JP2009536029A - ヤトロファ・クルカス(Jatrophacurcas)由来のアセチル−CoAカルボキシラーゼ(ACCアーゼ)遺伝子の分子クローニングおよび配列決定 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヤトロファ・クルカス・エル植物の油含有量を増加させる方法に関する。本発明は、さらに、ヤトロファアセチル−CoAカルボキシラーゼ(ACCアーゼ)をコードする部分および完全cDNA配列、ならびにヤトロファACCアーゼ遺伝子をクローニングおよび発現して、油含有量が増加した形質転換植物を産生する方法を提供する。細胞質ACCアーゼを過剰発現することにより、植物および種子の脂肪酸合成および伸長を制御する方法を開発した。本発明は、植物においてヤトロファのACCアーゼを発現することにより形質転換植物を産生することを意図する。このような方法は、さらに、細胞質ACCアーゼを植物細胞に形質転換すること、および当該細胞をカルスに、次いで植物に成長させること、または、代わりに、葉片の形質転換により直接的に形質転換植物を産生することを含む。
Description
関連する出願への相互参照
本願は、2006年5月9日に出願されたインド国仮特許出願第720/MUM/2006号の利益を主張し、インド国仮特許出願第720/MUM/2006号はその全体が本明細書において参考として援用される。
発明の分野
本発明は、ヤトロファ・クルカス(Jatropha curcas)植物の油含有量を増加させることによって、当該植物の価値を高める方法に関する。特に、本発明は、ヤトロファ(Jatropha)アセチル−CoAカルボキシラーゼ(ACCアーゼ)をコードする完全cDNA配列および部分的DNA配列を含む核酸に関する。本発明はまた、ヤトロファACCアーゼ遺伝子をクローニングおよび発現させて、油含有量が増加した形質転換ヤトロファ植物を産生する方法を提供する。
本願は、2006年5月9日に出願されたインド国仮特許出願第720/MUM/2006号の利益を主張し、インド国仮特許出願第720/MUM/2006号はその全体が本明細書において参考として援用される。
発明の分野
本発明は、ヤトロファ・クルカス(Jatropha curcas)植物の油含有量を増加させることによって、当該植物の価値を高める方法に関する。特に、本発明は、ヤトロファ(Jatropha)アセチル−CoAカルボキシラーゼ(ACCアーゼ)をコードする完全cDNA配列および部分的DNA配列を含む核酸に関する。本発明はまた、ヤトロファACCアーゼ遺伝子をクローニングおよび発現させて、油含有量が増加した形質転換ヤトロファ植物を産生する方法を提供する。
発明の背景
ヤトロファ・クルカスは、ラテンアメリカ起源の植物であり、世界の乾燥熱帯地域および半乾燥熱帯地域にわたって広く分布している。ヤトロファは、170種以上を含む大きな属である。インドに一般的に存在する種は、ヤトロファ・クルカス、ヤトロファ・グランジュリフェラ(J.glandulifera)、ヤトロファ・ゴシピフォリア(J.gossypifolia)、ヤトロファ・マルチフィダ(J.multifida)、ヤトロファ・ナナ(J.nana)、ヤトロファ・パンディイロエフォリア(J.panduraefolia)、ヤトロファ・ヴィロサ(J.villosa)およびヤトロファ・ポダグリカ(J.podagrica)である。ヤトロファ・クルカスは、蝋燭およびセッケンを製造するための非食用ヤトロファ油を製造するために、およびバイオディーゼルの製造のための原料として、用いられる。ヤトロファは、栄養補助食品、医薬品、皮膚科学的およびパーソナル・ケア製品において、多様な医薬用途を有する。ヤトロファ・クルカス由来のラテックスは、「ヤトロフィン」として知られるアルカロイドに関連する抗癌性を有する。
ヤトロファ・クルカスは、ラテンアメリカ起源の植物であり、世界の乾燥熱帯地域および半乾燥熱帯地域にわたって広く分布している。ヤトロファは、170種以上を含む大きな属である。インドに一般的に存在する種は、ヤトロファ・クルカス、ヤトロファ・グランジュリフェラ(J.glandulifera)、ヤトロファ・ゴシピフォリア(J.gossypifolia)、ヤトロファ・マルチフィダ(J.multifida)、ヤトロファ・ナナ(J.nana)、ヤトロファ・パンディイロエフォリア(J.panduraefolia)、ヤトロファ・ヴィロサ(J.villosa)およびヤトロファ・ポダグリカ(J.podagrica)である。ヤトロファ・クルカスは、蝋燭およびセッケンを製造するための非食用ヤトロファ油を製造するために、およびバイオディーゼルの製造のための原料として、用いられる。ヤトロファは、栄養補助食品、医薬品、皮膚科学的およびパーソナル・ケア製品において、多様な医薬用途を有する。ヤトロファ・クルカス由来のラテックスは、「ヤトロフィン」として知られるアルカロイドに関連する抗癌性を有する。
ヤトロファ種のほとんどは、油を産生する種であるヤトロファ・クルカスおよびヤトロファ・グランジュリフェラを除いて、装飾用である。種子は、医学的および獣医学的目的に有用であることが見出されている半乾性油を含む。油含有量は、種子中で25〜30%であり、核種中で50〜60%である。油は、21%の飽和脂肪酸および79%の不飽和脂肪酸を含む。
ヤトロファ油は、リノレン酸(C18:2)およびオレイン酸(C18:1)であり、それらは共に油組成の80%までを占める。パルミチン酸(C16:0)およびステアリン酸(C18:0)は、この油中に存在する他の脂肪酸である。従って、ヤトロファ種に望ましい形質を導入する方法が必要である。種子収率および油含有量は、ヤトロファなどの種に最も望ましい形質である。
アセチル−CoAカルボキシラーゼ(ACCアーゼ、EC6.4.1.2)は、植物脂肪酸の生合成を制御し、かつそれによって脂質生合成に影響を及ぼすのに非常に重要な調節的役割を有する。ACCアーゼは、アセチル−CoAのATP依存的カルボキシル化を触媒して、マロニル−CoAを産生する。この反応は、HCO3をカルボキシルドナーとして用いてビオチン補欠分子族をカルボキシル化し、次いで、カルボキシル基をビオチンからアセチル−CoAに伝達する2つの段階で起こる。ビオチンカルボキシラーゼ、カルボキシル転移酵素、およびACCアーゼのビオチン成分は、それぞれ、原核生物中の異なるポリペプチドと関連する。非特許文献1。対照的に、非植物真核生物のACCアーゼは、単一の多機能性ポリペプチドの多量体から構成される。
原核生物型および真核生物型ACCアーゼはいずれも、植物中で見出された。(Kannangara,C.G.ら、Arch.Biochem.Biophys.152:83−91(1972);Nikolau,B.J.ら、“The Biochemistry and Molecular Biology of Acetyl−CoA Carboxylase and Other Biotin Enzymes,” In N Murata,C Somerville,eds,Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants,American Society of Plant Physiologists,Rockville,Md.pp.138−149(1993)およびSasaki,Y.ら、J.Biol.Chem.268:25118−25123(1993))(Harwood,J.L.,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.39:101−138(1988)。
ACCアーゼにより産生されるマロニル−CoAは、脂肪酸の合成および伸長、フラボノイドの合成、ならびにエチレン前駆物質であるアミノシクロプロパン−1−カルボン酸のマロニル化(malonation)、ならびにアミノ酸および配糖体のマロニル化などの、植物におけるいくつかの生化学反応および経路に関与する。(Harwood,J.L.,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.39:101−138(1988))(Ebel,J.ら、Eur.J Biochem.75:201−209(1977)Ebel,J.ら、Arch.Biochem.Biophys.232:240−248(1984)),(Liu,Y.ら、Planta 158:437−441(1983);Kionka,C.ら、Planta 162:226−235(1984))。
マロニル−CoAは、複数の細胞内位置で入手可能であるが、これは、脂肪酸合成などのこれらの反応のいくつかは色素体の内側で起こるがフラボノイド合成および脂肪酸伸長などの他の反応は色素体の外側で起こるからである。例えば,超長鎖脂肪酸は、原形質膜脂質の成分であり(Cahoon,E.B.ら、Plant Physiol.95:58−68(1991))、かつ、空中組織および地下組織の両方の表面を被覆するためのクチクラワックスの合成にも必要とされる。Harwood,J.L.,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.39:101−138(1988)。これらの超長鎖脂肪酸は、色素体から排出される炭素数16または18の脂肪酸の伸張によって、色素体の外側で合成される。伸長反応のためのマロニル−CoAは、細胞質中に存在し、おそらく、細胞質ACCアーゼにより提供される。
マロニル−CoAは、時および組織に関して非常に異なる量で入手可能である。例えば、増加した量のマロニル−CoAは、種の種子の発生における脂肪酸合成に必要であり、多量のトリアシルグリセロールを貯蔵する。Post−Beitenmiller,D.ら、“Regulation of Plant Lipid Biosynthesis:An Example of Developmental Regulation Superimposed on a Ubiquitous Pathway”,In DPS Verma,ed,Control of Plant Gene Expression,CRC press,Boca Raton,Fla.pp.157−174(1993)。花組織では、マロニル−CoAはフラボノイド色素の合成のためのカルコンシンターゼ反応において用いられ、この組織の乾燥重量の15%までを占める。Goodwin,T.W.ら、“Introduction to Plant Biochemistry”,2nd ed.,Pergamon Press New York,p.545(1983)。いくつかの組織では、ACCアーゼは、マロニル−CoAを恒常的に提供して、膜の合成および維持のための脂肪酸を産生し、かつ、短期間にわたって、紫外光に曝露している間(Ebel,J.ら、Eur J Biochem.75:201−209(1977))または病原真菌の攻撃の間(Ebel,J.ら、Arch.Biochem.Biophys.232:240−248(1984))に、フラボノイドを合成する。
多様な知見により、ACCアーゼは油料種子の脂肪酸合成のための律速酵素であるとの考えに達した。基質および産物のプールサイズの解析により、ACCアーゼは、ホウレンソウの葉および葉緑体における脂肪酸合成の明暗制御と関係付けられた。非特許文献2および非特許文献3。さらに、ACCアーゼ活性は、油料種子作物の種子の発生における脂質の析出と共に増加する。非特許文献4;非特許文献5;非特許文献6および非特許文献7。従って、アセチル−CoAのカルボキシル化を制御して脂肪酸合成物質マロニル−CoAを産生すると考えられる、アセチル−CoAカルボキシラーゼ(ACCアーゼ)をコードする遺伝子を提供することが望ましい。ヤトロファ・クルカスの植物、種子、培養物、細胞および組織において脂肪酸合成および伸長の長期制御を得るために、ACCアーゼ遺伝子の完全配列をクローン化および取得し、その後それを安定している植物プロモータ下でアグロバクテリウムが媒介する手段または微粒子銃の手段のいずれかにより植物組織中に形質転換することが望ましい。これは油含有量が高い遺伝子改変ヤトロファ・クルカス植物を提供し得るであろう。
非特許文献8は、細胞質アセチル−CoAカルボキシラーゼ(ACCアーゼ)アイソザイムをコードするシロイヌナズナ遺伝子を特徴付けた。特許文献1は、プロモータに作動可能に連結した細胞質ACCアーゼを含む組換え核酸構築物を含むダイズ植物の種子を開示する。これらの種子は、ACCアーゼをコードする核酸で形質転換していない対応する植物により産生される種子と比較して、増加した油含有量を示す。しかしながら、これらの教示は、アブラナ種子に比較的特異的である。
また、ACCアーゼは、フラボノイド、イソフラボノイドおよび他の二次的代謝産物の合成に利用可能なマロニル−CoAの量を増加することもまた報告されている。逆に、ACCアーゼ遺伝子の発現を減少させることにより、植物に存在するマロニル−CoAの量が低減され得、かつアセチル−CoAの量が増加され得る。従って、ACCアーゼ遺伝子の発現を変化させることにより、その多くが病原体に対する植物防疫または薬用もしくは他の用途に価値を有する二次的植物産物の産生に利用可能なアセチル−CoAまたはマロニル−CoAの量が変化し得る。当該分野でのこの必要性の観点では、本発明まで、対応するACCアーゼ遺伝子はヤトロファ・クルカスから精製されなかった。
アブラナ、ダイズ、またはACCアーゼ遺伝子を過剰発現する他の油用種子作物は、種子の脂肪酸合成を増加させ、その結果、アブラナ、ダイズ、または他の油用種子作物の油含有量が増加することが観察されている。さらに、ACCアーゼ遺伝子発現を減少させることによって種子の脂肪酸合成を減少させる結果、低脂肪ピーナッツなどの「低脂肪」種子が得られることが観察されている。また、細胞質ACCアーゼ遺伝子を過剰発現させることにより種子の脂肪酸伸長を増加させることは、アブラナ、ハマナおよび他の油用種子植物におけるエルカ酸などの超長鎖脂肪酸の含有量を増加させるのにも有用であることが、Battey,J.F.ら、Trends in Biotech.7:122−125(1989)に報告されている。エルカ酸およびその誘導体は、潤滑剤、可塑剤およびナイロンの製造に用いられ、かつ、他の産業上の用途を有するので、このことは望ましい。エルカ酸は重要な産業上の用途を有するが、食物製品においてヒトが消費するには健康的ではないであろう。従って、アンチセンスRNA方法によって細胞質ACCアーゼ遺伝子の発現を減少させることによって脂肪酸伸長を減少させ、それによってエルカ酸含有量を減少させることもまた望ましい。このことにより、ヒトの消費に適したアブラナ、マスタード、ハマナおよび他の油用種子植物の種子油が得られ得るが、これはエルカ酸、エイコサノイル酸および他の超長鎖脂肪酸の含有量が減少するからである。
ACCアーゼはまた、Burton,J.D.ら、Biochem.Biophys.Res.Commun.148:1039−1044(1987)に報告されているように、アリールオキシフェノキシプロピオネートおよびシクロヘキサンジオンファミリーの除草剤のターゲットである。トウモロコシなどのいくつかの単子葉植物のACCアーゼは、双子葉種のACCアーゼと比べて、除草剤への感受性がずっと高い。従って、トウモロコシなどの感受性種の色素体において双子葉シロイヌナズナ由来ACCアーゼ遺伝子を過剰発現させることにより、希望する種において除草剤抵抗性がもたらされ得る。従って、除草剤は、遺伝子改変された植物種の分野において単子葉植物草を制御するのに有用であるであろう。アセチル−CoAおよびマロニル−CoAは、種々の植物の二次的代謝産物の前駆物質であることが、研究により示されている。従って、ACCアーゼの発現を増加させることにより、フラボノイド、イソフラボノイド、植物脂肪酸合成および他の二次的代謝産物の合成に利用可能なマロニル−CoAの量が増加する。
当該分野では、ヤトロファ・クルカスの植物、種子、培養、細胞および組織における脂肪酸の合成および伸長の長期制御を得るため、ヤトロファ・クルカスACCアーゼ遺伝子の完全配列が必要とされている。従って、ACCアーゼ遺伝子の完全配列を構成する核酸をクローン化し、それを安定な植物プロモータ下で植物組織を形質転換するのに用いることが望ましいであろう。このことは、油含有量が高い遺伝子改変ヤトロファ植物を提供するであろう。
Samols,D.ら、J.Biol.Chem.263:6461−6464(1988)
Post−Beitenmiller,D.ら、J.Biol.Chem.266:1858−1865(1991)
Post−Beitenmiller,D.ら、Plant Physiol.100:923−930(1992)
Simcox,P.D.ら、Canada J.Bot.57:1008−1014(1979)
Turnham,E.ら、Biochem.J.212:223−229(1983)
Charlesら、Phytochem.25:55−59(1986)
Deerburg,S.ら、Planta 180:440−444(1990)
Roesler(1994)ら、Plant Physiol.105:611−617
発明の目的
本発明の目的は、ヤトロファACCアーゼ酵素をコードする完全cDNA配列およびゲノムDNA配列を提供することである。
本発明の目的は、ヤトロファACCアーゼ酵素をコードする完全cDNA配列およびゲノムDNA配列を提供することである。
本発明の目的は、植物細胞において機能的なプロモータに作動可能に連結したアセチル−CoAカルボキシラーゼまたはその機能的変異体をコードする遺伝子を含む発現カセットを提供することである。
本発明の目的は、ヤトロファアセチル−CoAカルボキシラーゼ遺伝子を植物細胞中に導入しかつ発現することにより、植物の油含有量を変化させる方法を提供することである。
本発明の目的はまた、少なくとも1.5〜2倍増加した油含有量を有する形質転換植物を提供することによって、植物の商業的価値を増強することである。
発明の要旨
本発明は、ヤトロファ植物においてアセチル−CoAのカルボキシル化を増加および減少させて、マロニル−CoAを産生するのに用いられ得る核酸配列に関する。本発明では、本発明者らは、その発現によってアセチル−CoAのカルボキシル化を制御してマロニル−CoAを産生することができる、部分的に配列決定された細胞質ACCアーゼを開示する。マロニル−CoAが植物および種子中での脂肪酸合成および伸長に必要であることを念頭に置いて、本発明の発明者らは、細胞質ACCアーゼを過剰発現することにより、植物および種子の脂肪酸合成および伸長を制御する方法を首尾よく開発した。従って、本発明は、構築物によりこれらの植物においてヤトロファのACCアーゼを発現することにより形質転換植物を産生することを意図する。このような方法は、さらに、細胞質ACCアーゼを植物細胞に形質転換すること、および当該細胞をカルスに、次いで植物に成長させること、または、代わりに、葉片の形質転換により直接的に形質転換植物を産生することを含む。
本発明は、ヤトロファ植物においてアセチル−CoAのカルボキシル化を増加および減少させて、マロニル−CoAを産生するのに用いられ得る核酸配列に関する。本発明では、本発明者らは、その発現によってアセチル−CoAのカルボキシル化を制御してマロニル−CoAを産生することができる、部分的に配列決定された細胞質ACCアーゼを開示する。マロニル−CoAが植物および種子中での脂肪酸合成および伸長に必要であることを念頭に置いて、本発明の発明者らは、細胞質ACCアーゼを過剰発現することにより、植物および種子の脂肪酸合成および伸長を制御する方法を首尾よく開発した。従って、本発明は、構築物によりこれらの植物においてヤトロファのACCアーゼを発現することにより形質転換植物を産生することを意図する。このような方法は、さらに、細胞質ACCアーゼを植物細胞に形質転換すること、および当該細胞をカルスに、次いで植物に成長させること、または、代わりに、葉片の形質転換により直接的に形質転換植物を産生することを含む。
本発明は、植物においてアセチル−CoAのカルボキシル化を一般的に増加および減少させてマロニル−CoAを産生するのに用いられ得る配列を単離することに関する。本発明において、本出願人は、その発現がアセチル−CoAのカルボキシル化を制御してマロニル−CoAを産生することができる、部分的に配列決定された細胞質ACCアーゼを開示した。本発明は、特に、ヤトロファアセチル−CoAカルボキシラーゼをコードする完全cDNA配列およびゲノムDNA配列を提供する。
本発明は、さらに、ヤトロファ・クルカスの油含有量を増加させる方法を提供する。本発明は、また、ヤトロファACCアーゼ遺伝子をクローニングおよび発現させて、油含有量が増加した形質転換植物を形成する方法を提供する。従って、本発明は、ヤトロファのACCアーゼ遺伝子を発現させることによる形質転換植物の産生を意図する。ACCアーゼは、発現構築物によって、植物に導入することができる。これは、細胞質ACCアーゼを含む構築物を植物細胞に形質転換し、当該細胞をカルスに、およびその後植物に成長させることを含む。あるいは、形質転換植物は、葉片の形質転換により直接的に産生させることもできる。
1つの実施態様では、本発明は、単離および精製された、ヤトロファACCアーゼ遺伝子をコードするcDNAのセグメントを含むcDNA分子を提供する。植物アセチル−CoAカルボキシラーゼをコードするcDNA分子は、植物アセチル−CoAカルボキシラーゼ遺伝子またはその部分に実質的に相補的なアンチセンスcDNA配列をコードする未改変の植物アセチル−CoAカルボキシラーゼまたは改変された植物アセチル−CoAカルボキシラーゼをコードすることができる。本発明のcDNA分子はまた、ヤトロファアセチル−CoAカルボキシラーゼ遺伝子に作動可能に連結したアミノ末端植物葉緑体輸送ペプチド配列をさらに含むこともできる。
他の実施態様では、本発明は、油含有量が増加または変化したヤトロファ植物を産生する方法を提供する。当該方法は、植物ACCアーゼ遺伝子を植物細胞に導入しかつ発現することを含む。当該方法は、さらに、植物細胞のプロモータ機能に作動可能に連結した植物アセチル−CoAカルボキシラーゼあるいはその改変されたまたは機能的な変異体をコードする遺伝子を含むキメラcDNA分子を植物細胞に導入する工程、および当該遺伝子を、植物細胞の油含有量を変化させるのに有効な量で発現させることを含む。
他の実施態様では、本発明は、油含有量を変化させる方法であって、そのタイプの植物細胞に通常存在する全油含有量の変化、または細胞に存在する油のタイプの変化を含む、方法に関する。本発明の方法による植物細胞中での油含有量の変化は、以下を含む少なくとも2つの方法により、達成される:(1)改変された植物アセチル−CoAカルボキシラーゼ遺伝子の発現の増加または減少、あるいは(2)改変されたまたは機能的な変異体植物アセチル−CoAカルボキシラーゼ遺伝子を導入することによる。
1つの実施態様では、当該方法は、以下の工程を含む:(i)ヤトロファにおけるACCアーゼ遺伝子の単離および同定、(ii)ACCアーゼをコードするcDNAクローンの形成、(iii)発現カセットの調製、(iv)発現カセットの植物細胞への導入/伝達、(v)形質転換植物におけるコードされた遺伝子の発現/活性の検出、および(vi)植物の再現。
1つの実施態様では、ヤトロファにおけるACCアーゼをコードする遺伝子の単離および同定は、Sambrookら(1989)により記載された標準的な方法を用いる縮重プライマーストラテジーを用いて単離および同定されたゲノムDNAまたはcDNAプールを含む。部分的ACCアーゼ遺伝子は、本明細書中で詳細な説明において援用される。植物ACCアーゼ遺伝子の単離された全長コピーの存在は、植物アセチル−CoAカルボキシラーゼ酵素の部分配列解析によるかまたは発現解析により検証される。
本発明の他の実施態様では、5’、中央および3’末端の部分をコードするDNAフラグメントが得られ、これらはACCアーゼ遺伝子を含む発現カセットを構築するのに用いられる。この方法は、発現カセットの単一または複数のコピーを植物細胞に導入することを含む。好ましい実施態様では、単離された不変のACCアーゼ遺伝子は、植物細胞においてACCアーゼ遺伝子の発現を促進するプロモータと組み合わされるか、またはそれに連結される。発現カセットは、機能的プロモータに連結されたACCアーゼ遺伝子を含む。他の実施態様では、機能的プロモータに連結されたACCアーゼ遺伝子は、発現ベクター中で提供される。
本発明の1つの実施態様では、高レベルの遺伝子発現に用いられるプロモータは、強いプロモータとしても知られる誘導性プロモータである。1つの実施態様では、用いられる強いプロモータは、異種性遺伝子発現のために単離された配列であり、これは形質転換細胞の検出および選択を促進する一方、所望される場合は、高レベルの遺伝子発現を提供する。本発明の好ましい実施態様では、プロモータは、植物においてACCアーゼ遺伝子またはその機能的変異体の過剰発現を特異的に促進し、それによってアセチル−CoAを増加させ、最終的には、植物中でのマロニル−CoAレベルの増加をもたらす。このようなプロモータには、35Sカリフラワーモザイクウイルスプロモータ、ノパリンシンターゼ(NOS)プロモータ、ならびにβ−ファゼオリン、ナピンおよびユビキチンなどのいくつかの他の胚乳特異的プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の他の実施態様では、発現カセットは、必要に応じて、他のDNA配列を含むことができる。
本発明の他の実施態様では、発現カセットは、さらに、プロモータと植物ACCアーゼ遺伝子との間で作動可能に連結した葉緑体輸送ペプチド配列を含む。
本発明の他の実施態様では、植物細胞に導入される発現カセットは、植物ACCアーゼ遺伝子の3’末端に連結した植物転写末端およびポリアデニル化シグナルおよび翻訳シグナルを含む。
本発明の他の実施態様では、輸送ペプチドをコードするDNAフラグメントは、輸送ペプチドの公知配列から全体的にまたは部分的にのいずれかで化学的に合成される。
本発明の他の実施態様では、ACCアーゼ遺伝子を含む発現カセットは、公知の発現ベクターにサブクローン化される。当該方法は、発現ベクターを宿主細胞に導入すること、ならびに植物ACCアーゼ遺伝子の発現を検出および/または定量化することを含む。適切なベクターには、プラスミドまたは他のバイナリーベクターが挙げられる。発現ベクターは、プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウムにより媒介される形質転換、電気穿孔法、マイクロプロジェクタイル法または任意の当該分野で公知の技術により、原核細胞または真核細胞に導入することができる。形質転換細胞の選択は、発現ベクター内でコードされるマーカーを用いて行うことができる。
本発明の1つの実施態様では、遺伝子発現の検出は、PCR技術またはWesternブロットによる定量的検出により行われる。特異的酵素活性の変化は、形質転換細胞において酵素活性を測定することにより検出される。油含有量の変化は、標準的な方法により検討される。
本発明の1つの実施態様では、方法は、油含有量の変化または量の変化またはACCアーゼ遺伝子の特異的活性を示す形質転換植物および種子を再現することを含む。形質転換植物は、当該分野で公知の標準的技術および本明細書中の教示を用いて産生される。好ましい実施態様では、本発明は、少なくとも1.5〜2倍の増加した油含有量を有することによって植物の商業的価値が高まった種子を提供する。
以下の図面は、本明細書の部分を構成し、本開示の特定の局面をさらに示すために含まれ、その発明は、1つまたはそれ以上のこれらの図面を、本明細書中に示される特定の実施態様の詳細な説明と共に参照することにより、より良く理解することができる。
図1は、ヤトロファ・クルカス由来のACCアーゼ遺伝子の625塩基対ゲノムフラグメントの増幅を図解する。
図2Aおよび図2Bは、ヤトロファ・クルカス由来のACCアーゼ遺伝子の597塩基対中間フラグメントを含むpGEM:Jlクローンのヌクレオチド配列を図解する。プライマー結合部位(ME23およびME25)には下線を付している。
図3は、ヤトロファ・クルカス由来のACCアーゼ遺伝子の1.25kb中間フラグメントを含むクローン番号J−2 Forward(配列番号2)およびJ−2 Reverse(配列番号3)のヌクレオチド配列を図解する。
図3は、ヤトロファ・クルカス由来のACCアーゼ遺伝子の1.25kb中間フラグメントを含むクローン番号J−2 Forward(配列番号2)およびJ−2 Reverse(配列番号3)のヌクレオチド配列を図解する。
図4は、ヤトロファ・クルカス由来のACCアーゼ遺伝子の1.25kb増幅されたフラグメントの確認を図解する。
図5は、クローン番号J2 Reverseを有する配列番号3の配列リストを図解する。長さ:626塩基タイプ:核酸らせん型:二重トポロジー:線状分子型:DNA(ゲノムの)
図6は、ヤトロファ・クルカスJ−1アセチル−CoAカルボキシラーゼ遺伝子部分配列の翻訳されたペプチド配列である配列番号4を図解する。
図7は、ヤトロファ・クルカスクローンJ−2アセチル−CoAカルボキシラーゼ配列の部分配列である配列番号5を図解する。長さ:611塩基、タイプ:核酸、らせん:一重、トポロジー:線状、および分子型:mRNA
図8は、ヤトロファ・クルカスクローンJ−2アセチル−CoAカルボキシラーゼ遺伝子の翻訳されたペプチド配列である、配列番号6の部分配列を図解する。長さ:303、タイプ:タンパク質
図9A、B、C、Dは、ヤトロファ・クルカスアセチル−CoAカルボキシラーゼmRNAの部分配列(配列番号7)を図解する。長さ:6634タイプ:核酸らせん:一重トポロジー:線状分子型:Mrna
図9A、B、C、Dは、ヤトロファ・クルカスアセチル−CoAカルボキシラーゼmRNAの部分配列(配列番号7)を図解する。長さ:6634タイプ:核酸らせん:一重トポロジー:線状分子型:Mrna
図9A、B、C、Dは、ヤトロファ・クルカスアセチル−CoAカルボキシラーゼmRNAの部分配列(配列番号7)を図解する。長さ:6634タイプ:核酸らせん:一重トポロジー:線状分子型:Mrna
図10は、ヤトロファ・クルカスアセチル−CoAカルボキシラーゼmRNAの翻訳されたペプチド配列である、部分配列(配列番号8)を図解する。長さ:2211およびタイプ:タンパク質
図10は、ヤトロファ・クルカスアセチル−CoAカルボキシラーゼmRNAの翻訳されたペプチド配列である、部分配列(配列番号8)を図解する。長さ:2211およびタイプ:タンパク質
図11A〜Fは、ヤトロファ・クルカスのゲノムDNA配列である。
図11A〜Fは、ヤトロファ・クルカスのゲノムDNA配列である。
図11A〜Fは、ヤトロファ・クルカスのゲノムDNA配列である。
図11A〜Fは、ヤトロファ・クルカスのゲノムDNA配列である。
図11A〜Fは、ヤトロファ・クルカスのゲノムDNA配列である。
図11A〜Fは、ヤトロファ・クルカスのゲノムDNA配列である。
図11A〜Fは、ヤトロファ・クルカスのゲノムDNA配列である。
発明の詳細な説明
定義:
本明細書中で用いられる「遺伝子導入」は、外来性のDNAを、生物体の細胞内に、通常、ベクターにより(しかし、必ずしもそうではない)取り込むことを意味する。
定義:
本明細書中で用いられる「遺伝子導入」は、外来性のDNAを、生物体の細胞内に、通常、ベクターにより(しかし、必ずしもそうではない)取り込むことを意味する。
本明細書中で用いられる用語「形質転換された」は、構築物などの外来性ポリヌクレオチド分子が導入された細胞、組織、器官または生物体について述べている。好ましくは、導入されたポリヌクレオチドは、導入するポリヌクレオチド分子が引き続く子孫により受け継がれるように、レシピエントの細胞、組織、器官または生物体のゲノムDNAに一体化される。
「遺伝子改変植物」は、1つまたはそれ以上の個別の遺伝子を植物にコピーおよび伝達してその遺伝的構成を変化させ、次いで植物に特定の特徴を取り込むかまたはそれから除去する技術により、遺伝子的に改変された植物である。
「形質転換植物」は、新しい機能を付与し得る新しい遺伝子(導入遺伝子)を有する遺伝子改変植物を意味する。例えば、形質転換植物は、新しい特徴(例えば、増加した油含有量)を有する植物を作製するための組換えDNA技術を用いて遺伝子操作された植物である。形質転換植物は、1つまたはそれ以上の遺伝子を、しばしば形質転換により植物ゲノムに加えることにより、産生される。
「形質転換」または「形質転換された」細胞または生物体には、細胞または生物体の子孫、およびこのような形質転換植物を親として交配に用いる育種プログラムから産生され、かつ外来性ポリヌクレオチド分子の存在から得られる改変表現型を示す子孫が挙げられる。
本明細書中で用いられる「アグロバクテリウムが媒介する形質転換」は、DNAを伝達して植物遺伝子工学の目的で利用される細胞を培養するためのアグロバクテリウムの使用である。
本明細書中で用いられる「増加した」または「変化した」または「高い」「油含有量」のヤトロファ・クルカス植物は、油含有量が増加した種子を有するものである。例えば、30%を超える油含有量の種子を有するヤトロファ・クルカスは、「油含有量が高い」植物であると考えられる。
実施態様に従って、本発明は、ヤトロファ植物におけるACCアーゼ遺伝子の単離および同定を提供する。植物ACCアーゼをコードする遺伝子は、縮重プライマーストラテジーを用いて、ヤトロファ・クルカス・エルのgDNAまたはcDNAプールから同定および単離された。その部分配列は、Sambrookら(1989)に記載されるような標準的方法で得られたが、当該方法は、本発明において本明細書中で参照として援用される。配列相同性は、他の公知のアセチル−CoAカルボキシラーゼと比較された。得られた5’、中央および3’末端の部分をコードするDNAフラグメントが、ACCアーゼ遺伝子を含む発現カセットを構築するのに用いられた。植物ACCアーゼ遺伝子の単離された全長コピーの存在は、部分配列解析により、または植物アセチル−CoAカルボキシラーゼ酵素の発現により、検証された。
次いで、cDNAまたは部分的DNA配列を適切なプロモータと組み合わせて、組換え型発現カセットを形成する。次いで、この発現カセットを、植物細胞中で伝達、導入および発現させる。次いで、植物細胞の酵素活性または遺伝子発現を検出し、次いで、さらに、油含有量が高い植物を再現する。
植物ACCアーゼ遺伝子を得て増幅した後、次いで、これを、植物細胞中で機能的な適切なプロモータと併用して、発現カセットを形成することができる。本発明の発現カセットは、植物細胞中で機能的なプロモータに作動可能に連結した植物アセチル−CoAカルボキシラーゼまたはその機能的変異体をコードする遺伝子を含む。当該遺伝子は、植物細胞の油含有量を変化させることができる植物ACCアーゼをコードすることができる。本発明の発現カセットはまた、プロモータに作動可能に連結したACCアーゼ遺伝子またはその部分に相補的なアンチセンスDNA配列を含む。プロモータは、恒常的なプロモータまたは胚乳特異的プロモータなどの組織特異的プロモータから選択される。ACCアーゼ遺伝子のアンチセンスDNAを有する発現カセットは、植物細胞中でACCアーゼの発現を減少させるのに用いることができる。
ほとんどの遺伝子は、プロモータとして知られるDNA配列の領域を有し、これは遺伝子発現を制御する。プロモータ領域は、代表的には、原核細胞および真核細胞の両方におけるコード配列からの上流の隣接するDNA配列において見出される。プロモータ配列は、下流の遺伝子配列の転写の制御を提供し、代表的には、約50〜約2000のヌクレオチド塩基対を含む。プロモータ配列はまた、遺伝子発現のレベルに影響し得るエンハンサー配列などの制御配列を含む。いくつかの単離されたプロモータ配列は、未変性または相同の遺伝子とは異なる遺伝子である異種性遺伝子の遺伝子発現を提供することができる。プロモータ配列はまた、強いまたは弱いまたは誘導性であることが知られている。強いプロモータは、高レベルの遺伝子発現を提供するが、弱いプロモータは、非常に低レベルの遺伝子発現を提供する。誘導性プロモータは、外因的に加えられた因子または発生上の刺激の環境に応答して、遺伝子発現の作動および停止を提供するプロモータである。プロモータはまた、組織特異的または発生上の制御を提供することができる。異種性遺伝子の強いプロモータである単離プロモータ配列は有利であるが、これは、形質転換細胞の容易な検出および選択を可能にするのに十分なレベルの遺伝子発現を提供し、かつ、所望の場合に高レベルの遺伝子発現を提供するからである。植物細胞で機能的な特異的プロモータには、35Sカリフラワーモザイクウイルスプロモータ、ノパリンシンターゼ(NOS)プロモータなどが挙げられる。発現に好ましいプロモータは、35Sカリフラワーモザイクウイルスプロモータ、ならびにβ−ファゼオリン、ナピンおよびユビキチンなどのいくつかの胚乳特異的プロモータであるが、本発明は、このようなプロモータに限定されない。
ACCアーゼ遺伝子は、上記のSambrookに記載の標準的な方法により、プロモータと組み合わせることができる。簡便には、35Sカリフラワーモザイクウイルスプロモータなどのプロモータを含むプラスミドは、Jefferson(Plant Molecular Biology Reporte 5:387(1987))に記載のように構築することができるか、またはClontech Lab,Mountain View,Calif(例、pBI121またはpBI221)から得ることができる。代表的には、これらのプラスミドは、プロモータから下流の異なる制限酵素に特異性を有する複数のクローニング部位を提供するために構築される。植物ACCアーゼの遺伝子は、制限酵素を用いてプロモータから下流にサブクローン化されて、遺伝子が発現されることができるように遺伝子がプロモータに対して正しい方向で挿入されることを確実にすることができる。好ましいバージョンでは、ヤトロファ・クルカスACCアーゼは、35SCaMV、あるいはpBI121またはpBI221などのプラスミド中のβ−ファゼオリンまたはナピンまたはユビキチンプロモータに作動可能に連結する。一旦植物ACCアーゼ遺伝子がプロモータおよびプラスミドに作動可能に連結すると、このように形成された発現カセットは、他のプラスミドまたはベクターにさらにサブクローン化することができる。
発現カセットは、必要に応じて、他のDNA配列を含むことができる。発現カセットは、さらに、プロモータに作動可能に連結した葉緑体輸送ペプチド配列および隣接する植物ACCアーゼ遺伝子を含むこともできる。発現カセットを植物細胞に導入する場合、発現カセットはまた、植物ACCアーゼ遺伝子の3’末端に連結した植物転写末端およびポリアデニル化シグナルおよび翻訳シグナルを含むこともできる。植物ACCアーゼに関与する生合成経路の1つの部位は葉緑体であるので、必要であれば、発現カセットを、葉緑体輸送ペプチドをコードするDNA配列と組み合わせることができる。葉緑体輸送ペプチドは、代表的には、長さが40〜70アミノ酸であり、翻訳後にタンパク質を葉緑体(choloroplast)に指向するよう機能する。輸送ペプチドは、葉緑体への移入の間または直後のいずれかに切断されて、成熟タンパク質を生じる。植物ACCアーゼをコードする遺伝子の完全コピーは、葉緑体輸送ペプチド配列を含み得る。この場合、外因的に含まれる葉緑体輸送ペプチド配列を発現カセットに組み合わせる必要はないかもしれない。
輸送ペプチド配列は、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ、フェリドキシン、葉緑素a/b結合タンパク質などの小さなサブユニットである。あるいは、輸送ペプチドをコードするDNAフラグメントは、輸送ペプチドの公知配列から全体的にまたは部分的にのいずれかで化学的に合成され得る。輸送ペプチドの供給源に関係なく、これは、翻訳開始コドン、および宿主植物の葉緑体により認識されかつその中で適切に機能するアミノ酸配列を含む。輸送ペプチドおよび植物ACCアーゼの間の接合部におけるアミノ酸配列は、実質的に切断に関連して、成熟タンパク質(例えば、酵素)を生じる。
本発明はまた、宿主細胞において植物ACCアーゼを産生する方法を提供する。当該方法は、植物ACCアーゼをコードする遺伝子を含む発現カセットを導入する工程を含む。発現カセットは、真核細胞または原核細胞のいずれかで機能的なプロモータを含むことができる。好ましくは、発現カセットは、組換えで産生されるタンパク質の産生に常套的に用いられる大腸菌などの原核細胞に導入される。発現カセットは、プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウムが媒介する形質転換、微粒子銃、電気穿孔法などの標準的な方法により、単子葉植物または双子葉のいずれかに導入することができる。形質転換された組織または細胞は、選択可能なマーカー遺伝子の存在のために選択することができる。
植物ACCアーゼ遺伝子の発現または過剰発現をスクリーニングする方法もまた、本発明により提供される。ACCアーゼ遺伝子を含む発現カセットは、一旦形成されると、公知の発現ベクターにサブクローン化することができる。このスクリーニング方法は、発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、および植物ACCアーゼ遺伝子の発現を検出および/または定量化する工程を含む。
植物ACCアーゼ遺伝子の一過性の発現は、形質転換細胞中で検出および定量化することができる。遺伝子発現は、クローンACCアーゼに特異的な抗体を用いる定量的ウエスタンブロットまたは酵素の比活性の増加を検出することにより、定量化することができる。植物ACCアーゼの過剰発現を提供する発現カセットは、単子葉植物および/または双子葉組織を形質転換して形質転換植物および種子を再現するのに用いることができる。
本発明はまた、植物中の油含有量を変化させる方法を提供する。当該方法は、植物細胞中で機能的なプロモータに作動可能に連結する植物ACCアーゼをコードする遺伝子を含む発現カセットを植物組織の細胞に導入する工程、および遺伝子を植物細胞の油含有量を変化させるのに有効な量で発現させる工程を含む。植物細胞における油含有量の変化には、植物細胞に通常存在する油含有量に対する全油含有量の変化を挙げることができる。植物細胞の油含有量を変化させるのに有効な量での遺伝子の発現は、当該遺伝子が不変のACCアーゼあるいは遺伝子の変異体または改変型のいずれをコードするかに依存する。不変の植物ACCアーゼの有効な量での発現は、当該植物細胞中で通常存在する油含有量に対して当該細胞中で少なくとも約1.2〜2倍の油含有量の変化を提供し得る量であり、好ましくは、ACCアーゼの量を、当該植物細胞中に存在する酵素の量に対して約2〜20倍増加させる。酵素の改変型は、未変性の酵素のレベルに匹敵する量で、または当該酵素の改変型がより高い特異的活性を有する場合はより低いレベルで、発現し得る。
以下の実施例は、本発明の実施態様を説明する。以下の実施例に開示された技術は、本発明の実施にあたってより良く機能することが本発明者によって発見された技術を代表することが、当業者に理解されるであろう。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施態様に多くの改変をすることができ、かつ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく類似または同様の結果を得ることができることを理解すべきである。
実施例1:ヤトロファにおけるACCアーゼ遺伝子の単離および同定。
ヤトロファ・クルカスの成熟種子は、南インドのアーンドラ・プラデーシュ(Andhra Pradesh)で得た。種子を、自然の野原で出芽させた。2〜3ヶ月の実生から非常に若い葉を収集した。材料を、使用するまで−70℃で貯蔵した。上記葉材料由来のゲノムDNAを、Sigma Gen Elute(商標)Plant Genomic DNA miniprep kit(Sigma社、アメリカ合衆国)に提供された方法に従って抽出した。
実施例2:ACCアーゼをコードするcDNAクローンの形成。
(a)変性オリゴヌクレオチドプライマーの設計:
PCRによる縮重プライマーストラテジーを用いる、ヤトロファ・クルカス・エルからの細胞質ACCアーゼ遺伝子の増幅およびその部分配列を、本明細書中に示す。縮重度割合が低い複数のプライマー(特に3’末端および中間フラグメントにおける)を、トウモロコシ(gi1045304)、イネ(ジャポニカ栽培品種群)(gi3753346)、アルファルファ(gi495724)、シロイヌナズナ(gi501151)、アブラナ(gi 12057068)、コムギ(gi:514305)およびダイズ(クローン513および1221)(gi1066856)のACCアーゼ遺伝子ファミリーの保存配列モチーフに基づいて設計した。配列は、Clustal Wを用いて整列させた。23の逆方向および順方向の両方の変性オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを設計し、ヤトロファ・クルカスのゲノムDNAについて試験した。
実施例2:ACCアーゼをコードするcDNAクローンの形成。
(a)変性オリゴヌクレオチドプライマーの設計:
PCRによる縮重プライマーストラテジーを用いる、ヤトロファ・クルカス・エルからの細胞質ACCアーゼ遺伝子の増幅およびその部分配列を、本明細書中に示す。縮重度割合が低い複数のプライマー(特に3’末端および中間フラグメントにおける)を、トウモロコシ(gi1045304)、イネ(ジャポニカ栽培品種群)(gi3753346)、アルファルファ(gi495724)、シロイヌナズナ(gi501151)、アブラナ(gi 12057068)、コムギ(gi:514305)およびダイズ(クローン513および1221)(gi1066856)のACCアーゼ遺伝子ファミリーの保存配列モチーフに基づいて設計した。配列は、Clustal Wを用いて整列させた。23の逆方向および順方向の両方の変性オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを設計し、ヤトロファ・クルカスのゲノムDNAについて試験した。
625塩基対保存領域の増幅:ヤトロファACCアーゼ遺伝子を特徴付けするために、遺伝子の部分のPCRによる増幅を、縮重ヌクレオチドプライマーを用いて行った。縮重プライマーME23(5’−GAGGTSTAYAGCTTYCASATGC−3’順方向プライマー)およびME25(5’−CTGAAGDATTCCTTCRAAVAG−3’逆方向プライマー)を用いて、約625塩基対の中間フラグメントを、それが真に保存モチーフであることを示すアルファルファ、シロイヌナズナおよびヤトロファ・クルカス(図1)のゲノムDNAから増幅した。増幅は、Eppendorf Gradient Thermal Cycler(96ウェル)システム中、94℃で45秒、55℃で45秒および72℃で1分の35サイクルで行った。最初の10サイクルは、サイクル毎に1℃ずつ低下させる65℃〜55℃のTouch Downプログラムを用い、残りの25サイクルについては、55℃のアニーリング温度を維持した。最終サイクルの後、増幅を72℃で7分延長した。縮重プライマーPCR反応の産物を、Sambrookら(1989)に従ってゲル電気泳動(1%アガロース、作動緩衝液としてTAEを用いた)に供し、長さ625塩基対のDNAフラグメントを、QIA Quickゲル抽出キット(Qiagen,Valencia,CA)を用いてゲルから回収した。次いで、この産物を、pGEM−T Easy Vector System I(Promega Corp、アメリカ合衆国)にクローン化し、大腸菌DH5α(Gibco BRL)に形質転換した。構築物を、pGEM:J1クローンと命名した。
(b)pGEM:J1クローンの配列決定:陽性組換え型コロニーを単離し、プラスミドDNAを調製した。配列決定を、ABI Prism Automated sequencingを用い、M13順方向および逆方向汎用プライマーを用いて行った。597塩基対配列決定の結果については、図2を参照されたい。
(c)種々のACCアーゼ遺伝子ファミリーメンバー間での配列の類似性および比較:ヤトロファ・クルカス由来のACCアーゼ遺伝子の625塩基対保存モチーフを含むクローンpGEM:J1のコーディングヌクレオチド配列を、GenBank配列に対するBLASTn(Basic Local Alignment Search Tool)に供した。
(b)pGEM:J1クローンの配列決定:陽性組換え型コロニーを単離し、プラスミドDNAを調製した。配列決定を、ABI Prism Automated sequencingを用い、M13順方向および逆方向汎用プライマーを用いて行った。597塩基対配列決定の結果については、図2を参照されたい。
(c)種々のACCアーゼ遺伝子ファミリーメンバー間での配列の類似性および比較:ヤトロファ・クルカス由来のACCアーゼ遺伝子の625塩基対保存モチーフを含むクローンpGEM:J1のコーディングヌクレオチド配列を、GenBank配列に対するBLASTn(Basic Local Alignment Search Tool)に供した。
Blastn(National Center for Biotechnology Informationデータベース)でのデータベース検索は、他のACCアーゼ遺伝子ファミリーと比較的高い類似性を示した。ダイズ(gi992916)との類似率は84%であり、アルファルファ(gi495724)との類似率は84%であり、インゲンマメ(gi7839251)との類似率は84%であり、アブラヤシのマイクロサテライト(gi12053787)との類似率は100%であった。
(d)ACCアーゼ遺伝子からの1.25kb中間フラグメントの増幅:ヤトロファ・クルカスの保存配列モチーフ由来の597塩基対中間フラグメントの配列(図2)を用いて、597塩基対領域での遺伝子特異的順方向プライマー、および変性ヌクレオチドである3’末端からの逆方向プライマーを設計した。遺伝子特異的順方向プライマーME−50 5’GTCTCAGATGATCTAGAAGGTGTATC 3’および変性逆方向プライマーME−59 5’AGCAAGWCCTTGWGGYAGAGCTTG3’を、アルファルファ、シロイヌナズナおよびダイズの保存領域に基づいて3’領域で設計した。ME50およびME59での産物は、上述のように増幅されかつゲル溶出された1.3kbフラグメントであった。PCR産物を配列決定し、J−2と命名した(図3)。上記1.3kbフラグメントの配列決定の結果に基づき、遺伝子特異的順方向(ME−75:5’GTGGACCCATAGTTATGGCAACC 3’)および逆方向プライマー(ME−76:5’AGAAAGCTTCATCATTCCCCCAAG 3’)を、ACCアーゼ遺伝子の1.25kbフラグメントを3’末端に向かって増幅するように設計した。結果を表4に示す。増幅を、BioRad i−Cylcer Thermal Cycler(96ウェル)システム内で、95℃で45秒、54℃で45秒、および72℃で6分の33サイクルで行った。最初の8サイクルは、サイクル毎に1℃ずつ低下させる62℃〜54℃のTouch Downプログラムを用い、残りの25サイクルについては、54℃のアニーリング温度を維持した。最終サイクルの後、増幅を72℃で20分延長した。PCR反応の産物を、Sambrookら(1989)に従ってゲル電気泳動(1%アガロース、作動緩衝液としてTAEを用いた)に供し、長さ1.25kbのDNAフラグメントを、QIA Quickゲル抽出キット(Qiagen)を用いてゲルから回収した。PCR産物は、1.25kbフラグメントの存在を確認した(図4)。
(d)ACCアーゼ遺伝子からの1.25kb中間フラグメントの増幅:ヤトロファ・クルカスの保存配列モチーフ由来の597塩基対中間フラグメントの配列(図2)を用いて、597塩基対領域での遺伝子特異的順方向プライマー、および変性ヌクレオチドである3’末端からの逆方向プライマーを設計した。遺伝子特異的順方向プライマーME−50 5’GTCTCAGATGATCTAGAAGGTGTATC 3’および変性逆方向プライマーME−59 5’AGCAAGWCCTTGWGGYAGAGCTTG3’を、アルファルファ、シロイヌナズナおよびダイズの保存領域に基づいて3’領域で設計した。ME50およびME59での産物は、上述のように増幅されかつゲル溶出された1.3kbフラグメントであった。PCR産物を配列決定し、J−2と命名した(図3)。上記1.3kbフラグメントの配列決定の結果に基づき、遺伝子特異的順方向(ME−75:5’GTGGACCCATAGTTATGGCAACC 3’)および逆方向プライマー(ME−76:5’AGAAAGCTTCATCATTCCCCCAAG 3’)を、ACCアーゼ遺伝子の1.25kbフラグメントを3’末端に向かって増幅するように設計した。結果を表4に示す。増幅を、BioRad i−Cylcer Thermal Cycler(96ウェル)システム内で、95℃で45秒、54℃で45秒、および72℃で6分の33サイクルで行った。最初の8サイクルは、サイクル毎に1℃ずつ低下させる62℃〜54℃のTouch Downプログラムを用い、残りの25サイクルについては、54℃のアニーリング温度を維持した。最終サイクルの後、増幅を72℃で20分延長した。PCR反応の産物を、Sambrookら(1989)に従ってゲル電気泳動(1%アガロース、作動緩衝液としてTAEを用いた)に供し、長さ1.25kbのDNAフラグメントを、QIA Quickゲル抽出キット(Qiagen)を用いてゲルから回収した。PCR産物は、1.25kbフラグメントの存在を確認した(図4)。
本明細書中で開示されかつ特許請求された全ての組成物および方法は、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく作製されかつ実施され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施態様の点から記載されているが、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および/または方法ならびに方法の工程または工程の順番に改変が応用され得ることは、当業者に明らかとなろう。より詳細には、化学的または生理学的に関連する特定の試薬は、同じまたは類似の結果が達成されるであろう本明細書に記載の試薬で置き換えられ得ることが明らかとなろう。当業者に明らかな全てのこのような類似の置換および改変は、本発明の概念、範囲および趣旨の範囲内にあるとみなされる。確かに、当業者に理解される本発明を実施するために記載された態様の種々の改変は、特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。本明細書中で引用された全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
Claims (21)
- ヤトロファ・クルカス・エル(Jatropha curcas L.)由来の活性アセチル−CoAカルボキシラーゼ(ACCアーゼ)を含む、単離および精製されたポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号4、配列番号6、配列番号8およびそれらのフラグメントからなる群から選択される、請求項1に記載のポリペプチド。
- ヤトロファ・クルカス・エル由来のアセチル−CoAカルボキシラーゼ(ACCアーゼ)遺伝子またはそれらのフラグメントをコードする、単離および精製された核酸。
- 前記核酸が、配列番号1、配列番号2、配列番号5、配列番号7およびそれらのフラグメントからなる群から選択される、請求項3に記載の核酸。
- 前記核酸が、配列番号9を含む、請求項3に記載の核酸。
- 遺伝子改変されたヤトロファ・クルカス(Jatropha curcas)植物を産生する方法であって、
(i.)ヤトロファ・クルカス植物を提供すること、
(ii.)ACCアーゼをコードする核酸を含む発現カセット、および必要に応じて輸送ペプチドを、当該植物に導入すること、
(iii.)当該植物が遺伝子改変されているかどうかを判断するために、当該植物中でのACCアーゼの増加した活性または増加した発現を検出すること、および
(iv.)当該遺伝子改変されたヤトロファ・クルカス植物を再現すること
を含む、方法。 - 前記ACCアーゼが、細胞質ヤトロファ・クルカスACCアーゼである、請求項6に記載の方法。
- 前記ACCアーゼが、ヤトロファ・クルカス中で発現可能なプロモータに作動可能に連結している、請求項6に記載の方法。
- 前記ACCアーゼが、前記遺伝子改変されたヤトロファ・クルカス植物中で発現する、請求項8に記載の方法。
- 前記プロモータが、導入可能なプロモータである、請求項8に記載の方法。
- 前記プロモータが、CaMV 35Sプロモータ、ノパリンシンターゼ(NOS)プロモータおよび胚乳特異的プロモータからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記胚乳特異的プロモータが、β−ファゼオリンプロモータ、ナピンプロモータおよびユビキチンプロモータからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記発現カセットが、発現ベクターを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記輸送ペプチドが、プロモータとACCアーゼ遺伝子との間に位置する葉緑体輸送ペプチドである、請求項6に記載の方法。
- 前記発現カセットが、プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウムにより媒介される形質転換、電気穿孔法および微粒子銃からなる群から選択される方法により前記植物に導入される、請求項6に記載の方法。
- 前記発現カセットが、1つまたはそれ以上の植物ACCアーゼ遺伝子の3’末端に連結した植物転写終結およびポリアデニル化シグナルおよび翻訳シグナルをさらに含む、請求項6に記載の方法。
- 前記遺伝子改変されたヤトロファ・クルカス植物が、油含有量が増加した種子を産生する、請求項6に記載の方法。
- 前記油含有量が、天然に存在するヤトロファ・クルカス植物により産生される種子と比較して少なくとも1.2倍増加する、請求項17に記載の方法。
- 前記油含有量が、天然に存在するヤトロファ・クルカス植物により産生される種子と比較して2〜20倍増加する、請求項17に記載の方法。
- 前記油含有量が30%である、請求項17に記載の方法。
- 実質的に実施例および図面を参照して本明細書に記載されたとおりの、上記特許請求の範囲に記載の活性アセチル−CoAカルボキシラーゼ(ACCアーゼ)を含む単離精製されたポリペプチド、およびヤトロファ・クルカス・エル由来のアセチル−CoAカルボキシラーゼ(ACCアーゼ)遺伝子またはそれらのフラグメントをコードする核酸、および本明細書中に記載のその方法。
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