HU214630B - Eljárás szabad lizintartalom növelésére növényi sejtekben, valamint transzformált növényi sejtek és kifejező kazetták előállítására - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás lizin túltermelés kiváltására növényekben. A találmány tárgya közelebbről eljárás a szabad lizintartalom növelésére növényi sejtekben, valamint transzformált növényi sejtek és kifejező kazetták előállítására.

A géntechnológia fejlődése új lehetőségeket nyitott arra, hogy növényekben kívánt jellemző vonásokat alakítsunk ki. Különböző gének bevitelével például megnövelték a növényeknek a környezeti behatásokkal szembeni védelmét. Egyes gének például növelik a kémiai anyagokkal, így glükozáttal [Comai: Natúré, 317, 741-744 (1985); Shah: Science 233, 478-481 (1986)], foszfinotricinnel [De Block: EMBO, 6, 2513-2518 (1987)], bromoxinillel (PCT/US87/00044 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés) és szulfonil-karbamidokkal [Haughn: Mól. Gén. Génét., 211, 266-271 (1988)] szembeni ellenállást. Kifejlesztettek olyan transzgenetikus növényeket is, amelyek bizonyos ellenállást mutatnak rovarkártevők [142 924 számú európai szabadalmi bejelentés és Vaeck: Natúré, 328, 33-37 (1987)], gombás kártevők [Taylor: Mól. Gén. Génét. 210, 572-577 (1987)] és vírusos kártevők [Ábel: Science, 232, 738-743 (1986); Nelson: Bio/Technol. 6, 403-405 (1988)] szemben.

Az érdeklődés másik területe új tulajdonságoknak növényekbe, elsősorban kultúrnövényekbe történő bevitele. Az ilyen tulajdonságokra példaként említhető az élelmiszerként alkalmazott termény táplálkozástani tulajdonságainak javítása. A lizin az emberek és egyszerű gyomrú állatok táplálkozásának egyik lényeges aminosavja, de a legtöbb gabonaféle vonatkozásában a három leginkább korlátozott tápanyag közé tartozik. Ennek következtében, a szemes gabonán alapuló, így az árpa, búza, rizs, kukorica, köles, cirok és hasonló alapú táplálkozás esetén kiegészítőként költséges szintetikus lizint vagy lizint tartalmazó olajos magvakból származó fehéqét kell alkalmazni. A szemes gabona lizin-tartalmának megnövelése tehát egy új értékes tulajdonság lenne. A lizin szint növelésére eddig csak szokásos növénytermesztési módszereket, elsősorban mutációt és sejtkultúra tenyésztést alkalmaztak.

Ismert néhány természetes eredetű, nagy lizintartalmú mutáns a kukorica [Mertz: Science, 145, 279 (1964) és Nelson: Science 150, 1469-1470 (1965)], az árpa [Műnek: Science 168, 985-987 (1970)] és a cirok [Singh és munkatársai: Crop Sci. 13, 535-539 (1973)] vonatkozásában. A megnövelt lizintartalom egyik esetben sem a szabad lizintermelés fokozásában, hanem a gabona általános fehérjeprofiljának eltolásában jelentkezik. Ez azt jelenti, hogy a lizinben szegény endospermium fehérjék (prolaminok) csökkentett szintjét lizinben dús fehérjék (albumin, globulin és glutelin) megnövelt szintjével ellensúlyozzák. Táplálkozástani előnyei ellenére ezek a mutánsok csökkentett terméshozammal csak rossz minőségű terményt termelnek, ezért agronómiái értékük jelentős mértékben lecsökkent.

A táplálkozástani minőség javításának egy másik lehetősége megnövelt szabad lizintartalmú biokémiai variánsok in vitro kiválasztása. A lizin az aminosavak aszpartát családfába tartozik a magasabbrendű növényekben és mikroorganizmusokban (lásd az 1. ábrát). Mint ilyen, bioszintézisének szabályozása közvetlenül összefügg a család más tagjainak, így a treoninnak, metioninnak és izoleucinnak bioszintézisével. A metabolitikus folyamat szabályozása főként a kulcsszerepet játszó enzimatikus lépésnél végrehajtott végtermékvisszacsatolásos gátlással valósítható meg. Az első ilyen lépés, az aszpartát aszpartát-kinázzal (AK.katalizált foszforilezése, mind a négy végtermék egyik alapvető lépése. A másik szabályozási hely az elágazási reakció, vagyis a piruvát és az aszpartil szemialdehid kondenzációja, amelynek során dihidro-dipikolinsav keletkezik. Ez a lizin bioszintézisének első saját lépése, és a dihidro-dipikolinsav-szintáz (DHDPS) katalizálja, amely a vizsgált növényekben a lizin visszacsatolásával erősen gátolható [Weallsgrove és munkatársai: Phytochem. 20, 2651-2655 (1981) és Kumpaisal: Plánt Physiol. 85, 145-151 (1987)].

Különböző tapasztalatok arra utalnak, hogy az AK enzim több mint egy formában létezik [Muflin; The Biochemistry of Plants, 5. kötet, „Amino Acids and Derivatives”, Stumpf and Cohn kiadó, 420-426, Academic Press (1980)]. Az egyik forma érzékeny a treoninos gátlásra, a másik a lizines gátlásra. A növényi sejttenyészetek növekedése gátolható ekvimoláris mennyiségű lizin és treonin jelenlétével. Ez a gátlás visszafordítható metionin vagy homoszerin adagolásával (ez utóbbi gyorsan metioninná alakul) [Green és munkatársai: Crop. Sci. 14, 827-830 (1974)]. Hibberd olyan stabil kukorica kallusz vonalat szelektált (Planta 148, 183-187 (1980)], amely rezisztens a növekedés fenti gátlásával szemben. Ezek a vonalak túltermelik a treonint (6-9-szeresen), és kisebb mennyiségben a metionint, a lizint és az izoleucint (2-4-szeresen). Kimutatták, hogy a változásért egy lizint elviselő AK enzim felelős. A teljes, termő növényekké regenerált vonalakban ez a túltermelés stabil és öröklődő tulajdonsággá vált [Hibberd és munkatársai: PNAS 79, 559563 (1982)]. Hasonló szelekciót hajtottak végre dohány [Bourgin: „Variability in Plants Regenerated írom Tissue Culture”, Earle and Demarly kiadó, 163-174, Praeger, New York (1982)], árpa [Arruda: Plánt Physiol. 76, 442-446 (1984)] és sárgarépa [CattoirReynaers: Biochem. Physiol. Pfanzen 178, 81-90 (1983)] vonatkozásában.

Lizin analógokat, elsősorban az S-(2-amino-etil)ciszteint (AEC) szintén alkalmaztak önmagukban vagy lizinnel és treoninnal kombinálva lizint túltermelő mutánsok szelektálásához. Sano és munkatársai [J. Gén. Appl. Microbiol. 16, 373-391 (1970)] AEC szelekció segítségével magas lizintermelő baktérium mutánsokat izoláltak, és kimutatták, hogy az AEC hamis visszacsatoló inhibitorként működik az AK vagy DHDPS vagy mindkettő vonatkozásában. A hasonló növénymutánsok előállítására vonatkozó törekvések vegyes eredményeket hoztak, Widholm [Can. J. Bot. 54, 1523-1529 (1976)] dohány szuszpenziós sejteket mutáltak, és olyan AEC rezisztens sejtvonalat szelektáltak, amely a lizint tízszeresen túltermelte. Ismert olyan gyöngyköles mutáns is, amely 5-7-szeres lizin túltermelést mutat

HU 214 630 Β [Boyes és munkatársai: Plánt Sci. 50, 195-203 (1987)]. Bright [Planta, 146, 629-633 (1979)] olyan AEC rezisztens árpa vonalat szelektált, amely AEC távollétében lizint nem halmoz fel, és amely az AEC-t felveszi. Kimutatták, hogy az AEC gátló hatását jobban kifejti fehérjékbe beépítve, mint a lizin bioszintézisbe történő beavatkozás során. Schaeffer és munkatársai [Plánt Physiol., 84, 509-515 (1987)] sorozatos AEC és lizin plusz treonin szelekciót alkalmaztak olyan rizs mutánsok előállítására, amelyek a magban felhalmozott fehérjékben 14%-kal több lizint tartalmaznak, de a szabad lizin mennyisége nem változott. Ismert AEC rezisztens burgonyatenyészet is [Jacobsen: J. Plánt. Physiol., 123, 307-315 (1986)]. Ennél a mutánsnál az átlagos aminosavszint magasabb, mint a kontroll tenyészetnél, de ez nem lizin, treonin vagy metionin túltermelés hatása. Negrutiu [Theor. Appl. Génét. 68, 11-20 (1984)] dohány protoplaszton mutációt és ezt követő AEC szelekciót végzett. Két rezisztens sejtvonalat kapott, amely a lizint 10-30-szoros arányban túltermeli, Biokémiai és genetikai analízissel visszacsatolásra érzéketlen DHDP szintáz enzimet mutattak ki. Ez a tulajdonság egyszerű domináns génként öröklődik.

A metabolit termelés növelése és így a növény értékének fokozása területén a rekombináns DNS és gén transzfer technológiát eddig nem alkalmazták. Ismert azonban, hogy az Escherichia coli baktérium a magasabbrendű növényekkel lényegében azonos úton szintetizálja a lizint. A dihidroxi-pikolinsav-szintáz enzimet az E. coli dap A génje kódolja, és bár a lizinre érzékeny [Yugari és munkatársai: Biochim. Biophys. Acta 62, 612-614 (1962)] a lizin in vitro gátlásával szembeni érzékenysége legalább kétszázad része a növényből izolált enzimből mérhető érzékenységhez viszonyítva. Azok az E. coli sejtek, amelyek egy multikópiás plazmidon dap A gént tartalmaznak, nagymennyiségű szabad lizint halmoznak fel [Dauce-LeReverand: Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 15, 227-231 (1982)], ami arra utal, hogy a DHDPS mennyisége korlátozó lépést katalizál. A gént szekvenálták és jellemezték [Richaud: J. Bacteriol. 166, 297-300(1986) és Glassmann: 1988, M.S. Thesis, University of Minnesota, Minneapolis, USA],

Mivel a szokásos növénynemesítési és szövettenyésztési technológiákkal nem lehet lizintúltermelést kiváltani, szükség van olyan rekombináns DNS és géntranszfer eljárásra, amely a lizin túltermelést növényekben biztosítja.

A találmány tárgya tehát eljárás szabad lizintartalom növelésére növényi sejtekben oly módon, hogy egy növényi szövetminta sejtjeibe egy, a növényi sejtben működőképes 5 ’ és 3 ’ szabályzó szakaszokkal rendelkező, idegen DNS-t viszünk be, ahol az idegen DNS egy első, az endogén úton termelt szabad L-lizin visszacsatolásos gátlásával szemben rezisztens dihidro-dipikolinsavszintázt kódoló DNS szekvenciát és egy második, kloroplaszt tranzit peptidet kódoló DNS szekvenciát tartalmaz.

A találmány tárgya továbbá eljárás transzformált növényi sejt előállítására oly módon, hogy egy növényi szövetminta sejtjeibe a fenti idegen gént visszük be.

A találmány tárgya továbbá eljárás a fenti idegen gént tartalmazó kifejező kazetta előállítására.

A találmány szerint alkalmazott idegen gén az endogén úton előállított szabad L-lizin visszacsatolásos gátlásával szemben lényegében rezisztens dihidrodipikolinsav-szintázt (DHDPS) kódoló DNS szekvenciát tartalmaz.

Az alkalmazott idegen gén egy második DNS szekvenciát is tartalmaz, amely a DHDPS DNS szekvencia 5’ végéhez kapcsolódik, és amely kloroplaszt tranzit peptidet (CTP) kódol. A CTP az adott sejt kloroplasztjaiban lokalizálja a DHDPS-t, ahol az kifejtheti a szabad L-lizin bioszintézisének fokozását.

A találmány szerinti eljárással egy idegen gén bevitelével transzformált növényi sejtet kapunk, ahol az idegen gén az endogén lizin visszacsatolásos gátlásával szemben lényegében rezisztens DHDPS-t fejez ki. Mivel ismertek azok a technikák, amelyekkel különböző növényi szövettenyészetek sejtjeiből az egész növény regenerálható, a találmány szerinti eljárással olyan transzformált növény nyerhető, amely bioszintetikus úton DHDPS segítségével szabad L-lizint termel, ahol a DHDPS egy idegen (exogén) gén terméke, és az endogén módon termelt lizin visszacsatolásos gátlásával szemben lényegében rezisztens. A találmány szerinti eljárással előnyösen transzformálhatok a különböző pázsitfűfélék, elsősorban a fent felsorolt növények. A transzformált növények fogyasztható részei az azonos fajtájú transzformálatlan növény lizinszintjéhez képest legalább ötvenszeres mennyiségű szabad L-lizint tartalmaznak.

A növényi sejtek transzformálásához idegen génként előnyösen egy kimér gén kifejező kazettát alkalmazunk, amely DHDPS-t vagy annak enzimatikusan funkcionális fragmensét kódoló gént tartalmaz, amely a visszacsatolásos gátlással szemben lényegében rezisztens. A kifejező kazetta tartalmaz továbbá egy második DNS szekvenciát, amely aminotermimális kloroplaszt tranzit szekvenciát (CTS) kódol. A DHDPS gén vagy génfragmens egy pontos leolvasó keretben 5’ végén kapcsolódik a CTS génhez. Az idegen gén előnyösen az adott növényi sejtben működőképes szabályozószakasz átírási és lefordítási kontrollja alá esik. Ilyen szakaszok előállíthatok például a növényi sejtbe A. tumefaciensből származó Ti vagy Ri plazmiddal, például T DNS szegmenssel transzformált DNS szekvenciából. így például, hatékony átírási iniciátor szakasz izolálható az oktopin-szintázt, nopalin-szintázt vagy mannopinszintázt kódoló Ti vagy Ri plazmid génből. A kifejező kazetta tartalmaz továbbá valamely, az adott növényi sejtben szelektálható tulajdonságot kódoló gént, így vegyszer vagy herbicid rezisztenciát kódoló gént, ami lehetővé teszi a transzformált sejtek és az ebből származó növények azonosítását.

A találmány tárgya továbbá kifejező vektor, így plazmid, amely beépül az említett kifejező kazettába, és amely baktériumban, így E. coli-ban vagy Agrobacterium-ban sokszorosítható. Az idegen gén csupasz DNSként a növényi sejt genomjába beépíthető, például elektroporáció, mikrobefecskendezés, mikroprojekciós injekció vagy liposzóma kapszulázás segítségével. Az

HU 214 630 Β idegen gént hordozó plazmid szintén beépíthető a növényi sejt genomjába A. tumefaciens által közvetített transzformálás segítségével.

A gén vagy génfragmens vonatkozásában alkalmazott idegen jelző azt jelenti, hogy a gént vagy génfragmenst egy vagy több olyan forrásból nyerjük, amely különbözik annak a növényfajtának a genomjától, amelyben végül kifejezzük. Gén lehet természetes eredetű, amelynek során élő anyagból, így baktériumból, élesztőből, gombából vagy hasonló szervezetekből vagy eltérő fajtájú növényből állítjuk elő. A funkcionális DHDPS-t kódoló gén előállításához előnyösen alkalmazható az E. coli dap A génje. Alkalmazható továbbá mesterséges gén vagy génfragmens is, amelyeket in vitro körülmények között kémiai szintézissel állítunk elő.

A növényi sejtbe bevitt idegen génnel vagy génfragmenssel kapcsolatban alkalmazott kifejezés azt jelenti, hogy a gén stabilan beépül a sejt genomjába, és a sejt funkcionális formában termeli a gén által kódolt terméket, például az enzimet, így a DHDPS enzimet. A funkcionális forma például a DHDPS vonatkozásában azt jelenti, hogy az enzim katalizálja a lizin endogén bioszintézisének egyik lépését.

A DHDPS enzimnek az endogén lizinnel végzett visszacsatolásos gátlása vonatkozásában a „lényegében rezísztens” kifejezés azt jelenti, hogy a DHDPS funkcionális formában marad az endogén lizin jelenlétében is, és így a növény lényegesen több lizint halmoz fel, mint az azonos fajtához tartozó olyan növény, amely nem szintetizál ugyanilyen mértékben rezisztens DHDPS enzimet. így például a találmány szerinti eljárással kapott új növények a kivonható lizint legalább

10-szeres, előnyösen legalább 50-szeres, például mintegy 50-250-szeres mennyiségben tartalmazzák az azonos fajtához tartozó, de csak természetes DHDPS-t tartalmazó növényhez képest. Emellett, a szabad lizin mennyisége nem éri el az adott megváltoztatott növényfajtára vonatkozó toxikus szintet. A transzformált növényi sejtben vagy növényben az idegen gén vagy génfragmens stabilan, funkcionálisan és örökölhetően beépült a genomba.

Az 1. ábra lizin bioszintézisének vázlatos ábrája, ahol az egyes betűk a következő enzimeket jelölik: a aszpartát-kroáz; b - aszpartil-szemialdehid-dehidrogenáz; c - dihidrodipikolinsav-szintáz; d - dihidrodipikolinsav-reduktáz; e - szukcinil-oxo-amino-pimelát-szintáz; f - szukcinil-diamino-pimelát-amino-transzferáz; g - szukcinil-diamino-pimelát-deszukciniláz; h - diamino-pimelát-dekarboxiláz; és i - mezodiamino-pimelátdekarboxiláz.

A 2. ábra a dap A gén I. példa szerinti feldolgozását mutatja.

A találmány szerinti eljárás tehát új megoldást biztosít nagymennyiségű szabad lizint termelő növények, így gabonafélék előállítására. A túltermelés dihidrodipikolinsav (DHDP) szintázt, a lizin növényekben és baktériumban történő bioszintézisének elágazási pontját katalizáló enzimet kódoló bakteriális gén bevitelével, és kifejezésével érhető el. A természetes növényi DHDP szintáz igen érzékeny az L-lizin visszacsatolásos gátlására, és így a bioszintézis szabályozásának kulcspontját képezi. Ezzel szemben, az Escherichia coli-ból izolált DHDP szintáz legalább 200-szoros mennyiségű L-lizin jelenlétében is aktív.

Annak érdekében, hogy a növénybe nagymennyiségű szabad lizin felhalmozását biztosító lizin-toleráns DHDSP szintáz enzimet kódoló gént vigyünk be, egy sor hosszú és komplex műveletet kell végrehajtani.

Első lépésként a bakteriális DHDP szintázgént in vitro körülmények között módosítjuk annak érdekében, hogy a gén a növényi sejtekben történő génkifejezéshez szükséges szabályozó szakaszokat tartalmazza. Mivel a lizin bioszintézisét a növényben a kloroplaszt végzi, a bakteriális génhez előnyösen egy aminoterminális kloroplaszt tranzit peptid szekvenciát kódoló szekvenciát viszünk be, és így a génterméket ezekhez a szervecskékhez irányítjuk.

A lizin bioszintézisének megváltoztatásához a gént növényi sejtbe kell bevinni, és a transzformált sejtet azonosítani kell. Szükséges továbbá, hogy a gén stabilan beépüljön a növényi sejt genomba. További feltétel, hogy a növényi sejt felismerje és működtesse a gén transzkripciós szignálját. Ez azt jelenti, hogy a gént messenger RNS-sé kell átírni, az m-RNS-nek a növény sejtmagjában stabilnak kell lenni, és sértetlenül a citoplazmához kell szállítani, ahol megtörténik a transzláció. Annak érdekében, hogy a növényi sejt riboszóma felismerje és megfelelően lefordítsa a gént, annak megfelelő transzlációs szignállal kell rendelkeznie. A polipeptid génterméknek el kell viselnie a citoplazmában a proteolitikus támadást, és fel kell vennie az enzimatikus aktivitáshoz szükséges háromdimenziós térállást. A bakteriális DHDP szintáznak részt kell venni a lizin bioszintézisében, vagyis a bioszintézis elágazó lépését katalizáló természetes növényi enzimhez közel kell elhelyezkednie (feltehetően a kloroplasztban) annak érdekében, hogy elérje a szükséges szubsztrátumot (aszpartil-szemialdehid és piruvát) és a megfelelő termékhez szállítsa (dihidro-pikolinsav).

Ha valamennyi fenti feltétel teljesül, a lizin túltermelését akkor sem lehet garantálni. Nem lehet ugyanis jelen más olyan kontroll mechanizmus, amely a DHDP szintáz lépés csökkentett szabályozását kompenzálja. Ez azt jelenti, hogy nem lehet jelen más bioszintézist inhibitáló faktor, valamint olyan mechanizmus, amely növelné a felhalmozott lizin lebontását. További feltétel, hogy a lizin túltermelésének mértéke nem érheti el a növényre nézve toxikus szintet. Végül, a kereskedelmi felhasználás érdekében a bevitt tulajdonságnak stabilnak és örökölhetőnek kell lennie.

A bakteriális gén módosítása a növényi sejtben történő kifedeződés és funkció érdekében Dihidrodipikolinsav-szintázt (DHDPS) kódoló gén bármely olyan mikroorganizmusból kinyerhető, amely a diamino-pimelát útvonalon lizint szintetizál. A gén kiválasztásának fő kritériuma, hogy a géntermék (DHDPS) viszonylag érzéketlen legyen a lizines gátlásra. A találmány értelmében kiindulási anyagként elő4

HU 214 630 Β nyösen alkalmazható gén az E. coli dap A gén, amely a DHDPS egyik funkcionális 32 kD fajtáját kódolja, és amely erős rezisztenciát mutat a lizin visszacsatolásos gátlásával szemben. A gén a mikroorganizmusból a közismert eljárásokkal izolálható. Ennek során eljárhatunk például úgy, hogy a genomtárban megkeressük a DHDPS ismert mutánsának komplementerét, a géntár által kifejezett polipeptideken immunológiai vizsgálatot végzünk, a genom tárat rádió jelölésű oligonukleotid mintával szemben hibridizáljuk.

Az oligonukleotid minta más fajtákból származó gén szekvenciája alapján illetve egy izolált DHDPS alegység polipeptid szekvenciájának reverz transzlációjával állítható elő. Eljárhatunk úgy is, hogy a gént részben vagy egészben kémiailag szintetizáljuk.

Izolálás után a gént standard rekombináns DNS műveletekkel és molekula analízissel jellemezzük. Ezek a technikák szakember számára ismertek [Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982)]. A DHDPS gént hordozó DNS fragmens méretét a lehető legkisebb funkcionális fragmensig lecsökkentjük, vagyis a génhez kapcsolódó külső DNS-t megfelelő módszerrel, például Bal31 emésztéssel, ismert restrikciós endonukleáz fragmenssel kiiktatjuk vagy más hasonló módon eltávolítjuk, és így megkapjuk azt a legkisebb DNS fragmenst, amely komplementer a DHDPS mutánssal. Ez a fragmens általában kisebb, mint 3 kilobázis, előnyösen mintegy 1 kilobázis. Ennek a DNS fragmensnek a nukleotid szekvenciája bármely szokásos módszerrel meghatározható. Ezután azonosítjuk a nyílt leolvasó keretet (kódoló szekvencia), a feltételezett RNS polimeráz megkötőhelyet (promoter), a riboszomális megkötőhelyet és a transzkripció (átírás) végét jelző terminátor szekvenciát. Az átírás kezdőpontja ismert módon, például SÍ nukleáz enzimmel felvett térképpel vagy primer párosító analízissel meghatározható. Az izolált gént valamely plazmidhoz kötődve tartalmazó baktériumos (általában E. coli) extraktumban meghatározzuk a DHDPS aktivitás jelenlétét, és az L-lizinnel szembeni in vitro viszonylagos rezisztenciáját.

Jellemzés után a gént olyan értelemben módosítjuk, hogy lehetővé váljon a növényi sejtbe történő beépülés, a kifejeződés és a géntermék működése. Ennek során előnyösen úgy járunk el, hogy

1. amionoterminális kloroplaszt tranzit peptidet kódoló DNS szekvenciát kapcsolunk a DHDPS kódoló szekvencia 5 ’ végéhez,

2. a bakteriális 5’ és 3’ szabályozó szakaszokat a növényi sejt által felismerhető és ott működőképes 5 ’ és 3 ’ szabályozó szakaszokkal cseréljük le,

3. ezt a növény specifikus kifejező kazettát olyan vektorba építjük be, amely alkalmas a DHDPS génnek a növényi sejtbe történő bevitelére és ott stabil megkötésére.

Kloroplaszt tranzit peptid (CTP) DNS szekvencia bevitele

A lizin bioszintézisével kapcsolatban álló és eddig vizsgált valamennyi növényi enzim a kloroplasztokban lokalizálódik. Ezért az idegen gén termékének megfelelő elhelyezkedéséhez egy kloroplaszt tranzit peptid szekvenciát kódoló DNS fragmenst kapcsolunk a DHDPS-t kódoló DNS szekvencia 5’ végéhez a megfelelő leolvasókeretben, miáltal a génfuzió átírásakor egy komplett tranzit peptid-DHDPS preprotein olvasódik le. A megfelelő tranzit peptidek (általában 40-70 aminosav hosszúságú) a leolvasás után a preproteint a kloroplaszthoz irányítják, ahol a preprotein egy energiafüggő folyamatban vesz részt. A tranzit peptid az érett polipeptid termelése során vagy közvetlen utána lehasad.

A tranzit peptidet kódoló DNS fragmens előállítható különböző növények sejtmag génjeiből, amennyiben a géntermékek aminoterminális tranzit peptidet tartalmazó preproteinként fejeződnek ki, és a kloroplasztba kerülnek. Ilyen tranzit peptid szekvenciát tartalmazó ismert növényi géntermékek például a ribulóz biszfoszfát-karboxiláz kis alegysége, a ferredoxin, a klorofil A/B megkötő fehérje, a kloroplaszt riboszomális fehérje, amelyet sejtmag gének kódolnak, bizonyos hősokk fehérjék, aminosav bioszintetikus enzimek, így acetohidroxisav-szintóz és három enol-piruvil-foszfosikimát szintáz és ehhez hasonlók. Emellett, a tranzit peptidet kódoló DNS fragmens részben vagy egészen vegyileg szintetizálható tranzit peptidek ismert szekvenciáiból.

A tranzit peptidet kódoló DNS fragmensnek eredetétől függetlenül olyan transzlációs iniciátor kodont kell tartalmaznia, és olyan aminosav-szekvenciát kell kódolnia, amely a gazdanövény kloroplasztjában felismerhető és jól működik. Ügyelni kell a tranzit peptid és az érett DHDPS alegység kapcsolódásánál található aminosavszekvenciára, ahol a preprotein érett DHDPS-re hasad. Megtörtént néhány megőrzött aminosav-szekvencia azonosítása, amelyek mintaként szolgálnak. A tranzit peptidet kódoló szekvencia és a DHDPS-t kódoló szekvencia pontos fúziójához az egyik vagy másik DNS szekvencián bizonyos műveleteket kell elvégezni, például egy megfelelő hasítási helyen. Ez megvalósítható például helyspecifikus mutációval, kémiailag szintetizált oligonukleotid linker beépítésével vagy más hasonló módon.

A kloroplaszt tranzit peptid működése in vitro körülmények között az alábbiak szerint vizsgálható:

A tranzit peptid-DHDPS gént kifejező kazettát valamely plazmid vektorba visszük be úgy, hogy a gén a megfelelő orientációban helyezkedjen el egy bakteriofág promoter, így SP6, T3 vagy T7 transzkripciós kontrollja alatt. A kapott plazmidot a kódoló szekvenciához viszonyított 3’ hasítóhelyen emésztve lineáris DNS molekulát állítunk elő. Ezzel a DNS molekulával egy gyorsan lejátszódó transzkripciós reakciót hajtunk végre az alkalmazott promoterre specifikus RNS polimeráz felhasználásával. Az ilyen reakció kitermelése általában 10-12 μg lényegében tiszta messenger RNS (mRNS) 1 μg lineáris DNS templátra számolva. Ezt az mRNS-t egy vagy több radio-jelölésű aminosav jelenlétében in vitro leolvasó rendszerben, így búzacsíra vagy nyúl retikulocita lizátum jelenlétében radio-jelölésű preproteint állítunk elő.

A radio-jelölésű preproteint izolált intakt kloroplaszttal inkubáljuk fény jelenlétében a hatékonyság

HU 214 630 Β megállapításához. A kloroplasztot ezután valamely proteázzal vagy proteázok kombinációjával, így termolizinnel, tripszinnel vagy kimotripszinnel kezeljük. Ez a kezelés elroncsol minden olyan fehérjét, amely nem a kloroplaszton belül választódott le. Proteáz inhibitorok jelenlétében végzett mosás után a kloroplasztot centrifügálással, fagyasztás/felolvasztás kezeléssel, redukált ozmózis nyomással vagy ezek kombinációjával roncsoljuk. A lizátumot a) közvetlenül vizsgáljuk, b) először DHDPS alegység antibakteriális antiszérum segítségével végzett immunokicsapásos módszerrel a standard eljárással vizsgáljuk, c) centrifugálva elválasztjuk a váz fehéijéket (felülúszó) a tilakoid membránban lokalizált fehérjékből (pellet), d) vagy a fenti eljárások kombinációját hajtjuk végre. SDS poliakrilamid gél analízissel ellenőrizzük az érett bakteriális DHDPS alegység molekulatömegének megfelelő radio-jelölésű fehéijesáv jelenlétét. A sáv jelenléte azt igazolja, hogy a preprotein megfelelő méretben beépült és működik.

Növény által felismerhető szabályozó szakaszok beépítése

Bakteriális gén, így DHDPS növényi sejtben történő kifejezéséhez olyan szabályozó szakasz szükséges, amely növényi sejtben felismerhető és működőképes. Ilyen szekvencia az 5’ transzkripciós iniciátor szakasz és a 3’ transzlációs és transzkripciós terminátor szakasz. Az 5’ transzkripciós iniciátor szakasz RNS polímeráz kötőhelyet tartalmaz (promoter). Az átírás szabályozására tartalmazhat olyan szakaszokat is, amelyek a szabályozást kémiai vagy fizikai indukció vagy elnyomás közvetítésével végzik.

Az ilyen szabályozásra példaként említhető a ribulóz biszfoszfáz-karboxiláz kisegység fénnyel indukált kifejezése, a hősokk fehérjék hővel indukált kifejezése, a génnel szabályozott növényi hormonok vagy más metabolitok, a fejlődés által szabályozott kifejeződések, és sérüléssel vagy stresszhatással kiváltott kifejeződések.

Az 5’ szekvencia tartalmazhat még olyan szekvenciát is, amely az átírást segíti. Az 5’ szekvencia a gazdanövény vonatkozásában lehet natív vagy származhat más növényből is, ahol a szekvenciák a gazdanövényben működőképesek. Megfelelő szekvenciák állíthatók elő Agrobacterium tumefaciens-ből származó Ti plazmid génjeiből is, amelyek oktopin-szintázt, nopalin-színtázt, mannopin-szintázt vagy hasonlókat tartalmaznak, valamint egyes vírusgénekből is. Eljárhatunk úgy is, hogy a transzkripciós iniciátor szakaszt részben vagy egészben kémiailag szintetizáljuk.

A 3’ szakasz transzkripciós terminátor szakaszt és adott esetben poliadenilező szignál szekvenciát tartalmaz. Ez a szekvencia származhat az 5’ szekvenciával azonos vagy attól eltérő génből. Lehetséges az is, hogy ezt a szekvenciát kémiailag szintetizáljuk.

A kapott kifejező kazetta 5’ transzkripciós iniciátor szakaszt, kloroplaszt tranzit peptidet kódoló szekvenciát, bakteriális DHDPS alegységet kódoló szekvenciát, transzlációs stop-kodont és 3 ’ transzkripciós terminátor szakaszt tartalmaz. A kazetta általában legfeljebb 5 kilobázis, előnyösen 2-3 kilobázis méretű.

A kifejező kazettának növény transzformálására alkalmas vektorba történő beépítése A bakteriális DHDPS kifejező kazettának a növényi sejtbe történő beviteléhez alkalmazott vektor kiválasztása az alkalmazott transzformálási eljárástól függ, amely a gazdanövénytől és az alkalmazott növényszövettől függ. Idegen DNS-nek egyszikű és kétszikű sejtekbe történő bevitelére egy sor eljárás ismert, példaként említhető a mikrobefecskendezés, elektroporáció, Ca⁺⁺-ionnal kicsapott DNS-sel végzett inkubálás, az idegen DNS-t tartalmazó liposzomával végzett inkubálás (előnyösen PVA és Ca' jelenlétében), vírus rendszerek, és Agrobacterium-mal közvetített transzformálás [M. Fromm és munkatársai: PNAS US, 82, 5824 (1985); T.M. Klein és munkatársai: Natúré 327, 70 (1987); P. Lurquin és munkatársai: Plánt Sci. Lett., 25, 133 (1982); J. Paszkovwki és munkatársai: EMBO1,3, 2717(1984)].

Az első négy eljárást „csupasz” DNS-sel végezzük, ahol a kifejező kazetta valamely E. coli klónozó vektort, így pBR322, pRK290, pACYC184 plazmidot hordoz. Vírus vektor alkalmazása esetén előnyös, ha a rendszer fenntartja a replikációs funkciót, de a betegséget nem váltja ki. Agrobacterium-mal közvetített transzformációhoz a kifejező kazetta egy vektort és az Agrobacterium Ti vagy Ri plazmid fragmensét tartalmazza, amely megadja a Ti vagy Ri plazmiddal transzferált DNS (T-DNS) jobb és adott esetben bal szegélyét. Ez elősegíti az idegen génnek a növényi sejt genomjába történő beépülését. A vektor olyan szekvenciát is tartalmaz, amely elősegíti a plazmidnak az Agrobacterium sejtben, valamint E. coli sejtben történő replikálódását.

A DNS műveleteket általában E. coli sejtekben hajtjuk végre, és a DHDPS kifejező kazettát hordozó plazmidot közvetlen DNS transzformálással, konjugációval vagy más hasonló módon Agrobacterium sejtekbe visszük. Az Agrobacterium sejtek egy második, Ti vagy Ri plazmidokból származó plazmidot is tartalmaz, amely tartalmazza az idegen DNS-nek növényi sejtbe történő beviteléhez szükséges valamennyi vir gént.

Az alkalmazott vektortól és transzformálási eljárástól függetlenül a transzformált növényi sejtek azonosítása megkönnyíthető valamely, növényi sejtekben szelektálható funkciót kódoló gén alkalmazásával. Előnyösen alkalmazhatók a növényi sejtekre nézve káros vegyszerekkel szembeni rezisztenciát kódoló gének, így a higromicin, kanamicin, metoteraxát és bizonyos herbicidek elleni rezisztenciát kódoló gének. A szelektálható marker bevihető olyan külön plazmiddal, amelyet a DHDPS plazmiddal együtt transzformálunk, vagy ugyanannak a plazmidnak a részét képezheti. Az Agrobacterium által közvetített transzformálás esetén a szelektálható marker a T-DNS szegélyeket jelölő plazmidok részét is képezheti. Eljárhatunk úgy is, hogy valamely kimutatható markert, így B-glükuronidáz gént alkalmazunk a szelektálható marker helyett. Az ilyen génnel transzformált sejtek 5-bróm-4-klór-3-indol-p-Dglükuroniddal (X-Gluc) végzett kezelés után a kék szín alapján azonosíthatók.

HU 214 630 Β

Növények transzformálása és regenerálása

A transzformáláshoz alkalmazott növényi szövetet a gazdanövény típusa és a transzformálási eljárás függvényében választjuk meg. Szövetként alkalmazható a kallusz, szuszpenziós sejtkultúra, protoplaszt, levélszegmens, szárszegmens, kukoricacímer, virágpor, embrió, hipokotil, gumószegmens, merisztéma szakasz és hasonló részek. Előnyösen olyan szövetet alkalmazunk, amelyből a transzformálás után az egész termő növény regenerálható.

A transzformálást az alkalmazott növényi szövethez igazodva végezzük. A növényi sejtet vagy szövetet megfelelő ideig a DHDPS kifejező kazettát hordozó DNS-sel kezeljük. A kezelési idő elektroporáció alkalmazása esetén lehet egy legfeljebb 1 másodperc hosszú elektromos impulzus, vagy plazmidot hordozó Agrobacterium sejtek jelenlétében végzett 2-3 napos együtt tenyésztés. A puffért és a közeget szintén az alkalmazott növényi szövet és transzformálási eljárás függvényében választjuk meg. Egyes transzformálási eljárásoknál előnyös lehet a szuszpendált sejtkultúrát (például dohánykultúrát.adagoló rétegben alkalmazni egy szilárd tápközeg felületén, amelyet egy steril szűrőpapírlemez választ el a transzformált növényi sejtektől vagy szövetektől.

A DNS-sel végzett kezelés után a növényi sejtet vagy szövetet különböző ideig tenyésztjük a szelektálás előtt, vagy közvetlenül a szelektálószerrel kezeljük. Agrobacterium alkalmazása esetén segédanyagként olyan szert alkalmazunk, amely akadályozza az Agrobacterium sejtek növekedését. Előnyösen alkalmazható a cefotaxim és a karbenicilin. A szelektáláshoz alkalmazott közeg kialakítható úgy, hogy a transzformált kalluszt vagy szuszpenziós sejtkultúrát változatlan állapotban fenntartsa vagy lehetővé tegye a kalluszból hajtás, levél vagy szár szegmens vagy gumó kialakulását.

Transzformáltnak minősíthetők azok a sejtek és kalluszok, amelyek a szelektálószer normális esetben gátlást kiváltó koncentrációja jelenlétében is fejlődőképesek. Ezeket kívánt esetben megfelelő ideig tovább tenyésztjük a nem rezisztens változatok eltávolításához. A sejtekben vagy kalluszban ezután kívánt esetben ellenőrizzük a bakteriális DHDPS gén kazetta jelenlétét, majd az ismert módon növénnyé regeneráljuk. Hajtások közvetlen előállítása esetén a szelektáló közegen megjelenő hajtásokat transzformáltnak tekintjük. Ezeket eltávolítjuk, és gyökérképződést elősegítő szelektív közegen továbbtenyésztjük, vagy gyökeresedést kiváltó vegyületbe merítjük, és közvetlenül vermikulitban elültetjük.

A regenerált növény és utódjai jellemzése

Megemelt szabad lizintartalommal rendelkező transzgenetikus növények előállításához a bakteriális génnek be kell épülnie a növényi sejtbe, közelebbről a növényi genomba. Valamely inhibitorszerrel szembeni rezisztencia alapján kiválogatott növényi sejtekről és szövetekről feltételezhetjük, hogy a transzformálás során felvették a rezisztenciát kódoló gént. Mivel ez a marker gén általában a bakteriális DHDP szintáz génhez kapcsolódik, feltételezhető, hogy a növényi sejt vagy szövet a bakteriális DiqP szintáz gént is felvette. Az idegen gén felvételét és növényi genomba történő beépülését mintaként bakteriális DHDP szintáz génre specifikus próbát alkalmazó Southern folthibridizációs analízissel ellenőrizhetjük. A vizsgálat eredményeitől következtethetünk a gén beépült másolatainak számára is. Az idegen génnek mRNS-sé történő hatásos átírását a teljes sejt RNS és/vagy poliadenilezett szakasszal dúsított sejt RNS Northern folthibridizációs analízisével vizsgálhatjuk.

Az átírás után az mRNS-t a növényi riboszómában le kell olvasni, és olyan polipeptidet, így bakteriális DHDPS szintáz alegységet kell képezni, amely felveszi a katalitikus aktivitáshoz szükséges háromdimenziós konfigurációt. Azok a növényi sejtek és szövetek, amelyek hordozzák és átírják a bakteriális DHDP szintáz gént, tovább jellemezhetők a sejt vagy szövet extrakciójával és a lizin-toleráns DHDP szintáz aktivitás mérésével. Ez az in vitro lizin-tolerancia előnyösen hasonlítható a gén előállításához alkalmazott mikroorganizmus extraktumában megfigyelhető jelenséghez, és könnyen megkülönböztethető a kontroll növényi sejtből vagy szövetből extrahált, erősen lizinérzékeny természetes DHDP szintáz aktivitástól. A kazettában alkalmazott átírási iniciátor és regulátor szekvencia függvényében az aktivitás kimutatható a növény valamennyi szövetében, néhány kiválasztott szövetben vagy csak megfelelő indukáló körülmények között.

A növényen belüli elhelyezkedéstől függetlenül a bakteriális DHDP szintáz aktivitásnak a növényi sejten belül kell elhelyezkedni ahhoz, hogy részt vehessen a lizin bioszintézisében, a szubsztrátumnak termékké történő átalakítását katalizálva. A bakteriális DHDP szintáznak ezt a képességét úgy vizsgálhatjuk, hogy meghatározzuk a növényi sejtnek vagy szövetnek a lizin analóg S-(2-amino-etil)-ciszteinnel (AEC) szembeni relatív toleranciáját. A lizinhez hasonlóan az AEC is potenciálisan gátolja a növényi DHDP szintáz enzimet. A gátló mennyiségű AEC-vel kezelt növényi sejtek vagy szövetek hiányolják a lizint. Az E. coli-ból származó DHDP szintáz azonban lényegesen kevésbé érzékeny ezzel a gátló hatással szemben. Az aktív bakteriális DHDP szintázt kifejező növényi sejteknek vagy szöveteknek az a képessége, hogy elviselik az AEC normális gátló koncentrációját, arra utal, hogy a bakteriális enzim kifejti szerepét a lizin bioszintézisében.

Ha a bakteriális DHDP szintáz elősegíti a lizin bioszintézisét, és nincs más olyan mechanizmus, amely szabályozza a szabad lizin mennyiségét, akkor a szabad lizin jóval nagyobb mennyiségben felhalmozódik, mint a kontroll növényi sejtekben vagy szövetekben. A szabad aminosav mennyisége könnyen meghatározható ismert technikákkal, így a transzgenikus növényi sejt vagy szövet triklór-ecetsawal (TCA) képzett extraktumának reverz fázisú HPLC analízisével.

A fenti mechanizmus alapján fokozott lizintermelést mutató növényeket érettségig neveljük. A növényeket hagyjuk virágozni, majd önbeporzással vagy megfelelő szülővonallal keresztezve magokat állítunk elő. A magokban vizsgálhatjuk a kívánt tulajdonság öröklődését.

HU 214 630 Β

A vizsgálathoz a magokat olyan koncentrációjú AEC jelenlétében csíráztatjuk és hajtatjuk, amely megakadályozza a kontroll magok csírázását. Az AEC toleranciát mutató hajtósokat tovább termesztjük, és az eredeti regenerált növényre ismert módon jellemezzük.

A találmány szerinti transzformálás különböző növényfajtákkal elvégezhető. Példaként említjük a kultúrnövényeket, így szójababot, burgonyát, paradicsomot, csillagfürtöt, napraforgót és gyapotmagot, takarmánynövényeket, így lucernát, lóherét és csenkeszt, valamint a gabonaféléket, így kukoricát, búzát, árpát, zabot, rizst, cirkot, kölest és rozsot. Táplálékként vagy takarmányként felhasználhatjuk az egész növényt vagy annak részeit, vagy a lizint táplálék vagy takarmányadalékként történő felhasználáshoz kivonjuk.

Bár a fokozott lizintermelés a fent ismertetett módon a transzformált növény leveleiben érhető el, feltételezhető, hogy a találmány szerinti eljárással a szabad lizin felhalmozása más növényi részekben, így gumóban vagy termésben is biztosítható.

A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példákban mutatjuk be anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna.

I. példa

A. Felhasznált anyagok és módszerek

A restrikciós endonukleázokat, a T4 ligázt, a polinukleotid kinázt és a borjúból foszfatázt a gyártó cég előírásai szerint alkalmazzuk. A standard rekombináns DNS eljárást, az Escherichia coli sejtek transzformálását és molekuláris analízisét Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982) szerint végezzük.

Az in vitro átírást (SP6) és leolvasást (nyúl retikulocita lizátum) a Promega Biotec (Madison, USA) reagenseivel és a gyártó előírásai alapján végezzük.

Az oligonukleotidokat foszfor-amidit módszerrel [Caruthers: Science, 230, 281-285 (1985)] kémiailag szintetizáljuk.

A növényi sejtek transzformálásához Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzset [pAL4404; Hoekema és munkatársai: Natúré, 303, 179-180 (1983)] alkalmazásával végezzük.

A dap A gén izolálását és jellemzését Glassman ismerteti [Cloning and Characterization of the dap A Gene of Escherichia coli, M.S. Thesis, Univ. of Minnesota, Minneapolis, USA (1983)].

A géneket Escherichia coli genomtárából izoláljuk (Clarké and Carbon Collection of Hybrid Plasmids, Yale University School of Medicine, New Haven, USA). A plazmidnak (pLC1730) a dap A gént hordozó fragmenseit pBR322 klónozó vektorba szubklónozzuk. A dap A gént hordozó fragmenseket az E. coli dap A mutánsával kiegészítve azonosítjuk, és a plazmid által kódolt 32 kilodalton moltömegű fehérje (megfelel a dihidro-dipikolinsav-szintáz alegységnek) kimutatásával, és a dihidro-dipikolinsav-szintáz enzimatikus aktivitásának mérésével ellenőrizzük. Az egyik ilyen plazmid szerkezet nukleotid szekvenciáját meghatározzuk, és azonosítjuk a feltételezett promoter szekvenciát és a dap A gén kódoló szekvenciáját. A külső DNS oldalláncokat további szubklónozással távolítjuk el.

A pDAP1763 plazmid hordozza a teljes dap A kódoló szekvenciát, valamint az 5’ és 3’ le nem olvasott szakaszokat egy 1564 bp Ndel-BstEII fragmensen belül. A pDAP1205 plazmid egy 1375 bp Ndel-Sphl fragmenst tartalmaz, amelyből hiányzik a kódoló szekvencia utolsó tizenhárom bázisa és a teljes le nem olvasott 3’ szekvencia. Mindkét plazmid pBR322 származék, és a köz számára hozzáférhető anyagokból előállítható. A dap A gént kódoló restrikciós fragmensek a pLC1730 plazmidból (Clarké and Carbon Collection of Hybrid Plasmids, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA) nyerhetők. A dap A gént hordozó fragmenseket pBR322 plazmidba (Gibco, katalógusszám 5367A) szubklónozzuk.

A pDAP1763 plazmid előállításához a dap A gén 1564 bp méretű Ndel-BstEII ffagmensét pBR322 plazmidba szubklónozzuk a szokásos módon (Maniatis et al: A Guide to Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, NY, USA, 1982). A pDAP1205 plazmid előállításához a dap A gén Ndel-Sphl fragmensét szubklónozzuk a pBR322 plazmidba.

B. Kloroplaszt tranzit pepiid szekvencia

Egy borsó kloroplaszt tranzit peptidet kódoló DNS szekvenciát állítunk elő, amelynek során először szubfragmenseket szintetizálunk és ezeket egyesítjük.

A borsó ribulóz biszfoszfát-karboxiláz kis alegység génjének kloroplaszt tranzit peptidje szekvenciája alapján [Cashmore: Genetic Engineering of Plants, A. Hollander, Plenum Press (1983)] nyolc oligonukleotidot (szálanként négy) szintetizálunk vegyi úton.

ILVB52

AGCTTTGCAATTCATACAGAAGTGAGAAAAATGGCTTCTATGATATCCTCTT

ILVB32

AACGTTAAGTATGTCTTCACTCTTTTTACCGA

ILVB50

AGATACTATAGGAGAAGGCGACACTGTTGTCAGTCGGCACGGAGATCCCC

ILVB57

CCGCTGTGACAACAGTCAGCCGTGCCTCTAGGGGGCAATCCGCCGCAGTGGCTCCAT

ILVB58

CGTTAGGCGGCGTCACCGAGGTAAGCCGCCGGAGTTTAGGTACTGACCTAAGGGTCAC

ILVB55

TCGGCGGCCTCAAATCCATGACTGGATTCCCAGTGAAGAAGGTCAACACTGACAT

HU 214 630 Β

ILVB56

TTCTTCCAGTTGTGACTGTAATGAAGGTAATGTTCGTTACCACCTTCTCATTTCAC

ILVB40

TACTTCCATTACAAGCAATGGTGGAAGAGTAAAGTGCATG.

A hat belső 5’ terminális bázist T4 polinukleotid-kináz segítségével foszforilezzük, majd a nyolc oligonukleotid mindegyikéből 100-100 pmol mennyiséget 70 μΐ össztérfogatban összekeverünk. Az elegyből 10 μ 1-t 100 ng HindlII-Sphl emésztett pPol26 plazmiddal egyesítünk [Robbins és munkatársai: J. Virol. 58, 339-347 (1986)], 5 percen keresztül 95 °C hőmérsékleten denaturáljuk, majd 2 órán keresztül szobahőmérsékleten temperáljuk, végül ligáljuk. így pSTP31 plazmidot kapunk. A szintetikus szekvencia egy HindlII 5’ tullógó részt, 30 bp le nem olvasott leadert, az 57 aminosavas tranzit peptidet (tp) kódoló 171 bp szakaszt, és egy 3’ Sphl tullógó részt tartalmaz, ami a tranzit pepiidnek az evolúció során megőrzött hasítási helyét reprezentálja.

C. A dap A gén módosítása a növénysejtben történő felhasználáshoz

A dap A gén kódoló szakaszán kívül eső bakteriális DNS-t eltávolítjuk, és a növényi sejt által felismerhető és felhasználható szekvenciával helyettesítjük.

A fenti tranzit peptid szekvencia hozzáadásához a dap A kódoló szekvencia 5’ terminális részét módosítva egy Sphl helyet alakítunk ki. Ehhez a pDAP1763 108 bp Nsil-Nrul fragmensét egy 29 bp szintetikus linkerrel helyettesítjük,

TGCATGCTCACGGGAAGTATTGTCG

ACGTACGTACGAGTGCCCTTCATAACAGC amely mind az Nsil, mind az Nrul helyet regenerálja. Ez az eljárás kiiktatja a dap A bakteriális promoterét, és a start kodon körüli szekvenciát CCATGT-ről GCATGC-re változtatja, kialakítva így a szükséges Sphl hasító helyet. Ez a változtatás az aminosav-szekvenciában a 2-helyzetben a fenilalanint leucinra cseréli. A plazmid a pDAP1900 j elet kapta.

A pDAP1900 plazmid 865 bp Sphl fragmensét, amely tartalmazza a dap A kódoló szekvenciát (legalább az utolsó tizenhárom bázispárt) Sphl enzimmel hasított pSTP31-be ligáljuk úgy, hogy a dap A kódoló szekvencia 5’ vége a szintetikus tranzit peptid szekvencia 3’ végéhez kapcsolódjon, és a borsó kis alegység preprotein természetes hasítóhelye megmaradjon. A kapott plazmid a pDAP4001 jelet kapta. A plazmidban lévő polilinker egy SacI helyet biztosít a kódoló szekvencia végétől a 3’ irányba. Ezt a helyet felhasználva a tranzit peptid (tp)::dap kazettát egy HindlII-Sacl 1070 bp fragmens formájában HindlIISacI hasított pGEM3-ba (Promega Biotec, Madison, USA) visszük, és így pDAP4104 jelű plazmidot kapunk.

A dap A kódoló szekvencia 3’ terminális részét négy szempontból módosítjuk:

1. elroncsoljuk az Sphl helyet (így egyedüli hasítóhelyként az 5’ terminális részen előállított hely marad meg);

2. visszaállítjuk a szekvencia utolsó négy aminosavját, amit a pD API 205 eredeti szerkezetében elveszítettünk;

3. két stop-kodont adunk hozzá;

4. a kódoló szekvencia végével szomszédosán egy BamHI-et alakítunk ki.

Ezt a következőképpen hajtjuk végre:

A pDAP1205 plazmidot Sphl és BamHI enzimmel hasítjuk, és egy 25 bp szintetikus linkért

GCGGTTTGCTGTAATAG

GTACCGCCAAACGACATTATCCTAG Egálunk a pBR322 DNS 147 bp helyére, és így pDAP1252 plazmidot kapunk. A kodon Sphl helyének elroncsolásával az aminosav-szekvencia 289 helyén az alanint glicinre cseréltük.

Az újonnan előállított BamHI helyet felhasználva növényi sejt által felismerhető transzkripciós terminátor szignált építünk be. A pDAP1252 plazmidot BamHI és HindlII enzimmel emésztjük, és a pRLIOl 260 bp BamHI-HindlII fragmenséhez ligáljuk, amely tartalmazza a transzkripciós terminátort, és a pTiC58 nopalin-szintáz (nos) génjének poliadenilező szignál szekvenciáját [673-422 nukleotid; Bevan és munkatársai: NAR, 11, 369-385 (1983)]. A kapott plazmid a pDAP1264 jelet kapta.

Végül a módosított dap A terminális részt egyesítve helyreállítjuk a gént. A pDAP1264 plazmidot BstEII enzimmel (a dap A kódoló szekvencia közepén) és EcoRI enzimmel (a nos poliA szekvencia 3’ végénél) emésztjük, és a pDAP4104 plazmid BstEII-EcoRI fragmensébe ligáljuk. A kapott pDAP4201 plazmid tartalmazza a szintetikus kloroplaszt tranzit peptid (STP) szekvenciát, amelyhez dap A kódoló szekvencia és nos 3’ szakasz kapcsolódik, valamennyi a pGEM3 SP6 promoterének szabályozása alatt. Ezt a szerkezetet használjuk a tranzit peptid funkció in vitro analíziséhez.

A génfunkció növényi sejtben történő in vivő vizsgálatéhoz a fenti STP::dap A::nos 3’ kazettát a CaMV 35S promoterének szabályozása alá helyezzük. Ehhez a pPO126 polilinker BamHI helyére a pCaMVPRO 35S promoter szekvenciáját hordozó 450 bp BamHI-BglII fragmensét [Fromm és munkatársai: PNAS, 82, 5824-5828 (1985)] építjük be, és így p35-227 plazmidot kapunk. Ez a szerkezet a promoter 3’ részén egy Hindin helyet épít be. A pDAP4201 1340 bp HindlII ffagmensét, amely tartalmazza a teljes dap A gén kazettát, a fenti helyre ligáljuk olyan pozícióban, amely lehetővé teszi a növényi sejtben történő kifejezéshez szükséges funkcionális átírási egység képzését (pDAP4307 plazmid).

D. A tranzit peptid in vitro funkciója

A szintetikus tranzit pepiidnek azt a képességét, hogy irányítsa a dap A géntermék intakt kloroplaszt által törté9

HU 214 630 Β nő kifejezését, in vitro kloroplaszt kifejező vizsgálattal [della-Cioppa és munkatársai: Bio/Technology, 5, 579-584 (1987)] vizsgáljuk. 35S metioninnal jelölt preproteint állítunk elő a vizsgálathoz. Ehhez pDAP4201 DNS-t EcoRI-gyel emésztünk, és SP6 polimeráz segítségével átújuk [Méltón és munkatársai: NAR, 12, 7035-7036 (1984)]. A plazmid DNS-t RNáztól mentes DNázI enzimmel emésztve eltávolítjuk, az mRNS-t etanollal kicsapjuk, 25 μΐ steril, desztillált, ionmentesített vízben szuszpendáljuk, és spektrofotometriásán analizáljuk. 8 pg mRNS-t használunk egy in vitro leolvasási reakcióban (nyúl retikulocita lizátum), amely 145 μΐ össztérfogatban 2,5 pCi/pl 35S metionint (New England Nuclear, Boston, USA) tartalmaz. A reakcióelegyet percen keresztül 35 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd a reakciót jéggel megállítjuk.

Aktív, intakt kloroplasztot izolálunk Lactuca sativa (fejessaláta) leveleiből Bartlett és munkatársai által borsóhajtásra ismertetett módszerével [Methods in Chloroplast Molecular Biology, Edelman és munkatársai, Elsevier Biomedical Press, (1982)]. Az izolált kloroplasztot kifejező pufferben (50 mmol/1 HEPES, pH = 7,6, 0,3 mol/1 szorbitul) hozzáadunk 2 mg/ml klorofillt és felhasználásig jégen tartjuk.

μΐ in vitro transzlációs terméket (főként tp::DHDPS alegység preprotein) jégen 110 μΐ kifejező pufferrel, 25 μΐ, 0,1 mol/1 L-metioninnal, 15 μΐ 0,1 mol/1 ATP-vel és 100 μ 1 kloroplaszttal egyesítünk. A reakcióelegyet tengelyre helyezzük, és óvatosan forgatjuk egy 150 W-os optikai szálas izzó előtt szobahőmérsékleten. 5, és 15 perc elteltével 70 μΐ mintát veszünk, és pipettával jéggel hűtött, 7 ql 1 mg/ml termolizint és 10 mmol/1 kalcium-kloridot tartalmazó oldatot tartalmazó Eppendorf edénybe pipettáljuk [Cline és munkatársai: Plánt Physiol., 75, 675-678 (1984)]. 15 perc elteltével egy második mintát veszünk, és kontrollként jéggel hűtött, 7 μΐ 10 mmol/ml kalcium-kloridos oldatot tartalmazó Eppendorf edénybe pipettázzuk. Az edényeket jégen 20 percen keresztül inkubáljuk, majd 150 μΐ kifejező pufferrel hígítjuk, amely a termolizin gátlásához 50 mmol/1 EDTA-t tartalmaz. 10 másodperces centrifugálás után a kloroplasztot 50 μΐ sejtroncsoló pufferben (10 mmol/1 HEPES, pH = 7,5, 10 mmol/1 EDTA, 1 mmol/1 PMSF, 30 dg/ml aprotinin) szuszpendáljuk, és fagyasztás/megolvasztás két ciklusával roncsoljuk, majd 14000 g értéken 20 percen keresztül centrifugálva elválasztjuk a vázfehérjét (felülúszó) és a tilakoidot (pellet).

A vázfehérje mintákat 12,5 tömeg%-os SDS poliakrilamid gélen [Laemmli: Natúré, 227, 680 (1970)] elektroforizáljuk. A gélt színezzük, szárítjuk, és autoradiografíásan vizsgáljuk. A kontrollminta (nem tartalmaz proteázt.egy 42 kilodaltonos sávot mutat a tp::DHDPS alegység preproteinnek megfelelően. Mind a három termolizinnel kezelt mintában hiányzik a 42 kilodaltonos sáv, és ehelyett mintegy 32 kilodaltonos sávot tartalmaz, ami a proteolitikus emésztésből származik, és ezért feltételezhető, hogy a kloroplasztba történő bevitel megtörtént. A 32 kilodaltonos fehéije az érett bakteriális dihidro-dipikolinsav-szintáz alegység móltömegének felel meg.

E. BinerpBVI vektor előállítása

A módosított dap A gén növényi sejtbe történő beviteléhez alkalmazott vektor egy bal és egy jobb T-DNS szegélyt tartalmaz, amely a pTiAch5 plazmidból származik, és amely gyorsítja a génnek a növényi genomba történő beépülését. A vektor tartalmaz továbbá egy E. coli szelektálható markert (ampicillin rezisztencia), egy Agrobacterium tumefaciens és dohány szelektálható markert (kanamicin rezisztencia), és egy replikációs origót, amely lehetővé teszi a plazmidnak az E. coli-ban és az Agrobacterium tumefaciensben történő replikálódását.

1. A T-DNS szegélyek szubklónozása

A pTiAch5 TL DNS bal szegélyét úgy állítjuk elő, hogy a pOTY8 plazmidot (Hoekema idézett műve) BamHI és Clal enzimmel emésztjük, majd egy 1206 bp fragmenst izolálunk [1-1206 nukleotid; Barker és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 2, 335-350 (1983); DeVos és munkatársai: Plasmid, 6, 249-253 (1981)]. A fragmenst BglII-Clal-enzimmel emésztett pPol26 plazmidba ligáivá pOTBLl plazmidot kapunk.

A jobb szegélyt hasonló módon állítjuk elő a pOTY8 plazmidból, amelynek során egy 5766 bp HpalXhol fragmenst építünk be a Hpal és Xhol enzimmel emésztett pPo 126 polilinker szakaszába, és így pTB 11828 plazmidot kapunk.

2. pSa renlikációs origo szubklónozása

A pSa széles gazda-spektrumú replikációs origóját pUCD2 plazmid [Close és munkatársai: Plasmid 12,

111-118 (1984)] Hindii és BamHI enzimmel végzett emésztésével izoláljuk. A 2900 bp őri fragmenst HpalBhlII emésztett pPol26 plazmidba ligáivá pPolSa plazmidot kapunk.

3. Bal és jobb T-DNS szegélyt és pSa replikációs origót tartalmazó plazmid (pBR322LRSa) előállítása

A bal és jobb T-DNS szegélyt és a pSa replikációs origót pBR322 plazmidba építjük be az alábbi módon. pOTBLl plazmidot Call és HindlII enzimmel emésztünk (602 nukleotid, Barker idézett műve) és így 604 bp fragmenst kapunk, amelyet a DNS polimeráz Klenow fragmensével tompa végűvé alakítunk. A DNS fragmenst a pBR322 plazmid PvuII helyébe beépítve pBR322L plazmidot kapunk. A jobb szegélyt a pTBl 1828 plazmid 912 bp Clal-BamHI fragmense hordozza (13774-14686 nukleotid, Barker idézett műve), és ezt Clal és BamHI enzimmel emésztett pBR322L plazmidba ligáivá pBR322LR plazmidot kapunk.

A pBR322LR hibrid Clal helye érzékeny az E. coli MC1000 törzs metilezésére, és ezért visszajelzi a Clal emésztést. A plazmidot E. coli GM272 (danr, dcnr) törzsbe [Marinus és munkatársai: J. Bacteriol. 114, 1143-1150 (1973)] visszük be, és így lehetővé tesszük a pPolSa plazmidból származó 2900 bp EcoRI-CalI pSa fragmensnek az EcoRI-Clal enzimmel emésztett pBR322LR plazmidba történő beépülését. A kapott plazmid a pBR322LRSa jelet kapta.

HU 214 630 Β

4. Kanamicin rezisztencia marker kialakítása Agrobacterium-ban és növényben kanamicin rezisztenciát kiváltó szelektálható markert állítunk elő a pTiAch5 TR DNS 24 átírásából származó promoter felhasználásával. Ezt a promoter szakaszt a pRK290Eco Cla plazmid 1503 bp EcoRI-Clal fragmenseként [Gelvin és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 199, 240-248 (1985)] állítjuk elő, amely a 2166320128 nukleotidnak felel meg (Barker idézett müve). A fragmenst EcoRI és Clal enzimmel emésztett pPol26 plazmidba ligáivá pPoIPTR plazmidot állítunk elő. A 24. transzkriptum promoter 3’ részénél lévő polilinker BamHI helyére Tn5-ből származó 1500 bp BglII-BamHI fragmenst [Rothstein és munkatársai: Cell 19, 795-805 (1980)] építünk be. Ez a fragmens tartalmazza a neomicin foszfotranszferáz II (NPTII) kódoló szakaszát, de hiányzik a természetes NPTII promoter. Annak ellenőrzésére, hogy a fragmens a 24. transzkriptum promoterhez képest megfelelő orientációban helyezkedik el, vizsgáljuk, hogy a kapott pPOINPTII plazmid kanamicin rezisztenciát okoz-e E. coli sejtekben.

A pTiAch5 oktopin-szintetáz (öcs) génjéből poliadenilező szignálszekvenciát izolálunk a pTBl 1828 707 bp PvuII fragmense formájában (12541-11834 nukleotid, Barker idézett műve). A fragmenst Smal enzimmel emésztett pPoINPTII plazmidba Egáljuk, és így a 3’ rész 500 bp külső Tn5 szekvenciáját az NPTII kódoló szekvenciára cseréljük. A poliA fragmens megfelelő orientációját az XmalII enzimmel emésztett fragmensminták segítségével határozzuk meg. A plazmid a pPoINPTII-A jelet kapta.

5. Szelektálható markerpBR322LRSa plazmidba történő beépítése

A pTR::NPT2::ocs 3’ gén kazettát egy 3100 bp Xhol fragmens formájában a pPoINPTII-A fragmensből az Sáli enzimmel emésztett pBR322LRSa plazmidba visszük, és így pBVl plazmidot kapunk. Ez a 11,5 kilobázis méretű plazmid az egyetlen EcoRI helytől az óramutató járásának irányába haladva a következő komponenseket tartalmazza: széles gazda-spektrumú pSa őri, jobb szegély, Hpal és BamHI klónozó helyek, pTR/NPTII/ocs kimér gén (az óramutató járásának irányában átírva), a pBR3221415 bp szakasza (SallPvuII), bal szegély és pBR322 PwII-EcoRI fragmense, amely tartalmazza a replikációs origót, és az ampicillin rezisztencia gént.

F. Módosított dap A gént tartalmazó transzformációs vektor előállítása (pDPZ4474 éspDAP4511)

A pBVl jobb oldali szegélyén található Hpal és

BamHI helyeket felhasználva beépítjük a CaMV p35S::STP31::dap A::nos 3’ kazettát. A pDAP4307 plazmidban lévő azonos kazetta polilinker oldalláncának hasítási helyeit felhasználva egy 1830 bp SmalBglII fragmenst Egálunk a Hpal-BamHI-emésztett pBVl plazmidba, és így pDPZ4474 plazmidot kapunk. Ebben a szerkezetben a dap A gén az NPTII gén mellett helyezkedik el, és vele azonos irányban íródik át.

Hasonló módon, a pDAP43071830 bp BamHI (részleges)-Hpal fragmensét Hpal-BamHI emésztett pBVl plazmidba ligáljuk, és így pDAP4511 plazmidot kapunk. Ebben a szerkezetben a dap A gén szintén az NPTII szelektálható marker mellett helyezkedik el, de ellentétes orientációban, ezért eltérő módon íródik át.

A pDPZ4474 (ATCC 67721) és a pDAP4511 plazmidokat Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404) sejtekbe transzformájuk Van Vliet és munkatársai módszerével [Plasmid, 1, 446-455 (1978)]. A transzformánsokat 50 dg/ml kanamicint tartalmazó lemezen szelektáljuk, és a telepeket szétterítjük.

G. Nicotiana tabacum SRI transzformálása és a növény regenerálása

Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404) tenyészetét, amely pDPZ4474, pDAP4511 vagy pVBl plazmidot hordoz, alkalmazunk a dohány levéllemezek együtt tenyésztéssel végzett transzformálásához. A levéllemezek egy csoportját negatív kontrollként steril vízzel kezeljük.

A Nicotiana tabacum SRI növény levéllemezeit lényegében Horsch és munkatársai módszerével [Science 227, 1229-1231 (1985)] transzformáljuk, azzal az eltéréssel, hogy az Agrobacterium tenyészetet 523 közegen [Kado és munkatársai: Physiol. Plánt Pathol. 2, 47-59 (1972)] tenyésztjük, ahol a tápközeget 20 pg/ml rifampicinnel, 100 μg/ml sztreptomicinnel és 50 μg/ml kanamicinnel egészítjük ki. A tenyésztést 28 °C hőmérsékleten 48 órán keresztül végezzük, majd mossuk, és steril vízben szuszpendáljuk. Tápláló kultúraként tápláló lemezen Black Mexican Sweet szuszpenziós tenyészetét alkalmazzuk. Valamennyi szilárd tápközeg 2,5 g/1 Gelrite-t (Scott Laboratories, Omaha, USA) tartalmaz agar helyett.

A tápláló lemezeket 2 napon keresztül tenyésztjük, majd a levéllemezeket rázókultúrába helyezzük (azonos a tápláló közeggel, de 500 pg/ml karbenicillint és 0, 100 vagy 200 Hg/ml kanamicint tartalmaz, és hiányzik a tápláló kultúra). A lemezeket parafilmmel lezárjuk, és 26 °C hőmérsékleten 12 órás megvilágítási periódus mellett inkubáljuk. A hajtásokat 1 cm vastagság elérésekor levágjuk, és karbenicillint és kanamicint azonos koncentrációban tartalmazó, de hormonmentes gyökereztető közegbe visszük. A gyökerek megjelenése után a növényeket vermikulitba, majd talajba ültetjük.

H. A dap A gén kifejeződésének ellenőrzése regenerált dohány-növényeken

Növényi szöveteken vizsgáljuk a bevitt dap A gén kifejeződését. Ehhez a lizin analóg S-(2-amino-etil)ciszteinnel (AEC) szembeni rezisztencia megjelenését ellenőrizzük. Az AEC a dihidro-dipikolinsav-szintáz potenciális inhibitora növényeken, de a bakteriális DHDPS érzékenysége jóval alacsonyabb. Levéllemezeket preparálunk felületén sterilizált levelekből a transzformációnál ismertetett módon. A levéllemezeket 1 mmol/I Largininnal, és 0, 0,1, 0,2 vagy 0,4 mmol/1 AEC-vel kiegészített hajtatóközegre helyezzük (lemezenként négy levéllemez és kezelésenként két lemez). A 75 μg/ml kanamicinnel kiegészített hajtatóközeget tartalmazó le11

HU 214 630 Β mezeket a szelektálható marker kimutatására alkalmazzuk. A lemezeket 26 °C hőmérsékleten fény mellett 1 héten keresztül tenyésztjük, majd az egyes levéllemezeket lemérjük, és meghatározzuk az átlagos friss tömeget és a standard deviációt.

Valamennyi növényről származó levéllemez zöld marad és AEC távollétében jól fejlődik. A friss tömeg levéllemezenként 9-60 mg értékkel növekszik egy hét alatt. A növekedést a kontroll növényben erősen gátolja az AEC jelenléte. A legalább 0,2 mmol/1 AEC-t tartalmazó lemezen lévő levéllemezek elbamulnak és megfonnyadnak. Ezzel ellentétben a dap A génnel kiegészített növény levéllemezei AEC jelenlétében is zöldellnek és fejlődnek. Ezzel a módszerrel egy sor AEC toleráns növényt azonosítottunk. Egyik ilyen növény jellemzését az alábbiakban ismertetjük.

I. 327 jelű dap A+ dohánynövény jellemzése 1. AEC tolerancia

A 327 jelű növényről származó levéllemezeknek AEC jelenlétére adott válaszát a 101 jelű, vízzel kezelt kontroll növény levéllemezeinek válaszával hasonlítjuk össze. Az eredményeket az 1. táblázat tartalmazza.

1. táblázat

AEC (mmol/1)	Friss tömeg (a kontroll tömeg%-a)
	327	101
0	100	100
0,1	88	32
0,2	81	15
0,4	71	10

A levéllemezek friss tömegét (négy levéllemez lemezenként, két lemez minden AEC koncentrációra) egy hét után mérjük. Az átlagos friss tömeget minden AEC koncentrációnál meghatározzuk, és az AEC mentes lemezen lévő kontroll átlagos friss tömegére vonatkoztatva százalékosan fejezzük ki.

2. Lizin-toleráns DHDP szintáz aktivitása levél extraktumban

A 327 jelű és a magról nevelt NT-SR1 jelű növény fiatal leveleit az alábbi módon extraháljuk. 1-2 g levelet 4 °C hőmérsékleten 2 ml extrakciós pufferben (0,1 mol/1 kálium-foszfát, pH = 7,5/4 °C, 2 mmol/1 EDTA, 1 mmol/1 β-merkapto-etanol, 10 mmol/1 nátrium-piruvát.l g szövetre számolva 0,14 g polivinil-pirrolidon jelenlétében őrölünk. Az extraktumot Miracloth (Carbiochem) szűrőn szűrjük, majd 8000 g értéken 4 °C hőmérsékleten 10 percen keresztül centrifugáljuk. A felülúszóhoz lassan, óvatos kevertetés közben 4 °C hőmérsékleten finoman porított szilárd ammónium-szulfátot adunk 40 tömeg% koncentráció eléréséig. A csapadékot centrifugáljuk, a felülúszóhoz ismét ammónium-szulfátot adagolunk 66 tömeg% koncentráció eléréséig, és a 40-66 tömeg% csapadékot a fent leírt módon centrifugáljuk. A pelletet oszlop pufferben (50 mmol/1 TriszHC1, pH =-7,5/4 °C, 1 mmol/1 EDTA, 10 mmol/1 nátrium-piruvát és 10 tömeg% glicerol) szuszpendáljuk, és Sephadex G25 töltött oszlopon sómentesítjük.

A fehérjekoncentrációt Bradford módszerével (REF) határozzuk meg, amelynek során standardként borjúszérum albumin V faktor por desztillált vízben felvett elegyét alkalmazzuk.

A dihidro-dipikolinsav-szintáz aktivitás kimutatásához o-amino-benzaldehid (ABA) vizsgálatot végzünk [Yugari és munkatársai: J. Bioi. Chem. 240,4710-4716 (1965)]. Desztillált vízben L-lizin-hidroklorid törzsoldatokat készítünk, szűrve sterilizáljuk, és a megadott koncentrációban a kezdődő enzimreakcióhoz adagoljuk. Ezzel egyidejűleg a mintából 200 μΐ alikvot részt eltávolítunk, és a reakciót 800 μΐ stop-pufferrel (0,21 mol/1 citromsav, 0,53 mol/1 nátrium-foszfát, pH = 5/25 °C, amelyhez közvetlenül a felhasználás előtt frissen előállított 10 mg/ml abszolút etanolos oldatból 0,24 mg o-ABA-t adunk) megállítjuk. A rózsaszín elszíneződés kialakításáig a mintát egy órán keresztül 25 °C hőmérsékleten állni hagyjuk, majd az optikai sűrűséget 520 nm hullámhosszon mérjük.

A 327 jelű növény levelei DHDP szintáz aktivitása mintegy 30-szorosa a magról nevelt NT-SR1 jelű növény leveleiben mérhető aktivitásnak. Még jellemzőbb, hogy a 327 jelű növény leveleiben mérhető enzim aktivitás 100 pmol/l L-lizinnel szemben teljesen rezisztens, és 500 pmol/l L-lizin jelenlétében is csak 14 s-os gátlás mérhető. Ezzel szemben, 100 pmol/l L-lizin az NT-SR1 jelű növény DHDP szintáz aktivitását 87%ban gátolja és 500 pmol/l L-lizin jelenlétében aktivitás nem mutatható ki.

3. Southern/Northern hibridizációs analízis

A transzformált növény és a 101 jelű növény leveleiből genom DNS-t izolálunk Shure és munkatársai módszerével [Cell, 35, 225-233, (1983)]. Minden növényből 10 pg DNS-t egymástól elkülönítve BamHI és BstEII enzimmel emésztünk, és 0,7 tömeg%-os agarózon elektroforizáljuk. A BamHI enzimmel végzett emésztés egy 1540 bp belső fragmenst, míg a BstEII enzimmel végzett emésztés a dap A kódoló szekvenciát vágja ki. A gélt egy nylon membránon felitatjuk és hibridizáljuk [Southern: J. Mól. Bioi. 98, 503-517 (1975)], amelynek során mintaként a pDAP4307 plazmid 1540 bp BamHI fragmensét alkalmazzuk, amely 32P jelölést hordoz. A folt autoradiográfiás vizsgálata jellemző 1540 bp sávot mutat a BamHI enzimmel emésztett fragmensben és két sávot ad a BstEII enzimmel emésztett fragmensben. Ezek az eredmények a másolatok számára vonatkozó rekonstrukciós markerrel együtt arra utalnak, hogy a dap A gén egyetlen másolatban beépült a transzformált növénybe. A 101 jelű növény DNS-ét tartalmazó mintákban hibridizálás nem volt lehetséges.

A Northern foltanalízist elvégezve kimutatható, hogy a dap A gén aktívan átírható. A transzformált növény leveleiből izolált teljes RNS és oligo-dT segítségével szelektált poliA RNS mintáin végzett fenti hibridizálás egyfajta RNS jelenlétét igazolja, amelynek mérete

HU 214 630 Β mintegy 1100 nukleotid. A 101 jelű növényből származó RNS esetében hibridizálás nem figyelhető meg.

4. Szabad lizinszint meghatározása a levelekben

A 327 és 101 jelű növények leveleiből triklór-ecetsavas (TCA) extraktumot állítunk elő a szabad aminosavszint meghatározásához. 1-2 g fiatal levelet jéggel hűtött mozsárba helyezünk, folyékony nitrogént teszünk rá és porrá dörzsöljük. A porított leveleket egy éjszakán keresztül liofilizáljuk, és tömegállandóságig szárítjuk. A liofilizált mintákat visszahelyezzük a hűtött mozsárba, és 2 ml 10 tömeg%-os TCA jelenlétében ismét őröljük. A mozsarat további 2 ml TCA-val átöblítjük. A TCA extraktumokat egyesítjük, és jégen 30 percen keresztül időnként megkeverve inkubáljuk. Az extrakciós elegyet 4 °C hőmérsékleten 20 percen keresztül centrifugáljuk, és a felülúszót jéggel lehűtjük. A pelletet 2 ml 10 tömeg%-os TCA-val a fent leírt módon ismét extraháljuk, majd a felülúszókat egyesítjük. 2 ml egyesített extraktumot 3x5 ml éterrel extrahálunk. Az éteres extraktumot -70 °C hőmérsékleten tároljuk.

A szabad aminosavszintet reverz fázisú HPLC segítségével az o-ftáldialdehid származékképzés módszerével [Jones és munkatársai: J. Chromatog. 266, 471-482 (1983)] határozzuk meg. Az NT-SR1 jelű növény leveleiből készített három mintában átlag 75 pg szabad lizint mutatunk ki 1 g liofílizált szövetre vonatkoztatva. A 327 jelű növény leveleiből készített két minta szerint a szabad lizin mennyisége 15450 pg és 14630 pg 1 g liofílizált szövetre vonatkoztatva, ami mintegy kétszázszoros szabad lizinmennyiségnek felel meg.

5. A dap A gén öröklődése

327 jelű dohánynövényt virágzásig termesztünk, majd hagyjuk keresztbe beporozni, és magokat állítunk elő. Az érett, száraz magokat összegyűjtjük, felületén 10 tömeg%-os mészoldattal sterilizáljuk, és steril vízzel jól leöblítjük. A magokat csíráztató lemezre (1/4 MS só, 2,5 g/1 Gelrite) helyezzük, amely 0, 1, 10, 30,

100 és 300 pmol/l AEC-t tartalmaz (50 mag lemezenként és két lemez vizsgálatonként). Az önbeporzott

101 jelű növény magjait kontrollként azonos módon kezeljük. A magokat 3-4 napon keresztül csíráztatjuk. 10 nap elteltével minden lemezen megszámoljuk a zöldhajtások számát. Két hét elteltével a hajtásokat óvatosan eltávolítjuk a Gelrite közegről és meghatározzuk a gyökér hosszát. A mérési eredményeket a 2. táblázat tartalmazza, amelyből világosan látható, hogy az AEC toleranciát a 327 jelű növény utódai öröklik.

Claims (17)

1. Eljárás szabad lizintartalom növelésére növényi sejtekben, azzal jellemezve, hogy egy növényi szövetminta sejtjeibe egy, a növényi sejtben működőképes 5’ és 3’ szabályzó szakaszokkal rendelkező, idegen DNS-t viszünk be, ahol az idegen DNS egy első, az endogén úton termelt szabad L-lizin visszacsatolásos gátlásával szemben rezisztens dihidro-dipikolinsav-szintázt kódoló DNS szekvenciát és egy második, kloroplaszt tranzit peptidet kódoló DNS szekvenciát tartalmaz.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dihidro-dipikolinsav-szintázt kódoló DNS szekvenciaként bakteriális gént alkalmazunk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kloroplaszt tranzit peptidet kódoló DNS szekvenciaként növény sejtmagjából izolált és egy aminoterminális kloroplaszt tranzit peptidet tartalmazó preproteint kódoló génből előállított kloroplaszt tranzit peptidet kódoló DNS szekvenciát alkalmazunk.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az idegen DNS-t tartalmazó plazmidot viszünk be a sejtbe.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmidként bakteriális klónozóvektort alkalmazunk.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy bakteriális klónozóvektorként E. coli klónozóvektort alkalmazunk.

7. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a plazmidot Agrobacterium által közvetített transzformálással visszük be a növényi sejtbe.

8. Eljárás transzformált növényi sejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy növényi szövetminta sejtjeibe egy, a növényi sejtben működőképes 5’ és 3’ szabályzó szakaszokkal rendelkező, idegen DNS-t viszünk be, ahol az idegen DNS egy első, az endogén úton termelt szabad L-lizin visszacsatolásos gátlásával szemben rezisztens dihidro-dipikolinsav-szintázt kódoló DNS szekvenciát és egy második, kloroplaszt tranzit peptidet kódoló DNS szekvenciát tartalmaz.

9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dihidro-dipikolinsav-szintázt kódoló DNS szekvenciaként bakteriális gént alkalmazunk.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy bakteriális génként E. coli dap A gént alkalmazunk.

11. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kloroplaszt tranzit peptidet kódoló DNS szekvenciaként egy borsó kloroplaszt tranzit peptidet kódoló gént alkalmazunk.

HU 214 630 Β

12. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy bakteriális génként E. coli dap A gént alkalmazunk.

13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szabad L-lizin mennyiségét legalább 50-szeresére növeljük az azonos fajtához tartozó transzformálatlan növény szintjéhez képest.

14. Eljárás kifejező kazetta előállítására, azzal jellemezve, hogy egyesítünk

a) egy első, az endogén úton termelt szabad L-lizin visszacsatolásos gátlásával szemben rezisztens dihidro-dipikolinsav-szintázt kódoló DNS szekvenciát,

b) egy második, aminoterminális kloroplaszt tranzit peptidet kódoló DNS szekvenciát,

c) egy, növényi sejtben szelektálható funkciót kódoló DNS szekvenciát, és

d) legalább egy T-DNS szegélyt, ahol a dihidro-dipikolinsav-szintázt kódoló DNS szekvencia korrekt leolvasó kereten belül 5’-terminális végén a második DNS szekvenciához csatlakozik, és ahol a DNS szekvenciák növényi sejtben funkcióképes sza5 bályozó szakaszok transzkripciós és transzlációs szabályozása alá esnek.

15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dihidro-dipikolinsav-szintázt kódoló DNS szekvenciaként bakteriális gént alkalmazunk.

10

16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy bakteriális génként E. coli dap A gént alkalmazunk.

17. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kifejező kazettát E. coli-ban és/vagy

15 A. tumefaciensben replikációra képes plazmidba építjük be.