CN112824526A - 一种水稻ACCase突变型蛋白及相应基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻ACCase突变型蛋白及相应基因。所述ACCase突变型基因编码蛋白的氨基酸序列存在如下突变：其对应于野生型水稻ACCase的氨基酸序列的第1792位发生突变。利用CRISPR介导的单碱基编辑途径，使野生型水稻ACCase基因第5374位点核苷酸发生突变，由A变成G，导致其相应编码的氨基酸序列的第1792位点由异亮氨酸变为缬氨酸，从而获得ACCase突变型蛋白。将该ACCase突变型基因导入水稻基因组并使其表达，受体植物可以具有对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂的抗(耐)性。

Description

一种水稻ACCase突变型蛋白及相应基因

技术领域

本发明涉及基因领域，具体涉及一种水稻抗乙酰辅酶A羧化酶类除草剂的ACCase突变型蛋白。

背景技术

粮食短缺是本世纪最严重的全球性问题之一，近年来随着社会经济的快速发展和农业技术的不断提高，粮食短缺的问题得到缓解，但为了满足由于人口迅速增长而不断扩大的粮食需求，急需提高水稻产量和改善稻米品质。随着水稻直播栽培技术在农业生产中的大面积应用，水稻直播生产中农田杂草问题成为影响农作物产量的重要因素。为了防除稻田杂草，不仅投入大量的人力物力和财力，还喷洒了大量除草剂。

由于化学除草剂的广泛使用，杂草抗性发生的速度如此之快、范围如此之广，不但增加了除草成本，也增加了环境压力。

对除草剂的施用效果，人们追求的目标是既高效地除草又确保作物安然无恙。尽管由于作物与杂草的一些生理生态的差异以及某些栽培方式的辅助，除草剂致毒时对作物和杂草有所选择，比如时差选择、位差选择及生理选择等，但作物的生长发育仍然或多或少地要受到一些影响。因此，如果作物本身具备了抗除草剂的特性，就如水稻对敌稗、玉米和高粱对阿特拉津具有不同的生化选择性而最终表现出抗性一样，除草剂的使用自然会更加方便有效。但遗憾的是自然界中能够抗除草剂的作物类型很少，能同时抗多种除草剂的作物就更是少见，对某种高效除草剂的抗性也往往仅限于少数几种作物。因此，如何运用基因工程技术解决上述问题，创造出更多抗除草剂的作物新品种，已成为当前植物基因工程研究的主要目标之一。

而传统的育种方式周期长，可利用的种质资源匮乏。因此，培育更多抗除草剂的水稻十分必要。

发明内容

技术问题：本发明所要解决的技术问题是提供一种水稻ACCase突变型蛋白。本发明利用CRISPR介导的A:T突变成G:C定点替换的腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor,ABE)的单碱基编辑途径产生内源抗除草剂水稻的位点，该基因所编码的蛋白的氨基酸序列对应于野生型水稻ACCase的氨基酸序列的第1792位发生突变。发明人发现，通过在该基因序列的1792位点进行突变，可以赋予植物抗(耐)乙酰辅酶A羧化酶类除草剂抗性。

为此，本发明提供了一种编码水稻ACCase突变型蛋白的核酸或基因。

在一种实施方式中，本发明提供了一种水稻ACCase突变型蛋白，所述ACCase突变型蛋白的氨基酸序列经过定点替换：其由水稻ACCase的氨基酸序列的第1792位发生突变。

优选地，本发明的水稻ACCase的氨基酸序列第1792位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸。

优选地，本发明的水稻ACCase的氨基酸序列第1792位氨基酸突变除了缬氨酸之外的其它氨基酸。

优选地，本发明的ACCase突变型蛋白发生突变的氨基酸位点突变成其他氨基酸的情况也在本发明的保护范围之内，例如：第1792位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸、甘氨酸、精氨酸、丝氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸；

本发明还提供一种水稻ACCase突变型蛋白，包括：(a)其氨基酸序列SEQ ID NO:1，及在(a)中的氨基酸序列经过定点替换具有乙酰辅酶A羧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明还提供一种核酸或基因，其编码所述的蛋白。

本发明所述的核酸或基因，包括：

(i)编码所述的蛋白的核酸或基因；或

(ii)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的核苷酸序列；或

(iii)其核苷酸序列选自序列表中SEQ ID NO:2所示序列。

进一步地，本发明的水稻ACCase突变型基因，所述水稻ACCase基因存在以下一种突变：只在水稻ACCase基因的第5374位核苷酸发生突变。

优选地，本发明的水稻ACCase突变型基因，所述水稻ACCase基因存在以下一种突变：只在水稻ACCase基因的第5374位核苷酸由A突变为G。

本发明的ACCase突变型基因发生突变的核苷酸，在上述位点突变成其他核苷酸的情况也在本发明的保护范围之内，例如：A突变为T、C、G。

本发明还提供一种表达盒、重组载体，其含有所述的核酸或基因。

本发明还提供所述的水稻ACCase突变型蛋白、核酸或基因，表达盒、重组载体在植物抗除草剂方面的应用。

本发明还提供获得具有除草剂抗性的植物的方法，包括如下步骤：

1)使植物包含所述核酸或基因；或

2)使植物表达所述水稻ACCase突变型蛋白。

进一步地，所述获得具有除草剂抗性的植物的方法为利用CRISPR介导的ABE单碱基编辑途径。

本发明还提供了获得具有除草剂抗性的植物的方法。进一步地，本发明提供了用于增强植物、植物组织、植物细胞对于至少一种除草剂的耐受性的方法，所述除草剂干扰ACCase酶的活性。因此，本发明中除草剂抗性指的是抗(耐)乙酰辅酶A羧化酶类除草剂。

本发明所述的增强植物、植物组织或者植物细胞对除草剂的抗性方法可以通过转化或者杂交、自交和无性繁殖的方法实施，也可通过基因定点突变的方式获得，使改变的植株包括本发明的核苷酸序列SEQ ID No:2。

本发明所述的增强植物、植物组织或者植物细胞对除草剂的抗性方法可以通过转化或者杂交、自交和无性繁殖的方法实施，也可通过基因定点突变的方式获得，使改变的植株表达本发明的氨基酸序列SEQ ID No:1。

本发明还提供了获取耐受除草剂的水稻植株的方法，该方法包括将含有抗除草剂突变位点的ACCase基因转入水稻中，该基因序列不同于野生型水稻植物的ACCase基因序列，是ACCase基因含有抗除草剂突变位点的序列。发现携带有ACCase突变位点的转基因水稻可以抗乙酰辅酶A羧化酶类除草剂，而野生型水稻对乙酰辅酶A羧化酶类除草剂表现敏感。本发明还提供了所述核酸或基因及蛋白在植物育种中的应用，用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，还提供了这些蛋白及其编码基因在转基因或者非转基因如水稻等植物中的应用。

附图说明

图1示出在含有潮霉素和9μmol的甲禾灵双重抗性的筛选培养基上的抗性愈伤；

图2示出在含有潮霉素和9μmol的甲禾灵双重抗性的分化培养基上的抗性愈伤长出幼苗；

图3示出在含有潮霉素和9μmol的甲禾灵双重抗性的生根培养基上，非转基因水稻(左)、及含有ACCase突变位点的转基因水稻(右)的生长情况；

图4示出了非转基因水稻(左)和突变型ACCase基因水稻在喷施80mg/ml的甲禾灵除草剂5天后的生长状况；

图5示出了突变型ACCase基因水稻的ACCase突变位点的测图；

具体实施方式

以下参照实施例对本发明进行说明。但本领域技术人员可以理解，以下实施例仅用于说明本发明，而不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

(1)水稻ACCase突变位点获得和植物表达载体的构建

选择水稻ACC基因中的核苷酸序列gagaatatacatggaagtgctgc(下划线部分为所述5’NGG-3’结构的PAM序列)，作为打靶位点。按所选择靶位点合成(华大基因公司)正向寡核苷酸链(ACC-ABE FP)和可与之互补的反向寡核苷酸链(ACC-ABE RP)，

具体序列为：

ACC-ABE FP:ggcagagaatatacatggaagtgc

ACC-ABE RP:aaacgcacttccatgtatattctc

经过退火程序，将ACC-ABE FP和ACC-ABE RP两链退火形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的插入片段。

本实施例中利用CRISPR介导的单碱基编辑系统，采用SpCas9-NG蛋白介导的ABE编辑系统pHUN411NG-ABE进行基因编辑，该系统可使靶位点的A·T变成G·C，下面将对该过程进行展开说明。

用BsaI内切酶(NEB公司)在37℃酶切pHUN411NG-ABE载体2小时，65℃失活酶切体系10分钟，作为构建重组载体的骨架片段。用T4连接酶(NEB公司)将重组载体骨架片段和插入片段相连，转入大肠杆菌中。通过选择具有卡那霉素抗性且不具壮观霉素抗性的菌斑，获得阳性转化子。经测序验证后，提取阳性质粒，构成用于水稻ACC基因CRISPR/Cas9打靶的重组载体质粒，命名为pHUN411NG-ABE-ACC，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，获得含有pHUC411NG-ABE-ACC的农杆菌。

(2)阳性转基因植株获得

成熟水稻种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀种子的沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用上述步骤中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等过程参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol forAgrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerasepositive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。为得到含有除草剂抗性水稻愈伤组织和幼苗，在筛选阶段，使用含有潮霉素和9μmol的甲禾灵双重抗性的培养基，待抗性愈伤组织长出后(图1)，再转入含有潮霉素和9μmol的甲禾灵抗除草剂双重抗性的分化培养基中，使其分化成苗(图2)。经过大量的筛选和分化，最终得到2株含有潮霉素和甲禾灵抗除草剂抗性的水稻植株(图3)。将获得的抗除草剂水稻移栽到土里，待其长到3-4叶幼苗期，喷施80mg/ml的甲禾灵除草剂后，植株仍然正常生长发育，而野生型水稻在喷施80mg/ml的甲禾灵除草剂5天后表现为整株死亡(图4)。

(3)水稻抗乙酰辅酶A羧化酶类除草剂突变体1792突变位点分析从获得的2株抗除草剂水稻突变植株选取叶片并提取基因组DNA，使用一对引物对靶标序列上下游序列进行扩增，FP：ttccgtgttgggtggtctgatg，RP：aactgcatgtgggagctgtaca。扩增产物送Invitrogen公司进行基因组测序。测序结果与野生型日本晴ACCase基因比较，发现在在这2株抗除草剂水稻突变植株中的ACCase基因上发生了1个位点的突变，第5374位点碱基发生突变，由A变成G(图5)，导致其相应编码的氨基酸序列的第1792位点由异亮氨酸变为缬氨酸，即抗除草剂突变体的ACCase基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其编码的ACCase蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

从上面的实验可以证实：利用SpCas9-NG蛋白介导的ABE编辑系统可以对ACCase基因进行基因编辑，使其基因上1792位碱基发生替换，从而改变了ACCase的蛋白序列，赋予了含有ACCase突变蛋白的植株具有除草剂抗性。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

序列表

<110> 安徽省农业科学院水稻研究所

<120> 一种水稻ACCase突变型蛋白及相应基因

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 2327

<212> PRT

<213> 突变蛋白(Man made)

<400> 3

Met Thr Ser Thr His Val Ala Thr Leu Gly Val Gly Ala Gln Ala Pro

1 5 10 15

Pro Arg His Gln Lys Lys Ser Ala Gly Thr Ala Phe Val Ser Ser Gly

20 25 30

Ser Ser Arg Pro Ser Tyr Arg Lys Asn Gly Gln Arg Thr Arg Ser Leu

35 40 45

Arg Glu Glu Ser Asn Gly Gly Val Ser Asp Ser Lys Lys Leu Asn His

50 55 60

Ser Ile Arg Gln Gly Leu Ala Gly Ile Ile Asp Leu Pro Asn Asp Ala

65 70 75 80

Ala Ser Glu Val Asp Ile Ser His Gly Ser Glu Asp Pro Arg Gly Pro

85 90 95

Thr Val Pro Gly Ser Tyr Gln Met Asn Gly Ile Ile Asn Glu Thr His

100 105 110

Asn Gly Arg His Ala Ser Val Ser Lys Val Val Glu Phe Cys Thr Ala

115 120 125

Leu Gly Gly Lys Thr Pro Ile His Ser Val Leu Val Ala Asn Asn Gly

130 135 140

Met Ala Ala Ala Lys Phe Met Arg Ser Val Arg Thr Trp Ala Asn Asp

145 150 155 160

Thr Phe Gly Ser Glu Lys Ala Ile Gln Leu Ile Ala Met Ala Thr Pro

165 170 175

Glu Asp Leu Arg Ile Asn Ala Glu His Ile Arg Ile Ala Asp Gln Phe

180 185 190

Val Glu Val Pro Gly Gly Thr Asn Asn Asn Asn Tyr Ala Asn Val Gln

195 200 205

Leu Ile Val Glu Ile Ala Glu Arg Thr Gly Val Ser Ala Val Trp Pro

210 215 220

Gly Trp Gly His Ala Ser Glu Asn Pro Glu Leu Pro Asp Ala Leu Thr

225 230 235 240

Ala Lys Gly Ile Val Phe Leu Gly Pro Pro Ala Ser Ser Met His Ala

245 250 255

Leu Gly Asp Lys Val Gly Ser Ala Leu Ile Ala Gln Ala Ala Gly Val

260 265 270

Pro Thr Leu Ala Trp Ser Gly Ser His Val Glu Val Pro Leu Glu Cys

275 280 285

Cys Leu Asp Ser Ile Pro Asp Glu Met Tyr Arg Lys Ala Cys Val Thr

290 295 300

Thr Thr Glu Glu Ala Val Ala Ser Cys Gln Val Val Gly Tyr Pro Ala

305 310 315 320

Met Ile Lys Ala Ser Trp Gly Gly Gly Gly Lys Gly Ile Arg Lys Val

325 330 335

His Asn Asp Asp Glu Val Arg Thr Leu Phe Lys Gln Val Gln Gly Glu

340 345 350

Val Pro Gly Ser Pro Ile Phe Ile Met Arg Leu Ala Ala Gln Ser Arg

355 360 365

His Leu Glu Val Gln Leu Leu Cys Asp Gln Tyr Gly Asn Val Ala Ala

370 375 380

Leu His Ser Arg Asp Cys Ser Val Gln Arg Arg His Gln Lys Ile Ile

385 390 395 400

Glu Glu Gly Pro Val Thr Val Ala Pro Arg Glu Thr Val Lys Glu Leu

405 410 415

Glu Gln Ala Ala Arg Arg Leu Ala Lys Ala Val Gly Tyr Val Gly Ala

420 425 430

Ala Thr Val Glu Tyr Leu Tyr Ser Met Glu Thr Gly Glu Tyr Tyr Phe

435 440 445

Leu Glu Leu Asn Pro Arg Leu Gln Val Glu His Pro Val Thr Glu Trp

450 455 460

Ile Ala Glu Val Asn Leu Pro Ala Ala Gln Val Ala Val Gly Met Gly

465 470 475 480

Ile Pro Leu Trp Gln Ile Pro Glu Ile Arg Arg Phe Tyr Gly Met Asn

485 490 495

His Gly Gly Gly Tyr Asp Leu Trp Arg Lys Thr Ala Ala Leu Ala Thr

500 505 510

Pro Phe Asn Phe Asp Glu Val Asp Ser Lys Trp Pro Lys Gly His Cys

515 520 525

Val Ala Val Arg Ile Thr Ser Glu Asp Pro Asp Asp Gly Phe Lys Pro

530 535 540

Thr Gly Gly Lys Val Lys Glu Ile Ser Phe Lys Ser Lys Pro Asn Val

545 550 555 560

Trp Ala Tyr Phe Ser Val Lys Ser Gly Gly Gly Ile His Glu Phe Ala

565 570 575

Asp Ser Gln Phe Gly His Val Phe Ala Tyr Gly Thr Thr Arg Ser Ala

580 585 590

Ala Ile Thr Thr Met Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val Gln Ile Arg Gly

595 600 605

Glu Ile His Ser Asn Val Asp Tyr Thr Val Asp Leu Leu Asn Ala Ser

610 615 620

Asp Phe Arg Glu Asn Lys Ile His Thr Gly Trp Leu Asp Thr Arg Ile

625 630 635 640

Ala Met Arg Val Gln Ala Glu Arg Pro Pro Trp Tyr Ile Ser Val Val

645 650 655

Gly Gly Ala Leu Tyr Lys Thr Val Thr Ala Asn Thr Ala Thr Val Ser

660 665 670

Asp Tyr Val Gly Tyr Leu Thr Lys Gly Gln Ile Pro Pro Lys His Ile

675 680 685

Ser Leu Val Tyr Thr Thr Val Ala Leu Asn Ile Asp Gly Lys Lys Tyr

690 695 700

Thr Ile Asp Thr Val Arg Ser Gly His Gly Ser Tyr Arg Leu Arg Met

705 710 715 720

Asn Gly Ser Thr Val Asp Ala Asn Val Gln Ile Leu Cys Asp Gly Gly

725 730 735

Leu Leu Met Gln Leu Asp Gly Asn Ser His Val Ile Tyr Ala Glu Glu

740 745 750

Glu Ala Ser Gly Thr Arg Leu Leu Ile Asp Gly Lys Thr Cys Met Leu

755 760 765

Gln Asn Asp His Asp Pro Ser Lys Leu Leu Ala Glu Thr Pro Cys Lys

770 775 780

Leu Leu Arg Phe Leu Val Ala Asp Gly Ala His Val Asp Ala Asp Val

785 790 795 800

Pro Tyr Ala Glu Val Glu Val Met Lys Met Cys Met Pro Leu Leu Ser

805 810 815

Pro Ala Ser Gly Val Ile His Val Val Met Ser Glu Gly Gln Ala Met

820 825 830

Gln Ala Gly Asp Leu Ile Ala Arg Leu Asp Leu Asp Asp Pro Ser Ala

835 840 845

Val Lys Arg Ala Glu Pro Phe Glu Asp Thr Phe Pro Gln Met Gly Leu

850 855 860

Pro Ile Ala Ala Ser Gly Gln Val His Lys Leu Cys Ala Ala Ser Leu

865 870 875 880

Asn Ala Cys Arg Met Ile Leu Ala Gly Tyr Glu His Asp Ile Asp Lys

885 890 895

Val Val Pro Glu Leu Val Tyr Cys Leu Asp Thr Pro Glu Leu Pro Phe

900 905 910

Leu Gln Trp Glu Glu Leu Met Ser Val Leu Ala Thr Arg Leu Pro Arg

915 920 925

Asn Leu Lys Ser Glu Leu Glu Gly Lys Tyr Glu Glu Tyr Lys Val Lys

930 935 940

Phe Asp Ser Gly Ile Ile Asn Asp Phe Pro Ala Asn Met Leu Arg Val

945 950 955 960

Ile Ile Glu Glu Asn Leu Ala Cys Gly Ser Glu Lys Glu Lys Ala Thr

965 970 975

Asn Glu Arg Leu Val Glu Pro Leu Met Ser Leu Leu Lys Ser Tyr Glu

980 985 990

Gly Gly Arg Glu Ser His Ala His Phe Val Val Lys Ser Leu Phe Glu

995 1000 1005

Glu Tyr Leu Tyr Val Glu Glu Leu Phe Ser Asp Gly Ile Gln Ser Asp

1010 1015 1020

Val Ile Glu Arg Leu Arg Leu Gln His Ser Lys Asp Leu Gln Lys Val

1025 1030 1035 1040

Val Asp Ile Val Leu Ser His Gln Ser Val Arg Asn Lys Thr Lys Leu

1045 1050 1055

Ile Leu Lys Leu Met Glu Ser Leu Val Tyr Pro Asn Pro Ala Ala Tyr

1060 1065 1070

Arg Asp Gln Leu Ile Arg Phe Ser Ser Leu Asn His Lys Ala Tyr Tyr

1075 1080 1085

Lys Leu Ala Leu Lys Ala Ser Glu Leu Leu Glu Gln Thr Lys Leu Ser

1090 1095 1100

Glu Leu Arg Ala Arg Ile Ala Arg Ser Leu Ser Glu Leu Glu Met Phe

1105 1110 1115 1120

Thr Glu Glu Ser Lys Gly Leu Ser Met His Lys Arg Glu Ile Ala Ile

1125 1130 1135

Lys Glu Ser Met Glu Asp Leu Val Thr Ala Pro Leu Pro Val Glu Asp

1140 1145 1150

Ala Leu Ile Ser Leu Phe Asp Cys Ser Asp Thr Thr Val Gln Gln Arg

1155 1160 1165

Val Ile Glu Thr Tyr Ile Ala Arg Leu Tyr Gln Pro His Leu Val Lys

1170 1175 1180

Asp Ser Ile Lys Met Lys Trp Ile Glu Ser Gly Val Ile Ala Leu Trp

1185 1190 1195 1200

Glu Phe Pro Glu Gly His Phe Asp Ala Arg Asn Gly Gly Ala Val Leu

1205 1210 1215

Gly Asp Lys Arg Trp Gly Ala Met Val Ile Val Lys Ser Leu Glu Ser

1220 1225 1230

Leu Ser Met Ala Ile Arg Phe Ala Leu Lys Glu Thr Ser His Tyr Thr

1235 1240 1245

Ser Ser Glu Gly Asn Met Met His Ile Ala Leu Leu Gly Ala Asp Asn

1250 1255 1260

Lys Met His Ile Ile Gln Glu Ser Gly Asp Asp Ala Asp Arg Ile Ala

1265 1270 1275 1280

Lys Leu Pro Leu Ile Leu Lys Asp Asn Val Thr Asp Leu His Ala Ser

1285 1290 1295

Gly Val Lys Thr Ile Ser Phe Ile Val Gln Arg Asp Glu Ala Arg Met

1300 1305 1310

Thr Met Arg Arg Thr Phe Leu Trp Ser Asp Glu Lys Leu Ser Tyr Glu

1315 1320 1325

Glu Glu Pro Ile Leu Arg His Val Glu Pro Pro Leu Ser Ala Leu Leu

1330 1335 1340

Glu Leu Asp Lys Leu Lys Val Lys Gly Tyr Asn Glu Met Lys Tyr Thr

1345 1350 1355 1360

Pro Ser Arg Asp Arg Gln Trp His Ile Tyr Thr Leu Arg Asn Thr Glu

1365 1370 1375

Asn Pro Lys Met Leu His Arg Val Phe Phe Arg Thr Leu Val Arg Gln

1380 1385 1390

Pro Ser Val Ser Asn Lys Phe Ser Ser Gly Gln Ile Gly Asp Met Glu

1395 1400 1405

Val Gly Ser Ala Glu Glu Pro Leu Ser Phe Thr Ser Thr Ser Ile Leu

1410 1415 1420

Arg Ser Leu Met Thr Ala Ile Glu Glu Leu Glu Leu His Ala Ile Arg

1425 1430 1435 1440

Thr Gly His Ser His Met Tyr Leu His Val Leu Lys Glu Gln Lys Leu

1445 1450 1455

Leu Asp Leu Val Pro Val Ser Gly Asn Thr Val Leu Asp Val Gly Gln

1460 1465 1470

Asp Glu Ala Thr Ala Tyr Ser Leu Leu Lys Glu Met Ala Met Lys Ile

1475 1480 1485

His Glu Leu Val Gly Ala Arg Met His His Leu Ser Val Cys Gln Trp

1490 1495 1500

Glu Val Lys Leu Lys Leu Asp Cys Asp Gly Pro Ala Ser Gly Thr Trp

1505 1510 1515 1520

Arg Ile Val Thr Thr Asn Val Thr Ser His Thr Cys Thr Val Asp Ile

1525 1530 1535

Tyr Arg Glu Met Glu Asp Lys Glu Ser Arg Lys Leu Val Tyr His Pro

1540 1545 1550

Ala Thr Pro Ala Ala Gly Pro Leu His Gly Val Ala Leu Asn Asn Pro

1555 1560 1565

Tyr Gln Pro Leu Ser Val Ile Asp Leu Lys Arg Cys Ser Ala Arg Asn

1570 1575 1580

Asn Arg Thr Thr Tyr Cys Tyr Asp Phe Pro Leu Ala Phe Glu Thr Ala

1585 1590 1595 1600

Val Arg Lys Ser Trp Ser Ser Ser Thr Ser Gly Ala Ser Lys Gly Val

1605 1610 1615

Glu Asn Ala Gln Cys Tyr Val Lys Ala Thr Glu Leu Val Phe Ala Asp

1620 1625 1630

Lys His Gly Ser Trp Gly Thr Pro Leu Val Gln Met Asp Arg Pro Ala

1635 1640 1645

Gly Leu Asn Asp Ile Gly Met Val Ala Trp Thr Leu Lys Met Ser Thr

1650 1655 1660

Pro Glu Phe Pro Ser Gly Arg Glu Ile Ile Val Val Ala Asn Asp Ile

1665 1670 1675 1680

Thr Phe Arg Ala Gly Ser Phe Gly Pro Arg Glu Asp Ala Phe Phe Glu

1685 1690 1695

Ala Val Thr Asn Leu Ala Cys Glu Lys Lys Leu Pro Leu Ile Tyr Leu

1700 1705 1710

Ala Ala Asn Ser Gly Ala Arg Ile Gly Ile Ala Asp Glu Val Lys Ser

1715 1720 1725

Cys Phe Arg Val Gly Trp Ser Asp Asp Gly Ser Pro Glu Arg Gly Phe

1730 1735 1740

Gln Tyr Ile Tyr Leu Ser Glu Glu Asp Tyr Ala Arg Ile Gly Thr Ser

1745 1750 1755 1760

Val Ile Ala His Lys Met Gln Leu Asp Ser Gly Glu Ile Arg Trp Val

1765 1770 1775

Ile Asp Ser Val Val Gly Lys Glu Asp Gly Leu Gly Val Glu Asn Val

1780 1785 1790

His Gly Ser Ala Ala Ile Ala Ser Ala Tyr Ser Arg Ala Tyr Lys Glu

1795 1800 1805

Thr Phe Thr Leu Thr Phe Val Thr Gly Arg Thr Val Gly Ile Gly Ala

1810 1815 1820

Tyr Leu Ala Arg Leu Gly Ile Arg Cys Ile Gln Arg Leu Asp Gln Pro

1825 1830 1835 1840

Ile Ile Leu Thr Gly Tyr Ser Ala Leu Asn Lys Leu Leu Gly Arg Glu

1845 1850 1855

Val Tyr Ser Ser His Met Gln Leu Gly Gly Pro Lys Ile Met Ala Thr

1860 1865 1870

Asn Gly Val Val His Leu Thr Val Ser Asp Asp Leu Glu Gly Val Ser

1875 1880 1885

Asn Ile Leu Arg Trp Leu Ser Tyr Val Pro Ala Tyr Ile Gly Gly Pro

1890 1895 1900

Leu Pro Val Thr Thr Pro Leu Asp Pro Pro Asp Arg Pro Val Ala Tyr

1905 1910 1915 1920

Ile Pro Glu Asn Ser Cys Asp Pro Arg Ala Ala Ile Arg Gly Val Asp

1925 1930 1935

Asp Ser Gln Gly Lys Trp Leu Gly Gly Met Phe Asp Lys Asp Ser Phe

1940 1945 1950

Val Glu Thr Phe Glu Gly Trp Ala Lys Thr Val Val Thr Gly Arg Ala

1955 1960 1965

Lys Leu Gly Gly Ile Pro Val Gly Val Ile Ala Val Glu Thr Gln Thr

1970 1975 1980

Met Met Gln Thr Ile Pro Ala Asp Pro Gly Gln Leu Asp Ser Arg Glu

1985 1990 1995 2000

Gln Ser Val Pro Arg Ala Gly Gln Val Trp Phe Pro Asp Ser Ala Thr

2005 2010 2015

Lys Thr Ala Gln Ala Leu Leu Asp Phe Asn Arg Glu Gly Leu Pro Leu

2020 2025 2030

Phe Ile Leu Ala Asn Trp Arg Gly Phe Ser Gly Gly Gln Arg Asp Leu

2035 2040 2045

Phe Glu Gly Ile Leu Gln Ala Gly Ser Thr Ile Val Glu Asn Leu Arg

2050 2055 2060

Thr Tyr Asn Gln Pro Ala Phe Val Tyr Ile Pro Met Ala Ala Glu Leu

2065 2070 2075 2080

Arg Gly Gly Ala Trp Val Val Val Asp Ser Lys Ile Asn Pro Asp Arg

2085 2090 2095

Ile Glu Cys Tyr Ala Glu Arg Thr Ala Lys Gly Asn Val Leu Glu Pro

2100 2105 2110

Gln Gly Leu Ile Glu Ile Lys Phe Arg Ser Glu Glu Leu Gln Asp Cys

2115 2120 2125

Met Ser Arg Leu Asp Pro Thr Leu Ile Asp Leu Lys Ala Lys Leu Glu

2130 2135 2140

Val Ala Asn Lys Asn Gly Ser Ala Asp Thr Lys Ser Leu Gln Glu Asn

2145 2150 2155 2160

Ile Glu Ala Arg Thr Lys Gln Leu Met Pro Leu Tyr Thr Gln Ile Ala

2165 2170 2175

Ile Arg Phe Ala Glu Leu His Asp Thr Ser Leu Arg Met Ala Ala Lys

2180 2185 2190

Gly Val Ile Lys Lys Val Val Asp Trp Glu Glu Ser Arg Ser Phe Phe

2195 2200 2205

Tyr Lys Arg Leu Arg Arg Arg Ile Ser Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu

2210 2215 2220

Ile Arg Ala Val Ala Gly Glu Gln Phe Ser His Gln Pro Ala Ile Glu

2225 2230 2235 2240

Leu Ile Lys Lys Trp Tyr Ser Ala Ser His Ala Ala Glu Trp Asp Asp

2245 2250 2255

Asp Asp Ala Phe Val Ala Trp Met Asp Asn Pro Glu Asn Tyr Lys Asp

2260 2265 2270

Tyr Ile Gln Tyr Leu Lys Ala Gln Arg Val Ser Gln Ser Leu Ser Ser

2275 2280 2285

Leu Ser Asp Ser Ser Ser Asp Leu Gln Ala Leu Pro Gln Gly Leu Ser

2290 2295 2300

Met Leu Leu Asp Lys Met Asp Pro Ser Arg Arg Ala Gln Leu Val Glu

2305 2310 2315 2320

Glu Ile Arg Lys Val Leu Gly

2325

<210> 2

<211> 6984

<212> DNA

<213> 基因(Man made)

<400> 2

atgacatcca cacatgtggc gacattggga gttggtgccc aggcacctcc tcgtcaccag 60

aaaaagtcag ctggcactgc atttgtatca tctgggtcat caagaccctc ataccgaaag 120

aatggtcagc gtactcggtc acttagggaa gaaagcaatg gaggagtgtc tgattccaaa 180

aagcttaacc actctattcg ccaaggtctt gctggcatca ttgacctccc aaatgacgca 240

gcttcagaag ttgatatttc acatggttcc gaagatccca gggggcctac ggtcccaggt 300

tcctaccaaa tgaatgggat tatcaatgaa acacataatg ggaggcatgc ttcagtctcc 360

aaggttgttg agttttgtac ggcacttggt ggcaaaacac caattcacag tgtattagtg 420

gccaacaatg gaatggcagc agctaagttc atgcggagtg tccgaacatg ggctaatgat 480

acttttggat cagagaaggc aattcagctg atagctatgg caactccgga ggatctgagg 540

ataaatgcag agcacatcag aattgccgat caatttgtag aggtacctgg tggaacaaac 600

aacaacaact atgcaaatgt ccaactcata gtggagatag cagagagaac aggtgtttct 660

gctgtttggc ctggttgggg tcatgcatct gagaatcctg aacttccaga tgcgctgact 720

gcaaaaggaa ttgtttttct tgggccacca gcatcatcaa tgcatgcatt aggagacaag 780

gttggctcag ctctcattgc tcaagcagct ggagttccaa cacttgcttg gagtggatca 840

catgtggaag ttcctctgga gtgttgcttg gactcaatac ctgatgagat gtatagaaaa 900

gcttgtgtta ctaccacaga ggaagcagtt gcaagttgtc aggtggttgg ttatcctgcc 960

atgattaagg catcttgggg tggtggtggt aaaggaataa ggaaggttca taatgatgat 1020

gaggttagga cattatttaa gcaagttcaa ggcgaagtac ctggttcccc aatatttatc 1080

atgaggctag ctgctcagag tcgacatctt gaagttcagt tgctttgtga tcaatatggc 1140

aacgtagcag cacttcacag tcgagattgc agtgtacaac ggcgacacca aaagataatc 1200

gaggaaggac cagttactgt tgctcctcgt gagactgtga aagagcttga gcaggcagca 1260

cggaggcttg ctaaagctgt gggttatgtt ggtgctgcta ctgttgaata cctttacagc 1320

atggaaactg gtgaatatta ttttctggaa cttaatccac ggctacaggt tgagcatcct 1380

gtcactgagt ggatagctga agtaaatttg cctgcggctc aagttgctgt tggaatgggt 1440

ataccccttt ggcagattcc agagatcagg cgcttctacg gaatgaacca tggaggaggc 1500

tatgaccttt ggaggaaaac agcagctcta gcgactccat ttaactttga tgaagtagat 1560

tctaaatggc caaaaggcca ctgcgtagct gttagaataa ctagcgagga tccagatgat 1620

gggtttaagc ctactggtgg aaaagtaaag gagataagtt tcaagagtaa accaaatgtt 1680

tgggcctatt tctcagtaaa gtctggtgga ggcatccatg aattcgctga ttctcagttc 1740

ggacatgttt ttgcgtatgg aactactaga tcggcagcaa taactaccat ggctcttgca 1800

ctaaaagagg ttcaaattcg tggagaaatt cattcaaacg tagactacac agttgaccta 1860

ttaaatgcct cagattttag agaaaataag attcatactg gttggctgga taccaggata 1920

gccatgcgtg ttcaagctga gaggcctcca tggtatattt cagtcgttgg aggggcttta 1980

tataaaacag taactgccaa cacggccact gtttctgatt atgttggtta tcttaccaag 2040

ggccagattc caccaaagca tatatccctt gtctatacga ctgttgcttt gaatatagat 2100

gggaaaaaat atacaatcga tactgtgagg agtggacatg gtagctacag attgcgaatg 2160

aatggatcaa cggttgacgc aaatgtacaa atattatgtg atggtgggct tttaatgcag 2220

ctggatggaa acagccatgt aatttatgct gaagaagagg ccagtggtac acgacttctt 2280

attgatggaa agacatgcat gttacagaat gaccatgacc catcaaagtt attagctgag 2340

acaccatgca aacttcttcg tttcttggtt gctgatggtg ctcatgttga tgctgatgta 2400

ccatatgcgg aagttgaggt tatgaagatg tgcatgcccc tcttatcacc cgcttctggt 2460

gtcatacatg ttgtaatgtc tgagggccaa gcaatgcagg ctggtgatct tatagctagg 2520

ctggatcttg atgacccttc tgctgttaag agagctgagc cgttcgaaga tacttttcca 2580

caaatgggtc tccctattgc tgcttctggc caagttcaca aattatgtgc tgcaagtctg 2640

aatgcttgtc gaatgatcct tgcggggtat gagcatgata ttgacaaggt tgtgccagag 2700

ttggtatact gcctagacac tccggagctt cctttcctgc agtgggagga gcttatgtct 2760

gttttagcaa ctagacttcc aagaaatctt aaaagtgagt tggagggcaa atatgaggaa 2820

tacaaagtaa aatttgactc tgggataatc aatgatttcc ctgccaatat gctacgagtg 2880

ataattgagg aaaatcttgc atgtggttct gagaaggaga aggctacaaa tgagaggctt 2940

gttgagcctc ttatgagcct actgaagtca tatgagggtg ggagagaaag tcatgctcac 3000

tttgttgtca agtccctttt tgaggagtat ctctatgttg aagaattgtt cagtgatgga 3060

attcagtctg atgtgattga gcgtctgcgc cttcaacata gtaaagacct acagaaggtc 3120

gtagacattg tgttgtccca ccagagtgtt agaaataaaa ctaagctgat actaaaactc 3180

atggagagtc tggtctatcc aaatcctgct gcctacaggg atcaattgat tcgcttttct 3240

tcccttaatc acaaagcgta ttacaagttg gcacttaaag ctagtgaact tcttgaacaa 3300

acaaaactta gtgagctccg tgcaagaata gcaaggagcc tttcagagct ggagatgttt 3360

actgaggaaa gcaagggtct ctccatgcat aagcgagaaa ttgccattaa ggagagcatg 3420

gaagatttag tcactgctcc actgccagtt gaagatgcgc tcatttcttt atttgattgt 3480

agtgatacaa ctgttcaaca gagagtgatt gagacttata tagctcgatt ataccagcct 3540

catcttgtaa aggacagtat caaaatgaaa tggatagaat cgggtgttat tgctttatgg 3600

gaatttcctg aagggcattt tgatgcaaga aatggaggag cggttcttgg tgacaaaaga 3660

tggggtgcca tggtcattgt caagtctctt gaatcacttt caatggccat tagatttgca 3720

ctaaaggaga catcacacta cactagctct gagggcaata tgatgcatat tgctttgttg 3780

ggtgctgata ataagatgca tataattcaa gaaagtggtg atgatgctga cagaatagcc 3840

aaacttccct tgatactaaa ggataatgta accgatctgc atgcctctgg tgtgaaaaca 3900

ataagtttca ttgttcaaag agatgaagca cggatgacaa tgcgtcgtac cttcctttgg 3960

tctgatgaaa agctttctta tgaggaagag ccaattctcc ggcatgtgga acctcctctt 4020

tctgcacttc ttgagttgga caagttgaaa gtgaaaggat acaatgaaat gaagtatacc 4080

ccatcacggg atcgtcaatg gcatatctac acacttagaa atactgaaaa ccccaaaatg 4140

ttgcaccggg tatttttccg aacccttgtc aggcaaccca gtgtatccaa caagttttct 4200

tcgggccaga ttggtgacat ggaagttggg agtgctgaag aacctctgtc atttacatca 4260

accagcatat taagatcttt gatgactgct atagaggaat tggagcttca cgcaattaga 4320

actggccatt cacacatgta tttgcatgta ttgaaagaac aaaagcttct tgatcttgtt 4380

ccagtttcag ggaatacagt tttggatgtt ggtcaagatg aagctactgc atattcactt 4440

ttaaaagaaa tggctatgaa gatacatgaa cttgttggtg caagaatgca ccatctttct 4500

gtatgccaat gggaagtgaa acttaagttg gactgcgatg gtcctgccag tggtacctgg 4560

aggattgtaa caaccaatgt tactagtcac acttgcactg tggatatcta ccgtgagatg 4620

gaagataaag aatcacggaa gttagtatac catcccgcca ctccggcggc tggtcctctg 4680

catggtgtgg cactgaataa tccatatcag cctttgagtg tcattgatct caaacgctgt 4740

tctgctagga ataatagaac tacatactgc tatgattttc cactggcatt tgaaactgca 4800

gtgaggaagt catggtcctc tagtacctct ggtgcttcta aaggtgttga aaatgcccaa 4860

tgttatgtta aagctacaga gttggtattt gcggacaaac atgggtcatg gggcactcct 4920

ttagttcaaa tggaccggcc tgctgggctc aatgacattg gtatggtagc ttggaccttg 4980

aagatgtcca ctcctgaatt tcctagtggt agggagatta ttgttgttgc aaatgatatt 5040

acgttcagag ctggatcatt tggcccaagg gaagatgcat tttttgaagc tgttaccaac 5100

ctagcctgtg agaagaaact tcctcttatt tatttggcag caaattctgg tgctcgaatt 5160

ggcatagcag atgaagtgaa atcttgcttc cgtgttgggt ggtctgatga tggcagccct 5220

gaacgtgggt ttcagtacat ttatctaagc gaagaagact atgctcgtat tggcacttct 5280

gtcatagcac ataagatgca gctagacagt ggtgaaatta ggtgggttat tgattctgtt 5340

gtgggcaagg aagatggact tggtgtggag aatgtacatg gaagtgctgc tattgccagt 5400

gcttattcta gggcatataa ggagacattt acacttacat ttgtgactgg aagaactgtt 5460

ggaataggag cttatcttgc tcgacttggc atccggtgca tacagcgtct tgaccagcct 5520

attattctta caggctattc tgcactgaac aagcttcttg ggcgggaagt gtacagctcc 5580

cacatgcagt tgggtggtcc caaaatcatg gcaactaatg gtgttgtcca tcttactgtt 5640

tcagatgacc ttgaaggcgt ttctaatata ttgaggtggc tcagttatgt tcctgcctac 5700

attggtggac cacttccagt aacaacaccg ttggacccac cggacagacc tgttgcatac 5760

attcctgaga actcgtgtga tcctcgagcg gctatccgtg gtgttgatga cagccaaggg 5820

aaatggttag gtggtatgtt tgataaagac agctttgtgg aaacatttga aggttgggct 5880

aagacagtgg ttactggcag agcaaagctt ggtggaattc cagtgggtgt gatagctgtg 5940

gagactcaga ccatgatgca aactatccct gctgaccctg gtcagcttga ttcccgtgag 6000

caatctgttc ctcgtgctgg acaagtgtgg tttccagatt ctgcaaccaa gactgcgcag 6060

gcattgctgg acttcaaccg tgaaggatta cctctgttca tcctcgctaa ctggagaggc 6120

ttctctggtg gacaaagaga tctttttgaa ggaattcttc aggctggctc gactattgtt 6180

gagaacctta ggacatacaa tcagcctgcc tttgtctaca ttcccatggc tgcagagcta 6240

cgaggagggg cttgggttgt ggttgatagc aagataaacc cagaccgcat tgagtgctat 6300

gctgagagga ctgcaaaagg caatgttctg gaaccgcaag ggttaattga gatcaagttc 6360

aggtcagagg aactccagga ttgcatgagt cggcttgacc caacattaat tgatctgaaa 6420

gcaaaactcg aagtagcaaa taaaaatgga agtgctgaca caaaatcgct tcaagaaaat 6480

atagaagctc gaacaaaaca gttgatgcct ctatatactc agattgcgat acggtttgct 6540

gaattgcatg atacatccct cagaatggct gcgaaaggtg tgattaagaa agttgtggac 6600

tgggaagaat cacgatcttt cttctataag agattacgga ggaggatctc tgaggatgtt 6660

cttgcaaaag aaattagagc tgtagcaggt gagcagtttt cccaccaacc agcaatcgag 6720

ctgatcaaga aatggtattc agcttcacat gcagctgaat gggatgatga cgatgctttt 6780

gttgcttgga tggataaccc tgaaaactac aaggattata ttcaatatct taaggctcaa 6840

agagtatccc aatccctctc aagtctttca gattccagct cagatttgca agccctgcca 6900

cagggtcttt ccatgttact agataagatg gatccctcta gaagagctca acttgttgaa 6960

gaaatcagga aggtccttgg ttga 6984

Claims (7)

1.一种水稻ACCase突变型蛋白，其特征在于，所述ACCase突变型蛋白的氨基酸序列由野生型水稻ACCase的氨基酸序列在第1792位发生突变而获得。

2.根据权利要求1所述的ACCase突变型蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的ACCase突变型蛋白，其特征在于，其氨基酸序列经过定点替换，具有乙酰辅酶A羧化酶活性。

4.一种ACCase突变型基因，其特征在于，

(i)其编码根据权利要求1～3中任一项所述的蛋白；或

(ii)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的核苷酸序列；或

(iii)其核苷酸序列选自序列表中SEQ ID NO.2所示序列。

5.一种权利要求4所述的ACCase突变型基因的获取方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

1)构建含有ACCase突变靶位点的CRISPR介导的单碱基编辑表达载体和表达盒；

2)将上述表达载体通过遗传转化水稻，使植物获得包含根据权利要求4所述的ACCase突变型基因；

3)使植物表达根据权利要求1或2所述的水稻ACCase突变型蛋白。

6.一种含有根据权利要求4所述ACCase突变型基因的重组载体和表达盒。

7.一种权利要求4所述的ACCase突变型基因的应用，其特征在于，所述应用包括将所述ACCase突变型基因通过转基因、杂交或回交导入受体水稻细胞，从而使水稻具有抗乙酰辅酶A羧化酶类除草剂性状。

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