JP2001029085A - 分泌型酸性フォスファターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 分泌型酸性フォスファターゼの遺伝子とこの
遺伝子を利用した植物への低リン耐性を付与する方法を
提供する。また分泌シグナルを用いて任意のタンパク質
を細胞外に分泌させる方法を提供する。さらに根の表面
に結合させるペプチドを用いることにより、任意のタン
パク質を根の表面に結合させる方法を提供する。 【解決手段】 リン酸飢餓でルーピンの根で発現が大量
に誘導される分泌型酸性フォスファターゼを精製し、そ
の遺伝子及び分泌シグナルペプチドさらに根の表面に結
合するペプチドを単離する。この遺伝子を植物体内で機
能するプロモーターの下流に接続した発現ベクターを組
み込んだ形質転換植物で分泌型酸性フォスファターゼを
発現させる。または任意のタンパク質をこの分泌シグナ
ルと連結させ細胞外に分泌させる。または任意のタンパ
ク質を根の表面への結合ペプチドと連結し根の表面に結
合させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物の遺伝子工学
的手法に関するもので、遺伝子組換えによる形質転換植
物の作出・高機能植物の育成、並びに植物を用いての物
質生産に利用される。

【０００２】

【従来の技術】植物の生育にリンは必須であり、土壌中
のリンが欠乏した場合、植物の生育は大きく妨げられ
る。また、世界全体にはリン欠乏状態にある土壌が広く
分布しており、この様な土地で植物を正常に生育させる
ためにはリン肥料を投入する必要があった。しかしなが
ら、リン肥料の原料である燐鉱石が枯渇し始めており、
近い将来、作物生産が減少し食糧問題が生じることが危
惧されている。その一方で、土壌中には植物が直接利用
できない形態ではあるが、有機態リンとしてリンが多量
に存在することが知られている。来るべき食糧問題に対
処していくため、これらのリン資源を効果的に循環利用
しながら植物を正常に生育させることが強く求められて
いる。

【０００３】植物は軽度のリン欠乏状態では、根から酸
性フォスファターゼを分泌することで有機態リンを分解
し、放出した無機態リンを吸収・利用している。この能
力が特に高い植物は低リン耐性植物と呼ばれ、低濃度の
リンでも正常に生育することが出来る。すなわち、低リ
ン耐性植物はリン欠乏土壌で土壌中の有機態リンを有効
に利用する能力を持つ。

【０００４】植物の持つ酸性フォスファターゼ（ＥＣ
３．１．３．２）としては、数種の植物由来のものが知
られている。さらに、これらは基質特異性によって大き
く高親和性と低親和性に分類され、低親和性の酸性フォ
スファターゼは土壌中に存在する様々な形態の有機リン
を分解するのに有効とされている。

【０００５】低リン耐性植物の一つであるルーピン（Ｌ
ｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ Ｌ．）は、低リン条件下で
根から大量の低親和性の酸性フォスファターゼを分泌す
る。この分泌型酸性フォスファターゼが精製され、その
特性が明らかにされた。この酵素は、ｐＨ４．０からｐ
Ｈ９．０の広い範囲で、また、７０℃まで温度を上昇さ
せても安定である。しかも、土壌の水抽出液中に１４日
間保持した場合でも、最大５５％の活性が残存すること
が示されている。この様な安定性は、植物の根から酵素
を土壌中に分泌させて機能させる上で極めて有効な特性
である。

【０００６】この様に、ルーピンの低親和性の分泌型酸
性フォスファターゼの機能は知られていたが、それをコ
ードする遺伝子の配列、及び分泌シグナルをコードする
ＤＮＡの配列、さらに根の表面にタンパク質を結合させ
るシグナルをコードするＤＮＡの配列に関しては、全く
知られていなかった。さらには、低親和性の酸性フォス
ファターゼを一般的なリン欠乏で生育が抑制される植物
で発現させることによって低リン耐性が向上するか否か
については、全く不明であった。また分泌シグナルや根
の表面にタンパク質を結合させるシグナル配列を任意の
タンパク質に結合させることにより該植物の機能改変が
できるかどうかは全く不明であった。

【０００７】さらに近年、動物の組織培養や微生物のタ
ンク培養による高価なタンパク質生産法に代替し得る方
法として、植物を用いて有用タンパク質などを大量に発
現させる方法が注目を集めているが、植物組織内に蓄積
することには量的に限界があった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、低リ
ン耐性植物が分泌し、かつ、有機態リンの分解・利用に
寄与している分泌型の酸性フォスファターゼの遺伝子を
提供することにある。さらに言えば、該遺伝子を利用し
た発現ベクターを提供し、植物体内で発現させることに
よって植物に低リン耐性を付与する方法およびこれによ
って得られる低リン耐性植物を提供することにある。そ
こで、本発明では、ルーピンの根から低リン条件で大量
に分泌される、根の表面に結合する低親和性の分泌型酸
性フォスファターゼをコードする遺伝子を提供すること
を目的とする。

【０００９】さらに細胞から任意のタンパク質を分泌さ
せたりもしくは根の表面に結合させる方法により、低リ
ン耐性以外にも耐病性や耐虫性を含む様々な形質を植物
に付与する方法を提供することを目的とする。

【００１０】さらに本発明の課題は、任意のタンパク質
を植物を用いて大量に生産させる方法を提供することに
ある。そこで本発明では、任意のタンパク質を細胞内に
蓄積させる代わりに、細胞から分泌させる方法及び根表
面に発現させる方法を提供することで、植物に任意のタ
ンパク質を大量に生産させることを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、リン酸飢
餓でルーピンの根でその発現が大量に誘導される酸性フ
ォスファターゼに着目した。低リン条件で誘導される酸
性フォスファターゼを精製し、さらには、この酵素をコ
ードする遺伝子の単離を試みた。その結果、ルーピンの
分泌型酸性フォスファターゼのｃＤＮＡを単離すること
に成功した。単離した遺伝子の機能を鋭意解析した結
果、単離したルーピン由来のｃＤＮＡの１つのｃＤＮＡ
にコードされる分泌型酸性フォスファターゼが根の表面
に局在することを見出した。さらに、該ｃＤＮＡを植物
用のプロモーターの下流に接続した発現ベクターを構築
し、該発現ベクターを組み込んだ植物が低リン条件下で
も生育できることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。

【００１２】すなわち、本発明は以下のとおりである。 ［１］ 植物の根の表面に結合し、配列表の配列番号１
の１番から３１番のアミノ酸配列で規定される分泌に関
与するシグナル配列を有する分泌型酸性フォスファター
ゼ。 ［２］ 植物の根の表面に結合し、配列表の配列番号１
の５０２番から５９１番のアミノ酸配列で規定され、タ
ンパク質を根の表面に結合させる機能を有するポリペプ
チドを有する分泌型酸性フォスファターゼ。 ［３］ 配列表の配列番号１に記載の１番から３１番の
アミノ酸配列を有する事を特徴とする分泌に関与するシ
グナル配列。 ［４］ 配列表の配列番号１の５０２番から５９１番で
示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該
ポリペプチドを含むタンパク質を根の表面に結合させる
機能を有するポリペプチド。 ［５］ 上記［１］又は［２］に記載の分泌型酸性フォ
スファターゼをコードする遺伝子。 ［６］ 上記［３］に記載のシグナル配列をコードする
ＤＮＡ。 ［７］ 上記［４］に記載のポリペプチドをコードする
ＤＮＡ。 ［８］ 配列表の配列番号１に記載の１番から６４８番
のアミノ酸配列で規定される分泌型酸性フォスファター
ゼをコードするｃＤＮＡ。 ［９］ 上記［５］に記載の遺伝子を含む発現ベクタ
ー。 ［１０］ 上記［６］に記載のＤＮＡを含む発現ベクタ
ー。 ［１１］ 上記［７］に記載のＤＮＡを含む発現ベクタ
ー。 ［１２］ 上記［８］に記載のＤＮＡを含む発現ベクタ
ー。 ［１３］ 上記［９］〜［１１］の何れか一項に記載の
発現ベクターを保持する細胞。 ［１４］ 上記［１３］に記載の発現ベクターを保持す
る細胞を有する形質転換植物。 ［１５］ 配列表の配列番号１８の１番から３４番のア
ミノ酸配列で規定される分泌に関与するシグナル配列を
有する分泌型酸性フォスファターゼ。 ［１６］ 配列表の配列番号１８に記載の１番から３４
番のアミノ酸配列を有する事を特徴とする分泌に関与す
るシグナル配列。 ［１７］ 上記［１５］に記載の分泌型酸性フォスファ
ターゼをコードする遺伝子。 ［１８］ 上記［１６］に記載のシグナル配列をコード
するＤＮＡ。 ［１９］ 配列表の配列番号１８に記載の１番から４６
２番のアミノ酸配列で規定される分泌型酸性フォスファ
ターゼをコードするｃＤＮＡ。 ［２０］ 上記［１７］に記載の遺伝子を含む発現ベク
ター。 ［２１］ 上記［１８］に記載のＤＮＡを含む発現ベク
ター。 ［２２］ 上記［２０］または［２１］の何れか一項に
記載の発現ベクターを保持する細胞。 ［２３］ 上記［２２］に記載の発現ベクターを保持す
る細胞を有する形質転換植物。 ［２４］ 上記［３］または［１６］に記載された配列
を用いて任意のタンパクを細胞外に分泌させる方法。 ［２５］ 上記［４］の配列に記載された配列を用いて
任意のタンパク質を根の表面で発現させる方法。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明において酸性フォスファタ
ーゼとは正リン酸エステルを酸性で加水分解する酵素
で、基質特異性（基質選択性）が低いものを指す。さら
に、本発明の分泌型酸性フォスファターゼとは植物体の
根から分泌され、植物体の根の表面および土壌中で機能
するものを指す。すなわち、本発明の分泌型酸性フォス
ファターゼの前駆体タンパクには酸性フォスファターゼ
の機能を持つ領域に加え、Ｎ末端には植物体外への分泌
に必要なシグナル配列を有し、さらに、Ｃ末端領域付近
には根の表面に結合するためのペプチドが含まれる場合
がある。

【００１４】本発明の分泌型酸性フォスファターゼは上
記の機能および構造の特徴を有するものを指し、この条
件を満たす配列で有れば如何なるアミノ酸配列であって
も本発明に含まれる。

【００１５】分泌型酸性フォスファターゼとしては、例
えば、配列番号１または１８で示されるアミノ酸配列を
持つものが挙げられる。配列番号１番のアミノ酸配列の
１番から３１番で示されるペプチドを含む領域もしくは
配列番号１８番のアミノ酸配列の１番から３４番で示さ
れるペプチドが、分泌に関与するシグナル配列として機
能する。これらのシグナル配列を任意のタンパク質につ
なぎ、このタンパク質を適当なプロモーターにさらに連
結することにより、所望のタンパク質を目的組織特異的
に分泌させることができる。また配列番号１番のアミノ
酸配列の５０２番から５９１番で示されるペプチドを含
むＣ末端付近の領域が根の表面への結合に関与する。配
列番号１番の１６２番アスパラギン酸、１９１番のアス
パラギン酸、１９４番のチロシン、２２８番のアスパラ
ギン、３１５番のヒスチジン、３５２番のヒスチジン、
３５４番のヒスチジンの７つのアミノ酸残基は金属イオ
ン結合部位として機能し、酸性フォスファターゼの活性
に寄与している。配列番号１番及び１８番で示されるタ
ンパク質間ではアミノ酸レベルで６１％の相同性があ
る。

【００１６】以下に、本発明の実施形態として、分泌型
酸性フォスファターゼの精製方法、ｃＤＮＡの単離方
法、発現ベクターの構築方法ならびに形質転換植物の作
製方法について説明する。

【００１７】（１）分泌型酸性フォスファターゼの精製 分泌型酸性フォスファターゼは、植物の根や根からの分
泌物から精製する事ができ、特に低リン条件で植物を生
育させた場合には、多量に発現・分泌され、大量の酸性
フォスファターゼを得ることができる。この分泌型酸性
フォスファターゼを抽出するための植物種としては、低
リン条件下でも生育可能な低リン耐性植物が好ましい。
低リン耐性植物としては、例えば、ルーピン等が挙げら
れる。しかしながら、低リン耐性植物以外でも、実質的
に同様に機能を有する分泌型酸性フォスファターゼをコ
ードしている可能性があり、低リン耐性植物以外の植物
であっても、酸性フォスファターゼの供給源として用い
ることは可能である。

【００１８】本発明の分泌型酸性フォスファターゼは、
根組織から抽出または根から分泌・回収された多数のタ
ンパク質が混在する粗タンパクの中に含まれる。粗タン
パクからの酸性フォスファターゼの精製は、例えば、ゲ
ル濾過・イオン交換クロマトグラフィー等の定法を適宜
組み合わせることで行える。精製された分泌型酸性フォ
スファターゼの一部のアミノ酸配列はそのＮ末端を直
接、または、タンパク分解酵素を用いて分解・分画した
ペプチドを用いてタンパク内部のアミノ酸配列を決定す
ることができる。

【００１９】（２）分泌型酸性フォスファターゼ遺伝子
の単離 次に、分泌型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子
の単離方法について説明する。精製した分泌型酸性フォ
スファターゼに対する抗体を作製する。抗体は一般に行
われている方法によって作製できる。作製した抗体をプ
ローブとして用い、遺伝子を単離する植物種から作製し
たｃＤＮＡの発現ライブラリーをスクリーニングするこ
とで、分泌型酸性フォスファターゼのｃＤＮＡを単離す
ることができる。発現ライブラリーは市販されている、
例えば、λＺＡＰII（Stratagene社）等のクローニング
ベクターにｃＤＮＡを組み込むことによって作製でき
る。また、決定した部分的なアミノ酸配列に基づいて合
成したペプチドに対する抗体も同様に利用できる。

【００２０】また、同定された分泌型酸性フォスファタ
ーゼの部分的なアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオ
チドを利用することによって分泌型酸性フォスファター
ゼをコードする遺伝子を単離することができる。すなわ
ち、部分的なアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチ
ドを推定し、合成したオリゴヌクレオチドをラベルして
プローブとして用いることによって、ゲノミックライブ
ラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーから直接遺伝子を
単離する。あるいは、ＰＣＲを用いた方法として以下の
方法を用いることができる。すなわち、アミノ酸配列に
対応する複数の配列を持つオリゴヌクレオチドが混合さ
れた、いわゆる、デジェネレートプライマーを用いる。
この方法によって分泌型酸性フォスファターゼの遺伝子
の一部分もしくは全体を増幅する。さらに、Ｎｅｓｔｅ
ｄ−ＰＣＲと呼ばれるデジェネレートプライマーの内側
の配列を用いて２回目のＰＣＲを実施することで、デジ
ェネレートプライマーを用いた方法の精度を更に高める
ことができる。ＰＣＲの鋳型としては、全ＲＮＡ、ｍＲ
ＮＡ、全ＤＮＡ等を用いることができるが、これらから
作製したｃＤＮＡライブラリーやゲノミックライブラリ
ーも用いることができる。

【００２１】増幅された遺伝子が分泌型酸性フォスファ
ターゼの遺伝子の一部分である場合には、増幅された遺
伝子の一部分をプローブとして、ｃＤＮＡライブラリー
やゲノミックライブラリーから完全長の遺伝子を含むク
ローンを単離することができる。また、増幅された遺伝
子の一部分に対応する塩基配列を基にプライマーを合成
し、ＴＡＩＬ−ＰＣＲやＩｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲ等の方
法を用いて、全ＤＮＡを鋳型として遺伝子全体を単離す
ることもできる。

【００２２】スクリーニングやＰＣＲの鋳型に供するＤ
ＮＡライブラリーは、遺伝子単離を目的とする植物種の
組織から抽出したＤＮＡやＲＮＡを定法に従って前処理
した後に、ｐＵＣ等のプラスミドベクターやあるいはＢ
ＡＣベクター・λファージベクター等の市販のベクター
に挿入し、大腸菌に導入または感染させることによって
構築することができる。

【００２３】（３）発現ベクターの構築 本発明において発現ベクターとは、実質的に分泌型酸性
フォスファターゼをコードしうるｃＤＮＡもしくは遺伝
子を植物体内で機能しうるプロモーターの下流に連結
し、その下流にターミネーターと呼ばれるポリアデニル
化シグナル配列を接続したものを、さらに、植物形質転
換に用いることの出来るベクターに組み込んだものを言
う。

【００２４】植物体内でその下流に接続した遺伝子を発
現できるもので有れば如何なるプロモーターであっても
用いることができるが、特に、植物の根において強く発
現するプロモーターが望ましい。さらに、プロモーター
が低リン状態で発現誘導されるものがより好ましい。こ
の様なプロモーターとして、例えば、本発明の分泌型酸
性フォスファターゼ遺伝子のプロモーターやシロイヌナ
ズナのリン酸トランスポーター遺伝子のプロモーターが
利用できる。一方、ターミネーターとしては一般に用い
られている植物で機能するポリアデニレーションシグナ
ルの配列を用いることができる。この様な配列の一例と
して、例えば、ノパリン合成酵素やデンプン合成酵素の
遺伝子のポリアデニレーションシグナル等が挙げられ
る。また、植物の形質転換に用いる事の出来るベクター
としては、例えば、市販のｐＵＣ１９等の大腸菌で増幅
可能なベクターやアグロバクテリウムの保持しているＴ
ｉプラスミド由来のｐＢＩ１２１（Clontech社）等のバ
イナリーベクターが挙げられる。

【００２５】（４）形質転換植物の作出 構築した上記ベクターを高等植物の細胞に導入する方法
としては、植物細胞の形質転換方法として確立している
任意の方法が利用できる。例えば、電気穿孔法、ポリエ
チレングリコール法、マイクロインジェクション法によ
る植物プロトプラストへの直接導入法、シリコンカーバ
イドウィスカーやパーティクルガンを用いた植物組織へ
の直接導入法やアグロバクテリウムを介した導入方法を
用いる事が出来る。また、形質転換される植物細胞とし
ては、導入方法に適した細胞や組織を用いることが出来
る。本発明の発現ベクターを使用できる植物種として
は、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ等の単子葉植
物、タバコ、ジャガイモ、トマト等の双子葉植物、ポプ
ラ、ユーカリ等の木本植物等が挙げられるが、形質転換
による外来遺伝子の組み込みが可能で有れば、如何なる
植物種であっても構わない。

【００２６】

【実施例】以下に本発明を実施例に基づき詳細に説明す
る。 ［実施例１］分泌型酸性フォスファターゼの単離 （１）植物材料の育成 ルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ Ｌ． ｃｖ．
Ｋｉｅｖｓｋｉｊ）の種子の表面を７０％エタノールで
滅菌後、播種し、温室内で育成した。生育期間中の温室
内の気温は２０℃から３０℃に維持した。発芽後４日目
に３６個の実生をプラスチック製のバットに移植し、１
０Ｌの水耕液で水耕栽培を行った。水耕液は、１．４ｍ
Ｍ ＮＨ₄ＮＯ₃、２．０ｍＭ ＮａＮＯ₃、２．０ｍＭ
ＭｇＳＯ₄、２．０ｍＭ ＣａＣｌ₂、１．０ｍＭ Ｋ
₂ＳＯ₄、６５μＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、３６μＭ、ＦｅＳＯ
₄、１７μＭ ＭｎＳＯ₄、３．１μＭ ＺｎＳＯ₄、
０．１６μＭ ＣｕＳＯ₄、４７μＭ Ｈ₃ＢＯ₄、７．
５ｎＭ （ＮＨ₄）６Ｍｏ₇Ｏ_{2 4}の成分を含む。３日間水
耕栽培を続けた後、ＮａＨ₂ＰＯ₄を含む水耕液（＋Ｐ）
もしくは、これを含まない水耕液（−Ｐ）に移植した。
水耕液は、０．１ＮＮａＯＨを用いてｐＨ５．３に調整
した。ｐＨの調整は毎日実施し、さらに、４日毎に新し
い水耕液と交換した。

【００２７】（２）分泌型酸性フォスファターゼの分離
精製 根から水耕液中に分泌されるタンパク質は透析膜（Visk
ase Corp., Ｍ．Ｗ．１２０００−１４０００）を用い
て、毎日、サンプリングした。透析した分泌タンパク
は、水耕液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ（Pharmacia社）のカラム
（５．６×２１ｃｍ）に重層した。水耕液で洗浄後、０
から７００ｍＭの連続密度勾配のＮａＣｌで溶出した。
各画分の酸性フォスファターゼの活性は、ポリアクリル
アミド電気泳動で分画した後に活性染色で調べた。活性
染色は以下の方法で行った。すなわち、２５ｍｇ／５ｍ
Ｌの４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅと２０ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａを含む、４
００ｍＭ クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）に浸した
酢酸セルロース膜を電気泳動後のゲルに重ね、３７℃で
５分間反応させる。精製した蛍光４−ｍｅｔｈｙｌｕｍ
ｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅを３５０ｎｍの紫外線で検出す
る。これによって、活性のある画分を集め、超透析膜
（Sartorius、Ｍ．Ｗ．１３２００）を用いて濃縮し
た。濃縮によって生じた沈殿は１５０００×ｇ、１０分
間の遠心分離で除去し、上清を回収した。回収した上清
は２００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）で一晩透析した。次に、上記濃縮液
を２００ｍＭ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）で平衡化したＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−２００（Bi
o-Rad社）のカラム（２．０ｃｍ×６０ｃｍ）に重層
し、酵素を同じ組成のバッファーで溶出した。再度、活
性のある画分を集めて、超透析膜を用いて濃縮した。さ
らに、残存する不純物を除去するため、濃縮液を電気泳
動によって分画し、活性のある画分のみを切り出し、２
００ｍＭ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）で溶出した。溶出液は超透析膜を用いて濃縮した。
得られた酵素液を、再び２００ｍＭ ＮａＣｌを含むＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化したＢｉｏ−Ｇ
ｅｌ Ｐ−２００（Bio-Rad社）のカラム（２．０ｃｍ
×６０ｃｍ）に重層し、酵素を同じ組成のバッファーで
溶出した。得られた分泌型酸性フォスファターゼは、分
子量７２０００のモノマーが会合した分子量１４０，０
００のホモダイマーで、その等電点は４．３，至適ｐＨ
は４．７であった。

【００２８】［実施例２］アミノ酸配列の決定 （１）分泌型酸性フォスファターゼの部分アミノ酸配列
の決定 精製した分泌型酸性フォスファターゼのＮ末端のアミノ
酸配列はＰｒｏ−ＳｐｉｎＴＭ（Perkin Elmer Cetus
社）を用いて決定した。また、分泌型酸性フォスファタ
ーゼを、ＣＮＢｒもしくはＬｙｓｉｌ−ｅｎｄｏｐｅｐ
ｔｉｄａｓｅを用いて分解し、５箇所の部分配列を決定
した。高速液体クロマトグラフィーによって分画し、１
３０Ａ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Perkin
Elmer Cetus社）と４４７Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅｒ（Perkin Elmer Cetus社）を用いて解析し
た。決定した部分アミノ酸配列を、配列番号９、配列番
号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３お
よび配列番号１４で示した。

【００２９】（２）ＰＣＲによる分泌型酸性フォスファ
ターゼｃＤＮＡの部分配列の増幅 決定した部分アミノ酸配列を元に、配列番号１５および
配列番号１６で示される２つのデジェネレートプライマ
ーを設計した。これらのプライマーを用いて、実施例３
に記載のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＰＣＲによ
って分泌型酸性フォスファターゼのｃＤＮＡの一部分を
増幅した。ＰＣＲはＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌ
ｅｒ ＰＪ１０００（Perkin Elmer Cetus社）を使用し
た。ＰＣＲの条件は、９４℃で１分間のディネーチャ
ー、５０℃で２分間のアニール、７２℃で３分間の伸長
反応を１サイクルとし、３０サイクル反応させた。反応
液を１％アガロースで分画したところ、増幅された約
０．９ｋｂのＤＮＡ断片が一本、検出された。増幅され
たＤＮＡ断片を回収し、その末端部分をＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼを用いて平滑化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
II ＳＫ＋（Stratagene社）のＥｃｏＲＶサイトにサブ
クローニングした。サブクローニングされたｃＤＮＡ断
片の塩基配列を３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（ABI
社）を用いて決定した。

【００３０】（３）ＤＮＡプローブの作製 上記サブクローンの一部分をＰＣＲによって増幅し、ｐ
ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ＋（Stratagene社）のＥ
ｃｏＲＶサイトにサブクローニングした。得られたクロ
ーンは配列番号１７に示す４９１ｂｐの分泌型酸性フォ
スファターゼのｃＤＮＡの一部分の塩基配列を含んでい
た。このプラスミドをｐＢＬＡＰ４９３とした。このｐ
ＢＬＡＰ４９３を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断
し、インサートを切り出した。切り出したフラグメント
をＬＡＰ４９３と名付け、これを実施例３のプローブと
して用いた。

【００３１】［実施例３］ｃＤＮＡの構築 （１）植物体の育成 ルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ Ｌ． ｃｖ．
Ｋｉｅｖｓｋｉｊ）の種子の表面を７０％エタノールで
滅菌後、播種し、温室内で育成した。生育期間中の温室
内の気温は２０℃から３０℃に維持した。発芽後７日目
に５６Ｌのプラスチック製のバットに移植し、水耕栽培
を行った。水耕液の組成は、１．４ｍＭＮＨ₄ＮＯ₃、
２．０ｍＭ ＮａＮＯ₃、２．０ｍＭ ＭｇＳＯ₄、２．
０ｍＭＣａＣｌ₂、１．０ｍＭ Ｋ₂ＳＯ₄、６５μＭ
ＮａＨ₂ＰＯ₄、３６μＭ ＦｅＳＯ₄、１７μＭ Ｍｎ
ＳＯ₄、３．１μＭ ＺｎＳＯ₄、０．１６μＭ ＣｕＳ
Ｏ₄、４７μＭ Ｈ₃ＢＯ₄、７．５ｎＭ （ＮＨ₄）６Ｍ
ｏ₇Ｏ₂₄で、一週間毎に交換した。水耕液のｐＨは、
０．１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ５．３に調整した。ｐ
Ｈの調整は毎日実施した。ルーピンをリン酸飢餓条件で
生育させた後、根を収穫した。収穫した根は蒸留水で洗
浄後に、表面の水を拭き取り、−８０℃で保存した。

【００３２】（２）ｃＤＮＡライブラリーの構築 全ＲＮＡは保存しておいた根（１４ｇ）からＳＤＳ／フ
ェノール法（PalmiterBiochemistry (1974）13:3606-36
15)で抽出した。さらに、全ＲＮＡからＯｌｉｇｏｔｅ
ｘ−ｄＴ３０（Takara社）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）⁺Ｒ
ＮＡを抽出した。ｃＤＮＡ合成キット（Amersham社）を
用いてｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡから２本鎖のｃＤＮＡを
合成した。２本鎖のｃＤＮＡをブラントエンド化し、さ
らに、ＥｃｏＲＩメチレースでメチル化した後、Ｅｃｏ
ＲＩリンカー（Takara社）をライゲーションした。リン
カーを連結したｃＤＮＡをλｇｔ１０（Stratagene社）
のＥｃｏＲＩサイトに組み込んだ後、Ｇｉｇａｐａｃｋ
II Ｇｏｌｄ（Stratagene社）を用いてパッケージン
グし、さらに、大腸菌ＮＭ５１４株に感染させ、ｃＤＮ
Ａライブラリーを作製した。

【００３３】（３）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ
ング ５．５×１０⁴個の組換えファージをプラークハイブリ
ダイゼ−ションによってスクリーニングした。プローブ
は、実施例２で得たＬＡＰ４９３をＤＩＧラベリングキ
ット（Boehringer Mannheim社）を用いてＤｉｇｏｘｙ
ｇｅｎｅｉｎで標識したものを用いた。６０℃で１５時
間ハイブリダイゼーションを行った後、ＤＩＧディテク
ションキット（Boehringer Mannheim社）を用いて、陽
性プラークを検出した。その結果、５個の陽性クローン
が得られた。

【００３４】（４）インサートのサブクローニングと塩
基配列の決定 陽性クローンに組み込まれたｃＤＮＡ断片はλｇｔ１０
のマルチクロ−ニングサイトを挟んで向かい合うプライ
マー、λｇｔ１０ Ｐｒｉｍｅｒ（ｆｏｒｗａｒｄ）と
λｇｔ１０ Ｐｒｉｍｅｒ（ｒｅｖｅｒｓｅ）（Takara
社）を用い、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲはＧｅｎ
ｅＡｍｐ９６００システム（ABI社）を使用し、２０μ
Ｌの反応量で行った。反応液２０μＬ中には１０ｎｇ
鋳型ＤＮＡ、０．５ｕｎｉｔｓＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔ
ａｑ（Takara社）、４ｎｍｏｌｅ ｄＮＴＰ、１０ｐｍ
ｏｌｅ ｐｒｉｍｅｒが含まれる。反応バッファーはＴ
ａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑに添付のバッファーを用い
た。ＰＣＲの条件は、９５℃１０秒間のディネーチャ
ー、６０℃で３０秒間のアニール、７２℃で２分間の伸
長反応を１サイクルとし、３０サイクル反応させた。増
幅されたＤＮＡ断片はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II Ｓ
Ｋ＋ベクターに（Stratagene社）のＨｉｎｃIIサイトに
サブクローニングした。これらのクローンの中で、最長
のｃＤＮＡを含むクローン‘ＬＡＳＡＰ１’について全
塩基配列を決定した。ＬＡＳＡＰ１からデリーションク
ローンを作製し、各デリーションクローンの塩基配列を
決定した。シークエンス反応ではｄＧＴＰの代わりに、
７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰを用いた。塩基配列の解析は
３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（ABI社）を用いて行
った。決定した各デリーションクローンの塩基配列を整
列させ、最終的に配列番号１で示されるＬＡＳＡＰ１の
全塩基配列を決定した。ＬＡＳＡＰ１は１９１４塩基か
らなるｃＤＮＡを含んでいた。

【００３５】［実施例４］遺伝子ホモログの単離 （１）複数の植物種からの分泌型酸性フォスファターゼ
遺伝子ホモログの単離 イネの葉、ダイズの葉およびトマトの根から実施例３に
記載の方法でｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡを抽出した。抽出
したｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡから一本鎖のｃＤＮＡを合
成し、これをＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲはＰＣ
Ｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＭＰ（ＴＰ３０
０）（Takara社）を使用し、５０μＬの反応量で行っ
た。配列番号２と配列番号３で示される塩基配列を持つ
プライマーを用いて、１００ｎｇの一本鎖ｃＤＮＡを鋳
型として、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Perkin Elmer
Cetus社）によって増幅を行った。ＰＣＲの条件は、９
４℃で３０秒間のディネーチャー、３７℃で１分間のア
ニール、７２℃で２分間の伸長反応を１サイクルとし、
６０サイクル反応させ、引き続き、７２℃で１０分間の
伸長反応を行った。反応後、１μＬの反応液を鋳型とし
て、配列番号４と配列番号５で示される塩基配列のプラ
イマーを用いて、第２回目のＰＣＲを行った。ポリメラ
ーゼは第１回目と同じＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Pe
rkin Elmer Cetus社）を用い、５０μＬの反応量で行っ
た。ＰＣＲの条件は、９４℃で３０秒間のディネーチャ
ー、５０℃で１分間のアニール、７２℃で２分間の伸長
反応を１サイクルとし、６０サイクル反応させ、引き続
き、７２℃で１０分間の伸長反応を行った。反応液を１
％アガロースで分画したところ、何れの植物種からも約
０．３ｋｂのＤＮＡ断片の増幅がみられた。これら増幅
されたＤＮＡ断片を回収し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
II ＳＫ＋（Stratagene社）のＳｍａＩサイトにサブク
ローニングした。サブクローニングされたｃＤＮＡ断片
の塩基配列を３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（ABI
社）を用いて決定した。イネからは配列番号６、ダイズ
からは配列番号７、トマトから配列番号８で示される塩
基配列を持つｃＤＮＡの一部が増幅された。これらの塩
基配列に対応するアミノ酸配列は実施例３で得られたル
ーピンの分泌型酸性フォスファターゼに対応しており、
これらが、それぞれの植物種の持つ分泌型酸性フォスフ
ァターゼの一部であることが確認された。

【００３６】［実施例５］形質転換植物の作製 （１）発現ベクターの構築 実施例３で得られたルーピンの分泌型酸性フォスファタ
ーゼのｃＤＮＡを含むクローン、ＬＡＳＡＰ１、を制限
酵素ＥｃｏＲＩで切断し、ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を
切り出した。このｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
II ＳＫ＋ベクター（Stratagene社）のＥｃｏＲＩサイ
トにサブクローニングした。得られたサブクローンの組
み込み方向を確認し、Ｔ７プロモーター側がｃＤＮＡの
５’側となっているクローンを選択した。選択したクロ
ーンを制限酵素ＳａｃＩとＳｍａＩで切断し、ｃＤＮＡ
を含むＤＮＡ断片を切り出した。一方、ｐＢＩ１２１も
制限酵素ＳａｃＩとＳｍａＩで切断し、ＧＵＳ遺伝子を
含む部分を除去した。このプラスミドと上記のｃＤＮＡ
を含むＤＮＡ断片を連結し、植物形質転換用バイナリー
ベクター‘ｐＢＩ３５ＬＡＳＡＰ１’を構築した。ｐＢ
Ｉ３５ＬＡＳＡＰ１はエレクトロポレーションによっ
て、アグロバクテリウム（ＬＢＡ４４０４）に導入し
た。

【００３７】（２）形質転換タバコの作製 ｐＢＩ３５ＬＡＳＡＰ１を保有するアグロバクテリウム
を用い、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ
Ｘａｎｔｈｉｎ）の葉ディスク法によって行った。切
り取った無菌苗の葉をアグロバクテリウムを増殖させた
プレートにのせ、注射針を用いて、葉を突き刺し、傷つ
ける。３日間共存培養した後、抗生物質として５００μ
ｇ／ｍＬのカルベニシリンと１００μｇ／ｍＬのカナマ
イシンを含み、ＩＡＡ（１×１０^-6Ｍ）とＢＡ（１×１
０^-5Ｍ）を含むＭＳ培地で培養した。この段階で、アグ
ロバクテリウムを除菌するとともにｐＢＩ３５ＬＡＳＡ
Ｐ１が組み込まれた形質転換カルスを形成させた。３〜
４週間後、形成されたカルスから出てきたシュートを切
り取り、５００μｇ／ｍＬのカルベニシリンと１００μ
ｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＭＳ培地に移植した。移
植後１〜２週間後に、発根してきた植物を土に移植し、
形質転換植物を得た。

【００３８】（３）形質転換イネの作製 ｐＢＩ３５ＬＡＳＡＰ１を保有するアグロバクテリウム
は、Hieiら（(1994) Plant Journal 6:271-282））の方
法に従って、イネ胚盤由来カルスに感染させた。アグロ
バクテリウムを除菌後、ｐＢＩ３５ＬＡＳＡＰ１が組み
込まれた形質転換カルスをジェネテシンを用いて選抜し
た。選抜した耐性カルスから植物体を再生させ、形質転
換イネ植物を得た。形質転換イネは閉鎖系のグロースチ
ャンバー内で、温度２４℃、湿度６０％、１４時間日長
（７００μｍｏｌ／ｍ²／ｓｅｃ．）に環境条件を調整
して育成した。

【００３９】［実施例６］ＬＡＳＡＰ２の単離 リン酸飢餓処理したルーピンの根から前述のＳＤＳ／フ
ェノール法にて全ＲＮＡを単離し、１ｕｇを３' ｆｕｌ
ｌ ＲＡＣＥ ｃｏｒｅ ｋｉｔ(TAKARA社) を用いて
３‘にアダプターを結合させた一本鎖ｃＤＮＡを合成し
た。センスプライマーとして配列番号１９の配列を、ま
た３’アダプタープライマーとしてTAKARAのプロトコー
ルに記載のオリゴヌクレオチド（配列表の配列番号２０
の配列を有する）をプライマーとして用い、上記ｃＤＮ
Ａの１／１２量を以下の条件でＰＣＲに供した。ＰＣＲ
の条件は、９４℃で１分間のディネーチャー、６０℃で
３分間のアニール、７２℃で５分間の伸長反応を１サイ
クルとし、６０サイクル反応させ、引き続き、７２℃で
１０分間の伸長反応を行った。得られた反応産物をＢａ
ｍＨＩで切断後ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋に
サブクローニングした。サブクローニングしたｃＤＮＡ
断片の塩基配列を３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（AB
I社）を用いて決定した。その結果を配列表の配列番号
１８に示した。

【００４０】

【発明の効果】本発明により、リン酸飢餓で大量に誘導
され、根の表面で機能している低親和性の分泌型酸性フ
ォスファターゼをコードするｃＤＮＡおよびこれを用い
た発現ベクター、該発現ベクターを組み込んだ形質転換
植物が提供され、さらに、形質転換植物でこの分泌型酸
性フォスファターゼを発現させることで、低リン条件下
でも生育可能な植物を育成する事が出来る。さらに、本
発明によって、リン酸肥料の施用を低減化することが可
能となる。また任意のタンパク質を根特異的に分泌させ
ること、さらに根表面に発現させることができ、このこ
とにより他の性質を付与したり、任意のタンパク質を植
物に大量に生産させることが可能になる。

【００４１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>MITSUI CHEMICALS, INC. <120>SECRETORY ACID PHOSPHATASE <130>31000001 <160>20 <210>1 <211>2187 <212>DNA <213>Lupinus albus L. <220> <221>CDS <222>(1)...(1914) <220> <221>sig_peptide <222>(1)...(93) <400>1 atg ggt tat tat tca att tat tgt ttg ata gtg tta gtg aat gta ttg 48 Met Gly Tyr Tyr Ser Ile Tyr Cys Leu Ile Val Leu Val Asn Val Leu 1 5 10 15 gtg ttt tgc gat gga ggg aag acg agt agt ttt gtt agg gaa tct gag 96 Val Phe Cys Asp Gly Gly Lys Thr Ser Ser Phe Val Arg Glu Ser Glu 20 25 30 aga gct ata gat atg gca ctt gat agc gat gta ttt cat gtc cct cgt 144 Arg Ala Ile Asp Met Ala Leu Asp Ser Asp Val Phe His Val Pro Arg 35 40 45 ggt tac aat gct cct cag cag gtt cat ata aca caa ggt gat ctt gtt 192 Gly Tyr Asn Ala Pro Gln Gln Val His Ile Thr Gln Gly Asp Leu Val 50 55 60 ggg aaa gca gtg att gtg tca tgg gtg aca gtg gat gaa cct ggt tcc 240 Gly Lys Ala Val Ile Val Ser Trp Val Thr Val Asp Glu Pro Gly Ser 65 70 75 80 acc aaa gtg agt tat tgg agt gac aaa cac agt cat gat aag aag tca 288 Thr Lys Val Ser Tyr Trp Ser Asp Lys His Ser His Asp Lys Lys Ser 85 90 95 gct cat ggc aaa att gtt act tat agg ttc ttc aat tac act tct gga 336 Ala His Gly Lys Ile Val Thr Tyr Arg Phe Phe Asn Tyr Thr Ser Gly 100 105 110 ttt att cat cat acc atc aag cat ttg aag tat acc act aaa tat cac 384 Phe Ile His His Thr Ile Lys His Leu Lys Tyr Thr Thr Lys Tyr His 115 120 125 tat gaa gtt ggg tcc tgg aat acc aca cgc cac ttt tgg gtt tac aac 432 Tyr Glu Val Gly Ser Trp Asn Thr Thr Arg His Phe Trp Val Tyr Asn 130 135 140 ttc ccc atc cag ttt ggc ctt gat gtg cct tgc act ttt ggc ctc ata 480 Phe Pro Ile Gln Phe Gly Leu Asp Val Pro Cys Thr Phe Gly Leu Ile 145 150 155 160 ggt gat ctc ggt cag act ttt gat tcc aat caa aca ctt act cac tat 528 Gly Asp Leu Gly Gln Thr Phe Asp Ser Asn Gln Thr Leu Thr His Tyr 165 170 175 caa cat aac cca aga aaa gga cag gcc gtc ctc tat gtt gga gac ctc 576 Gln His Asn Pro Arg Lys Gly Gln Ala Val Leu Tyr Val Gly Asp Leu 180 185 190 tcc tat gcc gat aac tac ccc aat cac gat aat gtt aga tgg gat act 624 Ser Tyr Ala Asp Asn Tyr Pro Asn His Asp Asn Val Arg Trp Asp Thr 195 200 205 tgg gga agg ttc act gaa aga gtt gtt gcg tat caa cct tgg ata tgg 672 Trp Gly Arg Phe Thr Glu Arg Val Val Ala Tyr Gln Pro Trp Ile Trp 210 215 220 act gcc ggg aac cat gaa ctc gat ttt gtt cca gaa att ggt gaa acc 720 Thr Ala Gly Asn His Glu Leu Asp Phe Val Pro Glu Ile Gly Glu Thr 225 230 235 240 aaa cct ttc aag cct ttt aca cac cgt tac cct gtt cct ttt aaa cca 768 Lys Pro Phe Lys Pro Phe Thr His Arg Tyr Pro Val Pro Phe Lys Pro 245 250 255 tca gag agt act gaa ccc ttc tgg tat tct atc aag aga ggc cca gca 816 Ser Glu Ser Thr Glu Pro Phe Trp Tyr Ser Ile Lys Arg Gly Pro Ala 260 265 270 cac gtc att gtc tta gcc tca tac aaa gcc tat gga aaa tat aca cca 864 His Val Ile Val Leu Ala Ser Tyr Lys Ala Tyr Gly Lys Tyr Thr Pro 275 280 285 cag tac caa tgg ctt gaa gcg gag ttg cca aaa cca aaa gtc aac agg 912 Gln Tyr Gln Trp Leu Glu Ala Glu Leu Pro Lys Pro Lys Val Asn Arg 290 295 300 aag gag act cct tgg ttg att gtt ctt gtg cat tca cct tgg tat aac 960 Lys Glu Thr Pro Trp Leu Ile Val Leu Val His Ser Pro Trp Tyr Asn 305 310 315 320 agc tac aac tat cat ttt atg gaa ggg gaa aca atg aga gta atg ttt 1008 Ser Tyr Asn Tyr His Phe Met Glu Gly Glu Thr Met Arg Val Met Phe 325 330 335 gag tcc tgg ctt gtg cag tac aag gtt gat gtt gtc ttt gct ggc cat 1056 Glu Ser Trp Leu Val Gln Tyr Lys Val Asp Val Val Phe Ala Gly His 340 345 350 gtt cat gcc tat gaa cga tct gaa tgc gtg tca aat gtt gaa gta cga 1104 Val His Ala Tyr Glu Arg Ser Glu Cys Val Ser Asn Val Glu Val Arg 355 360 365 cat tgt aaa tgg caa gtg tac ccc tgt aaa gat caa tca gct ccg gta 1152 His Cys Lys Trp Gln Val Tyr Pro Cys Lys Asp Gln Ser Ala Pro Val 370 375 380 tat ata acc att ggg gat gga gga aac att gaa ggc tta gca aac aac 1200 Tyr Ile Thr Ile Gly Asp Gly Gly Asn Ile Glu Gly Leu Ala Asn Asn 385 390 395 400 atg aca gaa cca cag cca aag tac tca gca tat aga gag gca agc ttt 1248 Met Thr Glu Pro Gln Pro Lys Tyr Ser Ala Tyr Arg Glu Ala Ser Phe 405 410 415 gga cat gcc att ttc gac ata aag aat cgg act gtt ctg ggt ttg ttt 1296 Gly His Ala Ile Phe Asp Ile Lys Asn Arg Thr Val Leu Gly Leu Phe 420 425 430 tct gag aat tat cgg tta cac aca aag caa gaa gaa gat gaa aag aat 1344 Ser Glu Asn Tyr Arg Leu His Thr Lys Gln Glu Glu Asp Glu Lys Asn 435 440 445 ttg gcg tca aaa ggt gct atg gtt aaa gga gtt att ctc caa caa gta 1392 Leu Ala Ser Lys Gly Ala Met Val Lys Gly Val Ile Leu Gln Gln Val 450 455 460 gtt cag gct gtg gtc gca acc ctc tta ttt gcg gtg act gga aat gat 1440 Val Gln Ala Val Val Ala Thr Leu Leu Phe Ala Val Thr Gly Asn Asp 465 470 475 480 agc caa gat aca aat cag aat gct tcc ctt ctt gtt tca gct agg caa 1488 Ser Gln Asp Thr Asn Gln Asn Ala Ser Leu Leu Val Ser Ala Arg Gln 485 490 495 ttt gtt att gct atg ctt gta atc gac aca tgg cag tat ttt atg cac 1536 Phe Val Ile Ala Met Leu Val Ile Asp Thr Trp Gln Tyr Phe Met His 500 505 510 aga tac atg cat cac aac aag ttc cta tac aag cat atc cac tct caa 1584 Arg Tyr Met His His Asn Lys Phe Leu Tyr Lys His Ile His Ser Gln 515 520 525 cat cac aga ctc att gtg ccc tat tca ttt gga gct ctc tac aat cac 1632 His His Arg Leu Ile Val Pro Tyr Ser Phe Gly Ala Leu Tyr Asn His 530 535 540 cct ttg gtg gga ctt att ctc gac acc atc ggt ggg gct tta tcg ttc 1680 Pro Leu Val Gly Leu Ile Leu Asp Thr Ile Gly Gly Ala Leu Ser Phe 545 550 555 560 ctc atc tcc ggc atg agt ccc cga atc tcc atc ttc ttc ttc tcc ttt 1728 Leu Ile Ser Gly Met Ser Pro Arg Ile Ser Ile Phe Phe Phe Ser Phe 565 570 575 gcc acc att aaa acc gtc gat gat cac tgt ggt tta tgg ctc cct ggg 1776 Ala Thr Ile Lys Thr Val Asp Asp His Cys Gly Leu Trp Leu Pro Gly 580 585 590 aac ctt ttc cat ata ttt tca aca aca att ctg ctt acc atg atg ttc 1824 Asn Leu Phe His Ile Phe Ser Thr Thr Ile Leu Leu Thr Met Met Phe 595 600 605 act atc agc ttt tcg gca aca agt aca act act cac agc cat tct ttg 1872 Thr Ile Ser Phe Ser Ala Thr Ser Thr Thr Thr His Ser His Ser Leu 610 615 620 tta tgt ggg ata aaa tct tgg gta cct aca tgc ctt aca cac tagagaaga 1923 Leu Cys Gly Ile Lys Ser Trp Val Pro Thr Cys Leu Thr His 625 630 635 aggtgggtgg tggttttgaa actagacctt gtaaagatgc acaaggatga ttaaccattt 1983 tgcttggtgt gcattcctct tgtattagta ttgtgatccc tctatatgag cagaacttac 2043 cggaatgatc atgtttgtat atacacatga atatgatgtg cccttttcta tttttcttta 2103 tctactgtcc atactagata gtatctcaat aaagaaattt gaggagctac ctattaggga 2163 gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2187 <210>2 <211>26 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>i <400>2 ggntataatg cnccncagca gatnca 26 <210>3 <211>29 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>i <400>3 tcgtangcgt gnacgtgncc ngcgaanac 29 <210>4 <211>24 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>4 agatgggata cttggggaag gttc 24 <210>5 <211>24 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>5 cttcaagcca ttggtactgt ggtg 24 <210>6 <211>222 <212>DNA <213>Oryza sativa L. <220> <221>CDS <222>(1)...(222) <400>6 act gag agg agt gtt gct tat caa cca tgg ata tgg act gca gga aac 48 Thr Glu Arg Ser Val Ala Tyr Gln Pro Trp Ile Trp Thr Ala Gly Asn 1 5 10 15 cat gaa att gat ttt gct cca gaa att ggt gaa act gta cct ttc aag 96 His Glu Ile Asp Phe Ala Pro Glu Ile Gly Glu Thr Val Pro Phe Lys 20 25 30 cct tat acc cac cgt tac cat gtt cct tat aaa gca tct caa agt act 144 Pro Tyr Thr His Arg Tyr His Val Pro Tyr Lys Ala Ser Gln Ser Thr 35 40 45 tca ccc ttc tgg tat tct atc aag aga gct tca gca cac atc att gtt 192 Ser Pro Phe Trp Tyr Ser Ile Lys Arg Ala Ser Ala His Ile Ile Val 50 55 60 ttg gcc tca tat tca gcg tat gga aaa tat 222 Leu Ala Ser Tyr Ser Ala Tyr Gly Lys Tyr 65 70 <210>7 <211>222 <212>DNA <213>Glycine max L. <220> <221>CDS <222>(1)...(222) <400>7 gta gag agg aat gtt gcc tac cag cct tgg atc tgg aca gct gga aat 48 Val Glu Arg Asn Val Ala Tyr Gln Pro Trp Ile Trp Thr Ala Gly Asn 1 5 10 15 cat gag ata gat ttt gcc cca gaa ctt ggt gaa acg aag cca ttc aag 96 His Glu Ile Asp Phe Ala Pro Glu Leu Gly Glu Thr Lys Pro Phe Lys 20 25 30 cca tac agc tat agg tac ccc aca cct tat aag gct tcc ggt agc acg 144 Pro Tyr Ser Tyr Arg Tyr Pro Thr Pro Tyr Lys Ala Ser Gly Ser Thr 35 40 45 gca cct ttc tgg tat tct gtc aaa aga gca tct gct tat att att gtc 192 Ala Pro Phe Trp Tyr Ser Val Lys Arg Ala Ser Ala Tyr Ile Ile Val 50 55 60 ttg gca tca tat tca tca tat gga aag tat 222 Leu Ala Ser Tyr Ser Ser Tyr Gly Lys Tyr 65 70 <210>8 <211>222 <212>DNA <213>Lycopersicon esculentum P. <220> <221>CDS <222>(1)...(222) <400>8 gta gag aga agt act gct tat caa cct tgg att tgg aca gca gga aat 48 Val Glu Arg Ser Thr Ala Tyr Gln Pro Trp Ile Trp Thr Ala Gly Asn 1 5 10 15 cat gag tta gat ttt gct cct gaa att ggg gaa aca aaa cca ttt aag 96 His Glu Leu Asp Phe Ala Pro Glu Ile Gly Glu Thr Lys Pro Phe Lys 20 25 30 ccc tac act cat cgg tat cat gtc cca ttc aga gca tca gac agc aca 144 Pro Tyr Thr His Arg Tyr His Val Pro Phe Arg Ala Ser Asp Ser Thr 35 40 45 tct cca ctt tgg tat tca atc aag cga gct tca gcg tat atc ata gtt 192 Ser Pro Leu Trp Tyr Ser Ile Lys Arg Ala Ser Ala Tyr Ile Ile Val 50 55 60 tta tcc tca tat tca gca tat ggc aaa tct 222 Leu Ser Ser Tyr Ser Ala Tyr Gly Lys Thr 65 70 <210>9 <211>27 <212>PRT <213>Lupinus albus L. <400>9 Glu Arg Ala Ile Asp Met Ala Leu Asp Ser Asp Val Phe His Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Tyr Asn Ala Pro Gln Gln Val His Ile 20 25 <210>10 <211>9 <212>PRT <213>Lupinus albus L. <400>10 Lys Pro Phe Thr His Arg Tyr Pro Val 1 5 <210>11 <211>8 <212>PRT <213>Lupinus albus L. <400>11 Trp Leu Glu Ala Glu Leu Pro Lys 1 5 <210>12 <211>9 <212>PRT <213>Lupinus albus L. <400>12 Pro Trp Tyr Asn Ser Tyr Asn Tyr His 1 5 <210>13 <211>17 <212>PRT <213>Lupinus albus L. <400>13 Lys Val Asp Val Val Phe Ala Gly His Val His Ala Tyr Glu Arg Ser 1 5 10 15 Glu <210>14 <211>15 <212>PRT <213>Lupinus albus L. <400>14 Pro Gln Pro Lys Tyr Ser Ala Tyr Arg Glu Ala Ser Phe Gly His 1 5 10 15 <210>15 <211>15 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>i <400>15 ggntataatg cnccncagca gatnca 26 <210>16 <211>29 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>i <400>16 tcgtangcgt gnacgtgncc ngcgaanac 29 <210>17 <211>491 <212>DNA <213>Lupinus albus L. <400>17 tctatgttgg agacctctcc tatgccgata actaccccaa tcacgataat gttagatggg 60 atacttgggg aaggttcact gaaagagttg ttgcgtatca accttggata tggactgccg 120 ggaaccatga actcgatttt gttccagaaa ttggtgaaac caaacctttc aagcctttta 180 cacaccgtta ccctgttcct tttaaaccat cagagagtac tgaacccttc tggtattcta 240 tcaagagagg cccagcacac gtcattgtct tagcctcata caaagcctat ggaaaatata 300 caccacagta ccaatggctt gaagcggagt tgccaaaacc aaaagtcaac aggaaggaga 360 ctccttggtt gattgttctt gtgcattcac cttggtataa cagctacaac tatcatttta 420 tggaagggga aacaatgaga gtaatgtttg agtcctggct tgtgcagtac aaggttgatg 480 ttgtctttgc t 491 <210>18 <211>1541 <212>DNA <213>Lupinus albus L. <220> <221>CDS <222>(11)...(1396) <220> <221>sig_peptide <222>(11)...(112) <400>18 ggatccagaa atg aaa atg ggt tat agt agt ttt gtt gca ata gct ttg 49 Met Lys Met Gly Tyr Ser Ser Phe Val Ala Ile Ala Leu 1 5 10 ttg atg agt gta gtg gtt gtt tgc aat gga ggc aag acc agc act tat 97 Leu Met Ser Val Val Val Val Cys Asn Gly Gly Lys Thr Ser Thr Tyr 15 20 25 gtg agg aat ctt att gag aag cca gtg gat atg cca ctt gat agt gat 145 Val Arg Asn Leu Ile Glu Lys Pro Val Asp Met Pro Leu Asp Ser Asp 30 35 40 45 gcc ttc gct att cct cct ggt tat aat gcc ccc cag cag gtt cat ata 193 Ala Phe Ala Ile Pro Pro Gly Tyr Asn Ala Pro Gln Gln Val His Ile 50 55 60 aca caa ggt gac ctt gtg ggc caa gca atg atc ata tca tgg gtc aca 241 Thr Gln Gly Asp Leu Val Gly Gln Ala Met Ile Ile Ser Trp Val Thr 65 70 75 gtg gat gaa cct ggc tcc aac caa gtc att tat tgg agt gat agt agt 289 Val Asp Glu Pro Gly Ser Asn Gln Val Ile Tyr Trp Ser Asp Ser Ser 80 85 90 ctc caa aat ttc aca gct gaa gga gaa gtt ttt act tac acg tac tac 337 Leu Gln Asn Phe Thr Ala Glu Gly Glu Val Phe Thr Tyr Thr Tyr Tyr 95 100 105 aat tac act tct ggt ttt att cat cac acc acc atc aca aat ttg gag 385 Asn Tyr Thr Ser Gly Phe Ile His His Thr Thr Ile Thr Asn Leu Glu 110 115 120 125 ttt gac act aca tat tac tat gag gtt gga att gga aac acc aca cgg 433 Phe Asp Thr Thr Tyr Tyr Tyr Glu Val Gly Ile Gly Asn Thr Thr Arg 130 135 140 cag ttt tgg ttt ata act cct cct gaa gtt ggt ctt gat gtg cca tac 481 Gln Phe Trp Phe Ile Thr Pro Pro Glu Val Gly Leu Asp Val Pro Tyr 145 150 155 aca ttt ggt atc ata ggg gat ctt ggt cag act ttt gat tca aat acg 529 Thr Phe Gly Ile Ile Gly Asp Leu Gly Gln Thr Phe Asp Ser Asn Thr 160 165 170 acc ctc act cac tat caa aac agt aac gga acg gcc cta ctg tat gtt 577 Thr Leu Thr His Tyr Gln Asn Ser Asn Gly Thr Ala Leu Leu Tyr Val 175 180 185 gga gac ctt tct tat gca gat gac tat cca tat cat gat aat gtt agg 625 Gly Asp Leu Ser Tyr Ala Asp Asp Tyr Pro Tyr His Asp Asn Val Arg 190 195 200 205 tgg gac acc tgg gga agg ttt aca gaa aga agt gct gct tat caa cct 673 Trp Asp Thr Trp Gly Arg Phe Thr Glu Arg Ser Ala Ala Tyr Gln Pro 210 215 220 tgg ata tgg acc gca gga aac cat gaa att gat ttt gat cta caa att 721 Trp Ile Trp Thr Ala Gly Asn His Glu Ile Asp Phe Asp Leu Gln Ile 225 230 235 ggg gaa aca caa cca ttt aag cct ttt tcc act cgt tac cat act cct 769 Gly Glu Thr Gln Pro Phe Lys Pro Phe Ser Thr Arg Tyr His Thr Pro 240 245 250 tat gaa gca tca caa agt act gaa ccg ttc tat tat tca atc aag aga 817 Tyr Glu Ala Ser Gln Ser Thr Glu Pro Phe Tyr Tyr Ser Ile Lys Arg 255 260 265 ggc cca gca cat gtt att gta ttg gca aca tac tca gct ttt gga tat 865 Gly Pro Ala His Val Ile Val Leu Ala Thr Tyr Ser Ala Phe Gly Tyr 270 275 280 285 tct acc ttg caa tac aaa tgg ctt aca gca gaa ttg cca aaa gtt aat 913 Ser Thr Leu Gln Tyr Lys Trp Leu Thr Ala Glu Leu Pro Lys Val Asn 290 295 300 agg tca gag act tcc tgg ttg atc gtt ctc atg cat gca cct tgg tat 961 Arg Ser Glu Thr Ser Trp Leu Ile Val Leu Met His Ala Pro Trp Tyr 305 310 315 aat agc tac aat aat cat tat atg gaa gga gaa cca atg aga gta ata 1009 Asn Ser Tyr Asn Asn His Tyr Met Glu Gly Glu Pro Met Arg Val Ile 320 325 330 tat gag tcc ttg ttt ctg aaa tac aag gtt gat gtt gtg ttc gct ggt 1057 Tyr Glu Ser Leu Phe Leu Lys Tyr Lys Val Asp Val Val Phe Ala Gly 335 340 345 cat gtt cat gca tat gaa cga tct gaa cgc gtc tca aat aac aaa tat 1105 His Val His Ala Tyr Glu Arg Ser Glu Arg Val Ser Asn Asn Lys Tyr 350 355 360 365 aat att aca aat ggt att tgt act cct gtg aaa gat ata aca gct cct 1153 Asn Ile Thr Asn Gly Ile Cys Thr Pro Val Lys Asp Ile Thr Ala Pro 370 375 380 ata tat ata acc aat ggg gat gga gga aac cta gaa ggc tta gca acc 1201 Ile Tyr Ile Thr Asn Gly Asp Gly Gly Asn Leu Glu Gly Leu Ala Thr 385 390 395 atg aaa caa cca caa cct tca tac tca gca tat aga gag gca agc ttt 1249 Met Lys Gln Pro Gln Pro Ser Tyr Ser Ala Tyr Arg Glu Ala Ser Phe 400 405 410 gga cat ggc att ttt gca ata aaa aat cga aca cat gct cac tat agc 1297 Gly His Gly Ile Phe Ala Ile Lys Asn Arg Thr His Ala His Tyr Ser 415 420 425 tgg aac agg aat caa gat gga tat gct gtg gag gct gat aaa ttg tgg 1345 Trp Asn Arg Asn Gln Asp Gly Tyr Ala Val Glu Ala Asp Lys Leu Trp 430 435 440 445 ttg ttc aat aga tac tgg aac cca ctt aat gat tcc aca att cac ata 1393 Leu Phe Asn Arg Tyr Trp Asn Pro Leu Asn Asp Ser Thr Ile His Ile 450 455 460 cct tga taccaagatt tataatggtc tcttgagtga aataaacaaa tatggtttga at 1451 Pro aaattcatga tttggtaatt gaatgtatgt cattaccaat atataacact tattattgca 1511 gttgttttgt ttttctaaaa aaaaaaaaaa 1541 <210>19 <211>27 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>19 ggccttgaga atcaatagga tccagaa 27 <210>20 <211>22 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>20 ctgatctaga ggtaccggat cc 22

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 大崎 満 北海道札幌市北区北９条西９丁目 北海道 大学大学院農学研究科 (72)発明者 信濃 卓郎 北海道札幌市北区北９条西９丁目 北海道 大学大学院農学研究科 (72)発明者 伊藤 浩之 北海道札幌市北区北９条西９丁目 北海道 大学大学院農学研究科 (72)発明者 和崎 淳 北海道札幌市北区北９条西９丁目 北海道 大学大学院農学研究科

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 植物の根の表面に結合し、配列表の配列
   番号１の１番から３１番のアミノ酸配列で規定される分
   泌に関与するシグナル配列を有する分泌型酸性フォスフ
   ァターゼ。
2. 【請求項２】 植物の根の表面に結合し、配列表の配列
   番号１の５０２番から５９１番のアミノ酸配列で規定さ
   れ、タンパク質を根の表面に結合させる機能を有するポ
   リペプチドを有する分泌型酸性フォスファターゼ。
3. 【請求項３】 ルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ
   Ｌ．）由来であることを特徴とする請求項１又は２に
   記載の分泌型酸性フォスファターゼ。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号１に記載の１番から６
   ４８番のアミノ酸配列を有する事を特徴とする請求項３
   に記載の分泌型酸性フォスファターゼ。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号１に記載の１番から３
   １番のアミノ酸配列を有する事を特徴とする分泌に関与
   するシグナル配列。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号１の５０２番から５９
   １番で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであっ
   て、該ポリペプチドを含むタンパク質を根の表面に結合
   させる機能を有するポリペプチド。
7. 【請求項７】 請求項１〜４の何れか一項に記載の分泌
   型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子。
8. 【請求項８】 請求項５に記載のシグナル配列をコード
   するＤＮＡ。
9. 【請求項９】 請求項６に記載のポリペプチドをコード
   するＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 配列表の配列番号１に記載の１番から
    ６４８番のアミノ酸配列で規定される分泌型酸性フォス
    ファターゼをコードするｃＤＮＡ。
11. 【請求項１１】 配列表の配列番号１の１番〜１９１４
    番の塩基配列で規定される請求項１０に記載のｃＤＮ
    Ａ。
12. 【請求項１２】 請求項７に記載の遺伝子を含む発現ベ
    クター。
13. 【請求項１３】 請求項８に記載のＤＮＡを含む発現ベ
    クター。
14. 【請求項１４】 請求項９に記載のＤＮＡを含む発現ベ
    クター。
15. 【請求項１５】 請求項１０又は請求項１１に記載のＤ
    ＮＡを含む発現ベクター。
16. 【請求項１６】 請求項１２〜１５の何れか一項に記載
    の発現ベクターを保持する細胞。
17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の発現ベクターを保
    持する細胞を有する形質転換植物。
18. 【請求項１８】配列表の配列番号１８の１番から３４番
    のアミノ酸配列で規定される分泌に関与するシグナル配
    列を有する分泌型酸性フォスファターゼ。
19. 【請求項１９】 ルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕ
    ｓ Ｌ．）由来であることを特徴とする請求項１８に記
    載の分泌型酸性フォスファターゼ。
20. 【請求項２０】配列表の配列番号１８に記載の１番から
    ４６２番のアミノ酸配列を有する事を特徴とする請求項
    １９に記載の分泌型酸性フォスファターゼ。
21. 【請求項２１】 配列表の配列番号１８に記載の１番か
    ら３４番のアミノ酸配列を有する事を特徴とする分泌に
    関与するシグナル配列。
22. 【請求項２２】 請求項１８〜２０の何れか一項に記載
    の分泌型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子。
23. 【請求項２３】 請求項２１に記載のシグナル配列をコ
    ードするＤＮＡ。
24. 【請求項２４】 配列表の配列番号１８に記載の１番か
    ら４６２番のアミノ酸配列で規定される分泌型酸性フォ
    スファターゼをコードするｃＤＮＡ。
25. 【請求項２５】 配列表の配列番号１８の１番〜１５４
    １番の塩基配列で規定される請求項２４に記載のｃＤＮ
    Ａ。
26. 【請求項２６】 請求項２２に記載の遺伝子を含む発現
    ベクター。
27. 【請求項２７】 請求項２３に記載のＤＮＡを含む発現
    ベクター。
28. 【請求項２８】 請求項２４又は請求項２５に記載のＤ
    ＮＡを含む発現ベクター。
29. 【請求項２９】 請求項２６〜２８の何れか一項に記載
    の発現ベクターを保持する細胞。
30. 【請求項３０】 請求項２９に記載の発現ベクターを保
    持する細胞を有する形質転換植物。
31. 【請求項３１】 請求項５または２１に記載された配列
    を用いて任意のタンパク質を細胞外に分泌させる方法。
32. 【請求項３２】 請求項６の配列に記載された配列を用
    いて任意のタンパク質を根の表面で発現させる方法。