JP2001238556A - アミノ酸組成が改良されたトランスジェニック植物の作出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決課題】 植物の可食部分における遊離アミノ酸、
特にグルタミン酸、アルパラギン、アスパラギン酸、セ
リン、スレオニン、アラニン、およびヒスチジンの少な
くとも一つの遊離アミノ酸を高度に蓄積するトランスジ
ェニック植物およびその作出方法を提供する。 【解決手段】 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤ
Ｈ）遺伝子をコード配列を植物細胞において発現させる
ために適切な制御配列と共に植物に導入し、ＧＤＨ遺伝
子を過剰発現させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遊離アミノ酸が増
強されたトランスジェニック植物およびその作成方法に
関する。より具体的には、本発明は、アスパラギン、ア
スパラギン酸、セリン、スレオニン、アラニン、ヒスチ
ジンおよびグルタミン酸の少なくとも１つを高蓄積する
トランスジェニック植物およびその作製方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物に特定の遺伝子を導入し形質転換さ
せる技術が世界で初めて報告されたのは土壌細菌、Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用
いてタバコに遺伝子を導入した研究であり、その後多く
の有用農業形質を付与した作物が作出され、植物に有用
成分を作らせる試みも行われてきた。このようなトラン
スジェニック植物作成技術を用いた植物育種法は、交配
等による従来の伝統的な育種に代わるものとして有望視
されている。その中で、窒素同化に関する植物の特性改
良の研究も進められてきており、特に、アミノ酸は窒素
代謝産物の中でも、果実、根菜類の根、種子などにおい
て重要な成分であり、また食味にも大きく影響を与える
ことから盛んに研究が行われてきている。

【０００３】アミノ酸の生合成に関する研究としては、
例えば、大腸菌由来ＤＨＤＰＳ遺伝子をタバコに導入
し、遊離リジンが２００倍上昇したという報告（米国特
許第５２５８３００号、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ Ｒｅｓ．＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ａ
Ｋ遺伝子の導入により遊離リジンが増加したという報告
（ＥＰ４８５９７０，ＷＯ９３１９１９０）、ＡＳ遺伝
子をタバコに導入し、アスパラギン含量が１００倍上昇
したという報告（ＷＯ ９５０９９１１，Ｕｎｉｖ Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，ＷＯ ９０１３５３３，Ｕｎｉｖ Ｒ
ｏｃｋｆｅｌｌｅｒ）、アントラニル酸合成酵素をイネ
に導入しトリプトファン含量が９０倍上昇したという報
告（ＷＯ ９７２６３６６，ＤＥＫＡＬＢ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃ Ｃｏｒｐ）がなされている。遺伝子導入の対象と
なる植物はタバコ、シロイヌナズナ等のモデル植物に限
られず、トマトなどの果実をもつ植物も利用されてい
る。例えば、トマトについては１９８６年にアグロバク
テリウム法を用いて形質転換体が作出され（Ｓ．ＭｃＣ
ｏｒｍｉｃｋ，Ｊ．Ｎｉｅｄｅｒｍｅｙｅｒ，Ｊ．Ｆｒ
ｙ，Ａ．Ｂａｒｎａｓｏｎ，Ｒ．Ｈｏｒｓｃｈ ａｎｄ
Ｒ．Ｆｒａｌｅｙ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏ
ｒｔｓ，５，８１−８４（１９８６）；Ｙ．Ｓ．Ｃｈｙ
ｉ，Ｒ．Ａ．Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ，Ｄ．Ｇｏｌｄｓｔｅ
ｒｎ，Ｓ．Ｄ．Ｔａｒｋｓｌｅｙ ａｎｄ Ｆ．Ｌｏａ
ｉｚａ−Ｆｉｇｕｅｒｏｅ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．，２０４，６４−６９（１９８６））、それ以来形
質転換系の改良がなされてきている。また、アミノ酸生
合成、窒素同化に関与する遺伝子は上述の他にも多数知
られており、アスパラギナーゼ、ＧＯＧＡＴ等が含ま
れ、これらの塩基配列も報告されている。

【０００４】ここで、特にα−アミノ酸の一種であるグ
ルタミン酸は、一般にタンパク質中に広く分布し、調味
用途として使用されている、トマトのうま味成分や、ダ
イズではその醸造食品（例えば、醤油、ミソなど）中の
うま味成分は、いずれもグルタミン酸であることが知ら
れており、高等植物では窒素代謝の最初の段階で合成さ
れることが知られている。また、グルタミン酸より生じ
たグルタミン、アスパラギンが篩管を経由して各組織に
分配されその他のアミノ酸合成、タンパク質合成に用い
られることが分かっている。植物においては、スクロー
スやアミノ酸などの光合成産物の輸送経路である篩管に
は高濃度に存在する例が報告されている（茅野充男ら、
植物栄養・肥料学ｐ１２５（１９９３））が、可食部分
に高濃度に含まれる例としては、トマト果実に０．２５
ｇ／１００ｇ ｆ．ｗ．程度含まれる例（ときめき２
号、日本食品工業学会誌、第３９巻、ｐ６４−６７（１
９９２））が知られている。しかしながら、グルタミン
酸の場合は、ソース器官での生合成能が向上できたとし
てもアミノ基供与の出発物質であり、前述のように種々
の生合成経路で代謝されるため、植物体中でグルタミン
酸を高濃度に蓄積させるのは容易ではない。交配育種、
遺伝子操作を問わず、これまでグルタミン酸の濃度を植
物体中で飛躍的に高めるのに成功した例は出願人の知る
限り見当たらない。

【０００５】無機窒素を有機体に同化する第一段階は、
上述したように主にグルタミンを生成するためのグルタ
ミン酸へのアンモニアの取り込みであり、これはグルタ
ミンシンテターゼ酵素（ＧＳ）により触媒される。次い
で、このグルタミンは、グルタミン酸シンターゼ（ＧＯ
ＧＡＴ）に触媒され、α−ケトグルタル酸とから２分子
のグルタミン酸が生成される。このＧＳ／ＧＯＧＡＴサ
イクルが、植物における窒素同化の主要な経路と考えら
れている（文献：ＭｉｆｌｉｎおよびＬｅａ，１９７
６，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５；８７３−８
８５）。一方、アンモニアの取り込みが、ＧＳにより触
媒される経路以外の代謝経路により進行する事が知られ
ている（Ｋｎｉｇｈｔ ａｎｄ Ｌａｎｇｓｔｏｎ−Ｕ
ｎｋｅｆｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：９
５１−９５４）。即ち、グルタミン酸を生成するための
α−ケトグルタル酸へのアンモニアの取り込みであり、
これはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）により
触媒される。しかし、植物のＧＤＨは、アンモニアに対
して高いＫｍ値を有しており、一方、アンモニアは毒性
があり、細胞内アンモニアは通常低濃度であるため、正
常な生育条件下でのこの窒素同化経路の役割については
未だ充分には明らかにされていないが、ある研究では、
細胞内のアンモニウム濃度が正常レベルを越えて上昇し
た時の窒素同化に寄与しているとの報告がある（Ｋｎｉ
ｇｈｔ ａｎｄ Ｌａｎｇｓｔｏｎ−Ｕｎｋｅｆｅｒ、
前掲）。

【０００６】植物におけるグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ酵素（ＧＤＨ）は上記の様にグルタミン酸を生成する
ためα−ケトグルタル酸へアンモニアを取り込ませる場
合と逆にα−ケトグルタル酸を生成するためにグルタミ
ン酸からアンモニアを解離させる場合と可逆的な反応を
触媒する。前者はアンモニア量が高い場合に、また後者
は窒素含量が高い場合に機能すると考えられており（Ｒ
ｏｂｉｎｓｏｎら、１９９１，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．９５；８０９−８１６：Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，１
９９２，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９８；１１９０
−１１９５）、微生物に見られるようなグルタミン酸を
合成する方向に機能する酵素ＧＤＨ−Ａや分解する方向
に機能する酵素ＧＤＨ−Ｂ等のように方向性が明確でな
い。また、植物ではクロロプラストで機能するＮＡＤＰ
依存型ＧＤＨとミトコンドリアで機能するＮＡＤ依存型
ＧＤＨの２種類があると考えられているが、ＧＤＨはア
ンモニアに対して高いＫｍ値を示し、また、光呼吸時に
おけるアンモニアレベルとの相関性が高いことから、ミ
トコンドリアに局在するＮＡＤ依存型ＧＤＨがアンモニ
アの同化に重要な働きをしていると考えられている（Ｓ
ｒｉｖａｓｔａｖａおよびＳｉｎｇｈ ＲＰ，１９８
７，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６；５９７−６
１０）。

【０００７】植物のＧＤＨは、２種類の異なるポリペプ
チド（α−サブユニット、β−サブユニット）がランダ
ムに結合し、ヘキサマーを形成し、さらに、結合の程度
により７つのアイソザイムパターンを示すことが知られ
ている。Ｇｒａｐｅｖｉｎｅのカルス細胞を用いた研究
において、硝酸塩やグルタミン酸を加えた培地で培養し
たカルスは、電気泳動した際β−サブユニットから成る
アイソザイムが陰極側に増加し、アンモニアやグルタミ
ンを加えた培地で培養したカルスはα−サブユニットか
ら成るアイソザイムが陽極側に増加すること、さらに、
硝酸塩培地からアンモニア源培地に移した場合、ＧＤＨ
活性が３倍増加し（α−サブユニット４倍増加し、β−
サブユニット減少）、活性が陰極側から陽極側に移行し
たことが報告され（ＬｏｕｌａｋａｋｉｓおよびＰｏｕ
ｂｅｌａｋｉｓ−Ａｎｇｅｌａｋｉｓ，１９９６，Ｐｌ
ａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７；１０４−１１１１）、
アンモニアの同化にα−サブユニットが重要な働きをし
ていると考えられている。

【０００８】１９９５年Ｓａｋａｋｉｂａｒａら（Ｐｌ
ａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，３３；１１９３−
１１９８）によりトウモロコシの根から７つのアイソザ
イムバンドのうち陰極側の２つのバンドを元にＧＤＨ遺
伝子が植物で初めて単離され、その後Ｇｒａｐｅｖｉｎ
ｅ（Ｓｙｎｔｉｃｈａｋｉら，１９９６，Ｇｅｎｅ１６
８；８７−９２）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ｍｅｌｏ
−Ｏｌｉｖｅｒａら、１９９６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３；４７１８−４７２
３）、トマト（Ｐｕｒｎｅｌｌら、１９９７，Ｇｅｎｅ
１８６；２４９−２５４）からＧＤＨ遺伝子が単離さ
れてきた。特に、Ｇｒａｐｅｖｉｎｅのカルスから単離
された遺伝子はアンモニア処理した細胞において発現し
てきたアイソザイムを元に単離されており、α−サブユ
ニットをコードする遺伝子であると考えられている。い
ずれの遺伝子においてもミトコンドリアで機能するため
のトランジェットペプチドを有しているが、トウモロコ
シやトマトのＧＤＨ遺伝子は根で多量に発現しているの
に対し、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓでは葉や花での発現が
高い。またトウモロコシ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｇ
ｒａｐｅｖｉｎｅでは複数個の遺伝子の存在が示唆され
ているのに対し、トマトでは１コピーであることが報告
されているように植物においても遺伝子構成や機能に違
いを有しており、複雑であることが予測されている。

【０００９】このＧＤＨ遺伝子を導入したトランスジェ
ニック植物も作製されており、大腸菌由来グルタミン酸
デヒドロゲナーゼ酵素ＧＤＨ（ＮＡＤＰ−ＧＤＨ）を除
草剤フォスフィノスリシン耐性付与を目的としてタバコ
とトウモロコシに導入したところ、根でグルタミン酸含
量が１．３〜１．４倍増加したことが報告されている
（Ｌｉｇｈｔｆｏｏｔ Ｄａｖｉｄら、ＣＡ２１８０７
８６（１９９６）。この報告では、タバコの根におい
て、１４．７ｍｇ／１００ｇｆ．ｗ．であったグルタミ
ン酸含量が２０．６ｍｇ／１００ｇｆ．ｗに、トウモロ
コシの根において１６．２ｍｇ／１００ｇｆ．ｗであっ
たグルタミン酸含量が１９．１ｍｇ／１００ｇｆ．ｗ．
に増大した。これ以外に、ＧＤＨ遺伝子の利用について
記載された報告もあるが、実施例は示されていない（Ｗ
Ｏ９５０９９１１、クロレラ由来のα、β−サブユニッ
ト（ＷＯ９７１２９８３））。またグルタミン酸族アミ
ノ酸についての分析値も示されていない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、植物
の貯蔵器官の遊離アミノ酸含量、特に根、果実、種子を
含む植物の可食部分における遊離アミノ酸、特にグルタ
ミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、セリン、スレ
オニン、アラニンおよびヒスチジンの少なくとも１つの
蓄積を増強する方法、および、遊離アミノ酸が高度に蓄
積されたトランスジェニック植物を提供することであ
る。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、窒素の
同化および利用に関わる主要な酵素の発現レベルおよび
／または細胞特異的な発現バランスを変化させた植物お
よびその作製方法を提供することによって達成される。
このような植物は、窒素同化または利用酵素をコードす
る１以上の遺伝子を適切な制御配列と共に導入し、これ
を過剰発現または発現抑制することによって作製され
る。本発明の方法による遊離アミノ酸を高度に蓄積する
トランスジェニック植物、特にグルタミン酸、アスパラ
ギン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、アラニン
およびヒスチジンの少なくとも１つ、とりわけグルタミ
ン酸を高度に蓄積する植物は、真核生物由来のグルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子を適切な制御配
列と共に植物に導入し、これを過剰発現させることによ
って得られる。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明は、植物における窒素代謝
の遺伝子操作に関する。特に、本発明は、果実、根菜類
の根、種子など有用植物の可食部分の遊離アミノ酸、特
にうま味成分であるグルタミン酸の高蓄積を図るために
窒素同化および利用に関与する酵素の発現量を変化させ
ることに関する。これらの酵素はその発現が増強され、
あるいは修飾され、あるいは抑制され、所望の性質を有
する植物が作製される。本発明において使用される標的
遺伝子は、アンモニアのアミノ酸への同化に関係する酵
素をコードする遺伝子である。標的遺伝子としては例え
ば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）が挙げら
れる。この酵素はその発現が増進され、またそれ以外に
修飾（例えばトランジット配列付加による異所性発現）
されて所望の性質を有する植物が作製される。操作は植
物を本明細書に記載された核酸構築物で形質転換するこ
とにより行うことができる。形質転換された植物または
それらの子孫は所望の改変された酵素を発現し、相当す
るｍＲＮＡの発現変化、窒素同化または利用能の変化、
および／または植物の遊離アミノ酸含量増加についてス
クリーニングされる。

【００１３】簡単には本発明の方法は以下の手順を含
み、また本発明のトランスジェニック植物はこのような
方法によって作製されたトランスジェニック植物であ
る： ａ）目的とする遺伝子をクローニングするステップ； ｂ）得られた遺伝子を必要により適切なベクターへ再ク
ローニングするステップ； ｃ）植物細胞へ上記ベクターを導入し、形質転換体を得
るステップ； ｄ）得られた形質転換体を植物体へ再生させ栽培するス
テップ；

【００１４】本発明の実施態様の一つにおいては、窒素
同化または利用酵素をコードする１個または数個の遺伝
子が強力な構成的プロモーター制御下に置かれ、植物体
中で過剰発現される。このような発現の改変は、例え
ば、 ａ）酵素のコーディング配列が強力な構成プロモーター
に機能し得る状態で結合されているトランスジーン、 ｂ）所望の酵素をコードする、多コピー数の天然遺伝
子、 ｃ）窒素同化または利用のための目的遺伝子の発現を活
性化する調節遺伝子、 ｄ）発現を高めるように修飾され調節領域を有する１コ
ピーの天然遺伝子、および、 ｅ）変異型、改変型またはキメラ型の窒素同化または利
用酵素を発現するトランスジーン、の少なくとも１つを
用いて植物を遺伝子操作することによって達成され得
る。

【００１５】本発明の別の実施態様においては、窒素同
化または利用酵素の発現パターンが改変される。このよ
うな発現パターンの改変は、例えば、 ａ）酵素のコーディング配列が所望の発現パターンを有
するプロモーター（例えば、器官特異的または生育ステ
ージ特異的発現パターンを示すプロモーター）に機能し
得る状態で結合されているトランスジーン、 ｂ）酵素をコードする遺伝子の好ましいパターンでの発
現を活性化する修飾調節遺伝子、 ｃ）好ましいパターンで発現するように修飾された調節
領域を有する、１コピーの天然遺伝子、の少なくとも１
つを用いて植物を遺伝子操作することによって達成され
得る。

【００１６】本発明のさらに別の実施態様においては、
窒素同化または利用経路において改変された酵素または
異なる型の酵素が発現される。この型の実施態様には、
宿主植物の窒素同化または利用酵素の触媒作用とは異な
る触媒作用を有する対応酵素をコードする、植物細胞中
で発現可能な遺伝子構築物を作製し、これにより植物を
遺伝子操作することが含まれる。このような手段をとる
ことにより、増強された遊離アミノ酸を含有する植物が
得られる。また、このような植物を育成するために伝統
的な作物育種法では大きな分離集団のスクリーニングを
必要とし、多大の時間を要するところ、本発明によれば
このような手段をとることによりこうしたことを回避す
ることができる。

【００１７】以下は本明細書において使用される用語お
よび略語の定義である。 ＣａＭＶ３５Ｓ ＝ カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター ＮＡＤＰ−ＧＤＨ ＝ ＮＡＤＰ依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ＮＡＤ−ＧＤＨ ＝ ＮＡＤ依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼ 遺伝子融合体 ＝ 異種遺伝子が連結されたプロモーターを含む遺伝子構 築物（前記プロモーターは異種遺伝子の転写を調節する） 異種遺伝子 ＝ 遺伝子構築において、異種遺伝子はその遺伝子が自然 に連結されていないプロモーターに連結されていることを意味する。異種遺伝子 は前記プロモーターを寄与する生物からのものであってもよく、またそうでなく てもよい。 ＧＡＢＡ ＝ γ−アミノ酪酸

【００１８】本発明に使用できる酵素遺伝子は、細菌、
酵母、藻類、動物および植物由来であってよく、これら
に限定されず、様々な供給源から得ることができる。そ
のような供給源から得られた配列は植物細胞内で機能す
る適切なプロモーターと機能可能に連結させることがで
き、また宿主植物におけるそれらの翻訳効率を高めるた
め、あるいはコードされた酵素の触媒作用を変えるため
にｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発またはｄｅ ｎｏｖｏ
合成によって改変してもよい。これらの改変には基質お
よび／または触媒作用に関与する残基の修飾が含まれる
が、これらに限られない。さらに、導入遺伝子は発現さ
れる宿主あるいはオルガネラのコドン使用頻度に応じて
最適なコドンを有するように改変してもよい。また、必
要に応じてこれらの遺伝子配列に適切なトランジットペ
プチドをコードする核酸配列を連結してもよい。好まし
い改変には、ハイブリッド酵素の構築も含まれる。例え
ば、同一の、または異なる生物から得られた関連酵素の
異なるドメインを組み合わせて新規な性質を有する酵素
が作製されることもある。さらに、所望の活性を有する
限り、上述した様々な核酸配列にストリンジェントな条
件でハイブリダイズする核酸断片も本発明に使用するこ
とができる。したがって、１以上のアミノ酸が欠失、付
加、置換されたタンパク質をコードする核酸断片が含ま
れる。「ストリンジェントな条件」とはＳａｍｂｒｏｏ
ｋら（１９８９、前述）に記載されているような、当業
者によく知られた一般的な条件をいう。そのような条件
でハイブリダイズする核酸配列は一般に６０％、好まし
くは８０％、特に好ましくは９０％以上のホモロジーを
互いに有しているであろう。

【００１９】本発明に使用できる窒素同化または利用酵
素遺伝子には既に述べたような種々の遺伝子が含まれる
が、グルタミン酸を蓄積させるために利用できる好まし
い遺伝子の一つの例としては、グルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子が挙げられる。ＧＤＨ遺伝子が
使用される場合はセンス方向で発現される。ＧＤＨ遺伝
子が選ばれる場合は、５’側にトランジットペプチドを
結合した融合遺伝子として発現させるのが好ましく、特
に好ましいトランジットペプチドはミトコンドリアへの
トランジットペプチドおよびクロロプラストへのトラン
ジットペプチドである。本発明の好ましい実施態様の一
つにおいては、カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕ
ｌａｎｓ）由来のＮＡＤＰ依存型ＧＤＨ遺伝子（Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１８，１０５，１９
８９）または、トマト由来のＮＡＤ依存型ＧＤＨ遺伝子
（Ｐｕｒｎｅｌｌら、１９９７，Ｇｅｎｅ １８６；２
４９−２５４）をコードする配列に、機能的に連結され
た強力な構成的植物プロモーターであるカリフラワーモ
ザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターをコー
ドする組換え構築物を用いて、トマト植物を遺伝子工学
的に操作した実施例により説明される。ＧＤＨを過剰発
現する系統は、対象の親植物よりも遊離アミノ酸含量の
増加、特にグルタミン酸含量の増加（２〜３倍）が見ら
れる。

【００２０】本発明に使用し得る核酸構築物は当業者に
公知の方法を使用して作成し得る。例えば、構築物の成
分を単離、特性決定、その操作および構築物それ自体を
作るのに使用しうる組換えＤＮＡ法については、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ−
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓのような出典を参考にし得る。所望の成
分の塩基配列が知られているような場合には生物起源か
らそれを単離するのではなく合成することが有利であ
る。この様な場合当業者はＣａｒｕｔｈｅｒｓら、１９
８０，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅ
ｒ．７：２１５−２３３及びＣｈｏｗ及びＫｅｍｐｅ，
１９８１，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．９：２８０７
−２８１７のような文献を参考にすることができる。そ
の他の場合、所望の成分はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）増幅により有利に生産しうる。ＰＣＲ法について
は、当業者は、Ｇｅｌｆａｎｄ，１９８９，ＰＣＲ技
術、ＤＮＡ増幅に関する原理及び応用、Ｈ．Ａ．Ｅｒｌ
ｉｃｈ編集、ストックトンプレス，Ｎ．Ｙ．、分子生物
学における現行のプロトコル、２巻、１５章、Ａｕｓｕ
ｂｅｌら編集、ジョンウイリイ＆サンズ，１９８８を参
考にし得る。

【００２１】本発明に使用される遺伝子構築物は、一般
に、目的遺伝子の他に植物細胞内で機能する適切なプロ
モーター、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターのよ
うな適切なターミネーター、その他の発現制御に有用な
エレメント、および、形質転換体を選抜するための適切
なマーカー遺伝子、例えばカナマイシン耐性、Ｇ４１８
耐性、ハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子を含
んでいる。この構築物に含まれるプロモーターは構成的
プロモーターであっても器官特異的若しくは生育特異的
であってもよく、使用する宿主、遺伝子、必要とする発
現量、発現させるべき器官、生育ステージ等に応じて選
択することができる。本発明によれば、窒素同化または
利用酵素の過剰発現を示す植物は、所望の酵素をコード
する配列に連結された植物プロモーターを含む遺伝子構
築物で植物細胞を形質転換することにより作製すること
ができる。本発明の好ましい実施態様において使用され
る関連プロモーターは強力かつ非器官特異的または非生
育ステージ特異的プロモーター（例えば、多くまたは全
ての組織中で強く発現するプロモーター）である。この
様な強力な構成的プロモーターの例として、ＣａＭＶ３
５Ｓプロモーターが挙げられる。

【００２２】本発明の別の実施態様において、器官特異
的または生育ステージ特異的プロモーターを所望の酵素
をコードする配列に結合させた遺伝子構築物で植物を操
作するのが有利なことがある。例えば、光合成組織及び
器官中の発現が所望される場合は、リブロースビスフォ
スフェートカルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）遺伝子
又は葉緑体ａ／ｂ結合蛋白質（ＣＡＢ）遺伝子のプロモ
ーターが使用しうる。種子中の発現が所望される場合
は、種々の種子貯蔵蛋白質遺伝子のプロモーターを使用
することができ、果実中での発現が所望される場合は、
果実特異的プロモーター（例えばトマトの２Ａ１１）を
使用することができ、塊茎中での発現が所望される場合
は、塊茎貯蔵蛋白質遺伝子のプロモーター（例えばポテ
トのパタチン）を使用することができる。

【００２３】本発明の更に別の実施態様において、誘導
プロモーターを所望の酵素をコードする配列に結合させ
た遺伝子構築物で植物を形質転換する事が有利であり得
る。この様なプロモーターの例は多岐にわたる。例え
ば、熱ショック遺伝子、防御応答遺伝子（例：フェニル
アラニンアンモニアリアーゼ遺伝子）、傷害応答遺伝子
（例：ヒドロキシプロリンに富む細胞壁蛋白質遺伝
子）、化学誘導遺伝子（例：ニトレート還元酵素遺伝
子、キチナーゼ遺伝子）、暗所誘導遺伝子（例：アスパ
ラギンシンテターゼ遺伝子（ＣｏｒｕｚｚｉおよびＴｓ
ａｉ、ＵＳ５，２５６，５５８）が挙げられるがこれら
に限定されない。

【００２４】本発明の組換え核酸構築物は、その構築物
の伝達追跡のための選択可能なマーカーを含んでもよ
い。例えば、細菌中で伝達される構築物は抗生物質耐性
遺伝子、例えばカナマイシン、テトラサイクリン、スト
レプトマイシン、またはクロラムフェニコール対する耐
性を与える遺伝子を含むことが好ましい。構築物を伝達
するのに適したベクターとして、プラスミッド、コスミ
ド、バクテリオファージまたはウイルスが挙げられる。
加えて、組換え構築物は、これらの構築物により形質転
換された植物細胞の単離、同定または追跡のための植物
発現性の選択可能なマーカー遺伝子又はスクリーニング
可能なマーカー遺伝子を含んでも良い。選択可能なマー
カーとして、抗生物質耐性（例えば、カナマイシンまた
はハイグロマイシンに対する耐性）、または除草剤耐性
（例えば、スルフォニル尿素、フォスフィノスリシン、
またはグリフォセートに対する耐性）を与える遺伝子が
挙げられるが、これらに限定されない。スクリーニング
可能なマーカーとして、β−グルクロニダーゼをコード
する遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，１９８７，Ｐｌａｎ
ｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ ５：３８７−４０
５）、ルシフェラーゼをコードする遺伝子（Ｏｗら、１
９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：８５６−８５９）、
アントシアニン色素産生を調節するＢ及びＣ１遺伝子産
物（Ｇｏｆｆら、１９９０，ＥＭＢＯ Ｊ，９：２５１
７−２５２２）が挙げられるがこれらに限定はされな
い。

【００２５】本発明に使用できる遺伝子導入法は特に限
定されず、植物細胞あるいは植物体への遺伝子導入法と
して当業者に知られるいずれの方法を使用してもよい。
例えば、本発明の実施態様の一つにおいて、アグロバク
テリウムが遺伝子構築物を植物に導入するのに用いられ
る。この様な形質転換は２成分アグロバクテリウムＴ−
ＤＮＡベクター （Ｂｅｖａｎ，１９８４，Ｎｕｃ．ａ
ｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１）、および
同時培養操作（Ｈｏｒｓｃｈら、１９８５，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２２７：１２２９−１２３１）を使用することが
望ましい。一般に、アグロバクテリウム形質転換系が双
子葉植物を操作するのに使用される（Ｂｅｖａｎｓら、
１９８２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１６ ：３
５７−３８４；Ｒｏｇｅｒｓら、１９８６，Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１８：６２７−６４１）。
アグロバクテリウム形質転換系はまた単子葉植物および
植物細胞を形質転換するのに使用することもできる（Ｈ
ｅｒｎａｌｓｔｅｅｎら、１９８４， ＥＭＢＯ
Ｊ．，３：３０３９−３０４１；Ｈｏｙｋａｓｓ−Ｖａ
ｎ Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，
３１１：７６３−７６４；Ｇｒｉｍｓｌｅｙら、９８
７，Ｎａｔｕｒｅ，３２５ ：１６７−１６７９；Ｂｏ
ｕｌｔｏｎら、１９８９，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１２：３１−４０； Ｇｏｕｌｄら、１９９１，
Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９５： ４２６−４３
４）。植物を形質転換するためにアグロバクテリウム系
を利用する場合は、組換えＤＮＡ構築物は植物細胞に導
入すべきＤＮＡ配列に隣接する位置に、Ｔ−ＤＮＡ領域
の少なくとも右ボーダー配列を更に含む。好ましい実施
態様においては、移入される配列は左右のＴ−ＤＮＡボ
ーダー配列の間に挿入される。この様なＴ−ＤＮＡをベ
ースとする形質転換ベクターの適切な設計及び構築は当
業者に公知である。

【００２６】別の実施態様において、組換え核酸構築物
を植物および植物細胞に導入する為の種々の別法を使用
することができる。別の遺伝子導入法および形質転換方
法として、裸のＤＮＡの、カルシウム、ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）またはエレクトロポレーション介在
性取り込みによるプロトプラスト形質転換（Ｐａｓｚｋ
ｏｗｓｋｉら、１９８４，ＥＭＢＯ Ｊ．，３：２７１
７−２７２２；Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５，Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１６９−１７７；
Ｆｒｏｍｍら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：５８２４−５８２８ ；Ｓ
ｈｉｍａｍｏｔｏら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３３
８：２７４−２７６）が挙げられる。本発明によれば、
多種の植物及び植物細胞系が本発明の核酸構築物および
上記の形質転換方法を使用して本明細書に記載された所
望の生理学的特性につき操作しうる。これらの方法は、
標的が単子葉植物または植物細胞である場合に特に有益
である。好ましい実施態様において、操作のための標的
植物および植物細胞として、トマト、ポテト、ビート、
ダイズ、アラビドプシス、トウモロコシ、小麦、イネ、
サトウキビ等が挙げられるが、これらに限定されない。

【００２７】本発明によれば、本明細書に開示されたよ
うな遺伝子構築物を、プロトプラスト、組織培養細胞、
組織及び器官外殖体、花粉、胚ならびに植物全体を含む
がこれらに限定されない種々の植物細胞型に導入および
操作することにより所望の植物が得られる。本発明の実
施態様において、操作された植物体は下記のアプローチ
および方法に従って形質転換体につき選択又はスクリー
ニングされる。次に単離された形質転換体を植物個体に
再生させてもよい。植物細胞、組織または器官から植物
個体に再生するための方法は、多くの植物種において当
業者に公知である。

【００２８】形質転換された植物細胞、カルス、組織ま
たは植物は、形質転換に用いた遺伝子構築物に存在する
マーカー遺伝子によりコードされた形質につき選択又は
スクリーニングする事により同定され、単離することが
できる。例えば、形質転換遺伝子構築物が耐性を与える
ような抑制量の抗生物質または除草剤を含む培地で操作
された植物体を生育させることにより、選択を行うこと
ができる。更に形質転換された植物細胞および植物は、
本発明の組換え核酸構築物に存在しうる可視のマーカー
遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ遺伝子、ルシフ
ェラーゼ遺伝子、Ｂ遺伝子またはＣ１遺伝子）の活性に
つきスクリーニングする事により同定しうる。この様な
選択方法およびスクリーニング方法は当業者に公知であ
る。

【００２９】また、本発明の遺伝子構築物を含む植物ま
たは植物細胞形質転換体を同定するために物理的方法お
よび生化学的方法が使用しうる。そのような方法とし
て、 １）組換えＤＮＡインサートの構造を検出および測定す
るためのサザン分析またはＰＣＲ増幅； ２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写産物を検出および測定す
るためのノーザンブロット、Ｓ１ＲＮａｓｅ保護、プラ
イマー伸長ＰＣＲ増幅または逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−
ＰＣＲ）増幅； ３）遺伝子構築産物が蛋白質である場合は、蛋白質ゲル
電気泳動、ウエスタンブロット、免疫沈殿、またはエン
ザイムイムノアッセイが挙げられるが、これらに限定さ
れない。これらのアッセイ方法は全て当業者に公知であ
る。

【００３０】本発明によれば、改良された成分特性を有
する植物を得るため、形質転換された植物を所望の生理
学的変化に関してスクリーニングしてよい。例えば、Ｇ
ＤＨ酵素の過剰発現に関して操作した場合、形質転換さ
れた植物は、所望のレベルで所望の組織および生育段階
でＧＤＨ酵素を発現する植物について試験されるであろ
う。次に、所望の生理学的変化、例えば、ＧＤＨ遺伝子
の過剰発現を示す植物を、所望の成分変化について引き
続きスクリーニングすることができる。本発明によれ
ば、窒素同化プロセスまたは利用プロセスの変化で操作
された植物は、改良された成分特性、すなわち、遊離ア
ミノ酸高含有、特にグルタミン酸、アスパラギン、アス
パラギン酸、セリン、スレオニン、アラニン、ヒスチジ
ン、とりわけうま味成分であるグルタミン酸高含有を示
しうる。この様な改良された特性を有する操作された植
物および植物系統は、植物の遊離アミノ酸含量を測定す
る事により同定しうる。この分析のための操作および方
法は当業者に公知である。本発明によって得られる植物
は、遊離アミノ酸含量において対照植物（非形質転換植
物）に対して増加した植物である。好ましい実施態様に
おいて、所望の植物は、その果実、根、種子等の可食部
分での遊離アミノ酸含量、とりわけうま味成分であるグ
ルタミン酸含量が２倍以上の増加を示し、全アミノ酸量
も２〜４倍に増加する。グルタミン酸以外のアミノ酸に
ついては、特に、アスパラギン酸、アスパラギン、アラ
ニン、セリン、スレオニンおよびヒスチジンの増加が著
しい。

【００３１】

【実施例】本発明は、ＮＡＤＰ−ＧＤＨ遺伝子またはＮ
ＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の過剰発現につき操作された植物の
作製に関する以下の実施例により具体的かつ詳細に説明
される。実施例１：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ
およびトマトのＧＤＨ遺伝子の単離とＴｉプラスミッド
の構築 （１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来
ＮＡＤＰ依存型ＧＤＨ遺伝子（ＡＮ−ｇｄｈ−１７）お
よびトマト由来ＮＡＤ依存型ＧＤＨ遺伝子（Ｔ−ｇｄｈ
−４）の単離 Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓをポテトデキストロース寒天培地
にまき、一晩３０℃で培養し、さらに得られたコロニー
をデキストロース液体培地で２日間培養した。増殖した
菌よりＴｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。７０％エタノー
ル（３０秒）、２％次亜塩素酸ナトリウム（１５分）を
用いて表面殺菌したトマト種子を植物ホルモンを含まな
いＭＳ寒天培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏ
ｇ、１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５：４
７３−４７９）に植え、１６時間日長、２５℃で１週間
培養し、無菌植物を得た。得られた幼植物の根よりＴｏ
ｔａｌ ＲＮＡを調製した。

【００３２】Ｔｏｔａｌ ＲＮＡはＰｏｌｙ（Ａ）Ｑｕ
ｉｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてｍＲＮＡを精製した後、
Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｈｅｃｈ社）を用いてＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａ
ｎｄ ｃＤＮＡを作成した。作成したＦｉｒｓｔ−Ｓｔ
ｒａｎｄ ｃＤＮＡをテンプレートに用いてＰＣＲ反応
を行ったＰＣＲ反応条件は９４℃−３分；９４℃−４５
秒、５９℃−３０秒、７２℃−９０秒、３５サイクル；
７２℃−１０分とし、パーキンエルマー社のＰＣＲｓｙ
ｓｔｅｍ ２４００を用いて行った。用いたプライマー
を表−１に示した。その結果、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ由
来の約１．４ｋｂｐのバンド、およびトマト由来の約
１．２ｋｂのバンドが増幅され、それぞれ予測される目
的遺伝子サイズと一致した。得られたＰＣＲ産物はＴＡ
−Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
を用いてクローニングした。

【００３３】Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ由来の目的サイズの
遺伝子がクローニングできたプラスミッド２クローンお
よびトマトの根由来の目的サイズの遺伝子がクローニン
グできたプラスミッド５クローンの配列をシークエンサ
ー（ＡＢＩ社３７７Ａ）を用いて決定し、既知のＡ．ｎ
ｉｄｕｌａｎｓ由来ＮＡＤＰ依存型ＧＤＨ遺伝子（Ａｌ
ａｓｔａｉｒら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，１９８
９，２１８；１０５−１１１）およびトマト由来ＧＤＨ
遺伝子（Ｐｕｒｎｅｌｌら、１９９７，Ｇｅｎｅ１８
６；２４９−２５４）との相同性について調査した。
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ由来の２クローン中１クローン
（ＡＮ−ｇｄｈ−１７）の塩基配列が既知のＮＡＤＰ−
ＧＤＨ遺伝子配列と一致した（図１，２）．しかし、そ
の遺伝子には２箇所存在するスプライシングサイトのう
ち、約５０ｂｐのスプライシングサイトが１つ残存して
いることが分かった。Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓは真核生物
型のスプライシングサイト認識部位を持つため、本実験
では残存するスプライシングサイトを残したまま次の操
作に入ることにした。一方、トマトの根由来の５クロー
ン中、２クローン（Ｔ−ｇｄｈ−４，Ｔ−ｇｄｈ−２
２）の塩基配列が既知のｌｅｇｄｈ１配列と一致した。
ＡＮ−ｇｄｈ−１７の塩基配列を配列表の配列番号１
に、Ｔ−ｇｄｈ−４の塩基配列を配列表の配列番号２に
示した。

【００３４】

【表１】 ａ．ＮＡＤＰ−ＧＤＨ遺伝子特異的プライマー（Ａｌａ
ｓｔａｉｒら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，１９８
９，２１８；１０５−１１１，ＰＣＲ産物、約１．４ｋ
ｂｐ） ｂ．ｌｅｇｄｈ１特異的プライマー（Ｐｕｒｎｅｌｌ
ら、１９９７，Ｇｅｎｅ１８６；２４９−２５４，ＰＣ
Ｒ産物、約１．２ｋｂｐ） ＜配列表フリーテキスト＞ 配列番号３および４：ＮＡＤＰ−ＧＤＨ特異的ＰＣＲプ
ライマー 配列番号５および６：ｌｅｇｄｈ１特異的ＰＣＲプライ
マー

【００３５】（２）ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子のＴｉプ
ラスミッド（ｐＭＡＴ０３７）へのサブクローニング ＰＣＲ２．１ベクターにクローニングしたＡＮ−ｇｄｈ
−１７遺伝子を、植物形質転換用ベクターである、Ｔｉ
プラスミッド（ｐＭＡＴ０３７）（Ｍａｔｓｕｏｋａお
よび Ｎａｋａｍｕｒａ，１９９１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ
ｌ．ＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ ８８：８３４−８３８）
にサブクローニングした。直接挿入するするのに適切な
制限酵素サイトがｐＭＡＴ０３７に無いため、一度ｐＵ
Ｃ１８につなぎ（ＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩサイト使用）、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。さらにｐＵ
Ｃ１８中のＰｓｔＩサイトとＥｃｏＲＩサイトを用いて
Ｔｉプラスミッドへ連結しプラスミッドｐＡＮ−ｇｄｈ
−１７を得（図３、表２）Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αにト
ランスフォーメーションした。ＡＮ−ｇｄｈ−１７を導
入したＴｉプラスミッドｐＡＮ−ｇｄｈ−１７（図３）
でグロバクテリウム株ＥＨＡ１０１を形質転換し、得ら
れたアグロバクテリウムをトマトに感染させるために用
いた。

【００３６】（３）ｐＣｔ−ＡＮ−ｇｄｈ、ｐＣｔ−ｄ
ＡＮ−ｇｄｈ、ｐＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈの構築 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｒａｎｓ由来ＮＡＤ
Ｐ−ＧＤＨ遺伝子には本来、スプライシングサイトが２
箇所存在する。ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりＧＤＨ
遺伝子の増幅を行ったので、これらのスプライシングサ
イトは除かれ、存在しないはずであるが、本実験で取得
したＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子には、約５０ｂｐのスプ
ライシングサイトが１箇所残ったままであった（図１、
塩基配列中に記載）。そこでＰＣＲ法を用いて、残った
ままであった約５０ｂｐの塩基配列を取り除いた（表
２、図４、５）

【００３７】これらの遺伝子構築物の構築手順の概略は
図５に示した通りである。すなわち、最初に、クローニ
ングされた上記遺伝子配列の５’端を含むプライマーＰ
１およびスプライシング領域の５’側と３’側を含むが
スプライシング領域を含まないプライマーＰ２、および
スプライシング領域の５’側と３’側を含むがスプライ
シング領域を含まないプライマーＰ３とＡＮ−ｇｄｈ−
１７遺伝子の３’端を含むプライマーＰ４を用いて、そ
れぞれＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を鋳型としてＰＣＲに
よってＤＮＡ断片を増幅した。次に、電気泳動によりＰ
ＣＲ産物のサイズの確認およびゲルからの再抽出を行っ
た。それぞれの再抽出ＰＣＲ産物を混合し、プライマー
Ｐ１およびＰ４を用いて再度ＰＣＲ反応を行った。得ら
れたＰＣＲ産物をクローニングし、シークエンシングを
行い、スプライシング領域が正しく除去されていること
を確認した。

【００３８】上述のＰ１〜Ｐ４の配列を以下に示す。 これらの操作により、スプライシングサイトを除去した
ｄＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を得た（表２、図４、
５）。更に導入遺伝子を適所でより機能的に働かせるた
めに、ミトコンドリアまたはクロロプラストへのトラン
ジットペプチド配列をＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子又はｄ
ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子の開始コドンの上流側に連結
させた（表２、図４）。用いたペプチド配列はミトコン
ドリアへのトランジットペプチド配列としてトマト由来
ＧＤＨ遺伝子に付加している約７０ｂｐからなる塩基配
列を、クロロプラストへのトランジットペプチド配列と
して、トマト由来ＲｕＢｉｓＣＯの小サブユニット遺伝
子に付加している約１２０ｂｐからなる塩基配列を用い
た。また、これらの遺伝子とＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子
又はｄＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子の連結はＰＣＲ法を用
いて行った。ミトコンドリアへのトランジットペプチド
配列は、２種のプライマー（５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧ
ＡＡＴＧＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＡＡＣ−３’：配列番号
１１、５’−ＴＣＴＡＧＡＴＡＡＡＣＣＡＡＧＡＡＧＣ
ＣＴＡＧＣＴＧ−３’：配列番号１２）を使用しＰＣＲ
によって得た。クロロプラストへのトランジットペプチ
ド配列は、２種のプライマー（５’−ＣＴＧＣＡＧＡＴ
ＧＧＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＣＧ−
３’：配列番号１３、５’−ＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＣＴ
ＡＡＣＧＣＧＴＣＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴ−３’：配列番
号１４）を使用しＰＣＲによって得た。

【００３９】これらのトランジットペプチド配列のＡＮ
−ｇｄｈ−１７遺伝子又はｄＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子
への結合は図６に示したように行った。すなわち、トラ
ンジットペプチドの５’側に対応するプライマーＰ５と
トランジットペプチドの３’端およびＡＮ−ｇｄｈ−１
７遺伝子又はｄＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子の５’端の配
列を含むプライマーＰ６、およびトランジットペプチド
の３’端およびＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子またはｄＡＮ
−ｇｄｈ−１７遺伝子の５’端の配列を含むプライマー
Ｐ７およびＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子またはｄＡＮ−ｇ
ｄｈ−１７遺伝子の３’端配列を含むプライマーＰ８を
用いてそれぞれのＤＮＡ断片を増幅後、電気泳動により
ＰＣＲ産物のサイズの確認およびゲルからの抽出を行っ
た。抽出したそれぞれの断片を混合し、プライマーＰ５
とＰ８を用いて再度ＰＣＲを行った。増幅された断片を
クローニングしシーケンシングを行い、トランジットペ
プチドの塩基配列がＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子またはｄ
ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子に正しく付加されていること
を確認した（図６）。

【００４０】ここで、Ｐ５からＰ８の配列は以下に対応
する。ミトコンドリアへのトランジットペプチド配列と
の連結の際に用いたプライマーの場合は であり、クロロプラストへのトランジットペプチド配列
との連結の際用いたプライマーの場合は である。

【００４１】ここで、ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子はＴｉ
プラスミッドｐＭＡＴ０３７のマルチクローニングサイ
トにセンス方向に導入したが（図２）、ｐＣｔ−ＡＮ−
ｇｄｈ、ｐＣｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ、ｐＭｔ−ｄＡＮ−ｇ
ｄｈの構築に際してはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを用
いた場合と後述する果実特異的プロモーター遺伝子（２
Ａ１１）を用いた場合との導入遺伝子の効果を比較する
ためＴｉプラスミッドｐＩＧ１２１−Ｈｍを用いてクロ
ーニングを行い、遺伝子導入を行った（表２、図４）。 ＜配列表フリーテキスト＞ 配列番号７〜１０：スプライシング領域除去のためのＰ
ＣＲプライマー 配列番号１１および１２：ミトコンドリアへのトランジ
ットペプチドをコードする配列増幅用のＰＣＲプライマ
ー 配列番号１３および１４：クロロプラストへのトランジ
ットペプチドをコードする配列増幅用のＰＣＲプライマ
ー 配列番号１５〜１８：ミトコンドリアトランジットペプ
チド−ＧＤＨをコードする配列の作製のためのＰＣＲプ
ライマー 配列番号１９〜２２：クロロプラストトランジットペプ
チド−ＧＤＨをコードする配列の作製のためのＰＣＲプ
ライマー

【００４２】（４）果実特異的プロモーター（２Ａ１１
プロモーター）を用いた遺伝子構築 果実特異的発現プロモーター（２Ａ１１）はトマトの幼
植物より調製したＴｏｔａｌ ＤＮＡをテンプレートに
用いて、ＰＣＲ法により取得した。用いたプライマー
（配列番号２３および配列番号２４）にはＴｉプラスミ
ッドに導入する際に用いる制限酵素サイト、ＨｉｎｄＩ
ＩＩおよびＸｂａＩの配列を各々のプライマーに設計し
た。プライマーの配列を以下に示す： 得られたＰＣＲ産物はＴＡクローニングキットを用いて
クローニングした後、シークエンス分析によって塩基配
列の確認を行った。得られた２Ａ１１プロモーターは上
記、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いてＴ
ｉプラスミッドｐＩＧ１２１−ＨｍのＧＵＳ遺伝子前の
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと置換した。その後、ＧＵ
Ｓ部分とＣｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ遺伝子またはＭｔ−ｄＡ
Ｎ−ｇｄｈ遺伝子との置換を行った。Ｃｔ−ｄＡＮ−ｇ
ｄｈ遺伝子またはＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ遺伝子の置換手
順についてはＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを用いた場
合と同様である。これにより、プラスミッドｐ２ＡＣｔ
−ｄＡＮ−ｇｄｈおよびＰ２ＡＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈを
得た（図７）。 ＜配列表フリーテキスト＞ 配列番号２３および２４：２Ａ１１プロモーター配列増
幅用ＰＣＲプライマー上述した手順により作製したプラ
スミッドの重要な構造を以下の表２にまとめた。

【００４３】

【表２】

【００４４】（５）Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子のＴｉプラス
ミッド（ｐＩＧ１２１−Ｈｍ）へのサブクローニング クローニングしたトマト由来ＧＤＨ遺伝子（Ｔ−ｇｄｈ
−４）をＴｉプラスミッド（ｐＩＧ１２１−Ｈｍ）に導
入しプラスミッドｐＴ−ｇｄｈ−４を得た。導入に際し
ては、単離の際に使用したプライマーに予め設けておい
たＸｂａＩサイトおよびＳａｃＩサイトを用いた。Ｔ−
ｇｄｈ−４遺伝子を導入したＴｉプラスミッド（図８）
は、アグロバクテリウム株ＥＨＡ１０１に形質転換し
た。

【００４５】（６）変異型トマトＧＤＨ遺伝子のＴｉプ
ラスミッド（ｐＩＧ１２１−Ｈｍ）へのサブクローニン
グ トマト由来ＮＡＤ−ＧＤＨにおいて、グルタミン酸結合
部位の９０番目のアミノ酸リジンをアラニンに置換し、
その効果について調査した（図９）。これは、高等植物
のＧＤＨ遺伝子がアンモニアイオン濃度や栄養条件によ
って、グルタミン酸を減少させる方向に働く可能性が有
るため、結合できなくすることを目的とした改変であ
る。１アミノ酸の置換はＰＣＲを利用した部位特異的変
異導入により、ＬｙｓをコードするＡＡＧをＡｌａをコ
ードするＧＣＧに変換することによって行った。得られ
た改変遺伝子をＴｄ−ｇｄｈと命名した。次に、Ｔｄ−
ｇｄｈ遺伝子配列をＴｉプラスミッドへ導入してプラス
ミッドｐＴｄ−ｇｄｈを得た（図９）。この手順はＴ−
ｄｇｈ−４遺伝子の場合と同様である。

【００４６】実施例２．トマトの子葉片へのアグロバク
テリウム感染による形質転換体の作製 トマト（栽培品種、ミニトマト）の種子を７０％エタノ
ール（３０秒）、２％次亜塩素酸ナトリウム（１５分）
を用いて表面殺菌した後、植物ホルモンを含まないＭＳ
寒天培地に置床し、１６時間日長、２５℃で１週間培養
した。得られた無菌幼植物より子葉を切り取り、２ｍｇ
／ｌゼアチンと０．１ｍｇ／ｌインドール酢酸を加えた
ＭＳ寒天培地（再分化培地、９ｃｍシャーレ使用）に置
床し２日間同条件で培養した。構築した遺伝子を含むア
グロバクテリウム（ＥＨＡ１０１）はＹＥＰ培地（表−
３）で一晩培養したものを感染に用いた。２日間培養し
た子葉を滅菌シャーレに集めアグロバクテリウム液を加
え感染させた。滅菌したろ紙を用いて余分なアグロバク
テリウム液を子葉から取り除き、さらに、アグロバクテ
リウムの急激な増殖を防ぐため、先に用いたシャーレ培
地に滅菌ろ紙を敷き、その上に感染させた子葉を乗せ、
２４時間共存培養した。

【００４７】その後、子葉を５０ｍｇ／ｌカナマイシ
ン、５００ｍｇ／ｌクラフォランを含むＭＳ再分化培地
（選抜培地）に移し、形質転換体の選抜を行った。再分
化したシュートを新しい選抜培地に移し再選抜を行っ
た。緑色で旺盛に生育したシュートを茎の部分で切り取
り、植物ホルモンを含まないＭＳ培地（発根培地，試験
管）に移した。発根した再分化植物を順次土壌に馴化さ
せた。

【表３】

【００４８】実施例３．減圧浸潤法によるアラビドプシ
スの形質転換 アラビドプシスへの遺伝子導入はＢｅｃｈｔｏｌｄ Ｎ
（Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ，Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６；１１９４−１１９９，１９９
３）の方法を改編して用いた。培養土にアラビドプシス
の種子をまき１０日間、１６時間日長、２２℃栽培した
幼植物をロックウール（３ｃｍ×３ｃｍ）１個に１株ず
つ移植し、３週間同条件で栽培した。植物が抽だいを始
めたら摘心し、さらに一週間栽培を行った。アグロバク
テリウムは抗生物質を含むＹＥＰ培地で２４時間、２８
℃で培養し、遠心（７０００ｒｐｍ、１０分）によって
集菌し、浸潤用懸濁培地（１／２ ＭＳ塩、１／２ Ｇ
ａｍｂｏｒｇ Ｂ５ビタミン、５％ショ糖、０．５ｇ／
ｌ ＭＥＳ、０．０４４μＭ ベンジルアミノプリン、
ｐＨ ５．７）に懸濁した。すでに開花・結実している
花を取り除き、アグロバクテリウム懸濁液に漬け、デシ
ケーター中に入れ、１５分間減圧（４０ｍｍＨｇ）処理
を行った。処理した植物は１カ月間栽培した後種子を収
穫した。採取した種子は５０ｍｇ／ｌカナマイシン、２
００ｍｇ／ｌクラフォランを添加したＭＳ培地にまき、
形質転換体の選抜を行った。

【００４９】実施例４．導入遺伝子の確認 ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を含むアグロバクテリウムを
感染させて得られた選抜個体４個体、Ｔ−ｇｄｈ−４遺
伝子を含むアグロバクテリウムを感染させて得られた選
抜個体４個体、目的遺伝子を含まないＴｉプラスミッド
のみのアグロバクテリウムを感染させて得られた植物各
々３個体、およびアグロバクテリウムで処理せずに子葉
より直接再分化させた植物体２個体からそれぞれＴｏｔ
ａｌ ＤＮＡを本田らの方法に従い抽出した（Ｈｏｎｄ
ａおよびＨｉｒａｉ、１９９０、Ｊｐｎ Ｊ Ｂｒｅｅ
ｄ ４０，３３９−３４８）。抽出したＤＮＡはＲＮＡ
ａｓｅ処理、フェノール／クロロホルム処理、さらにＰ
ＥＧ沈殿させ精製した。０．０１μｇ／μｌになるよう
に希釈し、ＰＣＲ用のテンプレートとした。ＰＣＲはＮ
ｏｓ−ＰｒｏｍｏｔｅｒからＮＰＴＩＩの領域を増幅す
るプライマーＰ９およびＰ１０（ＰＣＲ産物、１．０ｋ
ｂｐ）を用いて行なった。反応条件は、９４℃−１分、
５５℃−１分、７２℃−２分、３５サイクルで行った。
ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルを用いて電気泳動し、
エチジウムブロマイドで染色した（図１０および１
１）。使用したプライマーは以下の通りである。

【００５０】その結果、ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を感
染させた４系統に、Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子を感染させた
４系統に目的サイズのバンド（１．０ｋｂ）が観察さ
れ、非形質転換体２系統には検出されなかった。以上の
結果から、ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を含むＴｉプラス
ミッドを用いて感染させた４系統およびＴ−ｇｄｈ−４
遺伝子を含むＴｉプラスミッドを用いて感染させた４系
統に各々の遺伝子が導入されていることが確認された。 ＜配列表フリーテキスト＞ 配列番号２５、２６：Ｎｏｓ−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＮＰ
ＴＩＩ領域増幅用ＰＣＲプライマー

【００５１】実施例５． 導入遺伝子の発現の確認 次に、目的の遺伝子が導入されたことが確認できた形質
転換トマトにつき、導入遺伝子が発現されていることを
ＲＴ−ＰＣＲによって確認した。ＡＮ−ｇｄｈ−１７ま
たはＴ−ｇｄｈ−４遺伝子を含むアグロバクテリウムを
感染させ、実施例５において遺伝子導入が確認された系
統、および非形質転換トマトの葉または果実から全ＲＮ
Ａを抽出し、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを作
製した。次にＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡをテ
ンプレートとして各々の遺伝子を単離する際に用いたプ
ライマー（配列番号３と４、及び５と６）を用いてＰＣ
Ｒを行なった。反応条件は９４℃−１分、５５℃−１
分、７２℃−２分、３０サイクルとした。その結果、そ
れぞれにおいて、導入した遺伝子が葉および果実のいず
れにおいても発現していることが確認された（図１２、
１３）。

【００５２】実施例６． 遊離アミノ酸の抽出と定量 馴化させた形質転換トマトの開花後６週目の果実を収穫
し、−８０℃に保存した。果実は約１／６にカットし、
重さを測定した後、乳鉢に入れ液体窒素で凍らせすりつ
ぶした。さらに３ｍｌの８０％エタノールを加え、丁寧
にすりつぶした後、遠心チューブに移し、８０℃で２０
分間インキュベートした。１０，０００ｒｐｍで２０分
間遠心し、上澄を新しいチューブに移し、残ったペレッ
トに２ｍｌの８０％エタノールを加え、再度乳鉢ですり
つぶし、８０℃で２０分間インキュベートした。遠心
後、上澄をチューブに移し、先の上澄と併せ、８０％エ
タノールを用いて総量を５ｍｌに調製した。良く混合し
た後、２０μｌ取り乾燥させた後、０．０２Ｎ塩酸に溶
解した。０．４５μｍのフィルターでろ過し、分析用サ
ンプルとした。アミノ酸分析は日立高速アミノ酸分析計
（Ｌ−８８００）を用いて行った。ＡＮ−ｇｄｈ−１７
遺伝子を導入した株の開花後６週間目の果実（赤色）を
用いてアミノ酸分析を行った結果を非形質転換体植物
（対照植物）の分析結果とともに表４に示した。顕著な
グルタミン酸含量の増加が見られた系統においては、Ｎ
ｏ．６で１．７５倍、Ｎｏ．１５で２．５４倍、Ｎｏ．
１７で２．４８倍グルタミン酸含量が増加した（図１
４）。グルタミン酸以外のアミノ酸、例えば、アスパラ
ギン、アスパラギン酸、アラニン、セリン、スレオニ
ン、ヒスチジン等の増加も見られた。

【００５３】

【表４】

【００５４】

【表５】

【００５５】トマト由来のＴ−ｇｄｈ−４遺伝子を導入
した４株についても同じく開花後６週間目の果実を用い
てアミノ酸分析を行った（表５）。顕著なグルタミン酸
含量の増加が見られた系統においては、Ｎｏ．２で２．
２８倍、Ｎｏ．７−２で３．５２倍、Ｎｏ．９−２で
２．７４倍、Ｎｏ．１０で２．５３倍グルタミン酸含量
が増加した（図１５）。グルタミン酸含量が高かった系
統においては、他のアミノ酸、例えば、アスパラギン
酸、アスパラギン、スレオニン、セリン、アラニン、ヒ
スチジンの含量も高く、Ｔｏｔａｌアミノ酸含量におい
て、Ｎｏ．７−２は４倍も増加していることが分かっ
た。これらの結果を以下の表５にまとめた。

【００５６】

【表６】

【００５７】

【表７】

【００５８】実施例７．トマト形質転換体後代（Ｔ_１）
世代の解析 １）Ｔ_１世代の選抜 アグロバクテリウム法により遺伝子導入を行ったトマト
形質転換植物（Ｔ_０世代）より得られた種子を、８０％
エタノールで３０秒，２％次亜塩素酸ナトリウムで１５
分間表面殺菌した後、カナマイシン３５０ｍｇ／ｌを含
むＭＳ寒天培地に無菌播種した。１ヵ月後、生育の良い
植物を選抜した結果、ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子導入系
統では、Ｎｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．１５、Ｎｏ．２．
１から選抜個体が得られた。Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子導入
系統では、Ｎｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．８から選抜個体
が得られた。株当たりの果実数を増加させるため、屋外
の閉鎖系温室で栽培を行った。栄養条件を同じにするた
め、馴化時に１ｋｇの培養土（パワーソイル，サカタの
タネ）に移植した後は、追肥を行わなかった。また、同
化能を同一にするために以下の分析では葉を摘み取ら
ず、腋芽を同一条件で栽培し，その葉組織を用いた。

【００５９】２）サザン分析による導入遺伝子の確認 馴化させた植物の腋芽の葉組織より全ＤＮＡを抽出した
（Ｈｏｎｄａ ａｎｄＨｉｒａｉ １９９０，Ｊｐｎ
Ｊ Ｂｒｅｅｄ ４０，３３９−３４８）。１５μｇの
ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩの組み合わせ
とＸｂａＩで処理し、電気泳動後、ナイロンメンブラン
にトランスファーした。ＤＩＧ−Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａ
ｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用い
て、ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子またはＴ−ｇｄｈ−４遺
伝子をプローブにし、サザンハイブリダイゼーションを
行った。ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子をプローブに用いて
サザンハイブリダイゼーションを行った結果、ＡＮ−ｇ
ｄｈ−１７遺伝子導入系統Ｎｏ．１、３、１５、２．１
系統に目的サイズのバンド（１．８ｋｂ、０．８ｋｂ）
が検出され、導入遺伝子が確認できた（図１６）。同様
にＴ−ｇｄｈ−４遺伝子をプローブに用いてサザンハイ
ブリダイゼーションを行った結果、Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝
子と同じサイズのバンド（１．２ｋｂｐ）が確認され
た。２０ｋｂｐ付近にバンドが見られるものもあり内在
性のｇｄｈ遺伝子と考えられた（図１７）。

【００６０】３）ＮＡＤＰ−ＧＤＨとＮＡＤ−ＧＤＨ活
性の測定 形質転換トマト（Ｔ_１）の腋芽の葉組織（０．２ｇ）を
液体窒素で凍結させ、乳鉢で破砕した後、重量の５倍量
の抽出緩衝液｛２００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），
１４ｍＭ β−メルカプトエタノール，１０ｍＭ Ｌ−
システイン−ＨＣｌ，０．５ｍＭ ＰＭＳＦ，０．５％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００｝を加えた。遠心チューブに
移し、４℃、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心した
後、上清を限外ろ過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ウルトラフ
リー０．５フィルターユニット、バオイマックス−１
０）し、抽出緩衝液で３回洗浄した。抽出した酵素は反
応液｛１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），２０ｍＭ
２−α−ケトグルタル酸，１．０ｍＭ ＣａＣｌ_２，
０．２ｍＭ ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＰ−ＧＤＨ活性測定）
又は０．２ｍＭ ＮＡＤＨ（ＮＡＤ−ＧＤＨ活性測
定），２００ｍＭ塩化アンモニウム｝に混合し、室温で
反応させ、３４０ｎｍにおける吸光度の減少を測定し
た。

【００６１】ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を導入した形質
転換トマト（Ｔ_１）の葉組織を用いて、ＮＡＤＰ−ＧＤ
Ｈ活性を測定した結果、非形質転換体では活性が認めら
れないのに対し、形質転換体は２３０−４００ｎｍｏｌ
／（分・ｍｇタンパク質）の活性が測定できた（表
６）。Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子を導入した系統ではＮＡＤ
−ＧＤＨ活性が非形質転換体に比べて約２倍以上増加し
ていた（表７）。

【００６２】

【表８】

【００６３】

【表９】

【００６４】４）果実中のアミノ酸含量の測定 第一果房の開花後６週目の果実３個を分析に用いた。
果実に８０℃に熱した８０％エタノールを重量の３倍量
加え、乳鉢ですりつぶした後、再度８０℃で２０分間加
熱した。７、０００ｒｐｍで遠心して、上清を回収した
後、再度８０％エタノールを加え、８０℃に加温した。
エタノールによる抽出を３回行い、総量を８０％エタノ
ールで１００ｍｌに合わせた。良く混合した後、抽出液
２００μｌをエッペンドルフチューブに取り、乾燥さ
せ、２００μｌの滅菌水に溶かした。エチルエーテル２
００μｌ加え混合後、１２，０００ｒｐｍで遠心し、エ
ーテル層を取り除いた。水層を再度乾燥させた後、２０
０μｌの０．０２Ｎ ＨＣｌに溶解し、０．４５μｍの
ろ過フィルターを用いてろ過したろ液をサンプルとし、
日立高速アミノ酸計測器（Ｌ−８８００）を用いて分析
を行った。

【００６５】結果は３個の果実の平均値を示した。ＡＮ
−ｇｄｈ−１７遺伝子導入系統においては、非形質転換
体に比べて、ＡＮ−ｇｄｈ−１７ Ｎｏ．１系統由来の
ＡＮ１−１−２、ＡＮ１−１−３のグルタミン酸含量が
それぞれ、２．１倍、２．８倍増加し、ＡＮ−ｇｄｈ−
１７ Ｎｏ．３系統由来のＡＮ３−１−２、ＡＮ３−１
−３が２．８倍，２．５倍それぞれ増加していた。ＡＮ
−ｇｄｈ−１７ Ｎｏ．１５系統由来のＡＮ−ｇｄｈ−
１７ Ｎｏ．２．１系統由来のＡＮ２．１−１−１も
２．１倍、１．９倍増加していた（表８、図１８）。形
質転換当代（Ｔ_０）で高いグルタミン酸含量を示したＮ
ｏ．１５系統の後代においても同様な傾向が示された。
Ｍｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ遺伝子を導入した系統、ＭｔｄＡ
Ｎ−２４−４においては非形質転換体のグルタミン酸含
量と有意差は認められなかった。

【００６６】

【表１０】

【００６７】

【表１１】

【００６８】

【表１２】

【００６９】Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子導入系統では、調査
したＴ−ｇｄｈ−４ Ｎｏ．１，３，８系統の後代ＴＧ
ＤＨ１−２、３−１、８−１で、非形質転換体のグルタ
ミン酸含量に比べて、２．３倍，２．１倍、２．４倍増
加していた。（表９、図１９）。また、グルタミン酸以
外のアミノ酸ではアスパラギン酸、グルタミン、γ−ア
ミノ酪酸含量の顕著な増加が見られ、結果として全遊離
アミノ酸含量も非形質転換体と比較して２−３倍増加し
た。

【００７０】

【表１３】

【００７１】

【表１４】

【００７２】

【表１５】

【００７３】実施例８．ポテト形質転換体の作出と解析 １）形質転換体の作出（実施例４参照） 茎頂培養によってポテト（バレイショ）の無菌植物を
得、茎頂を継代することによって材料を増やした。ＭＳ
培地に２％ショ糖を加えた液体培地（１０ｍｌ）に茎頂
を入れ、発根を誘導した。発根後、１６％ショ糖を含む
ＭＳ液体培地を１０ｍｌ加え、暗所培養を行い、マイク
ロチューバーを誘導した。６−８週後のマイクロチュー
バーをディスク状に切り、皮をむいた後、２８℃で一晩
培養したアグロバクテリウム液（Ｔｉ−プラスミッド、
ｐＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ又はｐＣｔ−ＡＮ−ｇｄｈを含
む）を感染させた。滅菌ろ紙を敷いたＭＳ寒天培地（Ｍ
Ｓ培地、２．０ｍｇ／ｌゼアチン，０．１ｍｇ／ｌイン
ドール酢酸，０．３％ゲルライト）上に乗せ、２５℃、
１６時間日長で２日間共存培養した。その後選抜培地
｛ＭＳ培地、２．０ｍｇ／ｌゼアチン，０．１ｍｇ／ｌ
インドール酢酸，０．３％ゲルライト，５０ｍｇ／ｌカ
ナマイシン，５００ｍｇ／ｌクラフォラン｝に移し、同
条件で培養した。１週間ごとに新しい選抜培地に移し、
再分化したシュートを植物ホルモンを含まない選抜培地
に移し、発根を誘導した。Ｔｉ−プラスミッドｐＭｔ−
ｄＡＮ−ｇｄｈおよびｐＣｔ−ＡＮ−ｇｄｈを持つアグ
ロバクテリウムを感染させ、カナマイシン５０ｍｇ／ｌ
を含む培地で選抜を行った結果、Ｍｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ
Ｎｏ．２，５，８，Ｃｔ−ＡＮ−ｇｄｈ Ｎｏ．１の
４系統が選抜できた。

【００７４】２）サザン分析による導入遺伝子の確認 馴化させた植物の葉組織よりＴｏｌａｌ ＤＮＡを抽出
した（Ｈｏｎｄａ ａｎｄ Ｈｉｒａｉ １９９０、Ｊ
ｐｎ Ｊ Ｂｒｅｅｄ ４０，３３９−３４８）。１５
μｇのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、電気泳動
後、ナイロンメンブランにトランスファーした。サザン
ハイブリダイゼーションはＤＩＧ−Ｌａｂｅｌｉｎｇ
ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｒｏｃｈｅ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用
いて行った。プローブにＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を用
いた。その結果、４系統すべてに導入遺伝子サイズのバ
ンド（約１．５ｋｂ）が確認され（図２０）、トランジ
ェットペプチドを付加したｇｄｈ遺伝子が導入されてい
ることが示唆された。

【００７５】３）ＮＡＤＰ−ＧＤＨ活性の測定 形質転換ポテトの葉組織（約０．１ｇ）を液体窒素で凍
結させ、乳鉢で破砕した後、重量の５倍量の抽出緩衝液
｛２００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１４ｍＭ β
−メルカプトエタノール、１０ｍＭ Ｌ−システイン−
ＨＣｌ，０．５ｍＭ ＰＭＳＦ，０．５％ Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００｝を加えた。遠心チューブに移し、１２，
０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を限外ろ過
（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ウルトラフリー０．５フィルタ
ーユニット、バオイマックス−１０）し、抽出緩衝液で
３回洗浄した。抽出した酵素は反応液｛１００ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ（ｐＨ８．０），２０ｍＭ ２−α−ケトグルタ
ル酸，１．０ｍＭ ＣａＣｌ_２，０．２ｍＭ ＮＡＤＰ
Ｈ，２００ｍＭ 塩化アンモニウム｝に混合し、室温で
反応させ、３４０ｎｍにおける吸光度の減少を測定し
た。サザン分析で導入遺伝子が確認できた形質転換ポテ
トおよび非形質転換ポテトの葉組織を用いて、ＮＡＤＰ
−ＧＤＨ活性を測定した結果、非形質転換体では活性が
認められないのに対し、形質転換体では１５０−３００
ｎｍｏｌ／（分ｍｇタンパク質）の活性が測定できた
（表１０）。Ｃｔ−ＡＮ−ｇｄｈ系統よりＭｔ−ｄＡＮ
−ｇｄｈ系統の方が高い活性を示した。

【００７６】

【表１６】

【００７７】４）マイクロチュバーのアミノ酸含量の測
定 非形質転換体と形質転換体４系統の茎頂を液体培養し、
発根誘導した後、１６％ショ糖を加え、暗所処理後６週
目のマイクロチューバーを用いて、アミノ酸含量を測定
した。８０℃に熱した８０％エタノールを重量の３倍量
加え、乳鉢ですりつぶした後、再度８０℃で２０分間加
熱した。７，０００ｒｐｍで遠心して、上清を回収した
後、再度８０％エタノールを加え、８０℃に加温した。
エタノールによる抽出を３回行い、総量を８０％エタノ
ールで５ｍｌに合わせた。よく混合した後、抽出液２０
０μｌをエッペンドルフチューブに取り、乾燥させ、２
００μｌの滅菌水に溶かした。エチルエーテル２００μ
ｌ加え混合後、１２，０００ｒｐｍで遠心し、エーテル
層を取り除いた。水層を再度乾燥させた後、４００μｌ
の０．０２Ｎ ＨＣｌに溶解し、０．４５μｍのろ過フ
ィルターを用いてろ過したろ液をサンプルとし、日立高
速アミノ酸計測器（Ｌ−８８００）を用いて分析を行っ
た。

【００７８】遺伝子導入系統より誘導したマイクロチュ
ーバーを用いてアミノ酸分析を行った。それぞれの株は
２個以上のマイクロチュバーを分析し，統計処理を行っ
た。Ｍｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ遺伝子を導入したＮｏ．２，
５，８系統由来Ｍｔ２−２，Ｍｔ５−１，Ｍｔ５−２，
Ｍｔ８−１，Ｍｔ８−２株はそれぞれグルタミン酸含量
が非形質転換体に比べて、１．７倍，２．２倍，２．５
倍，３．０倍，２．２倍増加していることが分かった
（表１１、図２１）。Ｃｔ−ＡＮ−ｇｄｈ遺伝子導入系
統においては、非形質転換体と比べてグルタミン酸含量
に有意差は認められなかった。グルタミン酸以外のアミ
ノ酸ではグルタミンやプロリンの顕著な増加が示され、
結果として全遊離アミノ酸含量も非形質転換体と比較し
て２−３倍増加した。

【００７９】

【表１７】

【００８０】

【表１８】

【００８１】

【表１９】

【００８２】

【発明の効果】本発明により、遊離アミノ酸を高濃度に
含有する植物が得られ、付加価値の高い原料作物および
食品素材が提供される。本発明により全アミノ酸量が２
〜４倍に増加し、特にグルタミン酸、アスパラギン、ア
スパラギン酸、セリン、スレオニン、アラニンおよびヒ
スチジンの少なくとも１つについてアミノ酸含量の高い
作物が提供され、これらのアミノ酸の後添加を必要とし
ない付加価値の高い原料作物が提供される。また、本発
明により、直接調理するような野菜類で高濃度にグルタ
ミン酸を蓄積したもの、すなわち、うま味の優れた食品
素材が提供される。さらに、本発明により、そのような
遊離アミノ酸を高度に蓄積する植物を育種するための期
間が大幅に短縮される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由
来グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子ＡＮ
−ｇｄｈ−１７と既知のＮＡＤＰ−ＧＤＨ遺伝子配列を
比較したものである。上段がＮＡＤＰ−ＧＤＨ遺伝子の
塩基配列、下段がＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子の塩基配列
である。

【図２】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由
来グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子ＡＮ
−ｇｄｈ−１７と既知のＮＡＤＰ−ＧＤＨ遺伝子配列の
比較（図１続き）。上段がＮＡＤＰ−ＧＤＨ遺伝子の塩
基配列、下段がＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子の塩基配列。

【図３】ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子のＴｉプラスミッド
（ｐＭＡＴ０３７）へのクローニング手順を示したもの
である。図中、３５Ｓ ＰｒｏはＣａＭＶ３５Ｓプロモ
ーター、Ｔｅｒｍはターミネータを表す。

【図４】トランジットペプチドを結合したＡｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ由来ＮＡＤＰ−ＧＤＨＡ遺伝子をコードする
配列を含む遺伝子構築物、ｐＣｔ−ＡＮ−ｇｄｈ、ｐＣ
ｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ、ｐＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈの構築手
順およびそれらの構造を模式的に示したものである。

【図５】ＮＡＤＰ−ＧＤＨ遺伝子中のスプライシング領
域を除去する手順の概略を示したものである。図中、太
い線はスプライシング領域、Ｐ１〜Ｐ４はＰＣＲプライ
マーを表す。

【図６】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来ＮＡＤＰ−ＧＤＨ
Ａ遺伝子配列へのトランジットペプチド配列結合手順
の概略を示したものである。図中Ａはトランジットペプ
チドの塩基配列、ＢはＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子の塩基
配列を表す。Ｐ５〜Ｐ８はそれぞれＰＣＲプライマーを
表す。

【図７】２Ａ１１プロモーターに接続されたＡｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来ＮＡＤＰ−ＧＤＨ
遺伝子を有する、遺伝子構築物ｐ２ＡＣｔ−ｄＡＮ−ｇ
ｄｈおよびｐ２ＡＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈの構造を模式的
に示したものである。

【図８】トマト由来ＮＡＤ−ＧＤＨ遺伝子（Ｔ−ｇｄｈ
−４）のＴｉプラスミッド（ｐＩＧ１２１−Ｈｍ）への
クローニング手順を示したものである。図中、３５Ｓは
ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、ＮｏｓはＮｏｓ−ター
ミネーターを表す。

【図９】トマト由来ＮＡＤ−ＧＤＨ遺伝子、Ｔ−ｇｄｈ
−４の改変手順の概略を示したものである。

【図１０】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ
由来ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を導入した形質転換体の
ＰＣＲ解析。レーン２、３：非形質転換トマト、レーン
４〜６：プラスミッド（ｐＭＡＴ０３７）遺伝子を導入
した形質転換トマト；レーン７〜１０：ＡＮ−ｇｄｈ−
１７遺伝子を導入した形質転換トマト（Ｎｏ−６，Ｎｏ
−８−２，Ｎｏ−１５，Ｎｏ−１７）。

【図１１】トマト由来ＮＡＤ−ＧＤＨ遺伝子ＧＤＨ（Ｔ
−ｇｄｈ−４）遺伝子を導入した形質転換体のＰＣＲ解
析。レーン２，３：非形質転換トマト；レーン４〜６：
プラスミッド（ｐＩＧ１２１−Ｈｍ）遺伝子を導入した
形質転換トマト；レーン７〜１０：Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝
子を導入した形質転換トマト（Ｎｏ．２、Ｎｏ．７−
２、Ｎｏ．９−２、Ｎｏ．１０）。

【図１２】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ
由来ＡＮ−ｇｈｄ−１７遺伝子を導入した形質転換体の
ＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｎｏ．６、Ｎｏ．１５は形質転換ト
マトを表し、（）内は全ＲＮＡを抽出した組織を表す。

【図１３】トマト由来Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子を導入した
形質転換体のＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｎｏ．２、Ｎｏ．７−
２、Ｎｏ．９−２、Ｎｏ．１０は形質転換トマトを表
し、（）内は全ＲＮＡを抽出した組織を表す。

【図１４】ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を導入した形質転
換体（Ｎｏ．６、Ｎｏ．１５、Ｎｏ．１７）のアミノ酸
（グルタミン酸−Ｇｌｕ、グルタミン−Ｇｌｎ、γ−ア
ミノ酪酸−ＧＡＢＡ、リジン−Ｌｙｓ）含量を比較した
グラフである。

【図１５】Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子を導入した形質転換体
（Ｎｏ．２、Ｎｏ．７−２、Ｎｏ．９−２、Ｎｏ．１
０）のアミノ酸（グルタミン酸−Ｇｌｕ、グルタミン−
Ｇｌｎ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、リジン−Ｌｙ
ｓ）含量を比較した結果である。

【図１６】ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を導入した形質転
換トマトのサザン分析の結果を示したものである。全Ｄ
ＮＡ（１５μｇ）をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化
した（Ａ）、または全ＤＮＡ（１５μｇ）をＸｂａＩで
消化した（Ｂ）サンプルを使用した。レーン１：非形質
転換トマト、レーン２：ＡＮ−ｇｄｈ−１７ Ｎｏ．
１、レーン３：ＡＮ−ｇｄｈ−１７ Ｎｏ．３、レーン
４：ＡＮ−ｇｄｈ−１７ Ｎｏ．１５、レーン５：ＡＮ
−ｇｄｈ−１７ Ｎｏ．２．１。

【図１７】Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子を導入した形質転換ト
マト（Ｔ１）のサザン分析の結果を表す。全ＤＮＡ１５
μｇをＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化したサンプルを使
用した。レーン１：非形質転換トマト、レーン２：Ｔ−
ｇｄｈ Ｎｏ．１−２、レーン３：Ｔ−ｇｄｈ Ｎｏ．
３−１、レーン４：Ｔ−ｇｄｈ Ｎｏ．８−１。矢印は
導入遺伝子（１．２ｋｂ）に対応するバンドの位置を示
す。

【図１８】ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を導入した形質転
換トマトの後代（Ｔ_１）における果実中のアミノ酸含量
を比較したグラフである。対照は非形質転換トマトを使
用した。測定は３個体ずつ行なった。

【図１９】Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子を導入した形質転換ト
マトの後代（Ｔ_１）における果実中のアミノ酸含量を比
較したグラフである。測定は３個体ずつ行なった。

【図２０】Ｃｔ−ＡＮ−ｇｄｈとＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ
遺伝子を導入したポテトのサザン分析の結果を示したも
のである。全ＤＮＡ（１５μｇ）のＥｃｏＲＩ消化物を
使用した。レーン１：非形質転換ポテト−１、レーン
２：非形質転換ポテト−２、レーン３〜６はそれぞれの
遺伝子構築物を導入した形質転換ポテトに対応する。レ
ーン３：Ｃｔ−ＡＮ−ｇｄｈ Ｎｏ．１、レーン４：Ｍ
ｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ Ｎｏ．２、レーン５：Ｍｔ−ｄＡ
Ｎ−ｇｄｈ Ｎｏ．５、レーン６：Ｍｔ−ｄＡＮ−ｇｄ
ｈ Ｎｏ．８。矢印は導入遺伝子の断片に対応するバン
ドの位置を示す。

【図２１】Ｃｔ−ＡＮ−ｇｄｈとＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ
遺伝子を導入したポテトのマイクロチューバー中のグル
タミン酸（Ｇｌｕ）含量を示したグラフである。対照と
しては非形質転換ポテトを使用した。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 同条件で栽培した天然の同種植物と比べ
   て、植物の可食部分における１以上の遊離アミノ酸をよ
   り多く蓄積するトランスジェニック植物を作出する方法
   であって、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の
   過剰発現を与える遺伝子構築物で植物を形質転換し、該
   遺伝子構築物に連結されたマーカー遺伝子により付与さ
   れた形質に基づいて前記形質転換植物を選択または同定
   し、１以上のアミノ酸をより多く蓄積する植物について
   前記形質転換植物をスクリーニングし、前記形質転換植
   物を選別することを含む、前記方法。
2. 【請求項２】 遺伝子構築物が、強力な構成的プロモー
   ターまたは果実特異的プロモーターに機能可能に連結さ
   れたＧＤＨをコードする遺伝子を含む、請求項１記載の
   方法。
3. 【請求項３】 構成的プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓプ
   ロモーターであり、果実特異的プロモーターが２Ａ１１
   プロモーターである、請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 遺伝子構築物がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
   ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のＮＡＤＰ−ＧＤＨ遺伝子を含
   む、ｐＡＮ−ｇｄｈ−１７またはｐＣｔ−ＡＮ−ｇｄｈ
   またはｐＣｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈまたはｐＭｔ−ｄＡＮ−
   ｇｄｈまたはｐ２ＡＣｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈまたはｐ２Ａ
   Ｍｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈである、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 遺伝子構築物がトマト由来のＮＡＤ−Ｇ
   ＤＨ遺伝子を含む、ｐＴ−ｇｄｈ−４またはｐＴｄ−ｇ
   ｄｈである、請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 遊離アミノ酸が、アスパラギン、アスパ
   ラギン酸、セリン、スレオニン、アラニン、ヒスチジン
   およびグルタミン酸からなる群より選ばれる、請求項１
   〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 【請求項７】 遊離アミノ酸の一つが遊離グルタミン酸
   である、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 トランスジェニック植物がトランスジェ
   ニックトマトである、請求項１〜７のいずれか１項に記
   載の方法。
9. 【請求項９】 トランスジェニック植物がトランスジェ
   ニックポテトである７のいずれか１項に記載の方法。
10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか１項に記載の
    方法により作出されたトランスジェニック植物および、
    グルタミン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現する遺伝子構
    築物を含有する、前記植物の子孫。
11. 【請求項１１】 請求項１〜９のいずれか１項に記載の
    方法により作出された、可食部分のグルタミン酸含量が
    ２倍以上に増加したトランスジェニック植物および、可
    食部分のグルタミン酸含量が２倍以上に増加したその子
    孫植物。
12. 【請求項１２】 請求項１〜９のいずれか１項に記載の
    方法により作出された、可食部分の全遊離アミノ酸含量
    が２倍以上に増加したトランスジェニック植物および、
    可食部分の全遊離アミノ酸含量が２倍以上に増加したそ
    の子孫植物。
13. 【請求項１３】 請求項１０〜１２のいずれか１項に記
    載のトランスジェニック植物またはその子孫植物の種子
    であって、グルタミン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現す
    る遺伝子構築物を含有する前記種子。