CN114349830A

CN114349830A - 一种PhlH蛋白突变体及其在提高2,4-二乙酰基间苯三酚产量中的应用

Info

Publication number: CN114349830A
Application number: CN202111541422.6A
Authority: CN
Inventors: 张楠楠; 汪军; 朱先峰; 李�杰; 葛宏华; 何永兴; 张萍萍
Original assignee: Anhui University
Current assignee: Anhui University
Priority date: 2021-12-16
Filing date: 2021-12-16
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2041-12-16
Also published as: CN114349830B

Abstract

本发明公开了一种PhlH蛋白突变体及其在提高2,4‑二乙酰基间苯三酚产量中的应用，涉及基因工程技术领域，所述突变体为PhlH蛋白序列的第124位氨基酸由精氨酸突变为丙氨酸制备获得。本发明通过与2,4‑DAPG识别和结合的PhlH蛋白氨基酸残基产生R124A定点突变，以减弱PhlH蛋白对2,4‑DAPG生物合成的负反馈调节，获得2,4‑DAPG产量的提升。

Description

一种PhlH蛋白突变体及其在提高2,4-二乙酰基间苯三酚产量中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种PhlH蛋白突变体及其在提高2,4-二乙酰基间苯三酚产量中的应用。

背景技术

2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol,2,4-DAPG)是荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescen)产生的次级代谢产物，具有抗真菌、抗细菌等作用，对多种土传病原菌引起的植物根部的病害还有植物苗期的病害都能防治，是一种新型的抗生素。

2,4-DAPG是间苯三酚的衍生物，其在植物根系的生物防治活动中起着决定性的作用；2,4-DAPG可以激活根瘤菌属关键基因的表达促进根瘤的产生，也可以抑制芽孢杆菌的细胞分化和生物膜的形成，以此来发挥生物防治作用，其作为一种广谱抗生素在生物防治领域具备广泛的应用前景。

2,4-DAPG虽然可以作为拮抗其他微生物生长的“武器”，但也对菌株自身的基础代谢造成严重的负担，因此2,4-DAPG的生物合成必须通过严格的生物调控将荧光假单胞菌体内的2,4-DAPG水平维持在稳定的动态变化。位于2,4-DAPG生物合成基因簇phl上的TetR家族转录因子PhlH调节整个基因簇的转录，在2,4-DAPG的生物合成中起着非常重要的调节作用。PhlH可以调节2,4-DAPG的水平，实时监测2,4-DAPG的产生，调节2,4-DAPG带来的负担。基于上述内容，我们前期解析了PhlH的结构，对2,4-DAPG与PhlH识别和结合关键的氨基酸残基进行突变，从而筛选出高产2,4-DAPG的菌株，因此，提出一种PhlH蛋白突变体及其在制备2,4-DAPG中的应用。

发明内容

本发明的目的在于，针对phlH的负反馈调节导致2,4-DAPG产量低的问题，提供一种PhlH蛋白突变体及其在提高2,4-DAPG产量中的应用。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明提供了一种可提升2,4-DAPG产量的PhlH蛋白突变体，所述突变体为PhlH蛋白序列的第124位氨基酸由精氨酸突变为丙氨酸制备获得，所述PhlH蛋白来源于荧光假单胞菌P.fluorescen 2P24，所述PhlH蛋白突变体记为PhlH/R124A。

进一步改进在于，所述PhlH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因phlh的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述突变体PhlH/R124A的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

本发明还提供了一种phlh/R124A2基因，所述phlh/R124A2基因用于编码上述PhlH蛋白突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒含有上述phlh/R124A2基因。

进一步改进在于，所述重组质粒为pBBR5pemIK质粒。

本发明还提供了一种高产2,4-DAPG的遗传工程菌，所述遗传工程菌包含上述重组质粒或基因组中整合有上述phlh/R124A2基因。

进一步改进在于，所述遗传工程菌为大肠杆菌DH5α或荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescen 2P24。

本发明还提供了一种上述遗传工程菌在提高2,4-DAPG产量中的应用。

本发明的原理为：2,4-DAPG是荧光假单胞菌产生的众多次生代谢产物中的一种，其可以在荧光假单胞菌中保持动态稳定的含量，这里phlH的负反馈发挥着至关重要的作用，同时也是2,4-DAPG生物合成产量受限的主要原因，本发明通过定点突变降低了phlH对2,4-DAPG的亲和力，从而获得了2,4-DAPG更高产量的突变菌株，具备较高的应用价值。

本发明具有如下有益效果：

通过与2,4-DAPG识别和结合的PhlH蛋白氨基酸残基产生定点突变，以减弱PhlH蛋白对2,4-DAPG生物合成的负反馈调节，获得2,4-DAPG产量的提升。

本发明中使用下列的缩写或简称：

负反馈：一种代谢反应被其反应产物所抑制的现象，称为负反馈；

TetR家族：多种细菌中普遍存在的转录调节子家族；

荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)2P24：是中国农业大学张力群教授从山东小麦全蚀病土壤中分离的生防菌株；

2,4-DAPG：2,4-二乙酰基间苯三酚；

PCR：聚合酶链式反应；

Ala(A)：丙氨酸；

Arg(R)：精氨酸。

附图说明

图1为pK18mobSacB-phlH载体示意图；

图2为ΔphlH/pBBR5pemIK::phlH/R124A载体示意图；

图3为标准品2,4-DAPG高效液相色谱检测图；

图4为野生型荧光假单胞菌2P24产2,4-DAPG的高效液相色谱检测图；

图5为回补突变菌株ΔphlH/pbbR5pemIK::phlHR124A产2,4-DAPG的高效液相色谱检测图；

图6为缺失突变菌ΔphlH产2,4-DAPG的高效液相色谱检测图；

图7为回补空载ΔphlH/pbbR5pemIK产2,4-DAPG的高效液相色谱检测图；

图8为各菌株2,4-DAPG的最终产量对比图。

具体实施方式

下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。

1、材料

本实验所用所有试剂如无特殊说明均为常规试剂，均使用去离子水配制，所使用到的仪器均为实验室常规仪器。

(1)用酶试剂购自Thermo公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自诺唯赞公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。

(2)敲除质粒pK18mobsacB带nptII(卡那霉素抗性基因)抗性标记，及sacB选择性标记。

(3)pBBR5pemIK质粒带广谱复制子pBBR1，能在多种宿主细胞中进行自主复制，pBBR1复制子为中低拷贝复制子，携带pemI/K抗内毒素基因，能提高质粒在宿主细胞内的稳定性；带庆大霉素抗性标记。

(4)本实验使用试剂及培养基配方如下：

LB培养基:酵母粉5g，NaCl10g,蛋白胨10g，定容至1L；

KB培养基(g/L):蛋白胨10g，甘油10ml，MgSO4.7H2O1.5g，K2HPO41.5g,pH7.0-7.2，定容至1L。

本实验各个步骤均按照标准的分子克隆技术和微生物操作进行，本实验所使用的方法如下，不受具体实施案例的影响。

2、方法

2.1构建phlH敲除质粒

以荧光假单胞菌P.fluorescens2P24基因组DNA为模板，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescen)phlH序列如SEQ ID NO.1所示，通过PCR扩增获得PhlH的上下游同源臂：

上游同源臂正向引物序列为：5'-CGGAATTCGCCGTGGTCCTGTTGACCCACG-3'，反向引物序列为：5'-GCTCTAGAATGAGCTATGCCCTTGGCGGCC-3'；

下游同源臂正向引物序列为：5'-AATCTAGAGTTGGCCAACCCCTGCTCGGCA-3'，

反向引物序列为：5'-CCCAAGCTTTTGCTGTATTTTTTCGACAGC-3'。

克隆所得的上游同源臂由EcoRⅠ，XbalⅠ双酶切，下游同源臂由XbalⅠ，HindⅢ双酶切，载体pK18mobSacB经EcoRⅠ，HindⅢ双酶切后，利用回收试剂盒分别回收酶切后的上下游同源臂片段和载体pK18mobSacB片段，利用连接酶将三片段进行连接，连接产物转化E.coliDH5α，筛选出阳性克隆，得到重组质粒pK18mobSacB-phlH，如图1所示，其上下游同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

2.2制备缺失phlH的2P24菌株

将重组成功的基因敲除载体pK18mobSacB-phlH通过转化的方法转化到供体菌株S17-1的感受态细胞中，将其作为基因敲除载体的供体菌株接种于LB培养基中(含有Kana抗生素)并在37℃进行过夜培养，同时在28℃培养计划进行基因敲除的菌株——荧光假单胞菌2P24，待上述供受体菌种长起来后，通过低速离心(防止菌体破裂)的方法收集菌体，而后用新鲜的无抗培养基清洗2-3次，然后再用一定体积的新鲜培养基重新悬浮菌体，接下来将带有自杀质粒的S17-1菌株作为载体供应菌株与载体接收菌株的2P24分别按照一定的比例混合起来，将混合菌株滴到无抗KB固体培养基上，在28℃条件下培养8-10h，此时，基因敲除载体会从供体菌株S17-1接合到受体菌株2P24中，然后用灭菌枪尖将菌斑划起来并接种到带有双重抗性(自杀质粒自身带有Kana抗性和载体受体菌2P24自身具备Amp抗性)的新鲜液体培养基中培养，至其菌株长起来后，然后按照一定的稀释比例对菌液进行稀释并且均匀涂布于Kana+Amp双抗生素平板，迫使其在抗生素压力下发生第一次同源重组，20h后挑取单克隆且通过PCR的方法筛选已经将自杀载体整合到其基因组上的单交换菌株。

而后将已验证为发生单交换的受体菌株在无抗培养基中培养10h，随后按照合适的比例进行稀释，并均匀涂布与含有10％蔗糖的固体KB培养基，在蔗糖致死压力下迫使其发生第二次同源重组，挑取已经发生双交换的受体菌株，并且采用菌液PCR的方法来验证目的基因敲除菌株，从而获得缺失突变菌ΔphlH。

2.3phlH点突回补质粒的构建

首先构建pBBR5pemIK-phlH，以P.fluorescens2P24基因组DNA为模板，通过PCR扩增克隆获得phlH基因，PCR扩增正向引物序列为5‘-AAAGGTACCATGGACAATGCCATTGGCAA-3’，反向引物序列为5‘-AAAAAGCTTTCAGCTTGCAGCATCGTGCG-3’，克隆所得的phlH基因片段和pBBR5pemIK载体经KpnⅠ，HindⅢ双酶切后，利用胶回收试剂盒回收酶切后的，在进行连接，连接产物转E.coliDH5αE.coliDH5α，筛选出阳性克隆，得到重组质粒pBBR5pemIK-phlH。

构建出pBBR5pemIK-phlH之后，以此为基础构建124精氨酸突变为丙氨酸的pBBR5pemIK-phlH/R124A，荧光假单胞菌PhlH氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，通过PCR点突变质粒，正向引物序列为5‘-GTTGGGCGTGAAAGTGCTCACGGCCGAAGTGCTTTC-3’，反向引物序列为5‘-CTCGGGAGAAGGCGAAAGCACTTCGGCCGTGAGCAC-3’，用PCR清洁试剂盒回收，将回收质粒用DpnⅠ酶切，在进行连接，连接产物转化E.coliDH5α，筛选出阳性克隆，得到重组质粒pBBR5pemIK-phlH/R124A，突变后的phlH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，PhlH蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.4构建phlH突变型回补菌株

以接合转移方式将pBBR5pemIK质粒导入假单胞菌，那么当大肠杆菌和假单胞菌共培养后，取共培养液梯度稀释涂双抗(庆大霉素/氨苄霉素)LA平板所获得克隆即为回补或过表达菌株。

若以电转方式将pBBR5pemIK质粒导入假单胞菌，那么双抗LA平板所获得克隆即为回补或过表达菌株。获得的回补突变菌株记为ΔphlH/pBBR5pemIK::phlH/R124A，ΔphlH/pBBR5pemIK::phlH/R124A载体示意图如图2所示。

2.5发酵实验

获得回补菌株之后进行发酵实验，主要涉及野生型荧光假单胞菌2P24、缺失突变菌ΔphlH、回补空载ΔphlH/pBBR5pemIK以及回补ΔphlH/pbbR5pemIK::phlH/R124A。

2.5.1培养菌株

具体地，在双抗(庆大霉素/氨苄霉素)平板所获得回补或过表达菌株之后，挑取单克隆接种至含20mLLB培养基的50mL三角瓶中，按0.1％添加抗生素，28℃200rpm振荡培养16h；按5％接种量转接至含50mLKB培养基的250mL三角瓶中，按0.1％添加合适抗生素，依次接种野生型荧光假单胞菌2P24、缺失突变菌ΔphlH、回补空载ΔphlH/pBBR5pemIK以及三瓶回补ΔphlH/pbbR5pemIK::phlH/R124A的菌株(记为ΔphlH/pbbR5pemIK::phlH/R124A1/2/3)，28℃200rpm振荡培养。

2.5.2高效液相色谱仪测定菌株产2,4-DAPG含量

分时段取样，每间隔12h取发酵液1mL至1.5mL离心管，再各取0.1ml发酵液至酶标板，用酶标仪测定实时OD，用于后面结果可信度的评估依据。本发明共取24、36、48三个时段的发酵液样品，12000rpm离心10min之后，将上清液转移至新的1.5ml离心管，用0.22μm有机滤头过滤，转移至HPLC进样瓶内。

随后制备标品，称取10mg2,4-DAPG，溶于1mL乙醇，制备成10g/L母液；梯度稀释成20mg/L，50mg/L，100mg/L，500mg/L。

随后用HPLC检测2,4-DAPG含量(流动相：A相为乙腈；B相为ddH2O；色谱柱：WondaSilC18-WRcolumn(5μm,4.6x150mm)；检测条件：A相55％，B相45％，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长270nm，检测时间10min/样品，2,4-DAPG保留时间为2.3min)，结果如图3-7所示。

3、结果

具体效果在摇瓶水平上，如图用于对照的野生型菌株2P24的2,4-DAPG平均产量为139mg/L，缺失突变菌株ΔphlH的产量为70.5895mg/L，回补突变菌株ΔphlH/pbbR5pemIK产量为44.8256mg/L回补突变菌株ΔphlH/pbbR5pemIK::phlH/R124A1的2,4-DAPG产量为382.0748mg/L，回补突变菌株ΔphlH/pbbR5pemIK::phlH/R124A2的2,4-DAPG产量为408.6772mg/L，回补突变菌株ΔphlH/pbbR5pemIK::phlH/R124A3的2,4-DAPG产量为426.3501mg/L。可以看出回补突变菌株ΔphlH/pbbR5pemIK::phlH/R124A的2,4-DAPG平均产量为405mg/L，较野生型荧光假单胞菌2P24的2,4-DAPG产量提升191％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽大学

<120> 一种PhlH蛋白突变体及其编码基因、重组质粒、工程菌和应用

<141> 2021-12-16

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 678

<212> DNA

<213> 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescen)

<400> 1

atggacaatg ccattggcaa gccttccctg cctcgtgctt cgcggctcga tgggcaggca 60

acgcggctgc agattctgga aaaggcgggt gaattgtttg ccgagcaggg gttggccaac 120

accaccagca agcagatttg tgaacgttcg caagccaaca gtgcggcggt gaactatcac 180

ttcgtgaata aagagggcct gtatcgcgca gtgttgctcg aagcccatgc tcggttggtg 240

caactggaaa cgctggtttc gcttaacgag cggccaggtt cgccgcagga caagttgcgt 300

gcgctcatta ccgtgctggt cgagcgactg cacaatcatc ccgatggttg ggcgctgaaa 360

gtgctcacgc gcgaagtgct ttcgccttct cccgagtttg aggtggtgct caaggagcaa 420

tcgtttccca aggcacacat cctgcgtggc ttgcttggac aaatcatgaa cttgccggcg 480

gatcacccga caacgttgcg cagcgccatc agcgtcttcg caccctgtct tttcctgctt 540

atagcccatc agccgctaaa gcagcatgta ctgcaggggt tgagtctcga gccgcagggc 600

ttgatagacc acatgatgag ctatgccctt ggcggcctcc aggcagtggc ggcaactgcg 660

cacgatgctg caagctga 678

<210> 2

<211> 225

<212> PRT

<213> 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescen)

<400> 2

Met Asp Asn Ala Ile Gly Lys Pro Ser Leu Pro Arg Ala Ser Arg Leu

1 5 10 15

Asp Gly Gln Ala Thr Arg Leu Gln Ile Leu Glu Lys Ala Gly Glu Leu

20 25 30

Phe Ala Glu Gln Gly Leu Ala Asn Thr Thr Ser Lys Gln Ile Cys Glu

35 40 45

Arg Ser Gln Ala Asn Ser Ala Ala Val Asn Tyr His Phe Val Asn Lys

50 55 60

Glu Gly Leu Tyr Arg Ala Val Leu Leu Glu Ala His Ala Arg Leu Val

65 70 75 80

Gln Leu Glu Thr Leu Val Ser Leu Asn Glu Arg Pro Gly Ser Pro Gln

85 90 95

Asp Lys Leu Arg Ala Leu Ile Thr Val Leu Val Glu Arg Leu His Asn

100 105 110

His Pro Asp Gly Trp Ala Leu Lys Val Leu Thr Arg Glu Val Leu Ser

115 120 125

Pro Ser Pro Glu Phe Glu Val Val Leu Lys Glu Gln Ser Phe Pro Lys

130 135 140

Ala His Ile Leu Arg Gly Leu Leu Gly Gln Ile Met Asn Leu Pro Ala

145 150 155 160

Asp His Pro Thr Thr Leu Arg Ser Ala Ile Ser Val Phe Ala Pro Cys

165 170 175

Leu Phe Leu Leu Ile Ala His Gln Pro Leu Lys Gln His Val Leu Gln

180 185 190

Gly Leu Ser Leu Glu Pro Gln Gly Leu Ile Asp His Met Met Ser Tyr

195 200 205

Ala Leu Gly Gly Leu Gln Ala Val Ala Ala Thr Ala His Asp Ala Ala

210 215 220

Ser

225

<210> 3

<211> 678

<212> DNA

<213> 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescen)

<400> 3

atggacaatg ccattggcaa gccttccctg cctcgtgctt cgcggctcga tgggcaggca 60

acgcggctgc agattctgga aaaggcgggt gaattgtttg ccgagcaggg gttggccaac 120

accaccagca agcagatttg tgaacgttcg caagccaaca gtgcggcggt gaactatcac 180

ttcgtgaata aagagggcct gtatcgcgca gtgttgctcg aagcccatgc tcggttggtg 240

caactggaaa cgctggtttc gcttaacgag cggccaggtt cgccgcagga caagttgcgt 300

gcgctcatta ccgtgctggt cgagcgactg cacaatcatc cgcatggttg ggcgctgaaa 360

gtgctcacgc gcgaagtgct ttcgccttct cccgagtttg aggtggtgct caaggagcaa 420

tcgtttccca aggcacacat cctgcgtggc ttgcttggac aaatcatgaa cttgccggcg 480

gatcacccga caacgttgcg cagcgccatc agcgtcttcg caccctgtct tttcctgctt 540

atagcccatc agccgctaaa gcagcatgta ctgcaggggt tgagtctcga gccgcagggc 600

ttgatagacc acatgatgag ctatgccctt ggcggcctcc aggcagtggc ggcaactgcg 660

cacgatgctg caagctga 678

<210> 4

<211> 225

<212> PRT

<213> 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescen)

<400> 4

Met Asp Asn Ala Ile Gly Lys Pro Ser Leu Pro Arg Ala Ser Arg Leu

1 5 10 15

Asp Gly Gln Ala Thr Arg Leu Gln Ile Leu Glu Lys Ala Gly Glu Leu

20 25 30

Phe Ala Glu Gln Gly Leu Ala Asn Thr Thr Ser Lys Gln Ile Cys Glu

35 40 45

Arg Ser Gln Ala Asn Ser Ala Ala Val Asn Tyr His Phe Val Asn Lys

50 55 60

Glu Gly Leu Tyr Arg Ala Val Leu Leu Glu Ala His Ala Arg Leu Val

65 70 75 80

Gln Leu Glu Thr Leu Val Ser Leu Asn Glu Arg Pro Gly Ser Pro Gln

85 90 95

Asp Lys Leu Arg Ala Leu Ile Thr Val Leu Val Glu Arg Leu His Asn

100 105 110

His Pro Asp Gly Trp Ala Leu Lys Val Leu Thr Ala Glu Val Leu Ser

115 120 125

Pro Ser Pro Glu Phe Glu Val Val Leu Lys Glu Gln Ser Phe Pro Lys

130 135 140

Ala His Ile Leu Arg Gly Leu Leu Gly Gln Ile Met Asn Leu Pro Ala

145 150 155 160

Asp His Pro Thr Thr Leu Arg Ser Ala Ile Ser Val Phe Ala Pro Cys

165 170 175

Leu Phe Leu Leu Ile Ala His Gln Pro Leu Lys Gln His Val Leu Gln

180 185 190

Gly Leu Ser Leu Glu Pro Gln Gly Leu Ile Asp His Met Met Ser Tyr

195 200 205

Ala Leu Gly Gly Leu Gln Ala Val Ala Ala Thr Ala His Asp Ala Ala

210 215 220

Ser

225

<210> 5

<211> 453

<212> DNA

<213> 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescen)

<400> 5

gccgtggtcc tgttgaccca cggtttgcca aaggctctgc gcagctccca cggttcgatg 60

gcggatccaa tggccgcctc gatcaacctt atccagaacg tgatggggct gcctttcgct 120

gcgcagcttg cctttctggt catgcttctg gagacgatcg gtgcagtcat gctggcgatg 180

gggttgggta cgcgactcgt cgccctgctg atcgccattc aaatgcttgc aatcagctat 240

gcgctgggac cgacatggcc ttggatagac cgaggcattg aatttcctgt actgatgggc 300

tttctcgccc tctacatcgt cgcgcgcggc ggcggagcct attcattgga ctcgcgccag 360

cggtagacgc cgatgatggc ggccccggtg tcagcttgca gcatcgtgcg cagttgccgc 420

cactgcctgg aggccgccaa gggcatagct cat 453

<210> 6

<211> 423

<212> DNA

<213> 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescen)

<400> 6

gttggccaac ccctgctcgg caaacaattc acccgccttt tccagaatct gcagccgcgt 60

tgcctgccca tcgagccgcg aagcacgagg cagggaaggc ttgccaatgg cattgtccat 120

gagctcatct ctttatagtt ctaattcaaa tttgactttt tatttcagcc tacctatttt 180

ggtcccgtca ttgtcccttt acaacaccgc gtgaggactt cgcagccgat gctgcggctt 240

ctcacgcact atcaaggaaa tatcgtcatg gaagcgcgcg taatgacacc tttcacctac 300

ttctcattgc caatgcagaa gcagttcctg gccaatcaac aggccgttca aggcaaaccc 360

tacgccgaat ttttccgctc gaagatcagc gtgccgctca gtgctgtcga aaaaatacag 420

caa 423

Claims

1.一种PhlH蛋白突变体PhlH/R124A，其特征在于，所述突变体为PhlH蛋白序列的第124位氨基酸由精氨酸突变为丙氨酸制备获得。

2.根据权利要求1所述的一种PhlH蛋白突变体PhlH/R124A，其特征在于，所述PhlH蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述突变体具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

3.一种phlh/R124A2基因，其特征在于，所述phlh/R124A2基因编码权利要求1所述的突变体。

4.根据权利要求3所述的一种phlh编码基因，其特征在于，所述phlh/R124A2编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有如权利要求3所述的phlh/R124A2编码基因。

6.根据权利要求5所述的一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pBBR5pemIK质粒。

7.一种高产2,4-DAPG的遗传工程菌，其特征在于，所述遗传工程菌包含如权利要求5所述重组质粒或基因组中包含如权利要求3所述phlh/R124A2编码基因。

8.根据权利要求7所述的一种遗传工程菌，其特征在于，所述遗传工程菌为大肠杆菌DH5α或荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescen 2P24。

9.一种如权利要求1所述的PhlH蛋白突变体在提高2,4-DAPG产量中的应用。