JPH10512451A - グルタチオンｓ−トランスフェラーゼをコードするデオキシリボ核酸およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ならびにベクター、宿主生物体、および植物の形質転換のための、そして除草剤に対して高い耐性を示す植物の育種のためのその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするデオキシリボ核酸およびその 使用 本発明は、新規デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ならびにベクター、宿主生物体 、および植物の形質転換のため、そして除草剤に対する耐性が増加している植物 を産生するためのその使用に関する。 特定の除草剤に対する耐性が増加するような植物の遺伝子改変が既に開示され ている。このことにより、低い選択性を有するが、その他の点でそれらの作物植 物の有利な特性を有する除草剤の使用を可能にする（生来の非トランスジェニッ ク形態においてそれら除草剤により傷害を被るであろう）。従って除草剤耐性植 物の供給により、利用することができる除草剤の選択肢が広がり、そして多くの 場合、例えば特定の傷害閾に達するそれらの発芽後においてのみ所望されない植 物を制御することができる場合には相対的に低い除草剤施用率での使用も可能に する。従って、他の除草剤に対する耐性が増大している新規作物植物を作出する ことの必要性はかなり大きい。 グルタチオンＳ−トランスフェラーゼは細胞障害性物質の解毒作用に大きく貢 献する多機能性蛋白質である。この酵素は、天然もしくは合成起源のものであっ てよい求電子性疎水性基質に対する、還元型グルタチオンの共役を触媒する。 植物におけるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの生理学的基質および植物 代謝におけるそれらの役割についてはその詳細が知られていな い。しかしながらこれらの酵素は解毒作用に関与し、そしてそのためチオカルバ メート類、クロロアセトアニリド類、およびＳ−トリアキン類の群からの多数の 重要な除草剤の選択性のメカニズムに関与することが示されている：Ｍｏｚｅｒ Ｔ．Ｊ．、Ｔｉｅｍｅｉｅｒ Ｄ．Ｃ．、Ｊａｗｏｒｓｋｉ Ｅ．Ｇ．、Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２：１０６８−１０７２（１９８３）；Ｍｏｏｒｅ Ｒ．Ｅ．、Ｄａｖｉｅｓ Ｍ．Ｓ．、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ Ｋ．Ｍ．、Ｈａｒｄ ｉｎｇ Ｅ．Ｉ．、Ｗｉｅｇａｎｄ Ｒ．Ｃ．、Ｔｉｅｍｅｉｅｒ Ｄ．Ｃ．、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：７２２７−７２３５（１９８３ ）；Ｇｒｏｖｅ Ｇ．、Ｚａｒｌｅｎｇｏ Ｒ．Ｐ．、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｎ Ｋ．Ｐ．、Ｌｉ Ｎ．、Ｔａｍ Ｍ．Ｆ．、Ｔｕｃ Ｃ．Ｐ．Ｄ．、Ｎｕｃｌｅ ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：４２５−４３８（１９８８）。 配列番号２に列挙されるアミノ酸配列を有する新規蛋白質グルタチオンＳ−ト ランスフェラーゼＩＩＩｃ（今後「ＧＳＴＩＩＩｃ」とする）をコードする新規 デオキシリボ核酸が今回見いだされた（本発明に従う新規ＤＮＡは今後「ＧＳＴ ＩＩＩｃ ＤＮＡ」として引用される）。 それに加え、ゲノム内に新規ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡを取り込ませてある植物 は、対応する「出発植物」との比較により、除草剤、好ましくはヘテロアリール オキシアセトアミド除草剤に対する耐性が増加していることが見いだされた。 この新規ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡはトウモロコシ（ジー メイズ（Ｚｅａ ｍ ａｉｓ ））のムチン（Ｍｕｔｉｎ）変種から単離された。このＤＮＡは配列番号 ２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質ＧＳＴＩＩ Ｉｃをコードする。植物細胞では、２分子の蛋白質ＧＳＴＩＩＩｃは自発的に二 量体活性酵素を形成し（これは今後「ＧＳＴＩＩＩｃ酵素」として引用される） 、この二量体活性酵素は、利用される除草剤の解毒作用を確実に発揮し、そして そのため植物をその除草剤に対して耐性とさせる。 本発明に従う好ましいＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡは、配列番号１に列挙される配 列を有する。 本発明に従うと、本明細書中これ以降に記載されるベクタープラスミドｐＥＴ ３ａ−ＧＳＴＩＩＩｃおよびｐＳＳ−ＧＳＴＩＩＩｃ上に含まれるＧＳＴＩＩＩ ｃ ＤＮＡも同様に好ましい。 新規ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡは一本鎖の形態をとるか、もしくは特別な一本鎖 に対して相補的な鎖を追加的に含む二本鎖の形態をとることができる。 本発明の好ましい態様ではＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡは、５’末端上流に挿入さ れている植物内で有効なプロモーターを有する。植物内で有効な通常のプロモー ターをこの目的に用いることができる。挙げることができる例は、リブロース− １，５−二リン酸カルボキシラーゼ（ｒｂｓｃ）の小サブユニットの遺伝子のプ ロモーターである（ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．５ Ｎｏ．９，２０６ ３−２０７１（１９８６）、を参照されたい）。植物ウイルスからのプロモータ ーが利用されることが好ましく、一例としてＣａＭＶ ３５Ｓ ＲＮＡプロモー ターを挙げることができる。ＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサーおよび５’−３’配 列としてその後に続くＣａＭＶ ３５Ｓ プロモーターからなる既知の構築物（ 「ＣａＭＶ ３５Ｓダブルプロモーター」）が用いられることが 特に好ましい。ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡおよびＣａＭＶ ダブルプロモーターか らなる好ましい対応構築物が本明細書中これ以降に説明されるベクタープラスミ ドｐＳＳ−ＧＳＴＩＩＩｃ上に存在する。しかしながら、ムチン（Ｍｕｔｉｎ） 変種のトウモロコシ内でＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡの発現を調節する天然のプロモ ーターを用いることも可能である。 ５’−３’配列としてＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡの後に続く３’末端配列の性質 は非常に多岐にわたって変化することがあり得、かつ本発明にとっては決定的に 重要なものではない。植物の３’−末端配列が利用されることが好ましい。更に は、例えばムチン（Ｍｕｔｉｎ）変種のトウモロコシからのＧＳＴＩＩＩｃ遺伝 子の天然の末端配列を用いることも可能である。 配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する新規蛋白質ＧＳＴＩＩＩｃ、およ びその上、その蛋白質ＧＳＴＩＩＩｃが植物細胞内で形成された後に、その２分 子から自発的に生じる、先に既に記載される新規二量体（ＧＳＴＩＩＩｃ酵素） も同様に本発明の部分である。 本発明に従うＤＮＡおよび本発明に従う蛋白質（適切な場合には二量体をとる ）は更に、各事例においては各々そのＤＮＡおよびその蛋白質に由来するＤＮＡ 配列および蛋白質配列をも含む。誘導配列を有するＤＮＡおよび蛋白質は、各々 ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡおよび蛋白質ＧＳＴＩＩＩｃ（適切な場合には二量体形 態をとるＧＳＴＩＩＩｃ酵素として）の主な特徴を依然として有し、そしてその ため、本質的には同一の効果、すなわち植物において十分な程度にまで本発明に 従う除草剤耐性を生じるＤＮＡおよび蛋白質を意味することが意図される。この ような誘導配列では、個々のＤＮＡ、コドン、および／またはＤＮＡ部分配列、 ある いは個々のアミノ酸もしくはアミノ酸部分配列が欠失している（例えば、ＤＮＡ の場合には制限酵素の使用により）そして／あるいは本質的には同一効果を有す る他のＤＮＡ、コドン、およびＤＮＡ部分配列、またはアミノ酸もしくはアミノ 酸部分配列により置換されることが可能である。これらの種類の改変は、遺伝子 コードの縮重という理由により存在するか、あるいはＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡも しくは蛋白質ＧＳＴＩＩＩｃもしくはＧＳＴＩＩＩｃ酵素の操作から生じてよい 。本発明に従うＤＮＡは更に、その操作を容易にさせるＤＮＡ、コドン、もしく はＤＮＡ配列（例えば、いわゆるリンカー）、あるいは操作後（例えば、制限酵 素での切断の後）にそのようなリンカーから残されるものも含んでよい。ＧＳＴ ＩＩＩｃ ＤＮＡおよび蛋白質ＧＳＴＩＩＩｃもしくはＧＳＴＩＩＩｃ酵素は天 然の源のものであることができるか、または部分的もしくは完全に合成形態をと ることができる。 新規ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡもしくはそれに由来するＤＮＡを「外来性」もし くは「追加的」ＤＮＡとして含む原核生物もしくは真核生物の組換えＤＮＡも本 発明の部分である。挙げることができる例は、ウイルス性ＤＮＡ、微生物のＤＮ Ａ（具体的には例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）もしくは アグロバクテリウム ツメファキエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ ）からのＤＮＡのような細菌性ＤＮＡ）、ならびに植物のＤＮ Ａである。 本発明に従うＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡおよびそれに由来するＤＮＡ配列、なら びに原核生物もしくは真核生物の組換えＤＮＡおよびそれに由来するＤＮＡ配列 も、「外来性」もしくは「追加的」ＤＮＡとして、ベクター（具体的には、プラ スミド、コスミド、もしくはファージ）内、 形質転換微生物もしくはトランスジェニック微生物（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈ ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）もしくはアグロバクテリウム ツメファキエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のような細菌が好まし い）内、ならびに形質転換植物細胞および植物もしくはトランスジェニック植物 細胞および植物内、あるいはそれらのＤＮＡ内に含まれていてよい。これらのベ クター、微生物、植物細胞および植物、ならびにそれらのＤＮＡは本発明の部分 である。それらは、原核生物もしくは真核生物の組換えＤＮＡ同様、本記載、具 体的には配列番号１および配列番号２の知識を有する当業者により、一般的に知 られそして／または通常の課程および方法により取得することができる。 特に好ましいとして挙げることができるベクターは、ベクタープラスミドｐＥ Ｔ３ａ−ＧＳＴＩＩＩｃおよびｐＳＳ−ＧＳＴＩＩＩｃである。両ベクター共、 配列番号１に示される本発明に従うＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡを含む。 プラスミドｐＥＴ３ａ−ＧＳＴＩＩＩｃは、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ断片上にＧ ＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡを含む。このプラスミドを構築するためには、配列番号１ に示されるＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡをベクターｐＥＴ−３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社 ／Ｍａｄｉｓｏｎ）のＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ開裂部位内にクローン化した（ Ｓｔｕｄｉｅｒ Ｆ．Ｗ．，Ｍｏｆｆａｔｔ Ｂ．Ａ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ． １８９：１１３−１３０；Ｓｔｕｄｉｅｒ Ｆ．Ｗ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ ｌ． ２１９：３７−４４（１９９１））。このプラスミド（５３０６塩基対） が図１に示されている。矢印の方向はプロモーターおよび遺伝子、ならびに開始 コドンＡＴＧを有するＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡの方向を示す。「Ａｍｐ」 はアンピリシン耐性遺伝子を表す。 プラスミドｐＳＳ−ＧＳＴＩＩＩｃを構築するためには、ＧＳＴＩＩＩｃ Ｄ ＮＡをベクターｐＥＴ３ａ−ＧＳＴＩＩＩｃからのＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ断片と して精製し、そしてプラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫＩＩ（ＸｂａＩ／Ｂ ａｍ ＨＩで直線化させてある；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）内にクローン化させた 。その後にはＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡを、この様式で取得されたプラスミドＢｌ ｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫＩＩ−ＧＳＴＩＩＩｃからのＳｓｔＩ／ＳｍａＩ制限開 裂により単離し、そしてベクターｐＲＴ１０１（ＳｓｔＩ／ＳｍａＩで直線化さ せてある ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡを、この様式で取得されたベクターｐＲＴ１０１−ＧＳ ＴＩＩＩｃからのＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ断片として精製し、そしてバイナリーベ クターｐＳＳ（ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩで直線化させて れるベクターｐＳＳ−ＧＳＴＩＩＩｃでは、コーディングＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮ ＡはＣａＭＶからの重複する３５Ｓ ＲＮＡプロモーターの制御下に置かれる。 プラスミドｐＳＳ−ＧＳＴＩＩＩｃ（１００００塩基対）が図２に示される。 本発明に従うＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡは、必要であらば、一般には通常の課程 および方法により前記プラスミドから当業者により単離され得る。 特別に好ましいとして挙げることができる、本発明に従う形質転換微生物もし くはトランスジェニック微生物は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） 株ＤＳ ｐＥＴ３ａ−ＧＳＴＩＩＩｃおよびＤＳ ｐ ＳＳ−ＧＳＴＩＩＩｃ、ならびにそれらの突然変異体である。株ＤＳｐＥＴ３ａ −ＧＳＴＩＩＩｃはプラスミドｐＥＴ３ａ−ＧＳＴＩＩＩｃを含み、そして株Ｄ Ｓ ｐＳＳ−ＧＳＴＩＩＩｃはプラスミドｐＳＳ−ＧＳＴＩＩＩｃを含む。本発 明に従う突然変異体は、本発明を実施するのに必須の特徴を依然として含む、す なわち具体的には、プラスミドｐＥＴ３ａ−ＧＳＴＩＩＩｃおよび／またはｐＳ Ｓ−ＧＳＴＩＩＩｃ、あるいはそれらに由来するＤＮＡ配列を依然として含む微 生物である。これらの株は一般的には常法により成長させることができる。プラ スミドｐＥＴ３ａ−ＧＳＴＩＩＩｃおよびｐＳＳ−ＧＳＴＩＩＩｃも同様に、一 般的には常法によりこれらの微生物から単離することができる。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ｐＥＴ３ａ−ＧＳＴＩＩＩｃ は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブタペスト条約に従って、ｔｈｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｅｎ（ＤＳＭ）、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ、Ｄ−３８１２４ Ｂ ｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ連邦共和国、に寄託した（寄託日：１９９５年 １月１７日）。この株には受託番号ＤＳＭ９６７７が与えられた。 先に既に説明されたように、本発明は更に、ゲノム内にＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮ Ａもしくはそれに由来するＤＮＡ配列、および／または本発明に従う原核生物も しくは真核生物の組換えＤＮＡを「外来性」もしくは「追加的」ＤＮＡとして含 む、トランスジェニック植物および植物細胞（原形質体を初めとする）、ならび にそのようなトランスジェニック植物からの植物の部分（例えば、カルス、葉、 茎、花、花の部分、根、塊茎、種子、および他の繁殖用物質など）も含む。 本発明に従うトランスジェニック植物は更に、それらのトランスジェニック植 物がＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡもしくはそれに由来するＤＮＡ配列を「外来性」も しくは「追加的」ＤＮＡとして含む限りは、本発明に従って取得されるトランス ジェニック植物の子孫、ならびに他の植物とそれらの子孫との交雑の結果物も含 む。 好ましいトランスジェニック植物は、ゲノム内に「外来性」もしくは「追加的 」ＤＮＡとして配列番号１に示されるＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡを含む植物である 。 特に好ましいトランスジェニック植物は、ゲノム内に「外来性」もしくは「追 加的」ＤＮＡとして、ＣａＭＶ ３５Ｓダブルプロモーターと配列番号１に示さ れるＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡとからなる構築物を含む植物である。 特に非常に好ましいトランスジェニック植物は、ゲノム内に「外来性」ＤＮＡ として、配列番号１に示されるＧＳＴＩＩＩｃおよび／またはＣａＭＶ ３５Ｓ ダブルプロモーターと配列番号１に示されるＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡとからなる 構築物を含む植物である。ゲノム内にＧＳＴＩＩＩｃに相当するＤＮＡを含む、 トウモロコシ変種ムチン（Ｍｕｔｉｎ）とは違った植物はこれまでには全く開示 されていない。 本発明に関連する際には、「外来性」ＤＮＡは特別な原核生物もしくは真核生 物（植物を初めとする）のゲノム内には天然の状態では存在しないが、ただしこ のゲノム内にヒトの介在（形質転換）を通してのみ取り込まれるＤＮＡを意味す ることが意図される。「追加的」ＤＮＡは、特別な原核生物もしくは真核生物の ゲノム内には既に存在するものの、このゲノム内にヒトの介在（形質転換）を通 して追加量として取り込ま れるＤＮＡである。「外来性」もしくは「追加的」ＤＮＡは必要事項および特別 な事例の特性に依存して一つもしくは複数のコピーとして取り込まれ得る。 既に説明されているように本発明の主目的は、除草剤、好ましくはヘテロアリ ールオキシアセトアミド除草剤に対する耐性が増加している新規植物を産生する ことである。 従って、本発明に従う新規トランスジェニック植物（これは好ましいのもであ る）は、既述の特性（「外来性」もしくは「追加的」ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡの 内容物）に加え、除草剤、具体的にはヘテロアリールオキシアセトアミド除草剤 に対して、対応する非トランスジェニック植物と比較すると耐性が増加している ものである。従ってこれらのトランスジェニック植物の収穫物を、その作物植物 に傷害を与えることなしに所望されない植物を制御するために除草剤で処理する ことができる。 本発明に従うトランスジェニック植物細胞および植物の除草剤耐性の増加は、 観葉植物の栽培、医療用植物の栽培、および植物育種のため農業および林業にと っては重要である。 従って本発明は、除草剤に対する耐性が増加しており、かつ （ａ）ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡおよび／または蛋白質ＧＳＴＩＩＩｃをコードす るＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡを含む、本発明に従う組換えＤＮＡの一つもしくは複 数のコピーを植物細胞（原形質体を初めとする）のゲノム内に挿入し、そして適 切な場合には、 （ｂ）形質転換させた完全な植物を形質転換させた植物細胞（原型質体を初めと する）から再生させ、そして適切な場合には繁殖させ、そして適切な場合には、 （ｃ）植物の必要とされる部分（種子を初めとする）が、この様式で取得された 親世代もしくはそこから得られる更に先の世代のトランスジェニック植物から取 得される ことを特徴とする、トランスジェニック植物細胞（原形質体を初めとする）、お よびトランスジェニック植物（植物の部分および種子を初めとする）の生産のた めの課程にも関する。 課程段階（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は既知の課程および方法による通常の 様式で実施することができる。 「外来性」もしくは「追加的」ＤＮＡとしてＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡを一回も しくは複数回含むトランスジェニック植物細胞（原型質体を初めとする）および トランスジェニック植物（植物の部分および種子を初めとする）、ならびに先の 課程により取得される形質転換植物細胞および植物も同様に本発明の部分をなす 。 （ａ）植物細胞（原型質体を初めとする）および植物（植物の部分および種子 を初めとする）を形質転換させるための、ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡおよび／また は本発明に従う組換えＤＮＡおよび／または本発明に従う組換えベクターおよび ／または本発明に従う形質転換微生物の使用、 （ｂ）繁殖用物質を産生するため、ならびに新規植物およびそれらの繁殖用物 質を産生するための、本発明に従うトランスジェニック植物細胞（原形質体を初 めとする）およびトランスジェニック植物（植物の部分および種子を初めとする ）の使用、 （ｃ）植物内でＧＳＴＩＩＩｃ蛋白質もしくはＧＳＴＩＩＩｃ酵素をコードす るＤＮＡを決定するため、ならびに（一般的には）トランスジェニック植物細胞 （原形質体を初めとする）およびトランスジェニック植 物（植物の部分および種子を初めとする）の産生の際の、プラスミドｐＥＴ３ａ −ＧＳＴＩＩＩｃ上に含まれるｃＤＮＡもしくはその部分、および配列番号１に 列挙される配列に示される配列情報に相当するＤＮＡ配列の使用、ならびにＧＳ ＴＩＩＩｃ ＤＮＡの単離および検出（例えば、通常の抗体技術による）の際の 、ｐＥＴ３ａ−ＧＳＴＩＩＩｃのＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡによりコードされる蛋 白質配列および配列番号２に示される蛋白質の使用、 も本発明の部分である。 適切な場合にはＣａＭＶ３５Ｓダブルプロモーターを含む構築物としての、Ｇ ＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡを「外来性」もしくは「追加的」ＤＮＡとして植物もしく は植物細胞の遺伝物質内に挿入するのには、多数の異なる方法が利用可能である 。遺伝子導入は、一般的には既に知られる常法により実施することができ、当業 者は難無く各事例における適切な方法を確立することが可能である。 アグロバクテリウム ツメファキエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ ｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）のＴｉプラスミドをベクターとして利用することができ、 これは特に好ましく、かつ「外来性」もしくは「追加的」ＤＮＡを双子葉植物お よび単子葉植物のゲノム内に導入するのに広く利用され得る。蛋白質ＧＳＴＩＩ Ｉｃをコードする遺伝物質は、適切な場合には調節性ＤＮＡ配列と共に適切なＴ ｉプラスミドのＴ ＤＮＡ（例えば、Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９ ８３）内に挿入され、そしてそれは植物を感染させること、植物の部分もしくは 植物組織（例えば、一例では葉のディスク、茎、胚軸、子葉、分裂組織、ならび に一例では例えば二次胚子およびカルスのようなそれらに由来する組織 を感染させることによるか、あるいは原型質体をアグロバクテリウムツメファキ エンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）と共に同時培 養することにより導入される。 別法は、必要とされる遺伝子もしくは必要とされるＤＮＡを含む精製されたＤ ＮＡのポリカチオンもしくはカルシウム塩およびポリエチレングリコールの存在 下、植物原形質体内でのインキュベーションである（例えば、Ｈａｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９８５；Ｋｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．、１９８２；Ｐａｓｚｋｏｗｓｋ ｉ ｅｔ ａｌ．、１９８４）。 電場（電気穿孔）（例えば、Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．、１９８６）によるＤ ＮＡ取り込みも追加的に有利であり得る。 ＤＮＡを保持する物理的に加速させた粒子で花粉もしくは他の植物部分を「砲 撃すること」により、植物花粉を介する既知の方法でＤＮＡを取り込ませること もできる（欧州特許出願公開第０ ２７０ ３５６号を参照されたい）。 適切な栄養培地の助けを得る既知の様式で植物の再生を実施する（例えば、Ｎ ａｇｙ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ １９７６）。 本発明に従う課程の好ましい態様では、プラスミドｐＥＴ３ａ−ＧＳＴＩＩＩ ｃからのＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡがバイナリー発現ベクター（例 の後にこのキメラ遺伝子構築物をアグロバクテリウム ツメファキエンス（Ａｇ ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入させる（Ｋｏｎｃｚ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌ １９８６）。 別法では、ベクターｐＳＳ−ＧＳＴＩＩＩｃ上のキメラ遺伝子構築物が、植物 原型質体への直接遺伝子導入による通常の様式で導入される（例 えば、Ｈａｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９８５）。この事例では、プラスミドは環状 形態をとることが可能であるが、ただし直線形態をとることが好ましい。 このプラスミドがレポーター遺伝子と共に用いられる際には、カナマイシン− 耐性原型質体をその後に、ＧＳＴＩＩＩｃの発現について検査する。 形質転換させた（トランスジェニック）植物もしくは植物細胞を、例えば葉の ディスクの形質転換（一例では、Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．１９８５）による か、再生性植物原形質体もしくは細胞培養物とアグロバクテリウム ツメファキ エンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）との同時培養 （一例では、Ｍａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．１９７９、Ｈａｉｎ ｅｔ ａｌ．１ ９８５）によるか、あるいは直接的ＤＮＡトランスフェクションによるような既 知の方法により産生される。得られる形質転換植物は、レポーター遺伝子の発現 についての選択（例えば、インビトロでの硫酸カナマイシンのリン酸化による（ Ｒｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．１９８４；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８５ ））か、あるいはノパリンシンターゼ（Ａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．１９８３、の 方法）もしくはＧＳＴＩＩＩｃの発現（ノザン（Ｎｏｔｈｅｒｎ）ブロット分析 およびウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット分析による）のいずれかにより検 出される。蛋白質ＧＳＴＩＩＩｃは更に特異的抗体を用いるウエスタン（Ｗｅｓ ｔｅｒｎ）ブロット分析における既知の様式で形質転換植物内でも検出され得る 。 植物を完成させるための形質転換植物細胞の培養および再生は、一般的には各 事例に適する栄養物培地を用いる常法により実施される。 本発明に従うＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡを含み、かつ本発明の部分を形成する形 質転換植物細胞および形質転換植物の両方共は、除草剤、具体的にはヘテロアリ ールアセトアミド除草剤に対する耐性のかなりの上昇を示す。 本発明に関連する際には、用語「植物」は完全な植物および植物の部分（例え ば、葉、種子、塊茎、切り枝など）の両方を意味する。「植物細胞」は、原形質 体、細胞株、植物カルスなどを含む。「繁殖物質」は、形質転換させた植物およ び植物細胞を繁殖させるのに用いることができる植物および植物細胞を意味し、 かつそのため同様にこれも本発明の部分となる。 本発明に従うＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡの取り込みにより除草剤に対する耐性の 増加を付与することができる植物には、実質的には全ての植物が含まれる。当然 のことながら、例えば森林植物（一例では、トウヒ、モミ、アメリカトガサワラ 、マツ、カラマツ、ブナ、およびオーク）、例えば穀物類（具体的には、小麦、 ライ麦、大麦、カラスムギ、キビ、米、およびトウモロコシ）、イモ類、マメ類 （一例では、豆果、および具体的にはアルファルファ、ダイズ）、野菜類（特に 、アブラナおよびトマト）、果物（具体的には、リンゴ、ナシ、サクランボウ、 ブドウ、カンキツ類、パイナップル、およびバナナ）、キネアブラヤシ、茶、コ コアおよびコーヒーノキ、タバコ、サイザルおよび綿花などのような食品および 原材料を提供する植物、ならびに例えばインドジャボクおよびジギタリスのよう な医療用植物において耐性を生じさせることの特別な必要性が存在する。特に好 ましいとして挙げることができるものは、イモ類、テンサイ、サトウキビ、穀物 類（例えば、小麦と大麦、およびサ トウモロコシ、および米）である。本発明に従うＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡが植物 のゲノム内に「外来性」ＤＮＡとして取り込まれることが好ましい。 除草剤耐性の増加を本発明に従って生じさせることができる好ましい除草剤は 、ヘテロアリールオキシアセトアミドの群に属する。これに関連して特に好まし いものは、一般式（Ｉ） Ｈｅｔ−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＲ¹Ｒ² （Ｉ） ［式中、 Ｈｅｔは、少なくとも一つの窒素原子および一つの硫黄もしくは酸素原子を含む ことが好ましい、好ましくは５員環を有する、場合によっては置換される複素環 式芳香族性基を表し、挙げることができる特に好ましい基は５−トリフルオロメ チル−１，３，４，−チアジアゾール−２−イル基であり； Ｒ¹は、場合によっては置換されるアルキルもしくはアルコキシ（各事例共、好 ましくは１〜４の炭素原子を有する）を表し；そして Ｒ²は、場合によっては置換されるアリール基（好ましくはハロゲンにより置換 されるフェニル基が好ましい）を表す］ のヘテロアリールオキシアセトアミドである。 この種類の除草剤は既に開示されている（例えば、欧州特許出願公開第１８ ４９７号および対応する米国特許第４ ６４５ ５２５号、欧州特許出願公開第 ９４ ５４１号および対応する米国特許第４ ５８５ ４７１号、ならびに欧州 特許出願公開第３４８ ７３７号および対応する米国特許第４ ９６８ ３４２ 号を参照されたい）。これらの特許出願および特許に記載される除草剤は本発明 に関連する特に好ましいも のである。 欧州特許出願公開第３４８ ７３７号および対応する米国特許第４９６８ ３ ４２号に記載される、化学名（５−トリフルオロメチル−１，３，４−チアジア ゾール−２−イルオキシ）酢酸 Ｎ−イソプロピル−Ｎ−（４−フルオロフェニ ル）アミド（提唱されている一般名：チアフルアミド）を有する除草剤に対する 耐性は、本発明に従うと特に非常に好ましい。この耐性により、前記除草剤を、 非耐性形態をとり、その除草剤により許容されない様式での傷害を被るであろう 作物植物においてさえも利用することができるようになる。 本発明は以下の例示的態様により詳細に説明される予定である： Ｉ． トウモロコシからのＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡの単離 例えば以下の便覧に記載される分子生物学の既知の課程および方法がＧＳＴＩ ＩＩｃ ＤＮＡを単離するために用いられる：Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．，Ｆｒｉ ｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ ｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９８９ 。 ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡを単離するためには最初に蛋白質をトウモロコシのモ ヤシ（ジー メイズ（Ｚｅａ ｍａｉｓ））（ムチン（Ｍｕｔｉｎ）変種）から 精製し（１）、そしてそのアミノ酸配列を蛋白質配列分析により完全に決定する （２）。同様にｍＲＮＡをトウモロコシの若木から単離し（３）、そしてリバー ストランスクリプターゼにより酵素的にｃＤＮＡに転写させる（４）。この様式 で取得されるｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．、Ｆａ ｌｏｏｎａ Ｆ． Ａ．、（１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５５：３３５−３ ５０）における鋳型として利用してＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡを単離する。 １． トウモロコシ変種ムチン（Ｍｕｔｉｎ）からのＧＳＴＩＩＩｃ蛋白質の単 離 ＧＳＴＩＩＩｃ蛋白質を精製するためにはトウモロコシの若木を解体し、そし て０．２Ｍ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．８、１ ｍＭ ＥＤＴＡ（２ｍｌ／ｇの 新鮮重量）と混合する。この懸濁物を遠心分離にかけ、そして上清内の蛋白質分 画を３０％および７０％の飽和度の分別式硫酸アンモニウム沈殿法により取得す る。このＧＳＴＩＩＩｃ蛋白質を、明記される緩衝液条件を用いる以下のカラム 上でのクロマトグラフィーにより単離する： Ａ） セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） Ｇ−１００ （デキストランを基 にする分離用媒質）、ｖ＝５００ｍｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社） 緩衝液Ａ：５０ｍＭ リン酸カリウム ｐＨ７．３ Ｂ） ＤＥＡＥ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（共有結合により結合さ せてあるジエチルアミノエチル基を有する架橋結合させたアガロースマトリック ス）、ｖ＝５０ｍｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社） 緩衝液Ａ：１０ｍＭ リン酸カリウム ｐＨ７．３ 緩衝液Ｂ：１．０Ｍ リン酸カリウム ｐＨ７．３ 濃度勾配：５００ｍｌ中に含まれる０〜１００％のＢ Ｃ） グルタチオン−スルフォブロモフタレイン−アガロース、ｖ＝２０ｍｌ（ Ｓｉｇｍａ社） 緩衝液Ａ：５０ｍＭ リン酸カリウム ｐＨ７．３ 緩衝液Ｂ：５０ｍＭ リン酸カリウム ｐＨ８．０、５ｍＭ グルタチオ ン Ｄ） モノ（Ｍｏｎｏ） Ｑ ＨＲ ５／５（荷電している−ＣＨ₂Ｎ（ＣＨ₃）₃ ⁺ 基を有する架橋結合させたアガロースに基づくアニオン交換材、１０±５μｍ の粒子サイズ）、ｖ＝１ｍｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社） 緩衝液Ａ：２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．５ 緩衝液Ｂ：２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ ｐＨ８．０、１．０Ｍ ＮａＣｌ 濃度勾配：２０ｍｌ中に含まれる０〜２５％のＢ ２． ＧＳＴＩＩＩｃ蛋白質の蛋白質配列分析 トウモロコシ（ムチン（Ｍｕｔｉｎ）変種）から単離したＧＳＴＩＩＩｃ蛋白 質を還元し、カルボキシメチル化させ、そして０．２Ｍの重炭酸アンモニウムに 対して透析する（Ｇｌａｚｅｒ Ａ．Ｎ．、Ｄｅｌａｎｇｅ Ｒ．Ｊ．、Ｓｉｇ ｍａｎ Ｄ．Ｓ．、（１９７５） Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏ ｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒ ｅｓｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。エンドプロテアーゼ Ａｓｐ−Ｎ（配列決定用 等級、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）もしくはトリプシン（ＴＰ ＣＫ−処理したもの、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社）での蛋白質の後続開裂を１： １００の蛋白質／プロテアーゼ比で、２３℃下で、１６時間実施する。この開裂 反応は０．１％のトリフルオロ酢酸の添加により停止させる。不溶性ペプチドを 遠心分離により除去し、そして可溶性ペプチドを以下の条件下での逆相ＨＰＬＣ により互いに分離させる： カラム：Ｖｙｄａｃ Ｃ１８（脂肪族性鎖（Ｃ₁₈）を有するケイ素を基にする 分離用ゲル）、０．４６ｃｍ×２５ｃｍ 溶出液Ａ：０．１％ トリフルオロ酢酸 溶出液Ｂ：０．１％ トリフルオロ酢酸、９０％ アセトニトリル 濃度勾配：４０ｍｌ中に含まれる０〜６０％のＢ 流速：０．２５ｍｌ／分 単離されたペプチドのアミノ酸配列は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓ ４７０Ａおよび４７３Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒを用いて 決定する。ＧＳＴＩＩＩｃ蛋白質の全蛋白質配列が配列番号２に示される。 ３． トウモロコシ（ムチン（Ｍｕｔｉｎ）変種）からのポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ の単離 ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、および対応するｃＤＮＡは、互いに取得 し合うことができるヌクレオチド配列を含む。ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡを単離す るためには最初にポリアデニル化させたｍＲＮＡをトウモロコシのモヤシから調 製する。単離は、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）オリゴ（ｄＴ）₂₅を用い て製造業者のプロトコールに従い実施する（Ｄｙｎａｌ社、Ｏｓｌｏ／Ｎｏｒｗ ａｙ；Ｊａｋｏｂｓｅｎ Ｋ．Ｓ．、Ｂｒｅｉｖｏｌｄ Ｅ．、 （１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：３６６９）。ポリ（Ａ）＋Ｒ ＮＡを精製するためのこの方法は、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの３’末端の残基と磁 性金属ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ社）の表面に共有結合により連結させてある オリゴ（ｄＴ）残基との間の塩基対結合に基づく。０．２ｇの植物物質がミリグ ラム当たりのダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）に 利用される。ｃＤＮＡの酵素的合成のためには、この方法により単離されたｍＲ ＮＡを更に進んだ精製段階を踏まずに利用する。 ４． ｃＤＮＡの酵素的合成 ｃＤＮＡは第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐ−Ｌ Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．社）の助けを借りて調製する。この方法は、ＲＮ Ａ鋳型に従ってＤＮＡを合成するウイルス性ＤＮＡポリメラーゼ（リバーストラ ンスクリプターゼ）の酵素活性に基づく（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．，Ｆｒｉｔｓ ｃｈ Ｅ．Ｆ．，ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．，（１９８２） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。 製造業者の明細に従い、この反応を以下の様式で実施する： トウモロコシ（ムチン（Ｍｕｔｉｎ）変種）からの５μｍのポリ（Ａ）＋ｍＲ ＮＡを １μｍの０．５Ｍ ジチオエリトリトール １μｍのｄ（Ｔ）_16-18プライマー マウスのリバーストランスクリプターゼ、１３５ｍＭ トリス／ＨＣｌ、ｐＨ ８．３、２０４ｍＭ ＫＣｌ、２７ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．２４ｍｇ／ｍｌ Ｂ ＳＡ、５．４ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、 からなる１１μｍの反応混合物（バルク反応ミックス） と混合させた。 ３７℃下、１時間の反応時間の後に、このｍＲＮＡをアルカリ性加水分解によ り除去する。合成されたｃＤＮＡを沈殿させ、そしてポリメラ ーゼ連鎖反応用の鋳型として利用する。 ５． ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡの増幅、クローニング、および配列決定 ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡを単離するためには最初にＧＳＴＩＩＩｃをコードす るヌクレオチド配列をポリメラーゼ連鎖反応（Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．，Ｆａｌ ｏｏｎａ Ｆ．Ａ．，（１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５ ５：３３５−３５０）を用いて増幅させる。この反応に用いられる鋳型はトウモ ロコシｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡである。ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡの特異 的濃縮のためには、配列番号３に示されるプライマー１（順方向）および配列番 号４に示されるプライマー２（逆方向）が利用される。 以下の組成を有する反応混合物を調製する： ５μｍのＣＤＮＡ（２００ｎｇ／μｌ） １μｍの５０μＭ プライマー１ １μｍの５０μＭ プライマー２ ４μｌの２５０μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、 ５μｌの２００ｍＭ トリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１００ｍＭ ＫＣｌ、６ ０ｍＭ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ００ ３４μｌ Ｈ₂Ｏ。 ポリメラーゼ連鎖反応はＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム ９６００サーモサ イクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）で実施 する。１μｌのＰｆｕ Ｄｎａ ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、２５ ００Ｕ／ｍｌ）が熱安定性ポリメラーゼとして添加される。総計では３５回の反 応周期を以下の温度および反応時間 で実施する：９４℃で４５秒、５８℃で４５秒、７２℃で４５秒。ＧＳＴＩＩＩ ｃをコードするヌクレオチド配列を含む増幅されたＤＮＡ断片はアガロースゲル 電気泳動により精製し、そして既に記載された要領でベクターｐＥＴ３ａ内にク ローン化する。ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡの全ＤＮＡ配列（配列番号１）を、Ｓｅ ｑｕａｎａｓｅ ＤＮＡ配列決定用キット（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｃａｌ社／Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）を用いて決定する（Ｓａｎｇｅｒ Ｆ．，Ｃｏｕｌｓｏｎ Ｒ．，（１９７５） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９４： ４４１−４４８）。 ＩＩ． 米の形質転換 米（オリザ サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））を以下の参考文献に記 載される方法に従って形質転換することができる。 米内にベクターｐＳＳ−ＧＳＴＩＩＩｃを導入させるためには、Ｈａｙａｓｈ ｉｍｏｔｏら（１９９０）の方法を改変を行わずに用いた。 カナマイシン−耐性形質転換体を、ノザン（Ｎｏｔｈｅｒｎ）ブロット実験で のＧＳＴＩＩＩｃの発現について検査した。ＧＳＴＩＩＩｃ蛋白質の形成は特異 的抗体により検出した。除草剤（５−トリフルオロメチル−１，３，４−チアジ アゾール−２−イルオキシ）酢酸 Ｎ−イソプロピル−Ｎ−（４−フルオロフェ ニル）アミドの酵素による触媒反応を受ける改変を検出することにより、形質転 換米植物からの粗精製抽出物内の蛋白質の酵素活性を示すことが可能となった。 トランスジェニック米植物は、非形質転換対照との比較により前記除草剤に対 する耐性を示す。 ＩＩＩ． タバコの形質転換 ａ）タバコ若枝の栽培およびタバコ原形質体の単離 ニコティナ タバクム（Ｎｉｃｏｔｉｎａ ｔａｂａｃｕｍ）（ペティト ハ バナ（Ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎｎａ） ＳＲ１）をホルモン非含有性ＬＳ培地上 での滅菌若枝栽培物として繁殖させる（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏ ｇ １９６５）。約６〜８週間の間隔で若枝の切片を新鮮なＬＳ培地に移す。こ の若枝栽培物を１２時間光（１０００〜３０００ルクス）に当てながら、２４〜 ２６℃の成長室に保持する。葉の原形質体を単離するためには約２ｇの葉（約３ 〜５ｃｍの長さ）を新しいカミソリの刃を用いて小片（０．５ｃｍ×１ｃｍ）に 切断する。 この葉材料を、Ｋ３培地（Ｎａｇｙ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ １９７６）、０． ４Ｍ スクロース、ｐＨ５．６、２％ セルロース Ｒ１０（Ｓｅｒｖａ社）、 ０．５％ Ｍａｃｅｒｏｚｙｍ Ｒ１０（Ｓｅｒｖａ社）からなる２０ｍｌの酵 素溶液中、室温で１４〜１６時間インキュベーションする。その後には原形質体 を０．３０ｍｍおよび０．１ｍｍのジェットスクリーンを通す濾過により細胞残 渣から分離する。この濾液を１００×ｇでの１０分間の遠心分離にかける。この 遠心分離中、未処理の原形質体の浮遊物が存在し、これは酵素溶液の上端のバン ド内に集まる。細胞残渣のペレットと酵素溶液とをガラス製毛細管で吸引除去す る。予備精製した原形質体を新鮮なＫ３培地（浸透剤としての０．４ｍスクロー ス）で１０ｍｌにメスアップし、そして浮遊作業を繰り返す。洗浄用培地を吸引 除去し、そしてその原型質体を培養もしくは後のアグロバクテリアでの感染（同 時培養）用に１〜２×１０⁵／ｍｌに希釈する。原型質体の濃度は係数用チャン バー内で決定する。 ｂ）ベクターｐＳＳ−ＧＳＴＩＩＩｃの構築およびアグロバクテリウム ツメ ファキエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）内への 導入 ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡおよびＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列をベクター ｐＥＴ３ａ−ＧＳＴＩＩＩｃからのＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ断片として切り出し、 精製し、そしてプラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＳｋ＋／−（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ社、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｆｏｒｎｉａ）内にクローン化し、本 明細書では今後これをｐＢＳ−ＳＫＩＩとして引用する。ＸｂａＩおよびＢａｍ ＨＩ開裂部位が用いられた。その後にはＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡをベクターｐＢ Ｓ−ＳＫＩＩ−ＧＳ ＴＩＩＩｃからＳｓｔＩおよびＳｍａＩ開裂部位を介して切り出し、単離し、そ してベクターｐＲＴ１０１（ＳｓｔＩ／ＳｍａＩで直線化させ Ｈ．Ｈ．，（１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：５ ８９０）。 その後にＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡをベクターｐＲＴ１０１−ＧＳＴＩＩＩｃか らのＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ断片として精製し、そして発現ベク ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ １：１５−２６（１９９５）） 内にクローン化した。 前記ベクターの代わりに、適切な開裂部位を有する他のいずれかの発現ベクタ ーおよびシャトルベクターを利用することが可能であり、当業者は先の記載を基 にして容易に適切な選択を行うことが可能である。得られるシャトルベクターｐ ＳＳ−ＧＳＴＩＩＩｃ（これはＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡを含む）を、機能的ｖｉ ｒ領域を含むアグロバクテリウムツメファキエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）内に導入する（Ｋｏｎｃｚ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌ ｌ １９８６、ｖａｎ Ｈａｕｔｅ ｅｔ ａｌ． １９８３）。 ｃ）アグロバクテリウム ツメファキエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）との同時培養による再生性タバコ原形質体の形質転換 若干の改善を加えたＭａｒｔｏｎら（１９７９）の方法が今後本明細書で用い られる。原形質体を記載の要領で単離し、そしてＫ３培地（０． ４Ｍ スクロース、０．１ｍｇ／ｍｌ ＮＡＡ、０．２ｍｇのキネチン）中１〜 ２×１０⁵／ｍｌの密度、２６℃下、暗所で２日間、次いで弱い光り（５００ル クス）下で１〜２日間インキュベートする。 原形質体の第一分裂が生じるやいなや、最少Ａ（Ａｍ）培地中のｂ）からの３ ０μｌのアグロバクテリウム懸濁物（密度は約１０⁹アグロバクテリア／ｍｌ） を３ｍｌの再生性原形質体に添加する。同時培養は暗所、２０℃下で３〜４日間 実施する。その後にタバコ細胞を１２ｍｌの遠心管に入れ、海水（６００ｍＯｓ ｍ／ｋｇ）で１０ｍｌに希釈し、そして６０×ｇで１０分間ペレット化させる。 大半のアグロバクテリアを除去する目的でこの洗浄段階を１〜２回もしくはそれ を上回る回数反復させる。この細胞懸濁物を、１ｍｇ／ｌのＮＡＡ（ナフチル− １−酢酸）、０．２ｍｇ／ｌ キネチン、および５００ｍｇ／ｌのセファロスポ リン抗生物質セフォタキシムを含むＫ３培地（０．３ｍスクロース）中の５×１ ０⁴ｍｌの密度で培養する。この細胞懸濁物を毎週新鮮なＫ３培地で希釈し、そ してその培地の浸透値を一週間毎に０．０５Ｍ スクロース（約６０ｍＯｓｍ／ ｋｇ）ずつ連続的に減少させる。カナマイシン（１００ｍｇ／ｌ 硫酸カナマイ シン（Ｓｉｇｍａ社）、６６０ｍｇ／ｇの活性Ｋｍ）での選択をアガロースビー ズタイプ培養物中での同時培養後２〜３週間目に開始する（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ ｅｔ ａｌ． １９８３）。カナマイシン−耐性コロニーを選択作業開始後３〜 ４週間目に残りのコロニーのバックグラウンドから識別することができる。 ｄ）ＤＮＡでのタバコ原形質体の直接形質転換。硝酸カルシウム／ＰＥＧ形質 転換。 １８０μｌのＫ３培地中の約１０⁶の原形質体を、ペトリ（Ｐｅｔｒ ｉ）皿中の２０μｇのプラスミドｐＳＳ−ＧＳＴＩＩＩｃを含む２０μｌのＤＮ Ａ水溶液と注意深く混合させる。プラスミドｐＳＳ−ＧＳＴＩＩＩｃは、プラス ミドｐＥＴ３ａ−ＧＳＴＩＩＩｃ、ｐＲＴ１０１、ｐＢＳ−ＳＫＩＩ、およびｐ ＳＳから既知の方法により取得することができる。その後に２００μｌの融合用 溶液（０．１Ｍ 硝酸ナトリウム、０．４５Ｍ マニトール、２５％ ポリエチ レングリコール（ＰＥＧ６０００）、ｐＨ９）を注意深く添加する。１５分後に ５ｍｌの洗浄用溶液（０．２７５Ｍ 硝酸カルシウム ｐＨ６）を添加し、そし て更に５分後に原型質体を遠心管内に移し、そして６０×ｇでペレット化させる 。このペレットを少量のＫ３培地に溶かし、そして次の項目に記載される要領で 栽培する。別法では、この原型質体をＨａｉｎら、１９８５、により記載される 要領で形質転換させることができる。 ｅ）ＤＮＡと共にインキュベートした原型質体の培養およびカナマイシン−耐性 カルスの選択： 改変ビーズタイプ培養技術（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ ｅｔ ａｌ． １９８３）を 、本明細書のこの後に記載されるカナマイシン−耐性コロニーの培養および選択 のために用いる。原形質体のＤＮＡでの処理後１週間目に（ｄを参照されたい） ３ｍｌの細胞懸濁物を５ｃｍのペトリ（Ｐｅｔｒｉ）皿内の３ｍｌのＫ３培地（ ０．３Ｍ スクロース＋ホルモン類；１．２％ （Ｓｅａｐｌａｑｕｅ）ＬＭＴ アガロース（低融解アガロース、Ｍａｒｉｎｅ Ｃｏｌｌｉｄｓ（海洋性コロイ ド））と混合する。この目的のためには、アガロースをオートクレーブで乾燥さ せ、そしてＫ３培地の添加後、電子レンジ内で短時間沸騰させる。アガロースが 固化した後、そのアガロースディスク（ビーズ）を、包埋させたタバコマ イクロカルスと共に更に進んだ培養および選択のために１０ｃｍのペトリ（Ｐｅ ｔｒｉ）皿内に移し、そして各々のペトリ（Ｐｅｔｒｉ）皿に１０ｍｌのＫ３培 地（０．３Ｍ スクロース、１ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌ キネチン） および１００ｍｇ／ｌ 硫酸カナマイシン（Ｓｈｉｇｍａ社）を添加する。この 液体培地は毎週交換する。同時にその培地の浸透値を段階的に減少させる。 交換用培地（Ｋ３＋Ｋｍ）のスクロースは毎週０．０５Ｍ（約６０ｍＯｓｍ） ずつ減少させる。 ＤＮＡ形質転換後のカナマイシン−耐性タバココロニーの選択のための概要： （Ｋ３培地 １ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌ キネチン） Ａ＝ＤＮＡ取り込み Ｅ＝アガロース内への包埋 Ｓ＝カナマイシン（１００ｍｇ／ｌ 硫酸カナマイシン）での選択 Ｋ＝カナマイシン−耐性コロニーは明らかにバックグラウンドから識別できる ｅ）カナマイシン−耐性植物の再生： カナマイシン−耐性コロニーが直径約０．５ｃｍに達したら直ちにその半分を 再生用培地（ＬＳ培地、２％ スクロース、０．５ｍｇ／ｌベンジルアミノプリ ン ＢＡＰ）上に置き、そして１２時間光（３０００−５０００ルクス）に当て ながら２４℃の生育室内に維持する。残り の半分を、１ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌ キネチン、０．１ｍｇ／ｌ ＢＡＰ、および１００ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシンを含むＬＳ培地上でのカルス 栽培物として繁殖させる。再生させた若枝が約１ｃｍのサイズとなる時点でそれ らを切り取り、そして発根させる目的で成長調節剤を含まない１／２ ＬＳ培地 （１％スクロース、０．８％アガー）上に置く。この若枝を、１００ｍｇ／ｌの 硫酸カナマイシンを含む１／２ ＭＳ培地上で発根させ、そして後に土壌に移す 。 ｇ）アグロバクテリウム ツメファキエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）による葉のディスクの形質転換 葉のディスクの形質転換（Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ． １９８５）のために は、滅菌させた若枝栽培物からの約２〜３ｃｍの長さの葉を１ｃｍの直径のディ スクに切り、そしてＡｍ培地（下記を参照されたい）中の適切なアグロバクテリ アの懸濁物（約１０⁹／ｍｌ）（ｃを参照されたい）と共に約５分間インキュベ ートする。感染させた葉の細片を、ホルモン類を含まないＭＳ培地（以下を参照 されたい）上に約２４℃で３〜４日間維持する。この期間にアグロバクテリウム は葉の細片全体に増殖する。葉の細片を次にはＭＳ培地（０．５ｍｇ／ｍｌ Ｂ ＡＰ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＮＡＡ）中で洗浄し、そして５００μｇ／ｍｌのセフ ォタキシムおよび１００μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシンを含む同一培地（０．８ ％アガー）上に置く。２週間後には培地を新しいものに交換すべきである。形質 転換されたカナマイシン−耐性若枝は更に２〜３週間後には可視化される。 生化学的形質転換検出法 ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(ＮＰＴ ＩＩ)酵素アッセイ： り記載されかつＳｃｈｒｅｉｅｒら（１９８５）により改変された要領で、カナ マイシンのインサイチュウーリン酸化により検出され、それを以下に示す。５０ ｍｇの植物組織をガラス粉末を添加してある５０μｌの抽出用緩衝液（１０％ グリセロール、５％ ２−メルカプトエタノール、０．１％ ＳＤＳ、０．０２ ５％ ブロモフェノールブルー、６２．５ｍＭ トリス ｐＨ６．８）中、氷上 でホモジナイズし、そして４℃下で１０分間エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒ ｆ）遠心機内で遠心分離する。５０μｌの上清を改変させていないポリアクリル アミドゲル（１４５×１１０×１．２ｍｍ；分解用ゲル：１０％アクリルアミド 、０．３３％ビスアクリルアミド、０．３７５Ｍ トリス ｐＨ８．８、スタッ キングゲル：５％アクリルアミド、０．１６５％ビスアクリルアミド、０．１２ ５Ｍ トリス ｐＨ６．８）にかけ、そして４℃、６０Ｖで一晩電気泳動にかけ る。ブロモフェノールブルーマーカーがゲルを貫通するやいなや、そのゲルを蒸 留水で１０分間ずつ２度洗浄し、次いで反応用緩衝液（６７ｍＭ トリス マレ ート、ｐＨ７．１、４２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、４００ｍＭ 塩化アンモニウム）で １度３０分間洗浄する。このゲルを同一サイズのガラスプレート上に置き、そし て基質である硫酸カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）および２０〜２００μＣｉの³² Ｐ ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を含む反応用緩衝液中の４０ｍｌの１％濃 度のアガロースゲルで被覆する。このサンドウイッチゲルを室温で３０分間イン キュベートし、そしてその後に１枚のＰ８１ホスホセルロースペーパー（Ｗｈａ ｔｍａｎ社）をそのアガロース上に置く。その上に４層の３ＭＭ濾紙（Ｗｈａｔ ｍａｎ社）を、次いで数枚のペーパー タオルを重ねる。インサイチューでリン酸化させた放射活性性リン酸カナマイシ ンのＰ８１ペーパーへの転移は３〜４時間後に停止させる。このＰ８１ペーパー をプロテイナーゼＫおよび１％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の溶液中、 ６０℃下で３０分間インキュベートし、そしてその後に２５０ｍｌの１０ｍＭリ ン酸緩衝液 ｐＨ７．５中、８０℃で３〜４時間回洗浄し、乾燥させ、そして− ７０℃下で１〜１２時間オートラジオグラフィー（ＸＡＲ５フィルム Ｋｏｄａ ｋ社）にかける。 先の実施例におる全パーセンテージデータおよび本明細書中これ以降に記載さ れるものは、他に特別な記載がない限り重量パーセンテージである。 先の記載および実施例において取得される植物細胞および植物内でのＧＳＴＩ ＩＩｃ ＤＮＡの存在はサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ブロット分析により確認し た。ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡの発現はノザン（Ｎｏｔｈｅｒｎ）ブロット分析お よび特異的抗体を用いるウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロットにより検出した 。 植物および植物細胞の形質転換に利用される幾つかの培地が以下に記載される ：Ａｍ培地 ３．５ｇ Ｋ₂ＨＰＯ₄ １．５ｇ ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ クエン酸Ｎａ₃塩 ０．１ｇ ＭｇＳＯ₄×７Ｈ₂Ｏ １ｇ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ２ｇ グルコース を１Ｌに添加せよ滅菌タバコ若枝栽培物のための培地 ＭＳ塩の１／２の濃度の多量元素 ＭＳ塩の１／２の濃度の多量元素 Ｆｅ ＥＤＴＡ Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ） オートクレーブにかける前でｐＨ５．７Ｋ３培地 ニコティアナ タバクム ペティト ハバナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃ ｕｍ ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ） ＳＲ１、ニコティアナ タバクム ウィス コンシン（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ） ３８ 、およびニコティアナ プルマギニフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍａ ｇｉｎｉｆｏｌｉａ ）の原形質体を培養するため（Ｎａｇｙ ａｎｄ Ｍａｌｉ ｇａ、１９７６） 滅菌濾過Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ培地 （Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ １９６５） 再生用原形質体の培養のため、ならびにタバコ腫瘍およびカルスの組織培養の ため。Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（ＬＳ）培地は以下の改変を加 えたＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎ ｄ Ｓｋｏｏｇ、１９６２）である： − チアミンを０．１ｍｇ／ｌの代わりに０．４ｍｇ／ｌという一層高い濃度で 計量する； − グリシン、ピリドキシン、およびニコチン酸は非存在である。 植物および植物細胞の形質転換に関しては以下の文献が引用されることがある 。 以下の公開された特許出願公開が更に引用されることがある： 欧州特許出願公開第１１６ ７１８号 欧州特許出願公開第１５９ ４１８号 欧州特許出願公開第１２０ ５１５号 欧州特許出願公開第１２０ ５１６号 欧州特許出願公開第１７２ １１２号 欧州特許出願公開第１４０ ５５６号 欧州特許出願公開第１７４ １６６号 欧州特許出願公開第１２２ ７９１号 欧州特許出願公開第１２６ ５４６号 欧州特許出願公開第１６４ ５９７号 欧州特許出願公開第１７５ ９６６号 国際公開第８４／０２９１３号 国際公開第８４／０２９１９号 国際公開第８４／０２９２０号 国際公開第８４／０１１７６号 本発明に従う形質転換植物の耐性の増加は以下の実施例により一層詳細に説明 されることがある。 形質転換植物の耐性の増加の証明： 除草剤活性を有するヘテロオキシアセトアミドに対する耐性の増加を検査する ために、本発明に従って形質転換させた植物に対する傷害を、対照植物との比較 により決定する。利用される検査除草剤は、化合物（５−トリフルオロメチル− １，３，４−チアジアゾール−２−イルオキシ酢酸 Ｎ−イソプロピル−Ｎ−（ ４−フルオロフェニル）アミドである。 形質転換植物のＦ１世代の種子を温室（ガラス製）内のウエキバチ（ｄ＝１１ ｃｍ）内に３％腐植土を含む天然土壌上に撒く。この植物を２３℃の温度および ７０〜８０％の相対湿度下で成長させる。７０ＰＷ（湿式粉末）として製剤され る既述の除草剤化合物を２０００〜４０００ｇの活性化合物／ｈａの施用率に相 当する濃度で用いる処理を、その種子を撒いた後２４時間目に実施する。 評定は除草剤での処理後２０日目に実施する。トランスジェニック植 物に対する総計パーセンテージ傷害率は、同一濃度の活性化合物で処理した対応 対照植物と比較して評定する。 本発明に従ってＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡが挿入された形質転換タバコ植物は、 形質転換させていない対応対照植物と比較するとその除草剤の高施用率（２００ ０−４０００ｇ／ｈａ）に対して顕著に高い耐性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者 ハイン，リユデイガー ドイツ連邦共和国デー−40764ランゲンフ エルト・タルシユトラーセ53アー (72)発明者 マン，カールハインツ ドイツ連邦共和国デー−82152マルテイン スリート・コペルニクスベーク１ (72)発明者 ライフ，ハンス−イエルク ドイツ連邦共和国デー−50939ケルン・ゴ ツテスベーク165 (72)発明者 トムツイク，ユルゲン・エルンスト ドイツ連邦共和国デー−40764ランゲンフ エルト・ザウアーブルフシユトラーセ13ア ー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 配列番号２に示される蛋白質グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ Ｉ ＩＩｃ（ＧＳＴＩＩＩｃ）もしくはそれに由来する蛋白質をコードするＤＮＡ（ デオキシリボ核酸）（ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡ）。 ２． 配列番号１に示される配列もしくはそれに由来する配列を有する、請求 の範囲１に記載のＤＮＡ。 ３． ベクタープラスミドｐＥＴ３ａ−ＧＳＴＩＩＩｃ上に存在するＧＳＴＩ ＩＩｃ ＤＮＡの配列もしくはそれに由来する配列を有する、請求の範囲１に記 載のＤＮＡ。 ４． 請求の範囲１〜３に記載のＤＮＡおよびそれに相補的なＤＮＡ鎖を含む ＤＮＡ二本鎖の形態をとる、請求の範囲１〜３に記載のＤＮＡ。 ５． 植物内で有効なプロモーターが、コーディング配列の５’末端の上流に 挿入される、請求の範囲１〜４に記載のＤＮＡ。 ６． ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、あるいはＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサ ーおよびＣａＭＶ ３５ＳプロモーターからなるＣａＭＶ ３５Ｓダブルプロモ ーターがプロモーターとして用いられる、請求の範囲５に記載のＤＮＡ。 ７． ベクタープラスミドｐＳＳ−ＧＳＴＩＩＩｃ上に存在するＧＳＴＩＩＩ ｃ ＤＮＡおよびＣａＭＶ ３５Ｓダブルプロモーターの構築物を表す、請求の 範囲５に記載のＤＮＡ。 ８． 請求の範囲１〜７に記載のＤＮＡを含む、原核生物もしくは真核生物の 組換えＤＮＡ。 ９． 植物もしくは植物細胞内に存在し、かつ請求の範囲１〜７に記載のＤＮ Ａを含む、組換えＤＮＡ。 １０． 請求の範囲１〜７に記載のＤＮＡか、もしくは請求の範囲８および９に 記載の組換えＤＮＡを含むベクター。 １１． ベクタープラスミドｐＥＴ３ａ−ＧＳＴＩＩＩｃおよびｐＳＳ−ＧＳＴ ＩＩＩｃ。 １２． 請求の範囲１〜７に記載のＤＮＡか、もしくは請求の範囲８および９に 記載の組換えＤＮＡを含む形質転換微生物。 １３． 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＤＳ ｐＥＴ３ａ−Ｇ ＳＴＩＩＩＣ（ＤＳＭ ９６７７に従う）および本発明を実施するために必須な 特徴を依然として保持するその突然変異体。 １４． ゲノム内に、対応する非トランスジェニック植物のＤＮＡに加え、請求 の範囲１〜７に記載のＤＮＡを含むトランスジェニック植物（これらの植物の部 分、ならびに例えば原形質体、植物細胞、カルス、種子、塊茎、もしくは切り枝 などを初めとする）。 １５． ゲノム内に請求の範囲６に記載のＤＮＡを含む、請求の範囲１４に記載 のトランスジェニック植物。 １６． ゲノム内に請求の範囲７に記載のＤＮＡを含む、請求の範囲１４に記載 のトランスジェニック植物。 １７． 適切な場合には二量体形態をとるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ ＩＩＩｃ（ＧＳＴＩＩＩｃ）の内容物を有する、請求の範囲１４〜１６に記載の トランスジェニック植物。 １８． 対応する非トランスジェニック植物との比較により、除草剤、具体的に はヘテロオキシアセトアミド除草剤に対する耐性が増加している、請求の範囲１ ４〜１７に記載のトランスジェニック植物。 １９． トランスジェニック植物細胞（原型質体を初めとする）および トランスジェニック植物（植物の部分および種子を初めとする）を産生するため の、請求の範囲１〜７に記載のＤＮＡ、および／または請求の範囲８と９とに記 載の組換えＤＮＡ、および／または請求の範囲１０と１１とに記載のベクター、 および／または請求の範囲１２と１３とに記載の形質転換微生物の使用。 ２０． （ａ）請求の範囲１に記載のＤＮＡおよび／または請求の範囲８に記載 の組換えＤＮＡを植物細胞（原型質体を初めとする）のゲノム内に挿入し、そし て適切な場合には、 （ｂ）完全な形質転換植物をそのトランスジェニック植物細胞（原型質 体を初めとする）から再生させ、かつ適切な場合には繁殖させ、そして適切な場 合には、 （ｃ）植物の必要とされる部分（繁殖用物質を初めとする）をこの様式 で取得される親世代もしくはそこから取得される更に先の世代のトランスジェニ ック植物から取得する ことを特徴とする、請求の範囲１４に記載のトランスジェニック植物の産生のた めの方法。 ２１． 繁殖用物質を産生するため、ならびに請求の範囲１に記載のＤＮＡもし くは請求の範囲８に記載の組換えＤＮＡを含む新規植物およびそれらの繁殖用物 質を産生するための、請求の範囲１４に記載のトランスジェニック植物の使用。 ２２． プラスミドｐＥＴ３ａ−ＧＳＴＩＩＩｃ上に存在するＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡに完全にかもしくは部分的に対応するか、または配列番号１に完全にかも しくは部分的に対応するＤＮＡの、ＧＳＴＩＩＩｃ ＤＮＡの内容物を検出する ためか、またはその内容物について調査され る予定のＤＮＡ内の構成成分を検出するためのプローブとしての使用。 ２３． 対応する非トランスジェニック植物との比較によると除草剤、具体的に はヘテロオキシアセトアミド除草剤に対する耐性が増加しているトランスジェニ ック植物を産生するための、配列番号２に示される蛋白質ＧＳＴＩＩＩｃをコー ドするＤＮＡの使用。 ２４． 配列番号２に示されるアミノ酸配列もしくはそれに由来する配列を有す る蛋白質。 ２５． 二量体形態をとる、請求の範囲２４に記載の蛋白質。