DE68912783T2 - Verfahren zum induzieren einer überproduktion von lysin in pflanzen. - Google Patents

Description

Hintergrund der Erfindung
• Neuere Fortschritte in der Gentransfer-Technologie haben neue Möglichkeiten eröffnet, gewünschte Gene in Pflanzen einzuführen. Es wurde eine Reihe solcher Gene eingeführt, um der Wirtspflanze einen gewissen Schutz gegen Umweltbelastungen zu verleihen. Beispiele dafür sind Gene, die Verträglichkeit gegenüber chemischen Herbiziden verleihen, wie beispielsweise Glyphosat (Gomai, Nature, 317, 741-744 (1985) und Shah, Science, 233, 478-481 (1986)), Phosphinothricin (De Block, EMBO, 6, 2513-2518 (1987)), Bromoxynil (Stalker, 1987, Internationale Patentanmeldung PCT/US 87/00044) und Sulfonylharnstoffe (Haughn, Mol. Gen. Genet., 211, 266-271 (1988)). Es wurden auch transgene Pflanzen erzeugt, die gewissen Insektenschädlingen (Adang, 1985, veröffentlichte europäische Patentanmeldung 142 924 und Vaeck, Nature, 328, 33-37 (1987)), Pilzkrankheiten (Taylor, Mol. Gen. Genet., 210, 572-577 (1987)) und Virkuskrankheiten (Abel, Science, 232, 738-743 (1986) und Nelson, Bio/Technol., 6, 403-405 (1988)) widerstehen.
• Ein anderes interessierendes Gebiet ist das Entwerfen von Pflanzen, insbesondere von Feldfrüchten, mit zusätzlichen Werteigenschaften. Ein Beispiel für eine solche Eigenschaft ist verbesserte Nahrungsmittelqualität in angebauten Nahrungsmitteln. Lysin, eine in menschlicher Ernährung und in der Nahrung monogastrischer Tiere essentielle Aminosäure, ist in den meisten Zeralien eine der drei am meisten begrenzenden Nährstoffe. Infolgedessen muß Ernährung auf Getreidebasis wie beispielsweise auf Basis von "Korn", Gerste, Weizen, Reis, Mais, Hirse, Sorgum und dergleichen mit teuerem synthetischen Lysin oder mit Lysin enthaltender Nahrung aus Ölsaatprotein ergänzt werden. Das Erhöhen des Lysingehalts dieser Getreide oder beliebiger, als Komponenten zugesetzter Feldfrüchte ergäbe deshalb einen beachtlichen zusätzlichen Wert. Bis jetzt haben sich die Versuche zum Erhöhen der Lysingehalte von Pflanzen auf herkömmliche Züchtungsverfahren beschränkt und - neueren Datums - auf Mutagenese und die Zellkulturtechnik.
• Natürlich vorkommende Mutanten mit hohem Lysingehalt von Mais (Mertz, Science, 145, 279 (1964) und Nelson, Science, 150, 1469-1470 (1965)), Gerste (Munck, Science, 168, 985-987 (1970)) und Sorgum in Körnerform (Singh et al., Crop Sci., 13, 535-539 (1973)) wurden identifiziert. In jedem dieser fälle davon ist der verbesserte Lysingehalt nicht das Ergebnis einer erhöhten Produktion an freiem Lysin, sondern ergibt sich aus Verschiebungen im Gesamt-Proteinprofil des Korns: der kleinere Gehalt an Endospermproteinen (Prolamine) mit Lysinmangel wird ergänzt durch erhöhte Werte an lysinreicheren Proteinen (Albumine, Globuline und Gluteline). Obwohl diese Mutanten vom Standpunkt der Ernährung her gesehen überlegen sind, stehen sie mit verminderter Ausbeute und schlechter Kornqualität in Verbindung, was ihre landwirtschaftliche Brauchbarkeit einschränkt.
• Ein alternativer, zum Verbessern der Ernährungsqualität verwendeter Ansatz war die in-vitro-Selektion auf biochemische Varianten, die einen erhöhten Speicher an freiem Lysin aufweisen. Lysin ist ein Mitglied der "Aspartat- Familie" der Aminosäuren in höheren Pflanzen und Mikroorganismen (siehe Figur 1). Als solche ist die Regulation ihrer Biosynthese eng verknüpft mit der anderer Mitglieder der Familie: Threonin, Methionin und Isoleucin. Die Regulation des Metabolitenflusses scheint hauptsächlich durch Feedback- Inhibition von Endprodukten an enzymatischen Schlüsselschritten zu erfolgen. Der erste dieser Schritte, die durch Aspartatkinase (AK) katalysierte Phosphorylierung von Aspartat, ist allen vier Endprodukten gemeinsam. Eine zweite Regulationsstelle befindet sich bei der Branchpoint-Reaktion: die Kondensation von Pyruvat mit Aspartyl-Semialdehyd zur Bildung von Dihydrodipicolinsäure. Diese Reaktion ist die erste, die der Biosynthese von Lysin eigen ist, und wird durch Dihydrodipicolinsäure-Synthase (DHDPS) katalysiert, ein Enzym, von dem gezeigt wurde, daß es da, wo es untersucht wurde, durch Lysin stark feedback-inhibiert wird (Wallsgrove et al., Phytochem., 20, 2651- 2655 (1981), und Kumpaisal, Plant Physiol., 85, 145-151 (1987)).
• Es gibt Gründe, die Existenz von mehr als einer Form der AK anzunehmen (Miflin, 1980, in "The Biochemistry of Plants", Band 5, Amino Acids and Derivatives, Stumpf and Conn (Hrsg.), S. 420-426, Academic Press). Eine form ist empfindlich gegen eine Inhibition durch Threonin, die andere gegen eine Inhibition durch Lysin. Das Wachstum von Pflanzenzellkulturen wird in Gegenwart äquimolarer Mengen an Lysin plus Threonin inhibiert. Diese Inhibition kann umgekehrt werden durch Zusatz von Methionin oder Homoserin, (welches leicht in Methionin umgewandelt werden kann) (Green et al., Crop Sci., 14, 827-830 (1974)). Hibbered (Planta, 148, 183-187 (1980)) hat stabile Linien des Mais-Kallus selektiert, die gegen diese Wachstumsinhibierung resistent waren. Diese Linien zeigten eine Überproduktion von Threonin (6 bis 9-fach) und in geringerm Umfang von Methionin, Lysin und Isoleucin (2 bis 4-fach). Es gab Beweise dafür, daß eine lysinverträgliche AK für die beobachteten Veränderungen verantwortlich war. In den Linien, die zu ganzen, fruchtbaren Pflanzen regeneriert wurden, war die Überproduktion eine stabile, vererbbare Eigenschaft (Hibberd et al, PNAS, 79, 559-563 (1982)). Ähnliche Selektionen wurden durchgeführt an Tabak (Bourgin, 1982, in Variability in Plants Regenerated from Tissue Culture, Earle und Demarly (Hrsg.), S. 163-174, Praeger, New York), Gerste (Arruda, Plant Physiol., 76, 442-446 (1984) und Karotten (Cattoir-Reynaerts, Biochem Physiol. Pfanzen, 178, 81-90 (1983)).
• Lysinanaloge, insbesondere S(2-Aminoethyl)cystein (AEC) wurden ebenfalls entweder alleine oder in Verbindung mit Lysin- plus Threonin-Selektionen bei Versuchen verwendet, Mutanten mit Lysinüberproduktion zu isolieren. Sano et al. (J. Gen Appl. Microbiol., 16, 373-391 (1970)) konnten lysinreiche bakterielle Mutanten isolieren, indem sie die AEC-Selektion einsetzten, und es wurde vorgeschlagen, daß AEC als Falsch-Feedback-Inhibitor von AK oder von DHDPS oder von beidem wirken soll. Versuche, ähnliche Mutanten in Pflanzen zu isolieren, führten zu unterschiedlichen Ergebnissen. Widholm (Can. J. Bot., 54, 1523-1529 (1976)) mutagenisierten Tabak-Suspensionszellen und selektierten AEC-resistente Zellenlinien mit einer zehnfachen Überproduktion an Lysin. Es wurden Mutanten der Perlhirse isoliert, die eine 5- bis 7-fache Oberproduktion an Lysin zeigten (Boyes et al., Plant Sci., 50, 195-203 (1987)). Bright (Planta, 146, 629-633 (1979)) selektierten AEC-resistente Gerste- Linien, die in Abwesenheit von AEC Lysin nicht akkumulierten und von denen gezeigt wurde, daß sie AEC-aufnehmende Mutanten waren. Es gab auch Beweise dafür, daß AEC seinen inhibierenden Einfluß ausübt, indem es in Protein eingebaut wird und nicht mit der Biosynthese von Lysin in Wechselwirkung tritt. Schaeffer et al. (Plant Physiol., 84, 509-515 (1987)) setzten sequentielle AEC- und Lysin- plus Threonin-Selektion ein, um Reismutanten zu erzeugen, die im Proteinvorrat der Samen 14 % mehr Lysin enthielten, jedoch nicht mehr freies Lysin. Von Jacobsen wurde eine AEC-resistente Kartoffel kultur selektiert (J. Plant Physiol., 123, 307-315 (1986)). Dieser Mutant wies insgesamt höhere Aminosäuregehalte als Kontrollkulturen auf, zeigte jedoch keine Überproduktion von Lysin, Threonin oder Methionin. Negrutiu (Theor. Appl. Genet., 68, 11-20 (1984)) unterwarf Tabak-Protoplasten der Mutagenese gefolgt von AEC-Selektion. Es wurden zwei resistente Zellenlinien erhalten, die Lysin 10- bis 30-fach überproduzierten. Biochemische und genetische Analyse ergaben eine feedback-unempfindliche DHDP-Synthase. Die Eigenschaft wurde als einfaches dominantes Gen vererbt.
• Bis jetzt wurden die Techniken der DNA-Rekombination und des Gentransfers nicht auf das Gebiet erhöhter Metabolitenproduktion angewandt, um zusätzliche Werteigenschaften zu erhalten. Es ist jedoch bekannt, daß das Bakterium Escherichia coli Lysin auf einem Weg synthetisiert, der im wesentlichen dem höherer Pflanzen identisch ist. Dihydrodipicolinsäure-Synthase wird durch das dan-A-Gen von E. coli codiert und ist, obwohl es gegen Lysin empfindlich ist (Yugai et al., Biochim. Biophys. Acta, 62, 612-614 (1962)), verglichen mit dem gleichen, aus Pflanzen isolierten Enzym mindestens 200-fach weniger empfindlich gegenüber der Inhibition durch Lysin in vitro. Daneben akkumulieren E. coli-Zellen, die das dap-A-Gen auf einem Multicopy-Plasmid tragen, hohe Gehalte an freiem Lysin (Dauce-LeReverand, Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 15, 227-231 (1982)), was vermuten läßt, daß DHDPS einen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt katalysiert. Das Gen wurde sequenziert und charakterisiert (Richaud, J. Bacteriol., 166, 297-300 (1986) und Glassman, 1988, Dissertation, University of Minnesota, Minneapolis, MN).
• In Anbetracht des vergleichsweisen Unvermögens herkömmlicher Züchtungsverfahren und herkömmlicher Gewebskultur-Technik zum einfachen Erzeugen von Pflanzen, die wesentlich höhere Lysingehalte akkumulieren, besteht ein Bedarf, die Technik der DNA-Rekombination und des Gentransfers zum Erzeugen solcher Pflanzen einzusetzen.
Zusammenfassung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum wesentlichen Erhöhen des Gehaltes an freiem L-Lysin in einer Pflanze zur Verfügung, bei dem man: (a) in die Zellen eines Pflanzengewebe-Ausgangsmaterials ein fremdes Gen einführt, und (b) das fremde Gen in den Zellen exprimiert, wobei das fremde Gen eine DNA-Sequenz aufweist, die Dihydrodipicolinsäure-Synthase (DHDPS) codiert, welche im wesentlichen resistent gegen Feedback-Inhibition durch endogen erzeugtes freies L-Lysin ist. Bei der Ausführung des vorliegenden Verfahrens enthält das fremde Gen eine zweite DNA-Sequenz, die am 5'-Terminus der DHDPS-DNA-Sequenz hängt, und die ein Chloroplast-Transit-Peptid (CTP) codiert. Das CTP lokalisiert die DHDPS in den Chloroplasten der Zellen, wo sie eine Erhöhung der Biosynthese von freiem L-Lysin bewirken kann.
• Das vorliegende Verfahren stellt deshalb auch Pflanzenzellen zur Verfügung, die durch Einführen eines fremden Gens transformiert sind, welches eine Form der DHDPS exprimiert, die im wesentlichen resistent gegen Feedback-Inhibition durch endogenes Lysin ist. Weil Arbeitstechniken bekannt sind, mit denen Zellen aus einer großen Vielzahl von Pflanzengewebe-Ausgangsmaterial zu ganzen Pflanzen regeneriert werden können, stellt das vorliegende Verfahren eine transformierte Pflanze zur Verfügung, die freies L-Lysin über einen biosynthetischen Weg unter Einsatz von DHDPS erzeugt, wobei die DHDPS das Produkt eines fremden (exogenen) Gens ist, und die im wesentlichen resistent gegen Feedback-Inhibition durch endogen erzeugtes Lysin ist. Bevorzugte Pflanzen, die mit dem vorliegenden Verfahren transformiert werden können, sind grasartige Spezien wie beispielsweise die vorstehend aufgezählten. Die eßbaren Teile solcher transformierter Pflanzen können Gehalte an freiem L- Lysin aufweisen, die mindestens etwa 50-fach höher sind als die Lysingehalte einer untransformierten Pflanze der gleichen Spezies.
• Das zum Transformieren der Pflanzenzellen eingesetzte fremde Gen ist bevorzugt eine Chimären-Gen-Expressionskassette, die ein Gen enthält, welches für DHDPS oder ein enzymatisch funktionelles Fragment davon codiert, welches im wesentlichen resistent gegen Feedback-Inhibition ist. Die Expressionskassette enthält auch eine zweite DNA-Sequenz, die eine aminoterminale Chloroplast-Transit-Sequenz (CTS) codiert. Das DHDPS-Gen oder -Genfragment ist bei zutreffendem Leseraster an seinem 5'-Terminus mit dem CTS-Gen verbunden. Das fremde Gen steht bevorzugt unter der transkriptorischen und translatorischen Kontrolle von Regulationsbereichen, die in der Ziel-Pflanzenzelle funktionell sind. Solche Bereiche können aus DNA-Sequenzen erhalten werden, die auf Pflanzenzellen durch die Ti- oder Ri-Plasmide von A. tumefaciens, z. B. Segmenten der "T-DNA" übertragen werden. Beispielsweise kann ein brauchbarer transkriptorischer Initiationsbereich isoliert werden aus einem Ti- oder Ri- Plasmid-Gen, welches Octopin-Synthase, Nopalin-Synthase oder Mannopin-Synthase codiert. Die Expressionskassette enthält bevorzugt auch ein Gen, welches eine Funktion codiert, die in Pflanzenzellen wählbar ist, wie beispielsweise die Widerstandsfähigkeit gegen Arzneimittel oder Herbizide, so daß die transformierten Zellen - und die davon abstammenden Pflanzen - leicht identifiziert werden können.
• Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfaßt einen Expressionsvektor wie zum Beispiel ein Plasmid, welches die vorliegende Expressionskassette enthält, wobei das Plasmid zur Replikation in einem Bakterium wie beispielsweise E. coli oder Agrobacterium befähigt ist. Das fremde Gen kann in das Genom der Pflanzenzellen als "nackte" DNA mit Arbeitstechniken wie der Elektroporation, der Mikroinjektion, mit Mikroprojektilen oder mit der Liposomverkapselung eingeführt werden. Es kann auch ein Plasmid, welches das fremde Gen enthält, in das Genom der Pflanzenzellen mit von A. tumefaciens vermittelter Transformation eingeführt werden.
• Soweit hier in bezug auf ein Gen oder ein Genfragment verwendet, bedeutet der Begriff "fremd", daß das Gen oder das Genfragment von einer oder mehreren anderen Quellen als den Genom der Pflanzenspezies erhalten ist, in dem es schließlich exprimiert wird. Die Quelle kann eine natürliche Quelle sein, zum Beispiel kann das Gen von einer anderen Quelle lebender Materie erhalten werden, wie beispielsweise aus Bakterien, Hefe, Pilzen und dergleichen oder einer anderen Pflanzenspezies. Eine bevorzugte Quelle für ein Gen, welches DHDPS funktionell codiert, ist das E. coli dap-A-Gen. Die Quelle kann auch eine synthetische Quelle sein, zum Beispiel kann das Gen oder Genfragment durch chemische Synthese in vitro hergestellt werden.
• Soweit hier in bezug auf ein fremdes Gen oder Genfragment verwendet, welches in Pflanzenzellen eingeführt worden ist, bedeutet der Begriff "exprimiert", daß das Gen in das Genom der Zellen stabil eingeführt ist, so daß das von dem Gen codierte Produkt, zum Beispiel ein Enzym wie DHDPS, in den Zellen in funktioneller Form erzeugt wird. Beispielsweise katalysiert eine funktionelle Form von DHDPS einen Schritt der endogenen Biosynthese von Lysin.
• Soweit hier in bezug auf die Feedback-Inhibition von DHDPS durch endogenes Lysin verwendet, bedeutet der Begriff "im wesentlichen resistent", daß die DHDPS in Gegenwart von endogenem Lysin in dem Umfang funktionell bleibt, daß die Pflanze Lysin in wesentlichem Überschuß zu dem Lysin akkumuliert, welches von einer Pflanze derselben Spezies akkumuliert wird, die keine derartig resistente DHDPS synthetisiert. Beispielsweise enthalten neue Pflanzen als Ergebnis des vorliegenden Verfahrens extrahierbare Lysingehalte, die mindestens etwa 10 mal, und bevorzugt mindestens etwa 25 mal, zum Beispiel etwa 50 - 250 mal höher sind als die von Pflanzen derselben Spezies, die nur native DHDPS enthalten. Freies Lysin ist darüber hinaus nicht in Mengen vorhanden, welches für die bestimmte Pflanzenspezies, die verändert wurde, toxisch ist. Daneben haben Pflanzenzellen oder Pflanzen, die als "transformiert" bezeichnet werden, das fremde Gen oder Genfragment stabil, funktionell und vererblich in ihrem Genom intregiert.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
• Figur 1 ist eine schematische Darstellung des biosynthetischen Weges von Lysin, wobei die folgenden Buchstaben folgende Enzyme bedeuten: a--Aspartat- Kinase; b--Aspartylsemialdehyd-Dehydrogenase; c--Dihydrodipicolinsäure- Synthase; d--Dihydrodipicolinsäure-Reduktase; e--Succinyloxoaminopimelat- Synthase; f--Succinyldiaminopimelat-Aminotransferase; g--Succinyldiaminopimelat-Desuccinylase; h--Diaminopimelat- und i--meso-Diaminopimelat-Decarboxylase.
• Figur 2 zeigt schematisch die in Beispiel I beschriebene Manipulation des dap-A-Gens.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
• Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zum Erzeugen von Pflanzen, wie beispielsweise Getreide, die erhöhte Gehalte an freiem Lysin produzieren. Die Überproduktion entsteht durch das Einführen und Exprimieren eines eingeführten bakteriellen Gens, welches Dihydrodipicolinsäure (DHDP)-Synthase codiert, das Branchpoint-Enzym der Biosynthese von Lysin sowohl in Pflanzen als auch in Bakterien. Native Pflanzen-DHDP-Synthase ist äußerst empfindlich gegen Feedback-Inhibition durch L-Lysin und bildet die Schlüsselstelle der Regulation des Synthesewegs. Im Gegensatz dazu ist aus Escherichia coli isolierte DHDP-Synthase aktiv in Anwesenheit von mindestens 200-fach höheren Gehalten an L-Lysin.
• Damit das Einführen eins Gens, welches eine Lysin-verträgliche DHDP-Synthase codiert, zur Akkumulation höhere Gehalte an freiem Lysin in einer Pflanze führt, muß eine lange komplexe Ereigniskette erfolgen.
• Erstens muß das bakterielle DHDP-Synthase-Gen in vitro modifiziert werden, damit es regulatorische Signale einschließt, die für die Genexpression in Pflanzenzellen erforderlich sind. Weil berichtet wurde, daß der biosynthetische Weg von Lysin in Pflanzen in den Chloroplasten sequestriert wird, wird das bakterielle Gen bevorzugt so modifiziert, daß Sequenzen zugefügt werden, die eine aminoterminale Chloroplast-Transit-Peptid-Sequenz codieren, um das Genprodukt auf diese Organellen zu richten.
• Um die Biosynthese von Lysin zu verändern, müssen das Gen in die Pflanzenzellen eingeführt werden und diese transformierten Zellen identifiziert werden. Das Gen muß auch in das Genom der Pflanzenzelle stabil eingebaut sein. Die transkriptorischen Signale des Gens müssen erkannt werden und in den Pflanzenzellen funktionell sein. Dies bedeutet, das Gen muß in die Messenger-RNA transkribiert werden, und die mRNA muß im Pflanzenkern stabil sein und zur Translation intakt zum Zytoplasma transportiert werden. Das Gen muß geeignete translatorische Signale aufweisen, um von den Pflanzenzellen-Ribosomen erkannt und korrekt translatiert zu werden. Das Polypeptid-Gen-Produkt muß dem proteolytischen Angriff im Cytoplasma entkommen und muß in der Lage sein, eine dreidimensionale Konfiguration anzunehmen, die ihm enzymatische Aktivität verleiht. Die bakterielle DHDP-Synthase muß danben in der Lage sein, in der Biosynthese von Lysin zu fungieren; dies bedeutet, sie muß in der Nähe der nativen Pflanzenenzyme angeordnet sein, die die flankierenden Schritte bei der Biosynthese katalysieren (vermutlich in den Chloroplasten), um die erforderlichen Substrate zu erhalten (Aspartylsemialdehyd und Pyruvat) und auf das geeignete Produkt zu leiten (Dihydropicolinsäure).
• Selbst wenn all diese Bedingungen eingehalten werden, ist eine erfolgreiche Überproduktion von Lysin kein vorhersagbares Ereignis. Es darf keinen anderen Kontrollmechanismus geben, der die verminderte Regulation beim DHDP-Synthase- Schritt kompensiert. Dies bedeutet nicht nur keine andere Inhibition der Biosynthese, sondern auch keinen Mechanismus, der die Abbaugeschwindigkeit des akkumulierten Lysins steigert. Lysin muß auch in Mengen überproduziert werden, die für die Pflanze nicht toxisch sind. Schließlich muß die eingeführte Eigenschaft stabil und vererbbar sein, um wirtschaftliche Entwicklung und Verwendung zu erlauben.
Modifikation eines bakteriellen Gens zur Expression und Funktion in Pflanzenzellen
• Ein Gen, welches Dihydrodipicolinsäure-Synthase (DHDPS) codiert, kann aus jedem beliebigen Mikroorganismus erhalten werden, der Lysin auf dem Diaminopimelat-Weg synthetisiert. Ein Schlüsselkriterium bei der Auswahl des Gens ist die relative Unempfindlichkeit des Genprodukts (DHDPS) gegen Inhibition durch Lysin. Ein solches Gen, welches zum Einsatz im vorliegenden Verfahren ein bevorzugtes Ausgangsmaterial darstellt, ist das E. coli dap-A-Gen, welches eine funktionelle 32-kD-Spezies der DHDPS codiert, die gegen Feedback-Inhibition durch Lysin äußerst resistent ist. Das Gen kann aus dem Mikroorganismus mit im Stand der Technik bekannten Verfahren isoliert werden. Solche Verfahren sind beispielsweise das Screenen einer Genombibliothek auf eine Komplementation eines bekannten Mutanten von DHDPS; das immunologische Screenen von Polypeptiden, die durch Genbibliotheken exprimiert werden; das Screenen einer Genombibliothek auf eine Hybridisation mit einer radiomarkierten Oligonucleotid-Sonde und dergleichen.
• Die Oligonucleotid-Sonde kann synthetisiert werden auf der Grundlage von Sequenzen, die von Genen anderer Spezien stammen oder von der riversen Translation der Polypeptid-Sequenz einer isolierten DHDPS-Untereinheit. Alternativ kann das Gen vollständig oder teilweise chemisch synthetisiert werden.
• Wenn das Gen isoliert ist, wird es mit Standardverfahren der DNA-Rekombination und der Molekularanalyse charakterisiert. Solche Arbeitstechniken sind im Stand der Technik bekannt und werden ausgeführt in Maniatis et al "Molecular cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982). Typisch wird das das DHDPS-Gen tragende DNA-Fragment auf das kleinste mögliche funktionelle Fragment reduziert; dies bedeutet, daß die äußere DNA, die das Gen flankiert, mit Verfahren wie der Ba131-Digestion, Löschen eines bekannten Restriktions-Endonucleasenfragments und dergleichen entfernt wird, um das kleinste DNA-Fragment zu erhalten, welches beispielsweise den DHDPS- Mutanten noch komplimentiert. Dieses Fragment umfaßt normalerweise weniger als drei Kilobasen, häufiger etwa eine Kilobase. Die Nucleotidsequenz dieses DNA-Fragments kann dann mit einer Reihe herkömmlicher Verfahren bestimmt werden. Das offene Leseraster (Codierungssequenz), die vermutliche RNA- Polymerase-Bindungsstelle (Promoter), die ribosomale Bindungsstelle und die transkriptorische Terminations-Signalsequenz werden dann identifiziert. Die transkriptorische Initiationsstelle kann bestimmt werden mit Verfahren wie beispielsweise der S1-Nuclease-Kartierung oder der primer-repair-Analyse.
• Extrakte von Bakterien (typisch E. coli), die das isolierte Gen auf einem Plasmid enthalten, werden untersucht bzw. gemessen, um die Anwesenheit von DHDPS-Aktivität und die relative in-vitro-Beständigkeit der enzymatischen Aktivität gegenüber zugesetztem L-Lysin zu bestätigen.
• Nachdem das Gen charakterisiert ist, wird es modifiziert, um die Integration, Expression und Funktion des Genprodukts in der Wirts-Pflanzenzelle zu erreichen. Die bevorzugten Modifikationen sind: 1) das Anhängen einer DNA-Sequenz, die für ein aminoterminales Chloroplast-Transit-Peptid codiert, am 5'Terminus der DHDPS-Codierungssequenz; 2) das Ersetzen von bakteriellen regulatorischen 5'- und 3'-Sequenzen durch regulatorische 5'- und 3'-Sequenzen, die von Pflanzenzellen erkannt und in ihnen funktionell sind; und 3) Insertion dieser pflanzenspezifischen Expressionskassette in einen Vektor, der geeignet ist, das DHDPS-Gen in die Zellen der Wirtspflanze einzuführen und darin stabil zu etablieren.
Anhängen einer Chloroplast-Transit-Peptid (CTP)-DNA-Sequenz
• Alle bis heute in Pflanzen untersuchten biosynthetischen Lysin-Enzyme wurden in den Chloroplasten lokalisiert. Um deshalb eine richtige Lokalisation des Produkts eines Fremdgens zu erreichen, wird an den 5'-Terminus der DNA- Sequenz, die für DHDPS codiert, bei zutreffendem Leseraster ein DNA-Fragment angehängt, welches eine Chloroplast-Transit-Peptid-Sequenz codiert, wodurch ein vollständiges Transit-Peptid-DHDPS-Präprotein aus den Transkripten der Genfusion translatiert wird. Brauchbare Transit-Peptide (typischerweise mit einer Länge von 40 bis 70 Aminosäuren) fungieren posttranslatorisch, um das Präprotein auf den Chloroplasten zu richten, wo das Präprotein mit einem energieabhängigen Prozeß eingeschleust wird. Das Transit-Peptid wird entweder während oder nach dem Einschleusen gespalten, um das reife Polypeptid zu liefern.
• Das dieses Transit-Peptid codierende DNA-Fragment kann aus einer Vielzahl nuklearer Pflanzengene erhalten werden, solange die Produkte dieser Gene als ein aninoterminales Transit-Peptid enthaltende Präproteine exprimiert und in die Chloroplasten transportiert werden können. Beispiele für Pflanzen-Genprodukte, von denen bekannt ist, daß sie solche Transit-Peptid-Sequenzen einschließen, sind die kleine Untereinheit des Ribulosebisphosphat-Carboxylase, Ferredoxin, das Chlorophyl-a/b-Bindungsprotein, ribosomale Chloroplast-Proteine, die durch nukleare Gene codiert sind, gewisse Hitzeschock- Proteine, biosynthetische Aminosäure-Enzyme wie beispielsweise Acetohydroxysäure-Synthase und 3-Enolpyruvylphosphorshikimat-Synthase und dergleichen. Alternativ kann das das Transit-Peptid codierende DNA-Fragment entweder ganz oder teilweise aus den bekannten Sequenzen der beispielsweise vorstehend aufgelisteten Transit-Peptide chemisch synthetisiert werden.
• Unbesehen der Quelle für das das Transit-Peptid codierende DNA-Fragment sollte es ein Translations-Initiations-Codon enthalten und eine Aminosäuresequenz codieren, die von Chloroplasten der Wirtspflanze erkannt und darin fungiert. Es sollte auch die Aminosäuresequenz an der Verknüpfung zwischen dem Transit-Peptid und der reifen DHDPS-Untereinheit beachtet werden, wo das Präprotein gespalten wird, um reife DHDPS zu liefern. Es wurden bestimmte gesicherte Aminosäuresequenzen identifiziert und können als Richtschnur dienen. Die genaue Fusion der das Transit-Peptid codierenden Sequenz mit der die DHDPS codierenden Sequenz können die Manipulation einer oder beider DNA- Sequenzen erfordern, um beispielsweise eine herkömmliche Restriktionsstelle einzuführen. Dies kann mit Verfahren bewerkstelligt werden wie beispielsweise der site-directed-Mutagenese, der Insertion eines chemisch synthetisierten Oligonucleotid-Linkers und dergleichen.
• Die Funktion des Chloroplast-Transit-Peptids kann in vitro wie folgt untersucht bzw. bestimmt werden. Die Transit-Peptid-DHDPS-Gen-Expressionskassette kann in eine beliebige einer Anzahl von Plasmidvektoren eingeführt werden, so daß das Gen in richtiger Orientierung unter der transkriptorischen Kontrolle eines bakteriophagen Promoters plaziert wird, wie beispielsweise SP6, T3, T7 und dergleichen. Das entstehende Plasmid wird dann zur Bildung eines linearen DNA-Moleküls an einer bestimmten Restriktionsstelle in 3'-Stellung zur codierenden Sequenz digestiert. Dieses DNA-Molekül wird dann unter Verwendung einer für den verwendeten Promoter spezifischen RNA-Polymerase einer run-off- Transkriptions-Reaktion unterworfen. Die Ausbeuten solcher Reaktionen betragen typischerweise 10 bis 12 Mikrogramm einer im wesentlichen reinen Messenger-RNA (mRNA) pro Mikrogramm des linearen DNA-Templats. Diese mRNA-Transkripte werden dann in Anwesenheit einer oder mehrerer radiomarkierter Aminosäuren translatiert, wobei in-vitro-Translationssysteme verwendet werden wie beispielsweise Weizenkeime oder Kaninchen-Reticulocytenlysat, um radiomarkiertes Präprotein zu erhalten.
• Das radiomarkierte Präprotein wird dann mit isolierten intakten Chloroplasten in Anwesenheit von Licht inkubiert, um die eingeschleuste Leistungsfähigkeit zu messen. Die Chloroplasten werden dann mit einer Protease oder einer Kombination von Proteasen behandelt wie beispielsweise Thermolysin, Trypsin, Chymotrypsin und dergleichen. Bei dieser Behandlung wird alles Protein abgebaut, welches nicht innerhalb der Chloroplasten sequestriert ist. Nach Waschen in Anwesenheit von Proteasen-Inhibitoren werden die Chloroplasten durch Verwirbeln, Einfrier/Auftau-Behandlung, Verkleinern des Osmoticums oder einer Kombination davon lysiert. Das Lysat kann (a) unmittelbar bestimmt werden, (b) es kann zuerst der Immunpräzipitation unterworfen werden, wobei ein antibakterielles Antiserum gegenüber der DHDPS-Untereinheit verwendet wird, welches mit Standardverfahren hergestellt wird, (c) es kann zentrifugiert werden, um stromale Proteine (Überstand) von Proteinen abzutrennen, die in den Thylakoidmembranen (Pellet) lokalisiert sind, oder (d) eine Kombination dieser Maßnahmen kann eingesetzt werden. Die SDS-Polyacrylamidgel- Analyse wird eingesetzt, um die Anwesenheit oder Abwesenheit einer radiomarkierten Proteinbande zu bestätigen, die dem Molekulargewicht der reifen bakteriellen DHDPS-Untereinheit entspricht. Die Anwesenheit der Bande zeigt an, daß das Präprotein eingeschleust und zur richtigen Größe verarbeitet worden ist.
Anhängen von von der Pflanze erkannten regulatorischen Sequenzen
• Die Expression des bakteriellen Gens wie beispielsweise DHDPS in Pflanzenzellen erfordert regulatorische Sequenzen, die von den Pflanzenzellen erkannt werden und darin funktionell sind. Diese Sequenzen schließen einen 5'-transkriptorischen Initiationsbereich und 3'-translatorische und -transkriptorische Terminationsbereiche ein. Der 5'-transkriptorische Initiationsbereich unfaßt die RNA-Polymerase-Bindungsstelle (Promoter). Er kann auch Bereiche einschließen, die für die Regulation der Transkription benötigt werden, wenn die Regulation durch chemische oder physikalische Induktion oder Repression vermittelt wird.
• Beispiele für eine solche Regulation sind die lichtinduzierte Expression der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphat-Carboxylase, die wärmeinduzierte Expression von Hitzeschock-Proteinen, die entwicklungsmäßig regulierte Expression, die von Wunden oder durch Stress induzierte Expression und dergleichen.
• Die 5'-Sequenzen können auch transkriptorische Enhancersequenzen umfassen. Die 5'-Bereiche können nativ zur Wirtspflanze sein oder können von anderen Pflanzen stammen, wenn die Sequenzen in der Wirtspflanze funktionell sind. Geeignete Sequenzen können auch erhalten werden aus Genen des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens, unter Einschluß von Octopin-Synthase, Nopalin- Synthase, Mannopin-Synthase und dergleichen oder können aus bestimmten viralen Genen erhalten werden. Alternativ kann der transkriptorische Initiationsbereich ganz oder teilweise chemisch synthetisiert werden.
• Der 3'-Bereich umfaßt transkriptorische Terminationssequenzen und kann Polyadenylierungs-Signal-Sequenzen umfassen. Dieser Bereich kann vom selben Gen stammen wie die 5'-Sequenzen oder von einem anderen Gen. Diese Sequenzen können ebenfalls chemisch synthetisiert werden.
• Die entstehende Expressionskassette kann einen 5'-transkriptorischen Initiationsbereich, eine Chloropl ast-Transit-Peptid-Codierungssequenz, die Codierungssequenz der bakteriellen DHDPS-Untereinheit, einen translatorischen Stop-Codon und einen 3'-transkriptorischen Terminationsbereich umfassen. Die Kassette umfaßt normalerweise weniger als fünf Kilobasen, bevorzugt zwischen zwei und drei Kilobasen.
Insertion einer Expressionskassette in einen Vektor zur Transformation von Pflanzen
• Die Auswahl eines Vektors zum Einführen der bakteriellen DHDPS-Expressionskassette in Pflanzenzellen hängt ab von der Auswahl des Transformationsverfahrens, welches wiederum von der Wirtspflanze und der Auswahl des Pflanzengewebe-Ausgangsmaterials abhängt. Eine große Anzahl von Vorschriften für das Einführen fremder DNA in die Zellen sowohl von Monokotylen als auch von Dikotylen stehen zur Verfügung, unter Einschluß der Verwendung von Mikroprojektilen, der Mikroinjektion, der Elektroporation, der Inkubation mit Ca&spplus;&spplus;-präzipitierter DNA, der Inkubation mit Lyposomen, die die fremde DNA enthalten (bevorzugt in Anwesenheit von PVA und Ca²&spplus;) virale Systeme und der durch Agrobacterium vermittelten Transformation, siehe M. Fromm et al., PNAS USA, 82, 5824 (1985) (Electroporation), T. M. Klein et al., Nature, 327, 70 (1987) (Mikroprojektile), P. Lurquin et al., Plant Sci. Lett., 25, 133 (1982) (Liposome) und J. Paszkowski et al., EMBO J., 3, 2717 (1984) (Verwendung von OaMV-GenVI-Expressionssignalen), deren Offenbarung zum Inhalt der vorliegenden Beschreibung gemacht wird.
• Die ersten fünf Verfahren werden mit nackter- DNA ausgeführt, wobei die Expressionskassette in einfacher Weise auf jedem beliebigen E. coli-Klonierungsvektor getragen werden kann, wie beispielsweise die Plasmide pBR322, pRK290, pACYC184 und dergleichen. Bei viralen Vektoren ist es erwünscht, daß das System seine Replikationsfunktionen beibehält, jedoch keine Funktionen zur Krankheitsentstehung aufweist.
• Zur von Agrobacterium vermittelten Transformation ist die Expressionskassette in einem Vektor enthalten und von Fragmenten des Agrobacterium-Ti- oder -Ri- Plasmids flankiert, die die rechte und wahlweise die linke Grenze der vom Ti- oder Ri-Plasmid übertragenen DNA (T-DNA) darstellt. Dies erleichtert die Integration des fremden Gens in das Genom der Wirtspflanzenzelle. Dieser Vektor enthält auch Sequenzen, die die Replikation des Plasmids in Agrobacterium-Zellen wie auch in E. coli-Zellen erleichtern.
• Alle DNA-Manipulationen werden typischerweise in E. coli-Zellen durchgeführt, und das Endplasmid, welches die DHDPS-Expressionskassette trägt, wird durch direkte DNA-Transformation, Konjugation und dergleichen in Agrobacterium- Zellen bewegt. Diese Agrobacterium-Zellen enthalten ein zweites Plasmid, welches ebenfalls von Ti- oder Ri-Plasmiden stammt. Dieses zweite Plasmid trägt alle vir-Gene, die zum Transfer der fremden DNA in die Pflanzenzellen benötigt werden.
• Unbesehen der Auswahl des Vektors oder der Transformationsvorschrift wird die Identifikation von transformierten Pflanzenzellen erleichtert durch das Einschließen eines Gens, welches eine Funktion codiert, die in Pflanzenzellen wählbar ist. Bevorzugte Gene sind die, die Beständigkeit bzw. Widerstandsfähigkeit gegen chemische Stoffe codieren, die gegenüber Pflanzenzellen normalerweise inhibitorisch sind, wie beispielsweise Beständigkeit gegen Hygromycin, Kanamycin, Methotrexat und gewisse Herbizide. Der wählbare Marker kann von einem getrennten Plasmid getragen werden, das mit dem die DHDPS tragenden Plasmid co-transformiert wird, oder er kann von demselben Plasmid wie die DHDPS-Kassette getragen werden. Bei der von Agrobacterium ermittelten Transformation kann der wählbare Marker innerhalb des Bereiches des Plasmids enthalten sein, der von den T-DNA-Grenzbereichen flankiert wird. Alternativ kann ein screenbarer Marker anstelle eines wählbaren Markers verwendet werden, wie beispielsweise das β-Glucuronidase-Gen. Mit diesem Gen transformierte Zellen können identifiziert werden durch die Produktion eines blauen Produkts bei der Behandlung mit 5-Brom-4-chlor-3-indoyl-β-D-glucuronid (X-Gluc).
Transformation und Regeneration von Pflanzen
• Die Auswahl des Pflanzengewebe-Ausgangsmaterials zur Transformation hängt ab von der Natur der Wirtspflanze und der Transformationsvorschrift. Brauchbare Gewebe-Ausgangsmaterialien sind Kallus, Suspensions-Kulturzellen, Protoplasten, Blattsegmente, Stammsegmente, Quasten, Pollen, Embryonen, Hypokotyle, Knollensegmente, meristematische Bereiche und dergleichen. Das Gewebe-Ausgangsmaterial erhält bevorzugt seine Fähigkeit bei, nach der Transformation vollständige, fruchtbare Pflanzen zu regenerieren.
• Die Transformation wird unter Bedingungen ausgeführt, die auf das Pflanzengewebe der Wahl ausgerichtet sind. Die Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe werden genügend lange der DNA ausgesetzt, die die DHDPS-Expressionskassette trägt. Diese Zeit kann von Elektropulsen von weniger als einer Sekunde bei der Elektroporation bis zu einer zwei- bis dreitägigen Co-Kultivierung in Anwesenheit von Plasmid-tragenden Agrobacterium-Zellen reichen. Ebenso variieren die verwendeten Puffer und Medien mit dem Pflanzengewebe-Ausgangsmaterial und der Transformationsvorschrift. Viele Transformationsvorschriften verwenden eine Beschickungsschicht aus suspendierten Kulturzellen (z. B. Tabak oder Black Mexican Sweet) auf der Oberfläche von festen Medienplatten, die durch eine sterile Scheibe aus Filtrierpapier von den Pflanzenzellen oder den Geweben, die zu transformieren sind, getrennt werden.
• Nach der Behandlung mit der DNA können die Pflanzenzellen oder -gewebe vor der Selektion unterschiedliche Zeitspannen kultiviert oder unmittelbar einem selektiven Agens ausgesetzt werden, wie beispielsweise den vorstehend beschriebenen. Vorschriften, die eine Exposition gegenüber Agrobacterium vorsehen, enthalten auch ein Agens, welches gegenüber dem Wachstum der Agrobacterium-Zellen inhibitorisch ist. Üblicherweise verwendete Verbindungen sind Cefotaxin und Carbenicillin. Die bei der Selektion verwendeten Medien können so formuliert werden, daß sie die transformierten Kallus- oder Suspensions-Kulturzellen in einen undifferenzierten Stadium halten oder daß die Produktion von Sprossen aus Kallus-, Blatt- oder Stammsegnenten, Knollenscheiben und dergleichen ermöglicht wird.
• Von Zellen oder Kallus, bei denen ein Wachstum in Anwesenheit von normal erweise inhibitorischen Konzentrationen des selektiven Agens beobachtet wird, wird angenommen, daß sie transformiert sind, und sie können noch einige Male auf dem gleichen Medium subkultiviert werden, um nicht resistente Bereiche zu entfernen. Die Zellen oder Kalli können dann auf die Anwesenheit der bakteriellen DHDPS-Genkassette untersucht oder bekannten Vorschriften zur Pflanzenregeneration unterworfen werden. Bei Vorschriften, die die direkte Produktion von Sprossen einschließen, wird von den auf den selektiven Medien erscheinenden Sprossen angenommen, daß sie transformiert sind, und sie können exzidiert bzw. entfernt und angewurzelt werden, entweder auf einem selektiven Medium, welches für die Wurzelproduktion geeignet ist, oder indem der exzidierte Sproß einfach in eine wurzelbildende Verbindung eingetaucht und direkt in Vermiculit eingepflanzt wird.
Charakterisierung regenerierter Pflanzen und ihrer Nachkommen
• Zum Herstellen von transgenen Pflanzen, die erhöhte Gehalte an freiem Lysin zeigen, muß das bakterielle Gen in die Pflanzenzelle aufgenommen und innerhalb des Pflanzengenoms stabil integriert werden. Von Pflanzenzellen und -geweben, die auf ihre Resistenz gegenüber einem inhibitorischen Agens ausgewählt wurden, wird angenomnen, daß sie das die Resistenz codierende Gen während der Transformationsbehandlung erworben haben. Weil dieses Markergen normalerweise mit den bakteriellen DHDP-Synthase-Gen verknüpft ist, kann angenommen werden, daß das bakterielle DHDP-Synthase-Gen auf ähnliche Weise erworben worden ist. Dann kann die Southern-Blot-Hybridisierungsanalyse unter Verwendung einer speziellen Sonde für das bakterielle DHDP-Synthase-Gen eingesetzt werden, um zu bestätigen, daß das fremde Gen in das Genom der Pflanzenzelle aufgenommen und darin integriert wurde. Diese Technik kann auch einen Hinweis auf die Anzahl der Kopien des Gens ergeben, die eingebaut worden ist. Eine erfolgreiche Transkription des fremden Gens in mRNA kann auch untersucht werden, indem man für die gesamte zelluläre RNA und/oder die zelluläre RNA, die in einem polyadenylierten Bereich angereichert worden ist, die Northern-Blot-Hybridisierungsanalyse einsetzt.
• Wenn die mRNA transkripiert ist, muß sie durch die Pflanzenribosomen in ein Polypeptid translatiert werden, wie beispielsweise die bakterielle DHDP- Synthase-Untereinheit, die ihrerseits eine dreidimensionale Konfiguration annehmen können muß, die katalytische Aktivität verleiht. Pflanzenzellen oder -gewebe, die gezeigt haben, daß sie das bakterielle DHDP-Synthase-Gen sowohl tragen als auch transkribieren, können weiter charakterisiert werden durch Extraktion der Zellen oder der Gewebe und Demonstration einer gegenüber Lysin toleranten DHDPS-Synthase-Aktivität. Diese in-vitro-Toleranz gegenüber Lysin ist bevorzugt vergleichbar mit der, die in Extrakten des Mikroorganismus beobachtet werden, der als Ausgangsstoff für das Gen gedient hat, und sollte leicht unterscheidbar sein von der gegenüber Lysin wesentlich empfindlicheren nativen DHDP-Synthase-Aktivität, die aus Kontroll-Pflanzenzellen oder -Geweben extrahiert werden kann. In Abhängigkeit von der beim Aufbau der Kassette verwendeten transkriptorischen Initiation und regulatorischen Sequenzen kann die Aktivität in allen Pflanzengeweben in ausgewählten Geweben oder nur unter ausgewählten induzierenden Bedingungen festgestellt werden.
• Unbesehen des Ortes der bakteriellen DHDP-Synthase-Aktivität in der Pflanze muß sie innerhalb der Pflanzenzelle lokalisiert werden, so daß sie an der Biosynthese von Lysin teilnehmen kann, indem sie die Umwandlung von Substraten in Produkt katalysiert. Die Fähigkeit der bakteriellen DHDP-Synthase, daran teilzunehmen, kann beurteilt werden, indem man die relative Toleranz von Pflanzenzellen oder -geweben gegenüber dem lysinanalogen S-(2-Aminoet- Cystein (AEC) bestimmt. Wie Lysin ist AEG ein potenter Inhibitor von pflanzlicher DHDP-Synthase. Pflanzenzellen oder -gewebe, die inhibitorischen AEC- Konzentrationen ausgesetzt werden, entwickeln einen regelrechten Hunger nach Lysin. DHDP-Synthase aus E. coli ist jedoch gegen diese Inhibierung wesentlich weniger empfindlich. Die Fähigkeit von Pflanzenzellen oder -geweben, die die aktive bakterielle DHDP-Synthase exprimieren, normalerweise inhibitorische AEC-Konzentrationen zu tolerieren, stellt einen starken Hinweis dar, daß das bakterielle Enzym bei der Biosynthese von Lysin richtig arbeitet.
• Wenn die bakterielle DHDP-Synthase zur Biosynthese von Lysin beiträgt und wenn keine anderen Mechanismen die Regulation des freien Vorrats an Lysin regulieren, kann freies Lysin mit höheren Gehalten akkumuliert werden, als es bei Kontroll-Pflanzenzellen oder -geweben beobachtet wird. Gehalte an freien Aminosäuren können auf einfache Weise gemessen werden mit Arbeitstechniken wie der Umkehrphasen-HPLC-Analyse von Trichloressigsäure (TCA)-Extrakten von transgenen Pflanzenzellen oder -geweben.
• Pflanzen, die über diese Mechanismen wesentlich erhöhte Werte an freiem Lysin akkumulieren, werden bis zur Reife gezogen. Man läßt diese Pflanzen blühen, und sie werden selbstbestäubt oder zu einer geeigneten Parentallinie gekreuzt, um Samen zu erhalten. Dieser Samen kann dann auf die Vererbbarkeit des gewünschten Wesenszuges analysiert werden.
• Ein anfängliches Screenen des Samens kann das Keimen und das Setzlingswachstum in Anwesenheit von AEC-Konzentrationen sein, die das Wachstum von aus Kontrollsanen gekeimten Setzlingen inhibieren. Setzlinge, die eine AEC- Toleranz zeigen können, können aufgezogen und vollständig charakterisiert werden, wie es vorstehend für die orginalen Regeneratpflanzen beschrieben wurde.
• Pflanzen, die durch eine solche Transformation verbessert werden können, sind beispielsweise (jedoch ohne Beschränkung darauf) verarbeitete Pflanzen (Sojabohnen, Kanola, Kartoffeln, Tomaten, Lupinien, Sonnenblumen und Baumwollsamen), Futterpflanzen (Luzerne, Klee und Festuca) und Getreide (Mais, Weizen, Gerste, Hafer, Reis, Sorgum, Hirse und Roggen). Die Pflanzen oder Pflanzenteile können unmittelbar als Futtermittel oder Nahrung verwendet werden oder man kann das Lysin zur Verwendung als Futter- oder Nahrungsmittel -Zusatz extrahieren.
• Obwohl die hier beschriebenen freien Lysingehalte in den Blättern von transformierten Pflanzen erhöht sind, wird erwartet, daß das vorliegende Verfahren ein Erhöhen der freien Lysingehalte auch in anderen Pflanzenorganen gestattet, unter Einschluß von Knollen und Samen.
• Die Erfindung wird nach Maßgabe der folgenden detaillierten Beispiele weiter beschrieben.
Beispiel I A. Materialien und Methoden
• Restriktions-Endonucleasen, T4-Ligase, Polynucleotid-Kinase und Phosphatase aus Kalbdarm wurden gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Standardverfahren der DNA-Rekombination, Transformation von Escherichia coli- Zellen und molekulare Analysen wurden durchgeführt nach Maniatis et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982).
• Alle in-vitro-Transkriptionen (SP6) und -Translationen (Kaninchen-Reticulocytenlysat) wurden unter Verwendung von Reagenzien von Promega Biotect (Madison, WI) durchgeführt, wobei nach den Vorschriften des Herstellers gearbeitet wurde.
• Oligonucleotide wurden mit dem Phosphoramidit-Verfahren chemisch synthetisiert (Caruthers, Science, 230, 281-285 (1985)).
• Der Agrobacterium tunefaciens-Stamm LBA4404 (pAL4404) (Hoekema et al, Nature, 303, 179-180 (1983)) wurde für alle Pflanzenzellen-Transformationen verwendet.
• Die Isolierung und Charakterisierung des dap-A-Gens wurde beschrieben von Glassman, "Cloning and Characterization of the dap-A-Gen of Escherichia coli" (Dissertation, University of Minnesota, Minneapolis, MN (1988), dessen Offenbarung hiermit durch Zitat zum Bestandteil der Beschreibung gemacht wird.
• Das Gen wurde aus einer Escherichia coli-Genombibliothek isoliert (Clarke and Carbon Collection of Hybrid Plasmids, Yale University School of Medicine, New Haven, CT). Fragmente eines Plasmids (pLC1730), von dem berichtet worden war, daß es das dap-A-Gen trägt, wurden in den Klonierungsvektor pBR322 subkloniert. Fragmente, die das dap-A-Gen trugen, wurden durch Komplimentierung eines dap-A-Mutanten von E. coli identifiziert und bestätigt, indem gezeigt wurde, daß es sich um ein Plasmid-codiertes Protein mit einer Molekülmasse von 32 Kilodalton handelte (entsprechend der Molekülmasse der Dihydrodipicolinsäure-Synthase-Untereinheit), sowie durch die enzymatische Dihydrodipicolinsäure-Synthase-Aktivität. Die Nucleotidsequenz für ein solches Plasmid-Konstrukt wurde bestimmt, und die vernutlichen Promotersequenzen und eine Codierungssequenz für das dap-A-Gen wurden identifiziert. Die äußere, flankierende DNA wurde durch weiteres Subklonieren entfernt.
• Von besonderem Interesse sind die Plasnide pDAP1763 und pDAP1205. pDAP1763 trägt die gesamte dap-A-Codierungssequenz sowie nicht translatierte 5'- und 3'-Bereiche auf einem Ndel-BstEII-Fragment mit 1564 Bp. pDAP1205 trägt ein Ndel-Sphl-Fragment mit 1375 Bp, dem die letzten dreizehn Basen der Codierungssequenz und alle nicht translatierten 3'-Sequenzen fehlen. Beide Plasmide sind pBR322-Derivate.
B. Chloroplast-Transit-Peptid-Sequenz
• Eine DNA-Sequenz, die ein Erbsen-Chloroplast-Transit-Peptid codiert, wurde aufgebaut, indem zuerst Unterfragmente der Sequenz synthetisiert und diese dann kombiniert wurden.
• Auf der Grundlage der veröffentlichten Sequenz für das Chloroplast-Transit- Peptid einer kleinen Untereinheit des Ribulosebiphosphat-Carboxylase-Gens der Erbse (Cashmore in Genetic Engineering of Plants, A. Hollaender, Hrsg., Plenum Press (1983)) wurden acht Oligonucleotide (vier pro Strang) chemisch synthetisiert. Die sechs inneren 5'-Endbasen wurden unter Verwendung von T4- Polynucleotid-Kinase phosphoryliert, und es wurden dann 100 pmol aller acht Dligonucleotide zu einem Gesamtvolumen von 70 ul zusammengemischt. Zehn ul dieses Gemisches wurden mit 100 ng HindIII-SphI-digestiertem pPo126 (Robbins et al, J. Virol., 58, 339-347 (1986)) kombiniert, fünf Minuten lang bei 95 ºC denaturiert, zwei Stunden lang bei Zimmertemperatur vereinigt (annealing) und dann zu pSTP31 ligiert. Die synthetische Sequenz bestand aus einem HindIII- 5'-Überhang, 30 Bp nicht translatierter Leitsequenz, 171 Bp, die das 57- Aminosäure-Transit-Peptid (tp) codieren und aus einem 3'-SphI-Oberhang, der die evolutionär erhalten gebliebene Spaltungsstelle für das Transit-Peptid darstellt.
C. Modifikation des dap-A-Gens zur Verwendung in Pflanzenzellen
• Bakterielle DNA außerhalb des Codierungsbereiches des dap-A-Gens wurde entfernt und durch Sequenzen ersetzt, die von Pflanzenzellen erkannt und vearbeitet werden.
• Um die vorstehend beschriebene Transit-Peptid-Sequenz anzuhängen, wurde der 5'-Terminus der dap-A-Codierungssequenz modifiziert, um eine SphI-Stelle zu erzeugen. Dies wurde bewerkstelligt durch Ersetzen des NsiI-NruI-Fragments mit 108 Bp in pDAP1763 durch einen synthetischen Linker mit 29 Bp, der sowohl die Nsil- als auch die NruI-Stellen regenerierte. Dieser Schritt löschte den bakteriellen Promoter für dap-A und veränderte die das Startcodon umgebende Sequenz von CCATGT zu GCATGC und erzeugte so die benötigte SphI-Restriktionsstelle. Von dieser Veränderung wird vorhergesagt, daß sie zu einer Phenylalanin/Leucin-Substitution an der Position zwei der Aminosäuresequenz führt. Dieses Plasnid wurde als pDAP1900 bezeichnet.
• Das Sphl-Fragnent mit 865 Bp von pDAP1900, welches die dap-A-Codierungssequenz (abzüglich der letzten dreizehn Basenpaaren) einschließt, wurde so in SphI-digestiertes pSTP31 ligiert, daß der 5'-Terminus der dap-A-Codierungssequenz mit dem 3'-Terminus der synthetischen Transit-Peptid-Sequenz verschmolzen wurde, und die natürliche Spaltungsstelle der kleinen Untereinheit des Erbsen-Präproteins wurde wiederhergestellt. Das resultierende Plasmid wurde als pDAP4001 bezeichnet. Der Polylinker in diesem Plasmid ergab eine SacI-Stelle genau in 3'-Stellung zum Ende der Codierungssequenz. Diese Stelle wurde dazu verwendet, um die Transit-Peptid-(tp)::dap-A-Kassette als HindIII- SacI-1070-bp-Fragment in HindIII-SacI-geschnittenes pGEM3 (Promega Biotec, Madison, WI) zu bewegen, was zum Plasmid pDAP4104 führte.
• Der 3'-Terminus der dap-A-Codierungssequenz wurde in ähnlicher Weise modifiziert, um vier Dinge auszuführen: (1) Zerstören der SphI-Stelle (Individualisieren der am 5'-Terminus erzeugten Stelle), (2) Wiederherstellen der letzten vier Aminosäuren der Sequenz, die im ursprünglichen Aufbau von pDAP1205 verloren worden waren, (3) Anhängen von zwei Stopcodons und (4) Erzeugen einer BamHI-Stelle in der Nähe des Endes der Codierungssequenz.
• Dies wurde bewerkstelligt durch Digestieren des Plasmids pDAP1205 mit SphI plus BamHI und Ligieren eines synthetischen Linkers mit 25 Bp anstelle der 147 Bp von pBR322 DNA, was das Plasmid pDAP1252 ergab. Das Zerstören der SphI-Stelle führte zu einer Veränderung des Codons von Alanin zu Glycin an der Position 289 in der abgeleiteten Aminosäuresequenz.
• Die neu erzeugte BamHI-Stelle wurde dazu verwendet, Transkriptions-Terminations-Signale anzuhängen, die von Pflanzenzellen erkannt werden. pDAP1252 wurde mit BamHI und HindIII digestiert und an ein BamHI-HindIII-Fragment mit 260 Bp von pRL101 ligiert, welches die Transkriptions-Termination und die Polyadenylierungs-Signal-Sequenz des Nopalin-Synthase-(nos)-Gens von pTiC58 (Nucleotide 673 bis 422, Bevan et al, NAR, 11, 369-385 (1983)) enthielt. Dieses Konstrukt wurde als pDAP1264 bezeichnet.
• Schließlich wurden die modifizierten dap-A-Termini kombiniert, um das Gen zu rekonstruieren. pDAP1264 wurde mit BstEII (in der Mitte der dap-A-Codierungssequenz) und mit EcoRI (exakt in 3'-Stellung zum Ende der nos-Poly-A-Sequenz) digestiert und in BstEII-EcoRI-digestiertes pDAP4104 ligiert. Dieses Plasmid, pDAP4201, trug die an die Codierungssequenz von dap-A und an den nos-3'- Bereich fusionierte synthetische Chloroplast-Transit-Peptid (STP)-Sequenz, die alle unter der transkriptorischen Kontrolle des SP6-Promoters in pGEM3 standen. Diese Konstruktion wurde zur in-vitro-Analyse der Transit-Peptid- Funktion verwendet, wie es nachstehend in Abschnitt 4 beschrieben wird.
• Für in-vivo-Studien der Genfunktion in Pflanzenzellen wurde die vorstehend beschriebene STP :: dap-A :: nos 3'-Kassette wie folgt unter die Kontrolle des 35S-Promoters von CaMV gestellt. Das Plasmid p35-227 wurde von pP0126 abgeleitet durch Insertion des BamHf-BgIII-Fragments mit 450 Bp, welches die 35S-Promoter-Sequenz von pCaMVPR0 (zur Verfügung gestellt von V. Walbot; siehe Fromm et al, PNAS, 82, 5824-5828 (1985)) trug, in die BamHI-Stelle des pPo126-Polylinkers. Diese Konstruktion plazierte eine HindIII-Stelle genau in 3'-Stellung zum Promoter. Das HindIII-Fragment mit 1340 Bp von pDAP4201, welches die gesamte dap-A-Gen-Kassette trug, wurde in diese Stelle mit richtiger Orientierung liegiert, um eine funktionelle transkriptorische Einheit zur Expression in Pflanzenzellen (Plasmid pDAP4307) zu bilden.
D. In-vitro-Funktion des Transit-Peptids
• Die Fähigkeit der synthetischen Transit-Peptid-Sequenz, das Einschleusen und das Verarbeiten des dap-A-Gen-Produkts durch intake Chloroplasten zu richten, wurde unter Verwendung des in-vitro-Chloroplast-Import-Assays (della-Cioppa et al, Bio/Technology, 5, 579-584 (1987)) beurteilt. ³&sup5;S-Methionin-markiertes Präprotein für die Bestimmung wurde wie folgt hergestellt.
• pDAP4201-DNA wurde mit EcoRI digestiert und der run-off-Transkription unter Verwendung von SP6-Polymerase unterworfen (Melton et al, NAR, 12, 7035-7056 (1984)). Nach Entfernung von Plasmid-DNA durch Digestion mit RNase-freiem DNasel wurde die mRNA mit Ethanol gefällt, in 25 ul sterilem destilliertem entionisiertem Wasser resuspendiert und spectrophotometrisch quantifiziert. Acht Microgranm dieser mRNA wurden in einer in-vitro-Translations-Reaktion (Kaninchen-Reticulocytenlysat) eingesetzt, die 2,5 uCi/ul-³&sup5;S-Methionin (New England Nuclear, Boston, MA) in einem Gesamtvolumen von 145 ul enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde 90 Minuten lang bei 30ºC inkubiert und die Reaktion abgebrochen, indem es in Eis gestellt wurde.
• Aus Blättern von Latuca sativa (rumänischer Kopfsalat), aus denen die Blattadern entfernt worden waren, wurden aktive, intakte Chloroplasten isoliert, wobei das für Erbsen-Sämlinge beschriebene Verfahren verwendet wurde (Bartlett et al , in "Methods in Chloroplast Molecular Biology", Edelman et al Hrsg., Elsevier Biomedical Press (1982)). Isolierte Chloroplasten wurden in Importpuffer (50 mM HEPES, pH = 7,6, 0,3 M Sorbit) resuspendiert, auf 2 mg/ml Chlorophyl eingestellt und bis zur Verwendung auf Eis aufbewahrt.
• Fünfzig Mikroliter der in-vitro-Translations-Produkte (hauptsächlich tp :: DHDPS-Untereinheit-Präprotein) wurden auf Eis mit 110 ul Importpuffer, 25 ul 0,1 M L-Methionin, 15 ul 0,1 M ATP und 100 ul Chloroplasten kombiniert. Das Importreaktions-Gemisch wurde geneigt und unmittelbar vor einer 150 W-Faseroptiklampe bei Zimmertemperatur vorsichtig rotiert. Nach 5, 10 und 15 Minuten wurden 70 ul Probe entfernt und in Eppendorfröhrchen auf Eis pipetiert, die 7 ul Thermolysin (1 mg/ml) in 10 mM CaCl&sub2; enthielten (Cline et al, Plant Physiol., 75, 675-678, (1984)). Eine zweite, nach 15 Minuten gezogene Probe wurde in ein Röhrchen auf Eis pipetiert, welches 7 ul 10 mM CaCl&sub2; enthielt (Kontrolle). Alle Röhrchen wurden 20 Minuten lang auf Eis inkubiert, dann mit 150 ul Importpuffer verdünnt, der 50 mM EDTA zum Inhibieren von Thermolysin enthielt. Nach 10-minütigem Zentrifugieren wurden die Chloroplasten in 50 ul Lysierungspuffer (10 mM HEPES pH = 7,5, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF, 30 ug/ml Aprotinin) resuspendiert und in zwei Einfrier/Auftau-Zyklen und durch Verwirbeln lysiert. Die Lysate wurden 20 Minuten lang bei 14000 x g zentrifugiert, um die Stromalfraktion (Überstand) von der Thylakoidfraktion (Pellet) abzutrennen.
• Stromalprotein-Proben wurden auf 12,5 %-SDS-Polyacrylamidgel (Laemmli, Nature, 227, 680 (1970)) der Elektrophorese unterworfen. Das Gel wurde gefärbt, getrocknet, und der Autoradiographie unterworfen. Die Kontrollprobe (keine Protease) zeigte ein 42 Kilodalton-Band, welches dem tp :: DHDPS- Untereinheit-Präprotein entsprach. Bei allen drei mit Thermolysin behandelten Proben fehlte das 42 Kilodalton-Band, und es zeigte sich statt dessen ein bei etwa 32 Kilodalton wanderndes Band, welches gegen proteolytische Digestion geschützt war, und von dem deshalb angenommen werden konnte, daß es in den Chloroplasten eingeführt worden war. Das 32 Kiltodalton-Protein entspricht der molekularen Masse der reifen bakteriellen Dihydrodipicolinsäure-Synthase- Untereinheit.
E. Konstruktion des binären Vektors pBVI
• Der folgende Abschnitt beschreibt die Konstruktion des Vektors, der für das Einführen des modifizierten dap-A in Pflanzenzellen verwendet wurde. Der Vektor umfaßt zur leichteren Integration des Gens im Pflanzengenom eine linke und rechte T-DNA-Grenze aus pTiAch5, einen wählbaren Marker für E. coli (Ampicillin-Resistenz), einen wählbaren Marker für Agrobacterium tumefaciens und Tabak (Kanamycin-Resistenz) und Replikationsursprungs-Sequenzen, um die Plasmidreplikation sowohl in E. coli als auch Agrobacterium tumefaciens zu ermöglichen.
1. Subklonieren der T-DNA-Grenzen
• Die linke Grenze aus pTiAch5-TL-DNA wurde erhalten durch Digestieren von p0TY8 (Hoekema, loc. cit.) mit BamHI und ClaI und dann Isolieren eines Fragments mit 1206 Bp (Nucleotide 1 bis 1206 gemäß Barker et al, Plant Mol. Biol., 2, 335-350 (1983)); siehe auch DeVos et al, Plasmid, 6, 249-253 (1981)). Das Fragment wurde in BgIII-ClaI-digestiertes pPo126 ligiert, und es ergab sich das Plasmid p0TBL1.
• Die rechte Grenze wurde in ähnlicher Weise aus p0TY8 als HpaI-XhoI- Fragment mit 5766 Bp erhalten, welches in den Polylinkerbereich von mit HpaI und XhoI digestierter pPo126 insertiert wurde, um pTB11828 zu erhalten.
2. Subklonieren des pSa-Replikationsursprungs
• Der breite Wirtsbereich des Replikationsursprungs von pSa wurde isoliert durch Digestieren von pUCD2 (Close et al, Plasmid, 12, 111- 118 (1984)) mit HincII und BamHI. Das ori-Fragment mit 2900 Bp wurde mit Hpaf-BgIII-digestiertem pPo126 ligiert, um pPo1Sa zu erhalten.
3. Konstruktion von Plasmid enthaltend die linke und rechte T-DNA-Grenze und den pSa-Renlikationsursprung (pBR322LRSa)
• Die linke und die rechte T-DNA-Grenze und der pSa-ori wurden in pBR322 wie folgt insertiert. p0TBL1 wurde mit ClaI und HindIII digestiert (Nucleotid 602, Barker, loc. cit.), um ein Fragment mit 604 Bp zu erhalten, welches dann mit den Klenow-Fragment der DNA-Polymerase mit einem glatten Ende versehen wurde (blunt end). Das DNA-Fragment wurde in die PvuII-Stelle von pBR322 insertiert, um pBR322L zu erhalten. Die rechte Grenze war getragen auf einem Clal-BamHI-Fragment von pTB11828 mit 912 Bp (Nucleotide 13774 bis 14686, Barker, loc. cit) und wurde in ClaI-BamHI-digestiertes pBR322L ligiert, um pBR322LR zu erhalten.
• Die Hybrid-ClaI-Stelle von pBR322LR war empfindlich gegenüber Methylierung durch den E. coli-Stamn MC1000 und deshalb beständig gegenüber Digestion durch Clal. Transferieren des Plasmids in den E. coli-Stamm GM272 (dam-, dcm-) (Marinus et al, J. Bacteriol., 114, 1143- 1150 (1973)) ermöglichte die Insertion des EcoRI-Clal-pSa-Fragments mit 2900 Bp von pBolSa in EcoRI-ClaI-digestiertes pBR322LR. Das entstehende Plasmid wurde als pBR322LRSa bezeichnet.
4. Konstruktion eines Kanamycin-resistenten Markers
• Ein wählbarer Marker, der in der Lage war, Kanamycin-Resistenz sowohl auf Agrobacterium als auch auf Pflanzen zu übertragen, wurde konstruiert durch Verwendung des Promoters aus Transkript 24 der pTi- Ach5-TR-DNA. Dieser Promoterbereich wurde als EcoRI-Clal-Fragnent aus pRK290-EcoACla (Gelvin et al, Mol. Gen. Genet., 199, 240-248 (1985)) isoliert, welches die Nucleotide 21,631 bis 20,128 darstellt (Barker, loc. cit). Das Fragment wurde in pPo126 ligiert, welches mit EcoRI und Clal digestiert war, um pPo1PTR zu erhalten. Eine BamHI-Stelle im Polylinker genau in 3-Stellung zum Transkript-24-Promoter wurde verwendet, um ein BgIII-BamHI-Fragment mit 1500 Bp aus Tn5 (Rothstein et al, Cell, 19, 795-805 (1980)) zu insertieren. Dieses Fragment enthält die Neomycin-Phosphotransferase II (NPTII)-Codierungssequenz, es fehlt ihm jedoch der native NPTII-Promoter. Die funktionelle Orientierung des Fragments in bezug auf den Transkript-24-Promoter wurde bestätigt durch die Fähigkeit des entstehenden Plasmids pP01NPTII, Kanamycin-Resistenz auf E. coli-Zellen zu übertragen.
• Polyadenylierungs-Signalsequenzen aus dem Dctopin-Synthetase (ocs)- Gen von pTiAch5 wurden als PvuII-Fragment mit 707 Bp aus pTB11828 isoliert (Nucleotide 12,5541 bis 11,834, Barker, loc. cit.). Dieses Fragment wurde in SmaI-digestiertes pPo1NPTII liegiert und ersetzte 500 Bp der äußeren Tn5-Sequenzen in 3'-Stellung zur NPTII-Codierungssequenz. Die korrekte Orientierung des poly-A-Fragments wurde bestätigt durch das Fragmentmuster, welches durch Digestion mit XmaIII erzeugt wurde. Das Plasmid wurde als pPo1NPTII-A bezeichnet.
5. Insertion des wählbaren Markers in pBR322LRSa
• Die pTR :: NPTII :: ocs-3'-Genkassette wurde als XhoI-Fragment mit 3100 Bp von pPo1NPTII-A in Sall-digestiertes pBR322LRSa bewegt, um pBV1 zu erhalten. Dieses Plasmid mit 11,5 Kilobasen enthielt - in einer Orientierung in Urzeigersinn von der besonderen EcoRI-Stelle aus - die folgenden Komponenten: den breiten Wirtsbereich pSa-ori, die rechte Grenze, die Klonierungsstellen HpaI und BamHI, das pTR/NPTII/ocs-Chimärengen (im Urzeigersinn transkribiert), 1415 Bp von pBR322 (Sall bis PvuII), die linke Grenze und das PvuII-EcoRI-Fragment von pBR322, welches den Replikationsursprung und das Ampicillin- Resistenz-Gen einschließt.
F. Konstruktion des das modifizierte dap-A-Gen (DDPZ4474 und pDAP4511) enthaltenden Transformationsvektors
• Die besonderen HpaI- und BamHI-Stellen genau innerhalb der rechten Grenze von pBVl wurden zum Insertieren der CaMVP35S :: STP31 :: dar A :: nos 3'-Kassette verwendet. Unter Verwendung von Stellen im Polylinker, die diese Kassette in pDAP4307 flankieren, wurde ein Smal-BgIII-Fragment mit 1830 Bp in HpaI-BamHI- digestiertes pBVl ligiert, um pDPZ4474 zu erhalten. Bei diesem Aufbau liegt das dap-A-Gen genau vor dem NPTII-Gen und wird in der gleichen Richtung wie NPTII transkribiert.
• In ähnlicher Weise wurde ein BamHI-(Teil)-HpaI-Fragment mit 1830 Bp von pDAP4307 in HpaI-BamHI-digestiertes pBVl ligiert, um pDAP4511 zu erhalten. Bei dieser Konstruktion liegt das dap-A-Gen ebenfalls genau vor dem wählbaren NPTII-Marker, jedoch mit entgegengesetzter Orientierung, so daß es bezüglich NPTII abweichend transkribiert wird.
• pDPZ4474 (ATCC-Nr. 67721) und pDAP4511 wurden jeweils in Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404) transformiert, wobei das von VanVliet et al beschriebene Verfahren verwendet wurde (Plasmid, 1, 446-455 (1978)). Transformanten wurden auf Platten ausgewählt, die Kanamycin (50 ug/ml) enthielten, und nach reinen Einzelkolonien ausgestrichen.
G. Transformation von Nicotiana tabacum SR1 und Regeneration von Pflanzen
• Kulturen von Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404), die pDPZ4474, pDAP4511 oder pBV1 trugen, wurden für Co-Kultivierungs-Transformationen von Tabak-Blattscheiben verwendet. Ein Satz der Scheiben wurde als negative Kontrolle mit sterilen Wasser behandelt.
• Blattscheiben von Nicotiana tabacum SR1-Pflanzen wurden im wesentlichen so transformiert, wie es von Horsch et al beschrieben wurde (Science, 227, 1229- 1231 (1985)), jedoch mit folgenden Änderungen: Agrobacterium-Kulturen wurden 48 Stunden lang bei 28 ºC in 523-Medium (Kado et al, Physiol. Plant Pathol., 2, 47-59 (1972)) gezogen, welches ergänzt war mit Rifampicin (20 ug/ml), Streptomycin (100 ug/ml) und Kanamycin (50 ug/ml), gewaschen und in sterilem Wasser resuspendiert, bevor sie mit Blattscheiben verwendet wurden; Black- Mexican-Sweet-Suspensionskulturen wurden als Nährkulturen auf Nährplatten verwendet; alle festen Medien enthielten 2,5 g/l Gelrite (Scott Laboratories, Dmaha NE) anstelle von Agar.
• Nach zweitägigem Verweilen auf den Nährplatten wurden die Blattscheiben in Sprossungsmedium gesetzt (gleiches Medium wie das Nährmedium, jedoch enthaltend 500 ug/ml Carbenicillin und Kanamycin mit 0, 100 oder 200 ug/ml und ohne Nährkulturen oder Filterpapier). Die Platten wurden mit Parafilm verschlossen und bei einer 12-stündigen Fotoperiode bei 26 ºC inkubiert. Sprossen wurden entfernt, wenn sie 1 cm erreicht hatten, und in ein Wurzelungsmedium überführt (keine Hormone), welches Carbenicillin und Kanamycin in der Konzentration enthielt, auf der die Sprosse entstanden waren. Beim Erscheinen von Wurzeln wurden die Pflänzchen in Vermiculit gesetzt und dann in Erde überführt.
H. Screenen der Expression von dap-A in regenerierten Tabakpflanzen
• Die Tabakpflanze wurde zunächst auf die Expression des eingeführten dap-A- Gens gescreent, indem die Resistenz gegen das lysinanaloge S(2-Aminoethyl)cystein (AEC) untersucht wurde. AEC ist ein wirksamer Inhibitor der Dihydrodipicolinsäure-Synthase von Pflanzen, jedoch ist die bakterielle DHDPS ihm gegenüber wesentlich weniger empfindlich. Blattscheiben wurden aus an der Oberfläche sterilisierten Blättern hergestellt, wie es in der Transformationsvorschrift beschrieben wurde. Die Scheiben wurden (vier Scheiben pro Platte, zwei Platten pro Behandlung) auf Sprossungsmedium gesetzt, welches mit 1 mM L-Arginin und AEC mit 0, 0,1, 0,2 oder 0,4 mM ergänzt war. Für jede untersuchte Pflanze wurden Platten mitgeführt, die mit Kanamycin (75 ug/ml) ergänztes Sprossungsmedium enthielten, um den wählbaren Marker zu prüfen. Nach einer Woche bei 26 ºC an Licht wurden die einzelnen Blattscheiben gewogen und für jede Behandlung wurden das mittlere Frischgewicht und die Standardabweichung bestimmt.
• Die Blattscheiben aller Pflanzen blieben grün und expandierten in Abwesenheit von AEC. Das Frischgewicht pro Scheibe nahm in einer Woche von etwa 9 mg auf etwa 60 mg zu. Das Wachstum der Kontrollpflanzen in Anwesenheit von AEC wurde stark inhibiert. Blattpflanzen, die auf ein Medium plattiert wurden, welches mindestens 0,2 mM AEC enthielt, waren braun und runzelig. Im Gegensatz dazu waren Blattpflanzen aus vermutlichen dap A(+)-Pflanzen leicht erkennbar an ihrer Fähigkeit, in Anwesenheit von AEC grün zu bleiben und zu wachsen. Viele AEC-tolerante Pflanzen wurden mit diesem Screeningverfahren identifiziert. Die Charakterisierung einer solchen Pflanze ist nachfolgend im Detail angegeben.
I. Charakterisierung der dar A(+)-Tabakpflanze 327 1. AEC-Toleranz
• Die Antwort von Pflanzenscheiben der Pflanze 327 auf die Anwesenheit von AEC wurde mit derjenigen von Pflanzenscheiben aus der (Wasser)- Kontrollpflanze 101 verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 - AEC-Screening an Blattscheiben * Frischgewicht (Gew-% der Kontrolle)
• * Die Frischgewichte von Blattscheiben (4 Scheiben pro Platte, 2 Platten pro AEC-Konzentration) wurden nach einer Woche gemessen. Die mittleren Frischgewichte wurden für jede AEC-Behandlung bestimmt und sind angegeben in Prozenten des mittleren Frischgewichts auf Platten ohne AEC.
2. Lysin-tolerante DHDP-Synthase-Aktivität in Blattextrakten
• Junge Blätter der Pflanze 327 und angesähte und gezüchtete NT-SR1- Pflanzen wurden wie folgt extrahiert. Ein bis zwei Gramm Blätter, von denen die Blattadern entfernt worden waren, wurden bei 4 ºC in 2 ml Extraktionspuffer (0,1 M Kaliumphosphat (pH = 7,5 bei 4 ºC), 2 mM EDTA, 1 mM β-Mercaptoethanol, 10 mM Natriumpyruvat) in Anwesenheit von 0,14 g Polyvinylpyrrolidon pro Gramm Gewebe gemahlen. Das Extrakt wurde durch "Miracloth" (Calbiochem) filtriert und dann 10 Minuten lang bei 8000 x g (4 ºC) zentrifugiert. Der Überstand wurde langsam auf 40 % Sättigung gebracht, indem bei 4 ºC unter leichtem Rühren feingemahlenes festes Ammoniunsulfat zugesetzt wurde. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren entfernt. Der Überstand wurde mit Ammoniumsulfat auf 66 % Sättigung gebracht und das Präzipitat (40 bis 66 %) wie vorstehend beschrieben durch Zentrifugieren gesammelt. Das Pellet wurde in Säulenpuffer (50 mM Tris-HCl (pH = 7,5 bei 4 C), 1 mM EDTA, 10 mM Natriumpyruat, 10 % Glycerol) resuspendiert und zum Entsalzen durch eine Sephadex-G-25-Säule (Sigma) geleitet.
• Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem farbstoffbindungs-Verfahren von Bradford (REF) bestimmt, wobei Rinderserumalbumin-Pulver (Fraktion V) in destilliertem Wasser als Standard verwendet wurde.
• Die Dihydrodipicolinsäure-Synthase-Aktivität wurde mit Hilfe des o-Aminobenzaldehyd-Assays (ABA) (Yugari et al, J. Biol. Chem., 240, 4710-4716 (1965)) aufgezeichnet. Vorratslösungen von L-Lysinhydrochlorid wurden mit destilliertem Wasser hergestellt, Filter-sterilisiert und mit den angegebenen Konzentrationen bei Beginn der Enzymreaktion zugesetzt. Zu festgesetzten Zeitpunkten wurden Aliquote von 200 ul entfernt und die Reaktion in 800 ul Stop-Puffer gequencht (0,21 M Citronensäure, 0,53 M Natriumphosphat (pH = 5 bei 25 ºC), wobei unmittelbar vor der Verwendung 0,24 mg o-ABA aus einer frisch zubereiteten Vorratslösung in absolutem Ethanol zugegeben wurden, 10 mg/ml). Die rosa Farbe wurde eine Stunde lang bei 25 ºC entwickeln gelassen und dann die optische Dichte bei 520 nm gemessen.
• Die DHDPS-Synthase-Aktivität in den Blättern der Pflanze 327 war etwa 30-fach größer als die in den Blättern der angesähten und gezogenen Pflanze NT-SR1. Insbesondere war die Enzymaktivität in 327-Blättern vollständig resistent gegen L-Lysin, welches mit 100 uM zugesetzt wurde, und wurde in Anwesenheit von 500 uM L-Lysin nur mit 14 % inhibiert. Im Gegensatz dazu inhibierten 100 uM L-Lysin die DHDPS- Synthase-Aktivität in NT-SRI-Pflanzen um 87 %, und bei 500 uM L-Lysin konnte keine Aktivität festgestellt werden.
3. Southern/Northern-Hybridisierungsanalyse
• Aus Blättern von transformierten Pflanzen und aus 101 wurden gemäß dem Verfahren von Shure et al (Cell, 35, 225-233 (1983)) genomische DNA isoliert. Zehn Mikrogramm DNA aus jeder Pflanze wurde unabhängig mit BamHI und mit BstEII digestiert und auf 0,7 % Agarose der Elektrophorese unterworfen. Die Digestion mit BamHI erzeugt ein diagnostisches inneres Fragment mit 1540 Bp, wogegen BstEII einmal in die dap-A-Codierungssequenz einschneidet. Das Gel wurde auf eine Nylonmembran geblottet und hybridisiert (Southern, J. Mol. Biol., 98, 503- 517 (1975)), wobei als Sonde das mit ³²P markierte BamHI-Fragment mit 1540 Bp von pDAP4307 verwendet wurde. Die Autoradiographie des Blots zeigte eindeutig die charakteristische 1540-Bp-Bande in der BamHI- Digestspur und zwei Banden in der BstEII-Digestspur. Diese Ergebnisse sind, zusammen mit den Rekonstruktionsmarkern für die Kopienummer, damit konsistent, daß das dap-A-Gen in transformierten Pflanzen als Singlecopy anwesend ist. In Spuren, die DNA aus der Pflanze 101 enthielten, war keine Hybridisierung erkennbar.
• Es wurde ebenfalls eine Northern-Blot-Analyse durchgeführt, und die Ergebnisse zeigten, daß das dap-A-Gen aktiv transkribiert war. Bei Verwendung sowohl der gesamten RNA als auch von aus den Blättern isolierter Oligo-dT-selektierter polyA-RNA zeigte die oben beschriebene Sonde Hybridisierung zu einer einzigen Spezies der RNA mit etwa 1100 Nucleotiden. Bei 101 wurde keine Hybridisierung zu RNA beobachtet.
4. Gehalt an freiem Lysin in Blättern
• Zum Bestimmen des Gehalts an freier Aminosäure wurden Trichloressigsäure-(TCA)-Extrakte von Blättern der Pflanzen 327 und 101 hergestellt. Junge Blätter (1-2 g) wurden in einen eiskalten Mörser geschnipselt, mit flüssigem Stickstoff bedeckt und zu einem Pulver vermahlen. Die gemahlenen Blätter wurden über Nacht lyophilisiert und die Trockengewichte bestimmt. Jede lyophilisierte Probe wurde in einen kalten Mörser zurückgeführt und in Gegenwart von 2 ml 10 % TCA erneut gemahlen. Der Mörser wurde mit weiteren 2 ml TCA ausgespült. Die TCA-Extrakte wurden vereinigt und 30 Minuten lang bei gelegentlichem Umschütteln auf Eis inkubiert. Das Extraktionsgemisch wurde 20 Minuten lang (4 ºC) zentrifugiert und der Überstand entfernt und auf Eis gestellt. Das Pellet wurde wie zuvor mit 2 ml 10 % TCA erneut extrahiert, und die Überstände wurden gepoolt. Zwei Milliliter des gepoolten Extrakts wurden dreimal mit 5 ml Äther extrahiert. Der Ätherextrakt wurde bis zur Analyse bei -70 ºC aufbewahrt.
• Der Gehalt an freien Aminosäuren wurde mit Umkehrphasen-HPLC bestimmt unter Verwendung des o-Phthaldialdehyd-Derivatisierungsverfahrens von Jones et al (J. Chromatog., 266, 471-482 (1983)). Drei Proben NT-SR1- Blätter wiesen im Mittel 75 ug freies Lysin pro Gramm lyophilisiertes Gewebe auf. Zwei Proben von 327-Blättern ergaben Werte von 15450 bzw. 14630 ug freies Lysin pro Gramm lyophilisiertes Gewebe oder etwa eine 200-fache Zunahme an freiem Lysin.
5. Vererbbarkeit des dap-A-Gens
• Eine Tabakpflanze 327 wurde zum Blühen und zur Selbstbestäubung und zur Produktion von Samen gebracht. Reifer trockener Samen wurde gesammelt, mit 10 % Bleichmittel an der Oberfläche sterilisiert und gut mit sterilem Wasser gespült. Der Samen wurde auf Netz-Keimplatten (1/4 MS-Salze, 2,5 g/l Gelrite) plattiert (SO Samen pro Platte, zwei Platten pro Behandlung), welche AEC mit 0, 1, 10, 30, 100 und 300 um enthielten. Samen aus selbstbestäubten Pflanzen 101 wurden in identischer Weise als Kontrollen behandelt. Alle Samen keimten in drei bis vier Tagen. Nach zehn Tagen wurde die Anzahl grüner Sämlinge auf jeder Platte gezählt. Nach zwei Wochen wurden die Sämlinge vorsichtig aus dem Gelrite ausgezogen und die Wurzellängen gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt und zeigen deutlich, daß die Eigenschaft der AEC-Toleranz an die 327-Nachkommen vererbt wird. Tabelle 2 - AEC-Resistenz in Sämlingen mittlere Wurzellänge (% der Kontrolle)
• Wurzellängen gemessen zwei Wochen nach dem Plattieren. Die mittleren Wurzellängen wurden für jede AEC-Behandlung gemessen und sind angegeben in Prozenten der mittleren Wurzellänge auf einem Medium ohne AEC.
• Die Erfindung wurde beschrieben unter Bezugnahme auf eine Reihe spezieller und bevorzugter Ausführungsformen und Arbeitstechniken. Es versteht sich jedoch, daß viele Variationen und Modifikationen möglich sind, ohne daß der Grundgedanke und der Bereich der Erfindung verlassen werden.

Claims (26)

1. Verfahren zum Erhöhen des Gehaltes an freiem L-Lysin in einer Pflanze, bei dem man

(a) in die Zellen eines Pflanzengewebe-Ausgangsmaterials ein fremdes Gen einführt; und

(b) das fremde Gen in den Zellen exprimiert, wobei eine erste DNA- Sequenz des Gens Dihydrodipicolinsäure-Synthase (DHDPS) codiert, welche im wesentlichen resistent gegen Feedback-Inhibition durch endogen erzeugtes freies L-Lysin ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das DHDPS-Gen ein bakterielles Gen ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das fremde Gen eine zweite DNA- Sequenz aufweist, die am 5'-Terminus der ersten DNA-Sequenz hängt, und die ein Chloroplast-Transit-Peptid (CTP) codiert, welches die DHDPS in den Chloroplasten der Zellen lokalisiert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die CTP-DNA-Sequenz im wesentlichen identisch ist mit einer aus einem nuklearen Gen einer Pflanze erhaltenen CTP-DNA-Sequenz, die ein Prä-Protein codiert, welches ein aminoterminales CTP enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei man in die Zellen ein Plasmid einführt, welches das fremde Gen enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Plasmid ein bakterieller Klonierungsvektor ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Plasmid ein E. coli-Klonierungsvektor ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei man das fremde Gen in die Pflanzenzellen mit den Arbeitstechniken der Elektroporation, der Mikroinjektion, mit Mikroprojektilen oder mit der Liposomverkapselung einführt.

9. Verfahren nach Anspruch 5, wobei man das fremde Gen in die Pflanzenzellen mit von Agrobacterium vermittelter Transformation einführt.

10. Transformierte Pflanzenzelle, enthaltend ein fremdes Gen, welches Dihydrodipicolinsäure-Synthase exprimiert, die im wesentlichen resistent gegen Feedback-Inhibition durch endogen erzeugtes freies L- Lysin ist.

11. Pflanzenzellen nach Anspruch 10, wobei das DHDPS-Gen ein bakterielles Gen ist.

12. Pflanzenzelle nach Anspruch 11, wobei das DHDPS-Gen ein E. coli dap- A-Gen ist.

13. Pflanzenzelle nach Anspruch 10, wobei das fremde Gen auch ein Chloroplast-Transit-Peptid (CTP) exprimiert.

14. Pflanzenzelle nach Anspruch 13, wobei das CTP ein Erbsen-CTP ist.

15. Transformierte Pflanze, welche auf einem biosynthetischen Weg unter Einsatz von Dihydrodipicolinsäure-Synthase (DHDPS) freies L-Lysin erzeugt, wobei die DHDPS das Produkt ist (a) eines fremden Gens und (b) im wesentlichen resistent gegen feedback-Inhibition durch endogen erzeugtes freies L-Lysin ist.

16. Transformierte Pflanze nach Anspruch 15, wobei das fremde DHDPS-Gen ein bakterielles Gen ist.

17. Transformierte Pflanze nach Anspruch 16, wobei das fremde Gen ein E. coli dap-A-Gen ist.

18. Transformierte Pflanze nach Anspruch 15, enthaltend Gehalte an freiem L-Lysin, die mindestens etwa 50 mal höher sind als die Gehalte in einer untransformierten Pflanze der gleichen Spezies.

19. Expressionskassette, enthaltend ein Gen, welches Dihydrodipicolinsäure-Synthase (DHDPS) codiert, welche im wesentlichen resistent gegen feedback-Inhibition durch freies L-Lysin ist, wobei das Gen bei zutreffenden Leseraster an seinem 5'-Terminus mit einer zweiten DNA- Sequenz verbunden ist, die ein aminoterminales Chloroplast-Transit- Peptid (CTP) codiert, und wobei das DHDPS-Gen und die zweite DNA- Sequenz unter der transkriptorischen und translatorischen Regulationskontrolle von in einer Pflanzenzelle funktionellen Regulationsbereichen stehen.

20. Expressionskassette nach Anspruch 19, wobei das DHDPS-Gen ein bakterielles Gen ist.

21. Expressionskassette nach Anspruch 20, wobei das Gen das E. coli dap- A-Gen ist.

22. Expressionskassette nach Anspruch 19, wobei die Kassette mindestens eine T-DNA-Grenze aufweist.

23. Expressionskassette nach Anspruch 19, weiter enthaltend ein Gen, welches eine in Pflanzenzellen wählbare Funktion codiert.

24. Expressionskassette nach Anspruch 19, enthaltend weniger als etwa 5 Kilobasen.

25. Expressionskassette nach Anspruch 24, enthaltend etwa 2 bis 3 Kilobasen.

26. Plasmid, welches zur Replikation in mindestens einem aus E. coli und A. tumefaciens befähigt ist, enthaltend die Expressionskassette gemäß Anspruch 19.