RO111473B1

RO111473B1 - Metoda de inducere a supraproducerii de lizina in plante

Info

Publication number: RO111473B1
Application number: RO146495A
Authority: RO
Inventors: F Glassman Kimberly; J Barnes Linda; P Pilacinski William
Original assignee: Molecular Genetics Res & Dev
Priority date: 1988-06-09
Filing date: 1989-03-29
Publication date: 1996-10-31
Also published as: HUT56137A; HU214630B; EP0429458A4; CN1038465A; CA1338349C; AR243236A1; EP0429458B1; US5258300A; WO1989011789A1; CN1045995C; AU3540289A; DE68912783T2; JPH03504798A; EP0429458A1; DE68912783D1; JP3083531B2

Description

Recentele descoperiri în tehnologia transferului de gene au creat noi posibilități pentru introducerea unor caracteristici dorite în plante. 0 serie de astfel de gene au fost introduse, în scopul de a conferi plantei gazdă unele măsuri de protecție împotriva solicitărilor mediului înconjurător. Printre exemple, sunt incluse genele care conferă toleranță la erbicidele chimice, cum sunt glifozatul (Comai, Nature, 317, 741+744, 11985 și Shah, Science, 233, 478+481, 1986], fosfinotricina (De Block, EMBO, 6, 2513 + 2518, 1987], bromoxinilul (Stalker, 1987, Internațional Patent Application nr. PCT/US87/00044) și sulfonilureele (Haughn, Mol. Gen. Genet., 211, 266+271, 1988). Plantele transgenice au fost, de asemenea, supuse ingineriei genetice, pentru a rezista anumitor peste de insecte (Adang, 1985, cerere de brevet european publicată cu nr. 142924 și Vaeck, Nature, 328, 33+ 37, 1987), bolilor fungice (Taylor, Mol. Gen. Genet., 210, 572+577, 1987) și bolilor virotice (Abel, Science, 232, 738+743, 1986 și Nelson, Bio/

Technol. 6, 403+405, 1988) □ altă zonă de interes este crearea de plante, în special, plante de cultură, cu trăsături valoroase adăugate. Un exemplu de astfel de trăsături este calitatea îmbunătățită de nutriție la recoltele pentru alimentație. Lizina, un aminoacid esențial în dieta umană și a animalelor monogastrice, este printre cei trei agenți nutritivi cei mai limitatori în majoritatea recoltelor de cereale. în consecință, regimurile alimentare bazate pe grăunțe, cum sunt cele bazate pe grâu, orz, porumb, orez, mei, sorg și altele, trebuie să fie suplimentate cu lizină sintetică mai scumpă sau cu hrană proteinică cu semințe de oleaginoase ce conțin lizină. Prin creșterea conținutului de lizină al acestor grăunțe sau a oricăror cereale componente în hrană se realizează o valoare suplimentară semnificativă a acesteia. Până astăzi, încercările de a mări cantitățile de lizină din plante s-au bazat pe metodele convenționale de înmulțire și, mai recent, pe tehnologia de mutageneză și de cultură de celule.

Mutantele din porumb existente în natură care au multă lizină (Mertz, Science, 145, 279, 1964 și Nelson, Science, 150, 1469+1470, 1975), din orz (Munck, Science, 168, 985+987, 1970) și grăunțele de sorg (Singh și alții, Crop Sci., 13, 535+539, 1973) au fost identificate. In fiecare caz, conținutul mărit în lizină nu rezultă din producerea crescută de lizină liberă, ci din modificările în profilul general proteinic al grăunțelor: nivelele reduse ale proteinelor endosperme deficiente în lizină (prolaminele) sunt compensate de nivelele ridicate ale proteinelor mai bogate în lizină (albuminele, globulinele și glutelinele). Fiind superioare din punct de vedere nutritiv, aceste mutante se asociază cu recoltele slabe și cu grăunțele de calitate slabă, limitând utilitatea lor agronomică.

□ altă încercare utilizată pentru a îmbunătăți calitatea nutritivă a fost selecția in vitro de variante biochimice care să aibă rezerve mari de lizină liberă. Lizina este un membru al familiei aspartat a aminoacizilor din plantele mai înalte și microorganisme (vezi fig.1). Din acest motiv, reglementarea biosintezei ei este corelată intim cu aceea a altor membri ai familiei: treonina, metionina și izoleucina. Reglementarea flxuului metabolic reiese că se face, în principal, prin inhibarea reacției inverse a produsului final în etapele enzimatice cheie. Prima dintre aceste etape, fosforilarea aspartatului catalizată de aspartatchinază (AK) este comună tuturor celor patru produse finale. Al doilea loc de reglementare este la reacția din punctul de ramificație: condensarea piruvatului cu aspartilsemialdehida pentru a forma acidul dihidrodipicolinic. Această reacție este prima reacție unică în biosinteza lizinei și este catalizată de sintaza acidului dihidrodipicolinic (DHDPS), o enzimă ce s-a dovedit a fi puternic inhibată ca reacție inversă de către lizină în plante unde a fost examinată (Wallsgrove și alții, Phytochem., 20, 2651+2655, 1981 și Kumpaisal, Plant Physiol., 85, 145+151, 1987)

Există evidențe care sugerează existența a mai mult de o formă a AK (Miflin,

1980, in The Biochemistry of Plants, voi. 5, Aminoacizi și derivații lor, Stumpf și

Conn, pag.420+426, Academic Press).

t

RO 111473 Bl formă este sensibilă la inhibare de către treonină, cealaltă la inhibare de către lizină. Creșterea culturilor de celule de plante este inhibată în prezența unor cantități echimolare de lizină plus treonină. Această inhibare poate fi inversată prin adăugare de metionină sau homoserină (care se poate transforma ușor în metionină] (Gree și alții, Crop Sci. 14, 827+830, 1974] Hibberd (Planta, 148, 183+187, 1980] a selecționat liniile stabile de calus de porumb care erau rezistente la această inhibare a creșterii. Aceste linii au supraprodus treonină (de 6+9 ori] și în cantitate mai mică metionină, lizină și izoleucină (de 2+4 ori). A reieșit clar că o aspartatchinază (AK) tolerantă la lizină este cea care determină schimbările observate. La liniile care s-au regenerat în întregime în plantele fertile, supraproducția a fost o caracteristică stabilă, ereditară. (Hibberd și alții, PNAS, 79, 559+563, 1982). Selecții asemănătoare s-au efectuat pe tutun (Bourgin, 1982, Variabilități În plante regenerate din culturi de țesuturi, Earle și Demarly pag.163+174, Praeger, New York), pe orz (Arruda, Plant Physiol., 76, 442+446, 1984) și pe morcov (Cattoir-Reynaerts, Bichem. Physiol. Pfazen, 178, 81+90, 1983).

Analogii lizinei, în special S[2-aminoetil)-cisteina (AEC) au fost întrebuințați de asemenea fie singuri, fie împreună cu lizină plus treonină în selecții în încercarea de a izola mutante supraproducătoare de lizină. Sano și alții (j. Gen. Appl. Micro biol. 16, 373+391, 1970) au reușit să izoleze mutante bacteriene cu multă lizină, folosind selecția AEC și s-a sugerat că AEC acționează ca un fals inhibitor al reacției inverse a AK sau a DHDPS sau ambelor, încercările de a izola mutante asemănătoare din plante au avut rezultate combinate. Widholm (Can. J. Bot., 54, 1523+1529, 1976) a mutagenizat celule de tutun în suspensie și a selectat linii celulare rezistente la AEC care au supraprodus lizină de zece ori. Sau izolat mutante din boabele de mei care au supraprodus lizină de 5+7 ori (Boyes și alții. Plant Sci., 50, 195+203, 1987). Bright (Planta, 146, 629+633, 1979) a selectat linii din orz rezistente la AEC care nu au acumulat lizină în absența AEC și s-au dovedit a fi mutante care preiau AEC. S-a evidențiat de asemenea faptul că AEC își exercită efectele sale inhibitoare mai degrabă prin încorporarea sa în proteine decât prin interferența cu biosinteza lizinei. Schaeffer și alții (Plant Physiol., 84, 509+515, 1987) a aplicat pe rând selecțiile cu AEC și lizină plus treonină pentru a obține mutante de orez care au avut cu 14% mai multă lizină în proteinele depozitate în semințe, dar nu au avut mai multă lizină liberă. O cultură de cartofi rezistentă la AEC a selectat Jacobsen (J. Plant. Physiol., 123, 307+315, 1986) Această mutantă a avut cantitățile totale de aminoacizi mai mari decât cultura martor, ceea ce nu s-a datorat supraproducției de lizină, treonină sau metionină. Negrutiu (Theor. Appl. Genet., 68, 11+20, 1984] a supus protoplastele din tutun la mutageneză urmată de selecție AEC. S-au obținut două linii de celule rezistente care au supraprodus lizină de 10+30 ori. Analiza biochimică și genetică a arătat că este o sintază DHDP insensibilă la reacția inversă. Trăsătura a fost moșternită sub forma unei gene dominante singure.

Până acum, tehnologiile cu ADN recombinat și transfer de gene nu s-au aplicat în domensiul producerii sporite de metaboliți pentru a adăuga în valoare plantelor. însă, este cunoscut faptul că bacteria Escherichia coli sintetizează lizină pe o cale practic identică cu cea a plantelor mai înalte. Sintaza acidului dihidrodipicolinic este codificată de către gena dap A a E.coli și, fiind sensibilă la lizină (Yugari și alții, Biochim. Biophys. Acta, 62, 612+614, 1962) este de cel puțin 200 ori mai puțin sensibilă la inhibare de către lizină in vitro când se compară cu aceeași enzimă izolată din plante. în plus, celulele de E.coli care conțin gena dap A pe o plasmida multicopie acumulează cantități mari de lizină liberă (Dauce Le Re ve rând, Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 15, 22+231, 1982), sugerând astfel că DHDPS catalizează o etapă cu limitare de viteză. Gena a fost segmentată și caracterizată (Richaud, J.

Bacteriol., 166, 297+300, 1986 și

RO 111473 Bl

Glassman, 1988, M.S. Thesis, Universitatea din Minnesota, Minneapolis, MN], Ținând cont de relativa incapacitate a tehnologiei cunoscute de înmulțiere și cultură de celule de a obține ușor plante care să acimuleze cantități de lizină cu mult mai mari decât cele obișnuite, apare necesitatea de a aplica tehnologia cu ADN recombinat și transfer de gene pentru a produce astfel de plante.

Prezenta invenție se referă la o metodă de creștere substanțială a cantității de L-lizină liberă în plante care constă în aceea că: (a) se introduce o genă străină în celulele unei surse de țesuturi de plantă și (b) se exprimă gena străină în aceste celule, gena străină conținând o secvență ADN care codifică sintaza acidului dihidrodipicolinic (DHDPS) care este în totalitate rezistentă la inhibarea reacției inverse de către L-lizina liberă produse endogen. în practica acestei metode, gena străină conține o a doua secvență ADN care este atașată la terminația 5' a secvenței ADN DHDPS și care codifică o peptidă cloroplast de tranzit (PTC) PTC localizează DHDPS în cloroplastele din aceste celule, unde acesta poate acționa pentru mărirea biosintezei Llizinei libere. De aceea, metoda, conform prezentei invenții, realizează și celule de plante care au fost transformate prin introducerea unei gene străine care exprimă o formă de DHDPS ce este total rezistentă la inhibarea reacției inverse de către lizina endogenă. întrucât se cunosc tehnicile prin care celulele dintr-o mare varietate de surse de țesuturi de plante pot fi regenerate până la plantele întregi, metoda conform invenției prevede de asemenea o plantă transformată care produce L-lizină liberă pe o cale biosintetică folosind DHDPS, în care DHDPS este produsul unei gene străine (exogen] și este în totalitate rezistent la inhibarea reacției inverse de către lizina produs pe cale endogenă. Plantele preferate care sunt transformate prin metoda, conform invenției, cuprind speciile graminacee, cum sunt cele enumerate mai sus. Părțile comestibile ale acestor plante transformate pot avea cantități de L-lizină liberă care sunt de cel puțin 50 de ori mai mari decât cantitățile de lizină din planta netrans6 formată din aceeași specie.

Gena străină întrebuințată pentru a transforma celulele de plante este de preferință o casetă de genă de expresie ireală care conține o genă ce codifică DHDPS sau un fragment care funcționează enzimatic al acesteia, ce este practic rezistent la inhibarea reacției inverse. Caseta de expresie mai conține o a doua secvență ADN care codifică o secvență de tranzit de cloroplaste cu terminație amino (CTS). Gena sau fragmentul de genă DHDPS se leagă în cadrul corect de citire la terminația 5' a genei CTS. Gena străină este de preferință sub control transcripțional și de translație a zonelor regulatorii care sunt funcționale în celulele de plantă ce constituie obiectul transformării. Aceste zone se pot obține din secvențele de ADN care se transferă celulelor plantei de către plasmidele Ti sau Ri ale A tumefaciens, de exemplu, segmentele de ADN T. De exemplu, o regiune de inițiere a transcripției utilă se poate izola dintr-o genă de plasmidă Ti sau Ri care codifică sintaza octopinei, sintaza nopalinei sau sintaza manopinei. Caseta de expresie de preferință mai conține o genă care codifică o funcție ce este selectabilă din celulele plantei, cum ar fi rezistența la medicamente sau erbicide, astfel încât celulele transformate și plantele care derivă din acestea să poată fi identificate ușor.

Un alt aspect al prezentei invenții îl constituie un vector de expresie cum este o plasmidă, care încroporează caseta de expresie prezentă, în care numita plasmidă este capabilă de replicare într-o bacterie cum ar fi E. coli sau Agrobacterium. Gena străină se poate introduce în genomul celulelor plantei ca ADN gol prin metode cum sunt electroporația, microinjecția, injecția cu microproiectile sau prin încapsulare lipozomică. De asemenea, o plasmidă care încorporează gena străină se poate introduce în genomul celulelor plantei prin transformarea mediată de A. tumefaciens.

Așa cum este folosit în această descriere cu referire la genă sau fragment de genă, termenul străină înseamnă că gena sau fragmentul de genă se obține din una sau mai multe surse, altele decât

RO 111473 Bl genomul speciilor de plantă în care aceasta este exprimată în final. Sursa poate fi naturală, de exemplu, gena se poate obține dintr-o altă sursă de materie vie, cum este o bacterie, drojdie, fungi și altele asemenea sau o specie diferită de plantă. □ sursă preferată de genă care codifică DHDPS funcțional este gena £ coli dap A. Sursa poate fi de asemenea sintetică, de exemplu gena sau fragmentul de genă se poate prepara in vitro prin sintaza chimică.

Așa cum este utilizat în prezenta descriere cu referire la gena sau fragmentul de genă străină care a fost introdus în celulele plantei, termenul exprimă înseamnă că gena este încorporată stabil într-un genom al celulelor, de exemplu, o enzimă cum este DHDPS se produce în forma funcțională în celule. De exemplu, o formă funcțională de DHDPS catalizează o etapă din cadrul biosintezei endogenice a lizinei.

Termenul practic rezistentă așa cum este folosit în prezenta descriere cu referire la inhibarea reacției inverse a DHDPS de către lizină endogenă, înseamnă că DHDPS rămâne funcțional în prezența lizinei endogene în așa măsură încât planta acumulează lizină practic în exces față de cea acumulată de planta din aceeași specie care nu sintetizează DHDPS care astfel este rezistentă. De exemplu, noile plante rezultate prin metoda, conform prezentei invenții, conțin cantități de lizină ce se pot extrage de cel puțin zece ori, de preferință de cel puțin aprox. 50 ori, de exemplu, de cca 50=250 ori mai mari decât plantele din aceeași specie care conțin numai DHDPS nativ. în plus, lizină liberă nu este prezentă în cantități care să fie toxice pentru acele specii de plante care au fost modificate. De asemenea, celulele de plante sau plantele care sunt denumite transformate au gena sau fragmentul de genă străină încorporate stabil, funcțional și moștenibil în genomul lor.

Se prezintă, în continuare, descrierea desenelor din prezenta invenție:

fig.1 este prezentarea schematică a căii de biosinteză a lizinei în care următoa8 rele litere indică următoarele enzime: a aspartatchinază; b - aspartilsemialdehiddehidrogenază; c - sintaza acidului dihidrodipicolinic; d - reductaza acidului dihidrodipicolinic; e - sintaza succiniloxoaminopimelatului; f transferaza amino a succinildiaminopimelatului; g - desuccinilaza succinildiaminopimelatului; h - diaminopimelat și i - decarboxiiaza mezo-dimaniopimelatului. Fig.2 prezintă schematic manipularea genei dap A așa cum este descris în exemplul 1.

Prezenta invenție se referă la o nouă metodă de obținere de plante, cum sunt gramineele, care produce cantități mărite de lizină liberă. Supraproducerea acesteia rezultă din introducerea și expresia unei gene bacteriene introduse care codifică sintaza acidului dihidrodipicolinic (DHDP), enzima de la punctul de ramificație din biosinteză lizinei atât în plante cât și în bacterii. Sintaza DHDP nativă din plante este foarte sensibilă la inhibarea reacției inverse de către Llizină și constituie un punct cheie de reglare a sintezei. Prin contrast, sintaza DHDP izolată din Escherichia coli este activă în prezența a cel puțin de 200 ori cantități mai mari de L-lizină.

în scopul introducerii unei gene care să codifice o sintaza DHDP tolerantă de lizină pentru a se realiza acumularea de cantități mai mari de lizină liberă într-o plantă, trebuie să aibă loc un lung și complex șir de evenimente. în primul rând, gena sintazei DHDP bacteriene trebuie să fie modificată in vitro pentru a include semnale de reglare necesare pentru exprimarea genei în celulele plantelor. întrucât s-a relatat că sinteza biologică a lizinei în plante este sechestrată în cloroplaste, gena bacteriană este, de preferință modificată pentru a adăuga secvențe care codifică o secvență peptidică de transzit de cloroplaste cu terminație amino, pentru a îndepărta produsul genei spre aceste părți organice.

Pentru a modifica biosinteză lizinei, gena trebuie să fie introdusă în celulele plantei și aceste celule transformate

RO 111473 Bl trebuiesc identificate. Gena trebuie, de asemenea, să fie încorporată stabil în genomul celulei plantei. Semnalele transcripționale ale genei trebuie să fie recunoscute de celulele plantei și să fie funcționale. Aceasta înseamnă că gena trebuie să fie transcrisă în mesagerul ARN și mARIM trebuie să fie stabil în nucleul plantei și să fie transportat intact în citoplasmă pentru translatare. Gena trebuie să aibă semnale de translație corespunzătoare pentru a fi recunoscute și translatate adecvat de ribozomii celulei plantei. Produsul polipeptidic al genei trebuie să scape de atacul proteolitic din citoplasmă și să fie capabil să facă o conformație tridimensională care să confere activitate enzimatică. Sintaza bacteriană DHDP mai trebuie și să fie capabilă să funcționeze în biosinteza lizinei; aceasta înseamnă că trebuie să fie localizată lângă enzimele native ale plantei, catalizând etapele de flancare în biosinteza (probabil în cloroplaste) pentru a obține substratele necesare (aspartilsemialdehida și piruvatul) și a le trece în produsul corespunzător (acidul dihidropicolinic).

Chiar dacă se îndeplinesc toate aceste condiții, supraproducerea cu succes a lizinei nu este u neveniment previzibil. Nu trebuie să fie un alt mecanism de control care să compenseze reglarea scăzută în etapa sintazei DHDP. Aceasta înseamnă nu numai nici o altă inhibare a biosintezei, dar și nici un alt mecanism care să morească viteza de distrugere a lizinei acumulate, în plus, lizina trebuie să fie supraprodusă în cantități care nu sunt toxice pentru plante. în final, trăsătura caracteristică introdusă trebuie să fie stabilă și moștenibilă pentru a permite dezvoltarea și utilizarea comercială.

Modificarea unei gene bacteriene pentru exprimarea și funcționarea în celulele plantelor. 0 genă care codifică sintaza acidului dihidrodipicolinic (DHDPS) se poate obține din orice microorganism care sintetizează lizina pe calea diaminopimelatului. Un criteriu cheie în alegerea genei este inten10 sitivitatea relativă a produsului genei (DHDPS) la inhibarea lizinei. O astfel de genă, care este o materie primă preferată pentru utilizarea în metoda conform invenției, este gena E. coli dap A, care codifică o specie funcțională 32 kD a DHDPS, ce este foarte rezistentă la inhibarea de către lizină a reacției inverse. Gena poate fi izolată din microorganism prin metodologiile bine cunoscute în domeniu. Aceste metodologii cuprind ecranarea unui grup genomic pentru complementarea unei mutante cunoscute de DHDPS; selectarea imunologică a polipeptidelor exprimate din grupul de gene; selectarea unui grup genomic pentru hibridizare pe o probă de oligonucleotidă marcată radioactiv și altele.

Proba de oligonucleotidă poate fi sintetizată pe bază de secvență derivată din genele altor specii saudin translatarea inversă a secvenței de polipeptidă a unei subunități izolate de DHDPS. în alt mod, gena poate fi sintetizată chimic în întregime sau în parte.

După izolare, gena este caracterizată folosind manipulările ADIM-ului recombinat standard și analizele moleculare. Aceste tehnici sunt bine cunoscute celor care lucrează în acest domeniu și sunt subliniate de Maniatis si alții, Clonarea moleculară: un manual de laborator, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982. Practic, fragmentul de ADN care poartă gena DHDPS se reduce la fragmentul funcțional cel mai mic posibil; aceasta înseamnă că ADN neesențial care flanchează gena se îndepărtează prin metode cum sunt digestia Ba131, scoaterea unui fragment cunoscut de restricție a ehdonucleazei și altele, pentru a obține fragmentul cel mai mic de ADN care, de exemplu, încă va fi complementul mutantei DHDPS. Acest fragment este, de obicei, mai mic de trei kilobaze, mai adesea de aproximativ o kilobază. Secvența de nucleotidă a acestui fragment ADN poate fi apoi determinată prin oricare din cele câteva metode convenționale. Cadrul de citire des

Ϊ

RO 111473 Bl chis [secvența ce codifică), locul prezumtiv de legare a polimerazei ARN [promotor), locul de legare ribozomal și secvența semnal de transcripție a terminației sunt apoi identificate. Locul de inițiere a transcripției se poate determina prin tehnici ca înregistrarea S7-nucleazei sau analiza refacerii primare. Extractele de bacterii (de obicei E. coli) care conțin gena izolată pe o plasmidă sunt analizate pentru a confirma prezența activității DHDPS și rezistența in vitro a activității enzimatice față de L-lizina adăugată. Odată caracterizată, gena este modificată pentru a permite integrarea, expresia și funcția produsului genei în celulele plantei gazdă. Modificările preferate sunt: 1) adăugarea unei secvențe de ADN care codifică o peptidă de tranzit cloroplastică cu terminație amino la punctul terminus 5' ale secvenței ce codifică DHDPS; 2) înlocuirea secvențelor regulatoare bacteriene 5' și 3' cu secvențe regulatoare 5' și 3' recunoscute și funcționale în celulele de plante și 3) inserarea acestei casete de expresie specifică plantei întrun vector corespunzător pentru introducerea genei DHDPS în celulele plantei gazdă și stabilirea sa stabilă în acestea.

Adăugarea secvenței ADN peptidă de tranzit cloroplastă (CTP). Toate enzimele biosintetice ale lizinei studiate în plante până astăzi au fost localizate în cloroplaste. Astfel, pentru a efectua localizarea adecvată a produsului genei străine, se atașează un fragment de ADN care codifică o secvență de peptidă de tranzit cloroplastă la terminația 5' a secvenței ADN care codifică DHDPS, în cadrul de citire corespunzător, mod prin care o peptidă de tranzit completă preproteină DHDPS va fi translatată din transcriptorii fuziunii genei. Peptidele de tranzit utile (de obicei cu 40 până la 70 aminoacizi în lungime), funcționează după translație pentru a dirija preproteină spre cloroplastă, proteina fiind introdusă într-un proces dependent de energie. Peptidă de tranzit este desprinsă fie în timpul, fie imediat după introducere pentru a rezulta polipeptida matură.

Fragmentul ADN care codifică această peptidă de tranzit se poate obține dintr-o serie de gene nucleare de plante, atâta timp cât produsele numitei gene sunt exprimate ca preproteine ce cuprind o peptidă de tranzit cu terminație amino și transportate în cloroplaste. Exemple de produse de gene de plante cunoscute care includ astfel de secvențe de peptide de tranzit sunt micile subunități de ribuloză-bisfosfatcarboxilază, feredoxina, proteina care leagă clorofila a/b, proteinele ribozomale cloroplaste codificate de gene nucleare, anumite proteine de șoc termic, enzimele biosintetice de aminoacizi cum este sintaza acidului acetohidroxi și sintaza 3enolpiruvilfosfoșichimatului și altele. Un alt mod este ca fragmentul ADN care codifică peptidă de tranzit să fie sintetizat chimic în întregime sau în parte din secvențele cunoscute ale peptidelor de tranzit, cum sunt cele enumerate mai sus.

Indiferent de sursa fragmentului ADN care codifică peptidă tranzit, trebuie să se includă un codon de inițiere a translației și să se codifice o secvență de aminoacid care este recuoscută și va funcționa corespunzător în cloroplastele plantei gazdă. Trebuie să se acorde atenție și secvenței de aminoacid la legarea dintre peptidă de tranzit și subunitatea matură DHDPS unde preproteină este desprinsă pentru a produce DHDPS matură. Unele secvențe conservate de aminoacizi au fost identificate și pot servi ca linie ghid. Legarea precisă a secvenței care codifică peptidă de tranzit cu secvența care codifică DHDPS poate necesita manipularea uneia sau ambelor secvențe ADN pentru a introduce, de exemplu, un loc de restricție convenabil. Acesta poate fi realizat prin metode ca mutageneza dirijată spre un loc, inserția unei legături oligonucleotidice sintetizată chimic și altele.

Funcția peptidei de tranzit din cloroplaste poate fi analizată in vitro după cum urmează. Caseta de expresie peptidă de tranzit - genă DHDPS poate

RO 111473 Bl fi introdusă în oricare dintr-o serie de vectori plasmidă, astfel încât gena este plasată în orientarea corespunzătoare sub controlul transcripțional al unui promotor bacteriofag cum este SP6, T3, T7 și alții. Plasmida rezultantă este apoi digerată într-un loc unic de restricție 3' pe secvența de codificare pentru a forma o moleculă liniară ADN. Această moleculă ADIM este apoi supusă unei reacții de transcripție cu îndepărtare folosind o polimerază ARN specifică pentru promotorul întrebuințat. Randamentele unor astfel de reacții sunt tipic de 10-=-12 micrograme de mesager ARN (mARN) complet pur per microgram de model ADN liniar. Acești transcriptori mARN sunt apoi translatați în prezența a unul sau mai mulți aminoacizi marcați radioactiv, folosind sistemele de translație in vitro cum sunt germenii de grâu sau lizatul reticulocitelor de șobolan, pentru a obține preproteina marcată radiocativ. Această preproteină marcată se incubează apoi cu cloroplaste intacte izolate în prezența luminii pentru determinarea eficienței aduse. Cloroplastele sunt apoi tratate cu o protează sau cu combinații de proteaze cum sunt termolizina, tripsina, chimotripsina și altele. Acest tratament degradează orice proteină nesechestrată în cloroplaste. După spălarea în prezența unor inhibitori de protează, cloroplastele sunt lizate folosind tratamentul cu agitare, înghețare/desghețare, presiune osmotică redusă sau o combinație a acestora. Lizatul poate fi: (a) direct analizat, (b) poate fi supus mai întâi imunoprecipitării, folosind antiserul antibacterian de subunitateDHDPS creat prin metodele standard, (c) poate fi centrifugat pentru a separa proteinele stromale (supematantul) de proteinele localizate în membranele tilacoide (peleți), (d) sau supuse unei combinații a acestor procedee. Se întrebuințează analiza gelului SDS-poliacrilamidă pentru a confirma prezența sau absența unei benzi de proteină marcate radioactiv corespunzător greutății moleculare a subunității DHDPS mature bacteriene. Prezența benzii arată că preproteina a fost introdusă și prelucrată în locul corect.

Adăugarea secvențelor regulatoare recunoscute de plantă. Expresia genei bacteriene cum este DHDPS în celulele plantei necesită secvențe regulatoare care sunt recunoscute de celulele plantei și sunt funcționale în acestea. Aceste secvențe cuprind o regiune de inițiere a transcripției 5' și regiuni 3' de translație și terminarea transcripției. Regiunea de inițiere transcripțională 5' va cuprinde locul de legare a polimerazei ARN (promotor). Ea va cuprinde, de asemenea, regiunile necesare pentru reglarea transcripției acolo unde regularizarea este mediată de inducția chimică sau fizică sau de represie.

Exemple de astfel de regularizări sunt expresia indusă de lumină a subunității mici de ribuloză-bisfosfat-carboxilază, expresia indusă de căldură a proteinelor de șoc termic, genele reglate de hormonii din plante sau alți metaboliți, expresia reglată prin dezvoltare, expresia indusă de rănire sau tensionare și altele. Secvențele 5' mai pot să cuprindă secvențe demărire a transcripției. Regiunile 5' pot fi naturale ale plantei gazdă, sau pot fi derivate de la alte plante unde secvențele sunt funcționale în planta gazdă. Secvențe corespunzătoare se pot obține de asemenea din genele de plasmidă Ti ale Agrobacterium tumefaciens, incluzând sintaza octopinei, sintaza nopalinei, sintaza manopinei și altele, sau se pot obține din anumite gene virale. în alt mod, regiunea de inițiere a transcripției poate fi sintetizată chimic total sau parțial.

Regiunea 3' va cuprinde secvențele de terminație a transcripției și mai poate cuprinde secvențele semnalului de poliadenilare. Această regiune poate fi derivată din aceeași genă ca secvențele 5' sau dintr-o genă diferită. Și aceste secvențe pot fi sintetizate pe cale chimică.

RO 111473 Bl

Caseta de expresie obținută va cuprinde o regiune de inițiere a transcripției 5', o secvență de codificare a peptidei de tranzit din cloroplaste, secvența ce codifică subunitatea bacteriană DHDPS, un codon de oprire a translației și regiunea de terminație a transcripției 3'. Caseta va cuprinde de obicei mai puțin de cinci kilobaze, de preferință va cuprinde între două și trei kilobaze.

Inserția casetei de expresie întrun vector pentru transformarea plantelor. Alegerea unui vector pentru introducerea casetei de expresie bacteriene DHDPS în celulele plantei va depinde de alegerea metodei de transformare care, la rândul său, va depinde de planta gazdă și de alegerea sursei de țesut de plantă. 0 mare varietate de modalități sunt disponibile pentru introducerea unui ADN străin în celulele de monocotiledonate și dicotiledonate, printre care utilizarea microproiectilelor, microinjecțiilor, electroporarea, incubarea cu ADN precipitat cu Ca⁺⁺, incubarea cu lipozomi care conțin ADN străin (de preferință în prezența PVA și Ca⁺⁺), sistemele virale și transformarea mediată de Agrobacterium. Se vor vedea M.Fromm și alții, PNAS USA, 82, 5824 (1985) (electroporarea), T.M. Klein și alții, Nature, 327, 70 (1987) (microproiectile), P. Lurquin și alții, Plant Sci. Lett., 25, 133 (1982) (lipozomii) și J. Paszkowski și alții, EMBO J., 3, 2717 (1984) (utilizarea genei CaMV semnalelor de expresie VI), lucrările cărora sunt incluse în referințele bibliografice ale prezentei descrieri.

Primele cinci metode se efectuează cu ADN gol (pur) unde caseta de expresie poate fi purtată simplu pe orice vector de donare E. coli cum sunt plasmidele pBR322, pRK290, pAYC184 și altele asemenea. în cazul vectorilor virali, este de dorit ca sistemul să rețină funcțiile de replicare, dar să lipsească funcțiile pentru inducerea bolii.

Pentru transformarea mediată de

Agrobacterium, caseta de expresie va fi introdusă într-un vector și flancată de fragmente de plasmidă Agrobacterium Ti sau Ri, reprezentând marginile dreaptă și eventual stângă ale ADN transferat de plasmida Ti sau Ri. (T-ADN). Aceasta ușurează integrarea genei străine în genomul celulei plantei gazdă. Acest vector va mai conține de asemenea secvențe care facilitează replicarea plasmidei în celulele Agrobacterium, precum și în celulele E.coli.

Toate manipulările ADN se efectuează tipic în celulele de E.coli și plasmida finală care poartă caseta de expresie DHDP9 se mișcă în celulele Agrobacterium prin transformarea directă a ADN, conjugare și altele. Aceste celule Agrobacterium vor conține o a doua plasmidă derivată tot de la plasmidele Ti sau Ri. Această a două plasmidă va purta toate genele vir necesare pentru transferul ADN străin în celulele plantei.

Fără a ține seama de alegerea vectorului sau de modalitatea de transformare, identificarea celulelor transformate ale plantei este ușurată prin includerea unei gene care codifică o funcție ce este selectabilă în celulele plantei. Genele preferate sunt acelea care codifică rezistența la inhibitorii normali chimici asupra celulelor plantei, cum este rezistența la higromicină, canamicină, metotrexat și anumite erbicide. Marcherul selectabil poate fi purtat pe o plasmidă separată care este transformată totodată cu plasmida ce poartă DHDPS, sau poate fi purtat pe aceeași plasmidă cu caseta DHDPS. în cazul transformării mediate de Agrobacterium. marcherul selectabil poate fi conținut în regiunea plasmidei flancată de regiunile marginale T-ADN. în locul unui marcher selectabil se poate întrebuința un marcher ecranabil cum este gena βglucuronidază. Celulele transformate cu această genă se pot identifica prin producerea unui produs albastru la tratarea cu 5-brom-4-clor-3-indoil-p-Dglucuronidă (X-Gluc).

ί

RO 111473 Bl

Transformarea și regenerarea plantelor. Alegerea sursei de țesut de plantă pentru transformare va depinde de natura plantei gazdă și de modalitatea de transformare. Ca surse de țesuturi utile sunt călușul, celulele de culturi în suspensie, protoplastele, segmentele de frunze, segmentele de tulpini, panicule terminale, polen, embrioni, hipocotiledonate, segmente de tuberculi, regiuni de meristem și altele. De preferință, sursa de țesut va păstra capacitatea de regenerare a întregului, a plantei fertile în urma transformării.

Transformarea se efectuează în condițiile îndreptate spre țesutul de plantă ales. Celulele sau țesutul de plantă sunt expuse la ADN purtător al casetei de expresie DHDPS pe o perioadă eficientă de timp. Aceasta poate fă varieze de la un puls de mai puțin de o secundă electricitate pentru electroporație, până la 2 sau 3 zile de cocultivare în prezența celulelor de Agrobacterium purtătoare de plasmidă. Agentul tampon și mediul întrebuințat va varia, de asemenea, în funcție de sursa de țesut de lantă și de modul de transformare. Multe modalități de transformare întrebuințează un strat de alimentare din celule de culturi suspendate (de exemplu tutun sau Black Mexican Sweet] pe suprafața unor plăci de mediu solide, separate printr-un disc de hârtie de filtru de celulele de plante sau de țesutul supus transformării.

Când se efectuează tratamentul cu ADN, celulele sau țesutul de plantă pot fi cultivate perioada variabile de timp înainte de selecție sau pot fi expuse imediat unui agent selectiv, cum sunt cei descriși mai sus. Modalitățile care întrebuințează expunerea la Agrobacterium vor cuprinde, de asemenea, un agent de inhibare a creșterii celulelor de Agrobacterium. De obicei, compușii folosiți sunt cefotaxima și carbenicilina. Mediul întrebuințat în selecție poate fi formulat pentur a menține călușul transformat sau suspensia de culturi de celule într-o stare nediferențiată sau pentru a permite producerea de muguri de calus, segmente de frunză sau tulpină, discuri de tuberculi și altele. Se presupune că celulele sau călușul supuse observației pentru că vor crește în prezența unui inhibitor în concentrații normale ale agentului selectiv se vor transforma și pot fi subcultivate încă de câteva ori pe același mediu pentru a îndepărta secțiunile nerezistente. Celulele sau calușii pot fi apoi supuși analizei, verificând prezența casetei cu gena bacteriană DHDPS, sau pot fi supuse modalităților cunoscute de regenerare a plantelor. în modalitățile care întrebuințează producerea directă de muguri, se presupune că acei muguri care apar pe mediul selectiv sunt transformați și pot fi tăiați și puși să prindă rădăcină, fie pe un mediu selectiv corespunzător pentru producerea de rădăcini, fie prin simpla scufundare a mugurilor extirpați într-un compus care induce formarea rădăcinii și plantarea lui directă în vermiculit.

Caracterizarea plantelor regenerate și rodul lor. în scopul de a produce plante transgenice care să conțină cantități mărite de lizină liberă, gena bacteriană trebuie să fie preluată în plantă în celulele sale și integrată stabil în genomul plantei. Se presupune că celulelele și țesutirile plantei selectate pentru rezistența lor la un agent inhibitor și-au însușit gena care codifică această rezistență în timpul tratamentului de transformare. întrucât această genă marcher, de obicei, se leagă de gena sintazei bacteriene DHDP, se poate presupune că gena sintazei bacteriene DHDP a fost însușită asemănător. Analiza hibridizării cu pata din sud (Southern blot) folosind o probă specifică pentru gena sintazei bacterieine DHDP se poate întrebuința după aceea pentru a confirma că gena străină a fost preluată și integrată în genomul celulei plantei. Această tehnică poate să dea, de asemenea, unele indicații asupra numărului de copii de genă care au fost încorporate. Transcripția cu succes a genei străine în mARN poate fi analizată asemănător folosind analiza hibridizării cu pata din nord a întregului ARN celular

RO 111473 Bl și/sau a ARN celular care a fost îmbogățit într-o regiune poliadenilată.

După ce a fost transcris, mARN trebuie să fie translatat de ribozomii plantei într-o polipeptidă, cum este subunitatea sintazei bacteriene DHDP, care la rândul său trebuie să fie capabilă să realizeze o configurație tridimensională care va conferi activitate catalitică. Celulele sau țesuturile plantei au arătat atât faptul că poartă cât și că transcriu gena sintazei bacterieine DHDP și în plus pot fi caracterizate prin extracția de celule sau țesuturi și demonstrarea activității sintazei DHDP tolerante la lizină. Această toleranță la lizină in vitro se compară, de preferință, cu cea observată în extractele de microorganisme care au servit ca sursă a genei și trebuie să fie ușor de distins de activitatea sintazei DHDP native mult mai mult sensibilă la lizină, care poate fi extasă din celulele sau țesuturile plantei martor. în funcție de inițierea transcripțională și de secvențele regulatoare utilizate în construcția casetei, activitatea poate fi detectată în toate țesuturile plantei, în țesuturi selectate sau numai în condiții de inducere selectate.

Neținând cont de localizarea activității sintazei bacteriene DHDP în plantă, ea trebuie să fie localizată în celula plantei astfel încât ca să poată să participe la biosinteza lizinei, catalizând transformarea substratelor în produs. Capacitatea sintazei bacteriene DHDP de a participa astfel poate fi analizată prin determinarea toleranței relative a celulelor plantei sau a țesuturilor ei la analogul lizinei S-(2-aminoetil]-cisteina (AEC] La fel ca lizină, AEC este un inhibitor potențial a sintazei DHDP din plantă. Celulele sau țesuturile plantei expuse la concentrații inhibitoare de AEC sunt practic moarte pentru lizină. Sintaza DHDP din E. coli este însă mult mai puțin sensibilă la această inhibare. Capacitatea celulelor sau țesuturilor plantei ce exprimă sintaza activă bacteriană DHDP, de a tolera concentrațiile inhibitoare normale de AEC a sugerat puternic faptul că enzima bacteriană funcționează bine în biosinteza lizinei.

Dacă sintaza bacteriană DHDP contribuie la biosinteza lizinei și dacă nu acționează nici un alt mecanism pentru a regla rezerva de lizină liberă, lizină liberă se poate acumula până la cantități superioare celor constatate în celulele sau țesuturile plantelor de control. Cantitățile de aminoacid liber pot fi măsurate ușor prin tehnici ca analiza HPLC cu fază inversă a extractelor de acid tricloracetic [TCA] ale celulelor sau țesuturilor plantei transgenice.

Plantele care acumulează cantități foarte mari de lizină liberă, conform cu aceste mecanisme, cresc până la maturitate. Aceste plante se lasă să înflorească și se face autopolenizarea sau polenizarea încrucișată la o linie parentală corespunzătoare pentru a obține semințe. Aceste semințe pot apoi să fie analizate în ce privește moștenirea trăsăturii dorite.

O primă evidență a semințelor poate fi germinarea și creșterea răsadurilor în prezența AEC în conentrații care ar inhiba creșterea lăstarilor germinați din semințele de control. Răsadurile care manifestă toleranță la AEC pot să crească complet și să fie total caracterizate cum s-a descris mai sus pentru a regenera plantele originale.

Plantele care se pot îmbunătăți prin astfel de transformări includ dar nu se limitează la plantele industriale (fasole soia, canola, cartofi, tomate, floarea-soarelui și semințe de bumbac], plante furajere (alfaalfa, trifoi și păiuș] și graminee (grâu, orz, ovăz, orez, sorg, mei și secară]. Plantele sau părți din plante se pot utiliza direct ca alimente sau se poate extrage lizină pentru a se folosi ca aliment sau adaos în alimentație.

Cu toate că cantitățile de lizină liberă descrise aici sunt ridicate în frunzele plantelor transformate, este de așteptat ca această metodă să permită obținerea de cantități mari de lizină liberă în alte organe ale plantei, printre care în tuberculi și în semințe.

RO 111473 Bl

Se dau, în continuare, exemple de realizare a invenției:

Exemplul 1. A. Materiale și metode. Endonucleazele de restricție, ligaza T4, chinaza polinucleotidică și fosfataza intestinului de vițel au fost toate întrebuințate pe baza recomandărilor fabricanților lor. S-au aplicat tehnicile standard cu ADI\I recombinat, transformarea celulelor de Escherichia coli și analizele moleculare descrise de Maniatis și alții, donarea moleculară: un manual de laborator, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1982).

Toate transcripțiile in vitro (SP6) și translațiile (lizat de reticulocite de șobolan) s-au făcut folosind reactivii de la Promega Biotec (Madison, WI) și respectând modalitățile de lucru ale fabricantului. Oligonucleotidele au fost sintetizate chimic folosind metoda fosforamiditei (Caruthers, Science, 230, 281+285, 1985)

S-a folosit tulpina Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404) (Hoekema și alții, Nature, 303, 179+180, 1983) pentru toate transformările de celule de plante. Izolarea și caracterizarea genei dap A a fost descrisă de Glassman, Clonarea și caracterizarea genei dap A de Escherichia coli (M.S. Thesis, Univ. Minnesota, Minneapolis, MN, 1988) lucrare inclusă în referințele bibliografice din prezenta descriere. Gena a fost izlată dintr- ocolecție genomică de Escherichia coli (Clarke and Carbon Collection of Hybrid Plasmids, Yale University School of Medicine, New Haven, CT). Fragmentele de plasmidă (pLC1730) considerate că poartă gena dap A au fost subclonate în vectorul de donare pBR322. Fragmentele purtătoare de genă dap A s-au identificat prin complementarea mutantei dap A din E. coli și au fost confirmate prin demonstrarea unei proteine ce a codificat plasmida cu masă moleculară de 32 kilodaltoni (corespunzător masei moleculare a subuni22 tății sintazei acidului dihidrodipicolinic) și prin activitatea enzimatică a sintazei acidului dihidropicicolinic. S-a determinat secvența de nucleotidă pentru o astfel de construcție de plasmidă și s-au identificat secvențele prezumtiv promotoare și secvența codificatoare pentru gena dap

A. ADN care flanca în exterior a fost îndepărtat prin subclonare ulterioară.

Un deosebit interes prezintă plasmidele pDAP1763 și pDAP1205 pDAP1763 poartă întreaga secvență codificatoare dap A plus regiunile netranslatate 5' și 3' pe un fragment 1564 bp Ndel-BstEII. PDAP1205 poartă un fragment 1375 bp Ndel-Sphl din care lipsesc ultimele 13 baze ale secvenței codificatoare și toate secvențele netranslatate. Ambele plasmide sunt derivați pBR322

B. Secvența peptidei de tranzit cloroplast. □ secvență ADN care codifică o peptidă de tranzit cu cloroplaste din mazăre a fost construită prin sintetizarea mai întâi a subfragmentelor secvenței și apoi combinarea lor. Bazat pe secvența publicată pentru peptidă de tranzit cloroplastă a unei mici subunități de genă de mazăre ribuloză-bisfosfatcarboxilază [Cashmore în Genetic Engineering of Plant, A. Hollaender, ed., Plenum Press, 1983), s-au sintetizat pe cale chimică opt oligonucleotide (patru per fibră). Cele șase baze interne terminale 5' au fost fosforilate folosind chinaza polinucleotidică T4, apoi din toate opt oligonucleotidele s-au luat 1 □□ pmoli și s-au amestecat împreună într-un volum total de 70 ul. 10 microlitri din acest amestec s-au combinat cu 100 ng de pP0126 digerat Hindlll-Sphl (Robbins și alții, J. Vi rol., 58, 339+347, 1986) s-au denaturat la 95° timp de 5 min., s-au călit la temperatura camerei timp de 2 h și apoi s-au legat pentru a da pSTP31. Secvența sintetică a constat din HindIII supralegat în 5', 30 bp de conducător netranslatat, 171 bp peptidă de tranzit cu 57 aminoacizi de codificat (tp) și Sphl supralegat la 3' care reprezintă locul de desprindere con

RO 111473 Bl servat în timpul evoluției pentru peptida de tranzit.

C. Modificarea genei dap A pentru folosirea ei în celulele de plante. S-a îndepărtat ADI\I extern bacterian din regiunea de codificare a genei dap A și s-a înlocuit cu secvențele recunoscute și prelucrate de celulele plantei. în scopul de a adăuga secvența peptidei de tranzit descrisă mai sus, terminația 5' a secvenței de codificare dap A s-a modificat pentru a crea un loc Sphl. Aceasta s-a realizat prin înlocuirea fragmentului 108 bp NsiL-Nrul în pDAP1763 cu un liant sintetic 29 bp care a regenerat atât locul Nsil cât și locul Nrul. Acest procedeu a șters promotorul bacterian pentru dap A și a schimbat secvența ce înconjoară codonul inițial de la CCATGT la GCATGC, creând astfel locul de restricție necesar Sphl Se prevede că această schimbare determină o substituție de la fenilalanină la leucină în poziția doi din secvența aminoacidului. Această plasmidă a fost denumită pDAP1900

Fragmentul 865 bp Sphl al pDAP1900 care include secvența de codificare dap A (fără ultimele 13 perechi de baze) se leagă în pSTP31 digerat Sphl astfel încât terminația 5' a secvenței ce codifică dap A să se lege de terminația 3' a secvenței peptidei de tranzit sintetice și se reface locul natural de desprindere al micii subunități de preproteină de mazăre. Plasmida obținută a fost denumită pDAP4001. Poliliantul din această plasmidă a realizat un loc Saci chiar 3' la sfârșitul secvenței de codificare. Acest loc s-a utilizat pentru a mișca peptida de tranzit (tp): caseta dap A ca un fragment Hindlll-Sacl 1070 bp în Hindlll-Sacl a tăiat pGEM3 (Promega Biotec, Madison, Wl), generând plasmida pDAP4104.

Terminația 3' a secvenței de codificare dap A s-a modificat similar pentru a face 4 lucruri: (1) să distrugă locul

Sphl (făcând ca locul creat la terminația

5' să fie unic), (2) să redepoziteze ultimii aminoacizi ai secvenței care fuseseră pierduți în construcția inițială a pDAP1205, (3) să adaugă doi codon stop și (4) să creeze un loc BamHI învecinat cu capătul secvenței de codificare. Aceasta s-a realzat prin digestia plasmidei pDAP1205 cu Sphl plus BamHI și legarea unui liant sintetic 25 bpîn locul a 147 bp de pBR322 pentru a obține plasmida pDAP1252. Distrugerea locului Sphl a determinat o schimbare a codonului de la alanină la glicină în poziția 289 în secvența dedusă de aminoacizi. Noul loc creat BamHI a fost întrebuințat pentru a adăuga semnale de terminație transcripțională recunoscute de celulele plantei. pDAP1252 a fost digerat cu BamHI și HindlII și s-a legat la un fragment BatTiM-HindlII 260 bp din pRL101 care conține terminația de transcripție și secvențele semnal de poliadenilare din gena sintazei nopalinei (nos) a pTiC58 (nucleotidele 673 până la 422, Bevan și alții, NAR, 11, 369-385, 1983) Această construcție a fost denumită pDAP1264 în final, terminalele modificate ale dap A au fost combinate pentru a reconstrui gena. pDAP1264 a fost digerat cu BstEII (în mijlocul secvenței de codificare dap A) și EcoRI (chiar în 3' la sfârșitul secvenței nos poliA) și s-a legat în pDAP4104 digerat de BstEIIEcoRI. Această plasmidă, pDAP4201, poartă peptida de tranzit sintetică cloroplastă (STP) ca secvență legată de secvența codificatoare a dap A și de regiunea nos 3' toate sub controlul transcripțional al promotorului SP6 în pGEM3 Această -construcție a fost utilizată pentru analizele in uitro ale funcției peptidei de tranzit, așa cum se descrie în capitolul 4 care urmează.

Pentru studiile in vitro ale funcției genei în celulele plantei, s-a plasat caseta STP:: dap A :: nos 3' descrisă mai sus sub controlul unui promotor

35S de CaMV după cum urmează.

Plasmida p35-227 a fost derivată din

RO 111473 Bl pP0126 prin inserarea fragmentului BamHI-BglII 450 bp care poartă secvența de promotor 35S din pCaMVPRO (un dar de la V. Walbot; vezi Fromm și alții, PNAS, 82, 5824^-5828, 1985] în locul BamHi al poliliantului pP0126. Această construcție plasează un loc Hindlll în poziția 3' a promotorului. Fragmentul 1340 bp Hindlll al pDAP4201 care poartă întreaga casetă a genei dap A s-a legat în acest loc cu orientarea corectă pentru a forma o unitate funcțională transcripțională pentru expresia în celulele plantei (plasmida pDAP4307).

D. Funcția in vitro a peptidei de tranzit. Capacitatea secvenței peptidei de tranzit sintetice de a dirija introducerea și prelucrarea produsului genei dap A de către cloroplastele intacte a fost determinată folosind probele de introducere a cloroplastelor in vitro (della-Cioppa și alții, Bio/technology, 5, 579-=-584, 1987], Preproteina marcată S^-metionină pentru testare a fost preparată astfel: ADN pDAP4201 a fost digerat cu EcoRI și supus fluxului unei transcripții cu folosirea SP6 polimerazei (Melton și alții, NAR, 12, 7035* 7056, 1984). După îndepărtarea plasmidei ADN prin digestie cu DNasel lipsit de RNase, mARN a fost precipitat cu etanol, resuspendat în 25 ul de apă deionizată distilată sterilă și măsurat spectrofotometric. s-au folosit apoi 8 micrograme din acest mARN într-o reacție de translație in vitro (lizat de reticulocite de șobolan] care a inclus și 2,5 uCi/ul metionină S³⁵ (New England Nuclear, Boston, MA) în volum total de 145 ul. Amestecul de reacție s-a incubat la 30°C timp de 90 de min. și s-a oprit prin așezarea sa pe gheață.

Cloroplastele active, intacte au fost izolate din frunzele de Latuca sativa folosind o metodă descrisă pentru răsadurile de mazăre (Bartlett și alții, Metode În biologia moleculară a cloroplastelor, Edelman și alții, eds., Elsevier Biomedical Press, 1982).

Cloroplastele izolate au fost resuspendate în agentul tampon de introducere (50 mM HEPES, pH 7,6, sorbitol □,3 M), adăugate la 2 mg/ml clorofilă și menținute pe gheață până la utilizare.

microlitri din produsele de translație in vitro (majoritatea tp: DHDPS subunități de preproteina) s-au combinat pe gheață cu 110 ul tampon de introducere, 25 ul L-metionină 0,1 M, 15 ul ATP 0,1 M și 100 ul cloroplaste. Amestecul reacției de introducere a fost așezat într-un anumit unghi și rotit încet direct în fața unui bulb din fibră optică la temperatura camerei. La 5, 10 și 15 min. s-au scos probe de 70 ul și s-au pipetat în tuburi eppendorf pe gheață conținând 7 ul de termolizină 1 mg/ml în 10 mM CaCI₂ (Cline și alții, Plant Phisiol. 75, 675*678, 1984]’ O a doua probă luată la 15 min. a fost pipetată într-un tub pe gheață conținând 7 ul CaCI₂ 10 mM drept martor. Toate tuburile au fost incubate pe gheață timp de 20 min., apoi au fost diluate cu 150 ul tampon de introducere care conține EDTA 50 mM pentru a inhiba termolizina. După centrifugare timp de 10 sec., cloroplastele au fost resuspendate în 50 ul tampon de liză (HEPES 10 mM, pH 7,5, EDTA 10 mM, PMSF 1 mM, aprotinină 30 ul/ml] și au fost lizate în două cicluri de înghețare/desghețare și agitare. Uzatele au fost centrifugate la 14000 x g timp de 20 min. pentru a separa fracțiile stromală (supernatantul) și tilacoidă (peleți).

Probele de proteină stromală au fost supuse electroforezei printr-un gel 12,5% SDS-poliacrilamidă (Laemmli, Nature, 227, 680, 1970). Gelul a fost pătat, uscat și supus autoradiografiei. Proba martor (în protează] a prezentat bandă la 42 kilodaltoni corespunzătoare subunității de preproteina tp : : DHDPS. Toate cele trei probe tratate cu termolizină nu au avut bandă la 42 kilodaltoni și au prezentat în schimb o bandă care migrează la aproximativ 32 kilodaltoni care a fost protejată de digestia proteolitică și de aceea s-a concluzionat că a r

RO 111473 Bl fost introdusă în cloroplaste. Proteina de la 32 kilodaltoni corespunde masei moleculare a subunității de sintază matură bacteriană a acidului dihidrodipicolinic.

E. Construcția vectorului binar pBVI. în această secțiune se descrie construcția vectorului utilizat pentru introducerea dap A modificat în celulele plantei. Vectorul cuprinde marginile din stânga și din dreapta T-ADN ale pTiAch5 pentru a ușura integrarea genei în genomul plantei, un marcher selectabil pentru E. coli (rezistență la ampicilină), un marcher selectabil pentru Agrobacterium tumefacient și tutun (rezistență la canamicină) și originea secvențelor de replicare pentru a permite plasmidei replicarea atât în E. coli cât și în Agrobacterium tumefaciens.

1. Subclonarea marginilor T-ADN. Marginea din stânga a pTiAch5 T_L ADN s-a obținut prin digerarea pOTY8 (Hoekema, supra) cu BamHI și Clal și apoi izolarea unui fragment 1206 bp (nucleotidele 1 până la 1206 conform cu Barker și alții, Plant Mol. Biol., 2, 335+350, 1983); vezi, de asemenea DeVos și alții, Plasmid, 6, 249+253, 1981). Fragmentul a fost legat în BglllClal-pP0126 digerat pentru a da plasmida pOTBLI. Marginea din dreapta a fost obținută asemănător din pOTY8 ca un fragment 5766 bp Hpal-Xhol inserat în regiunea de poliliant a pP0126 digerat cu Hpal și Xhol pentru a face pTB11828

2. Subclonarea originii pSa de replicare. Intervalul larg de origine a gazdei de replicare a pSa s-a izolat prin digerarea pUCD2 (Close și alții, Plasmid, 12, 111+118, 1984) cu Hincll și BamHI. Fragmentul de 2900 bp a fost legat cu Hpal-Bglll-pP0126 digerat pentru a obține pPOISa.

3. Construcția plasmidei care conține marginile stânga și dreapta Ύ-ADN și originea pSa a replicării (pBR322LRSa). Marginile stânga și dreapta T-ADN și originea pSa au fost introduse în pBR322 după cum urmează: pOTBLI s-a digerat cu Clal și HindIIl (nucleotidă 602, Barker, supra] pentru a genera un fragment 604 bp care apoi a fost făcut lipsit de ascuțime cu fragmentul Klenow al polimerazei ADN. Fragmentul ADN a fost inserat în locul Pvull al pBR322 pentru a da pBR322L. Marginea din dreapta a fost așezată pe un fragment 912 bp Clal-Bamlll din pTBII828 (nucleotidele 13774 până la 14686, Barker, supra) și a fost legată în ClalBamHI-pBR322L digerat pentru a obține pBR322LR

Locul hibrid Clal al pBR322LR a fost sensibil la metilare pe tulpina E. coli MC1000 și de aceea refractar la digestia de către Clal. Transferarea plasmidei pe tulpina E. coli GM272 (dam, dcm ) (Marinus și alții, J.Bacteriol., 114, 1143+1150, 1973) a permis inserția fragmentului 2900 bp EcoRI-Clal pSa din pPOISa în EcoRI-Clal-pBR322LR digerat. Plasmida obținută a fost denumită pBR322LRSa

4. Construcția unui marcher rezistent la canamicină. S-a construit un marcher selectabil capabil să confere rezistență la canamicină în Agrobacterium și în plante, prin folosirea promotorului din transcriptorul 24 al pTiAch5 T_R ADN. Această regiune promotoare a fost izolată ca fragment 1503 bp EcoRI-Clal din pRK290-EcoD Cla (Gelvin și alții, Mol. Gen. Genet., 199, 240+248, 1985) reprezentând nucleotidele 21, 631 până la 20128 (Barker, supra.). Fragmentul a fost legat în pP0126 cu EcoRi și Clal pentru a face pPOIPTR. S-a folosit un loc BamHI în poliliantul din 3' pentru transcriptorului 24 promotor pentru inserarea uriui fragment 1500 bp BglII-BamHI din Tn5 (Rothstein și alții, Cell., 19, 795+805, 1980). Acest fragment conține neomicinfosfotransferaza II (NPTII) ca secvență ce codifică, dar nu are promotorul nativ NPTII. Orientarea funcțională a fragmentului în ce privește transcriptorul 24 promotor s-a confirmat prin capacitatea plasmidei rezultante pPOINPTII de a i

RO 111473 Bl conferi rezistență la canamicină celulelor E coli.

Secvențele cu semnal de poliadenilare din gena sintetazei octopinei ocs a pTiAch5 au fost izolate ca fragment 707 bp Pvull din pTB11828 (nucleotidele 21, 5541 până la 11834, Barker, supra.) Acest fragment a fost legat în Smal-pP01 NPTll digerat, înlocuind 500 bp din secvențele exterioare Tn5 din 3' pe secvența de codificare NPTll. Orientarea corectă a fragmentului poli A a fost confirmată de modelul de fragment generat prin digerarea cu Xmalll. Plasmida a fost denumită pP01IMPTII-A

5. Inserția unui marcher selectabil în pBR322LRSa. Caseta cu gena pTR :: NPTll :: ocs 3' a fost deplasată ca un fragment 3100 bp Xhoi din pP01l\lPTII-A în Sall-pBR322LRSa digerat pentru a face pBV1. Această plasmidă cu 1,5 kilobază conține - în orientarea în sensul acelor de ceasornic de la locul unic EcaRI - următoarele componente: pSa original cu domeniu mare de gazdă, marginea dreaptă, locurile de donare Hpal și BamHI, gena cimerică pTR/NPTII/ocs (transcrisă în sensul acelor ceasului), 1415 bp de pBR322 (Sa1l până la Pvull), marginea stângă și fragmentul Pvull-EcoRI al pBR322 care include originea replicării și gena rezistentă la ampicilină.

F. Construcția vectorului de transformare care conține gena modificată dap A (pDPZ4474 și pDAP4511). Locurile unice Hpal și BamHI chiar în interiorul marginii drepte a pBV1 s-au folosit pentru a insera caseta/CaMV p35S :: STP31 :: dap A :: nos 3'. Folosind locurile din poliliantul care flanchează această casetă în pDAP4307, s-a legat un fragment 1830 bp Smal>Bgill în Hpal-BamHI-pBV1 digerat pentru a da pDPZ4474. în această construcție gena dap A este chiar în fața genei NPTll și este transcrisă în aceeași direcție ca NPTll în mod similar, un fragment de

1830 bp BamHI (parțial) - Hpal din pDAP4307 s-a legat în Hpal-BamHIpBV1 digerat pentru a da pDAP4511. în această construcție gena dap A este, de asemenea, chiar în fața marcherului selectabil NPTll, dar în orientarea inversă, astfel că este transcris divergent față de NPTll.

p0PZ4474 (ATCC nr. G7721) și pDAP4511 au fost transformate fiecare în Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404) folosind metoda descrisă de VanVIiet și alții, Plasmid, 1, 446+ 455, 1978) Produsele transformării au fost selectate pe plăci care conțin canamicină (50 ug/ml) și evidențiate pentru puritatea coloniei singulare.

G. Transformarea Nicotiana tabacum SR1 și regenerarea plantelor. Culturile de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404) care poartă pDPZ4474, pDAP4511 sau pBV1 au fost întrebuințate pentru transformările cu cocultivarea discurilor de frunze de tutun. Un set de discuri a fost tratat cu apă sterilă ca martor negativ.

Discurile din frunzele plantelor Nicotiana tabacum SR1 au fost transformate esențial așa cum a descris Horsch și alții, Science, 227, 1229+ 1231, 1985) cu următoarele excepții: culturile de Agrobacterium au fost crescute în mediul 523 (Kado și alții, Physiol. Plant Pat hol. 2, 47+59, 1972), suplimentate cu rifampicină (20 ug/ml), streptomicină (100 ug/ml) și canamicină (50 ug/ml) la 28°C timp de 48 h, au fost spălate și resuspendate în apă sterilă înainte de a se utiliza cu discurile din frunze; culturile în suspensie de Black Mexican Sweet au fost întrebuințate drept culturi de alimentare pe plăci nutritive; toate mediile solide au conținut 2,5 g/l Gelrite (Scott Laboratories, Omaha, NE) în loc de agar.

După două zile pe plăcile nutritive, au fost așezate pe mediul de încolțire discurile de frunze (același ca mediul nutritiv, dar conținând 500 ug/ml carbenicilină și canamicină la O, 100 sau

200 ug/ml și neavând culturile de aii

RO 111473 Bl mentare sau hârtie de filtru). Plăcile au fost izolate cu parafilm și incubate la 26°C cu o fotoperioadă de 12 h. Mugurii au fost tăiați când au ajuns la 1 cm și au fost transferați în mediul de formae a rădăcinii (lipsit de hormoni) care conține carbenicilină și canamicină în aceeași concentrație în care s-a inițiat înmugurirea. Când au apărut rădăcinile, plantulele au fost amplasate în vermiculit și apoi au fost transplantate în sol.

H. Alegerea pentru expresia dap A în plantele regenerate de tutun. Țesutul plantei a fost mai întâi selectat pentru expresia genei dap A introduse prin evaluarea rezistenței la analogul lizinei S/2-aminoetil)-cisteină (AEC). AEC este un inhibitor potențial al sintazei acidului dihidrodipicolinic al plantelor, dar DHDPS bacteriană este mult mai puțin sensibilă la ea. Discurile de frunze au fost preparate din frunzele cu suprafața sterilizată așa cum s-a descris în modalitatea de transformare. Discurile au fost așezate (patru discuri pe o placă, două plăci la fiecare tratament) pe mediul de înmugurire suplimentat cu Larginină 1 mM și AEC la 0, 0,1, 0,2 sau 0,4 mM. Plăcile conținând mediul de înmugurire suplimentat cu 75 ug/ml canamicină au fost făcute pentru fiecare plantă testată pentru a verifica marcherul selectabil. După o săptămână la 26°C în lumină, discurile de frunze au fost cântărite individual și s-au determinat greutatea medie proaspătă și deviația standard pentru fiecare tratament.

Discurile de frunze de la toate plantele au rămas verzi și au crescut în absența AEC. Greutatea proaspătă per disc a crescut de la aprox. 9 mg la aprox. 60 mg într-o săptămână. Creșterea a fost puternic inhibată în plantele martor în prezența AEC. Discurile de frunze așezate pe mediul care conține cel puțin 0,2 mM AEC au devenit cafenii și s-au sfâșiat. în contrast cu aceasta, discurile de frunze de la plantele presupuse cu dap A+ au fost identificate cu ușurință prin capacitatea lor de a rămâne verzi și de a crește în prezența AEC. Multe plante tolerante la AEC au fost identificate folosind acest procedeu de alegere. Caracterizarea unei astfel de plante este descrisă mai jos în detaliu.

I. Caracterizarea plantei de tutun dap A+ 327. 1. Toleranța la AEC. Replica discurilor din frunze ale plantei 327 la prezența AEC a fost comparată cu aceea a discurilor din frunzele plantei 101 ca martor în apă. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 1.

Tabelul 1.

Disc de frunze selectat cu AEC greutatea proaspătă [% greutate martor]

AEC (mM)	327	101
0	100	100
0,1	88	32
0,2	81	15
0,4	71	10

Greutățile proaspete ale discurilor de frunze (patru discuri per placă, 2 plăci per concentrație AEC) s-au măsurat după o săptămână. Greutățile proaspete medii s-au determinat pentru fiecare tratament și s-au exprimat ca procentaj de greutate proaspătă medie pe plăcile fără AEC.

2. Activitatea sintazei DHDP tolerantă la Uzină în extractele din frunze. Frunze tinere din plantele 327 și semințele crescute de NT-SR1 au fost supuse extracției după cum urmează: 1 sau 2 g de frunze rupte au fost mărunțite la 4°C în 2 ml tampon de extracție (fosfat de potasiu 0,1 M, pH 7,5 la 4°C, EDTA 2 mM, β-mercaptoetanol 1 mM, piruvatde sodiu 10 mM) în prezența a 0,14 g polivinilpirolidonă per gram de țesut. Extractul s-a filtrat prin Miracloth (Calbiochem) și apoi s-a centrifugat timp de 10 min. la 8000 x g (4°C). Supernatantul s-a adus încet la 40% saturație prin adăugarea de sulfat de amoniu solid fin mărunțit la 4°C cu agitare lentă. Precipitatul s-a îndepărtat prin centri

RO 111473 Bl fugare. Supernatantul a fost adus la 66% saturație cu sulfat de amoniu și precipitatul de 40-1-66% s-a colectat prin centrifugare ca mai sus. Materialul s-a resuspendat într-o coloană cu tampon (50 mM Tris-HCI, pH 7,5 la 4°C, EDTA 1 mM, piruvat de sodiu 10 mM, glicerină 10%) și a trecut printr-o coloană Sephadex G-20 (Sigma) pentru scoaterea sării.

Concentrațiile de proteină au fost determinate prin metoda de legare a colorantului a lui Bradford (REF) folosind pulberea de albumină fracția V din serul de bovine în apă distilată ca martor.

Activitaea sintazei acidului dihidrodipicolinic a fost înregistrată folosind analiza cu o-aminobenzaldehidă (ABA) (Yugari și alții, J. Biol. Chem., 240, 47104-4716^ 1965). Soluțiile stoc de clorhidrat de L-lizină s-au făcut în apă distilată, sterilizate prin filtrare și s-au adăugat la concentrația indicată la începerea reacției enzimei. La timpii stabiliți s-au scos mici cantități de 200 ul și reacția s-a oprit brusc în 800 ul tampon de stopare (acid citric 0,21 M, fosfat de sodiu 0,53 M, pH 5 la 25°C, cu 0,24 mg o-ABA adăugată chiar înainte de utilizare dintr-un stoc proaspăt preparat de 10 mg/ml etanol absolut). S-a lăsat să se dezvolte culoarea roz timp de 1 h la 25 °C și apoi s-a măsurat densitatea optică la 520 nm.

Activitatea sintazei DHDP în frunzele de 327 a fost de aprox. 30 de ori mai mare decât în frunzele de semințe crescute de NT-SR1. Mai semnificativ, este faptul că activitatea enzimei în furnzele de 327 este complet rezistentă la adăugarea de L-lizină la 100 uM și inhibată numai 14% în prezența a 500 uM L-lizină. Prin contrast, 100 uM de Llizină au inhibat activitatea sintazei DHDP în frunzele de NT-SR1 în proporție de 87% și nu s-a mai detectat activitate la 500 uM de L-lizină.

3. Analiza hibridizării sud/nord.

ADI\I genomic s-a izolat din frunzele de plante transformate și 101 conform cu metoda lui Shure și alții, Cell, 35,

2254-233, 1983. 10 ug ADN din fiecare plantă s-au digerat separat cu BamHI și cu BstEII și s-au supus electroforezei prin 0,7% agaroză. Digestia cu BamHI un fragment intern de diagnostic 1540 bp, în timp ce BstEII taie odată în secvența codificatoare dap A. Gelul a fost absorbit pe o membrană nylon și hibridizat (Southern J. Mol. Biol., 98, 5034-517, 1975), folosind fragmentul 1540 bp BamHI de pDAP4307 marcat cu P³² ca probă. Autoradiografia materialului absorbit a arătat clar banda caracteristică 1540 bp pe urma BamEII digerat și două benzi pe urma digestiei BstEII. Aceste rezultate, corelate cu marcherii reconstrucției pentru numărul de copii, sunt concludente în ce privește faptul că gena dap A este prezentă în plantele transformate ca o singură copie. Nu s-a observat hibridizare în liniile care conțin ADN din planta 101.

Analiza materialului absorbit din nord s-a efectuat de asemenea și rezultatele au indicat că gena dap A a fost transcrisă activ. Folosind atât ARN total cât și ARN oligo-dT-selectat poli A izolat din frunzele de plante transformate, aceeași probă descrisă mai sus a arătat hibridizarea la o singură specie de ARN de cca 1100 nucleotide. Nu s-a observat hibrizidare la ARN din planta 101.

4. Cantitățile de Uzină liberă din frunze. Extractele în acid tricloracetic (TCA) ale frunzelor de 327 și 101 s-au preparat pentru a testa cantitățile de aminoacid liber. Frunzele tinere au fost introduse (14-2 g) într-un mojar rece ca gheața, acoperit cu azot lichid și s-au mărunțit până la , pulbere. Frunzele mărunțite au fost liofilizate peste noapte și s-au determinat greutățile în stare uscată. Fiecare probă liofilizată a fost returnată într-un mojar rece și remărunțită în prezența a 2 ml TCA 10%. Mojarul s-a clătit cu încă 2 ml TCA. Extractele de TCA s-au combinat și s-au incubat pe gheață timp de 30 min. cu agitare din timp în timp. Amestecul de extracție a fost centrifugat 20 min. la

RO 111473 Bl

4°C și supernatantul s-a îndepărtat și s-a așezat pe gheață. Materialul a fost reextras cu 2 ml TCA 10% ca mai înainte și s-au unit supernatantele. 2 ml din extractul reunit s-au extras de 3 ori cu 5 ml eter. Extractul eteric a fost depozitat la -70°C până la analiză.

Cantitățile de aminoacid liber s-au determinat HPLC fază inversă folosind metoda derivatizării o-ftaldialdehidei a lui Jones și alții, J. Chromatog., 266, 471^-482, 1983. Trei probe de frunze de NT-SR1 au conținut în medie 75 ug lizină liberă per gram țesut liofilizat. Două probe de frunze 327 au dat o valoare de 15450 și respectiv 14630 ug lizină liberă per gram de țesut liofilizat sau aprox. o creștere de 200 ori de lizină liberă.

5. Ereditatea genei dap A. Planta de tutun 327 a înflorit și a fost lăsată să se autopolenizeze și să producă semințe. Sămânța matură, uscată a fost colectată, sterilizată la suprafață cu soluție de clorură de var 10% și clătită bine cu apă sterilă. Semințele au fost așezate (50 semințe per placă, două plățci per tratament) pe plăci grătar de germinare ( 1/4 Ms săruri, 2,5 g/l Gelrite) care conțin AEC la O, 1, 10, 30, 100 și 300 uM AEC. Semințele de la planta autopolenizată 101 s-au tratat identic ca martori. Toate semințele au germinat în 3+4 zile. După 10 zile numărul de răsaduri verzi pe fiecare placă a fost numărat. După două săptămâni răsadurile au fost scoase cu grijă din Gelrite și s-au măsurat lungimile rădăcinilor. Rezultatele sunt date în tabelul nr.2 și demonstrează clar că trăsătura de toleranță la AEC este moștenită de progeniturile la 327.

T abelul 2

Rezistența la AEC a răsadurilor. Lungimea medie a rădăcinii (% față de martor]

AEC (uM)	327	1D1
0	100	100

1	111	46
3	87	33
10	51	27
30	46	16
100	21	0

Lungimile rădăcinii s-au măsurat la două săptămâni după plantare. Lungimile medii ale rădăcinilor s-au determinat pentru fiecare tratament cu AEC și rezultatele sunt exprimate în procente ale lungimii medii a rădăcinilor pe mediul fără AEC.

Prezenta invenție a fost descrisă cu referire la diferite realizări specifice și preferate. însă, se va înțelege că se pot face multe variații și modificări care se încadrează în spiritul și scopul acestei invenții.

Claims

1. Metodă pentru creșterea cantității de L-lizină liberă în plante, caracterizată prin aceea că (a) se introduce o genă străină în celulele, țesuturile unei plante dicatiledonate și (b) se exprimă această genă străină în numitele celule, când o primă secvență de ADI\I a genei codifică sintaza acidului dihidrodipicolinic DHDPS rezistentă la inhibarea reacției prin feedback de către L-lizina liberă produsă endogen și în care respectiva genă străină cuprinde o a doua secvență ADN atașată la secvența( 5') terminală a primei secvențe ADN care codifică o peptidă de tranzit a cloroplastei PTC care localizează DHDPS în cloroplastele respectivelor celule.

2. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că gena DHDPS este o genă bacteriană.

3. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că secvența PTC-ADN este identică cu secvența PTC-ADN, obținută dintr-o genă nucleară care codifică o preproteină conținând o peptidă de cloroplastă PTC cu

RO 111473 Bl

37 terminație amino.

4. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că o plasmidă care conține respectiva genă străină se introduce în celule.

5. Metodă conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că plasmida este un vector de donare bacterian.

6. Metodă conform revendicării 5, caracterizată prin aceea că numita plasmidă este un vector de donare E. coli.

7. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că gena străină este introdusă în numitele celule ale plantei prin tehnicile de electroporație, microinjecție, microproiectile sau încapsulare liposomală.

8. Metodă conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că gena străină este introdusă în celulele plantei prin transformare mediată de Agrobacterium.

9. Celulă de plantă transformată, caracterizată prin aceea că conține o genă străină care exprimă o peptidă de tranzit de cloroplastă PTC și care exprimă sintaza acidului dihidrodipicolinic DHDPS rezistentă la inhibarea prin feedback de către L-lizina liberă produsă endogenic.

10. Celulă de plante, conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că, numita genă DHDPS este o genă bacteriană.

11 .Celulă de plantă, conform revendicării 10, caracterizată prin aceea că numita genă DHDPS este o genă E. coli dap A.

12. Celulă de plantă, conform revendicării 10, caracterizată prin aceea că numita PTC este o PTC de mazăre.

13. Plantă dicotiledonată, transformată, care produce L-lizină liberă pe cale biosintetică, ntrebuințând sintaza acidului dihidrodipidolinic (DHDPS], caracterizată prin aceea că numita sintază DHDPS este produsul (a] unei gene străine care exprimă și o peptidă de tranzit cloroplastă și (b) este rezistentă la inhibarea prin feedback de către L-lizina liberă produsă endogenic.

14. Plantă transformată, conform revendicării 13, caracterizată prin aceea că gena străină DHDPS este o genă bacteriană.

15. Plantă transformată, conform revendicării 14, caracterizată prin aceea că gena străină este o genă E. coli dap A.

16. Plantă transformată, conform revendicării 13, caracterizată prin aceea că conține cantități de L-lizină liberă care sunt de cel puțin 50 ori mai mari decât cantitățile dintr-o plantă netransformată aparținând aceeași specii.

17. Casetă de expresie, caracterizată prin aceea că este formată dintr-o genă ce codifică sintaza acidului dihidrodipicolinic (DHDPS) care este rezistentă la inhibarea prin feedback de către L-lizina liberă, numita genă se leagă în cadrul corect de citire prin terminația sa (5 ) de o a doua secvență ADN codificând o peptidă de tranzit cloroplastă (PTC) cu terminație amino și în care gena DHDPS și o a doua secvență ADN sunt sub controlul regulator transcripțional și translațional al regiunilor regulatoare funcționale în celula unei plante.

18. Casetă de expresie, conform revendicării 17, caracterizată prin aceea că numita genă DHDPS este o genă bacteriană.

19. Casetă de expresie, conform revendicării 18, caracterizată prin aceea că numita genă este gena E. coli dap A.

20. Casetă de expresie, conform revendicării 17, caracterizată prin aceea că are cel puțin o margine T-DNA.

21. Casetă de expresie, conform revendicării 17, caracterizată prin aceea că mai conține o genă care codifică o funcție selectivă în celulele plantelor.

22. Casetă de expresie, conform revendicării 17, caracterizată prin aceea că conține mai puțin de 5 kilobaze.

23. Casetă de expresie, conform revendicării 22, caracterizată prin aceea că conține aproximativ 2...3 kilobaze.

24. Plasmidă capabilă de replicare în cel puțin una dintre E. coli și A. tumefaciens, caracterizată prin aceea că conține caseta de expresie din revendicarea 17.