	20.5	26.3	28.7	18.3
립수	94.4	94.0	99.4	108	104	101
등숙률(%)	88.1	85.5	85.9	84.8	86.0	86.7

상기 표에 기재된 바의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본원 발명에 따른 트랜스제닉 벼에 있어서, 식물당 트랜스제닉 벼의 정량적 특성, 즉 유효경비율에서도 현저히 개선된 효과가 관찰되었고, 곡물 수량 및 분얼수는 최대 2배까지 증가되었음을 알 수 있다.

시험예 2: 트랜스제닉 보리, 밀, 콩, 및 이탈리안 라이그래스 식물의 성장 결과

실시예 2와 같은 유사한 방법으로 재분화시킨 기타 단자엽 식물(보리, 밀), 쌍자엽 식물(콩) 및 목초(이탈리안 라이그래스)들의 생육 특성을 조사하여 본 결과 보리에서는 개체당 곡물수량이 118-127% 정도 증수효과를 확인할 수 있었으며(표 6), 밀의 경우114-125%의 수량증수가(표 7), 콩의 경우 123-128%(표 8), 이탈리안 라이그래스의 생체 목초량이 151%까지 증수효과를 나타내(표 9) 프로톡스 유전자에 의한 수량증수 효과가 벼 외 다른 단자엽 식물뿐 아니라 목초 및 쌍자엽 식물까지 확대 적용될 수 있는 현상을 보여 준다.

식물 개체당 트랜스제닉 보리의 수량 특성

특성	대조군	TC	C112	P115
곡물수량(g)(대조군대비 백분율)	177(100)	180(100)	228(127)	211(118)
1,000 곡물중량(g)	34.9	33.8	33.1	31.4
수수	4.3	4.0	6.3	5.5
립수	42.0	44.2	51.4	47.0
등숙률(%)	82.7	82.0	80.1	84.5
수장(cm)	3.9	3.8	4.0	4.2
식물길이(cm)	69.5	67.4	69.0	70.8

식물 개체당 트랜스제닉 밀의 수량 특성

특성	대조군	TC	C204	P207
곡물수량(g)(대조군대비 백분율)	247(100)	242(97)	310(125)	282(114)
1,000 곡물중량(g)	45.3	44.0	46.1	45.0
수수	5.6	5.3	7.2	8.3
립수	34.2	36.0	40.1	37.0
등숙률(%)	80.6	79.2	77.1	81.0
수장(cm)	7.8	7.1	7.6	7.7
식물길이(cm)	67.4	69.0	76.4	72.0

식물 개체당 트랜스제닉 콩의 수량 특성

특성	대조군	TC	C303	P310
곡물수량(g)(대조군대비 백분율)	39.2(100)	36.5(94)	48.5(123)	50.3(128)
1,000 곡물중량(g)	19.6	21.0	20.0	22.5
식물길이(cm)	71.4	68.4	78.0	76.3
등숙률(%)	80.2	81.0	90.4	87.4

식물 개체당 트랜스제닉 이탈리안 라이그래스의 수량 특성

특성	대조군	TC	P407
생체중(대조군대비 백분율)	117(100)	105(89)	178(151)
분얼경수	8.5	8.0	12.3
잎수	36.0	41.2	50.0

본원 발명에 따른, 프로톡스 유전자가 포함된 벡터계를 작물에 도입시킴으로써 작물의 수확량 또는 바이오매스가 현저히 증가됨이 확인되었으므로, 본 발명에 의해 식량난을 해결할 수 있음은 물론, 사료 작물을 포함하는 식물 자원의 확보가 가능하게 될 것이다.

[인용 문헌 리스트]

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Claims

프로토포르피리노겐 옥시다아제(protoporphyrinogen oxidase)에 대한 유전자가 포함된 벡터계를 식물 숙주에 도입시켜 작물의 수확량 또는 바이오매스를 증대시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 유전자가 원핵성 유전자임을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 원핵성 유전자가 바실러스 속 또는 장내세균속 유래의 것인 방법.
프로토포르피리노겐 옥시다아제에 대한 유전자가 포함된 벡터계로 형질전환된, 수확량 또는 바이오매스가 증대되는 작물, 작물 조직, 작물 세포 또는 작물 종자.
제4항에 있어서, 상기 작물이 단자엽 작물임을 특징으로 하는 작물, 작물 조직, 작물 세포 또는 작물 종자.
제5항에 있어서, 상기 작물이 보리, 평지, 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 잔디, 마초, 사탕수수, 기장, 라이그래스, 오챠드그래스 및 벼로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 작물, 작물 조직, 작물 세포 또는 작물 종자.
제4항에 있어서, 상기 작물이 쌍자엽 작물임을 특징으로 하는 작물, 작물 조직, 작물 세포 또는 작물 종자.
제7항에 있어서, 상기 작물이 콩, 담배 및 목화로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 작물, 작물 조직, 작물 세포 또는 작물 종자.
제1항 또는 제4항에 따른 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자, 유비퀴틴 프로모터 (constitutive ubiquitin promoter), 선별 마커로서 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제(hygromycin phosphotransferase)를 지닌 벡터.