JPH03504798A - 植物類においてリジン過剰生産を誘導する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １５、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＤＨＤＰＳ）をＷ　用する生合成経路 によって遊離し一リジンを生産し、該ＤＨＤＰＳが、（ａ）外来性遺伝子の産物 ａであり、かつ（ｂ）内因的に生産される遊離し一リジンによるフィードバック 抑制に対し実質的に耐性である形質転換植物。

１６、該外来性ＤＨＤＰＳ遺伝子が細菌遺伝子である請求の範囲第１５項記載の 形質転換植物。

１７、該外来性遺伝子がエシェリヒア・コ！Ｊ　ｄ　ａ　ｐ　Ａ遺ｒＥ子”ある 請求の範囲第１６項記載の形質転換植物。

１８、　遊離Ｌ−ＩＩリジンレベノにが同一種の非形質転換植物におけるレベル の少なくとも約５０倍高い請求の範囲第１５項記載の形質転換植物。

１９、遊離し一リジンによるフィードバック抑制に対し実質的に耐性であるジヒ ドロジピコリン酸シンターゼ（ＤＨＤＰＳ）についてフード付けする遺伝子より なり、該遺伝子が、その５°−末端にて、アミノ末端葉緑体トランジットペプチ ド（ＣＴＰ）をコード付けする第２のＤＮＡ配列に正しい読み枠で連結し、かつ 該ＤＨＤＰＳ遺伝子および該第２のＤ　Ｎ　Ａ配列が、植物細胞で機能的な調節 領域の転写および畦訳誠節制御下にある発現カセット。

２０、該ＤＨＤＰＳ遺伝子が細菌遺伝子である請求の範囲第１９項記載の発現カ セット。

２１、該遺伝子がエシェリヒア・コ’ＩｄａｐＡ遺伝子である請求の範囲第２０ 項記載の発現カセット。

２２、該カセットが少なくともｌのＴ−ＤＮＡを有する請求の範囲第１９項記載 の発現カセット。

２３、さらに、植物細胞で選択可能な機能をコード付けする遺［云子よりなる請 求の範囲第１９項記載の発現カセット。

２４、約５キロベース未満よりなる請求の範囲第１９項記載の発現カセット。

２５、約２〜３キロベースよりなる請求の範囲第２４項記載の発現カセット。

２６、請求の範囲第１９項記載の発現カセットよりなる、エシェリヒア・フリお よびアグロバクテリウム・チュメフ７シエンス（Ａ。

ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のうち少な（ともｌで復製可能なプラスミド。

明細書 植物類においてリジン過剰生産を誘導する方法発明の背景 遺伝子移入技術における最近の進歩により、所望の特性を植物類に導入する新し い可能性が開けた。宿主植物に環境ストレスに対する保護を多少付与するために 、多数のかかる遺伝子が導入されてきた。例としては、グリフｔセード（ｇｌｙ ｐｈｏｓａｔｅ）（コマイ（Ｃｏｎａｉ）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、　 　３１ヱ、７４１〜７４４　（１９８５）およびシャー　（Ｓｈａｈ）、サイエ ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　　２３３．　４７８〜４８１（１９８６））、ホス フィノドリチン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｉ）　（デ・ブロック（Ｄｅ 　Ｂｌｏｃｋ）、ＥＭＢｏ、６．２５１３〜２５１８（１９８７））、ブロモキ シニル（スタルカー（Ｓｔａｌｋｅｒ）、　　１９８７．国際特許出願ＰＣＴ／ ＵＳ１０ＯＯ４４）、　およびスルホニルウレア類（ホーグン（Ｈａｕｇｈｎ） 、モレキユラー・アンド・ジェネラル・ジエ不テイノクス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇ ｅｎｅｔｊ、　２上ユ、２６６〜２７１　（＋９８８））のごとき化学除草剤： ；対する耐性モ付与する遺伝子が含まれる。ある種の害虫（アダング（Ａｄａｎ ｇ）、　　１９８５．公開欧州特許出願１４２９２４号およびベック（Ｖａｅｃ ｋ）、　　ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、　　３２８゜３３〜３７（１９８７ ））、菌類病（ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）、モレキユラー・アンド・ジェネラル ・ジェ不ティノクス（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　）。

およびネルフン（Ｎｅｌｓｏｎ）、バイオテクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ １．　）。

６．４０３〜４０５　（１９８８）に耐性なトランスジェニック植物も設計され てきた。

もう１つの興味ある分野は価値ある特性が付加された植物、特に作物植物のデザ インである。かかる特性の例は食料作物における栄養品質の改善である。ヒトお よび単画の動物の食物における必須のアミノ酸であるリジンはほとんどの禾穀類 における３種の最も限定的栄養素の中にある。その結果、穀物、大麦、小麦、米 、トウモロフン、雑穀、ツルガム等のごとき穀実ヘースの食物にはかなり高価な 合成リジンまたはリジンを含量、する油料種子蛋白荒粉を補足しなければならな い。これらの穀実また：よいずれかの飼料成分作物のリジン含有量を増加させる と、価値がかなり付加される。今日まで、植物におけるリジンレベルを高める試 みは通常の育種方法、およびより最近では、突然変異誘発および細胞培養技術に 依存してきた。

トウモロコシ（メルフ（Ｍｅｒｔｚ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　　１ ４５゜２７９（１９６４）およびネルフン（Ｎｅｌｓｏｎ）、サイエンス（Ｓｃ ｉｅｎｃｅ）。

および穀実ツルガム（シンら（Ｓｉｎｇｈ）、　　クロップ・サイエンス（Ｃｒ ｏｐＳｃｉ、）、１３，５３５〜５３９　（１９７３）の天然に生じる高リジン 突然変異体が同定されている。各々の場合において、リジン含量の改良は遊離リ ジン生産の増加ではなく穀実の総蛋白プロフィールにおけるシフトに由来するも のであり；リジン欠損胚乳蛋白（プロラミン類）レベルの低下は、リジン富化蛋 白（アルブミン類、グロブリン類およびグロブリン類）レヘルの上昇によって補 足されている。栄養的には優れるが、これら−の突生変異体：ｉ収率の低下およ び穀類品質の貧化を伴い、その農学的有用性を限定する。

栄養品質を改良するのに用いる別法アプローチは、上昇した遊離リジンプールを 有する生物化学的品種のｉｎ　ｖｉｔｒｏ選抜であった。ＩＪリジン高等植物お よび微生物（第１図参照）におけるアミノ酸の「アスパラギン酸族」のメンバー である。従って、その生合成の調節は該層の他のメンバー：スレオニン、メチオ ニンおよびインロイシンのそれに密接に関係する。代謝産物の流れの調節はキイ となる酵素工程における最終産物フィードパ・ツク抑制を主として通じるようで ある。これらの工程の最初、すなわちアス／（ラギン酸キナーゼ（ＡＫ）によっ て触媒されるアスパルテートのリン酸化はすべての４種の最終産物に共通である 。調節の第２の箇所は、分岐点反応ニジヒドロジピコリン酸を形成するピルベー トとアスノくルチルセミアルデヒドとの縮合にある。この反応はリジンの生合成 までの最初（二特有なものであり、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＤＨＤＰ Ｓ）、すなわち調査された植物類におけるリジンによって強くフィードバック抑 制されることが示されて、いる酵素によって触媒される（ウォルスグローブろＵ ａｌｌｓｇｒｏｖｅ　ｅｔ　ａｌ）、フィトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｔ ）、２０．２６５１〜１６５５（１９８１）、およびり７／＜イザル（Ｋｕｍｐ ａｉｓａｌ）、プラント・フィジオロジ−（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）。

旦、１４５〜１５１　　（１９Ｂ？））。

ＡＫの１を越える形態の存在を示唆する証拠がある（ミツリン（ＭｉＨｉｎ）、 　　１９８０．ザ・バイオケミストリー・オブ・ブラソフ（Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈ ｅｇ＋１ｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ）、　　５巻、アミノ・アシノズ°アン ド・デリバテイプズ（Ａａ＋ｉｎｏ　Ａｃ１ｄｓ　ａｎｄ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖ ｅｓ）、　　スタンプおよびコン（Ｓｔｕｍｐｆ　ａｎｄ　Ｃｏｎｎ）ｆｉ、　 　４２０〜４２６頁、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ） ）。ｌの形態はスレオニンによる抑制に対して感受性であり、池の形態はリジン による抑制に対して感受性である。植物細胞培養の増殖は等モル量のリジン＋ス レオニンの存在下で抑制される。この抑制はメチオニンまたは（容易にメチオニ ンに変換される）ホモセリンの添加によって逆行され得る（グリ８２７〜８３０ 　（１９７４））、−ヒノバード（Ｈｉｂｂｅｒｄ）は、（ブランク（Ｐｌａｎ ｔａ）、　上土旦、１８３〜１８７（１９８０））、この増殖抑制に耐性のトウ モロコシカルスの安定な系を選抜した。これらの系はスレオニンを過剰生産（６ 〜９倍）し、より低い程度だがメチオニン、リジンおよびインロイシンを過剰生 産した（２〜４倍）。リジン−耐性ＡＫが観察された変化の原因であるという証 拠が存在した。完全な稔性植物に再生された系において、過剰生産は安定な遺伝 性特性であった（ヒノバード：）（Ｈｉｂｂｅｒｄ　ｅｔ　ａｌ）、　ＰＮＡＳ 、ヱ旦。

５５９〜５６３　（１９８２））。同様な選抜がタバコ（プルギン（Ｂｏｕｒｇ ｉｎ）、　　１９８２＋　パライアビリティ・イン・ブランク・り一ジェネレイ テソド・フロム・ティシュ−・カルチャー（Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙｉｎ　Ｐｌ ａｎｔｓ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ ）、イールおよびデマルリイ（Ｅａｒｌｅ　ａｎｄ　Ｄｅｍａｒｌｙ）！、１６ ３〜１７４頁、ブレガー（Ｐｒａｅｇｅｒ）、二ニーヨーク）、大麦（アルダ（ Ａｒｒｕｄａ）、プラント・フィジオロジ−（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、） 、７６、　４４２〜４４６（１９８４ン）、およびニンジン（カトワーレイ不ル ッ（Ｃａｔｔｏｉｒ−Ｒｅｙｎａｅｒｔｓ）、ビオ−ミー・ラント・フィジオロ ギー・イル・７ランツニン（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｈｙｓｉｏｌ、Ｐｆａｎ ｚｅｎ）、　　ｌ　７８．　８１〜９０　（１９８３）　）について行われてい る。

リジンアナログ類、特に５（２−アミノエチル）−システィン（ＡＥＣ）は、単 独またはりジン＋スレオニン選択いずれかにおいて、リジン過剰生産突然変異体 を単離する試行において用いられてきた。サノら（Ｓａｎｏ　ｅｔ　ａｌ）は、 （ジヂーナル・オブ・ジエン・アブルー？イクロバイオル（Ｊ、Ｇｅｎ、Ａｐｐ ｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）、　　１６．　３７３〜３９１　（１９７０））　 、ＡＥＣ選択を用いて高リジン細菌突然変異体を単離することができ、ＡＥＣは ＡＫまたはＣＨＤＰＳあるいは双方の偽フィードバック抑制物質として作用する と提唱した。ウィドホルム（Ｗｉｄｈｏｌｍ）は、（カナディアン・ジャーナル ・オブ・ボタニー（Ｃａｎ、Ｊ、Ｂｏｔ、）、３４．１５２３〜１５２９（１９ ７６）、タバコ浮遊細胞を突然変異誘発し、リジン８１０倍過剰生産する一Ａ　 Ｅ　Ｃ耐性細胞を選抜した。リジンを５〜７１告過剰生産するトウジンビニ突然 変異体が単離された（ボイエスろ′Ｂｏｙｅｓ　ｅｔ　ａｌ）、　プラント・サ ンエンス（Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、）、　　ｉ５０．−１９５〜２０３（１９８７ ））ニブライト（Ｂｒｉｇｈｔ）は、（ブランク（Ｐｌａｎｔａ）、　　１４６ ，６２９〜６３３（１９７９）、ＡＥＣの不存在下でリジンを蓄積せず、ＡＥＣ 摂取突然変異体であることが示されたＡＥＣ−耐性大麦系を選抜した。

また、ＡＥＣはリジン生合成に干渉するよりもむしろ蛋白類に取り込まれること によって、その抑制効果を発揮する証拠がある。シｆファーら（Ｓｃｈａｅｆｆ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、（プラント・フイジオロジ−（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ 、）、　　８４．　５０９〜５１５　（１９８７）　、系列的ＡＥＣおよびリジ ン＋スレオニン選択を適用して、種子貯蔵蛋白中に１４％の高いが、遊離リジン よりは高くはないリジンを有する米突然変異体を得た。ＡＥＣ抵抗性ジャガイモ 培養はジャコブセン（Ｊ　ａｃｏｂｓｅｎ）（ジャーナノいオブ・プラント・フ ィジオロジ−（Ｊ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　）。

１２３．２０７〜３１５（１９８６））によって選択され１こ。この突然変異体 は対照培養よりも高い総アミノ酸レベルを有していたが、これはリジン、スレオ ニンまたはメチオニンの過剰生産によるものではなかった。ネグルティ（Ｘｅｇ ｒｕｔｉｕ）Ｉ、（セアレテイカル・アンド・アプライド・ジェネティノ人（Ｔ ｈｅｐｒ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、）、　　６旦。

１１〜２０（１９８４））、タバコのプロトプラストを突然変異誘発、続いてＡ ＥＣ選択に付した。１０〜３０倍リジンを過剰生産する２種の抵抗性細胞系が得 ちれている。生物化学的および遺伝子分析により、フィードバック−非感受性Ｄ ＨＤＰシンターゼが明らかとされた。該特性は単一の支配的遺伝子として引き継 がれた。

従来、ＤＮＡ組換えおよび遺伝子移入技術は植物において価値を付加するために 代謝物生産の増大の領域に適用されたことがない。

しかしながら、細菌エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ） は高等植物と実質的に同一の経路によってリジンを合成する。ジヒドロピコリン 酸シンターゼはイー・コリのｄａｐＡ遺伝子によってコード付けされ、リジンに 対して感受性であり（ユガリら（Ｙｕｇａｒｉ　ｅｔａｌ）、ビオシミ力・工・ ビウフィジ力・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｏ＋、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、）、　　６２．　６１２〜６１４（１９８２））、それは植物から単 離された同一酵素と比較してｉｎ　ｖｉｔｒｏリジンによる抑制に対して２００ 倍感受性が低い。さらに、マルチコピープラスミド上にｄ　ａ　ｐ　、Ａ、遺伝 子を担持するイー・フリ細胞は”、高レベルの遊離リジンを蓄積しくダウスール レベランド（Ｄａｕｃｅ−ＬｅＲｅｖｅｒａｎｄ）、ユーロピーア７−ジャーナ ル・オブ・アプライド・マイクロバイオロジカル・バイオテクノロジー（Ｅｕｒ 、Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、）、　　１５． 　２２７〜２３１（１９８２））、これはＤ　ＨＤ　Ｐ　Ｓ　り（律速段階を触 媒することを示唆する。該遺伝子の配列は決定され、特徴付けられている（リシ ャウド（Ｒｉｃｈａｕｄ）、ジャーナル・オブ・バタテリオロジー（」。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、１６６．２９７〜３００（１９８６））およびグラス マン（ＧＩａｓｓａ＋ａｎ）、　　１９８８．エム・ニス・セイス（Ｌ　Ｓ、　 Ｔｈｅｉｓ）、ミネソタ大学、ミネアポリス、ミネソタ州）。

かなり高レベルのリジンを蓄積する植物を容易に得るための通常の育種および組 織培養技術の相対的無能性を考慮すると、Ｄ　Ｎ　Ａ組替えおよび遺伝子移入技 術を適用してかかる植物を作出する必要がある。

発明の要約 本発明は、（ａ）外来性遺伝子を植物組織源の細胞に導入し、次いで（ｂ）該外 来性遺伝子を該細“堕で発現させることよりｔす、ここに、該外来性遺伝子が、 内因的に生産された遊離リジンによるフィードパ、り抑制に対して実質的に耐性 であるジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＤＨＤＰＳ）をフード付けするＤＮＡ 配列よりなることを特徴とする植物において遊離し一リジンのレベルを実質的に 増大させる方法を提供する。本発明の方法の実施において、該外来性遺伝子は該 ＤＨＤＰＳ　　ＤＮＡ配列の５°−末端に連結し、かつ葉緑体トランジット（ｔ ｒａｎｓｉｔ）ペプチド（ＣＴＰ）をコード付けする第２のＤＮＡ配列よりなる 。該ＣＴＰは該ＤＨＤＰＳを、遊離し一リジンの生合成を促進させるよう作用で きる該細胞の葉緑体中に局在化させる。

従って、また、本発明は、内因性リジンによるフィードバック抑制に対し実質的 に耐性であるＤＨＤＰＳの形態を発現する外来性遺伝子の導入によって形質転換 された植物細胞を提供する。広範囲の植物組織源を完全な植物体に再生できる技 術は公知であるので、また、本発明の方法：ヱ、ＤＨＤＰＳを用いる生合成経路 によって遊離Ｌ−リジンを生産する形質転換ｔｉｌ物を提供するものでめ５）、 ここに、該Ｄ）ＩＤＰｓは外来性（外因性）遺伝子の産物であって、内因的に生 産されたリジンによるフィードパ・Ｉり抑制に対して実質的に耐性である。本発 明の方法によって形質転換された好ましい植物：よ、前記列挙のごときイネ科植 物種を含む。かかる形質転換植物の食用部分は、同一種の非形質転換植物におけ るリジンレベルよりも少なくとも約５０倍高い遊１ｉ１１Ｌ−リジンレベルを有 スる。

植物細胞を形質転換するのに用いる外来性遺伝子は、好ましくは、実質的にフィ ードパ・、り抑制に耐性なりＨＤＰＳについてコード付けする遺伝子またはその 酵素的機能性断片よりなるキメラ遺伝子発現カセットである。また、該発現カセ ットはアミノ末端葉緑体トランジット配列（ＣＴＳ）をコード付けする第２のＤ 　Ｎ　Ａ配列よりなる。該ＤＨＤＰＳ遺伝子または遺伝子断片はＣＴＳ遺伝子に 対するその５°末端にて正しい読取枠にて連結される。外来性遺伝子は、好まし くは、漂的植物細胞で機能する鍔部領域の転写および翻訳制御下にある。かかる 領域はアグロバクテリウム・チニメファンエンス（Ａ、　Ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ ｓ）のＴｉまたｉｔＲｉプラスミド、例えば、−Ｔ−ＤＮＡ−のセグメントによ って植物細りに移入されたＤ　Ｎ　Ａ配列かる得られる。例えば、有用な転写開 始領域は、オクトビンシンターゼ、ツバリンシンターゼまたはマンノビンシンタ ーゼをコード付けするＴｉまたはＲｉプラスミド遺伝子から単離できる。該発現 カセットは、好ましくは、さろに、形質転換細胞、およびそれに由来する植物が 容易に同定できるように、薬剤または除草剤耐性のごとき、植物細胞で選択可能 な機能をコード付けする遺伝子よりなる。

さらに、本発明の具体例は、本発明の発現カセットを取り込むプラスミドのごと き発現ベクターよりなり、該プラスミドはイー・コリまたはアグロバクテリウム のごとき細菌にて廣製が可能なものである。該外来性遺伝子は、電気穿孔、マイ クロインジェクシ誓ン、マイクロプロジェクティール注入により、またはリポソ ームのカプセル化を介するごとき方法！＝よって植物細胞のゲノムに「裸の−Ｄ 　Ｎ　Ａとして導入することができる。また、外来性遺伝子を取り込むプラスミ ドはアグロバクテリウム・テニメファシエンス媒介形質転換によって植物細胞の ゲノム（：、−組み込むことができる。

遺１云子または遺伝子断片に関して本明細書中で用いるごとく、−外来性！なる 語は、該遺伝子または遺伝子断片が、そこで最後に発現される植物種のゲノム以 外の１またはそれ以上の源から得ら（することを意味する。該源は天然のもので あり得、例えば、該遺伝子は細菌、酵母、菌類等、あるいは異なる植物種のごと きもう１つの生きた源から得られる。機能的ＤＨＤＰＳをフード付けする遺伝子 の好ましい源はイー・コリｄａｐＡ遺伝子である。該源は合成のものでもある得 、例えば、該遺伝子または遺伝子断片は化学合成によってｉｎ　ｖｉｔｒｏにて 調製できる。

植物細胞に導入された外来性遺伝子または遺伝子断片に関して本明細書中で用い るごとく、［発現−なる語は、遺（云子によってコード付けされる産物、例えば ＤＨＤＰＳのごとき酵素が細胞内で機能的形態で生産されるように、当該遺伝子 が安定に細胞のゲノムに組み込まれることを意味する。例えば、Ｄ　ＨＤ　Ｐ　 Ｓの機能的形９はリジンの内因性生合成における段階を触媒する。

内因性リジンによるＤＨＤＰＳ−のフィードパｌり抑制に関して本明細書中で用 いるごとく、「実質的に耐性どなる語は、植物が、ＤＨＤＰＳを合成しない同一 種の植物によって蓄積されるより実質的に過剰にリジンを蓄積し、そのように耐 性な程変まで、ＤＨＤＰＳが内因性レジンの存在下で機能性を維持することを意 味する。例えば、本発明の方法で得みれる新規植物は、未変性ＤＨＤＰＳのみを 含有する同種植物の少なくとも約１０倍、好ましくは、少なくとも約５０倍、例 えば約５０〜２５０　（＠高い抽出可能なリジンレベルを持つ。さらに、遊離リ ジンは変化された特定の植物種に毒性なレベルでは存在しない。また、「形質転 換された」という植物細胞または植物はそのゲノムに安定に、機能的に、かつ受 は継ぎ可能に組み込まれた外来性遺伝子または遺（云子断片を有する。

図面の簡単な記載 第１図はリジン生合成経路の模式図であり、以下の文字：ま以下の酵素ヲ示す： ａ・・・アスパラギン酸キナーゼ：ｂ・・・アスパルチル−セミアルデヒドデヒ ドロゲナーゼ：Ｃ・・ンヒドロジビコリン酸シンターゼ；ｄ・・・ジヒドロジピ コリン酸ルダクターゼ：ｅ・・・スク／ニルオ牛ソアミノビメリン酸シンターゼ ：ｆ・・・スクシニルジアミノビぜリン酸アミントランスフェーゼ：ｇ・・・ス クシニルジアミノピメリン酸デスクシニラーゼ；ｈ・・・ジアミノビメラート： および１・・・メソーノアミノジピメリン酸デカルボキシラーゼ。

第２図は実施例１に記載したごときｄａｐＡ遺伝子の操作を概略本発明は上昇し たレベルの遊離リジンを生産する穀実のごとき植物を得るための新規な方法に関 する。過剰生産はジヒドロジピコリン酸（ＤＨＤＰ）シンターゼ、すなわち植物 および細菌双方におけるリジンの生合成での分岐点酵素をコード付けする細菌遺 伝子の導入および導入された当該遺伝子の発現によってもたらされる。未変性植 物ＤＨＤＰシンターゼはＬ−リジンによるフィードパｌり抑制に対し高度に感受 性であり、該経路の調節のキイとなる箇所を構成する。対照的に、エシェリヒア ・コリから単離されたＤＨＤＰ／ンターゼ：ま少なくとも２００倍高レベルのし 一リジンの存在下で活性である。

植物で高レベルの遊離リジンの蓄積を得るためのリジン耐性ＤＨＤＰシンターゼ をコード付けする遺伝子の導入目的では、長くかつ複雑な鎖事件が起こる。

まず、細ｍＤＨＤＰシンターゼ遺伝子をｉｎ　ｖｉｔｒｏで修飾して植物細胞で の遺伝子発現に必要な調節シグナルを包含させなければならない。植物における リジン生合成経路は葉緑体に隔離されているので、該細菌遺伝子は、好ましくは 、遺伝子産物をこれらのオルガネラに導（ためには、アミノ末端葉緑体トランジ ットペプチド配列をフード付けする配列を付加するように修飾する。

リジンの生合成を変更させるためには、遺伝子を植物細胞に導入し、これらの形 質転換細胞が同定されなければならない。また、該遺伝子は植物細胞ゲノムに安 定に組み込まれなければならない。遺伝子の転写シグナルは植物細胞で認識され なければなろず、かつそこで機能しなければならない。すなわち、該遺伝子はメ 、センジャ−ＲＮＡに転写され、該ｍＲ，ＮＡ−は植物の核において安定で、か つ翻訳のために細胞質まで無傷で輸送されなければなるない。該遺伝子は植物細 胞リポソームによって認識されかつ適当に翻訳されるべく適当な翻訳シグナルを 有していければならない。ポリペプチド遺伝子産物は細胞質における蛋白分解攻 撃を免れなければならず、かつ酵素活性を付与する三次元フンフォメーシジンを 採らなければならない。細菌ＤＨＤＰシンターゼはさろにリジンの生合成で機能 できるものでなければならない：すなわち、必要な基質（アスパルチルセミアル デヒドおよびピルベート）を得、適当な産物（ジヒドロピコリン酸）を経過する ためには、生合成における（おそらくは葉緑体における）前後工程を触媒する未 変性植物酵素の近くに位置させなければなるない、 これらのすべての条件に合致したとしても、リジンの首尾良い過剰生産は予測さ れるものではない、Ｄ）（ＤＰシンターゼ工程における調節の減少を補償する他 の制御機構はないにちがいない。これは、生合成の池の抑制のみなろず、蓄積さ れたリジンの分解速度を増加させる機構がないことを意味す在。ま７二、リジン は植物に対し毒性でないレベルで過剰生産されなければなるない。最後に、商業 的育成および使用を可能とするために、導入された特性は安定でかつ遺伝性でな ければならない。

植物細胞における発現および機能のための細菌遺伝子の修飾ジヒドロジピコリン 酸シンターゼ（ＤＨＤＰＳ）をコード付けする遺伝子はジアミノピメリン酸経路 によってリジンを合成するいずれの微生物から得ることもできる。遺伝子の選択 におけるキイとなる基準はリジンによる抑制に対する遺伝子産物（ＤＨＤＰＳ） の相対的非感受性である。本発明の方法で用いる好ましい出発物質であるかかる １の遺伝子は、リジンによるフィードバック抑制に対し高度に耐性なりＨＤＰＳ の機能的３２ｋＤ種をフード付けするイー・コリｄａｐＡ遺伝子である。該遺伝 子は当該分野でよく知られた方法によって微生物から単離できる。かかる方法は ＤＨＤＰＳの公知突然変ｘ体の相補用ゲノミソクライブラリーのスクリーニング ；遺伝子ライブラリーから発現されたポリペプチドの免疫学的スクリーニング； 放射能襟識したオリゴ丸クレオチドプローブへの／％イブリダイゼーシジン用ゲ ノミソクライブラリーのスクリーニング等を包含する。

該オリゴヌクレオチドプローブは他の種の遺伝子から、または単離したＤＨＤＰ Ｓサブユニットのポリペプチド配列の逆翻訳かみ得られる配列に基づいて合成で きる。別法として、該遺伝子は全部または部分的に化学合成できる。

単離したならば、標準的なりＮＡ組替え操作および分子分析を用いて特徴付けら れる。かかる技術は当業者によく知られており、マニアナイスら（Ｍａｎｉａｔ ｉｓ　ｅｔ　ａｌ）、モレキニラー・クローニングニア“ラボラトリ−“マニュ アル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎ ｕａｌ）、コールド・スプリング・ノ＼−バー・ラボラトリ−（ＣｏｌｄＳｐｒ ｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、二ニーヨーク（１９８２） に記載されている。典型的には、ＤＨＤＰＳ遺伝子を担持するＤ　Ｎ　Ａ断片を 可能な最小の機能的断片まで小さくする：すなわち、該遺伝子の前後の外来性Ｄ ＮＡを、Ｂａ１３１消化、公知制限エンドヌクレアーゼ断片の欠失等のごとき方 法によ−って除去して、ＤＨＤＰＳ突然変異体に例えばなお相補する最小ＤＮＡ 断片を得る。この断片は通常３キロベ一ス未満であり、より通常には約１キロベ ースである。次いで、このＤＮＡ断片のヌクレオチド配列をいくつかの常法のう ちいずれかによって決定することができる。次いで、オーブンリーディングフレ ーム（コーディング配列）、推定されるＲＮＡポリメラーゼ結合部位（プロモー ター）、リポソーム結合部位、および転写終止シグナル配列を同定する。転写開 始部位はＳ１ヌクレアーゼマツピングまたはブライマー補修分析のごとき技術に よって決定することができる。単離した遺伝子をプラスミド上に取り込む細菌（ 典型的には、イー・コリ）の抽出物を検定してＣＨＤＰＳ活性の存在および添加 し一リジンに対する酵素活性のｉｎ　ｖｉｔｒｏ相対的耐性を確認する。

特徴付けを終えたならば、該遺伝子を修飾して、遺伝そ産物の宿主植物細胞にお ける取り込み、発現、および機能を可能とする。好ましい修飾は；ｌ）アミ／末 端葉緑体トランジットペプチドについてコード付けするＤＮＡ配列をＤ〜ＨＤＰ Ｓコーディング配列の５′末端に付加すること：２）植物細胞によって認識され かつそこで機能する５゛および３′側節配列で細菌の５′および３′側節配列を 置き換えること：および３）この植物特異的発現カセットを、ＤＨＤＰＳ遺伝子 を宿主植物細胞に導入し、かつそこでそれを安定に確立するのに適したベクター に挿入することである。

葉緑体トランジットペプチド（ＣＴＰ）ＤＮＡ配列の付加今日までに植物で調べ られているすべてのリジン生合成酵素を葉緑体中に局在させることができる。か くして、外来性遺伝子の産物の適当な局在を達成するには、葉緑体トランジット ペプチド配列をコード付けするＤ　Ｎ　Ａ断片を、ＤＨＤＰＳについてフード付 けするＤＮＡ配列の５°末端に、適当な読み枠にて連結させ、それにより完全な トランジットペプチド−ＤＮＡプレ蛋白が遺伝子融合の転写産物から翻訳される 。有用なトランジットペプチド（典型的には長さが４０〜７０個のアミノ酸）は 翻訳の後に機能してプレ蛋白を葉緑体に導き、そこで該プレ蛋白はエネルギー依 存性過程に移入される。該トランジットペプチドは８亥移入の間またはその直後 に切断されて成熟ポリペプチドが生成する。

このトランジットペプチドをフード付けするＤ　Ｎ　Ａ断片は、植物核遺伝子の 産物がアミノ末端トランジットペプチドよりなるプレ蛋白として発現され、かつ 葉緑体に移入される限り、種々の当該遺伝子から得ることができる。かかるトラ ンジットペプチド配列を包含することが公知の植物遺伝子産物の例はりブロース ビスホスフェートカルボキシラーゼのスモールサノユニ、ト、フェレドキシン、 クロロフィルａ　／　ｂ結合蛋白、核遺伝子によってフード付けされる葉緑体リ ポソーム蛋白、ある種の熱シｉｔ　７り蛋白、アセトヒドロキシ酸シンターゼお よび３−二／−ルビルビルホスホシ牛ミ酸シンターゼのごときアミノ酸生合成酵 素である。別法として、該トランジットペプチドをコード付けするＤＮＡ断片は 前記したごときトランジットペプチドの公知配列から全部または一部分を化学合 成できる。

トランジットペプチドをフード付けするＤＮＡ断片の源とは無関係に、それは１ 訳開始コドンを包含し、かつ宿生植物の葉緑体にょって認識されそこで適当に機 能するアミノ酸配列をコード付けしなければならない。プレ蛋白が切断されて成 熟ＤＨＤＰＳが生じるトランジットペプチドと成熟ＤＨＤＰＳサブユニットとの 間の連結部におけるアミノ酸配列にも注意されたい。ある種の保存されたアミノ 酸配列は同定されており、ガイドラインとして役に立ち得る。トランジットペプ チドコーディング配列とＤＨＤＰＳコーディング配列との正確な融合には、例え ば、都合良い制限部位を導入する１または双方のＤＮＡ配列の操作が必要とされ る。これは、部位指向性（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発、化学的 に合成したオリゴヌクレオチドリンカーの挿入等を含めた方法によって達成でき る。

葉緑体トランジットペプチドの機能は以下のごとくにｉｎ　ｖｉｔｒｏで検定で きる。ＳＦ３、Ｔ３、Ｔ７等のごときバクテリオファージプロモーターの転写制 御下、適当な向きに、トランジットペプチド−ＤＨＤＰＳ遺伝子を位置させるよ うに、当該遺伝子発現カセットを多数のプラスミド−ベクターのいずれに導入す ることもできる。次いで、得られたプラスミドをコーディング配列の３′側の唯 一の制限部位で消化して、線状ＤＮＡ分子を得る。次いで、このＤ　Ｎ　Ａ分子 を、用いるブｇモーターに特異的なＲＮ　Ａポリメラーゼを用い、ラン−オフ（ ｒｕｎ−Ｏｆｆ）転写反応に付す。かかる反応の収量は、典型的には、線状ＤＮ Ａ鋳型１μｇ当たり実質的に純粋なメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）１０〜 ｌ　２ｕｇである。次いで、小麦胚芽またはウサギ網状赤血球溶解物のごときｉ ｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系を用い、１またはそれ以上の放射能標識アミノ酸の存在下 で、これらのｍＲＮＡ転写産物を１訳させて放射能１票識プレ蛋白を得る。

次いで、該放射能標識プレ蛋白を、移入効率を検定する光の存在下で、単離した 無傷葉緑体と共にインキュベートする。次いで、該葉緑体をテルモリジン（ｔｈ ａｒａｏｌｙｓｉｎｓ）、）リプシン、キモトリプシン等のごときプロテアーゼ またはその組み合わせで処理する。この処理により、葉緑体内に隔離されていな いいずれの蛋白も分解される。プロテアーゼ阻害剤の存在下で洗浄した後、撹拌 、凍結／解凍処理、浸透圧低下またはこれらの組み合わせによって葉緑体を溶解 する。溶解産物；よ（ａ）直接検定でき、（ｂ）まず、ｔｙＡ準的なブロトフル によって生成したＤＨＤＰＳ−’ブユニノト抗菌抗血清を用いて免疫沈殿に付す ことができ、（ｃ）遠心してストロマ蛋白（上澄み）をチラフイド膜に局在する 蛋白（ベレット）から分離することができ、あるいは（ｄ）これらの手法の組み 合わせを用いることができる。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析を用いて成 熟細菌ＣＨＤＰＳサブユニットの分子量に対応する放射能標識蛋白バンドの存在 または不存在を確認する。バンドの存在は、該ブレ蛋白が移入され、正しいサイ ズに加工されたことを示す。

植物細胞におけるＤＨＤＰＳのごとき細菌遺伝子の発現には、植物細胞によって 認識されかつそこで機能する調節配列が必要である。これらの配列は５°転写開 始領域および３°転写および翻訳終止領域を含む。該５°転写開始領域はＲＮＡ ポリメラーゼ結合部位（プロモーター）を含む。また、それは、調節が化学的も しくは物理的誘導または抑制によって媒介される転写の調節に必要な領域も包含 し得る。

かかる調節の例はりブロースビスホスフェートカルポキンラーゼスモールユニノ トの光誘導発現、熱シＭ　’ｌり蛋白の熱誘導発現、植物ホルモンまたは池の代 謝産物によって調節される遺伝子、発生的に調節される発現、傷またはストレス −誘導発現等を含む。

該５゛配列は転写エンハンサ−配列を含み得る。該５°領域は宿主植物に本来の ものでよく、あるいは配列が宿主植物で機能する他の植物に由来するものでもよ い。また、適当な配列は、オクトビンシンターゼ、ツバリンシンターゼ、マンノ ピンシンターゼ等を含めたアグロバクテリウム・チ１メファシエンスのＴｉプラ スミドの遺伝子から得ることもでき、あるいは、ある種のウィルス遺伝子から得 ることもできる。別法として、転写開始領域は全部または部分的に化学的に合成 することもできる。

該３′領域は転写終止配列を包含し得、およびポリアデニル化シグナル配列を含 み得る。この領域は該５゛配列と同一の遺伝子から、あるいは異なる遺伝子から 由来するものでよい。これらの配列も化学的に合成することができる。

得られた発現カセット：ま５′転夏開始領域、葉緑体トランジットペプチドコー ディング領域、細菌ＤＨＤＰｓサブユニットコーディング配列、翻訳停止コドン 、および３゛転写終止領域よりなる。該カセットは、通常、５キロベ一ス未満を 包含し得、好ましくは２および３キロベースの間を包含し得る。

植物の形質転換用ベクターへの発現カセ、、トの挿入線１１ＤＨＤＰｓ発現カセ ットを植物細胞へ導入するベクターの選択は形質転換法の選択に依存する。即ち 、宿主植物および植物組織源の選択に依存する。マイクロプロジェクテイール、 マイクロインジェクシクン、電気穿孔、Ｃａ”−沈殿ＤＮＡを用いるインキュベ ーション、（好ましくはＰＶＡおよびＣａ”存在下での）外来性ＤＮＡを含有す るリポソームを用いるインキュベーション、ウィルス系、およびアグロバクテリ ウム媒介形質転換の使用を含めた広範囲のプロトコルが単子葉および双子葉植物 双方に外来性Ｄ　Ｎ　Ａを導入するのに利用できる。その開示をここに参照のた めに挙げるエム・フロムら（Ｍ、Ｆｒｏａｎ　ｅｔ　ａｔ）、ＰＮＡＳ　　ＵＳ Ａ、　　８２．　５８２４（ｉｉｉ気穿孔）、ティーｘム・クラインら（Ｔ、Ｍ 、Ｋｌｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ）、　　ネイテ−＝　−（Ｎａｔｕｒｅ）、３２７． ７０（１９８７）（マイクロプロジエクティール）、ビイ・ルルキンラ（Ｐ、Ｌ ｕｒｑｕｉｎ　ｅｔ　ａｌ）　（プラント・サイエンス・レターズ（Ｐｌａｎｔ 　Ｓｃｉ、Ｌｅｔｔ、）、　　２５．　　ｌ　３３（１９８２Ｘリポソーム）お よびジェイ・バスツフフスキイら（Ｊ、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ）、 　ＥＭＢＯＪ、。

３．２７１７（１９８４）（ＣａＭＶ遺伝子■発現シグナルの使用）参照。　最 初の５つの方法は「裸のＪ　ＤＮＡについて行い、そこでは発現カセットが、プ ラスミドｐＢＲ３２２、ｐＲＫ２９０、ｐＡＣＹＣ１８４等のごときいずれかの イー・コリのクローニングベクターに単純に担持させることができる。ウィルス ベクターの場合、該系は複製機能を保持するが病気誘導についての機能を欠くこ とが望ましい。

アグロバクテリウム媒介形質転換については、発現カモ８フトをベクターに包含 させて、ＴｉまたはＲｉプラスミド移入ＤＮＡ　（Ｔ−ＤＮＡ）の右および、所 望により左、境界を表す、アグロバクテリウムＴｉまたはＲｉプラスミドの断片 を両側に位置させる。これＣ＝より、外来性遺伝子の宿主植物細胞のゲノムへの 組み込みが容易となる。また、このベクターは、アグロバクテリウム細胞、なろ びにイー・フリ細胞におけるプラスミドの復製を容易とする。

すべてのＤＮＡ操作は、典型的には、イー・コリ細胞で行い、ＤＨＤＰＳ発現カ セント担持する最終のプラスミドを、直接ＤＮＡ形質転換、接合等によってアグ ロバクテリウム細胞に移動させる。

これらのアグロバクテリウム細胞は、やはりＴｉまたはＲｉプラスミドに由来す る第２のプラスミドを含有する。この第２のプラスミドは、植物細胞への外来性 ＤＮＡの移入に必要なすべてのｖｉｒ遺伝子を担持する。

ベクターまたは形質転換プロトフルの選択とは無関係に、形質転換植物細胞の同 定は、植物細胞で選択可能な機能をコード付けする遺伝子を包含させることによ って容易化される。好ましい遺伝子は、ヒグロマイシン、カナマイシン、メトト レキサート、およびある種の除草剤に対する耐性のごとき、植物細胞に対し化学 的な通常の抑制に対する耐性をコード付けする遺伝子である。選択可能なマーカ ーを、ＤＨＤＰＳ担持プラスミドで共形質転換した別のプラスミドに担持させる ことができるか、あるいはＤＨＤＰＳカセットとして同一のプラスミドに担持さ せることができる。アグロバクテリウム媒介形質転換の場合において、Ｔ−Ｄ、 ＮＡ境界領域によって両側を挟まれたプラスミドの領域内に選択可能なマーカー を含有させることができる。別法として、β−グルクロニターゼ遺伝子のごとき スクリーニング可能なマーカーを選択可能マーカーの代わりに用いることもでき る。この遺伝子で形質転換した細胞は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイ ル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）での処理による青色生成物が生じる ことによって同定できる。

植物の形質転換および再生 形質転換についての植物組織源の選択は宿主細胞の性質および形質転換プロトコ ルに依存する。宵用な組織源はカルス、浮遊培養細胞、プロトプラスト、葉セグ メント、茎セグメント、雄穂、花粉、胚芽、胚軸、塊茎セグメント、分裂組織領 域等を包含する。好ましくは、該組織源は形質転換後に爬全な稔性植物に再生さ れる能力を保持するものとする。

形質転換は、選択した植物組織に指向される条件下で行う。植物細胞または組織 を、効果的な間、ＤＨＤＰＳ発現カセットを担持するＤＮＡに暴露する。これは 、プラスミド担持アグロバクテリウム細胞の存在下、電気穿孔用電気の１秒／ｆ ルス未満から２〜３日の共培養の範囲とすることができる。また、用いる緩衝駅 および培地は植物組織源および形質転換プロトコルに応じて変更することができ る。多くの形質転換プロトコルでは、固形培地平板の表面に、形質転換すべき植 物細胞または組織から滅！ｌ！濾紙ディスクによって分離した、浮遊培養細胞の フィーダ一層（例えば、タノ匂またはブラ・ノクメキシカンスイート）を使用す る。

ＤＮＡでの処理の後、植物細胞または組織を選択に先立ち種々の期間培養できる か、あるいは前記したごとき選択剤に直ぐに暴露させることができる。アグロバ クテリウムへのａ露を含めたプロトコルは、また、アグロバクテリウム細胞の増 殖に対し抑制的な剤を含む。通常用いる化合物はセフォタキシニおよびカルベニ ンリンである。選択で用いる培地は、形質転換カルスまたは浮遊培養細胞を未分 化状態に維持するか、あるいはカルス、葉または茎セグメント、塊茎等から苗条 の生産を可能とするように処方できる。

通常に抑制的な１１１度の選択剤の存在下において増殖することが観察された細 胞またはカルスは形質転換されたと推定でき、同培地上でさらに数回継代培養し て非耐性セクションを除去することができる。次いで、該細胞またはカルスを細 菌ＤＨＤＰＳ遺伝子カセントの存在について検定できるか、あるいは公知の植物 再生プロトコルに付すことができる。苗条の直接生産を含めたプロトコルにおい て、選択培地上に現れた苗条は形質転換されたと推定され、切り出し、根の生成 に適した選択培地上で発根させるか、あるいは根誘導化合物中に切り出した苗条 を単に浸漬することによって発根させ、バーミキニライト中にそれを直接植える ことができる。

再生植物およびその後代の特徴付は 上昇した遊離リジンレベルを示すトランスジェニック植物を生産するためには、 細菌遺伝子を植物細胞に取り込み、植物ゲノム内に安定に組み込まなければなる ない。抑制剤に対する耐性について選択した植物細胞および組織は、形質転換処 理の間に、この耐性をフード付けする遺伝子を獲得したと推定される。このマー カー遺伝子は通常綿！ＩＤＨＤＰシンターゼに連結しており、細１１１ＤＨＤＰ シンターゼ遺伝子も同様に獲得されたと推定できる。次いで、細ｍＤＨＤＰシン ターゼ遺伝子に特異的なプローブを用いるサザーンブロ。

トハイブリダイゼーシａン分析を用いて外来性遺伝子が植物細胞のゲノムに取り 込まれ、組み込まれたことを確認することができる。

また、この技術により、組み込まれた遺伝子のコピー数を示すこともできる。外 来性遺伝子がｍ　ＲＮ　Ａに首尾よく転写されたことは、同様に、全細胞ＲＭＡ および／またはポリアデニル化領域で富化した細胞ＲＮ　Ａのノーザンブロノト ハイブリダイゼーション分析を用いて検定できる。

転写されたなろば、該ｍＲＮＡは、植物リポソームによって、細菌ＤＨＤＰシン ターゼユニットのごときポリペプチドに翻訳されなければならず、触媒活性を付 与する３次元フンフィギニレーションを採ることができなければならない。Ｌ９ １１ｍＤＨＤＰインターゼ遺伝子を担持し転写することが共に示された植物細胞 または組織：よ、さらに、細胞または組織の抽出およびリジン−耐性ＤＨＤＰシ ンターゼ活性の証明によって特徴付けを行うことができる。このＩｎ　ｖｉｔｒ 。

リジン耐性は、好ましくは、遺伝子源として作用する微生物の抽出物で観察され 、対照植物細胞または組繊から抽出できる高いリジン感受性の元来のＤＨＤＰシ ンターゼ活性から容易に区別されるべき耐性に匹敵する。カセットの構築で用い た転写開始および調節配列に応じ、該活性はすべての植物組繊で、選択した組織 で、または選択した誘導条件下のみで検出できる。

細１１ＤＨＤＰシンターゼ活性の植物における位置とは無関係に、それは、リジ ン生合成に関与でき、基質の産物への転換を触媒できるように、植物細宿内に位 置させなければならない。細！！ＤＨＤＰシンターゼがかく関与する能力は、リ ジンアナログ５−（２−アミノエチル）−システィン（ＡＥＣ）に対する植物細 胞または組織の相対的耐性を測定することによって評価できる。リジンと同様に 、ＡＥＣは植物ＤＨＤＰシンターゼの優れた抑制剤である。抑制濃度のＡＥＣに 暴露された植物細胞または組織はリジンが効果的に欠乏する。しかしながら、イ ー・コリからのＤＨＤＰシンターゼはこの抑制に対してかなり感受性が低い。通 常に抑制的な濃度のＡ　Ｅ　ＣＣ対抗する活性な細ｍＤＨＤＰシンターゼを発現 する植物細胞または組織の能力は、該細菌酵素はリジンの生合成で適当に機能し ていることを強く示唆する。

細［ＤＨＤＰシンターゼがリジンの生合成に寄与しているなろば、および他の機 構が遊離リジンブールを調節するように作用していないならば、遊離リジンは対 照植物の細胞または組織で観察されたよりも高いレベルまで蓄積され得る。遊離 アミノ酸レベルは、トランスジェニック植物の細胞または組織のトリクロロ酢酸 （ＴＣＡ）抽出物の逆相ＨＰＬＣ分析によって容易に測定することができる。

これらの機構でかなり上昇したレベルの遊離リジンを蓄積する植物を成体まで成 育させる。これらの植物を開花させ、自家授粉させるか、あるいは適当な親系統 に交−させて種子を得ることができる。

次いで、この種子を所望の特性の遺伝について分析することができる。

種子の最初のスクリーニングは、対照種子から発芽した実生の成育を抑制する濃 度のＡＥＣの存在下での発芽および実生発育とすることができる。ＡＥＣａｄ性 を示す実生を発育させ、元の再生植物について前記したごとく詳細に特徴付けを 行うことができる。

かかる形質転換によって改善された植物は、加工植物（大豆、カノラ（ｃａｎｏ ｌａ）、ジャガイモ、トマト、ハウチワマメ、ヒマワリおよび［）　、飼料植物 （アルファルファ、クローバ−およびウシ７ケ草）、および穀実（トウモロフン 、小麦、大麦、オート麦、米、ツルガム、キビおよびライ麦）を包含するが、そ れらに限定されるものではない。該植物または植物の部分は飼料または食品とし て用いることができるか、あるいはリジンは飼料または食品添加物として抽出す ることができる。

ここに記載する該遊離リジンのレベルは形質転換植物の葉で上昇するが、本発明 の方法は塊茎および種子を含めた池のＵ物器官での遊離リジンレベルの上昇を可 能とする。

本発明は以下の詳細な実施例によってさらに記載する。

制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４リガーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、および子 ウシ腸ホスファターゼはすべて製造業者の推奨法に従って用いた。襟卓的なりＮ Ａ組換え技術、エシェリヒア・フリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）細胞 の形質転換、および分子分析はマニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ ）、モレキユラー・クローニングニア・ラボラドＩＪ−〇マニニアル（Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コ ールド・スプリングハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、二ニーヨーク（１９８２）に従って行ツｒ：。

すべてのｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写（ＳＦ３）およびＩＩ訳（ウサギ網状赤血球溶解 物）をプロメガ・バイオチク（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）　（マジソン、 ウィスコンンンＪ１１）かろの試薬を用いて行い、製造業者のプロトコルに従っ た。

オリゴヌクレオチド：まホスホルアミティト法（カルザース（Ｃａｒｕｔｈｅｒ ｓ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　　２３０．　２８１〜２８５（１９８ ５））を用いて化学的に合成した。

アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｃｅ）株ＬＢＡ４４０４　（＋）ＡＬ４４０４）Ｃヘケマら（Ｈ ｏｅｋｅｏ＋ａ　ｅｔ　ａｔ）、ネイチャー（入ａｔｕｒｅ）、　　３０３．　 １７９〜１８０　（１９８３）’）をすべての植物細胞形質転換で用いた。

ｄａｐＡ遺伝子の単離および特徴付けはグラスマン（Ｇｌａｓｓｍａｎ）、［° エシェリヒア・コリのｄａｐＡ遺伝子のクローニングおよび特徴付け（Ｃｌｏｎ ｉｎｇ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　Ｏｆ　ｔｈｅ　ｄａｐ　 Ａ　Ｇｅｎｅ　ｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｊ　　（エム・ニス・ セイス（Ｍ、　Ｓ、　Ｔｈｅｓｉｓ）、セシス（Ｔｈｅｓ　ｉｓ）、ミネソタ大 学、ミネアポリス、ミネソタ州（１９８Ｂ））に記載されており、ここに参照の ために挙げる。

該遺伝子はエシェリヒア・コリのゲノミソクライブラリー（クラーケおよびカー ホン・コレクンヨン・τブ・ハイブリッド・プラスミズ（Ｃ１ａｒｋｅ　ａｈｄ 　Ｃａｒｂｏｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ ｓ）、イニール医学大学、ニニーハーペン、コネチカノト州）から単離した。

ｄａｐＡ遺伝子を担持することが報告されているプラスミド（ｐＬｃ１７３０） の断片をクローニングベクターｐＢＲ３２２！：継代クローン化した。ｄａｐＡ 遺伝子を担持する断片をイー・コリのｄａｐＡ突然変異体の相補によって同定し 、（ジヒドジビコリン酸シンターゼサブユニットの分子量に対応する）分子量３ ２キロダルトンのプラスミドフード付は蛋白の証明によって、およびジヒドロジ ピコリン酸シンターゼ酵素活性によって確認した。１のかかるプラスミド構築体 のヌクレオチド配列を決定し、推定されるプロモーター配列およびｄａｐＡ遺伝 子についてのコーディング配列を同定した。外来性フランキングＤＮＡをざらに 継代クローニングによって除去した。

特に興味深いのは、プラスミドｐＤＡＰ１７８３およびｐＤＡＰ１２０５である 。ｐＤＡＰ１７Ｂ３は１５６４ｂｐ　のＮｄｅｌ−Ｂｓ　ｔ　ＥＩＩ断片上に完 全なｄ　ａ　Ｉ）　Ａコーディング配列−５°および３゛非躬訳領域を担持する 。ｐＤＡＰ１２０５はコーディング配列の最後の１３塩基を失った１３７５ｂｐ ＮｄｅＩ−３ｐｈｌ断片およびすべての非關訳３゛配列を担持する。両プラスミ ドは、ｐＢＲ３２２の誘導体である。

Ｂ、葉１体トランジットペプチド配列 エントウ豆葉緑体トランジノトペブテドをコード付ケスるＤＮＡ配列は、まず、 配列のサブ断片を合成し、次いで、これらを合することによって構築した。

エントウ豆のりブロースビスホスフェートカルボキシラーゼスモールサブユニッ ト遺伝子の葉緑体トランジ・７トペブチドについての公表された配列（カノシ二 モアー（Ｃａｓｈｍｏｒｅ）、ジェ不ティノク・エンジニアリング・サブ・ブラ ソフ（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ）、エイ ・ホレンダー（Ａ、　Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ）ｍ、ブレエム・プレス（Ｐｌｅｎ ｕｍＰｒｅｓｓ）　（１９８３）　）に基づき、８のでリボヌクレオチド（スト ランド当たり４）を化学的に合成した。Ｔ４　ポリヌクレオチドキナーゼを用い て６の内部５′末端塩基を“、ｉン酸化し、次いで、すべての８のオリゴヌクレ オチドの１０−〇ピコモルを合計容量ＴＯＬｔＱにて一緒に混合レニ、この混合 物の１０マイクロリ、トルをＨｉｎｄＩｆｆ−３ｐｈｌ消化のｐＰｏ１２Ｂ（Ｏ ビンズ；＋（Ｒｏｂｂｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・オブ・ハイロロジー （Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）、　　５８．　３３９〜３４７（１９８６））の１００ｎ ｇと合し、９５℃で５分間変性し、室温で２時間アニールし、次いで結んでｐＳ ＴＰ３１を得た。合成配列ハ、Ｈｉｎｄ［［５’突出、非ＩＩｌ訳リーダー＜７ ＞３０ｂｐ、５７−７ミノ酸トランジツトペプチド（ｔ　ｐ）をコード付けする １７１ｂり。

およびトランジットペプチドについての進化過程で１呆存された切断部位を表す ３’Ｓｐｈ［突出よりなるものであった。

Ｃ１植物細胞で用いるｄａｐ−Ａ遺伝子の修飾ｄａｐ、Ａ遺伝子のコーディング 領域に対し外部の細菌ＤＮＡを除去し、植物によって認識され加工される配列で 置き換えた。

前記トランジットペプチド配列を付加するために、ｄ　ａ　ｐ　Ａコーディング 配列の５゛末端を修飾してＳｐｈ１部位を生成させた。これは、Ｉ）ＤＡＰ１７ ６３における１０８ｂｐＮｓ　ｉ　［−Ｎｒｕ　ｌ断片を、ＭｓｉｌおよびＸｒ ｕ　１部位炊方を再生する２９ｂｐ合成リンカーで置き換えることによって達成 した。この手法によって、ｄａｐＡについての細菌プロモーターを欠失し、ＣＣ ＡＴＧＴないしＧＣＡＴＧＣかろの開始コドンを囲む配列を変化させ、かくして 、必要な５ｐｈＩ制限部位を生成した。この変化の結果、アミノ酸配列の部位２ においてフェニルアラニンないしロイシン置換が生じることが期待される。この プラスミドをｐＤＡＰ１９００と命名した。　ｄａｐＡコーディング配列（最後 の１３塩基対未満）を包含するｐＤＡＰ　１９００の８６５ｂｐＳｐｈ　［断片 を、ｄａｐＡ−ｘ−ティング配列の５°末端が合成トランジットペプチド配列に 融合し、エントウ豆スモールサブユニットプレ蛋白の天然切［ｒｌが回［される ように５ｐｈｌ−消化のｐＳＴＰ３１に結んだ。得られたプラスミドをｐＤＡＰ ４００１と命名した。このプラスミドにおけるポリリンカーはコーディング配列 の末端の直く３゛側にＳａｃ！を提供した。この部位を用いてトランジットペプ チド（ｔｐ）、：：ｄａｐＡカセットをＨｉｎｄＩＩＩ−８ａｂＩ１０７０ｂｌ ）断片とじてＨｉ　ｎｄＵｌ−３ａ　ｃ　Ｉ切断ｐＧＥＭ３（プロメガ・バイオ チク（Ｐｒｏｍｅｇａ　　Ｂｉｏｔｅｃ）、マジソン、ウィスコンシン州）に移 動させ、プラスミドｐＤＡＰ４１０４を得た。

ｄａｐＡコーディング配列の３゛末端を同様に修飾して４つの事を行った：（１ ）Ｓｐｈ［部位を破壊しく５゛末端に生成した部位を唯一のものに変え）　、（ ２）ｐＤＡＰ　１２０５の元の構築体で失われた配列の最後の４個のアミノ酸を 回復し、（３）２の停止コドンを付加し、および（４）コーディング配列の末端 に隣接してＢａｍＨｊ部位を生成した。

これは、プラスミドｐＤＡＰ１２０３を５ｐｈｌ＋ＢａｍＨＩで消化し、ｐＢＲ ３２２ＤＮＡの代わりに２３ｂｐ含成リンカ−を結んでプラスミドｐＤＡＰ　　 １２５２を得ることによって行った。

Ｓｐｈ　１部位の破壊によって推測アミノ酸配列のアラニンないし２８９位のグ リノンまでのコドン変化ｔ（生じた。

新しく生じたＢａｍ８１部位を用いて、植物細胞によって認識される転写終止シ グナルを付加した。Ｉ）ＤＡＰ１２５２をＢａｍＨｌおよびＨｉ　ｎｄ［［で消 化し、ｐＴｉＣ５８の７バリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子（ヌクレオチド６７ ３ないし４２２、ベバンら（Ｂｅｖａｎｅｔ　ａｌ）、ＮＡＲ，１１，３６９〜 ３８５（１９８３））かろの転写終止およびポリアデニル化シグナルを含有する ｐＲＬ　１０１からの２６０ｂｐＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩ［ｒ断片に結んだ。こ の構築体をｐＤＡＰ１２６４と命名した。

最後に、修飾したｄａｐＡ末端を合して遺伝子を再構築した。

ｐＤＡＰ１２６４を（ｄａｐＡコーディング配列の中央において）ＢｓｔＥＩＩ および（ｎｏｓポリＡ配列の末端の丁度３′側において）ＥｃｏＲＩで消化し、 Ｂｓ　ｔ　ＥＩ［−ＥｃｏＲｒ消化のｐＤＡＰ４１０４に結んだ。このプラスミ ドｐＤ、ＡＰ４２０１は、すべてｐＧＥＭ３におけるＳＰ６プロモーターの転写 制御下にある、ｄａｐＡのコーディング配列およびｎｏｓ３’　領域に融合した 合成葉緑体トランジットペプチド（Ｓ　Ｔ　Ｐ）配列を担持していた。この構築 体を、前記第４節で記載したごとくに、トランジットペプチド機能の１ｎｖｉｔ ｒｏ分析で用いた。

植物細胞における遺伝子機能のｉｎ〜・ｉｖｏ研究のにめに、前記し７二ＳＴＰ ：　：ｄａｐＡ：　：ｎｏｓ３’カセットを、以下のごくとに、ＣａＭＶの３５ Ｓ　　プロモーターの制御下に置いた。ｐ　Ｃａ　Ｍ　Ｖ　ＰＲＯ（ブイー’フ ルポット（Ｖ、　ＷａｌｂｏＬ）からの寄贈；フロムら（Ｆｒｏｍｍ　ｅｔａｌ ）、ＰＮＡＳ、旦ｕ、　　５８２４〜５８２８（１９８５）参照）がるの３５Ｓ プロモーターを担持する４５０ｂｐＢａｍＨＩ−Ｂｇ　ｌ　ＵをｐＰｏ１２６ボ リリンカーのＢａｍ８１部位に挿入することによって、ｐＰｏ１２８からプラス ミドｐ３５−２２７を得た。この構築によりＨｉ　ｎｄＩｆｆ部位をプロモータ ーの丁度３′側に置いた。完全なｄａｐＡ遺伝子遺伝ツカセントするｐＤＡＰ４ ２０１の１３４０ｂｐＨｉｎｄｌＩｌ断片をこの部位に正しい向きに結んで、植 物細胞における発現用の機能的転写ユニットを形成した（プラスミドｐＤＡＰ４ ３０７）ａ Ｄ、　　トランジットペプチドのｉｎ　ｖｉｔｒｏ機能無傷葉緑体によるｄａｐ Ａ遺伝子産物の移入および加工を指示する合成トランジ／）ペプチド配列の能力 を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ葉緑体移入アッセイ（デラーシオバろ（ｄｅｌｌａ−Ｃｉ ｏｐｐａ　ｅｔ　ａｌ）、バイオチク／Ｃ’ノー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ）、　　５．　５７９〜．）８４（１９８７））を用いて評価した。該アッセ イ用の５ｓＳ−メチオニン標職プレ蛋白を以下のごとくに調製した。

ｐＤＡＰ４２０１　　ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ＳＰ６ポリメラーゼを用い てラン−オフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）転写に付した（メルトンら（Ｍｅｌｔｏｎ　ｅ ｔ　ａｌ）、ＮＡＲ，１２，７０３５〜７０５６（１９８４））。ＲＮＡ５　ｅ フリーＤＮＡ５ｅｌでの消化によるプラスミドＤＮＡの除去の後、ｍＲＮＡをエ タノール沈澱させ、２５μｅ滅菌蒸留脱イオン水に再懸濁し、分光光学的に定量 した。このｒｎＲＮＡの８マクイログラムを、合計容量１４５μｇ中の２．５μ Ｃｔ／μｍ２−３５Ｓ−メチオニン（二ニー・イングランド・ヌクレアー（Ｎｅ ｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）、ボストン、マサチニーセノン州）を包含 するｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応（ウサギ網状赤血球溶解物）で用いた。反応混合 物を３０°Ｃで９０分間インキニベートし、それを氷上に置くことによって停止 した。

エントウ豆実生について記載されている方法（、＜−トレ、・トら（Ｂａｒｔｌ ｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ）、メソノズ・イン・クロロプラスト・モレキュラー・バイ オロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）。

エデルマンラ（Ｅｄｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ）綱、エルセピエ・／　（イオメデ イカル・プレス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｂｉｏａ＋ｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ）（ １９８２））を用０て、ラティカ・サテイバ（Ｌａｔｕｃａ　５ａｔｉｖａ）（ タチシシャレタス）の脱脈葉力１ら活性な無傷葉緑体を単離した。単離した葉緑 体を移入緩衝液（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ％　ｐ）（７，ｅ、０．３Ｍソルビトー ル）に再懸濁し、２ｍｇ／ｍＱクロロフィルに調整し、用０るまで水上１；維持 した。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写産物（はとんどｔｐ：：ＤＨＤＰＳサブユニットプレ蛋白 ）の５マイクロリツトルを、水上で、１１０μＱ移入緩衝液、２５μｍ２０．１ ＭＬ−メチオニン、１５μＱＯ，ＩＭ　ＡＴＰ、および１００μｇ葉緑体と合し た。該移入反応混合物を角に置き、室温１；で１５０Ｗフアイバー光学バルブの 前で直接穏やか（二回転させた。

５．１０および１５分に、７０μＣ試料を取り出し、１０ｍＮ１のＣａＣＱｅ中 の１ｒｒ、ｇ／ｍ１２テルモリジンの７μｇｆ：含有する氷上のエノペンドルフ 試験管にピペットで入れた（クラインら（Ｃ１ｉｎｅ　ｅｔａｌ）、プラント・ フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、　　７５．　６７７〜６７ ８）１９８４））。対照として、１５分に採取した第２の試料を、７μ（１１０ ｍＭ　ＣａＣＱ＊を含有する氷上の試験管にビベ、７トで入れた。すべての試験 管を水上で２０分間インキニベートし、次いで、５０ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する １５０μｇ移入緩衝液で希釈してテルモリジンを抑制した。１０秒間遠心した後 、葉緑体を５０ｔｔ（ｌ溶解緩衝ｉ＆　（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　　ｐＨ７，５ ，１０ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、３０μｇ／ｍ１２アプロチニン）に再 懸濁し、２サイクルの凍結／解凍および撹拌によって溶解した。溶解物を１４０ ００Ｘｇで２２０分間遠心してストロマ（上澄み）およびチラコイド（ペレ／ト ）画分を分離した。

１２．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（レムリイ（Ｌａｅ開１１）。

ネイチｗ−（Ｎａｔａｒｅ）、　　２２７．　６８０（１９７０））を通してス トロマ蛋白試料を電気泳動泳動に付した。該ゲルを染色し、乾燥し、オ−トラジ オグラフィーに付した。対照試料ロブロチアーゼｔ　Ｌ　Ｉ　：ｉ該ｔ　ｐ　： 　：　ＤＨＤＰＳサブユニットプレ蛋白に対応する４２キロダルトンのバンドを 示した。すべての３つのテルモリジン−処理試料は該４２キロダルトンのバンド を欠き、代わりに、蛋白分解消化から保護された約３２キロダルトンにて移動す るバンドを示し、従って、葉緑体に移入されたと結論された。該３２キロダルト ン蛋白は成熟細菌ジヒドロジピコリン酸シンターゼサブユニットの分子量に以下 の節では、修飾されたｄａｐＡの植物細胞への導入に用いるベクターの構築を記 載する。該ベクターは、遺伝子を植物ゲノムに組み込むのを容易とするためのｐ 　Ｔ　ｉ　Ａ　Ｃｈ　５の左および右側Ｔ−ＤＮＡ境界、イー・コリについての 選択可能マーカー（アンピシリン耐性）、アグロバクテリウム・チュメファシエ ンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）およびタバコにつ いての選択マーカー（カナマイシン耐性）、およびイー・コリおよびアグロバク テリウム・チニメファシエンス双方でのプラスミド複製を可能とする複製始点配 列よ、ノなる。

１．７−ＤＮＡ境界の継代クローニングｐｏＴＹ８（ヘケ？　（Ｈｏｅｋｅｍａ ）　、前掲）をＢａｍＨＩおよびＣ１ａｌで消化し、次いで、１２０’６ｂｌ） 断片（バーカーら（Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、プラント・モレ牛ニラ−・バ イオロジー（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、　　２゜３３５〜３５０（１ ９８３）によるとヌクレオチド１ないし１２０６；また、デボスら（Ｄｅｖｏｓ 　ｅｔ　ａｌ）　、　　プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）、　　６゜２４９〜２５ ３　（１９８１）参照）を単離することによってｐＴｉＡｃｈ５　ＴＬ　ＤＮＡ の左側境界を得た。該断片をＢｇｌｌＩ−Ｃ１ａｒ−消化のｐＰｏ　ｌ　２６に 結んでプラスミドｐＯＴＢＬ１を得た。

Ｈｐａ　ＩおよびＸｈｏｌで消化したｐＰｏ　１２６のポリリンカー領域に挿入 した５７６６ｂｐ　　Ｈｐａ　［−Ｘｈｏ　Ｉ断片として、右側境界をｐＯＴＹ ８から同様に得た。

ｐＵＣＤ２（りニーズら（Ｃ１ｏｓｅ　ｅｔ　ａｌ）、プラスミド（Ｐｌａｓｍ ｉｄ）。

で消化することによってｐＳａの広宿主範囲複製始点を得た。該２９００ｂｐｔ ！４始点断片をＨｐａ　Ｉ−Ｂｇ　Ｉ　ＩＩ−消化のｐＰ。

１２６で結んでｐＰｏｌｓａを得た。

３、左および右側Ｔ−ＤＮＡ境界およびｐＳａ復製始点を含有するプラスミドの 構築（ｐＢＲ３２２ＬＲＳａ）左および右側Ｔ−ＤＮＡ境界およびｐ　Ｓ　ａ　 復製始点を以下のごとくに、）ＢＲ３２２に挿入した。ｐＯＴＢＬｌをＣ１ａｌ およびＨｉｎｄｎｌ（ヌクレオチド６０２、バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）、前掲） で消化して６０４ｂｐ断片を得、次いで、これをＤＮＡポリメラーゼのクレノー 断片で平滑末端とした。該ＤＮＡ断片をｐＢＲ３２２のＰｖｕ１１部位に挿入し てｐＢＲ３２２Ｌを得た。右側境界をｐＴ８１１８２８　（ヌクレオチド１３７ ７４〜＋４６８６、バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）、前掲）からの９１２ｂｐ　Ｃｌ 　ａ　［−ＢａｍＨＩ断片上に担持させ、Ｃｉ　ａ　（−ＢａｍＨＩ−消化のｐ ＢＲ３２２Ｌに結んでｐＢＲ３２２ＬＲを得た。

ｐＢＲ３２２ＬＲのハイブリ、ドＣ１ａ　１部位はイー・コリ株ＭＣ１００Ｏに 対するメチル化に対して感受性であり、従って、Ｃ１ａｌによる消化に対して抵 抗性である。該プラスミドのイー・コリ株ＧＭ２７２（ｄａｍ−、ｄｃｍ−）（ マリナスら（ＩＪａｒｉｎｕｓ　ｅｔ　ａｌ）、らの２９００ｂｐ　ＥｃｏＲＩ −Ｃ１ａｌ　　ｐＳａ断片のＥｃｏＲＩ−ＣＩａＩ−消化のｐＢＲ３２２ＬＲへ の挿入が可能となった。得られたプラスミドをｐＢＲ３２２ＬＲ３ａと命名した 。

４、カナマイシン耐性マーカーの構築 ｐＴ　１Ａｃｈ５　Ｔｌ１ＤＮＡの転写産物２４からのプロモーターを用い、ア グロバクテリウムおよび植物双方においてカナマイシン耐性を付与することがで きる選択可能なマーカーを構築した。このプロモーター領域を、ヌクレオチド２ １６３１ないし２０１２８（バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）、前掲）を表すｐＲＫ２ ９０−ＥｃｏΔＣ１ａ　（ケルビンラ（Ｇｅｌ〜ｉｎ　ｅｔ　ａｌ）、　モレキ ユラー・アンド・ジェネラル・ジェネティｌス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、 ）　＋　　ｌ　９旦、２４０〜２４８（１９８５））かろの１．＋０３ｂｐ　　 ＥｃｏＲＩ−Ｃｌａｌ断片としてこのプロモーターを単離した。該断片を、Ｅｃ ｏＲＩおよびＣ１ａ　Ｉで消化したｐＰｏ１２９に結んでｐＰｏｌＰＴＲを得た 。

転写産物２４プロモーターの丁度３°側のポリリンカー中のＢａｍＨ１部位を用 イテＴ　ｎ　Ｏ（ａ　スンｘタインら（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ）、セ ル（Ｃｅｌｌ）、±９，７９５〜８０５（１９８０））からのｌ　５００ｂｐＢ ｇ　Ｉ　ｎ−ＢａｍＨＩ断片を挿入した。この断片はネオマイシンホスホトラン スフェラーゼ７１（ＮＰＴＩ［）コーディング配列を含有するが、本来のＮＰＴ ＩＩプロモニターを欠く。転写産物２４プロモーターに関する断片の機能的向き は、得られたプラスミドｐｐｏｒＮｐＴｎがカナマイノン耐性をイー・コリ細胞 に付与する能力によって確認した。

ｐＴｉＡｃｈ５のオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）遺伝子からのポリアデニル化 シグナル配列はｐＴＢ１１８２Ｂ＜ヌクレオチド１２５５４１〜１１８３４、バ ーカー（Ｂａｒｋｅｒ）、前掲）からの７０７ｂｐ　　ｐｖｕｌｌ断片として単 離した。この断片をＳｒｒ＋ａｌ−消化のｐＰｏｌＸＰＴｆ［に結んでＮＰＴＩ Ｉコーディング配列の３゜側の外来性Ｔｎ配列の、５００ｂｐを置き換えた。ボ ＩＪＡ断片の正しい向きは、ＸｍａＩＩ［での消化によって生成した断片パター ンによって確認した。該プラスミドをｐＰｏ　ＩＮＰＴＩＩ−Ａと命名シタ。

５、選択可能マーカーのｐＢＲ３２２ＬＲ３ａへの挿入ｐＴＲ：　：ＮＰＴＩＩ ：　：ｏｃｓ３：遺伝子カセットをｐＰｏ　ＩＮＰＴＩＩ−Ａからの３１００ｂ ｐ　Ｘｈｏ断片として５ａｌｌ−消化のｐＢＲ３２２ＬＲＳａに移動してｐＢＶ ｌを作成した。この１１．５キロベースのプラスミドは、唯一のＥｃｏＲＩ部位 から時計回りの向きに、以下の成分：広宿主範囲ｐＳ　ａｌｌ製始点、右側境界 、クローニング部位Ｈｐａ　ｌおよびＢａｍＨｌ、ｐＴＲ／ＮＰＴＩＩ１０ｃ　 ｓキメラ遺伝子（時計回り向きに転写）、ｐＢＲ３２２の１４１５ｂｐ（Ｓａ　 Ｉ　ＩないしＰｖｕＩＩ）、左側境界、および複製始４点およびアンピシリン耐 性遺伝子を包含するｐ’　Ｂ　Ｒ３２２のＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を含有し ていた。

Ｆ、修飾したｄａｐＡ遺伝子を含有する形質転換ベクターの構築（ＤＰＺ４４７ ４およびｐＤＡＰ４５１１）ｐＢＶＩの右境界の丁度内側の唯一のＨｐａ　［お よびＢａｍＨ１部位を用いてＣａＭＶ　ｐ３５ｓ　：　：５ＴＰ３１　：　：ｄ ａｐ　Ａ：　：ｎｏｓ３’　カセットを挿入した。ｐＤＡＰ４０３７におけるこ のカセ・ノドの両側のポリリンカー中の部位を用いて、１８３０ｂｐＳｍａ−Ｂ ｇｌｌｌ断片をＨｐａ　Ｉ−ＢａｍＨＩ−消化のｐ　Ｂ　Ｖ　ｌに結んでｐＤＰ Ｚ４４７４を得た。この構築体おいて、ｄａｐＡ遺伝子はＮＰＴＩ［遺伝子の丁 度前にあり、ＮＰＴＩＩと同−向きに転写される。

同様に、ｐＤＡＰ４３０７の１８３０ｂｐ　　ＢａｍＨＩ　（部分的）−Ｈｐａ Ｉ断片をＨｐａ　Ｉ−ＢａｍＨＩ−消化のｐＢＶｉに結んでｐＤＡＰ４５１１を 得た。この構築体において、該ｄａｐ　　Ａ遺［ミツはやはりＮＰＴＩＩ選択マ ーカーの丁度前にあるが、反対の向きでは、それはＮＰＴ［Ｉに関して不一致で 転写される。

バンブリートら（ＶａｎＶｌｉｅｔ　ｅｔ　ａｌ）、プラスミド（Ｐｌａｓ＋ｎ １ｄ）。

１．４４６〜４５５（１９７８）に記載されている方法を用いて、ｐＤ　Ａ　Ｚ 　４４７４　（ＡＴＣＣＮｏ、　６７７２１）およびｐＤＡＰ４５１１をアグロ バクテリウム・チニメファシエンスＬＢＡ４４０４　（ｐＡＬ４４０４）に形質 転換した。形質転換体をカナマイシン（，５０μｇ／ｍ（りを含有する平板上で 選択し、単一コロ−ニー純度について画線培養した。

ｐＤＰＺ４４７４、ｐＤＡＰ４５１１、マタはｐＢＶＩを担持するアグロバクテ リウム・チニメファシエンス　ＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４）をタバコ葉デ ィスクの共培養形質転換で用いた。

ディスクのワンセットを陰性対照として滅菌水で処理した。

以下の例外：アグロバクテリウム培養を、リファンピシン（２０ｔｔ（１／ｍＱ 　）　、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍａ）、およびカナマイシン（５０ μｇ／ｍＱ　）を補足した５　２３　（＠地（カドら（Ｋａｄｏ　ｅｔ　ａｌ） 、フィジオロジカル・プラント・パソコン−（Ｐｈ＞・ｓ　１ｏｌＰｌａｎｔ　 Ｐａｔｈｏｌ、）、　　２．　４７〜５９　（１９７２）　）中、２８℃で４８ 時間増殖させ、洗浄し、葉ディスクと共に使用するに先立って滅菌水に再懸濁し ：ブラノクメキシカンスイート浮遊培養をナース平ｔｌＸ上のフィーダー培養と して用い；すべでの固体培地は寒天の代わりに２．５　ｇ　ｍ／Ｉ！　Ｇｅ１ｒ ｉｔｅ　（スコツト・ラボラトリズ（Ｓｃｏｔｔ　Ｌａｂｏ−ｒａＬｏｒｉｅｓ ）、オマハ（Ｏｍａｈａ）、ネブラス力州）を含有していたことを除いて、実質 的にホー／二ら（）Ｉｏｒｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ）、サイエンス（Ｓｅｉｅｎｃｅ ）、灸１ヱ、１２２９〜１２３１（１９８５）に記載されてい方法に従いニコチ アナ・タバカムＳＲＩ植物の葉ディスクを形質転換した。

ナース平板上の２日後、葉ディスクを（５００μｇ／ｍ１２カルベニシリンおよ び０．１００または２００μｇ／ｍＩ２のカナマイシンを含有し、フィーダー培 養または濾紙を欠く以外はナース培地に同じ）発芽培地上で平板培養した。平板 をパラフィンで７−ルし、１２時間の照光時間にて２６°Ｃでインキュベートし た。それが１ｃｍに到達したとき苗条を切り出し、苗条が生成したカルベニ／リ ンおよびカナマイシンを同濃度で含有する発根培地（ホルモン無し）に移した。

根が出現したとき、プラントレットをバーミキュライト中に入れ、次いで、土壌 に移植した。

Ｈ１再生したタバコ植物でのｄａｐ　　Ａの発現についてのスクリ一対する耐性 を評価することによって、最初に、導入されたｄａｐＡ遺伝子の発現についてＬ Ｈ物組織をスクリーニングした。ＡＥＣは植物のジヒドロジピコリン酸シンター ゼの優れた抑制剤であるが、細菌ＤＨＤＰＳはそれに対して感受性がかなり低い 。葉ディスクは形質転換プロトコルで記載したごとく表面滅菌葉から調製した。

１ｍＭＬ−アルギニンおよび０，０．１．０．２または０．４ｍＭのＡＥＣを補 足した発芽培地上でティスフを平板培養した（平板当たり４デイスク、処理当た り２平板）。７５μｇ／ｍＱカナマインンを補足した発芽培地を含有する平板を 、選択可能マーカーをチェ・７りするためにテストする各植物のために含めた。

照光中ζ二おける２６℃での１週間後、個々の葉ディスクを秤量し、平均￥Ｔ鮭 重重量よび標準偏差を各処理について測定しに。

すべての植物からの葉ディスクは緑のままで、ＡＥＣの不存在下でふくらんだ。

ＡＥＣの存在下では、対照植物において増殖は強く抑制された。対照的に、推定 ｄａｐＡ工植物からの葉ディスクは緑のままでいられるその能力およびＡＥＣの 存在下で増殖することによって容易に同定された。このスクリーニング手法を用 いて多くのＡＥＣ−耐性植物を同定した。１のかかる植物の特徴付けを以下で詳 細に記載する。

ＡＥＣの存在に対する植物３２７からの葉ディスクの応答を水対照植物１０１か らの葉ディスクのそれと比較した。結果を第１表に示す。

第１表−葉ディスクＡＥＣスクリーニング＊Ｏｔｏｏ　　　　　　　１００ ０、１　　　　　　　　８８　　　　　　　３２木葉ディスクの新鮮型ｊｌ（平 板当たり４皿、ＡＥｃＪｉ当たり２平板）を１週間後に測定した。平均新鮮重量 を各ＡＥＣ処理について測定し、ＡＥＣを含まない平板上の平均新鮮重量の百分 率として表した。

２、葉抽出物におけるリジン−耐性ＤＨＤＰシンターゼ活性３２７の幼葉および 種子成長ＮＴ−３ＲＩ植物を以下のごとくに抽出した。組織１ｇ当たりＯ，１４ ｇｍポリビニルピロリドンの存在下、２ｍＣ抽出緩衝液（０，１１リン酸カリウ ム（ｐＨ７，５，４’Ｃ）　、２ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　β−メルカプトエ タノール、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム）中、４°Ｃにて、葉脈を除去した葉 １〜２グラムを摩砕した。ミラクロス（Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）　（カルバイオケ ム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）　）を通して濾過し、次いで、８０００Ｘｇ（４° Ｃ）で１０分間遠心した。穏やかに撹拌しつつ、４°Ｃにて、微９砕した固体硫 酸アンモニウムを添加することによって上澄みをゆっくりと１０％飽和に持って 行った。沈殿を遠心によって除去した。上澄みを６６％硫酸アンモニウム飽和と し、遠心によって４０〜６６％沈殿を収集した。ペレ７）をカラム緩衝液（５０ ｍＭ）リス−ＨＣＣ（ｐＨ７，５，４°Ｃ）　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭピ ルビン酸ナトリウム、１０％グリセロール）に再懸濁し、セファデックスＧ−２ ５カラム（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を通して脱塩した。

標準として蒸留水中のウシ血清アルブミン画分Ｖ扮末を用い、ブラッドフォード （Ｂｒａｄ４ｏｒｄ）　（ＲＥ　Ｆ　）の染１４−結合方法によって蛋白濃度を 測定した。

０−アミ／ベンズアルデヒド（ＡＢＡ）アＩセイ（ユガイら（Ｙｕｇａｉｅｔ　 ａｌ）、ジで一ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（、′。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２４０．４７１０〜４７１６　（＋９６５））を用い 、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ活性をモニターした。Ｌ−リジン塩酸塩スト 、り溶液を蒸留水中で作成し、濾過滅菌し、酵素反応の初期に示した濃度で添加 した。設定した時点で、２００μｇ分を取り出し、停止緩衝液（０，２１Ｍクエ ン酸、０．５３Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ５，２５°Ｃ）、新たに作成したｌｏ ｍｇ／ｍ１２無水エタノールストックから使用直前に０．２４ｍｇｏ−ＡＢＡを 添加）８００μＱ中で反応物をクエンチした。２５℃で１時間ピンク色に発色さ せ、次いで、光学密度を５２０μｍで測定した。

３２７の葉におけるＤＨＤＰシンターゼ活性は、種子成長ＮＴ−ＳＲｉの葉にお けるそれよりもほぼ３０倍高かった。より重要には、３２７葉における酵素活性 は１００μＭで添加したし一リジンに完全に耐性で、５００μＭＬ−リジンの存 在下で１４％抑制されたにすぎない。対照的に、１００μλ１Ｌ−リジンはＮ　 Ｔ　−Ｓ　ＲｌＬ−リジンで：ま活性：ま検出されなかった。

３、サザーン、′ノーザンハイブリダイゼーション分析シ二−レら（Ｓｈｕｒｅ 　ｅｔ　ａｔ）、セル（Ｃｅｌｌ）、　　３５．　２２５〜２３３（１９８３） の方法に従い、ゲノミノクＤＮＡを形質転換植物および１０１０葉から単離した 。各植物からのＤＮＡｌ０マイクログラムを別々にＢａｍＨＩおよびＢｓｔＥＩ Ｉで消化し、０．７％アπ′−ロースを通して電気泳動に付した。ＢａｍＨＩで の消化により、特徴的な１５４０ｂｐ内部断片が生成し、一方、ＢｓｔＥＩＩは 一変ｄａｐ　　Ａコーディング配列において切断する。該ゲルをナイロン膜にプ ロットし、プローブとして３！Ｐで標識したｐＤＡＰ４３０７の１５４０ｂｐＢ ａｍＨＩ断片を用いてノ＼イブリタイズさせた（サザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｒ＋ ）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ ｌ、　）、旦８，５０３〜５１７　（１９７５））ｃ該プロ・７トのオートラジ オグラフィーはＢａｍＨＩｉＭ化トラックに化機ラック　５４０ｂｐバンドおよ びＢｓｔＥＩｌ消化トラックに２個０ノ９ンドを明瞭に示した。コピー数につい ての再構築マーカーと併せると、これらの結果は、単一コピーとして形質転換植 物に存在するｄａｐ　　Ａ遺伝子と合致する。植物１０１からのＤＮＡを含有す るレーンではハイブリダイゼーションは明らかではなかった。

ノーザンブロ、ト分析も行い、結果は、ｄａｐ　Ａ遺伝子は活性に転写されたこ とを示した。形質転換植物の葉かみ単離した合計ＲＮＡおよびオリゴ−ｄＴ−選 択ポリＡ　ＲＮＡを共に用い、前記と同一のプローブは、約１１０ヌクレオチド のＲＮＡの単一種に対するハイブリダイゼーションを示した。１０１からのＲＮ 　Ａに対するハイブリダイゼーションは観察されなかった。

４、葉における遊離リジンレベル ３２７およびｌｏｔからの葉のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）抽出物を調製して遊離 アミノ酸レベルを検定した。幼葉（１〜２ｇｍ）をサイコロ状に切って水冷乳鉢 に入れ、液体窒素で被覆し、摩砕して粉末とした。摩砕した葉を一晩凍結乾燥し 、乾燥重量を測定した。

各凍結乾燥試料を冷却乳鉢に戻し、２ｍ１２１０％ＴＣＡの存在下で再摩砕した 。乳鉢をさるにＴＣＡ２ｍｉ：ですすいだ。該Ｔ　ＣＡ抽出物を合し、時々攪拌 しながる水上で３０分間インキュベートし一ニュ抽出混合物を２０分間（４°Ｃ ）遠心し、上澄みを除去し、水上に置いた。ベレ、トを２ｍＬ！１０％ＴＣＡで 再度抽出し、上澄みをプールした。プールした抽出物２ミリリツトルを５ｍ（エ ーテルで３回抽出した。エーテル抽出物を分析まで一７０°Ｃで貯蔵した。

ジゴーンズら（Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・オブ・クロマトグラフ ィー（Ｊ、　Ｃｈｒｏａ＋ａｔｏｇ、　）、　　２６旦、４７１〜４Ｂ２（１９ ８３）の０−フタルジアルデヒド誘導体化方法を用い、逆相ＨＰＬＣによって遊 離アミノ酸レベルを測定した。ＮＴ−５Ｒ１葉の３試料は凍結乾燥組繊１グラム 当たり平均７５μｇの遊離リジンであった。３２７葉の２試料は、各々、凍結乾 燥組織１グラム当たり１５４５０および１４６３０μｇの遊離リジン値を与え、 即ち、ｉｉ離リジンが約２００倍増加しｆ二。

５、ｄａｐＡ遺伝子の遺伝性 タバコ植物３２７を開花させ、自家授粉させ、種子を結ばせｆ為成熟した乾燥種 子を収集し、１０％漂白剤で表面滅菌し、滅菌水で十分すすいだ、０．１．１０ ．３０．１００および３００μＸＩＡＥＣでＡＥＣを含有する格子状発芽平板（ １／４＼ＩＳ塩、２．５ｇ　ｍ／　ＯＧｅｌ　１ｔｅ）上で種子を平板培養した （平板当たり種子５０個、処理当たり２の平板）、自家授粉させた１０１からの 種子を対照として同一に処理した。１０日後、各平板上の緑色の実生の数を数え た。２週間後、実生をＧｅ１ｒｉｔｅから穏やかに引っ張り、根の長さを測定し た。結果を第２表に示すが、ＡＥＣ耐性特性は３２７の後代に遺伝していること が明瞭に示される。

第２表−実生におけるＡＥＣ耐性 平均根長（対照の％） 平板培養２週間後に測定した根長。平均根長は各ＡＥＣ処理について測定し、結 果をＡＥＣを欠く培地上の平均根長の百分率として表す。

種々の特別かつ好ましい具体例および技術を参照して本発明を説明してきた。し かしながら、本発明の精神および範囲内で多くの変形および修飾を行うことがで きることは理解されるであろう。

図１ ４−ホスホアスパルテート ＬＬ−２，６−ジアミノビメレート 図２Ａ 図２Ｂ 国際調査報告

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）外来性遺伝子を植物組織源の細胞に導入し、次いで（ｂ）該外来性遺 伝子を該細胞で発現させることよりなり；ここに、該遺伝子の第１の配列が、内 因的に生産された遊離Ｌ−リジンによるフィードバック抑制に対し実質的に耐性 であるジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＤＨＤＰＳ）をコード付けすることを 特徴とする植物において遊離Ｌ−リジンのレベルを上昇させる方法。
2. ２．該ＤＨＤＰＳ遺伝子が細菌遺伝子である請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．該外来性遺伝子が、第１のＤＮＡ配列の５′−末端に連結し、かつ該細胞の 葉緑体にＤＨＤＰＳを局在させる葉緑体トランジット（ｔｒａｎｓｉｔ）ペプチ ド（ＣＴＰ）をコード付けする第２のＤＮＡ配列よりなる請求の範囲第３項記載 の方法。
4. ４．該ＣＴＰＤＮＡ配列が、アミノ末端ＣＴＰよりなるプレ蛋白をコード付けす る植物核遺伝子から得られるＣＴＰＤＮＡ配列と実質的に同一である請求の範囲 第３項記載の方法。
5. ５．該外来性遺伝子よりなるプラスミドを細胞に導入する請求の範囲第３項記載 の方法。
6. ６．該プラスミドが細菌クローニングベクターである請求の範囲第５項記載の方 法。
7. ７．該プラスミドがエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のクローニングベクタ ーである請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．電気穿孔、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクティール、また はリポソームカプセル化の技術によって外来性遺伝子を該植物細胞に導入する請 求の範囲第１項記載の方法。
9. ９．アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換によって 外来性遺伝子を植物細胞に導入する請求の範囲第５項記載の方法。
10. １０．内因的に生産される遊離Ｌ−リジンによるフィードバック抑制に対し実質 的に耐性であるジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＤＨＤＰＳ）を発現する外来 性遺伝子よりなる形質転換植物細胞。
11. １１．該ＤＨＤＰＳ遺伝子が細菌遺伝子である請求の範囲第１０項記載の植物細 胞。
12. １２．該ＤＨＤＰＳ遺伝子がエシェリヒア・コリｄａｐＡ遺伝子である請求の範 囲第１１項記載の植物細胞。
13. １３．外来性遺伝子が葉緑体トランジットペプチド（ＣＴＰ）も発現する請求の 範囲第１０項記載の植物細胞。
14. １４．該ＣＴＰがエンドウ豆ＣＴＰである請求の範囲第１３項記載の植物細胞。
15. １５．ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＤＨＤＰＳ）を使用する生合成経路に よって遊離Ｌ−リジンを生産し、該ＤＨＤＰＳが、（ａ）外来性遺伝子の産物ａ であり、かつ（ｂ）内因的に生産される遊離Ｌ−リジンによるフィードバック抑 制に対し実質的に耐性である形質転換植物。
16. １６．該外来性ＤＨＤＰＳ遺伝子が細菌遺伝子である請求の範囲第１５項記載の 形質転換植物。
17. １７．該外来性遺伝子がエシェリヒア・コリｄａｐＡ遺伝子である請求の範囲第 １６項記載の形質転換植物。
18. １８．遊離Ｌ−リジンのレベルが同一種の非形質転換植物におけるレベルの少な くとも約５０倍高い請求の範囲第１５項記載の形質転換植物。
19. １９．遊離Ｌ−リジンによるフィードバック抑制に対し実質的に耐性であるジヒ ドロジピコリン酸シンターゼ（ＤＨＤＰＳ）についてコード付けする遺伝子より なり、該遺伝子が、その５′−末端にて、アミノ末端葉緑体トランジットペプチ ド（ＣＴＰ）をコード付けする第２のＤＮＡ配列に正しい読み枠で連結し、かつ 該ＤＨＤＰＳ遺伝子および該第２のＤＮＡ配列が、植物細胞で機能的な調節領域 の転写および翻訳調節制御下にある発現カセット。
20. ２０．該ＤＨＤＰＳ遺伝子が細菌遺伝子である請求の範囲第１９項記載の発現カ セット。
21. ２１．該遺伝子がエシェリヒア・コリｄａｐＡ遺伝子である請求の範囲第２０項 記載の発現カセット。
22. ２２．該カセットが少なくとも１のＴ−ＤＮＡを有する請求の範囲第１９項記載 の発現カセット。
23. ２３．さらに、植物細胞で選沢可能な機能をコード付けする遺伝子よりなる請求 の範囲第１９項記載の発現カセット。
24. ２４．約５キロベース未満よりなる請求の範囲第１９項記載の発現カセット。
25. ２５．約２〜３キロベースよりなる請求の範囲第２４項記載の発現カセット。
26. ２６．請求の範囲第１９項記載の発現カセットよりなる、エシェリヒア・コリお よびアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ） のうち少なくとも１で複製可能なプラスミド。