JP2003125661A - アミノ酸含量の増大した植物およびその作出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
（PEPC）遺伝子の導入により、遊離アミノ酸含量が増大
した形質転換植物を作出すること。また、その子孫植
物、それらの種子を提供すること。 【解決手段】 PEPC遺伝子を含む核酸構築物が導入され
た形質転換植物であって、前記PEPC遺伝子がコードする
PEPCが、自身の活性化のためにリン酸化を必要としな
い、および／または、アセチルCoA非依存性である、前
記形質転換植物である。特に、本発明は、シネココッカ
ス・ブルカヌス由来のPEPCをコードする核酸分子を含む
核酸構築物、または、PEPC活性を有するタンパク質をコ
ードし、かつ、前記遺伝子と80%以上のヌクレオチド配
列の相同性を有する核酸分子を含む核酸構築物が導入さ
れた形質転換植物

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遊離アミノ酸の含
量が増加した形質転換植物、およびその作出方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】植物は独立栄養生物として、その生存に
必須のすべての化合物を合成する能力を有する。アミノ
酸もその例外ではなく、植物は天然に存在する20種類す
べてのアミノ酸を光のエネルギーを利用して、水と二酸
化炭素、および、環境中で利用可能な無機窒素源より合
成する。ヒトを含む動物は、すべてのアミノ酸を合成す
ることができるわけではなく、合成できないアミノ酸は
必須アミノ酸として、その摂取は栄養学的に重要であ
る。動物はかかる必須アミノ酸を基本的に植物が合成す
るアミノ酸に依存している。したがって、植物に含まれ
るアミノ酸の質、及び量の改変は、植物の栄養学的な価
値を高める上で重要な課題である。

【０００３】また、植物のアミノ酸合成能の強化は植物
自身の成長の側面からも意義が大きい。上述したよう
に、植物は環境中の無機窒素よりアミノ酸を合成する
が、この過程は、植物側から見るならば、窒素をアミノ
酸として固定・吸収する過程と見なすことができる。す
なわち、植物は窒素を最終的にアンモニアの形態とし
て、グルタミン酸に固定し、このグルタミン酸が他のア
ミノ酸、核酸など様々な生体成分の窒素源として、分
配、利用される。したがって、アミノ酸合成能の強化
は、植物による窒素の利用効率の向上と言い換えること
もできる。窒素は植物の生長の大きな制限因子の1つで
あり、アミノ酸合成能の強化により、結果として、窒素
固定能の増強が達成されるならば、それは植物の生長促
進を伴うことが期待され、収量増加なども期待される。
また、効率的な窒素利用が実現するならば、無機窒素の
施肥を最小にとどめることが可能になり、環境負荷を減
少させる効果も期待される。

【０００４】植物のアミノ酸含量の増加の手段として
は、ひとつには、ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼ活性を増大させることが考えられる。ホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下ではPEPCと略し
て表記する）は、ホスホエノールピルビン酸に重炭酸を
固定して、オキザロ酢酸を生成する反応を触媒する。本
酵素は、微生物、植物に広く分布し、代謝上は、解糖系
とTCA回路のつなぎ目の部分に位置する。本酵素は生理
学的に極めて重要な2つの役割を担うとされている。そ
のひとつは、解糖系からTCA回路へのバイパスを形成
し、TCA回路に炭素骨格を供給することにより、TCA回路
の回転を維持する役割である。TCA回路は好気的な条件
下でのエネルギー生成のほかに、アミノ酸などの生合成
の出発物質を供給する役割も担う。このため、TCA回路
を形成する化合物は、他の代謝系にも流出していくこと
になり、回路に流入した炭素の一部のみが、回路の入口
であるオキザロ酢酸とアセチルCoAとが縮合しクエン酸
を生成する反応に戻る。したがって、回路の回転を維持
するためには、流出する炭素を補給する必要があり、PE
PCはこの役割（学術的に、anaplerotic roleと呼ばれ
る）を担う。本酵素の増強はTCA回路への炭素供給を増
強する結果となり、TCA回路から派生する化合物、すな
わち、アミノ酸の蓄積が起こることが期待される。

【０００５】もうひとつの本酵素の役割は、植物のC4型
光合成における最初の炭酸固定の役割である。C4型光合
成においては、二酸化炭素の固定が、2種類の分化した
細胞（葉肉細胞と維管束鞘細胞）で2つのステップを経
ておこる。すなわち、最初に葉肉細胞中でPEPCなどの作
用で二酸化炭素がリンゴ酸などに固定され、これが維管
束鞘細胞に輸送され、そこで再び遊離した二酸化炭素が
通常の炭素固定反応により糖に固定される。この型の光
合成では、通常の炭素固定反応に提供される二酸化炭素
濃度が一般の光合成より高濃度になる特色があり、炭素
固定の効率が高くなる。この過程の制御ポイントはPEPC
による炭酸固定の段階にあるとされ、本酵素の増強は植
物の光合成能、言い換えれば、物質生産能全体に影響を
及ぼす可能性も期待される。

【０００６】このように、PEPCの増強は植物のアミノ酸
生産能、あるいは、物質生産能全体を増強することにつ
ながる可能性が期待された。したがって、様々な起源の
PEPC遺伝子を植物に導入し、その酵素活性を増大する試
みがなされてきた。例えば、ドイツのJohanna Gehlenら
のグループは、大腸菌（Escherichia coli）、あるいは
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium
glutamicum）のPEPC遺伝子を構成的なカリフラワー・モ
ザイク・ウイルス 35Sプロモーターの制御下として、ジ
ャガイモに導入している。（Johannna Gehlen, et al.,
Plant Molecular Biology, 32, 831-848(1996)）。ま
た、内宮らのグループは、トウモロコシのPEPCを同様の
制御のもと、タバコに導入している（Hiroyuki Kogami,
et al.,Transgenic Research, 3, 287-296(1994)）。
さらに、農水省のグループはトウモロコシPEPC遺伝子を
cDNAではなく、プロモーターを含むゲノム断片の形でイ
ネに導入している（Maurice S. B. Ku, et al., Nature
Biotechnology, 17, 76-80(1999)、大崎満ら, 日本植
物生理学会2000年度年会要旨集pp63）。これらの形質転
換植物体中には、大量のPEPCタンパク質の蓄積が認めら
れ、その無細胞抽出液中には、当該酵素の活性が検出さ
れたとされている。しかしながら、期待に反して、これ
らの植物には顕著な表現型が現れたとの記載もなく、ア
ミノ酸の明らかな蓄積もこれまでに報告されていない。

【０００７】一方、トウモロコシPEPCやソルガムPEPCは
N末端のそれぞれ15番目、および8番目のセリン残基がリ
ン酸化されることが知られている。これらの酵素は、リ
ン酸化を受けることで、アロステリックなインヒビター
（リンゴ酸）への感受性が低下して活性化することが明
らかにされている（Jean Vidal and Raymond Chollet,
Trends in Plant Science, 2, 230-237(1997)）。リン
酸化されるセリン残基近傍のアミノ酸配列はトウモロコ
シとソルガムでよく保存されており、それはアミノ酸の
一文字表記で、ERLSSIDAQであり、当該配列中の5番目の
セリン残基がリン酸化される。現在、多くの植物種で、
PEPCの一次構造が明らかにされているが、そのほとんど
がN末端近傍に当該配列と類似の配列を有し、当該配列
の5番目のセリンから9番目のグルタミンは完全に保存さ
れていた。したがって、これらの酵素はその活性の発現
には、リン酸化を受ける必要があると考えられている。

【０００８】また、T. Nakamura, et al., J. Bioche
m., 120, 518-524(1996)は、微生物起源のPEPCの活性測
定にはアセチルCoAの添加が必須で、反応液中に少なく
とも0.05mM以上必要であることを報告している。実際、
アセチルCoAの濃度が0.05mMと0.3mMの場合を比べると、
基質であるホスホエノールピルビン酸への親和性が0.05
mMでは、0.3mMのおよそ1/2に低下し、酵素活性の発現も
低下することが示されている。一方、植物細胞内のアセ
チルCoA濃度は、脂肪酸合成の場であり、かつ、アセチ
ルCoAが高濃度に存在する細胞内小器官である葉緑体に
おいても0.01〜0.02mMと報告されている（P. G. Rougha
n, Biochem. J., 327, 267-273 (1997)）。

【発明が解決しようとする課題】本発明はPEPC遺伝子の
導入により、遊離アミノ酸含量が増大した形質転換植物
を作出することを目的とする。また、その子孫植物、そ
れらの種子を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これま
で、PEPC遺伝子の導入、および、その酵素タンパク質の
過剰蓄積にもかかわらず、アミノ酸含量の増大がおこら
なかった理由として、発現した酵素タンパク質がその性
質に起因して、植物細胞内中で、不活性な状態におかれ
ているためであると考えた。そこで、植物細胞内中でも
活性を発現しうる性質のPEPCをコードする遺伝子を導入
すれば、所期の効果が得られるとの考察に基づき本発明
を完成させるに至った。すなわち、本発明は、ホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)遺伝子を含む
核酸構築物が導入された形質転換植物であって、前記PE
PC遺伝子がコードするホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼが、自身の活性化のためにリン酸化を必要と
しない、および／または、アセチルCoA非依存性であ
る、前記形質転換植物である。また、本発明は、らん藻
由来PEPC遺伝子を含む核酸構築物が導入された形質転換
植物である。特に、本発明は、シネココッカス・ブルカ
ヌス（Synechococcus vulcanus）由来のPEPCをコードす
る核酸分子を含む核酸構築物、または、PEPC活性を有す
るタンパク質をコードし、かつ、前記遺伝子と80%以上
のヌクレオチド配列の相同性を有する核酸分子を含む核
酸構築物が導入された形質転換植物である。本発明に
は、これらの形質転換植物の種子も含まれる。更に、本
発明は、同一条件で栽培された同種の非形質転換植物と
比較して遊離アミノ酸含量が増大した形質転換植物を作
出する方法であって、PEPC遺伝子を植物細胞内で発現さ
せることのできる核酸構築物を植物に導入することを含
み、前記PEPC遺伝子がコードするPEPCが、自身の活性化
のためにリン酸化を必要としない、および／またはアセ
チルCoA非依存性であることを特徴とする、前記方法で
ある。また、本発明は、前記方法において、PEPC遺伝子
がらん藻由来であることを特徴とする、同一条件で栽培
された同種の非形質転換植物と比較して遊離アミノ酸含
量が増大した形質転換植物を作出する方法である。特
に、本発明は、前記方法において、PEPC遺伝子を含む核
酸構築物がシネココッカス・ブルカヌス（Synechococcu
s vulcanus）由来のPEPCをコードする核酸分子を含む核
酸構築物、または、PEPC活性を有するタンパク質をコー
ドし、前記遺伝子と80%以上のヌクレオチド配列の相同
性を有する核酸分子を含む核酸構築物であることを特徴
とする、同一条件で栽培された同種の非形質転換植物と
比較して遊離アミノ酸含量が増大した形質転換植物を作
出する方法である。

【発明の実施の形態】本発明は、ホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼ(PEPC)遺伝子を含む核酸構築物が
導入された形質転換植物であって、前記PEPC遺伝子がコ
ードするホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
が、自身の活性化のためにリン酸化を必要とせず、かつ
アセチルCoA非依存性である、前記形質転換植物であ
る。本明細書においては、「植物」とは、葉、茎、根、
塊根、塊茎、果実、花等を含む植物体全体、またはその
一部をいう。本発明においては、活性化にリン酸化を必
要としない、および／または、アセチルCoA非依存性で
あるPEPCおよびこれをコードする遺伝子が用いられる。
前述したように、トウモロコシPEPCやソルガムPEPCはN
末端のセリン残基がリン酸化されることによって、初め
て活性化することが明らかにされている（JeanVidal an
d Raymond Chollet, Trends in Plant Science, 2, 230
-237(1997)）。したがって、これらの酵素はその活性の
発現には、リン酸化を受ける必要があると考えられる。
一般に、植物由来のPEPCはその活性の発現にはリン酸化
を必要とする。本発明に用いるPEPCは、その活性がリン
酸化によって調節されない、特に活性の発現にリン酸化
を必要としない。特に、本発明に用いるPEPCは、その一
次構造上、N末端近傍に保存されたリン酸化配列、また
はこれに類似する配列を含まないことが好ましい。前述
したように、リン酸化によって活性化される植物由来PE
PCは、一般にはN末端に良く保存されたERLSSIDAQまたは
これに類似するアミノ酸配列を有する。したがって、本
発明で使用するPEPCは、N末端領域にERLSSIDAQおよびこ
れに類似のアミノ酸配列を含まないことが好ましい。こ
こで、ERLSSIDAQに類似のアミノ酸配列とは、電荷、分
子構造等の観点から類似すると考えられるアミノ酸間の
置換を含む配列をいい、例えば、X_A-X_B-X-X-SIDAQ（X_A
は酸性アミノ酸、X_Bは塩基性アミノ酸、Xは任意のアミ
ノ酸をそれぞれ表す）が含まれる。

【０００９】また、本発明に用いるPEPCは、その活性の
発現がアセチルCoA非依存性である。上述のとおり、本
発明の目的には活性化にリン酸化を必要としないPEPCが
好ましいため、PEPC遺伝子の供給源を植物以外に求める
ことが好ましい。しかしながら、微生物起源のPEPCは、
活性の発現にリン酸化を必要としないと考えられてお
り、すべて細胞内で活性を発現することが期待される
が、実際には、E.coliやCorynebacteriumのPEPC遺伝子
を導入しても、期待される効果は見られなかった。本発
明者は、この原因が微生物PEPCはその活性発現がアセチ
ルCoA依存性であるためと考えた。前述したように、微
生物起源のPEPCはin vitroで0.05mM以上の濃度のアセチ
ルCoAを必要とする。更に、アセチルCoAの濃度が0.05mM
の場合であっても、基質であるホスホエノールピルビン
酸への親和性が0.05mMでは、0.3mMのおよそ1/2まで低下
し、酵素活性の発現も低下することが示されている（T.
Nakamura, et al., J. Biochem., 120, 518-524(199
6)）。このようなアセチルCoA依存性はin vivoにおいて
もその活性発現に影響を与えることが考えられる。

【００１０】一方、植物細胞内のアセチルCoA濃度は、
脂肪酸合成の場であり、アセチルCoAが高濃度に存在す
る細胞内小器官である葉緑体においても0.01〜0.02mMと
考えられている（P. G. Roughan, Biochem. J., 327, 2
67-273(1997)）ので、仮に微生物由来のPEPCが酵素タン
パク質として存在しても、ほとんど活性が発現しないと
考えられる。従って、本発明に用いるPEPCはアセチルCo
A非依存性であることが好ましい。ここで、PEPCがアセ
チルCoA非依存性であるとは、アセチルCoA非存在下、ま
たは0.05mM未満のアセチルCoA存在下でも活性を有する
こと、好ましくは0.05mMのアセチルCoA存在下で至適濃
度付近における活性の70％以上、より好ましくは80％以
上のPEPC活性を有することをいう。さらに、本発明にお
いて利用するPEPCは耐熱性を有することがより望まし
い。異種起源のタンパク質は組換え宿主中で不安定にな
る傾向があるため、本質的に安定なタンパク質を発現す
ることは、酵素活性の発現に有利にはたらくことが予想
される。ここでの耐熱性とは、40℃以上においても、至
適温度での活性の半分以上の活性を有する性質を言う。

【００１１】本発明において使用し得るPEPCとしては、
例えば、らん藻（Cyanobacteria）由来のPEPCが挙げら
れる。らん藻とは、植物に分類される膜に包まれた核、
または、葉緑体を持たない生物と定義されるが、これは
光合成能を有する細菌とほぼ同義である。これまで、シ
ネコシスティス・ニズランス（Synechocystis nidulan
s）などの単細胞性らん藻, アナベナ・バリアビリス（A
nabaena valiabilis）などの糸状らん藻、シネココッカ
ス・ブルカヌス（Synechococcus vulcanus）などの耐熱
性らん藻など種々のらん藻に分類される生物種のPEPC遺
伝子が単離され、その構造が明らかにされている。これ
らはいずれもN末端近傍にERLSSIDAQ、ならびにそれに類
似する配列を有しない（H. Toh et al., Plant, Cell a
nd Enviroment, 17, 31-43(1994)、L-M Chen and K. Iz
ui, 日本植物生理学会2000年度年会要旨集pp158）。ま
た、Synechocystis nidulans（T. Kodaki, et al., J B
iochem. 97, 533-539(1985)）、Synechococcus vulcanu
s（L-M Chen and K. Izui,日本植物生理学会2000年度年
会要旨集pp158）、ココクロリス・ペニオシスティス（C
occochloris peniocystis）（G. W. Owttrim and B. Co
lman, J. Bacteriol., 168, 207-212(1986)）はその活
性がアセチルCoA非存在下でも検出され、アセチルCoA依
存性を有しない。すなわち、本発明に使用できるPEPCと
しての性質をらん藻由来PEPCは一般的に有していると考
えられる。特に、本発明において使用するPEPCおよびPE
PC遺伝子の起源としては、Synechococcus属に属するら
ん藻が好ましく、Synechococcus vulcanusであることが
より好ましい。本発明の好ましい実施態様においては、
Synechococcus vulcanus由来のPEPC遺伝子およびPEPCが
使用される。Synechococcus vulcanus由来のPEPC遺伝子
配列を配列番号１に、この遺伝子がコードするPEPCアミ
ノ酸配列を配列番号２に記載した。Synechococcus vulc
anusは分類学上Synechococcus elongatusやSynechococc
uslividusと同等である。これらの微生物はアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)より入手可
能であり、アクセッション番号としてATCC27184、ATCC3
3912、ATCC27179が付与されている。

【００１２】PEPC活性、活性化にリン酸化を必要としな
い性質、アセチルCoA非依存性という性質は、その遺伝
子配列、さらにはアミノ酸配列に依存した性質である。
したがって、Synechococcus vulcanus由来PEPCと相同な
アミノ酸配列を有するタンパク質も本発明において利用
できると考えられる。このようタンパク質をコードする
核酸分子は、例えば、Blastなどの配列の相同性を計算
できるプログラムと標準のパラメーターを用いて計算し
た場合にヌクレオチド配列レベルで80%以上、好ましく
は90％以上、より好ましくは95％以上の相同性を有する
分子として得ることができる。あるいは、Synechococcu
s vulcanus由来PEPCと相同性を有するアミノ酸配列をコ
ードする核酸分子は、Synechococcus vulcanus由来PEPC
をコードする核酸分子とストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズする核酸分子として得ることができる。この
ようなストリンジェントな条件は、例えば、通常ハイブ
リダイゼーションに用いられる条件の範囲において、二
本鎖DNAの融解温度Tmは、よく知られた下記の式に基づ
いて計算された値から相同性が１％低下する毎に１〜1.
5℃低下する、という知見に基づいて決定することもで
きる。

【００１３】Tm＝81.5℃+16.6(log₁₀[Na⁺])+0.41(GC含
量)-0.63(ホルムアミド％濃度)-(600/l) （式中、[Na⁺]はナトリウムイオン濃度、lは配列の長
さ）

【００１４】上述した、Synechococcus vulcanus由来PE
PCに相同なアミノ酸配列を有するPEPCについて、更に、
そのPEPC活性の存在、その活性化にリン酸化を必要とし
ないこと、およびその活性のアセチルCoA非依存性の各
性質を備えていることが好ましい。活性化にリン酸化を
必要としないことは、簡単には例えば、ERLSSIDAQに類
似のアミノ酸配列をN末端に有しないことにより容易に
確認することができる。更に、リン酸化と活性との関係
を直接測定することもできる。また、活性化がアセチル
CoA非依存性であることは、アセチルCoA非存在下、また
は種々の濃度のアセチルCoA存在下でPEPC活性を測定す
ることによって容易に確認することができる。

【００１５】PEPC活性の測定は様々な方法があるが、リ
ンゴ酸デヒドロゲナーゼとカップルさせて、生成するオ
キザロ酢酸を還元型ニコチンアミドヌクレオチドの吸光
度の減少として測定することにより求める方法が一般的
である。すなわち、2mM PEP、10mM KHCO₃、10mM MgS
O₄、0.1mM NADH、0.1M Tris-HCl(pH8.6)、1.0u ブタ心
臓リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Sigma-Aldrich社などよ
り購入することができる）を含む反応液に精製酵素、ま
たは、酵素を含む無細胞抽出液を加え、種々の温度で加
温する。このとき、PEPCの反応により生成するオキザロ
酢酸は定量的にリンゴ酸デヒドロゲナーゼにより還元さ
れ、それに伴いリンゴ酸デヒドロゲナーゼの補酵素であ
るNADHは酸化され減少していく。NADHは波長340nmに特
異的な吸収をもつので、NADH量の減少は波長340nmの吸
光度の減少として分光光度計で測定でき、これをもって
PEPC活性を測定することができる（T. Nakamura, et a
l., J. Biochem, 120, 518-524(1996)）。このとき、０
から0.05mM程度のアセチルCoA存在下における活性を、
充分な活性、例えば最大活性を示すに必要と考えられる
アセチルCoA濃度、例えば、0.3mM程度のアセチルCoA存
在下における活性と比較することにより、酵素のアセチ
ルCoA非依存性を確認することができる。

【００１６】本発明においては、活性化にリン酸化を必
要としない、および／またはアセチルCoA非依存性であ
るPEPC遺伝子を含む核酸構築物を植物に形質転換し、こ
れを発現させることにより、遊離アミノ酸総含量、特
に、遊離の、アスパラギン、グルタミン、アルギニン含
量が増大した植物が得られる。本発明の好ましい態様に
おいては、総遊離アミノ酸含量については４倍以上、ア
スパラギン含量については３倍以上、より好ましい態様
においては約４倍以上、グルタミン酸含量については８
倍以上、より好ましい態様においては１０倍以上、最も
好ましい態様においては１６倍以上、アルギニン含量に
ついては４倍以上、より好ましい態様においては５倍以
上、最も好まい態様においては６倍以上に増加した形質
転換植物が得られる。本発明において使用する核酸構築
物は当業者によく知られた方法を使用して作成すること
ができる。核酸構築物を単離し、その配列を決定する方
法を含む分子生物学的手段については、例えば、Sambro
okら、Molecular cloning-Laboratorymanual, 第2版, C
old Spring Harbor Laboratory Pressのような文献を参
照することができる。あるいは、本発明に使用しうる核
酸構築物を作成するためにPCR法をはじめとする遺伝子
増幅が必要になることもあるが、そのような手法につい
ては、F. M. Ausubel ら編集, Current Protocols in M
olecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)な
どを参照することができる。

【００１７】本発明に使用する核酸構築物は一般に、ま
たはその一部の植物細胞で機能する適切なプロモータ
ー、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子、カリフラワーモ
ザイクウィルスの35Sプロモーター（CaMV35S）、ノパリ
ン合成酵素遺伝子のターミネーターなどの適切なターミ
ネーター、その他の発現に必要、あるいは有利な配列、
及び、形質転換体を選抜するためのマーカー遺伝子、例
えば、カナマイシン耐性、G418耐性、ハイグロマイシン
耐性のような薬剤耐性遺伝子を含んでよい。

【００１８】そのような構築物に使用しうるプロモータ
ーは構成的プロモーターであっても器官特異的または生
育ステージ特異的であってもよく、使用する宿主、必要
とする発現量、発現を特に意図する器官、または、生育
ステージによって選択することができる。本発明の好ま
しい実施態様においては、器官、及び生育ステージに非
特異的に発現する強力なプロモーターが使用され、例え
ば、CaMV35Sプロモーターがそのようなプロモーターの
例として使用される。器官特異的プロモーターとして
は、ファゼオリン遺伝子プロモーターやパタチン遺伝子
プロモーターなどが使用される。本発明の最も好ましい
実施態様においては、CaMV35Sプロモーターのような強
力な構成的プロモーターで当該PEPC遺伝子をドライブす
る構築物が使用される。

【００１９】本発明において使用しうる遺伝子導入法は
特に限定されず、植物細胞、あるいは植物体へ遺伝子導
入法として当業者に知られた方法を宿主に応じて選択す
ることができる。例えば、本発明の実施態様の一つにお
いては、アグロバクテリウムを用いた遺伝子導入法が利
用される。このような形質転換系には、バイナリーベク
ターを使用することが望ましい。アグロバクテリウムを
利用する場合は、形質転換に用いる核酸構築物は植物細
胞に導入すべきDNA配列に隣接するT-DNA領域の少なくと
も右ボーダー配列をさらに含む。好ましい実施態様にお
いては移入された配列は左右のT-DNAボーダー配列の間
に挿入される。このようなT-DNAをベースとする形質転
換ベクターの適切な設計及び構築は当業者によく知られ
たものである。また、そのような核酸構築物を有するア
グロバクテリウムを植物に感染させるための条件も当業
者によく知られたものである。そのような技術、及び条
件については、例えば、秀潤社、細胞工学別冊「モデル
植物の実験プロトコル イネ・シロイヌナズナ編」（19
96）を参照することができる。

【００２０】本発明においては、他の遺伝子導入法を利
用することもできる。使用しうる遺伝子導入方法の例と
しては、ポリエチレングリコールやカルシウムを用いた
DNAのプロトプラストへの導入法、エレクトロポーレー
ションによるプロトプラストの形質転換法、パーティク
ルガンによる導入法等を挙げることができる。上述した
ような遺伝的操作をおこなう植物種は特に限定されない
が、植物体そのものを利用する場合以外は、形質転換が
容易で植物体への再生系が確立している植物種が好まし
い。本発明に適した植物は前述の特性を有するもののほ
か、産生されるアミノ酸の利用という観点から、大量栽
培技術の確立した植物種がより好ましい。本発明を実施
するため適した植物としては、例えば、アブラナ科植物
全般のほか、トマト、バレイショ、トウモロコシ、コム
ギ、イネ、サトウキビ、ダイズ、ソルガムなどが挙げら
れる。また、上述したような遺伝的操作をおこなう器
官、細胞は特に限定されず、使用する宿主、遺伝子導入
法等に応じて選択することができる。例として、器官外
植片、花粉、培養細胞、胚、植物体等を挙げることがで
きるが、これらに限定されない。

【００２１】次に上述したように操作された植物細胞等
は、形質転換について選抜される。この選抜は、例え
ば、形質転換に使用した核酸構築物上に存在したマーカ
ー遺伝子の発現に基づいておこなうことができる。例え
ば、マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である場合は、適
当な濃度の抗生物質、または除草剤等を含む培地上で操
作された植物細胞等を培養、または生育させることによ
り選択することができる。あるいは、マーカー遺伝子
が、β-グルクロニダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝
子などの場合はその活性についてスクリーニングするこ
とにより形質転換体を選抜することができる。このよう
にして同定された形質転換植物体が植物体以外、例え
ば、プロトプラスト、カルス、外植片等である場合は植
物体への再生がおこなわれる。この再生には使用する宿
主植物について当業者に知られた方法を利用することが
できる。このようにして得られた植物体は通常の方法、
すなわち、非形質転換体と同様の条件で栽培してよく、
本発明の核酸構築物を含む形質転換植物を同定するため
に前述のマーカー遺伝子に基づく選抜に加えて、種々の
分子生物学的手法を利用することができる。例えば、組
換えDNA挿入断片の有無及びその構造を検出するために
はサザンハイブリダイゼーションやPCRを利用すること
ができる。導入した核酸構築物に由来するRNA転写産物
を検出・測定するためには、ノーザンハイブリダイゼー
ションやRT-PCRなどを利用することができる。

【００２２】次に得られた形質転換体のPEPC遺伝子の発
現については、当該PEPCのタンパク質量、mRNA量、ある
いは形質転換植物の無細胞抽出液中の酵素活性によって
評価される。例えば、PEPCタンパク質の量はウェスタン
ブロット等の方法により、mRNA量はノーザンブロット、
定量的RT-PCR法によって、評価することができる。ま
た、PEPC活性は、例えば、Nakamuraらの方法（T. Nakam
ura, et al., J. Biochem., 120, 518-524(1996)）によ
り測定することができる。また、この方法により、PEPC
活性の種々のエフェクターへ感受性、とりわけ、アセチ
ルCoA依存性も調べることもできる。これらの方法はい
ずれも当業者にはよく知られたものであり、それらの方
法を簡便におこなうためのキット等の商業的な入手も可
能である。

【００２３】このようして、当該PEPC遺伝子の発現が確
認された形質転換植物については、さらに遊離アミノ酸
含量について評価される。遊離アミノ酸含量は、例え
ば、形質転換植物、または、その一部を破砕し、その抽
出液をアミノ酸分析装置にかけることにより調べること
ができる。アミノ酸分析用に形質転換植物は非形質転換
植物と同様な条件で栽培することが出来る。例えば、実
験室内試験では、1/2 MS組成の塩、1/2 B5組成の塩、10
g/lシュークロースおよび0.8%寒天を含む培地（pHをKOH
で5.5に調整）、または、5mM KNO₃, 2.5mM KH₂PO₄, 2.0
mM MgSO₄, 2.0mMCa(NO₃)₂, 0.05mM Fe-EDTA, 0.07mM H₃
BO₃, 0.014mM MnCl₂, 0.0005mM CuSO₄, 0.001mM ZnSO₄,
0.0002mM Na₂MoO₄, 0.01mM NaCl, 0.00001mM CoCl₂
（pHをKOHで5.5に調整）、10g/lシュークロース、0.8%
寒天を含むPNS培地を利用することが出来る。ここで、M
S培地は塩として1650mg/l NH₄NO₃、1900mg/l KNO₃、440
mg/lCaCl₂・2H₂O、370mg/l MgSO₄・7H₂0、170mg/l KH₂P
O₄、6.2mg/l H₃BO₃、22.3mg/lMnSO₄・4H₂O、8.6mg/l ZnS
O₄・7H₂O、0.83mg/l KI、0.25mg/l Na₂MoO₄・2H₂O、0.025
mg/l CuSO₄・5H₂O、0.025mg/l CoCl₂・6H₂O、37.3mg/l Na
₂・EDTA・2H₂O 27.8mg/lFeSO₄・7H₂Oを含む。また、B5培地
は、塩として2500mg/l KNO₃、250mg/l MgSO₄・7H₂O、150
mg/l NaH₂PO₄・H₂O、150mg/l CaCl₂・2H₂O、134mg/l (N
H₄)₂SO₄、37.3mg/l Na₂・EDTA・2H₂O、27.8mg/l FeSO₄・7H
₂O、10mg/l MnSO₄・H₂O、3mg/l H₃BO₃、2mg/l ZnSO₄・7H₂
O、0.75mg/l KI、0.25mg/l Na₂MoO₄・2H₂O、0.025mg/l C
uSO₄・5H₂O、0.025mg/l CoCl₂・6H₂Oを含む。

【００２４】このようにして、遊離アミノ酸含量が増大
した形質転換植物が同定されたならば、その形質が遺伝
的に安定に保持されるか否かが調べられる。このために
は、通常の条件に従い植物体を育成・栽培・採種し、後
代における形質、その分離を解析すればよい。後代にお
ける導入核酸構築物の有無、その位置、その発現等は初
代形質転換体と同様に解析することができる。

【００２５】遊離アミノ酸含量の増大した形質転換植物
は導入したゲノムに組み込まれた核酸構築物由来の配列
に関してヘミ接合の場合もホモ接合の場合もあり得る
が、必要に応じて交配すること等により、ヘミ接合体も
ホモ接合体も導くことができる。ゲノムに組み込まれた
核酸構築物由来の配列は後代において、メンデリズムに
従い分離する。従って、形質の安定性の観点から子孫植
物及び種子を取得するためには、ホモ接合植物を使用す
ることが望ましい。そのようにして得られた形質転換植
物は天然に存在する同種の植物と同様の栽培条件に従っ
て栽培することができ、アミノ酸含量が増大した収穫物
を提供することができる。

【００２６】

【実施例】実施例1. Synechococcus vulcanus PEPC遺
伝子の植物形質転換ベクターへの組込み E.coliにおけるSynechococcus vulcanus PEPC発現用プ
ラスミドSVPPC/pTVからのPEPC遺伝子の植物形質転換ベ
クターpBI121KExへの組込は以下のようにおこなった。p
BI121KExはpBI121（クローンテック社製）を改変したベ
クターで、pBI121が本来有するE.coli β-グルクロニダ
ーゼ遺伝子部分がEcoRI, BamHI, XhoI, NotI, SacIを含
むマルチクローニング部位に置換されたベクターであ
る。すなわち、pBI121KExでは、CaMV35Sプロモーターと
ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターの間が前述の制
限酵素部位を含む合成DNAに置換された構造となってい
る。Synechococcus vulcanus PEPC遺伝子はそのコード
領域にXhoIおよびSacIによる切断部位を有しないので、
これらの制限酵素を利用して、pBI121KExへの組込をお
こなった。まず、SVPPC/pTVまたは染色体DNAを鋳型にSV
PPC-Aプライマー（5'-GTCCTCGAGaatctgaaaa acaATGACAT
CAGTCCTCGATG-3'（配列番号３））、およびSVPPC-Bプラ
イマー（5'-GTCGAGCTCTTAGCCTGTATTGCGCATC-3'（配列番
号４））でPCRをおこない両端にpBI121KExへの組込み部
位を付加したPEPC遺伝子断片を得た。SVPPC-Aは5'側か
ら3塩基のextra base（制限酵素での切断効率を上げる
ため）、XhoIの認識配列、植物の翻訳促進配列（Kozak
box）、およびPEPC遺伝子の開始コドンから始まる19塩
基の配列からなる。SVPPC-Bは5'側から3塩基のextra ba
se、SacIの認識配列、およびPEPC遺伝子の終始コドンよ
り始まる19塩基の相補鎖の配列からなる。PCR反応に
は、エラーフリーのNative Pfu DNA polymerase（Strat
agene社）を用い、反応条件は製造者の推奨する条件に
したがった。得られた約3kbの断片はQIAGEN社のPCR pur
ification kitを用いて精製し、ただちに、SacI、およ
び、XhoIで切断した。切断後、Amersham-Pharmacia社の
Microspin Column S-300でゲル濾過し、同様にSacI、お
よびXhoIで切断したpBI121KExとライゲーション反応に
供した。ライゲーション混液を常法にしたがい、E.coli
に形質転換し、カナマイシン抵抗性コロニーを得た。カ
ナマイシン抵抗性コロニーはCaMV35Sプロモーターの配
列に由来するプライマー35S-5D（5'-gatatctccactgacgt
aaggg-3'（配列番号５））および、ノパリン合成酵素タ
ーミネーターの配列に由来するプライマーNOST-3（5'-c
ccagtcacgacgttgtaaaacgac-3'（配列番号６））による
コロニーPCRによりスクリーニングし、約3kbの断片を有
するクローンを選択し、植物形質転換用プラスミドpKEx
SVPPCを有するクローンを得た。また、コロニーPCRでの
増幅断片を35S-5D、およびNOST-3プライマーを用いてdi
rect sequencingをおこない、配列の確認をおこなっ
た。

【００２７】＜配列表フリーテキスト＞ 配列番号３，４：Synechococcus vulcanus PEPC用のPCR
プライマー 配列番号５，６：PCRプライマー

【００２８】実施例２.シロイヌナズナへのSynechococc
us vulcanus PEPC遺伝子の導入 pKExSVPPCを有するE.coliおよびヘルパーE.coli HB101/
pRK203を用いたトリパレンタルメーティングによって、
アグロバクテリウムC58C1Rifへ当該プラスミドを形質転
換した。得られたpKExSVPPCを保持するアグロバクテリ
ウムC58C1Rifは減圧浸潤法によりシロイヌナズナColumb
iaに感染させた。減圧浸潤法は秀潤社、細胞工学別冊
「モデル植物の実験プロトコル イネ・シロイヌナズナ
編」（1996）に記載の方法に従った。感染植物より得ら
れた種子（T1）は、カナマイシン100mg/mlを含むGM寒天
培地（1×MS、1×B5ビタミン、10g/lシュークロース、
0.5g/l MES-KOH（pH7.5）、0.8%寒天）上に1%有効塩素
濃度の次亜塩素酸ナトリウム溶液で殺菌したのち播種
し、形質転換体をスクリーニングした。

【００２９】形質転換体は多くの場合、遺伝子座として
は、1ヶ所に外来遺伝子が挿入されるが、複数の遺伝子
座に挿入された多コピーの形質転換体であることも珍し
くはない。多コピーの形質転換体は、後代で導入遺伝子
の安定性に問題がある場合が多く、好ましいものではな
い。したがって、T2でのカナマイシン抵抗性の分離比を
調べることにより、導入遺伝子が1遺伝子座であるもの
を選択する必要がある。T1世代ではヘミ接合体であるた
め、導入遺伝子が1遺伝子座である場合は、メンデルの
法則にしたがい、T2世代では、カナマイシン抵抗性と感
受性が3:1に分離する。また、多コピー導入遺伝子が存
在する場合は、抵抗性の頻度が高くなる。これに従い、
得られたT2種子を再びカナマイシンを含む培地に播種
し、3:1の分離比を示す系統を選択し、導入遺伝子が1遺
伝子座に存在すると考えられる形質転換体を選抜した。
カナマイシン抵抗性を示すT2植物の一部から、さらにT3
種子を得て、これらの薬剤抵抗性の分離比を調べ、感受
性の個体が分離しなくなった系統を選抜して、導入遺伝
子がホモになった系統を得た。

【００３０】実施例３. Synechococcus vulcanus PEPC
遺伝子を導入したシロイヌナズナのアミノ酸分析 得られた形質転換シロイヌナズナのアミノ酸分析を実施
した。シロイヌナズナを1/2 MS 組成の塩および1/2 B5
組成の塩、10g/lシュークロース、0.8%寒天を含む培地
（pHをKOHで5.5に調整）に播種し、16時間明期、8時間
暗期の長日条件下、22℃で2週間程度培養し、本葉が5〜
6枚程度展開した幼苗を得た。得られた幼苗は液体窒素
中で乳鉢と乳棒で破砕し、80%エタノール中70℃で抽出
後、エーテル抽出をおこない、脂溶性成分を除去した。
水層を凍結乾燥したのち、10mMHClに溶解し、これをア
ミノ酸分析のサンプルとした。サンプルは日立製作所ア
ミノ酸アナライザーLC8800により遊離アミノ酸量を定量
した。その代表的な結果を表１および図１に示す。ま
た、対照植物（非形質転換体）に対するアミノ酸含量の
比を図２に示した。

【００３１】

【表１】表１．形質転換体のアミノ酸含量（nmole/gF
W）

【００３２】このように、Synechochoccus vulcanus PE
PC遺伝子の導入により、植物の総アミノ酸量が顕著に増
大することが示された。増加は多くのアミノ酸に見られ
たが、とりわけ、アスパラギン、グルタミン、アルギニ
ンの増加が顕著であった。

【発明の効果】本発明により総遊離アミノ酸含量、中で
も、遊離グルタミン、アルパラギン、アルギニン含量が
増加した形質転換植物が得られる。特に、本発明によ
り、遊離グルタミン含量が約１０倍以上に増加した形質
転換植物が得られる。

【００３３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Transgenic plants having increased free amino acids content and methods for producing the same <130> Y1J0553 <140> <141> <150> JP 2001-247580 <151> 2001-08-17 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 3240 <212> DNA <213> Synechococcus vulcanus <220> <221> CDS <222> (169)..(3201) <400> 1 gtgaattatg gcgttcgcga tcgcctgcaa cacctggaac tgattctgag cagcaaaaca 60 gcttagaact gttaacaaat ccttaatacg cctgttatca attgttgtac cgccctggtt 120 caggattggg taaagtaagg agtattatct ttgcaggctg gggtaaat atg aca tca 177 Met Thr Ser 1 gtc ctc gat gtg acc aat cgc gat cgc tta att gaa agt gaa agt ttg 225 Val Leu Asp Val Thr Asn Arg Asp Arg Leu Ile Glu Ser Glu Ser Leu 5 10 15 gca gcc cgt acc cta cag gaa cgg ttg cga ctg gtg gaa gag gtc ttg 273 Ala Ala Arg Thr Leu Gln Glu Arg Leu Arg Leu Val Glu Glu Val Leu 20 25 30 35 gtc gat gtc ttg gcg gca gaa tcg ggt caa gaa ttg gtt gat cta ttg 321 Val Asp Val Leu Ala Ala Glu Ser Gly Gln Glu Leu Val Asp Leu Leu 40 45 50 cgg cgc ttg ggg gct ctc tct tcg ccg gaa ggt cat gtg ctc cat gcc 369 Arg Arg Leu Gly Ala Leu Ser Ser Pro Glu Gly His Val Leu His Ala 55 60 65 cca gaa ggg gaa ttg ctg aag gtt att gaa tcc ctc gaa ctc aat gag 417 Pro Glu Gly Glu Leu Leu Lys Val Ile Glu Ser Leu Glu Leu Asn Glu 70 75 80 gcc att aga gcg gcc cgg gct ttt aac ctc tac ttt caa att atc aac 465 Ala Ile Arg Ala Ala Arg Ala Phe Asn Leu Tyr Phe Gln Ile Ile Asn 85 90 95 atc gtt gag cag cat tac gaa caa caa tac aac cgt gaa cgc gct gcc 513 Ile Val Glu Gln His Tyr Glu Gln Gln Tyr Asn Arg Glu Arg Ala Ala 100 105 110 115 caa gag gga ttg cgc cgc cgc agt gtc atg agt gaa cca att tcc ggt 561 Gln Glu Gly Leu Arg Arg Arg Ser Val Met Ser Glu Pro Ile Ser Gly 120 125 130 gtc agt ggt gaa ggc ttt ccg ctg cct cat act gct gcc aac gca acg 609 Val Ser Gly Glu Gly Phe Pro Leu Pro His Thr Ala Ala Asn Ala Thr 135 140 145 gat gtg cgc agt ggg ccg agt gaa cgc cta gag cat agt ctc tac gaa 657 Asp Val Arg Ser Gly Pro Ser Glu Arg Leu Glu His Ser Leu Tyr Glu 150 155 160 gcc att ccc gct act cag cag tat ggt tcc ttt gct tgg ctc ttt cct 705 Ala Ile Pro Ala Thr Gln Gln Tyr Gly Ser Phe Ala Trp Leu Phe Pro 165 170 175 cgg ctg cag atg ctg aat gtg ccg ccg cgc cat att caa aag ctt ttg 753 Arg Leu Gln Met Leu Asn Val Pro Pro Arg His Ile Gln Lys Leu Leu 180 185 190 195 gat caa ctg gac att aag ttg gtt ttc act gct cac ccg acg gag att 801 Asp Gln Leu Asp Ile Lys Leu Val Phe Thr Ala His Pro Thr Glu Ile 200 205 210 gtg cgg caa acg att cgt gat aag cag cgg cgg gtt gcc cga tta ctt 849 Val Arg Gln Thr Ile Arg Asp Lys Gln Arg Arg Val Ala Arg Leu Leu 215 220 225 gag caa ctg gat gtg ctg gag ggg gct tct cca cac cta acg gat tgg 897 Glu Gln Leu Asp Val Leu Glu Gly Ala Ser Pro His Leu Thr Asp Trp 230 235 240 aac gcc caa act tta cgg gca caa ctg atg gag gaa att cgc ctc tgg 945 Asn Ala Gln Thr Leu Arg Ala Gln Leu Met Glu Glu Ile Arg Leu Trp 245 250 255 tgg cgc acc gat gag ttg cac caa ttt aag ccg gag gtg ctc gat gag 993 Trp Arg Thr Asp Glu Leu His Gln Phe Lys Pro Glu Val Leu Asp Glu 260 265 270 275 gtg gaa tac acc ctc cac tac ttc aag gag gtc att ttt gct gtc att 1041 Val Glu Tyr Thr Leu His Tyr Phe Lys Glu Val Ile Phe Ala Val Ile 280 285 290 ccc aag ctc tat cgc cgt ctg gag cag tca tta cat gaa acc ttt ccc 1089 Pro Lys Leu Tyr Arg Arg Leu Glu Gln Ser Leu His Glu Thr Phe Pro 295 300 305 gcg ctt cag ccc ccc cgt cac cgt ttc tgc cgc ttt ggc tct tgg gtg 1137 Ala Leu Gln Pro Pro Arg His Arg Phe Cys Arg Phe Gly Ser Trp Val 310 315 320 ggg ggc gat cgc gat ggc aat ccc tat gtc aaa cca gaa gta acg tgg 1185 Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Val Lys Pro Glu Val Thr Trp 325 330 335 caa acg gcc tgc tat cag cgc aac tta gtt ctt gag gag tat att aag 1233 Gln Thr Ala Cys Tyr Gln Arg Asn Leu Val Leu Glu Glu Tyr Ile Lys 340 345 350 355 tcc gtt gag cgc tta atc aat ttg ctc agc ctg tcc ctg cac tgg tgc 1281 Ser Val Glu Arg Leu Ile Asn Leu Leu Ser Leu Ser Leu His Trp Cys 360 365 370 gat gtg ctg cca gat ttg cta gat tcc ctt gag cag gat caa cgg caa 1329 Asp Val Leu Pro Asp Leu Leu Asp Ser Leu Glu Gln Asp Gln Arg Gln 375 380 385 ctc ccg agt atc tat gag cag tat gcg gtg cgc tat cgg cag gaa ccc 1377 Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Gln Tyr Ala Val Arg Tyr Arg Gln Glu Pro 390 395 400 tac cgc ctg aaa ctg gcc tat gtg ctc aaa cgg ctg caa aat acc cgc 1425 Tyr Arg Leu Lys Leu Ala Tyr Val Leu Lys Arg Leu Gln Asn Thr Arg 405 410 415 gat cgc aac cgg gcg ctg caa acc tat tgc att cgc cgc aat gag gcg 1473 Asp Arg Asn Arg Ala Leu Gln Thr Tyr Cys Ile Arg Arg Asn Glu Ala 420 425 430 435 gaa gag tta aat aat gga cag ttt tac cgc cac ggt gaa gaa ttc ttg 1521 Glu Glu Leu Asn Asn Gly Gln Phe Tyr Arg His Gly Glu Glu Phe Leu 440 445 450 gca gaa ctg ctg ctc att cag cgt aac ctc aag gaa acg gga ttg gcc 1569 Ala Glu Leu Leu Leu Ile Gln Arg Asn Leu Lys Glu Thr Gly Leu Ala 455 460 465 tgc cgc gaa ttg gat gat ttg att tgc cag gtg gag gtc ttt ggc ttt 1617 Cys Arg Glu Leu Asp Asp Leu Ile Cys Gln Val Glu Val Phe Gly Phe 470 475 480 aat cta gca gcc ttg gat att cgc caa gaa agt acc tgt cac gct gag 1665 Asn Leu Ala Ala Leu Asp Ile Arg Gln Glu Ser Thr Cys His Ala Glu 485 490 495 gcc ctc aat gaa att acc gcc tat ttg ggt att ctc ccc tgt ccc tat 1713 Ala Leu Asn Glu Ile Thr Ala Tyr Leu Gly Ile Leu Pro Cys Pro Tyr 500 505 510 515 aca gaa ctc tca gaa gcc gaa cgc acc cgc tgg ctc ctc agt gaa ctc 1761 Thr Glu Leu Ser Glu Ala Glu Arg Thr Arg Trp Leu Leu Ser Glu Leu 520 525 530 tcg acc cgt cgc ccc ttg att cca ggg gaa ctc ccc ttt agc gat cgc 1809 Ser Thr Arg Arg Pro Leu Ile Pro Gly Glu Leu Pro Phe Ser Asp Arg 535 540 545 acc aat gaa atc att gaa aca ttc cgc atg gtg cgg caa ctc cag cag 1857 Thr Asn Glu Ile Ile Glu Thr Phe Arg Met Val Arg Gln Leu Gln Gln 550 555 560 gaa ttt ggc acc gat ttg tgc aat acc tac atc atc agc atg agc cat 1905 Glu Phe Gly Thr Asp Leu Cys Asn Thr Tyr Ile Ile Ser Met Ser His 565 570 575 gag gtc agc gat ctg ttg gag gta ctc ctc ttt gct aag gag gca ggc 1953 Glu Val Ser Asp Leu Leu Glu Val Leu Leu Phe Ala Lys Glu Ala Gly 580 585 590 595 ctt ttt gat cca gcc act ggc gct agt acc ctg caa gcc att ccc ctg 2001 Leu Phe Asp Pro Ala Thr Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ala Ile Pro Leu 600 605 610 ttt gaa acg gtg gag gat ctc aag cac gcc cca gcg gtg ctg acc caa 2049 Phe Glu Thr Val Glu Asp Leu Lys His Ala Pro Ala Val Leu Thr Gln 615 620 625 cta ttc tct ctc ccc ttt tgc cgg agc tat ctt gga agc aac agt acc 2097 Leu Phe Ser Leu Pro Phe Cys Arg Ser Tyr Leu Gly Ser Asn Ser Thr 630 635 640 ccc ttt ctg cag gag gtc atg ctg ggc tat tcc gac agc aat aag gat 2145 Pro Phe Leu Gln Glu Val Met Leu Gly Tyr Ser Asp Ser Asn Lys Asp 645 650 655 tcg ggc ttc ctc agt agc aac tgg gaa att tat aag gca caa caa cag 2193 Ser Gly Phe Leu Ser Ser Asn Trp Glu Ile Tyr Lys Ala Gln Gln Gln 660 665 670 675 ctg cag aaa att gct gag agt ttt ggc ttc caa ctg cgc att ttc cac 2241 Leu Gln Lys Ile Ala Glu Ser Phe Gly Phe Gln Leu Arg Ile Phe His 680 685 690 ggt cgg ggt ggt tca gtg ggt cgg ggt ggt gga cct gcc tat gcg gcg 2289 Gly Arg Gly Gly Ser Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro Ala Tyr Ala Ala 695 700 705 att ttg gca cag cca gca caa acg att aag gga cga atc aag att act 2337 Ile Leu Ala Gln Pro Ala Gln Thr Ile Lys Gly Arg Ile Lys Ile Thr 710 715 720 gag cag ggg gag gta ctg gct tcc aaa tac tcg ttg ccg gaa ctc gcg 2385 Glu Gln Gly Glu Val Leu Ala Ser Lys Tyr Ser Leu Pro Glu Leu Ala 725 730 735 ctc ttt aac ctc gaa aca gtg gcc aca gcg gtc atc caa gct agt ttg 2433 Leu Phe Asn Leu Glu Thr Val Ala Thr Ala Val Ile Gln Ala Ser Leu 740 745 750 755 ctc cgc agt agt att gat gag att gag cct tgg cac gag att atg gag 2481 Leu Arg Ser Ser Ile Asp Glu Ile Glu Pro Trp His Glu Ile Met Glu 760 765 770 gag ttg gct acg cga tcg cgc cag tgc tat cgc cat ctc atc tat gag 2529 Glu Leu Ala Thr Arg Ser Arg Gln Cys Tyr Arg His Leu Ile Tyr Glu 775 780 785 cag cca gaa ttc att gaa ttc ttt aac gaa gtc acc cca atc caa gag 2577 Gln Pro Glu Phe Ile Glu Phe Phe Asn Glu Val Thr Pro Ile Gln Glu 790 795 800 att agc caa ctg caa att agc tca cgg cca aca cgg cgg ggg ggg aag 2625 Ile Ser Gln Leu Gln Ile Ser Ser Arg Pro Thr Arg Arg Gly Gly Lys 805 810 815 aaa acc ctt gag agc ctg cgg gca att cct tgg gtc ttt agt tgg acg 2673 Lys Thr Leu Glu Ser Leu Arg Ala Ile Pro Trp Val Phe Ser Trp Thr 820 825 830 835 caa acc cgt ttc ctg ctg ccg gct tgg tat ggc gtg ggt act gcc ctg 2721 Gln Thr Arg Phe Leu Leu Pro Ala Trp Tyr Gly Val Gly Thr Ala Leu 840 845 850 aag gaa ttc ctt gag gaa aaa ccc gct gag cat ctc tcc ctc ttg cgc 2769 Lys Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro Ala Glu His Leu Ser Leu Leu Arg 855 860 865 tac ttc tac tat aag tgg cct ttc ttc cgc atg gtg atc tct aag gtt 2817 Tyr Phe Tyr Tyr Lys Trp Pro Phe Phe Arg Met Val Ile Ser Lys Val 870 875 880 gag atg acc ctt gcc aag gtt gat cta gag att gcc cgc tac tat gtc 2865 Glu Met Thr Leu Ala Lys Val Asp Leu Glu Ile Ala Arg Tyr Tyr Val 885 890 895 caa gaa ctc agc cag ccc caa aac cgt gaa gcc ttc tgc cgc ctc tac 2913 Gln Glu Leu Ser Gln Pro Gln Asn Arg Glu Ala Phe Cys Arg Leu Tyr 900 905 910 915 gat cag att gct cag gaa tat cgc ctg acc acg gaa tta gtc ctc acg 2961 Asp Gln Ile Ala Gln Glu Tyr Arg Leu Thr Thr Glu Leu Val Leu Thr 920 925 930 att act ggc cat gag cgg cta ctc gat ggg gat ccg gcg ctt cag cga 3009 Ile Thr Gly His Glu Arg Leu Leu Asp Gly Asp Pro Ala Leu Gln Arg 935 940 945 tcg gtg caa ctg cgc aat cgc acc att gtt cct ttg ggc ttc ctg caa 3057 Ser Val Gln Leu Arg Asn Arg Thr Ile Val Pro Leu Gly Phe Leu Gln 950 955 960 gta tct ctt ttg aaa cgg ctg cgc cag cac aat agc caa acc acc tct 3105 Val Ser Leu Leu Lys Arg Leu Arg Gln His Asn Ser Gln Thr Thr Ser 965 970 975 ggg gca att ttg cgc tcc cgc tat ggt cgg ggt gaa ttg cta cgg ggg 3153 Gly Ala Ile Leu Arg Ser Arg Tyr Gly Arg Gly Glu Leu Leu Arg Gly 980 985 990 995 gca ctc ttg acc atc aat ggc ata gca gcg ggg atg cgc aat aca ggc 3201 Ala Leu Leu Thr Ile Asn Gly Ile Ala Ala Gly Met Arg Asn Thr Gly 1000 1005 1010 taagcaacgg cgagggtgaa tcatggaccc gacgacccg 3240 <210> 2 <211> 1011 <212> PRT <213> Synechococcus vulcanus <400> 2 Met Thr Ser Val Leu Asp Val Thr Asn Arg Asp Arg Leu Ile Glu Ser 1 5 10 15 Glu Ser Leu Ala Ala Arg Thr Leu Gln Glu Arg Leu Arg Leu Val Glu 20 25 30 Glu Val Leu Val Asp Val Leu Ala Ala Glu Ser Gly Gln Glu Leu Val 35 40 45 Asp Leu Leu Arg Arg Leu Gly Ala Leu Ser Ser Pro Glu Gly His Val 50 55 60 Leu His Ala Pro Glu Gly Glu Leu Leu Lys Val Ile Glu Ser Leu Glu 65 70 75 80 Leu Asn Glu Ala Ile Arg Ala Ala Arg Ala Phe Asn Leu Tyr Phe Gln 85 90 95 Ile Ile Asn Ile Val Glu Gln His Tyr Glu Gln Gln Tyr Asn Arg Glu 100 105 110 Arg Ala Ala Gln Glu Gly Leu Arg Arg Arg Ser Val Met Ser Glu Pro 115 120 125 Ile Ser Gly Val Ser Gly Glu Gly Phe Pro Leu Pro His Thr Ala Ala 130 135 140 Asn Ala Thr Asp Val Arg Ser Gly Pro Ser Glu Arg Leu Glu His Ser 145 150 155 160 Leu Tyr Glu Ala Ile Pro Ala Thr Gln Gln Tyr Gly Ser Phe Ala Trp 165 170 175 Leu Phe Pro Arg Leu Gln Met Leu Asn Val Pro Pro Arg His Ile Gln 180 185 190 Lys Leu Leu Asp Gln Leu Asp Ile Lys Leu Val Phe Thr Ala His Pro 195 200 205 Thr Glu Ile Val Arg Gln Thr Ile Arg Asp Lys Gln Arg Arg Val Ala 210 215 220 Arg Leu Leu Glu Gln Leu Asp Val Leu Glu Gly Ala Ser Pro His Leu 225 230 235 240 Thr Asp Trp Asn Ala Gln Thr Leu Arg Ala Gln Leu Met Glu Glu Ile 245 250 255 Arg Leu Trp Trp Arg Thr Asp Glu Leu His Gln Phe Lys Pro Glu Val 260 265 270 Leu Asp Glu Val Glu Tyr Thr Leu His Tyr Phe Lys Glu Val Ile Phe 275 280 285 Ala Val Ile Pro Lys Leu Tyr Arg Arg Leu Glu Gln Ser Leu His Glu 290 295 300 Thr Phe Pro Ala Leu Gln Pro Pro Arg His Arg Phe Cys Arg Phe Gly 305 310 315 320 Ser Trp Val Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Val Lys Pro Glu 325 330 335 Val Thr Trp Gln Thr Ala Cys Tyr Gln Arg Asn Leu Val Leu Glu Glu 340 345 350 Tyr Ile Lys Ser Val Glu Arg Leu Ile Asn Leu Leu Ser Leu Ser Leu 355 360 365 His Trp Cys Asp Val Leu Pro Asp Leu Leu Asp Ser Leu Glu Gln Asp 370 375 380 Gln Arg Gln Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Gln Tyr Ala Val Arg Tyr Arg 385 390 395 400 Gln Glu Pro Tyr Arg Leu Lys Leu Ala Tyr Val Leu Lys Arg Leu Gln 405 410 415 Asn Thr Arg Asp Arg Asn Arg Ala Leu Gln Thr Tyr Cys Ile Arg Arg 420 425 430 Asn Glu Ala Glu Glu Leu Asn Asn Gly Gln Phe Tyr Arg His Gly Glu 435 440 445 Glu Phe Leu Ala Glu Leu Leu Leu Ile Gln Arg Asn Leu Lys Glu Thr 450 455 460 Gly Leu Ala Cys Arg Glu Leu Asp Asp Leu Ile Cys Gln Val Glu Val 465 470 475 480 Phe Gly Phe Asn Leu Ala Ala Leu Asp Ile Arg Gln Glu Ser Thr Cys 485 490 495 His Ala Glu Ala Leu Asn Glu Ile Thr Ala Tyr Leu Gly Ile Leu Pro 500 505 510 Cys Pro Tyr Thr Glu Leu Ser Glu Ala Glu Arg Thr Arg Trp Leu Leu 515 520 525 Ser Glu Leu Ser Thr Arg Arg Pro Leu Ile Pro Gly Glu Leu Pro Phe 530 535 540 Ser Asp Arg Thr Asn Glu Ile Ile Glu Thr Phe Arg Met Val Arg Gln 545 550 555 560 Leu Gln Gln Glu Phe Gly Thr Asp Leu Cys Asn Thr Tyr Ile Ile Ser 565 570 575 Met Ser His Glu Val Ser Asp Leu Leu Glu Val Leu Leu Phe Ala Lys 580 585 590 Glu Ala Gly Leu Phe Asp Pro Ala Thr Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ala 595 600 605 Ile Pro Leu Phe Glu Thr Val Glu Asp Leu Lys His Ala Pro Ala Val 610 615 620 Leu Thr Gln Leu Phe Ser Leu Pro Phe Cys Arg Ser Tyr Leu Gly Ser 625 630 635 640 Asn Ser Thr Pro Phe Leu Gln Glu Val Met Leu Gly Tyr Ser Asp Ser 645 650 655 Asn Lys Asp Ser Gly Phe Leu Ser Ser Asn Trp Glu Ile Tyr Lys Ala 660 665 670 Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ile Ala Glu Ser Phe Gly Phe Gln Leu Arg 675 680 685 Ile Phe His Gly Arg Gly Gly Ser Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro Ala 690 695 700 Tyr Ala Ala Ile Leu Ala Gln Pro Ala Gln Thr Ile Lys Gly Arg Ile 705 710 715 720 Lys Ile Thr Glu Gln Gly Glu Val Leu Ala Ser Lys Tyr Ser Leu Pro 725 730 735 Glu Leu Ala Leu Phe Asn Leu Glu Thr Val Ala Thr Ala Val Ile Gln 740 745 750 Ala Ser Leu Leu Arg Ser Ser Ile Asp Glu Ile Glu Pro Trp His Glu 755 760 765 Ile Met Glu Glu Leu Ala Thr Arg Ser Arg Gln Cys Tyr Arg His Leu 770 775 780 Ile Tyr Glu Gln Pro Glu Phe Ile Glu Phe Phe Asn Glu Val Thr Pro 785 790 795 800 Ile Gln Glu Ile Ser Gln Leu Gln Ile Ser Ser Arg Pro Thr Arg Arg 805 810 815 Gly Gly Lys Lys Thr Leu Glu Ser Leu Arg Ala Ile Pro Trp Val Phe 820 825 830 Ser Trp Thr Gln Thr Arg Phe Leu Leu Pro Ala Trp Tyr Gly Val Gly 835 840 845 Thr Ala Leu Lys Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro Ala Glu His Leu Ser 850 855 860 Leu Leu Arg Tyr Phe Tyr Tyr Lys Trp Pro Phe Phe Arg Met Val Ile 865 870 875 880 Ser Lys Val Glu Met Thr Leu Ala Lys Val Asp Leu Glu Ile Ala Arg 885 890 895 Tyr Tyr Val Gln Glu Leu Ser Gln Pro Gln Asn Arg Glu Ala Phe Cys 900 905 910 Arg Leu Tyr Asp Gln Ile Ala Gln Glu Tyr Arg Leu Thr Thr Glu Leu 915 920 925 Val Leu Thr Ile Thr Gly His Glu Arg Leu Leu Asp Gly Asp Pro Ala 930 935 940 Leu Gln Arg Ser Val Gln Leu Arg Asn Arg Thr Ile Val Pro Leu Gly 945 950 955 960 Phe Leu Gln Val Ser Leu Leu Lys Arg Leu Arg Gln His Asn Ser Gln 965 970 975 Thr Thr Ser Gly Ala Ile Leu Arg Ser Arg Tyr Gly Arg Gly Glu Leu 980 985 990 Leu Arg Gly Ala Leu Leu Thr Ile Asn Gly Ile Ala Ala Gly Met Arg 995 1000 1005 Asn Thr Gly 1010 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer for Synechococcus vulcanus PEPC <400> 3 gtcctcgaga atctgaaaaa caatgacatc agtcctcgat g 41 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer for Synechococcus vulcanus PEPC <400> 4 gtcgagctct tagcctgtat tgcgcatc 28 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 5 gatatctcca ctgacgtaag gg 22 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 6 cccagtcacg acgttgtaaa acgac 25

【図面の簡単な説明】

【図１】 Synechochoccus vulcanus PEPC遺伝子構築物
を導入した形質転換体植物の新鮮質量1gあたりのアミノ
酸含量（nmole/gFW）を示す。

【図２】 Synechochoccus vulcanus PEPC遺伝子構築物
を導入した形質転換体植物の新鮮質量1gあたりのアミノ
酸含量（nmole/gFW）の対照植物に対する量比を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 木坂 広明 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 秋山 愛 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AA07 AB03 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD10 4B018 MD48 ME14 MF14 4B024 AA08 BA07 CA02 DA01 EA04 GA11 4B065 AA01Y AA89X AB01 BA02 CA27 CA41 CA53

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
   ーゼ遺伝子が導入された形質転換植物であって、前記遺
   伝子がコードするホスホエノールピルビン酸カルボキシ
   ラーゼが、活性化にリン酸化を必要としない、および／
   または、アセチルCoA非依存性であることを特徴とす
   る、前記形質転換植物
2. 【請求項２】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
   ーゼ遺伝子を導入した形質転換植物であって、前記遺伝
   子がコードするホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
   ーゼが、活性化にリン酸化を必要とせず、かつ、アセチ
   ルCoA非依存性であることを特徴とする、前記形質転換
   植物。
3. 【請求項３】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
   ーゼ遺伝子が導入された形質転換植物であって、前記ホ
   スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子がらん
   藻由来である前記形質転換植物。
4. 【請求項４】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
   ーゼが耐熱性を有する請求項1〜３のいずれか１項に記
   載の形質転換植物。
5. 【請求項５】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
   ーゼ遺伝子がシネココッカス属のらん藻由来である請求
   項３に記載の形質転換植物。
6. 【請求項６】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
   ーゼ遺伝子がシネココッカス・ブルカヌス由来である請
   求項５に記載の形質転換植物。
7. 【請求項７】 シネココッカス・ブルカヌス PEPC遺伝
   子と80%以上のヌクレオチド配列相同性を有する核酸分
   子を含む核酸構築物が導入された形質転換植物。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか１項に記載の植
   物の種子。
9. 【請求項９】 請求項１〜７のいずれか１項に記載の植
   物を含む食品。
10. 【請求項１０】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
    ラーゼ遺伝子を含む核酸構築物を植物に導入する工程を
    含み、前記遺伝子がコードするホスホエノールピルビン
    酸カルボキシラーゼが、活性化にリン酸化を必要としな
    い、および／または、アセチルCoA非依存性であること
    を特徴とする、同一条件で栽培された同種の非形質転換
    植物と比較して、遊離アミノ酸含量が増大した形質転換
    植物を作出する方法。
11. 【請求項１１】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
    ラーゼ遺伝子を含む核酸構築物を植物に導入する工程を
    含み、前記遺伝子がコードするホスホエノールピルビン
    酸カルボキシラーゼが、活性化にリン酸化を必要としな
    い、および、アセチルCoA非依存性であることを特徴と
    する、同一条件で栽培された同種の非形質転換植物と比
    較して、遊離アミノ酸含量が増大した形質転換植物を作
    出する方法。
12. 【請求項１２】 らん藻由来のホスホエノールピルビン
    酸カルボキシラーゼ遺伝子を含む核酸構築物を植物に導
    入することを特徴とする、同一条件で栽培された天然の
    同種の植物と比較して遊離アミノ酸含量が増大した形質
    転換植物を作出する方法。
13. 【請求項１３】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
    ラーゼが耐熱性を有する請求項１０〜１２のいずれか１
    項に記載の方法。
14. 【請求項１４】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
    ラーゼ遺伝子がシネココッカス属のらん藻由来である請
    求項１２に記載の方法。
15. 【請求項１５】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
    ラーゼ遺伝子がシネココッカス・ブルカヌス由来である
    請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 シネココッカス・ブルカヌス PEPC遺
    伝子と80%以上のヌクレオチド配列相同性を有する核酸
    分子を含む核酸構築物を導入することを特徴とする、同
    一条件で栽培された同種の非形質転換植物と比較して遊
    離アミノ酸含量が増大した形質転換植物を作出する方
    法。