DE19501840A1

DE19501840A1 - Desoxyribonukleinsäure und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE19501840A1
Application number: DE19501840A
Authority: DE
Inventors: Barbara Dr Bieseler; Peter Dr Reinemer; Ruediger Dr Hain; Karlheinz Dr Mann; Hans-Joerg Dr Reif; Juergen Ernst Dr Thomzik
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1995-01-23
Filing date: 1995-01-23
Publication date: 1996-07-25
Also published as: AU4484996A; EP0805865A1; WO1996023072A1; CA2210901A1; JPH10512451A; UA51642C2; CN1169160A; RU2169196C2; US5968796A; BR9606780A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Desoxyribonukleinsäure (DNA) und ihre Verwendung zur Transformation von Vektoren, Wirtsorganismen und Pflanzen sowie zur Erzeugung von Pflanzen, die eine erhöhte Resistenz gegenüber Her biziden aufweisen.

Es ist bereits bekannt, Pflanzen genetisch so zu verändern, daß sie gegenüber be stimmten Herbiziden eine erhöhte Resistenz aufweisen. Dies ermöglicht es, Her bizide, die bei einer gelingen Selektivität ansonsten vorteilhafte Eigenschaften auf weisen, in den Kulturen von solchen Pflanzen, die in der ursprünglichen nicht transgenen Form durch diese Herbizide geschädigt würden, einzusetzen. Durch die Bereitstellung von herbizidresistenten Pflanzen wird somit die Auswahl an ein setzbaren Herbiziden vergrößert, und es ist auch in vielen Fällen möglich, mit relativ geringen Herbizidaufwandmengen auszukommen, z. B. wenn die Be kämpfung der unerwünschten Pflanzen erst nach deren Auflaufen bei Erreichung der jeweiligen Schadschwelle, vorgenommen werden kann.

Es besteht somit ein erhebliches Bedürfnis neue Kulturpflanzen zu erzeugen, welche gegenüber wei teren Herbiziden eine erhöhte Resistenz aufweisen.

Gluthathion-S-Transferasen sind multifunktionelle Proteine, die eine wesentliche Rolle bei der Entgiftung cytotoxischer Substanzen spielen. Die Enzyme kataly sieren die Konjugation von reduziertem Glutathion an elektrophile, hydrophobe Substrate, die natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein können.

Die physiologischen Substrate pflanzlicher Glutathion- S-Transferasen und ihre Rolle im Stoffwechsel der Pflanzen sind im einzelnen nicht bekannt. Nachgewie sen ist jedoch die Beteiligung dieser Enzyme an der Entgiftung und damit am Selektivitätsmechanismus für eine Reihe wichtiger Herbizide aus der Gruppe der Thiocarbamate, Chloroacetanilide und S-Triacine: Mozer T.J., Tiemeier D.C., Jaworski E.G., Biochemistry 22: 1068-1072 (1983); Moore R.E., Davies M.S., O′Connell K.M., Harding E.I., Wiegand R.C., Tiemeier D.C., Nucleic Acids Res. 14: 7227-7235 (1983); Grove G., Zarlengo R.P., Timmermann K.P., Li N., Tam M.F., Tuc C.P.D., Nucleic Acids Res. 16: 425-438 (1988).

Es wurde nun die neue Desoxyribonukleinsäure gefunden, welche für das neue Protein Glutathion-S-Transferase IIIc (im folgenden "GSTIIIc") kodiert, das die in SEQ ID NO: 2 aufgeführte Aminosäuresequenz aufweist (wobei die neue erfin dungsgemäße DNA im folgenden als "GSTIIIc-DNA" bezeichnet wird).

Weiterhin wurde gefunden, daß Pflanzen, in deren Genom die neue GSTIIIc-DNA eingebaut wurde, im Vergleich zu den entsprechenden "Ausgangspflanzen", eine erhöhte Resistenz gegenüber Herbiziden, vorzugsweise Heteroaryloxyacetamid-Herbiziden, besitzen.

Die neue GSTIIIc-DNA wurde aus Mais (Zea mais) der Sorte Mutin isoliert. Diese DNA kodiert für das Protein GSTIIIc der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2. In Pflanzenzellen bilden 2 Moleküle des Proteins GSTIIIc spontan das dimere aktive Enzym (im folgenden als "GSTIIIc-Enzym" bezeichnet), welches für die Entgiftung des eingesetzten Herbizides sorgt und damit die Pflanzen gegen das Herbizid resistent werden läßt.

Die erfindungsgemäß bevorzugte GSTIIIc-DNA weist die in SEQ ID NO: 1 auf geführte Sequenz auf.

Erfindungsgemäß ebenfalls bevorzugt ist die GSTIIIc-DNA, wie sie auf den weiter unten beschriebenen Vektor Plasmiden pET3a-GSTIIIc und pSS-GSTIIIc enthalten ist.

Die neue GSTIIIc-DNA kann in Form eines Einzelstranges oder in Form des Dop pelstranges vorliegen, der zusätzlich einen zum jeweiligen Einzelstrang komple mentären Strang enthält.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der GSTIIIc-DNA am 5′-Ende ein in Pflanzen wirksamer Promotor vorgeschaltet. Hierfür können die üblichen, in Pflanzen wirksamen Promotoren verwendet wer den. Beispielhaft sei der Promotor des Gens der kleinen Untereinheit der Ribulose- 1,5-biphosphat-carboxylase (rbsc) (vgl. EMBO Journal, vol. 5 Nr. 9, 2063-2071 (1986)) genannt. Bevorzugt werden Promotoren von Pflanzenviren eingesetzt, wo bei der CaMV 35S RNA Promotor als Beispiel genannt werden soll. Besonders bevorzugt wird das bekannte Konstrukt aus dem CaMV 35S Enhancer und dem sich in 5′-3′-Reihenfolge anschließenden CaMV 35S Promotor ("CaMV 35S-Dop pelpromoto") verwendet. Ein entsprechendes bevorzugtes Konstrukt aus der GSTIIIc-DNA und dem CaMV-Doppelpromotor ist auf dem weiter unten er läuterten Vektor Plasmid pSS-GSTIIIc enthalten. Es ist jedoch auch möglich, den natürlichen Promotor, der die Expression der GSTIIIc-DNA in Mais, Sorte Mutin reguliert.

Die Art der sich an die GSTIIIc-DNA in 5′-3′-Reihenfolge anschließenden 3′-Ter minationssequenz ist weitestgehend variabel und für die vorliegende Erfindung nicht von entscheidender Bedeutung. Bevorzugt werden pflanzliche 3′-Termina tionssequenzen eingesetzt. Beispielhaft kann auch die natürliche Terminations sequenz des GSTIIIc-Gens aus Mais, Sorte Mutin verwendet werden.

Ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung ist das neue Protein GSTIIIc mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 sowie dessen ebenfalls neues Dimeres (GSTIIIc-Enzym), welches, wie bereits oben ausgeführt wurde, aus 2 Molekülen des Proteins GSTIIIc nach deren Bildung in Pflanzenzellen spontan entsteht.

Zur erfindungsgemäßen DNA bzw. zum erfindungsgemäßen Protein (gegebenenfalls in der dimeren Form) gehören jeweils auch die von dieser DNA bzw. von diesem Protein abgeleiteten DNA-Sequenzen bzw. Proteinsequenzen. Unter DNA bzw. Proteinen mit abgeleiteten Sequenzen soll DNA bzw. Protein verstanden werden, welche noch die wesentlichen Merkmale der GSTIIIc-DNA bzw. des Proteins GSTIIIc (gegebenenfalls als GSTIIIc-Enzym in der dimeren Form) aufweisen, die also im wesentlichen gleichwirkend sind, d. h. in Pflanzen die erfindungsgemäße Herbizidresistenz in einem ausreichenden Maße erzeugen. In solchen abgeleiteten Sequenzen können einzelne DNA′s, Kodons, und/oder DNA-Teilsequenzen bzw. einzelne Aminosäuren oder Aminosäuren-Teilsequenzen fehlen (im Falle der DNA z. B. durch die Verwendung von Restriktionsenzymen) und/oder durch andere, im wesentlichen gleichwirkende, DNA′s, Kodons und DNA-Teilsequenzen bzw. Aminosäuren oder Aminosäuren-Teilsequenzen ersetzt sein. Solche Modifikationen können aufgrund der Degeneration des genetischen Kodes vorliegen oder sich bei der Manipulation der GSTIIIc-DNA bzw. des Proteins GSTIIIc oder des GSTIIIc-Enzyms ergeben. Die erfindungsgemäße DNA kann auch DNA′s, Kodons oder DNA-Sequenzen enthalten, welche ihre Handhabung erleichtern, z. B. sogenannte Linker oder welche von solchen Linkern nach Manipulationen (z. B. nach Schnitten mit Restriktionsenzymen) übrig bleiben. Die GSTIIIc-DNA bzw. das Protein GSTIIIc oder das GSTIIIc-Enzym kann natürlichen Ursprungs sein oder teilweise oder vollständig in synthetisierter Form vorliegen.

Teil der vorliegenden Erfindung ist auch eine rekombinante prokaryontische oder eukaryontische DNA, welche die neue GSTIIIc-DNA oder eine davon abgeleitete DNA als "fremde" oder "zusätzliche" DNA enthält. Beispielhaft seien virale DNA, mikrobielle DNA (insbesondere bakterielle DNA, wie DNA von Escherichia coli oder Agrobakterium tumefaciens) und pflanzliche DNA genannt.

Die erfindungsgemäße GSTIIIc-DNA sowie die davon abgeleiteten DNA-Sequen zen sowie die rekombinante prokaryontische oder eukaryontische DNA sowie die davon abgeleiteten DNA-Sequenzen können als "fremde" oder "zusätzliche" DNA in Vektoren (insbesondere Plasmiden, Cosmiden oder Phagen), in transformierten bzw. transgenen Mikroorganismen (vorzugsweise Bakterien, wie Escherichia coli oder Agrobakterium tumefaciens) sowie in transformierten bzw. transgenen Pflan zenzellen und Pflanzen bzw. in deren DNA enthalten sein. Diese Vektoren, Mikroorganismen, Pflanzenzellen und Pflanzen sowie deren DNA sind Teil der vorliegenden Erfindung. Sie können, ebenso wie die rekombinante prokaryontische und eukaryontische DNA durch den Fachmann bei Kenntnis der vorliegenden Beschreibung, insbesondere der SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2, gemäß den allgemein bekannten und/oder üblichen Verfahren und Methoden erhalten werden.

Als besonders bevorzugte Vektoren seien die Vektor Plasmide pET3a-GSTIIIc und pSS-GSTIIIc genannt. Beide Vektoren enthalten die erfindungsgemäße GSTIIIc-DNA gemäß SEQ ID NO: 1.

Das Plasmid pET3a-GSTIIIc enthält die GSTIIIc-DNA auf einem NdeI/BamHI-Fragment. Zur Konstruktion dieses Plasmides wurde die GSTIIIc-DNA gemäß SEQ ID NO: 1 in die Ndel und BamHI Schnittstellen des Vektors pET-3a (Novagen/Madison) kloniert (Studier F.W., Moffatt B.A., J. Mol. Biol. 189: 113-130; Studier F.W., J. Mol. Biol. 219: 37-44 (1991)). Dieses Plasmid (5306 bps) wird in Fig. 1 dargestellt. Die Pfeilrichtung zeigt die Richtung des Promotors und des Gens bzw. der GSTIIIc-DNA mit dem Startkodon ATG. "Amp" steht für das Ampicillin-Resistenzgen.

Zur Konstruktion des Plasmids pSS-GSTIIIc wurde die GSTIIIc-DNA als Xbal/BamHI-Fragment aus dem Vektor pET3a-GSTIIIc gereinigt und in das Plasmid Bluescript-SKII (Xbal/BamHI-linearisiert; Stratagene) kloniert. Anschlie ßend wurde die GSTIIIc-DNA über eine SstI/SmaI-Restriktionsspaltung aus dem so erhaltenen Plasmid Bluescript-SKII-GSTIIIc isoliert und und in den Vektor pRT101 (SstI/SmaI-linerisiert; Töpfer et al. 1987) ligiert. Danach wurde die GSTIIIc-DNA als EcoRI/Smal-Fragment aus dem so erhaltenen Vektor pRT101-GSTIIIc gereinigt und in den binären Vektor pSS (EcoRI/Smal-linearisiert; Voß et al. 1994) kloniert. In dem entstandenen Vektor pSS-GSTIIIc steht die kodierende GSTIIIc-DNA unter der Kontrolle eines duplizierten 355 RNA Promotors aus CaMV. Das Plasmid pSS-GSTIIIc (10 000 bps) ist als Fig. 2 dargestellt.

Die erfindungsgemäße GSTIIIc-DNA kann bei Bedarf durch den Fachmann aus den genannten Plasmiden nach den allgemein üblichen Verfahren und Methoden isoliert werden.

Als besonders bevorzugte erfindungsgemäße transformierte bzw. transgene Mikro organismen seien die Escherichia coli-Stämme DS pET3a-GSTIIIc und DS pSS-GSTIIIc sowie deren Mutanten genannt. Der Stamm DS pET3a-GSTIIIc enthält das Plasmid pET3a-GSTIIIc und der Stamm DS pSS-GSTIIIc enthält das Plasmid pSS-GSTIIIc. Erfindungsgemäße Mutanten sind solche Mikroorganismen, die noch die für die Ausführung der Erfindung wesentlichen Merkmale enthalten, also insbesondere noch die Plasmide pET3a-GSTIIIc und/oder pSS-GSTIIIc oder davon abgeleitete DNA-Sequenzen enthalten. Diese Stämme können nach den allgemein üblichen Methoden vermehrt werden. Die Plamide pET3a-GSTIIIc und pSS-GSTIIIc können aus diesen Mikroorganismen ebenfalls nach den allgemein üblichen Methoden isoliert werden.

Der Escherichia coli-Stamm pET3a-GSTIIIc wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Bu dapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt (Hinterlegungs datum: 17.01.1995). Der Stamm erhielt die Hinterlegungsnummer DSM 9677.

Wie bereits oben dargelegt wurde, gehören zur vorliegenden Erfindung auch transgene Pflanzen sowie Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflan zenteile (wie Kallus, Blätter, Stengel, Blüten, Blütenteile, Wurzel, Knollen, Samen und sonstiges Vermehrungsmaterial) solcher transgenen Pflanzen, welche in ihrem Genom die GSTIIIc-DNA oder davon abgeleitete DNA-Sequenzen und/oder eine erfindungsgemäße rekombinante prokaryontische oder eukaryontische DNA als "fremde" oder "zusätzliche" DNA enthalten.

Zu den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen gehören auch die Nachkommen der erfindungsgemäß erhältlichen transgenen Pflanzen sowie die Kreuzungsergeb nisse mit anderen Pflanzen und deren Nachkommen, solange diese transgenen Pflanzen die GSTIIIc-DNA oder davon abgeleitete DNA-Sequenzen als "fremde" oder "zusätzliche" DNA enthalten.

Bevorzugte transgene Pflanzen sind solche Pflanzen, die in ihrem Genom die GSTIIIc-DNA gemäß SEQ ID NO: 1 als "fremde" oder "zusätzliche" DNA ent halten.

Besonders bevorzugte transgene Pflanzen sind solche Pflanzen, die in ihrem Genom das Konstrukt aus dem CaMV 355 Doppelpromotor und der GSTIIIc-DNA gemäß SEQ ID NO: 1 als "fremde" oder "zusätzliche" DNA enthalten.

Ganz besonders bevorzugte transgene Pflanzen sind solche Pflanzen, die in ihrem Genom die GSTIIIc-DNA gemäß SEQ II) NO: 1 und/oder das Konstrukt aus dem CaMV 355 Doppelpromotor und der GSTIIIc-DNA gemäß SEQ ID NO: 1 als "fremde" DNA enthalten. Bisher sind keine Pflanzen, außer Mais-Sorte Mutin bekannt geworden, welche eine der GSTIIIc-DNA entsprechend DNA in ihrem Genom enthalten.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll unter "fremder" DNA eine solche DNA verstanden werden, welche in einem bestimmten prokaryontischen oder eukaryontischen (einschließlich pflanzlichen) Genom nicht natürlich enthalten ist, sondern erst durch den Eingriff des Menschen (Transformation) in diesen Genom aufgenommen wird. "Zusätzliche DNA ist eine solche DNA, welche in dem jeweiligen prokaryonischen oder eukaryontischen Genom zwar bereits vor handen ist, jedoch in zusätzlicher Menge durch Eingriffe durch den Menschen (Transformation- in diesen Genom aufgenommen wird. Die "fremde" oder "zusätzliche" DNA kann je nach Bedarf und Art des vorliegenden Falles in einem oder mehreren Exemplaren eingebaut werden.

Wie bereits dargelegt wurde, liegt die liegt die Hauptzielsetzung der vorliegenden Erfin dung darin, daß neue Pflanzen erzeugt werden, die eine erhöhte Resistenz gegen über Herbiziden, vorzugsweise gegenüber Heteroaryloxyacetamid-Herbiziden auf weisen.

Somit werden solche erfindungsgemäße neue transgene Pflanzen bevorzugt, wel che zusätzlich zu den oben angegebenen Eigenschaften (Gehalt an "fremder" oder "zusätzlicher" GSTIIIc-DNA) im Vergleich zu den entsprechenden nicht-trans genen Pflanzen eine erhöhte Resistenz gegen Herbizide, insbesondere gegen Heteroarylacetamid-Herbizide, aufweisen. Kulturen dieser transgenen Pflanzen können somit mit den Herbiziden zur Bekämpfung von unerwünschten Pflanzen behandelt werden, ohne die Kulturpflanzen zu schädigen.

Die erhöhte Herbizidesistenz der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen ist von Bedeutung für Landwirtschaft und Forsten, für den Zier pflanzenanbau, den Heilpflanzenanbau und die Pflanzenzucht.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstellung trans gener Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflanzen (einschließlich Pflanzenteile und Samen) mit erhöhter Resistenz gegen Herbizide, weiches da durch gekennzeichnet ist, daß man

(a) ein oder mehrere Exemplare der GSTIIIc-DNA und/oder erfindungsgemäße rekombinante DNA, welche die GSTIIIc-DNA enthalten, die für das Pro tein GSTIIIc kodieren, in den Genom von Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) einsetzt und gegebenenfalls
(b) aus den transformierten Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) voll ständige transformierte Pflanzen regeneriert und gegebenenfalls vermehrt und gegebenenfalls
c) von den so erhaltenen transgenen Pflanzen der Elterngeneration oder wei terer daraus gewonnene Generationen die gewünschten Pflanzenteile (ein schließlich Samen) gewinnt.

Die Verfahrensschritte (a), (b) und (c) können nach bekannten Verfahren und Methoden in üblicher Weise durchgeführt werden.

Transgene Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflanzen (einschließlich Pflanzenteile und Samen), welche die GSTIIIc-DNA ein- oder mehrfach als "fremde" oder "zusätzliche" DNA enthalten sowie solche transformierte Pflan zenzellen und Pflanzen, welche nach den obigen Verfahren erhältlich sind, gehören ebenfalls zur vorliegenden Erfindung.

Teile der vorliegenden Erfindung sind auch die:

(a) Verwendung der GSTIIIc-DNA und/oder der erfindungsgemäßen rekombi nanten DNA und/oder der erfindungsgemäßen rekombinanten Vektoren und/oder der erfindungsgemäßen transformierten Mikroorganismen zur Transformation von Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflan zen (einschließlich Pflanzenteilen und Samen), die
(b) Verwendung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen (einschließ lich Protoplasten) und Pflanzen (einschließlich Pflanzenteilen und Samen) zur Erzeugung von Vermehrungsmaterial sowie zur Erzeugung neuer Pflan zen und deren Vermehrungsmaterial, die
c) Verwendung der auf dem Plasmid pEt3a-GSTIIIc enthaltenen cDNA oder ihrer Teile sowie der den Sequenzinformationen gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 entsprechenden DNA-Sequenzen zur Bestimmung von DNA, die für GSTIIIc-Protein oder GSTIIIc-Enzym kodieren in Pflanzen sowie (allgemein) bei der Erzeugung von transgenen Pflanzenzellen (einschließ lich Protoplasten) und Pflanzen (einschließlich Pflanzenteilen und Samen) sowie die Verwendung der durch die GSTIIIc-DNA von pET3a-GSTIIIc-codierten Proteinsequenz sowie des Proteins gemäß SEQ II) NO: 2 bei der Isolierung und dem Nachweis der GSTIIIc-DNA (z. B. durch die übliche Antikörper-Technik).

Eine Anzahl verschiedener Methoden steht zur Verfügung, die GSTIIIc-DNA, gegebenenfalls als Konstrukt mit dem CaMV35S Doppelpromotor, als "fremde" oder "zusätzliche" DNA in das genetische Material von Pflanzen bzw. Pflanzen zellen einzusetzen. Der Gentransfer kann nach den allgemein üblichen bekannten Methoden erfolgen, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierigkeiten ermitteln kann.

Das Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens steht als besonders günstiger und breit einsetzbarer Vektor zur Übertragung von "fremder" oder "zusätzlicher" DNA in Genome dikotyler und monokotyler Pflanzen zur Verfügung. Das genetische Material, welches für das Protein GSTIIIc kodiert, wird gegebenenfalls zusammen mit regulatorischen DNA-Sequenzen in die T-DNA von geeigneten Ti-Plasmiden eingesetzt (z. B. Zambryski et al., 1983) und durch Infektion der Pflanze, Infektion von Pflanzenteilen oder Pflanzengeweben, wie z. B. von Blattscheiben, Stengeln, Hypokotylen, Kotyledonen, Meristemen und davon ableitenden Geweben, wie z. B. sekundären Embryonen und Kalli oder durch Kokultur von Protoplasten mit Agrobacterium tumefaciens übertragen.

Eine Alternative ist die Inkubation von gereinigter DNA, die das gewünschte Gen bzw. die gewünschte DNA enthält, in Pflanzenprotoplasten (z. B. Hain et al., 1985;
Krens et al., 1982; Paszkowski et al., 1984) in Gegenwart von Polykationen oder Calziumsalzen und Polyethylenglykol.

Die DNA-Aufnahme kann auch zusätzlich durch ein elektrisches Feld (Elektro poration) begünstigt werden (z. B. Fromm et al., 1986).

Die DNA kann in bekannter Weise auch über Pflanzenpollen eingeführt werden, indem Pollen oder andere Pflanzenteile mit physikalisch beschleunigten Partikeln "beschossen" werden, welche die DNA tragen (vgl. EP-A 0 270 356).

Die Regeneration der Pflanzen erfolgt in bekannter Weise mit Hilfe geeigneter Nährmedien (z. B. Nagy und Maliga 1976).

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die GSTIIIc-DNA aus dem Plasmid pET3a-GSTIIIc in einen binären Expressions vektor kloniert (z. B. Voß et al. (1994)). Das chimäre Genkonstrukt wird dann auf Agrobakterium tumefaciens (Koncz und Schell 1986) übertragen.

Alternativ wird das chimäre Genkonstrukt auf dem Vektor pSS-GSTIIIc in üb licher Weise durch direkten Gentransfer auf Pflanzenprotoplasten übertragen (z. B. Hain et al. 1985). Dabei kann das Plasmid in zirkulärer, vorzugsweise jedoch in linearer Form, vorliegen.

Bei der Verwendung dieses Plasmids mit Reportergen werden Kanamycin-resi stente Protoplasten dann auf Expression von GSTIIIc überprüft.

Transformierte (transgene) Pflanzen bzw. Pflanzenzellen werden nach den bekann ten Methoden, z. B. durch Blattscheiben-Transformation (z. B. Horsch et al. 1985), durch Cokultur regenerierender Pflanzenprotoplasten oder Zellkulturen mit Agro bacterium tumefaciens (z. B. Marton et al. 1979, Hain et al. 1985) oder durch direkte DNA Transfektion erzeugt. Resultierende transformierte Pflanzen werden entweder durch Selektion auf die Expression des Reportergens, z. B. durch die Phosphorylierung von Kanamycinsulfat in vitro (Reiss et al. 1984; Schreier et al. 1985) oder durch die Expression der Nopalinsynthase (nach Aerts et al. 1983) oder von GSTIIIc durch Northern-Blot-Analyse und Western Blot-Analyse nachge wiesen. Das Protein GSTIIIc kann auch in bekannter Weise in Western-Blot-Analysen mit Hilfe spezifischer Antikörper in transformierten Pflanzen nachgewiesen werden.

Die Kultivierung der transformierten Pflanzenzellen sowie die Regeneration zu vollständigen Pflanzen erfolgt nach den allgemein üblichen Methoden mit Hilfe der jeweils geeigneten Nährmedien.

Sowohl die transformierten Pflanzenzellen als auch die transformierten Pflanzen, welche die erfindungsgemäße GSTIIIc-DNA enthalten und welche Bestandteile der vorliegenden Erfindung sind, zeigen eine erheblich höhere Resistenz gegen Herbizide, insbesondere gegen Heteroaryloxyacetamid-Herbizide.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "Pflan zen" sowohl vollständige Pflanzen als auch Pflanzenteile, wie Blätter, Samen, Knollen, Stecklinge usw. "Pflanzenzellen" schließen Protoplasten, Zellinien, Pflanzenkalli usw. ein. "Vermehrungsmaterial" bedeutet Pflanzen und Pflanzen zellen, welche zur Vermehrung der transformierten Pflanzen und Pflanzenzellen verwendet werden können und ist somit ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.

Zu den Pflanzen, welchen durch den Einbau (Transformation) der erfindungs gemäßen GSTIIIc-DNA eine erhöhte Resistenz gegenüber Herbiziden verliehen werden kann, gehören praktisch alle Pflanzen. Ein besonderes Bedürfnis zur Resistenzerzeugung besteht naturgemäß bei den Kulturpflanzen, wie Forstpflanzen, z. B. Fichten, Tannen, Douglasien, Kiefern, Lärchen, Buchen und Eichen sowie Nahrungsmittel und Rohstoffe liefernden Pflanzen, z. B. Getreide (insbesondere Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Hirse, Reis und Mais), Kartoffel, Leguminosen (wie Hülsenfrüchte und insbesondere Alfalfa, Sojabohnen), Gemüse (insbesondere Kohlarten und Tomaten), Obst (insbesondere Äpfel, Birnen, Kirschen, Wein trauben, Citrus, Ananas und Bananen), Ölpalmen, Tee-, Kakao- und Kaffee sträucher, Tabak, Sisal und Baumwolle sowie bei Heilpflanzen, wie Rauwolfia und Digitalis. Besonders bevorzugt seien Kartoffel, Zuckerrüben, Zuckerrohr, Getreide, wie Weizen und Gerste und Sorghum, und Reis genannt. Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße GSTIIIc-DNA als "fremde" DNA in den Genom von Pflanzen eingebaut.

Bevorzugte Herbizide, gegen die erfindungsgemäß eine erhöhte Herbizidresistenz erzeugt werden kann, gehören zur Gruppe der Heteroaryloxyacetamide. Besonders bevorzugt sind hierbei die Heteroaryloxyacetamide der allgemeinen Formel (I)

Het-O-CH₂-CO-NR¹R² (I)

in welcher
Het für einen gegebenenfalls substituierten heteroaromatischen Rest mit vorzugs weise 5 Ringliedern steht, der vorzugsweise wenigstens ein Stickstoffatom und ein Schwefel- oder Sauerstoffatom enthält, wobei als besonders bevorzugter Rest der 5-Trifluormethyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl-Rest genannt sei;
R¹ für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Alkoxy (mit jeweils vorzugsweise 1-4 Kohlenstoffatomen) steht; und
R² für einen gegebenenfalls substituierten Arylrest (vorzugsweise Phenylrest, welcher vorzugsweise durch Halogen substituiert ist) steht.

Solche Herbizide sind bereits bekannt (vgl. z. B. EP-A-18 497 und die entsprechen de US-Patentschrift Nr. 4 645 525, die EP-A-94 541 und die entsprechende US-Patentschrift Nr. 4 585 471 sowie die EP-A-348 737 und die entsprechende US-Patentschrift Nr. 4 968 342). Die in diesen Patentanmeldungen bzw. Patent schriften genannten Herbizide sind im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt.

Ganz besonders bevorzugt wird erfindungsgemäß eine Resistenz gegen das in der EP-A-348 737 und in der entsprechenden US-Patentschrift Nr. 4 968 342 genannte Herbizid mit der chemischen Bezeichnung: (5-Trifluormethyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl oxy)-essigsäure-N-isopropyl-N-(4-fluorphenyl)-amid (vorgeschlagener common name: Thiafluamide). Diese Resistenz erlaubt den Einsatz des genannten Herbizi des auch in solchen Kulturen, die in der nicht-resistenten Form in einer nicht akzeptablen Weise durch das Herbizid geschädigt würden.

Die vorliegende Erfindung soll anhand der folgenden beispielhaften Ausführungen näher erläutert werden:

I. Isolierung der GSTIIIc-DNA aus Mais

Bei der Isolierung der GSTIIIc-DNA werden die bekannten Verfahren und Methoden der Molekularbiologie verwendet, wie sie beispielsweise in folgendem Handbuch beschrieben werden: Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual; Cold Spring Habor Laboratory, Second Edition 1989.

Zur Isolierung der GSTIIIc-DNA wird zunächst das Protein aus etiolierten Maiskeimlingen (Zea mais), Sorte Mutin, gereinigt (1) und die Amino säuresequenz vollständig durch Proteinsequenzanalyse bestimmt (2). Eben falls aus Maiskeimlingen wird mRNA isoliert (3) und durch Reverse Transkriptase enzymatisch in cDNA umgeschrieben (4). Die so gewonnene cDNA wird als Matrize in der Polymerase-Kettenreaktion (Mullis K.B., Faloona F.A, (1987) Methods Enzymol. 155: 335-350) zur Isolierung der GSTIIIc-DNA eingesetzt.

1. Isolierung des GSTIIIc-Proteins aus Mais, Sorte, Mutin

Zur Reinigung des GSTIIIc-Proteins werden Maiskeimlinge aufgeschlossen und mit 0,2 M Tris/HCl pH 7,8, 1 mM EDTA (2 ml/g Frischgewicht) versetzt. Die Suspension wird zentrifugiert und die Proteinfraktion im Überstand durch fraktionierte Animoniumsulfatfallung mit einer Sättigung von 30% und 70% gewonnen. Die Isolierung des GSTIIIc-Proteins erfolgt durch Chromatographie auf folgenden Säulen mit den aufgeführten Puffer bedingungen:

A) Sephadex G-100 (Trennmedium auf Dextranbasis), v = 500 ml (Pharmacia)
Puffer A: 50 mM Kaliumphosphat pH 7,3
B) DEAE-Sepharose (vernetzte Agarosematrize mit kovalent gebun dener Diethylamino-ethyl-Gruppe), v = 50 ml (Pharmacia)
Puffer A:10 mM Kaliumphosphat pH 7,3
Puffer B: 1,0 M Kaliumphosphat pH 7,3
Gradient: 0-100% B in 500 ml
C) Glutathion-Sulfobromophthalein-Agarose, v = 20 ml (Sigma)
Puffer A: 50 mM Kaliumphosphat pH 7,3
Puffer B: 50 mM Kaliumphosphat pH 8,0, 5 mM Glutathion
D) Mono Q HR 5/5 (Anionenaustauscher-Material auf Basis quervernetzter Agarose mit geladenen -CH₂N(CH₃)₃ + -Gruppen, Partikelgröße von 10 ± 5 µm), v = 1 ml (Pharmacia)
Puffer A: 20 mM Tris/HCl pH 7,5
Puffer B: 20 mM Tris/HCl pH 8,0, 1,0 M NaCl
Gradient: 0-25% B in 20 ml

2. Proteinsequenzanalyse des GSTIIIc-Proteins

Das aus Mais (Sorte Mutin) isolierte GSTIIIc-Protein wird reduziert, car boxymethyliert und gegen 0.2 M Ammoniumhydrogencarbonat dialysiert (Glazer A.N., Delange R.J., Sigman D.S., (1975) Chemical Modification of Proteins, Elsevier Biomedical Press, Amsterdam). Die anschließende Spal tung des. Proteins mit den Endoproteasen Asp-N (sequencing grade, Boehringer Mannheim) oder Trypsin (TPCK-treated, Worthington) erfolgt bei 23°C für 16 Stunden mit einem Protein-Protease-Verhältnis von 1 : 100. Die Spaltungsreaktionen werden durch Zugabe von 0,1% Trifluoressigsäu re beendet. Unlösliche Peptide werden abzentrifugiert, die löslichen Peptide werden durch Reversed-Phase-HPLC unter folgenden Bedingungen von einander getrennt:

Säule: Vydac C 18 (Trenngel auf Silicabasis mit aliphatischen Ket ten (C₁₈)), 0,46 cm×25 cm
Eluent A: 0,1% Trifluoressigsäure
Eluent B: 0,1% Trifluoressigsäure, 90% Acetonitril
Gradient: 0-60% B in 40 min
Flußrate: 0,25 ml/min

Die Aminosäuresequenz der isolierten Peptide wird mit Hilfe der Applied Biosystems Proteinsequenatoren 470A und 473A bestimmt. Die vollstän dige Proteinsequenz des GSTIIIc-Proteins ist in SEQ ID No: 2 dargestellt.

3. Isolierung von poly(A) + mRNA aus Mais (Sorte Mutin)

Die GSTIIIc-DNA, die mRNA und die entsprechende cDNA enthalten Nukleotidsequenzen, die voneinander abgeleitet werden können. Zur Iso lierung der GSTIIIc-DNA wird zunächst polyadenylierte mRNA aus etio lierten Maiskeimlingen präpariert. Die Isolierung erfolgt mit Hilfe von Dynabeads Oligo (dT)₂₅ entsprechend dem Protokoll des Herstellters (Dynal, Oslo/Norwegen; Jakobsen K.S., Breivold E., (1990) Nucleic Acids Res. 18: 3669). Diese Methode zur Reinigung von poly(A) + RNA basiert auf der Basenpaarbindung zwischen den poly(A) + -Reste am 3′-Ende von mRNA und oligo(dT)-Resten, die kovalent auf der Oberfläche von mag netischen Metallkugeln (Dynabeads) gebunden sind. Pro Milligramm Dynabeads werden 0,2 g Pflanzenmaterial eingesetzt. Die mit dieser Me thode isolierte mRNA wird ohne weitere Reinigungsschritte für die enzy matische Synthese von cDNA eingesetzt.

4. Enzymatische Synthese von cDNA

Die Herstellung von cDNA wird mit Hilfe des "First Strand cDNA Synthesis Kits" (Pharmacia P-L Biochemicals Inc.) durchgeführt. Diese Methode basiert auf der enzymatischen Aktivität von viralen DNA-Poly merasen (Reverse Transkriptasen), welche DNA nach einer RNA-Matrize synthetisieren (Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J., (1982) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory).

Entsprechend den Angaben des Herstellers wird die Reaktion folgender maßen durchgeführt:
5 µm poly(A) + mRNA aus Mais, Sorte Mutin wurden versetzt mit:
1 µm 0,5 M Dithioeritrit
1 µm d(T)_16-18-Primer
11 µm Reaktionsmischung (Bulk Reaction Mix) bestehend aus:
Murine Reverse Transkriptase, 135 mM Tris/HCl, pH 8,3, 204 mM KCl, 27 mM MgCl₂, 0,24 mg/ml BSA, 5,4 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP.

Nach einer Reaktionszeit von einer Stunde bei 37°C wird die mRNA durch alkalische Hydrolyse entfernt. Die synthetisierte cDNA wird gefällt und als Matrize für die Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt.

Amplifizierung, Klonierung und Sequenzierung der GSTIIIc-DNA

Zur Isolierung der GSTIIIc-DNA wird die für GSTIIIc codierende Nukleotidsequenz zunächst mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion ampli fiziert (Mullis K.B., Faloona F.A., (1987) Methods Enzymol. 155: 335-350). Als Matrize für die Reaktion dient die aus Mais-mRNA hergestellte cDNA. Zur spezifischen Anreicherung der GSTIIIc-DNA werden die Primer 1 (forward) gemäß. SEQ ID NO: 3 und Primer 2 (reverse) gemäß SEQ ID No: 4 eingesetzt.

Reaktionsansätze mit folgender Zusammensetzung werden hergestellt:
5 µm cDNA (200 ng/µl)
1 µm 50 µM Primer 1
1 µm 50 µM Primer 2
4 µl 250 µM dATP, dCTP, dGTP, dTTP
5 µl 200 mM Tris/HCl, pH 8,8, 100 mM KCl, 60 mM (NH₄)₂SO₄, 15 mM Mg Cl₂, 1% Triton X-100
34 µl H₂O

Die Polymerase-Kettenreaktion erfolgt in einem GeneAmp PCR System 9600-Thermocycler (Perkin Elmer). Als hitzestabile Polymerase wird 1 µl Pfu-Dna-Polymerase (Stratagene, 2500 U/ml) zugesetzt. Insgesamt werden 35 Reaktionszyklen mit folgenden Temperaturen und Reaktionszeiten durchgeführt: 45 sec bei 94°C, 45 sec bei 58°C, 45 sec bei 72°C. Das am plifizierte DNA-Fragment, welches die für GSTIIIc kodierende Nukleotid sequenz enthält, wird durch Agarosegelelektrophorese gereinigt und, wie bereits beschrieben, in den Vektor pET 3a kloniert. Die vollständige DNA-Sequenz der GSTIIIc-DNA (SEQ ID NO: 1) wird unter Verwendung des Sequenase DNA Sequencing Kits (United States Biochemical/Cleveland) bestimmt (Sanger F., Coulson R., (1975) J. Mol. Biol. 94: 441-448).

II. Transformation von Reis

Die Transformation von Reis (Oryza sativa) kann entsprechend der Me thoden, die in folgenden Literaturstellen beschrieben werden, durchgeführt werden:
Zhang H.M., Yang H., Rech E.L., Golds T.J., Davis A.S., Mulligan B.J., (1988) Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plas mid uptake into protoplasts. Plant Cell Rep. 7: 379-384
Zhang W., Wu R., (1988) Efficient regeneration of transgenic plants from rice protoplasats and correcfly regulated expression of the foreign gene in the plant. Theor. Appl. Gen. 76: 835-840
Shimamoto K., Terada R., Izawa T., Fujimoto H., (1989) Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts. Nature 338: 274-276
Datta S.K., Peterhans A., Datta K., Potrykus I., (1990) Genetically engineered fertile indica-rice recovered from protoplasts. Biotechnol. 6: 736-740
Hayashimoto A., Li Z., Murai N., (1990) A polyethylene glycolmediated transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93: 857-863
Für die Übertragung des Vektors pSS-GSTIIIc in Reis wurde die Methode von Hayashimoto et al. (1990) ohne Veränderungen verwendet.

Kanamycinrestistente Transformanden wurden in Northern Blot-Experi menten auf die Expression von GSTIIIc überprüft. Die Bildung des GSTIIIc-Proteins wurde durch spezifische Antikörper nachgewiesen. Die enzymatische Aktivität des Proteins konnte im Rohextrakt von trans formierten Reispflanzen gezeigt werden durch den Nachweis der enzym katalysierten Modifikation des Herbizides (5-Trifluormethyl-1,3,4-thiadia zol-2-yl-oxy)-essigsäure-N-isoproypl-N-(4-fluorphenyl)-amid.

Transgene Reispflanzen weisen im Vergleich zu nicht transformierten Kon trollen eine Resistenz gegenüber dem genannten Herbizid auf.

III. Transformation von Tabak a) Kultur von Tabaksprossen und Isolierung von Tabakprotopasten

Nicotiana tabacum (Petit Havanna SR1) wird als sterile Sproßkultur auf hormonfreiem LS Medium (Linsmaier und Skoog 1965) vermehrt. In Ab ständen von ca. 6-8 Wochen werden Sproßabschnitte auf frisches LS-Medium umgesetzt. Die Sproßkulturen werden bei 12 h Licht (1000-3000 Lux) in einem Kulturraum bei 24-26°C gehalten.

Für die Isolierung von Blattprotoplasten werden ca. 2 g Blätter (ca. 3-5 cm lang) mit einer frischen Rasierklinge in kleine Stücke (0,5 cm×1 cm) ge schnitten. Das Blattmaterial wird in 20 ml Enzymlösung, bestehend aus K3 Medium (Nagy und Maliga 1976), 0,4 M Saccharose, pH 5,6, 2% Zellu lase R10 (Serva), 0,5% Macerozym R10 (Serva) für 14-16 h bei Raum temperatur inkubiert. Danach werden die Protoplasten durch Filtration über 0,30 mm und 0,1 mm Stahlsiebe von Zellresten getrennt. Das Filtrat wird 10 Minuten lang bei 100×g zentrifugiert. Während dieser Zentrifugation flotieren intakte Protoplasten und sammeln sich in einer Bande am oberen Rand der Enzymlösung. Das Pellet aus Zellresten und die Enzymlösung werden mit einer Glaskapillare abgesaugt. Die vorgereinigten Protoplasten werden mit frischem K3 Medium (0,4 M Saccharose als Osmotikum) auf 10 ml aufgefüllt und erneut flotiert. Das Waschmedium wird abgesaugt und die Protoplasten werden für Kultur oder folgende Infektion mit Agrobak terien (Kokultur) auf 1-2×10⁵/ml verdünnt. Die Protoplastenkonzentration wird in einer Zählkammer bestimmt.

b) Konstruktion des Vektors pSS-GSTIIIc und Übertragung in Agro bacterium tumefaciens

Die GSTIIIc-DNA und die Shine-Delgarno-Sequenz wurde als Xbal/BamHl-Fragment aus dem Vektor pET3a-GSTIIIc herausgeschnitten, gereinigt und in das Plasmid Bluescript II Sk +/- (Stratagene, La Jolla, Californien), im folgenden bezeichnet als pBS-SKII, kloniert. Verwendet wurden die Schnittstellen Xbal und BamHl. Anschließend wurde die GSTIIIc-DNA über die Schnittstellen Sstl und Smal aus dem Vektor pBS-SKII-GSTIIIc herausgeschnitten, isoliert und in den Vektor pRT101 (Sstl/Smal linearisiert) ligiert (Töpfer R., Matzeit V., Gronenborn B., Schell J., Steinbiß H.H., (1987) Nucleic Acids Res. 14: 5890).

Danach wurde die GSTIIIc-DNA als EcoRl/Smal-Fragment aus dem Vektor pRT101-GSTIIIc gereinigt und in den Expressionsvektor pSS (EcoRl/Smal linearisiert, Voß A et al, Molec. Breeding 1: 15-26 (1995)) kloniert.

Statt der genannten Vektoren können beliebige andere Expressionsvektoren und intermediäre Vektoren, die entsprechende Schnittstellen aufweisen, ein gesetzt werden, wobei der Fachmann anhand der obigen Angaben eine ge eignete Auswahl leicht treffen kann. Der resultierende intermediäre Vektor pSS-GSTIIIc, der die GSTIIIc-DNA enthält, wird nach Agrobacterium tumefaciens, das eine funktionelle vir-Region enthält, übertragen (Koncz und Schell 1986, van Haute et al. 1983).

c) Transformation von regenerierenden Tabakprotoplasten durch Ko kultur mit Agrobacterium tumefaciens

Es wird im folgenden die Methode von Marton et al. 1979 mit kleinen Veränderungen benutzt. Die Protoplasten werden wie beschrieben isoliert und in einer Dichte von 1-2×10⁵/ml in K3 Medium (0,4 M Saccharose, 0,1 mg/ml NAA, 0,2 mg Kinetin) zwei Tage im Dunkeln und ein bis zwei Tage unter Schwachlicht (500 lux) bei 26°C inkubiert.

Sobald die ersten Teilungen der Protoplasten auftreten, werden 30 µl einer Agrobakteriumsuspension gemäß -b) in minimal A (Am) Medium (Dichte ca. 10⁹ Agrobakterien/ml) zu 3 ml regenerierenden Protoplasten gegeben. Die Kokulturdauer beträgt 3-4 Tage bei 20°C im Dunkeln. Danach werden die Tabakzellen in 12 ml Zentrifugenröhrchen gefüllt, mit Seewasser (600 mOsm/kg) auf 10 ml verdünnt und bei 60×g 10 Minuten lang pelletiert. Dieser Waschvorgang wird noch 1-2× wiederholt, um den größten Teil der Agrobakterien zu entfernen. Die Zellsuspension wird in einer Dichte von 5×10⁴/ml in K3 Medium (0,3 m Saccharose) mit 1 mg/l NAA (Naphthyl-1-essigsäure), 0,2 mg/l Kinetin und 500 mg/l des Cephalosporin-Antibiotikums Cefotaxim kultiviert. Die Zellsuspension wird jede Woche mit frischem K3 Medium verdünnt und der osmotische Wert des Mediums graduell um 0,05 M Saccharose (ca. 60 mOsm/kg) pro Woche reduziert. Die Selektion mit Kanamycin (100 mg/l Kanamycinsulfat (Sigma), 660 mg/g aktives Km) wird 2-3 Wochen nach der Kokultur in Agarose "bead type culture" (Shillito et al. 1983) gestartet. Kanamycin resistente Kolonien können 3-4 Wochen nach Beginn der Selektion vom Hintergrund zurückgebliebender Kolonien unterschieden werden.

d) Direkte Transformation von Tabakprotoplasten mit DNA. Calcium nitrat-PEG Transformation

In einer Petrischale werden ca. 106 Protoplasten in 180 µl K3 Medium mit 20 µl wäßriger DNA Lösung, welche 20 µg Plasmid pSS-GSTIIIc enthält, vorsichtig gemischt. Das Plasmid pSS-GSTIIIc ist nach bekannten Me thoden aus den Plasmiden pET3a-GSTIIIc, pRT101, pBS-SKII und pSS er hältlich. Anschließend werden 200 µl Fusionslösung (0)1 M Calciumnitrat, 0,45 M Mannit, 25% Polyethylenglykol (PEG 6000), pH 9) vorsichtig zugegeben. Nach 15 Minuten werden 5 ml Waschlösung (0,275 M Calciumnitrat pH 6) addiert und nach weiteren 5 Minuten werden die Protoplasten in ein Zentrifugenröhrchen transferiert und bei 60×g pelliert. Das Pellet wird in einer kleinen Menge K3 Medium aufgenommen und wie im nächsten Abschnitt beschrieben kultiviert. Alternativ können die Proto plasten nach Hain et al. 1985 transformiert werden.

e) Kultur der mit DNA inkubierten Protoplasten und Selektion Kanamycin resistenter Kalli

Für die im folgenden beschriebene Kultur und Selektion Kanamycin resistenter Kolonien wird eine modifizierte "Bead Type culture"-Technik (Shillito et al. 1983) verwendet. Eine Woche nach Behandlung der Proto plasten mit DNA (vgl. d) werden 3 ml der Zellsuspension mit 3 ml K3 Medium (0,3 M Saccharose + Hormone; 1,2% (Seaplaque) LMT Agarose (low melting agarose, Marine Colloids) in 5 cm Petrischalen gemischt. Für diesen Zweck wird Agarose trocken autoklaviert und nach Zugabe von K3 Medium im Mikrowellenherd kurz aufgekocht. Nach Erstarren der Agarose werden die Agarosescheiben ("beads") mit den eingebetteten Tabak mikrokalli für weitere Kultur und Selektion in 10 cm Petrischalen trans feriert und je 10 ml K3 Medium (0,3 M Saccharose, 1 mg/l NAA, 0,2 mg/l Kinetin) und 100 mg/l Kanamycinsulfat (Sigma) addiert. Das Flüssigme dium wird jede Woche gewechselt. Dabei wird der osmotische Wert des Mediums stufenweise herabgesetzt.

Pro Woche wird das Austauschmedium (K3 + Km) um 0,05 M an Saccha rose (ca. 60 mOsm) reduziert.

Schema der Selektion kanamycinresistenter Tabakkolonien nach DNA Transformation

f) Regeneration kanamycinresistenter Pflanzen

Sobald die kanamycinresistenten Kolonien einen Durchmesser von ca. 0,5 cm erreicht haben, wird die Hälfte auf Regenerationsmedium (LS-Me dium, 2% Saccharose, 0,5 mg/l Benzylaminopurin BAP) gesetzt und bei 12 h Licht (3000-5000 lux) und 24°C im Kulturraum gehalten. Die andere Hälfte wird als Kalluskultur auf LS Medium mit 1 mg/l NAA, 0,2 mg/l Kinetin, 0,1 mg/l BAP und 100 mg/l Kanamycinsulfat propagiert. Wenn die regenerierten Sproße ca. 1 cm groß sind, werden sie abgeschnitten und auf 1/2 LS Medium (1% Saccharose, 0,8% Agar) ohne Wachstums regulatoren zur Bewurzelung gesetzt. Die Sproße werden auf 1/2 MS-Medium mit 100 mg/l Kanamycinsulfat bewurzelt und später in Erde umgesetzt.

g) Transformation von Blattscheiben durch Agrobacterium tumefaciens

Für die Transformation von Blattscheiben (Horsch et al. 1985) werden ca. 2-3 cm lange Blätter von sterilen Sproßkulturen in Scheiben von 1 cm Durchmesser gestanzt und mit einer Suspension entsprechender Agro bacterien (ca. 10⁹/ml) (vgl. c) in Am-Medium, siehe unten) für ca. 5 Minuten inkubiert. Die infizierten Blattstücke werden auf MS-Medium (siehe unten) ohne Hormone für 3-4 Tage bei ca. 24°C gehalten. Während dieser Zeit überwächst Agrobakterium die Blattstücke. Die Blattstücke wer den anschließend in MS-Medium (0,5 mg/ml BAP, 0,1 mg/ml NAA) ge waschen und auf das gleiche Medium (0,8% Agar) mit 500 µg/ml Cefo taxim und 100 µg/ml Kanamycinsulfat gelegt. Nach zwei Wochen sollte das Medium erneuert werden. Transformierte Kanamycin-resistente Sproße werden nach weiteren 2-3 Wochen sichtbar.

Biochemische Nachweismethode der Transformation Neomycin-Phosphotransferase (NPT II) Enzymtest

NPT II Aktivität in Pflanzengewebe wird durch in situ Phosphorylierung von Kanamycin, wie bei Reiß et al. (1984) beschrieben und von Schreier et al. (1985) modifiziert, wie folgt, nachgewiesen. 50 mg Pflanzengewebe werden in 50 µl Extraktionspuffer (10% Glycerin, 5% 2-Mercaptoethanol, 0,1% SDS, 0,025% Bromphenolblau, 62,5 mM Tris pH 6,8) unter Zusatz von Glaspulver auf Eis homogenisiert und 10 Minuten lang in einer Eppendorfzentrifuge bei 4°C zentrifugiert. 50 µl des Überstandes werden auf ein natives Polyacrylamidgel (145×110×1,2 mm; Trenngel: 10% Acrylamid, 0,33% Bisacrylamid, 0,375 M Tris pH 8,8, Sammelgel: 5% Acrylamid, 0,165% Bisacrylamid, 0,125 M Tris pH 6,8) aufgetragen und über Nacht bei 4°C und 60 V elektrophoretisiert. Sobald der Bromphenolblau-Marker aus dem Gel herausläuft, wird das Gel zweimal mit destilliertem Wasser 10 Min. lang und einmal 30 Min. mit Reaktionspuffer ge waschen (67 mM Tris-Maleat, pH 7,1, 42 mM MgCl₂, 400 mM Ammonium chlorid). Das Gel wird auf eine gleichgroße Glasplatte gelegt und mit 40 ml 1%iger Agarose in Reaktionspuffer, der die Substrate Kanamycinsulfat (20 µg/ml) und 20-200 µCi ³²P ATP (Amersham) enthält, überschichtet. Das Sandwichgel wird 30 min. bei Zimmertemperatur inkubiert und dann wird ein Blatt Phospho zellulosepapier P81 (Whatman) auf die Agarose gelegt. Darüber werden vier Filtrierpapierlagen 3 MM, (Whatman) und einige Papierhandtücher gestapelt. Der Transfer von in situ phosphoryliertem radioaktiven Kanamycinphosphat auf das P81 Papier wird nach 3-4 h gestoppt. Das P81 Papier wird für 30 min. in einer Lösung von Proteinase K und 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 60°C inkubiert und dann 3-4 mal in 250 ml 10 mM Phosphatpuffer pH 7,5 bei 80°C gewaschen, getrocknet und für 1-12 h lang bei -70°C autoradiografiert (XAR5 Film Kodak).

Alle Prozentangaben in den obigen sowie den weiter unten folgenden Beispielen beziehen sich auf Gewichtsprozente, wo nichts anderes angegeben wird.

In den gemäß den obigen sowie Beispielen erhaltenen Pflanzenzellen und Pflanzen wurde die Anwesenheit der GSTIIIc-DNA durch Southern Blot Analyse bestätigt. Die Expression der GSTIIIc-DNA wurde durch Northern Blot Analyse und We stern Blots mit Hilfe von spezifischen Antikörpern nachgewiesen.

Im folgenden werden einige der bei der Transformation von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen eingesetzte Medien beschrieben:
Am-Medium
3,5 g K₂HPO₄
1,5 g KH₂PO₄
0,5 g Na₃ Citrat
0,1 g MgSO₄×7H₂O
1 g (NH₄)₂SO₄
2 g Glukose
ad 1

Medium für sterile Sproßkultur von Tabak

K3-Medium

Zur Kultur von Nicotiana tabacum petit Havana SR1, Nicotiana tabacum Wiscon sin 38, und Nicotiana plumaginifolia Protoplasten (Nagy und Maliga, 1976)

Linsmaier und Skoog Medium (Linsmaier und Skoog 1965)

Zur Kultur von regenerierenden Protoplasten und für Gewebekultur von Tabak tumoren und Kallus. Linsmaier und Skoog (LS) Medium ist Murashige und Skoog Medium (Murashige und Skoog, 1962) mit den folgenden Modifikationen:

- Thiamin wird in höherer Konzentration eingewogen 0,4 mg/l anstatt 0,1 mg/l;
- Glycin, Pyridoxin und Nicotinsäure fehlen.

Zur Transformation von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen kann die folgende Literatur angeführt werden:
Fraley R.T., Rogers S.G., Horsch R.B., Sanders P.R., Flick J.S., Adams S.P., Bittner M.L., Brand L.A., Fink C.L., Fry J.S., Fallupi G.R., Goldberg S.B., Hoffmann N.L., Woo S.C. (1983). Expression of bacterial genes in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803-4807.
Fromm ME, Taylor LP, Walbot V (1986) Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation. Nature 319: 791-793
Hain, R., Stabel, P., Czernilofsky, A.P., Steinbiß, H.H., Herrera-Estrella, L., Schell, J. (1985) Uptake, integration, expression and genetic transmission of a selectable chimeric gene by plant protoplasts. Mol. Gen Genet 199: 161-168
Hernalsteens JP, Thia-Tong L, Schell J, Van Montagu M (1984) An Agrobac terium-transformed cell culture from the monocot Asparagus officinalis. EMBO J 3: 3039-3041
Herrera-Estrella L., De Block M., Messens E., Hernalsteens JP., van Montagu M., Schell J. (1983) EMBO J. 2: 987-995.
Horsch RB, Fry JE, Hoffmann NL, Eichholtz D, Rogers SG, Fraley RT (1985) A simple and general method for transferring genes into plants. Science 277: 1229-1231
Krens FH, Molendÿk L, Wullems GJ, Schilperoort RA (1982) In vitro transfor mation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA. Nature 296: 72-74
Koncz C, Schell J (1986) The promotor of T_L-DNA gene 5 controls the tissue specific expression of chimaeric genes carried by a noval type of Agrobacterium linary vector. Mol. Gen. Genet. (1986) 204: 338-396
Linsmaier DM, Skoog F (1965) Organic growth factor requirements of tobacco tissue cultures. Physiol Plant 18: 100-127
Marton L, Wullems GJ, Molendÿk L, Schilperoort PR (1979) In vitro transfor mation of cultured cells from Nicotiana tabacum by Agrobacterium tumefaciens. Nature 277: 1229-131
Nagy JI, Maliga P (1976) Callus induction and plant regeneration from mesophyll protoplasts of Nicotiana sylvestris. Z Pflanzenphysiol 78: 453-455
Paszkowski J, Shillito RD, Saul M, Mandak V, Hohn T, Hohn B, Potrykus I (1984) Direct gene transfer to plants. EMBO J 3: 2717-2722
Shillito RD, Paszkowski J. Potrykus I (1983) Agarose plating and Bead type culture technique enable and stimulate development of protoplast-derived colonies in an number of plant species. Pl Cell Rep 2: 244-247 Van den Elzen PJM, Townsend J, Lee KY, Bedbrook JR
Van den Elzen PJM, Townsend J, Lee KY, Bedbrook JR (1985) A chimaeric resistance gen as a selectable marker in plant cells. Plant Mol. Biol. 5, 299-302.
Velten J, Velten L, Hain R, Schell J (1984) Isolation of a dual plant promotor fragment from the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J 12: 2723-2730
Van Haute E, Joos H, Maes M, Warren G, Van Montagu M, Schell J (1983) Intergenic transfer and excharge recombination of restriction fragments clones in pBR 322: a novel strategy for the reversed genetics of Ti plasmids of Agrobac terium tumefacines. EMBO J 2: 411-418.
Zambryski P, Joos H, Genetello C, van Montagu M, Schell J (1983) Ti-plasmid vector for the iritroduction of DNA into plant cells without altering their normal regeneration capacity, EMBO J 12: 2143-2150.
Reiss, B., Sprengel, Will H., and Schaller H (1984) A new sensitive method for qualitative and quantitative assay of neomycin phosphotransferase in crude cell tracts, GENE 1081: 211-217
Schreier P.H., Seftor E.A., Schell J. and Bohnert H.J. (1985) The use of nuclear encoded sequences to direct the light-regulated synthesis and transport of a foreign protein into plant chloroplasts, EMBO J Vol. 4, No. 1: 25-32

Weiterhin können die folgenden veröffentlichten Patentanmeldungen aufgeführt werden:
EP-A 116 718
EP-A 159 418
EP-A 120 515
EP-A-120 516
EP-A-172 112
EP-A-140 556
EP-A-174 166
EP-A-122 791
EP-A-126 546
EP-A-164 597
EP-A-175 966
WO 84/02913
WO 84/02919
WO 84/02920
WO 83/01176

Die erhöhte Resistenz der erfindungsgemäßen transformierten Pflanzen sei anhand des folgenden Beispiels erläutert:

Nachweis der erhöhten Resistenz von transformierten Pflanzen:

Zur Prüfung der erhöhten Resistenz gegenüber herbizid wirkenden Herterooxyacet amiden wird die Schädigung der erfindungsgemäß transformierten Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bestimmt. Als Testherbizid wird die Verbindung (5-Trifluormethyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl-oxy-essigsäure-N-isopropyl-N--(4-fluorphenyl) amid eingesetzt.

Samen der F1-Generation der transformierten Pflanzen werden im Gewächshaus auf Landerde mit 3% Humusanteil in Töpfe (d = 11 cm) ausgelegt. Die Anzucht der Pflanzen erfolgt bei einer Temperatur von 23°C und einer relativen Luftfeuchte von 70-80%. Die Behandlung mit der oben genannten herbiziden Verbindung, formuliert als 70 WP (wettable powder), erfolgt 24 Stunden nach dem Auslegen der Samen mit Konzentrationen die einer Aufwandmenge von 2000-4000 g Wirkstoff/ha entsprechen.

Die Auswertung erfolgt 20 Tage nach der Behandlung mit Herbizid. Bonitiert wird der prozentuale Gesamtschaden an transgenen Pflanzen im Vergleich zu ent sprechenden Kontrollpflanzen, die mit der gleichen Wirkstoffkonzentration be handelt wurden.

Die transformierten Tabakpflanzen, in die die erfindungsgemäße GSTIIIc-DNA eingesetzt wurde, zeigen eine deutlich erhöhte Resistenz gegenüber hohen Auf wandmengen von des Herbizides (2000-4000 g/ha) im Vergleich zu nicht trans formierten entsprechenden Kontrollpflanzen.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. DNA (Desoxyribonukleinsäure), welche für das Protein Glutathion-S-Trans ferase IIIc (GSTIIIc) gemäß SEQ ID NO: 2 oder eine davon abgeleitete Proteinsequenz kodiert (GSTIIIc-DNA).

2. DNA gemäß Anspruch 1, welche die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine davon abgeleitete Sequenz aufweist.

3. DNA gemäß Anspruch 1, welche die Sequenz der GSTIIIc-DNA, die auf dem Vektor Plasmid pET3a-GSTIIIc enthalten ist oder eine davon abge leitete Sequenz aufweist.

4. DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, welche in Form eines DNA-Doppel stranges vorliegt, der die DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 und einen dazu komplementären DNA-Strang enthält.

5. DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, bei welcher am 5′-Ende der kodierenden Sequenz ein in Pflanzen wirksamer Promotor vorgeschaltet ist.

6. DNA gemäß Anspruch 5, wobei als Promotor der CaMV 35S-Promotor oder der aus dem CaMV 35S Enhancer und dem CaMV 35S Promotor zusammengesetzte CaMV 35S Doppelpromotor verwendet wird.

7. DNA gemäß Anspruch 5, welche ein Konstrukt aus der GSTIIIc-DNA und dem CaMV 35S Doppelpromotor darstellt, wie es auf dem Vektor Plasmid pSS-GSTIIIc vorliegt.

8. Rekombinante prokaryontische oder eukaryontische DNA, welche die DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 enthält.

9. Rekombinante DNA, die in Pflanzen oder Pflanzenzellen enthalten ist und die DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 enthält.

10. Vektoren, welche die DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 oder die rekom binante DNA gemäß den Ansprüchen 8 und 9 enthalten.

11. Vektor-Plasmide pET3a-GSTIIIc und pSS-GSTIIIc.

12. Transformierte Mikroorganismen, welche die DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 oder die rekombinante DNA gemäß den Ansprüchen 8 und 9 ent halten.

13. Escherichia coli Stamm DS pET3a-GSTIIIC (gemäß. DSM 9677) sowie seine Mutanten, welche noch die für die Ausführung der Erfindung wesent lichen Merkmale aufweisen.

14. Transgene Pflanzen (einschließlich Teile dieser Pflanzen sowie deren Ver mehrungsmaterial, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli, Samen, Knollen oder Stecklingen usw.), die in ihrem Genom die DNA gemäß den An sprüchen 1 bis 7 zusätzlich zur DNA der entsprechenden nicht transgenen Pflanzen enthalten.

15. Transgene Pflanzen gemäß Anspruch 14, welche in ihrem Genom die DNA gemäß. Anspruch 6 enthalten.

16. Transgene Pflanzen gemäß Anspruch 14, welche in ihrem Genom die DNA gemäß Anspruch 7 enthalten.

17. Transgene Pflanzen gemäß den Ansprüchen 14 bis 16, welche einen Gehalt an Glutathion-S-Transferase IIIc (GSTIIIc) gegebenenfalls in der dimeren Form aufweisen.

18. Transgene Pflanzen gemäß den Ansprüchen 14 bis 17, welche im Vergleich zu den entsprechenden nicht transgenen Pflanzen, eine erhöhte Resistenz gegen Herbizide, insbesondere gegenüber Heterooxyacetamid-Herbiziden, aufweisen.

19. Verwendung der DNA gemäß Ansprüchen 1 bis 7 und/oder der rekom binanten DNA gemäß den Ansprüchen 8 und 9 und/oder der Vektoren gemäß den Ansprüchen 10 und 11 und/oder der transformierten Mikro organismen gemäß den Ansprüchen 12 und 13 zur Erzeugung von trans genen Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflanzen (einschließ lich Pflanzenteilen und Samen).

20. Verfahren zur Herstellung der transgenen Pflanzen gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) die DNA gemäß Anspruch 1 und/oder die rekombinante DNA ge mäß Anspruch 8 in den Genom von Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) einsetzt und gegebenenfalls
(b) aus den transgenen Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) voll ständige transformierte Pflanzen regeneriert und gegebenenfalls ver mehrt und gegebenenfalls
(c) von den so erhaltenen transgenen Pflanzen der Elterngeneration oder weiterer daraus gewonnener Generationen die gewünschten Pflan zenteile (einschließlich Vermehrungsmaterial) gewinnt.

21. Verwendung der transgenen Pflanzen gemäß Anspruch 14 zur Erzeugung von Vermehrungsmaterial sowie zur Erzeugung neuer Pflanzen, die die DNA gemäß Anspruch 1 oder die rekombinante DNA gemäß Anspruch 8 enthalten und deren Vermehrungsmaterial.

22. Verwendung von DNA, welche ganz oder teilweise der GSTIIIc-DNA ent spricht, die auf dem Plasmid pET3a-GSTIIIc enthalten ist oder welche ganz oder teilweise der SEQ ID NO: 1 entspricht, als Sonde zum Nachweis des Gehaltes an GSTIIIc-DNA oder ihrer Bestandteile in einer DNA, die auf diesen Gehalt untersucht werden soll.

23. Verwendung der für das Protein GSTIIIc gemäß SEQ ID NO: 2 ko dierenden DNA zur Erzeugung von transgenen Pflanzen, welche im Ver gleich zu den entsprechenden nicht transgenen Pflanzen, eine erhöhte Re sistenz gegenüber Herbiziden, insbesondere Heterooxyacetamid-Herbiziden, aufweisen.

24. Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder einer da von abgeleiteten Sequenz.

25. Protein gemäß Anspruch 24 in der dimeren Form.