BR112021007864A2 - ácido nucleico recombinante, métodos e vegetal transgênico fértil - Google Patents
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Abstract
ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE, MÉTODOS E VEGETAL TRANSGÊNICO FÉRTIL.
A presente invenção se refere a enzimas aciltransferase BAHD, os ácidos nucleicos que codificam enzimas aciltransferase BAHD, e os ácidos nucleicos inibitórios adaptados para inibir a expressão e/ou a tradução de RNA da aciltransferase BAHD; a cassetes de expressão, a células vegetais, e a vegetais que têm ou codificam tais ácidos nucleicos e enzimas; e a métodos de fazer e usar tais ácidos nucleicos, enzimas, cassetes de expressão, células e vegetais.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE, MÉTODOS E VEGETAL TRANSGÊNICO FÉRTIL”
[001] Esta invenção foi feita com suporte governamental sob DE-FC02- 07ER64494 outorgado pelo Departamento de Energia dos EUA. O governo tem certos direitos na invenção.
[002] A invenção é direcionada a enzimas aciltransferase BAHD, os ácidos nucleicos que codificam enzimas aciltransferase BAHD, e os ácidos nucleicos inibitórios adaptados para inibir a expressão e/ou a tradução de RNA da aciltransferase BAHD; a cassetes de expressão, a células vegetais, e a vegetais que têm ou codificam tais ácidos nucleicos e enzimas; e a métodos de fazer e usar tais ácidos nucleicos, enzimas, cassetes de expressão, células, e vegetais.
[003] A lignina é um importante componente de parede celular que provê suporte estrutural aos vegetais e é necessária para a função do tecido vascular vegetal. A lignina também é uma fonte de material orgânico para a síntese de produtos químicos. A lignina é o segundo polímero inorgânico mais abundante na Terra, constituindo cerca de 30% do carbono orgânico não fóssil e de um quarto a um terço da massa seca de madeira. Em virtude de a estrutura química da lignina ser difícil de degradar por meios químicos e enzimáticos, a lignina torna a tarefa de produção de papel e biocombustíveis a partir das paredes de célula vegetal difícil. Modificar a lignina para tornar a mesma mais suscetível à degradação ou adequada para a produção de certos produtos químicos é desejável.
[004] A invenção se refere à identificação e ao isolamento de inovadores ácidos nucleicos e polipeptídeos de aciltransferase BAHD. As aciltransferases BAHD têm uma ou mais atividades de aciltransferase BAHD selecionadas a partir de pelo menos atividade de feruloil-coenzima A (CoA):monolignol transferase (FMT), atividade de p- coumaroil-CoA:monolignol transferase (PMT), atividade de p-hidroxibenzoil- CoA:monolignol transferase (pBMT), atividade de benzoil-CoA:monolignol transferase (BMT), atividade de acetil-CoA:monolignol transferase (AMT), ou uma combinação das mesmas. As aciltransferases BAHD podem ser usadas para fazer vegetais que contêm lignina modificada. A lignina modificada é suscetível à degradação e à produção de produtos químicos tipo commodity.
[005] Um aspecto da invenção é um ácido nucleico de aciltransferase BAHD que codifica um polipeptídeo de aciltransferases BAHD. O ácido nucleico de aciltransferase BAHD pode ser um ácido nucleico isolado, um ácido nucleico recombinante, ou ambos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico de aciltransferase BAHD codifica um polipeptídeo da aciltransferase BAHD que compreende uma sequência idêntica ou substancialmente idêntica a SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, e/ou SEQ ID NO:18. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos podem codificar uma aciltransferase BAHD com pelo menos cerca de 50% de pelo menos uma atividade de aciltransferase BAHD de uma aciltransferase BAHD com a sequência de aminoácido SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18.
[006] Um outro aspecto da invenção é uma célula vegetal transgênica que compreende um ácido nucleico isolado ou recombinante que codifica uma aciltransferase BAHD. O ácido nucleico pode incluir qualquer um dos ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD aqui descritos. Por exemplo, o ácido nucleico pode incluir um segmento de ácido nucleico que pode hibridizar seletivamente em um DNA com uma sequência SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17, e/ou um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18, e/ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da aciltransferase BAHD que compreende uma sequência substancialmente idêntica à sequência de aminoácido SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18, e/ou um ácido nucleico que codifica uma aciltransferase BAHD com pelo menos cerca de 50% de pelo menos uma atividade de aciltransferase BAHD de uma aciltransferase BAHD com a sequência de aminoácido SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18.
[007] Um outro aspecto da invenção é um cassete de expressão que compreende um dos ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD aqui descritos que é operativamente ligado a um promotor funcional em uma célula hospedeira. Um ácido nucleico como este pode incluir um segmento de ácido nucleico que pode hibridizar seletivamente em um DNA com uma sequência SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17, e/ou um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18, e/ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da aciltransferase BAHD que compreende uma sequência substancialmente idêntica à sequência de aminoácido SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18, e/ou um ácido nucleico que codifica uma aciltransferase BAHD com pelo menos cerca de 50% de pelo menos uma atividade de aciltransferase BAHD de uma aciltransferase BAHD com a sequência de aminoácido SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18. O cassete de expressão pode compreender adicionalmente um gene marcador selecionável. Em algumas modalidades, o cassete de expressão compreende adicionalmente DNA de plasmídeo. Por exemplo, o cassete de expressão pode estar em um vetor de expressão. Promotores que podem ser usados em tais cassetes de expressão incluem promotores funcionais durante o desenvolvimento ou o crescimento do vegetal.
[008] Um outro aspecto da invenção é uma célula vegetal que inclui um cassete de expressão que compreende um dos ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD aqui descritos que é operativamente ligado a um promotor funcional em uma célula hospedeira. Um ácido nucleico como este pode incluir um segmento de ácido nucleico que pode hibridizar seletivamente em um DNA com uma sequência SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17, e/ou um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18, e/ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da aciltransferase BAHD que compreende uma sequência substancialmente idêntica à sequência de aminoácido SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18, e/ou um ácido nucleico que codifica uma aciltransferase BAHD com pelo menos cerca de 50% de pelo menos uma atividade de aciltransferase BAHD de uma aciltransferase BAHD com a sequência de aminoácido SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18. A célula vegetal pode ser uma célula monocotiledônea. A célula vegetal também pode ser uma célula gimnosperma. Por exemplo, a célula vegetal pode ser uma célula de milho, grama ou madeira macia. Em algumas modalidades, a célula vegetal é uma célula dicotiledônea. Por exemplo, a célula vegetal pode ser uma célula de madeira dura, tais como álamo ou eucalipto.
[009] Um outro aspecto da invenção é um vegetal que inclui um cassete de expressão que compreende um dos ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD aqui descritos que é operativamente ligado a um promotor funcional em uma célula hospedeira. Um vegetal como este pode ser uma monocotiledônea. Um ácido nucleico como este pode incluir um segmento de ácido nucleico que pode hibridizar seletivamente em um DNA com uma sequência SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17, e/ou um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido SEQ ID
NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18, e/ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da aciltransferase BAHD que compreende uma sequência substancialmente idêntica à sequência de aminoácido SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18, e/ou um ácido nucleico que codifica uma aciltransferase BAHD com pelo menos cerca de 50% de pelo menos uma atividade de aciltransferase BAHD de uma aciltransferase BAHD com a sequência de aminoácido SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18. O vegetal também pode ser uma gimnosperma. Por exemplo, o vegetal pode ser um vegetal tipo milho, grama ou madeira macia. Em algumas modalidades, o vegetal é um vegetal dicotiledôneo. Por exemplo, o vegetal pode ser um vegetal tipo madeira dura, tais como álamo ou eucalipto.
[010] Um outro aspecto da invenção é um método para incorporar conjugados de monolignol éster na lignina de um vegetal que inclui: a) transformar estavelmente células vegetais com o cassete de expressão que compreende um dos ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD aqui descritos para gerar células vegetais transformadas; b) regenerar as células vegetais transformadas em pelo menos um vegetal transgênico, em que uma aciltransferase BAHD é expressada a partir do ácido nucleico de aciltransferase BAHD em pelo menos um vegetal transgênico em uma quantidade suficiente para incorporar conjugados de monolignol éster na lignina do vegetal transgênico.
[011] O ácido nucleico de aciltransferase BAHD pode ser um ácido nucleico que pode hibridizar seletivamente em um DNA com uma sequência SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17, e/ou um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18, e/ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da aciltransferase BAHD que compreende uma sequência substancialmente idêntica à sequência de aminoácido SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18, e/ou um ácido nucleico que codifica uma aciltransferase BAHD com pelo menos cerca de 50% de pelo menos uma atividade de aciltransferase BAHD de uma aciltransferase BAHD com a sequência de aminoácido SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18. Os conjugados de monolignol éster podem compreender um ou mais de monolignol ferulato, monolignol p-coumarato, monolignol p-hidroxibenzoato, monolignol benzoato, e monolignol acetato, e o grupo monolignol nos conjugados de monolignol éster pode compreender um ou mais de um grupo p-coumaril, um grupo coniferil, e um grupo sinapil. O método pode ser usado para gerar um vegetal transgênico que é fértil. O método pode incluir adicionalmente recuperar sementes transgênicas a partir do vegetal transgênico, em que as sementes transgênicas incluem o ácido nucleico que codifica uma aciltransferase BAHD. O vegetal que contém conjugados de monolignol éster em sua lignina pode ser uma monocotiledônea. O vegetal também pode ser uma gimnosperma. Por exemplo, o vegetal pode ser um vegetal tipo milho, grama ou madeira macia. Em algumas modalidades, o vegetal é um vegetal dicotiledôneo. Por exemplo, o vegetal também pode ser um vegetal tipo madeira dura. Um método como este pode incluir adicionalmente transformar estavelmente a(s) célula(s) vegetal(is) ou o vegetal com pelo menos um gene marcador selecionável. O marcador selecionável pode ser ligado ou associado com o cassete de expressão.
[012] O método para incorporar conjugados de monolignol éster na lignina de um vegetal também pode incluir procriar o vegetal transgênico fértil para produzir um vegetal progênie, em que o vegetal progênie tem um aumento no percentual de um ou mais de um ou mais dos conjugados de monolignol éster feito pela aciltransferase BAHD na lignina do vegetal progênie em relação ao correspondente vegetal não transformado.
[013] Um outro aspecto da invenção é uma lignina isolada do vegetal transgênico que compreende qualquer um dos ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD aqui descritos. Um outro aspecto da invenção é um material lenhoso isolado a partir do vegetal transgênico que compreende qualquer um dos ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD aqui descritos. A lignina ou o tecido lenhoso podem incluir qualquer um dos ácidos nucleicos aqui descritos que codificam uma aciltransferase BAHD. Em outras modalidades, a lignina ou o tecido lenhoso podem incluir qualquer uma das sequências de aminoácido ou polipeptídeo da aciltransferase BAHD aqui descritas.
[014] Um outro aspecto da invenção é um método de fazer um produto proveniente de um vegetal transgênico que compreende: (a) prover um vegetal transgênico que inclui um dos ácidos nucleicos isolados ou recombinantes aqui descritos que codificam uma aciltransferase BAHD; e (b) processar os tecidos do vegetal transgênico sob condições suficientes para digerir a lignina; para, desse modo, gerar o produto do vegetal transgênico, em que os tecidos do vegetal transgênico compreendem lignina que tem um maior percentual de conjugados de monolignol éster em relação a um vegetal correspondente não transformado. Um correspondente vegetal não transformado como este é, tipicamente, um vegetal das mesmas espécie, linhagem e/ou acessão do vegetal transformado. As condições suficientes para digerir a lignina podem incluir condições suficientes para clivar ligações de éster na lignina que contém conjugado de monolignol éster. Em algumas modalidades, as condições suficientes para digerir a lignina incluem condições moderadamente alcalinas. Em algumas modalidades, as condições suficientes para digerir a lignina incluem tratar os tecidos do vegetal transgênico com amônia por um tempo e uma temperatura suficientes para clivar ligações de éster na lignina que contém conjugado de monolignol éster. Em algumas modalidades, as condições suficientes para digerir a lignina incluem condições ácidas.
[015] Um outro aspecto da invenção é um ácido nucleico isolado ou recombinante que codifica uma aciltransferase BAHD, em que o ácido nucleico pode hibridizar seletivamente em um DNA com uma sequência SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17. Por exemplo, o ácido nucleico pode hibridizar seletivamente em um DNA com uma sequência SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17 sob condições de hibridização rigorosas. Em algumas modalidades, as condições de hibridização rigorosas compreendem uma lavagem em 0,1 x SSC, 0,1% SDS em 65 °C. Um ácido nucleico isolado ou recombinante como este pode ter pelo menos cerca de 79%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17. Em algumas modalidades, o ácido nucleico com a sequência SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17 codifica uma aciltransferase BAHD.
[016] Outros aspectos da invenção incluem ácidos nucleicos inibitórios adaptados para inibir a expressão e/ou a tradução de um mRNA da aciltransferase BAHD; cassetes de expressão, células vegetais, e vegetais compreendendo os ácidos nucleicos inibitórios; métodos que se referem ao uso dos ácidos nucleicos inibitórios; vegetais transgênicos compreendendo um knockdown ou knockout da aciltransferase BAHD endógena do vegetal; e outros aspectos descritos nas seguintes declarações da invenção e em outro local neste.
[017] Portanto, a invenção abraça enzimas aciltransferase BAHD, ácidos nucleicos que codificam ou que inibem a expressão de enzimas aciltransferase BAHD, bem como cassetes de expressão, células vegetais, e vegetais que têm ou codificam tais ácidos nucleicos e enzimas, e métodos de fazer e usar tais ácidos nucleicos, polipeptídeos, cassetes de expressão, células, e vegetais. Todas as patentes e publicações aqui referenciadas ou mencionadas são indicativas dos níveis de habilidade do versados na técnica à qual a invenção se refere, e cada uma de tais patente ou publicação referenciada é, pelo presente, especificamente incorporada pela referência na mesma extensão como se a mesma tivesse sido incorporada pela referência em sua íntegra individualmente ou aqui apresentada em sua íntegra. Os Requerentes se reservam ao direito de incorporar fisicamente nesta especificação todos e quaisquer materiais e informação provenientes de quaisquer tais patentes ou publicações citadas.
[018] Pretende-se que as faixas numéricas aqui usadas incluam cada número e subconjunto de números contidos nesta faixa, sejam especificamente revelados ou não. Adicionalmente, estas faixas numéricas devem ser interpretadas como provendo suporte para uma reivindicação direcionada a quaisquer número ou subconjunto de números nesta faixa. Por exemplo, uma revelação de 1 a 10 deve ser interpretada como suportando uma faixa de 2 a 8, de 3 a 7, de 5 a 6, de 1 a 9, de 3,6 a 4,6, de 3,5 a 9,9, e assim por diante.
[019] Os métodos e as composições específicos aqui descritos são representativos das modalidades preferidas e são exemplares, e não pretende-se que sejam limitações ao escopo da invenção. Outros objetivos, aspectos e modalidades irão ocorrer aos versados na técnica mediante consideração desta especificação e são abrangidos no espírito da invenção definido pelo escopo das reivindicações. Ficará prontamente aparente aos versados na técnica que substituições e modificações variáveis podem ser feitas na invenção aqui revelada sem fugir do escopo e do espírito da invenção. A invenção aqui ilustrativamente descrita pode ser adequadamente praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, ou limitação ou limitações, que não é aqui especificamente revelado como essencial. Os métodos e os processos aqui ilustrativamente descritos podem ser adequadamente praticados em diferentes ordens de etapas, e os métodos e os processos não são necessariamente restritos às ordens das etapas indicadas aqui ou nas reivindicações. Da forma usada aqui e nas reivindicações anexas, as formas no singular “um”, “uma”, “o” e “a” incluem a referência no plural, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. Assim, por exemplo, uma referência a “um ácido nucleico” ou “um polipeptídeo” inclui uma pluralidade de tais ácidos nucleicos ou polipeptídeos (por exemplo, uma solução de ácidos nucleicos ou polipeptídeos ou uma série de preparações de ácido nucleico ou polipeptídeo) e assim por diante. Sob nenhuma circunstância pode a patente ser interpretada coo limitada aos exemplos ou modalidades ou métodos específicos especificamente aqui revelados.
[020] Os termos e as expressões que foram empregados são usados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção no uso de tais termos e expressões para excluir qualquer equivalente dos recursos mostrados e descritos ou partes dos mesmos, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis no escopo da invenção reivindicada. Assim, será entendido que, embora a presente invenção tenha sido especificamente revelada pelas modalidades preferidas e recursos opcionais, modificação e variação dos conceitos aqui revelados podem ser recorridos pelos versados na técnica, e que tais modificações e variações são consideradas como no escopo desta invenção definida pelas reivindicações anexas e declarações da invenção.
[021] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado comumente entendido pelos versados na técnica à qual esta invenção pertence. A menos que mencionado de outra forma, as técnicas aqui empregadas ou contempladas são metodologias padrões bem conhecidas pelos versados na técnica. Os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não limitantes. O seguinte é apresentado a título de ilustração e não limita o escopo da invenção.
[022] As figuras 1A-1D ilustram modelos estruturais para alguns tipos de polímeros de lignina. As figuras 1A e 1B mostram exemplos de estruturas de lignina que podem ser encontradas em uma madeira macia (abeto). As figuras 1C e 1D mostram exemplos de estruturas de lignina que podem estar presentes em uma madeira dura (álamo). (Ralph, J., Brunow, G., and Boerjan, W. (2007) Lignins. In: Rose, F., and Osborne, K. (eds). Encyclopedia of Life Sciences, DOI:
10.1002/9780470015902.a0020104, John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, UK). A lignina da madeira macia é, no geral, mais ramificada e contém uma proporção mais baixa de unidades de β-éter. Note que cada uma destas estruturas representa apenas um de bilhões de possíveis isômeros (Ralph, J., Lundquist, K., Brunow, G., Lu, F., Kim, H., Schatz, P.F., Marita, J.M., Hatfield, R.D., Ralph, S.A., Christensen, J.H., e Boerjan, W. (2004) Lignins: natural polymers from oxidative coupling of 4- hydroxyphenylpropanoids. Phytochem. Revs. 3(1):29-60). Assim, estas estruturas são meramente ilustrativas de alguns dos tipos de ligação que podem estar presentes em diferentes ligninas. Um “S” em um anel indica uma unidade de siringil, ao mesmo tempo em que um “G” em uma unidade indica uma unidade de guaiacil.
[023] As figuras 2A-2E mostram as estruturas de possíveis reagentes e produtos da atividade de certas enzimas aciltransferase BAHD da invenção. A figura 2A mostra a estrutura de álcool sinapílico como um possível reagente. O álcool coniferílico, um outro possível reagente, carece de um dos dois grupos metóxi presentes no álcool sinapílico. O álcool p-Hidroxicinamílico (álcool p-coumarílico), um outro possível reagente, carece de ambos os grupos metóxi presentes no álcool sinapílico. A figura 2B mostra a estrutura de p-coumaroil-CoA, um outro possível reagente. A figura 2C mostra a estrutura de feruloil-CoA, um outro possível reagente. A figura 2D mostra a estrutura de sinapil p-coumarato como um possível produto resultante da conjugação do álcool sinapílico com p-coumaril-CoA. O coniferil p-coumarato, um possível produto resultante da conjugação do álcool coniferílico com p-coumaril-CoA, carece de um dos dois grupos metóxi presentes em sinapil p-coumarato. O p-Hidroxicinamil coumarato (p-coumaril coumarato), um possível produto resultante da conjugação do álcool p- Hidroxicinamílico e de p-coumaril-CoA, carece de ambos os grupos metóxi presentes em sinapil p-coumarato. A figura 2E mostra a estrutura de sinapil ferulato como um possível produto resultante da conjugação do álcool sinapílico com feruloil-CoA. O coniferil ferulato, um possível produto resultante da conjugação do álcool coniferílico com feruloil-CoA, carece de um dos dois grupos metóxi presentes em sinapil ferulato. O p-Hidroxicinamil ferulato (p-coumaril ferulato), um possível produto resultante da conjugação do álcool p-Hidroxicinamílico e feruloil-CoA, carece de ambos os grupos metóxi presentes em sinapil ferulato.
[024] As figuras 3A-6 mostram alinhamentos de sequências de aminoácido de aciltransferases BAHD (XMTs) exemplares da invenção geradas por Clustal O (versão
1.2.4). As figuras 3A-3C mostram um alinhamento de todos os XMTs exemplares. As figuras 4A-4B mostram um alinhamento de um primeiro grupo de XMTs. A figura 5 mostra um alinhamento de um segundo grupo de XMTs. A figura 6 mostra um subgrupo no segundo grupo de XMTs.
[025] As figuras 7A e 7B mostram os resultados da triagem da atividade da enzima XMT usando uma mistura de três monolignóis e vários substratos de CoA. A figura 7A mostra três cromatogramas de absorção da cromatografia líquida (LC) representativos (esquerda) que representam a janela de eluição para os produtos de transferase submetidos a ensaio (centro). XMT1 é uma aciltransferase ubíqua, com atividade com todos os cinco substratos de CoA testados. XMT2 é um exemplo de uma enzima com atividade primariamente de pBMT. XMT4 é um exemplo de uma enzima com atividade primariamente de FMT. A figura 7B mostra uma tabela que sumariza as atividades das enzimas XMT.
[026] As figuras 8A e 8B mostram a liberação aumentada de p-hidroxibenzoato a partir dos tecidos de xilema em álamo seguindo a hidrólise alcalina resultante da sobre-expressão de XMT6 sob o controle do promotor 35S (figura 8A) ou do promotor C4H (figura 8B).
[027] A figura 9 mostra a síntese de sinapil p-hidroxibenzoato a partir de p- hidroxibenzoil-CoA e álcool sinapílico através da atividade das enzimas pHBMT.
[028] A invenção provê ácidos nucleicos e métodos usados para alterar a estrutura de lignina e/ou o conteúdo da lignina em vegetais. Os vegetais com tais estrutura/conteúdo de lignina alterados são mais facilmente ou economicamente processados em produtos úteis, tais como biocombustíveis, papel ou produtos químicos tipo commodity. ACILTRANSFERASES DEPENDENTES DE ACIL-COA
[029] Aciltransferases dependentes de acil-CoA vegetal constituem uma grande, mas específica superfamília de proteína, chamada de BAHD. Os membros desta família tomam um ácido carboxílico ativado (isto é, uma forma de tioéster CoA do ácido) como um doador de acila e tanto um álcool quanto, mais raramente, uma amina primária, como uma aceitante de acila e catalisam a formação de uma ligação de éster ou de amida, respectivamente. Os doadores de acila e os aceitantes de acila que agem como substratos pelas aciltransferases BAHD são bastante diversos, e diferentes membros da família BAHD exibem uma faixa de especificidades do substrato.
[030] A invenção se refere os ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD e enzimas inovadores que habilitam a produção de vegetais transgênicos com lignina alterada. Os ácidos nucleicos BAHD podem ser usados nos cassetes de expressão, vetores de expressão, células vegetais transgênicas, vegetais transgênicos, e sementes transgênicas, da forma aqui descrita.
[031] Os ácidos nucleicos BAHD e as proteínas codificadas podem ser ácidos nucleicos ou proteínas isoladas ou recombinantes.
[032] O termo “isolado”, quando usado em conjunto com um ácido nucleico, polipeptídeo, ou célula, se refere a um segmento de ácido nucleico, polipeptídeo, ou célula que está presente em uma forma ou definição que é diferente daquela na qual é encontrada na natureza. Um exemplo de um ácido nucleico, polipeptídeo, ou célula isolada é um que é identificado e separado de pelo menos um ácido nucleico, polipeptídeo, ou célula contaminante com o qual o mesmo é ordinariamente associado em seu estado natural. Um exemplo de um ácido nucleico ou polipeptídeo isolados é um que foi removido de sua célula natural ou nativa. Assim, o ácido nucleico ou o polipeptídeo podem ser fisicamente isolados da célula ou o ácido nucleico ou o polipeptídeo pode estar presente ou ser mantido em uma outra célula em que o mesmo não está naturalmente presente ou sintetizado.
[033] O termo “recombinante” quando usado em referência a um ácido nucleico ou um polipeptídeo se refere a um ácido nucleico ou um polipeptídeo que tem um nucleotídeo ou sequência de aminoácido não naturais, isto é, um nucleotídeo ou uma sequência de aminoácido não encontrados na natureza.
Por exemplo, um ácido nucleico recombinante inclui um segmento de ácido nucleico proveniente de uma espécie que foi introduzido em um ácido nucleico de uma outra espécie.
Um ácido nucleico recombinante também inclui um segmento de ácido nucleico que é nativo de um organismo, mas foi alterado de alguma maneira (por exemplo, sofreu mutação, ligado a um promotor heterólogo ou sequência intensificadora, etc.). Um ácido nucleico recombinante também inclui um ácido nucleico que compreende uma combinação de elementos genéticos em que a combinação não ocorre na natureza.
Os exemplos não limitantes de tais elementos genéticos incluem sequências de codificação, promotores, intensificadores, sítios de ligação de ribossomo (por exemplo, sequências Shine Dalgarno, sequências Kozak), etc.
O termo “heterólogo” se refere a quaisquer tais elemento genético ou segmento de ácido nucleico individuais quando incluídos em uma combinação sem ocorrência natural como esta.
Ácidos nucleicos recombinantes podem incluir sequências de codificação otimizadas no códão que são distintas de quaisquer sequências de codificação encontradas na natureza.
Ácidos nucleicos recombinantes incluem segmentos de ácido nucleico compreendendo uma ou mais diferenças (isto é, substituições, deleções, inserções) em relação a quaisquer segmentos de ácido nucleico encontrados na natureza.
Ácidos nucleicos recombinantes podem incluir ácidos nucleicos, tais como formas de cDNA de um gene de vegetal, em que as sequências de cDNA são expressadas em uma direção sentido para produzir mRNA.
Em algumas modalidades, ácidos nucleicos recombinantes podem ser distinguidos de genes de vegetal endógenos em que segmentos de ácido nucleico heterólogos são associados a sequências de nucleotídeo compreendendo elementos regulatórios, tais como promotores que não são naturalmente encontrados associados com o gene endógeno em seu cromossomo natural.
Em algumas modalidades, ácidos nucleicos recombinantes podem ser distinguidos dos genes de vegetal endógenos em que os ácidos nucleicos recombinantes expressam a proteína codificada (ou parte de uma proteína) em partes do vegetal onde a proteína (ou parte da mesma) não é normalmente expressada. O termo “cDNA” se refere a qualquer DNA que inclui uma sequência de codificação para um polipeptídeo e carece de um ou mais intrões presentes em DNA genômico de ocorrência natural também compreendendo aquela sequência de codificação, independentemente se ou não o cDNA é diretamente gerado a partir de mRNA.
[034] O termo “recombinante” quando usado em referência a uma célula se refere a uma célula compreendendo um ácido nucleico recombinante ou um polipeptídeo recombinante.
[035] O termo “nativo”, quando usado pelo menos em referência a um ácido nucleico ou um polipeptídeo, se refere a um ácido nucleico ou um polipeptídeo como o mesmo existe na natureza. Os ácidos nucleicos ou os polipeptídeos nativos incluem DNA, RNA, ou sequências ou segmentos de aminoácido que não foram manipulados in vitro, isto é, não foram isolados, purificados, amplificados e/ou recombinados de nenhuma maneira.
[036] Feruloil-CoA:monolignol transferases (FMTs) constituem um tipo de aciltransferase BAHD. Feruloil-CoA:monolignol transferases têm a atividade de catalisar a acilação de qualquer um ou mais de três monolignóis (por exemplo, álcool p-coumarílico, álcool coniferílico, e/ou álcool sinapílico) com feruloil-CoA para gerar qualquer um ou mais de três monolignol ferulatos (por exemplo, p-coumaril ferulato, coniferil ferulato, e/ou sinapil ferulato). Um exemplo de uma destas reações é mostrado a seguir:
[037] Feruloil-CoA:monolignol transferases exemplares são descritas em Pedido US 62/481.281, Patente US 9.441.235, Patente US 9.487.794, Patente US 9.493.783, Publicação US 2015/0020234A1, Publicação US 2015/0307892A1, WO 2012/012698A1, WO 2012/012741A1, e WO 2013/052660A1. Os termos “feruloil- CoA:monolignol transferase(s)”, “feruloil-CoA monolignol transferase(s)”, e “monolignol ferulato transferase(s)” são aqui usados intercambiavelmente.
[038] Feruloil-CoA:monolignol transferases habilitam a produção de vegetais com lignina que é prontamente clivada e/ou removida, por exemplo, em virtude de a lignina nestes vegetais conter monolignol ferulatos, tal como coniferil ferulato (CAFA). Veja Karlen, S.D.; Zhang, C.; Peck, M.L.; Smith, R.A.; Padmakshan, D.; Helmich, K.E.; Free, H.C.A.; Lee, S.; Smith, B.G.; Lu, F.; Sedbrook, J.C.; Sibout, R.; Grabber, J.H.; Runge, T.M.; Mysore, K.S.; Harris, P.J.; Bartley, L.E.; Ralph, J. (2016) Monolignol ferulate conjugates are naturally incorporated into vegetal lignins. Science Advances, 2(10):e1600393.
[039] As p-Coumaroil-CoA:monolignol transferases (PMTs) constituem um outro tipo de aciltransferase BAHD. As p-Coumaroil-CoA:monolignol transferases têm a atividade de catalisar a acilação de qualquer um ou mais de três monolignóis (por exemplo, álcool p-coumarílico, álcool coniferílico, e/ou álcool sinapílico) com p- coumaroil-CoA para gerar qualquer um ou mais de três monolignol p-coumaratos (por exemplo, p-coumaril p-coumarato, coniferil p-coumarato, e/ou sinapil p-coumarato). Os exemplos destas reações são mostrados a seguir:
[040] As p-coumaroil-CoA:monolignol transferases exemplares são descritas em Publicação US 2018/0298353 e Publicação US 2016/0046955. Os termos “p- coumaroil-CoA:monolignol transferase(s)”, “p-coumaroil-CoA monolignol transferase(s)”, e “monolignol p-coumarato transferases” são aqui usados intercambiavelmente.
[041] As p-Hidroxibenzoil-CoA:monolignol transferases (pBMTs) constituem um outro tipo de aciltransferase BAHD. As p-Hidroxibenzoil-CoA:monolignol transferases têm a atividade de catalisar a acilação de qualquer um ou mais de três monolignóis (por exemplo, álcool p-coumarílico, álcool coniferílico, e/ou álcool sinapílico) com p- hidroxibenzoil-CoA (4-hidroxibenzoil-CoA) para gerar qualquer um ou mais de três monolignol p-hidroxibenzoatos (por exemplo, p-coumaril p-hidroxibenzoato, coniferil p-hidroxibenzoato, e/ou sinapil p-hidroxibenzoato). Os termos “p-hidroxibenzoil- CoA:monolignol transferase(s)”, “p-hidroxibenzoil-CoA monolignol transferase(s)”, e “monolignol p-hidroxibenzoato transferases” são aqui usados intercambiavelmente.
[042] As benzoil-CoA:monolignol transferases (BMTs) constituem um outro tipo de aciltransferase BAHD. As benzoil-CoA:monolignol transferases têm a atividade de catalisar a acilação de qualquer um ou mais de três monolignóis (por exemplo, álcool p-coumarílico, álcool coniferílico, e/ou álcool sinapílico) com benzoil-CoA para gerar qualquer um ou mais de três monolignol benzoatos (por exemplo, p-coumaril benzoato, coniferil benzoato, e/ou sinapil benzoato). Os termos “benzoil- CoA:monolignol transferase(s)”, “benzoil-CoA monolignol transferase(s)”, e “monolignol benzoato transferases” são aqui usados intercambiavelmente.
[043] As acetil-CoA:monolignol transferases (AMTs) constituem um outro tipo de aciltransferase BAHD. As acetil-CoA:monolignol transferases têm a atividade de catalisar a acilação de qualquer um ou mais de três monolignóis (por exemplo, álcool p-coumarílico, álcool coniferílico, e/ou álcool sinapílico) com acetil-CoA para gerar qualquer um ou mais de três monolignol acetatos (por exemplo, p-coumaril acetato, coniferil acetato, e/ou sinapil acetato). Os termos “acetil-CoA:monolignol transferase(s)”, “acetil-CoA monolignol transferase(s)”, e “monolignol acetato transferases” são aqui usados intercambiavelmente.
[044] Os vários tipos de aciltransferases BAHD não são mutuamente exclusivos uns dos outros. Assim, uma enzima pode ser tanto um FMT quanto um PMT se a enzima tiver atividade tanto de FMT quanto de PMT.
[045] O termo “conjugado de monolignol éster” é aqui usado para se referir a um composto ou fração compreendendo um grupo monolignol conjugado a um grupo éster. Os grupos monolignol exemplares incluem grupos p-coumaril, coniferil, e sinapil. Grupos éster exemplares incluem grupos ferulato, p-coumarato, p-hidroxibenzoato, benzoato, e acetato. Conjugados de monolignol éster exemplares incluem monolignol ferulatos, monolignol p-coumaratos, monolignol p-hidroxibenzoatos, monolignol benzoatos, e monolignol acetatos. Monolignol ferulatos exemplares incluem p- coumaril ferulato, coniferil ferulato, e sinapil ferulato. Monolignol p-coumaratos exemplares incluem p-coumaril p-coumarato, coniferil p-coumarato, e sinapil p- coumarato. Monolignol p-hidroxibenzoatos exemplares incluem p-coumaril p- hidroxibenzoato, coniferil p-hidroxibenzoato, e sinapil p-hidroxibenzoato. Monolignol benzoatos exemplares incluem p-coumaril benzoato, coniferil benzoato, e sinapil benzoato. Monolignol acetatos exemplares incluem p-coumaril acetato, coniferil acetato, e/ou sinapil acetato.
[046] Uma aciltransferase BAHD exemplar da invenção é aqui referida como “XMT1”. XMT1 tem atividade de pBMT, FMT, PMT, AMT, e BMT. Uma sequência de codificação exemplar para XMT1 compreende SEQ ID NO:1:
TTATGGAGAGATTTGCAATACTATTAGAGGAATTGGCAAGGCATGACCCAGAAA GAAGCCAAGAACAACAAGAAATGATACCAAGCTCCCTATAA (SEQ ID NO:1)
[047] XMT1 compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2:
GPPKAMPDEISMAGTYFLPYRFKNGERGVMLLVSLRAPVMERFAILLEELARHDPE RSQEQQEMIPSSL (SEQ ID NO:2)
[048] Uma outra aciltransferase BAHD exemplar da invenção é aqui referida como “XMT2”. XMT2 tem atividade de pBMT, AMT e BMT. Uma sequência de codificação exemplar para XMT2 compreende SEQ ID NO:3:
TTATGGAGAGATTTGCAATACTATTAGAGGAATTGGCAAGGCATGACCCAGAAA GAAGCCAAGAACAACAAGAAATGATACCAAGCTCCCTATAA (SEQ ID NO:3)
[049] XMT2 compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:4:
PKAMPDEISIAGTYFLPYRFKNGERGVMLLVSLRAPVMERFAILLEELARHDPERSQ EQQEMIPSSL (SEQ ID NO:4)
[050] Uma outra aciltransferase BAHD exemplar da invenção é aqui referida como “XMT3”. XMT3 tem atividade de pBMT, AMT e BMT. Uma sequência de codificação exemplar para XMT3 compreende SEQ ID NO:5:
TGGAGAGATTTGCAATACTATTAGAGGAATTGGCAAGGCATGACCCAGAAAGAA GCCAAGAACAACAAGAAATGATACCAAGCTCCCTATAA (SEQ ID NO:5)
[051] XMT3 compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:6:
PKAMPDEISIAGTYFLPYRFKNGERGVMLLVSLRAPVMERFAILLEELARHDPERSQ EQQEMIPSSL (SEQ ID NO:6)
[052] Uma outra aciltransferase BAHD exemplar da invenção é aqui referida como “XMT4”. XMT4 tem atividade de FMT, PMT e BMT. Uma sequência de codificação exemplar para XMT4 compreende SEQ ID NO:7:
TATGGAGAGATTTGCAATACTATTAGAGGAATTGGCAAGGCATGACCCAGAAAG AAGCCAAGGACAACAAGAAATGATACCAAGCTCCCTATAA (SEQ ID NO:7)
[053] XMT4 compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:8:
YSGPPKAMPDEISIAGTFVLPYRFKNGERGVMVLVSLRAPVMERFAILLEELARHDP ERSQGQQEMIPSSL (SEQ ID NO:8)
[054] Uma aciltransferase BAHD putativa é aqui referida como “XMT5”. Uma sequência de codificação exemplar para XMT5 compreende SEQ ID NO:9:
AGAGATTTGCAGTCCTCTTAGAGGAATTGGCAAGGAATGATCCAGAAAGAAGCC AAGGACAACAAGAAATGATACTAAGCTCCCTTTAA (SEQ ID NO:9)
[055] XMT5 compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:10:
KAMPDEISIAGTYFLPYRFKNGERGVMLLVSLRAPVMERFAVLLEELARNDPERSQ GQQEMILSSL (SEQ ID NO:10)
[056] Uma outra aciltransferase BAHD exemplar da invenção é aqui referida como “XMT6”. XMT6 tem atividade de pBMT. Uma sequência de codificação exemplar para XMT6 compreende SEQ ID NO:11:
CAGATAGTGGTCCAGCACAACACCACACTACTCTCCCTATAAGACACAGGCTTT GA (SEQ ID NO:11)
[057] XMT6 compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:12:
PDDINNSGTYYLPYRNKKGERGVMVLISLRAPVMARFAMLFEELTKHDPDSGPAQH HTTLPIRHRL (SEQ ID NO:12)
[058] Uma outra aciltransferase BAHD exemplar da invenção é aqui referida como “XMT7”. XMT7 tem atividade de FMT e de PMT. Uma sequência de codificação exemplar para XMT7 compreende SEQ ID NO:13:
AATTCTCTTCCTTTCTCATGGGATTGAGAGGAAAAACATAAACGTTCTCGTAGGC CTGCCAGCTTCTTCCATGAAGATATTTGAAGAACTAATGCAGATTTGA (SEQ ID NO:13)
[059] XMT7 compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:14:
YMRSAIDYFEVTRARPSLTATLLITTWSRLSFHTTDFGWGVPILSGPVALPEKEVILFL SHGIERKNINVLVGLPASSMKIFEELMQI (SEQ ID NO:14)
[060] Uma outra aciltransferase BAHD exemplar da invenção é aqui referida como “XMT8”. XMT8 tem atividade de FMT e de PMT. Uma sequência de codificação exemplar para XMT8 compreende SEQ ID NO:15:
AAAGAGAGAAAAAGCATAAATGTGCTTCTGGGTCTGCCAGCTTTAGCCATGAAG ACCTTCCAAGAAATGATACAGATTTAG (SEQ ID NO:15)
[061] XMT8 compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:16:
VQDAIKMVTDSYMRSAMDYFEATRVRPSLASTLLITTWSRLSFYTTDFGWGEPVLS GPVALPEKEVILFLSHGKERKSINVLLGLPALAMKTFQEMIQI (SEQ ID NO:16)
[062] Uma outra aciltransferase BAHD exemplar da invenção é aqui referida como “XMT9”. XMT9 tem atividade de FMT. Uma sequência de codificação exemplar para XMT9 compreende SEQ ID NO:17:
TAATGCTTCTGTAA (SEQ ID NO:17)
[063] XMT9 compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:18:
QNGIKMVNEEFVRSWIDYLEVMGAKDFPLHSYFKVSSWTRLSIECSDFGWGEPAQ FACTNLPKNSAFFLPDGKEKKGINLILDLPVTAMSTFQELMLL (SEQ ID NO:18)
[064] Ácidos nucleicos que codificam as supramencionadas aciltransferases BAHD permitem a identificação e o isolamento de ácidos nucleicos relacionados e suas enzimas codificadas que proveem um meio para a produção de ligninas alteradas em vegetais.
[065] Por exemplo, ácidos nucleicos relacionados podem ser isolados e identificados pela mutação da sequência SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17 e/ou pela hibridização em DNA e/ou RNA isolados a partir de outra espécie de vegetal usando ácidos nucleicos SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17 como sondas. A sequência da enzima aciltransferase BAHD (por exemplo, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18) também pode ser examinada e usada como uma base para desenhar ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD alternativos que codificam polipeptídeos da aciltransferase BAHD relacionados.
[066] Em uma modalidade, os ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD da invenção incluem qualquer ácido nucleico que pode hibridizar seletivamente em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17.
[067] O termo “hibridizar seletivamente” inclui hibridização, sob condições de hibridização rigorosas, de uma sequência de ácido nucleico em uma sequência alvo de ácido nucleico especificada (por exemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17) em um grau detectavelmente maior (por exemplo, pelo menos 2 vezes em relação à base) do que sua hibridização em sequências de ácido nucleico não alvos. Tal hibridização seletiva exclui substancialmente ácidos nucleicos não alvos. As sequências de hibridização seletiva têm tipicamente cerca de pelo menos 40% de identidade de sequência, ou pelo menos 50% de identidade de sequência, ou pelo menos 60% de identidade de sequência, ou pelo menos 70% de identidade de sequência, ou 60-99% de identidade de sequência, ou 70-99% de identidade de sequência, ou 80-99% de identidade de sequência, ou 90-95% de identidade de sequência, ou 90-99% de identidade de sequência, ou 95-97% de identidade de sequência, ou 97-99% de identidade de sequência, ou 100% de identidade (ou complementariedade) de sequência umas com as outras. Em algumas modalidades, uma sequência de hibridização seletiva tem pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 80% de identidade ou complementariedade de sequência com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17.
[068] Assim, os ácidos nucleicos da invenção incluem aqueles com cerca de 500 dos mesmos nucleotídeos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17, ou cerca de 600 dos mesmos nucleotídeos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17, ou cerca de 700 dos mesmos nucleotídeos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17, ou cerca de 800 dos mesmos nucleotídeos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17, ou cerca de 900 dos mesmos nucleotídeos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ
ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17, ou cerca de 1.000 dos mesmos nucleotídeos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17, ou cerca de 1.100 dos mesmos nucleotídeos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17, ou cerca de 1.200 dos mesmos nucleotídeos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17, ou cerca de 1.300 dos mesmos nucleotídeos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17, ou cerca de 500-1.325 dos mesmos nucleotídeos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17. Os nucleotídeos ou aminoácidos idênticos podem ser distribuídos por todo o ácido nucleico ou a proteína, e não precisa ser contíguo.
[069] Note que se um valor de uma variável que é necessariamente um número inteiro, por exemplo, o número de nucleotídeos ou aminoácidos em um ácido nucleico ou proteína, for descrito como uma faixa, por exemplo, 90-99% de identidade de sequência, o que entende-se é que o valor pode ser qualquer número inteiro entre 90 e 99 inclusive, isto é, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, ou qualquer faixa entre 90 e 99 inclusive, por exemplo, 91-99%, 91-98%, 92-99%, etc.
[070] Os termos “condições rigorosas” ou “condições de hibridização rigorosas” incluem condições sob as quais uma sonda irá hibridizar em sua sequência alvo em um grau detectavelmente maior do que outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes em relação à base). As condições rigorosas são um tanto dependentes da sequência e podem variar em diferentes circunstâncias. Pelo controle do rigor das condições de hibridização e/ou de lavagem, as sequências alvos podem ser identificadas com até 100% de complementariedade em relação à sonda (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de rigor podem ser ajustadas para permitir alguma divergência nas sequências de forma que graus mais baixos de similaridade da sequência sejam detectados (sondagem heteróloga). A sonda pode ter aproximadamente 20-500 nucleotídeos de comprimento, mas pode variar enormemente no comprimento de cerca de 18 nucleotídeos até igual à íntegra do comprimento da sequência alvo. Em algumas modalidades, a sonda tem cerca de 10- 50 nucleotídeos de comprimento, ou cerca de 18-25 nucleotídeos de comprimento, ou cerca de 18-50 nucleotídeos de comprimento, ou cerca de 18-100 nucleotídeos de comprimento.
[071] Tipicamente, as condições rigorosas serão aquelas em que a concentração de sal é menor do que cerca de 1,5 M íon de Na (ou outros sais), tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração do íon de Na (ou outros sais), em pH 7,0 até 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30 °C para sondas mais curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas mais longas (por exemplo, maiores do que 50 nucleotídeos). As condições rigorosas também podem ser alcançadas com a adição de agentes de desestabilização, tais como formamida ou solução de Denhardt. Condições de baixo rigor exemplares incluem hibridização com uma solução de tampão de 30 a 35% formamida, 1M NaCl, 1% SDS (dodecil sulfato de sódio) em 37 °C, e uma lavagem em 1 x SSC até 2 x SSC (em que 20 x SSC é 3,0 M NaCl, 0,3 M citrato de trissódio) em 50 a 55 °C. Condições de rigor moderado exemplares incluem hibridização em 40 a 45% formamida, 1M NaCl, 1% SDS em 37 °C, e uma lavagem em 0,5 x SSC a 1 x SSC em 55 a 60 °C. Condições de alto rigor exemplares incluem hibridização em 50% formamida, 1M NaCl, 1% SDS em 37 °C, e uma lavagem em 0,1 x SSC em 60 a 65 °C. Especificidade é tipicamente em função das lavagens pós-hibridização, em que os fatores que controlam a hibridização incluem a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final.
[072] Para os híbridos DNA-DNA, o Tm pode ser aproximado da equação de Meinkoth e Wahl (Anal. Biochem. 138:267-284 (1984)): Tm = 81,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (% GC) - 0,61 (% formamida) - 500/L em que M é a molaridade de cátions monovalentes; % GC é o percentual de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % formamida é o percentual de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de base. O Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma sequência alvo complementar hibridiza em uma sonda perfeitamente combinada. A Tm é reduzida em cerca de 1 °C para cada 1% de divergência. Assim, a Tm, condições de hibridização e/ou de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar nas sequências da identidade de sequência desejada. Por exemplo, se as sequências com identidade de sequência maior do que ou igual a 90% forem buscadas, a Tm pode diminuir 10 °C. No geral, as condições rigorosas são selecionadas para ser cerca de 5 °C mais baixa do que o ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica e seu complemento em uma força iônica e um pH definidos. Entretanto, condições severamente rigorosas podem incluir hibridização e/ou uma lavagem em 1, 2, 3 ou 4 °C mais baixo do que o ponto de fusão térmico (Tm). Condições moderadamente rigorosas podem incluir hibridização e/ou uma lavagem em 6, 7, 8, 9 ou 10 °C mais baixo do que o ponto de fusão térmico (Tm). As condições de baixo rigor podem incluir hibridização e/ou uma lavagem em 11, 12, 13, 14, 15 ou 20 °C mais baixo do que o ponto de fusão térmico (Tm). Usando a equação, as composições de hibridização e lavagem, e uma T m desejada, os versados na técnica podem identificar e isolar ácidos nucleicos com sequências relacionadas a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17.
[073] Os versados na técnica entendem como variar as soluções de hibridização e/ou de lavagem para isolar ácidos nucleicos desejáveis. Por exemplo, se o desejado grau de divergência resultar em um Tm de menos do que 45 °C (solução aquosa) ou 32 °C (solução de formamida), é preferido aumentar a concentração de SSC de forma que uma temperatura mais alta possa ser usada.
[074] Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen, LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY – HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, part 1, chapter 2, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”, Elsevier, N.Y. (1993); e em CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, chapter 2, Ausubel, et al., eds, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995).
[075] A menos que de outra forma declarado, no presente pedido, alto rigor é definido como hibridização em 4 x SSC, 5 x Denhardt (5 g Ficoll, 5 g de polivinilpirrolidona, 5 g de albumina sérica bovina em 500 mL de água), 0,1 mg/mL DNA de esperma de salmão fervido, e 25 mM fosfato de Na em 65 °C, e uma lavagem em 0,1 x SSC, 0,1% SDS em 65 °C.
[076] Os seguintes termos são usados para descrever os relacionamentos de sequência entre dois ou mais ácidos nucleicos ou ácidos nucleicos ou polipeptídeos: (a) “sequência de referência”, (b) “janela de comparação”, (c) “identidade de sequência”, (d) “percentual de identidade de sequência”, e (e) “identidade substancial”.
[077] Da forma aqui usada, “sequência de referência” é uma sequência definida usada como uma base para a comparação de sequência. A sequência de referência pode ser uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17) ou uma sequência de aminoácido (por exemplo, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18). Uma sequência de referência pode ser um subconjunto ou a íntegra de uma sequência especificada. Por exemplo, uma sequência de referência pode ser um segmento de um cDNA de comprimento completo ou de uma sequência de DNA genômico, ou o cDNA completo ou a sequência de DNA genômico completa, ou um domínio de uma sequência do polipeptídeo.
[078] Da forma aqui usada, a “janela de comparação” se refere a um segmento contíguo e especificado de um ácido nucleico ou uma sequência de aminoácido, em que o ácido nucleico/a sequência de aminoácido podem ser comparados com uma sequência de referência e em que a parte do ácido nucleico/da sequência de aminoácido na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, hiatos) comparadas com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para o alinhamento ideal das duas sequências. A janela de comparação pode variar para as sequências de ácido nucleico e de polipeptídeo. No geral, para ácidos nucleicos, a janela de comparação tem pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de comprimento e, opcionalmente, pode ter 30, 40, 50, 100 ou mais nucleotídeos. Para as sequências de aminoácido, a janela de comparação tem pelo menos cerca de 10 aminoácidos, e pode ser opcionalmente 15, 20, 30, 40, 50, 100 ou mais aminoácidos. Os versados na técnica entendem que, para evitar uma alta similaridade com uma sequência de referência devido à inclusão de hiatos no ácido nucleico ou na sequência de aminoácido, uma penalidade de hiato é tipicamente introduzida e é subtraída do número de combinações.
[079] Os métodos de alinhamento de nucleotídeo e sequências de aminoácido para comparação são bem conhecidos na tecnologia. O algoritmo de homologia local (BESTFIT) de Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math 2:482, pode permitir o alinhamento ideal das sequências comparadas; pelo algoritmo de alinhamento de homologia (GAP) de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; pelo método de busca por similaridade (Tfasta e Fasta) de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444; por implementações computadorizadas destes algoritmos, incluindo, mas sem limitações: CLUSTAL no programa PC/Gene por Intelligenetics, Mountain View, Califórnia, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no Pacote de Software Wisconsin Genetics, Versão 8 (disponível por Genetics Computer Group (programas GCG™ (Accelrys, Inc., San Diego, Califórnia)). O programa CLUSTAL é bem descrito por Higgins e Sharp (1988) Gene 73:237-244; Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet, et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-10890; Huang, et al. (1992) Computer Applications in the Biosciences 8:155- 165; e Pearson, et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. Um exemplo de um bom programa a usar para o alinhamento global ideal de múltiplas sequências é PileUp (Feng and Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 25:351-260, que é similar ao método descrito por Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153 (e é, pelo presente, incorporado pela referência). A família de programas BLAST que pode ser usada para buscas de similaridade em base de dados inclui: BLASTN para sequências de consulta de nucleotídeo contra sequências da base de dados de nucleotídeo; BLASTX para sequências de consulta de nucleotídeo contra sequências de base de dados de proteína; BLASTP para sequências de consulta de proteína contra sequências de base de dados de proteína; TBLASTN para sequências de consulta de proteína contra sequências da base de dados de nucleotídeo; e TBLASTX para sequências de consulta de nucleotídeo contra sequências da base de dados de nucleotídeo. Veja, Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, et al., eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995). Uma versão atualizada da família de programas BLAST inclui o BLAST+ suite. (Camacho, C., Coulouris, G., Avagyan, V., Ma, N, Papadopoulos J, Bealer K, Madden TL. (2009 Dec 15) BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics 10:421).
[080] GAP usa o algoritmo de Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-53, para encontrar o alinhamento de duas sequências completas que maximizam o número de combinações e minimizam o número de hiatos. GAP considera todos os possíveis alinhamentos e posições de hiato e cria o alinhamento com o maior número de bases combinadas e o mínimo de hiatos. O mesmo permite a provisão de uma penalidade de criação de hiato e uma penalidade de extensão de hiato em unidades de bases combinadas. GAP faz um proveito do número de penalidade de criação de hiato das combinações para cada hiato que o mesmo insere. Se uma penalidade de extensão de hiato maior do que zero for escolhida, GAP deve, além do mais, fazer um proveito para cada hiato inserido do comprimento dos tempos de hiato da penalidade de extensão de hiato. Os valores da penalidade de criação de hiato e os valores da penalidade de extensão de hiato padrões na Versão 10 do Pacote de Software Wisconsin Genetics são 8 e 2, respectivamente. As penalidades de criação de hiato e de extensão de hiato podem ser expressadas como um número inteiro selecionado a partir do grupo de números inteiros consistindo de 0 a 100. Assim, por exemplo, as penalidades de criação de hiato e de extensão de hiato podem ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 ou mais.
[081] GAP apresenta um membro da família dos melhores alinhamentos. Pode haver muitos membros desta família. GAP exibe quatro coeficientes de mérito para alinhamentos: Qualidade, Razão, Identidade e Similaridade. A Qualidade é a métrica maximizada a fim de alinhar as sequências. A Razão é a qualidade dividida pelo número de bases no segmento mais curto. Identidade Percentual é o percentual dos símbolos que realmente combinam. A Similaridade Percentual é o percentual dos símbolos que são similares. Os Símbolos que estão através dos hiatos são ignorados. Uma similaridade é pontuada quando o valor da matriz de pontuação para um par de símbolos for maior do que ou igual a 0,50, o limite de similaridade. A matriz de pontuação usada na Versão 10 do Pacote de Software Wisconsin Genetics é BLOSUM62 (veja: Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).
[082] Os valores de identidade/similaridade de sequência aqui providos podem se referir ao valor obtido usando o suite de programas BLAST+ 2.5.0 usando definições padrões (blast.ncbi.nlm.nih.gov) (Camacho, C., Coulouris, G., Avagyan, V., Ma, N, Papadopoulos J, Bealer K, Madden TL. (2009) BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics 10:421).
[083] Como os versados na técnica irão entender, as buscas BLAST consideram que as proteínas podem ser modeladas como sequências aleatórias. Entretanto, muitas proteínas reais compreendem regiões de sequências não aleatórias, que podem ser tratos homopoliméricos, repetições de período curto, ou regiões enriquecidas em um ou mais aminoácidos. Tais regiões de baixa complexidade podem ser alinhadas entre proteínas não relacionadas mesmo embora outras regiões da proteína sejam integralmente dissimilares. Inúmeros programas de filtro de baixa complexidade podem ser empregados para reduzir tais alinhamentos de baixa complexidade. Por exemplo, os filtros de baixa complexidade SEG (Wooten and Federhen, (1993) Comput. Chem. 17:149-63) e XNU (C1-ayerie and States (1993) Comput. Chem. 17:191-201) podem ser empregados individualmente ou em combinação.
[084] Os termos “identidade substancial” e “substancialmente idêntico” indicam que um polipeptídeo ou um ácido nucleico compreendem uma sequência com entre 55-100% de identidade de sequência em relação a uma sequência de referência, com pelo menos 55% de identidade de sequência, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 65%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 75%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência ou qualquer percentual de valor na faixa de 55-100% de identidade de sequência em relação à sequência de referência. A identidade de sequência percentual pode ocorrer sobre uma janela de comparação especificada. O alinhamento ideal pode ser certificado ou conduzido usando o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, supra.
[085] Uma indicação de que duas sequências de polipeptídeo são substancialmente idênticas é que ambos os polipeptídeos têm pelo menos uma atividade de aciltransferase BAHD (por exemplo, atividade de pBMT, FMT, PMT, AMT, e/ou BMT). O polipeptídeo que é substancialmente idêntico a uma aciltransferase BAHD com uma sequência SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18 pode não ter exatamente o mesmo nível de uma dada atividade como a aciltransferase BAHD com um SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18. Em vez disto, o polipeptídeo substancialmente idêntico pode exibir maiores ou menores níveis de uma dada atividade de aciltransferase BAHD do que a aciltransferase BAHD com SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18, medida pelo ensaio disponível na tecnologia ou aqui descrito. Por exemplo, o polipeptídeo substancialmente idêntico pode ter pelo menos cerca de 40%, ou pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 100%, ou pelo menos cerca de 105%, ou pelo menos cerca de 110%, ou pelo menos cerca de 120%, ou pelo menos cerca de 130%, ou pelo menos cerca de 140%, ou pelo menos cerca de 150%, ou pelo menos cerca de 200% de uma dada atividade da aciltransferase BAHD com a sequência SEQ ID NO:2,
SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18 quando medida por procedimentos de ensaio similares.
[086] O polipeptídeo que é substancialmente idêntico a uma aciltransferase BAHD com uma sequência SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18 também pode não ter exatamente o mesmo tipo da atividade de aciltransferase BAHD que a aciltransferase BAHD com um SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18. Em vez disto, o polipeptídeo substancialmente idêntico pode exibir uma atividade de aciltransferase BAHD diferente da atividade de aciltransferase BAHD ou atividades da aciltransferase BAHD com SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18. Assim, um polipeptídeo que é substancialmente idêntico a uma aciltransferase BAHD com atividade de FMT e nenhuma atividade de pBMT pode ter atividade de pBMT e nenhuma atividade de FMT.
[087] Uma outra indicação de que duas sequências de polipeptídeo são substancialmente idênticas é quando um segundo polipeptídeo for imunologicamente reativo com anticorpos cultivados contra um primeiro polipeptídeo (por exemplo, um polipeptídeo com SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18). Assim, um polipeptídeo é substancialmente idêntico a um primeiro polipeptídeo, por exemplo, quando os dois polipeptídeos diferirem apenas por uma substituição conservadora. Além do mais, um polipeptídeo pode ser substancialmente idêntico a um primeiro polipeptídeo quando os mesmos diferirem por uma mudança não conservadora se o epítopo que o anticorpo reconhece for substancialmente idêntico. Os polipeptídeos que são “substancialmente similares” compartilham sequências da forma notada anteriormente, exceto em que algumas posições de resíduo, que não são idênticas, podem diferir por mudanças de aminoácido conservadoras.
[088] Da forma aqui usada, “substituição conservadora” se refere a uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma dada posição entre duas sequências alinhadas com uma variante conservadora. As variantes conservadoras são resíduos que são funcionalmente similares. Os aminoácidos nos seguintes grupos são variantes conservadoras uns dos outros: glicina, alanina, serina, e prolina (muito pequena); alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, valina, prolina, e glicina (hidrofóbica); alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina (tipo alifático); cisteína, serina, treonina, asparagina, tirosina, e glutamina (polar); fenilalanina, triptofano, tirosina (aromática); lisina, arginina, e histidina (básica); aspartato e glutamato (ácido); alanina e glicina; asparagina e glutamina; arginina e lisina; isoleucina, leucina, metionina, e valina; e serina e treonina.
[089] Os polipeptídeos da aciltransferase BAHD da presente invenção podem incluir os primeiros 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 e 99 resíduos de aminoácido N terminal da sequência SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18. Alternativamente, os polipeptídeos da aciltransferase BAHD da presente invenção podem incluir os primeiros 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 e 99 resíduos de aminoácido C terminal da sequência SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18.
[090] A lignina se refere amplamente a um biopolímero que é um componente principal das paredes celulares secundárias do vegetal. A lignina é um complexo polímero aromático moderadamente reticulado (veja, por exemplo, as figuras 1A-1D). A lignina também pode ser covalentemente ligada a hemiceluloses. A hemicelulose se refere amplamente a uma classe de polímeros de açúcar ramificados compostos de pentoses e hexoses. A hemiceluloses tem tipicamente uma estrutura amorfa com até centenas de unidades, e as mesmas são, no geral, pelo menos parcialmente solúveis em alcalino diluído. A celulose se refere amplamente a um composto orgânico com a fórmula (C6H10O5)z, em que z é um número inteiro. A celulose é um polissacarídeo linear que pode incluir encadeamentos lineares de resíduos de β-1-4- glicose ligados de diversas centenas até mais do que dez milhares de unidades.
[091] A biomassa lignocelulósica representa uma carga de alimentação abundante, econômica e localmente disponível para conversão em combustível carbonáceo (por exemplo, etanol, biodiesel, biocombustível e similares). Entretanto, a complexa estrutura de lignina, que inclui ligações de éter e carbono-carbono que ligam as várias subunidades de lignina, e a reticulação da lignina em outros polímeros de parede celular vegetal, torna a mesma o mais recalcitrante dos polímeros vegetais. Assim, quantidades significativas de lignina em uma biomassa podem inibir o uso eficiente de vegetais como uma fonte de combustíveis e outros produtos comerciais. Ganhar acesso aos polímeros de carboidrato e de polissacarídeo das células vegetais para uso como fontes de carbono e de energia, portanto, exige significativa entrada de energia e, frequentemente, agressivos tratamentos químicos, especialmente quando quantidades significativas de lignina estiverem presentes. Por exemplo, os procedimentos de fabricação de papel, em que a lignina é removida das fibras de vegetal por reações de delignificação, são tipicamente onerosos, podem ser poluentes, e, no geral, exigem o uso de altas temperaturas e produtos químicos agressivos amplamente em virtude de a estrutura da lignina ser impermeável a condições brandas. Os vegetais com estruturas de lignina alteradas que podem ser mais prontamente clivadas sob condições mais brandas irão reduzir os custos de fabricação de papel e tornar a produção de biocombustíveis mais competitiva com os procedimentos atualmente existentes para produção de combustíveis de óleo e gás.
[092] Os vegetais fazem a lignina a partir de uma variedade de subunidades ou monômeros que são, no geral, chamados monolignóis. Tais monolignóis primários incluem álcool p-coumarílico, álcool coniferílico, e álcool sinapílico.
[093] Os monolignóis destinados para a polimerização de lignina em vegetais normais podem ser pré-acilados com p-coumarato, ferulato, p-hidroxibenzoato, benzoato, ou acetato (Ralph et al. (2004) Phytochem. Rev. 3:29-60). Embora os papeis in planta de tais ésteres, diferentes de, talvez, para melhorada defesa, e a pressão da seleção que resultou na introdução de tais unidades na lignina em várias linhagens vegetais bem-sucedidas, sejam essencialmente desconhecidos, as várias linhas vegetais possuem tais ligninas com núcleo retirado que estão, em alguns casos, em níveis muito altos; as mesmas são, portanto, aparentemente valiosas para o vegetal e podem prover valor significativamente intensificado para o componente de lignina que é frequentemente um resíduo subutilizado em operações de biorrefinaria.
[094] Os p-coumaratos podem acilar a posição γ das cadeias laterais de fenilpropanóide, principalmente, nas unidades de siringil de lignina. Os estudos indicam que monolignóis, primariamente, álcool sinapílico, são enzimaticamente pré- acilados com p-coumarato antes de sua incorporação em lignina, indicando que os conjugados de monolignol p-coumarato, coniferil p-coumarato e sinapil p-coumarato, também podem ser precursores de ‘monômero’ da lignina.
[095] Embora as unidades derivadas de monolignol p-coumarato possam compreender até 40% da lignina em alguns tecidos de grama, a fração de p-coumarato proveniente de tais conjugados não entra significativamente nas reações de acoplamento (polimerização) de radical que ocorrem durante a lignificação. Em vez disto, as frações de p-coumarato permanecem substancialmente como unidades de terminal com uma cadeia lateral insaturada e um grupo fenólico livre (Ralph et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:9448-9456; Hatfield et al. (1999) J. Sci. Food Agric. 79:891-899). Assim, a presença de conjugados sinapil p-coumarato produz um ‘núcleo’ de lignina com grupos p-coumarato terminais e nenhuma nova ligação na cadeia principal do polímero de lignina.
[096] Independentemente, a biomassa lignocelulósica com lignina compreendendo uma proporção mais alta de conteúdo de p-coumarato é mais suscetível a pré-tratamento e sacarificação (hidrólise). O pré-tratamento da biomassa remove uma grande proporção da lignina e outros materiais da celulose e da hemicelulose e intensifica a porosidade da biomassa para hidrólise à jusante opcional. Vários pré-tratamentos de biomassa são bem conhecidos na tecnologia. Os pré- tratamentos exemplares incluem lascagem, trituração, moagem, pré-tratamento de vapor, expansão de fibra de amônia (AFEX, também referida como explosão de fibra de amônia), percolação de reciclagem de amônia (ARP), explosão de CO 2, explosão de vapor, ozonólise, oxidação úmida, hidrólise ácida, hidrólise ácida diluída, hidrólise alcalina, organosolv, pré-tratamento de amônia extrativa (EA), e tratamento de campo elétrico pulsado, entre outros. Veja, por exemplo, Kumar et al. 2009 (Kumar, P.; Barrett, D. M.; Delwiche, M. J.; Stroeve, P. (2009) Methods for Pretreatment of Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis and Biofuel Production. Industrial & Engineering Chemistry Research 48(8):3713-3729) e da Costa Sousa et al. 2016 (da Costa Sousa, L.; Jin, M.; Chundawat, S.P.S.; Bokade, V.; Tang, X.; Azarpira, A.; Lu, F.; Avci, F.; Humpula, J.; Uppugundla, N.; Gunawan, C.; Pattathil, S.; Cheh, A.M.; Kothari, N.; Kumar, N.; Ralph, J.; Hahn, M.G.; Wyman, C.E.; Singh, S.; Simmons, B.A.; Dale, B.E.; Balan, V. (2016) Next-Generation Ammonia Pretreatment Enhances Cellulosic Biofuel Production. Energy Environ. Sci. 9:1215-1223). A hidrólise converte polímeros de biomassa em açúcares fermentáveis, tais como glicose e xilose, e outros componentes monoméricos ou oligoméricos. Os métodos para hidrolisar biomassa, também conhecidos como sacarificação, são bem conhecidos na tecnologia. Os métodos de hidrólise exemplares incluem hidrólise enzimática (por exemplo, com celulases ou outras enzimas) e hidrólise ácida (por exemplo, com ácidos sulfuroso, sulfúrico, hidroclórico, hidrofluórico, fosfórico, nítrico, acético, e/ou fórmico), entre outros métodos. Assim, vegetais e biomassa com lignina compreendendo uma proporção mais alta do conteúdo de p-coumarato são mais adequados ao processamento para aplicações à jusante.
[097] Lignina compreendendo uma proporção mais alta de conteúdo de p- coumarato também tem uma proporção mais alta de unidades de p-coumarato pendentes, que podem ser clivadas a partir da lignina usando condições tipicamente empregadas para clivar as ligações de éster, descritas com detalhe adicionais a seguir. As unidades de p-coumarato clivadas podem ser recuperadas para uso à jusante.
[098] O p-coumarato (ou ácido p-coumárico), atualmente avaliado em ~$20/kg, tem algumas aplicações significativas, mas, em virtude de o mesmo não ter sido previamente disponível em quantidades a granel, suas aplicações foram limitadas. Isto pode mudar prontamente com a lignina enriquecida com p-coumarato provida com a presente invenção.
O p-coumarato tem inúmeros usos médicos/cosméticos.
Veja, por exemplo, a Publicação US 2007/0183996 A1, a Publicação US 2007/0183996 A1, a Patente US 8.481.593, a Patente US 9.089.499, a Publicação US 2007/0183996, a Publicação US 2011/0237551, e a Publicação US 2013/0272983). O p-Coumarato também tem um grande número de aplicações nas indústrias da saúde, alimentícia, farmacêutica e cosmética devido a suas funções fisiológicas em atividades antioxidante, antimutagênese, antigenotoxicidade, antimicrobiano, anti-inflamatória, antimelanogênese, e antitrombose.
Veja Ferguson et al. 2003 (Ferguson, L.R., Lim, I.F., Pearson, A.E., Ralph, J., e Harris, P.J. (2003) Bacteriano antimutagenesis by hydroxycinnamic acids from plant cell walls.
Mutation Research-Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 542(1-2):49-58), Ferguson et al. 2005 (Ferguson, L.R., Zhu, S.T., and Harris, P.J. (2005) Antioxidant and antigenotoxic effects of plant cell wall hydroxycinnamic acids in cultured HT-29 cells.
Molecular Nutrition & Food Research 49(6):585-593), Bodini et al. (Bodini, S.F., Manfredini, S., Epp, M., Valentini, S., and Santori, F. (2009) Quorum sensing inhibition activity of garlic extract and p- coumaric acid.
Lett Appl Microbiol 49(5):551-555), An et al. 2008 (An, S.M., Lee, S.I., Choi, S.W., Moon, S.W., e Boo, Y.C. (2008) p-Coumaric acid, a constituinte of Sasa quelpaertensis Nakai, inhibits cellular melanogenesis stimulated by alpha-melanocyte stimulating hormone.
Brit J Dermatol. 159(2):292-299), e Razzaghi-Asl et al. 2013 (Razzaghi-Asl, N., Garrido, J., Khazraei, H., Borges, F., e Firuzi, O. (2013) Antioxidant properties of hydroxycinnamic acids: A review of structure-activity relationships.
Current Medicinal Chemistry 20(36):4436-4450). O p-Coumarato também é usado como um precursor para os compostos orgânicos aromáticos naturais, incluindo ácido p-hidroxibenzóico e 4-vinilfenol, ou uma variedade de produtos químicos tipo commodity, incluindo cafeato (Nambudiri AM, Bhat JV. (1972 Nov) Conversion of p- coumarate into caffeate by Streptomyces nigrifaciens.
Purification and properties of the hydroxylating enzyme.
Biochem J. 130(2):425-33), fenóis voláteis (Cabrita MJ P V, Patao R, Freitas AMC. (2012) Conversion of hydroxycinnamic acids into volatile phenols in a synthetic medium and red wine by Dekkera bruxellensis. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas 32(1):106–111), e ainda outros. Uma variedade de derivados que são prontamente produzidos a partir de p-coumarato são descritos na Publicação US 2018/0298353, que é aqui incorporada em sua íntegra.
[099] O p-Coumarato também é um versátil e atrativo bloco de construção para a geração de inéditos materiais poliméricos sustentáveis. Os grupos funcionais fenólico e de ácido carboxílico permitem que estes blocos de construção sejam usados como monômeros em reações de polimerização em etapa e em cadeia (Upton, B.M., and Kasko, A.M., (2016) Strategies for the conversion of lignin to high-value polymeric materials: Review and perspective. Chemical Reviews 116(4):2275-2306). Os derivados foram usados para a síntese de poliésteres, em que os mesmos substituem dióis com base em óleo (Kaneko, T., Matsusaki, M., Hang, T.T., and Akashi, M. (2004) Thermotropic liquid-crystalline polymer derived from natural cinnamoyl biomonomers. Macromol Rapid Comm. 25(5):673-677; Nagata, M., and Hizakae, S. (2003) Synthesis and characterization of photocrosslinkable biodegradable polymers derived from 4-hydroxycinnamic acid. Macromol Biosci. 3(8):412-419). A polimerização térmica de ácido p-coumárico, por exemplo, fornece um polímero cristalino líquido que adota uma estrutura cristalina líquida nemática em temperaturas entre 215–280 °C (Kaneko, T., Matsusaki, M., Hang, T.T., and Akashi, M. (2004) Thermotropic liquid-crystalline polymer derived from natural cinnamoyl biomonomers. Macromol Rapid Comm. 25(5):673-677). A metacrilação de certos monômeros derivados da lignina proveu acesso a monômeros que podem ser polimerizados usando métodos de polimerização de radical livre convencionais, bem como por meio de várias técnicas de polimerização de radical controladas, incluindo polimerização de radical por transferência atômica (ATRP) e polimerização por transferência de cadeia de fragmentação com adição reversível (RAFT) (Holmberg, A.L., Reno, K.H., Nguyen, N.A., Wool, R.P., e Epps, T.H. 3rd. (2016) Syringyl methacrylate, a hardwood lignin-based monomer for high-Tg polymeric materials. ACS Macro Letters 5(5):574-578).
[0100] Ao contrário de p-coumarato, os ésteres de ferulato passam por reações de acoplamento de radical sob condições de lignificação. Os ferulatos modelos, tal como o ferulato mostrado a seguir (em que R é CH3-, CH3-CH2-, um açúcar, um polissacarídeo, pectina, (arabino)xilano de parede celular ou outro componente vegetal), passam prontamente por reações de acoplamento de radical uns com os outros e com monômeros e oligômeros de lignina para formar redes reticuladas.
[0101] Se presentes durante a lignificação, ferulatos podem se tornar inextricavelmente ligados na lignina ligações de éter e C–C. Embora tais frações de ferulato sejam não mais extraíveis ou cliváveis a partir da estrutura de lignina do que outras unidades de lignina sob a maioria das condições, o próprio éster pode ser prontamente clivado usando as condições no geral empregadas para a clivagem de éster. Mediante a clivagem de tais ligações de éster, a delignificação é alcançada sob condições mais brandas, e outros componentes de parede celular vegetal podem ser liberados. Por exemplo, uma cadeia de arabinoxilano (hemicelulose) pode ser liberada a partir de uma anexação de lignina mediada por ferulato pela clivagem do éster.
[0102] Os conjugados de ferulato-monolignol éster, tais como coniferil ferulato ou sinapil ferulato, são feitos por vegetais como metabólitos secundários durante, entre outras coisas, a biossíntese de lignina. [Paula et al. (1994) Tetrahedron 51:12453- 12462; Seca et al. (2001) Phytochemistry 56:759-767; Hsiao & Chiang, (1995)
Phytochemistry 39:899-902; Li et al. (2005) Planta Med. 72:278-280]. As estruturas de coniferil ferulato e sinapil ferulato são mostradas a seguir.
[0103] Feruloil-CoA:monolignol transferases biossintetizam coniferil ferulato a partir de álcool coniferílico e feruloil-CoA da forma mostrada a seguir.
[0104] A incorporação de monolignol ferulatos na lignina de vegetais permite que os materiais da parede celular e a lignina sejam prontamente clivados ou processados em produtos úteis. Veja também, Patente US 9.441.235, Patente US 9.487.794, e Patente US 9.493.783, dos quais, todos os conteúdos são aqui especificamente incorporados pela referência em suas íntegras.
[0105] Os monolignol ferulatos feitos por feruloil-CoA:monolignol transferases podem ser incorporados pelo acoplamento de radical nas ligninas vegetais. As frações tanto do monolignol quanto do ferulato podem passar por tal acoplamento, resultando em uma lignina que pode ser complexa. Entretanto, tal ‘incorporação de terminação dupla’ ainda produz ligações de éster prontamente cliváveis que foram engenheiradas na cadeia principal da rede do polímero de lignina. Os ésteres são prontamente clivados sob condições muito menos rigorosas pelos mesmos processos químicos usados para clivar lignina, mas a lignina resultante dos métodos aqui descritos é significativamente mais fácil de clivar e provê acesso mais fácil e menos oneroso aos polissacarídeos da parede celular vegetal. Veja também Patente US 9.441.235, Patente US 9.487.794, e Patente US 9.493.783, dos quais, todos os conteúdos são especificamente aqui incorporados pela referência em suas íntegras.
[0106] É conhecido relativamente pouco sobre a natureza de ligninas p- hidroxibenzoiladas ou como as mesmas surgem. Como com a identificação de ácidos hidroxicinâmicos ligados em lignina (ácido p-coumárico e ácido ferúlico), a associação de p-hidroxibenzoato em lignina foi estabelecida há muito tempo (Smith, D.C.C. (1955a) Ester groups in lignin. Nature 176:267-268; Smith, D.C.C. (1955b) p- Hydroxybenzoates groups in the lignin of Aspen (Populus tremula). Journal of the Chemical Society 2347) em madeiras duras eudicotiledôneas, tais como álamo, salgueiro, e álamo tremedor, e apenas algumas monocotiledôneas, tais como palmeiras. Apenas recentemente foi determinado que as unidades de p- hidroxibenzoato são incorporadas no polímero de lignina em crescimento como conjugados de monolignol (Karlen, S.D., Smith, R.A., Kim, H., Padmakshan, D., Bartuce, A., Mobley, J.K., Free, H.C.A., Smith, B.G., Harris, P.J. and Ralph, J. (2017) Highly decorated lignins occur in leaf base cell walls of the Canary Island date palm Phoenix canariensis. Plant Physiology, 175:1058-1067; Lu, F., Karlen, S.D., Regner, M., Kim, H., Ralph, S.A., Sun, R.C., Kuroda, K.I., Augustin, M.A., Mawson, R., Sabarez, H., Singh, T., Jimenez-Monteon, G., Hill, S., Harris, P.J., Boerjan, W., Mansfield, S.D. and Ralph, J. (2015) Naturally p-hydroxybenzoylated lignins in palms. Bioenerg Res. 8:934-952). As mesmas comparam-se ao comportamento de monolignol p-coumaratos na lignificação, incluindo sua facilidade de remoção, e são analogamente um alvo em potencial para intensificar o valor de um vegetal. As unidades de p-hidroxibenzoato ligadas em lignina permanecem como grupos pendentes, enquanto que sua fração de monolignol associada incorpora normalmente no polímero de lignina em crescimento. A falta de reatividade in planta torna o p- hidroxibenzoato uma unidade atrativa para o alvo para limitação da biomassa para distribuir um composto puro com valor como um produto químico tipo commodity.
[0107] As ligninas podem ser degradadas por meios químicos ou enzimáticos para produzir uma variedade de monômeros e oligômeros menores. Embora os processos enzimáticos sejam, no geral, preferidos em virtude de os mesmos não exigirem altas temperaturas e produtos químicos agressivos, tais processos enzimáticos não foram previamente tão efetivos na solubilização das frações de lignina distante de valiosos constituintes de célula vegetal (por exemplo, polissacarídeos e carboidratos).
[0108] Os vegetais com os ácidos nucleicos e/ou enzimas de feruloil- CoA:monolignol transferase suprem monolignol ferulatos para a fácil lignificação em vegetais, desse modo, produzindo vegetais com ligninas que são mais prontamente clivados ou processados para liberar produtos de desagregação de celulose, hemiceluloses e lignina.
[0109] As condições para liberar os produtos de desagregação de celulose, hemiceluloses e lignina provenientes de vegetais contendo os ácidos nucleicos e/ou enzimas de feruloil-CoA:monolignol transferase incluem condições tipicamente empregadas para clivar ligações de éster. Assim, as ligações de éster em ligninas ricas em monolignol ferulato podem ser clivadas por condições alcalinas e/ou ácidas mais brandas do que as condições tipicamente usadas para desagregar a lignina de vegetais que não são ricos em monolignol ferulatos. Por exemplo, as condições moderadamente alcalinas que envolvem o uso de amônia podem ser usadas para clivar as ligações de éster em ligninas ricas em monolignol ferulato, enquanto que tais condições não irão clivar substancialmente nenhuma das ligações de éter e carbono- carbono em ligninas normais. Veja também Pedido de Patente US 12/830.905, depositado em 6 de julho de 2010 e Pedido de Patente US 61/213.706, depositado em 6 de julho de 2009, de ambos os quais, os conteúdos são especificamente aqui incorporados pela referência em suas íntegras.
[0110] Para a digestão de ácido, métodos exemplares incluem, mas sem limitações, a digestão ácida de ácido γ-valerolactona (Luterbacher, J.S., Azarpira, A., Motagamwala, A.H., Lu, F., Ralph, J., and Dumesic, J.A. (2015) Aromatic monomer production integrated into the γ-valerolactone sugar platform. Energy and Environmental Science 8(9):2657-2663), digestão descrita em Santoro et al. (Santoro, N., Cantu, S.L., Tornqvist, C.E., Falbel, T.G., Bolivar, J.L., Patterson, S.E., Pauly, M., and Walton, J.D. (2010) A high-throughput platform for screening milligram quantities of plant biomass for lignocellulose digestibility. Bioenergy Research 3(1):93-102), e digestão iônica (Kim, K.H., Dutta, T., Ralph, J., Mansfield, S.D., Simmons, B.A., e Singh, S. (2017) Impact of ligning polymer backbone esters on ionic liquid pretreatment of poplar. Biotechnology for Biofuels 10: 101, 1-10).
[0111] A fim de engenheirar vegetais com ligninas que contêm maiores níveis de certos conjugados de monolignol éster ou diferentes proporções relativas de vários conjugados de monolignol éster, os versados na técnica podem introduzir aciltransferases BAHD ou ácidos nucleicos que codificam tais aciltransferases BAHD nos vegetais. Por exemplo, os versados na técnica podem injetar enzimas aciltransferase BAHD em vegetais jovens.
[0112] Alternativamente, os versados na técnica podem gerar vegetais geneticamente modificados que contêm ácidos nucleicos que codificam aciltransferases BAHD em suas células somáticas e/ou germinativas. Tal modificação genética pode ser alcançada por procedimentos disponíveis na tecnologia. Por exemplo, os versados na técnica podem preparar um cassete de expressão ou vetor de expressão que pode expressar uma ou mais enzimas aciltransferase BAHD codificadas. As células vegetais podem ser transformadas pelo cassete de expressão ou vetor de expressão, e a íntegra dos vegetais (e suas sementes) pode ser gerada a partir das células vegetais que foram transformadas com sucesso com os ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD. Alguns procedimentos para fazer tais vegetais geneticamente modificados e suas sementes são descritos a seguir.
[0113] Promotores: os ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD da invenção podem ser operativamente ligados a um promotor, que provê a expressão de mRNA a partir dos ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD. O promotor é, tipicamente, um promotor funcional em vegetais e/ou sementes, e pode ser um promotor funcional durante o crescimento e o desenvolvimento do vegetal. Um ácido nucleico de aciltransferase BAHD é operativamente ligado ao promotor quando o mesmo estiver localizado à jusante do promotor, para, desse modo, formar um cassete de expressão.
[0114] A maioria dos genes endógenos tem regiões de DNA que são conhecidas como promotores, que regulam a expressão do gene. As regiões promotoras são tipicamente encontradas no DNA de flanco à montante da sequência de codificação em células tanto procarióticas quanto eucarióticas. Uma sequência de promotor provê a regulação da transcrição da sequência genética à jusante e, tipicamente, inclui de cerca de 50 a cerca de 2.000 pares de base de nucleotídeo. As sequências de promotor também contêm sequências regulatórias, tais como sequências intensificadoras que podem influenciar o nível de expressão do gene. Algumas sequências de promotor isoladas podem prover a expressão do gene de DNAs heterólogos, que é um DNA diferente do DNA nativo ou homólogo.
[0115] As sequências de promotor também são conhecidas como forte ou fraca, ou induzíveis. Um promotor forte provê um alto nível de expressão do gene, enquanto que um promotor fraco provê um nível muito baixo de expressão do gene. Um promotor induzível é um promotor que habilita seletivamente a ativação e a desativação da expressão do gene em resposta a um agente adicionado de forma exógena, ou a um estímulo ambiental ou de desenvolvimento. Por exemplo, um promotor bacteriano, tal como o promotor Ptac, pode ser induzido para variar os níveis de expressão do gene dependendo do nível de isotiopropilgalactosídeo adicionado nas células transformadas. Os promotores também podem prover regulação específica de tecido ou de desenvolvimento. Uma sequência de promotor isolado que é um promotor forte para DNAs heterólogos é vantajosa em virtude de a mesma prover um nível suficiente de expressão do gene para fáceis detecção e seleção de células transformadas e provê um alto nível de expressão do gene quando desejado.
[0116] Os promotores adequados para uso na presente invenção incluem promotores nativos ou heterólogos.
[0117] Os cassetes de expressão, no geral, incluem, mas sem limitações, um promotor vegetal, tais como o promotor CaMV 35S (Odell et al., Nature. 313:810-812 (1985)), ou outros, tais como CaMV 19S (Lawton et al. (1987) Plant Molecular Biology 9:315-324), nos (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:5745-5749), Adh1 (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:6624-6628), sacarose sintase (Yang et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:4144-4148), α-tubulina, ubiquitina,
actina (Wang et al. (1992), Mol.
Cell.
Biol. 12:3399), cab (Sullivan et al. (1989) Mol.
Gen.
Genet. 215:431), PEPCase (Hudspeth et al. (1989) Plant Molecular Biology 12:579-589) ou aqueles associados com o complexo do gene R (Chandler et al. (1989) The Plant Cell 1:1175-1183). O promotores adicionalmente adequados incluem o promotor 8 de sintase de celulose específico da parede celular secundária específica de xilema de álamo, o promotor do vírus do mosaico de couve-flor, o promotor Z10 proveniente de um gene que codifica uma proteína zeína 10 kD, um promotor Z27 proveniente de um gene que codifica uma proteína zeína 27 kD, promotores induzíveis, tais como o promotor induzível leve derivado do gene rbcS da ervilha (Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3(8):1671-1679) e o promotor de actina proveniente do arroz (McElroy et al. (1990) The Plant Cell 2:163-171). Os promotores específicos de semente, tal como o promotor de faseolina proveniente de feijões, também podem ser usados (Sengupta-Gopalan (1985) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA. 83:3320-3324). Os promotores adequados adicionais incluem qualquer um dos promotores nos vários genes da passagem biossintética do monômero de lignina convencional (monolignol). Veja, por exemplo, Vanholme et al. 2012 (Vanholme, R., Morreel, K., Darrah, C., Oyarce, P., Grabber, J.H., Ralph, J., and Boerjan, W. (2012) Metabolic engineering of novel lignin in biomass crops.
New Phytol. 196(4):978-1000); Vanholme et al. 2010 (Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., and Boerjan, W. (2010) Ligning biosynthesis and structure.
Plant Physiol. 153(3):895-905), Vanholme et al. 2008 (Vanholme, R., Morreel, K., Ralph, J., and Boerjan, W. (2008) Lignin engineering.
Curr.
Opin.
Plant Biol. 11(3):278-285), Boerjan et al. 2003 (Boerjan, W., Ralph, J., and Baucher, M. (2003) Lignin biosynthesis.
Annual Reviews in Plant Biology 54:519-546). Um promotor exemplar proveniente desta passagem é o promotor cinamato-4- hidroxilase (C4H) (Bell-Lelong, D.A., Cusumano, J.C., Meyer, K., and Chapple, C. (1997) Cinnamate-4-hydroxylase expression in Arabidopsis: regulation in response to development and the environment.
Plant Physiol. 113:729-738), cuja sequência é SEQ ID NO:19: aagcttagaggagaaactgagaaaatcagcgtaatgagagacgagagcaatgtgctaagagaagagattgggaa gagagaagagacgataaaggaaacggaaaagcatatggaggagcttcatatggagcaagtgaggctgagaaga cggtcgagtgagcttacggaagaagtggaaaggacgagagtgtctgcatcggaaatggctgagcagaaaagaga agctataagacagctttgtatgtctcttgaccattacagagatgggtacgacaggctttggagagttgttgccggccata agagtaagagagtagtggttttaacaacttgaagtgtaagaacaatgagtcaatgactacgtgcaggacattggacat accgtgtgttcttttggattgaaatgttgtttcgaagggctgttagttgatgttgaaaataggttgaagttgaataatgcatgtt gatatagtaaatatcaatggtaatattttctcatttcccaaaactcaaatgatatcatttaattataaactaacgtaaactgtt gacaatacacttatggttaaaaatttggagtcttgttttagtatacgtatcaccaccgcacggtttcaaaaccacataattgt aaatgttattggaaaaaagaacccgcaatacgtattgtattttggtaaacatagctctaagcctctaatatataagctctc aacaattctggctaatggtcccaagtaagaaaagcccatgtattgtaaggtcatgatctcaaaaacgagggtgaggtg gaatactaacatgaggagaaagtaaggtgacaaatttttggggcaatagtggtggatatggtggggaggtaggtagc atcatttctccaagtcgctgtctttcgtggtaatggtaggtgtgtctctctttatattatttattactactcattgttaatttctttttttct acaatttgtttcttactccaaaatacgtcacaaatataatactaggcaaataattatttaattgtaagtcaatagagtggttgt tgtaaaattgatttttgatattgaaagagttcatggacggatgtgtatgcgccaaatgctaagcccttgtagtcttgtactgtg ccgcgcgtatattttaaccaccactagttgtttctctttttcaaaaacacacaaaaaataatttgttttcgtaacggcgtcaa atctgacggcgtctcaatacgttcaattttttctttctttcacatggtttctcatagctttgcattgaccataggtaaagggataa ggataaaggttttttctcttgtttgttttatccttattattcaaaatggataaaaaaacagtcttattttgatttctttgattaaaaaa gtcattgaaattcatatttgattttttgctaaatgtcaactcagagacacaaacgtaatgcactgtcgccaatattcatggat catgaccatgaatatcactagaataattgaaaatcagtaaaatgcaaacaaagcattttctaattaaaacagtcttctac attcacttaattggaatttcctttatcaaacccaaagtccaaaacaatcggcaatgttttgcaaaatgttcaaaactattgg cgggttggtctatccgaattgaagatcttttctccatatgatagaccaacgaaattcggcatacgtgtttttttttttgttttgaa aaccctttaaacaaccttaattcaaaatactaatgtaactttattgaacgtgcatctaaaaattttgaactttgcttttgagaa ataatcaatgtaccaataaagaagatgtagtacatacattataattaaatacaaaaaaggaatcaccatatagtacat ggtagacaatgaaaaactttaaaacatatacaatcaataatactctttgtgcataactttttttgtcgtctcgagtttatatttg agtacttatacaaactattagattacaaactgtgctcagatacattaagttaatcttatatacaagagcactcgagtgttgt ccttaagttaatcttaagatatcttgaggtaaatagaaatagttaactcgtttttattttcttttttttaccatgagcaaaaaaag atgaagtaagttcaaaacgtgacgaatctacatgttactacttagtatgtgtcaatcattaaatcgggaaaacttcatcatt tcaggagtactacaaaactcctaagagtgagaacgactacatagtacatattttgataaaagacttgaaaacttgctaa aacgaatttgcgaaaatataatcatacaagtagaaccactgatttgatcgaattattcatagctttgtaggatgaacttaa ctaaataatatctcacaaaagtattgacagtaacctagtactatactatctatgttagaatatgattatgatataatttatccc ctcacttattcatatgatttttgaagcaactactttcgtttttttaacattttcttttttggtttttgttaatgaacatatttagtcgtttctt aattccactcaaatagaaaatacaaagagaactttatttaatagatatgaacataatctcacatcctcctcctaccttcac caaacacttttacatacactttgtggtctttctttacctaccaccatcaacaacaacaccaagccccactcacacacacg caatcacgttaaatctaacgccgtttattatctcatcattcaccaactcccacgtacctaacgccgtttaccttttgccgttgg tcctcatttctcaaaccaaccaaacctctccctcttataaaatcctctctcccttctttatttcttcctcagcagcttcttctgcttt caattactctcgccgacgattttctcaccggaaaaaaacaatatcattgcggatacacaaactata (SEQ ID NO:19)
[0118] Outros promotores usados na prática da invenção são conhecidos pelos versados na técnica.
[0119] Alternativamente, inéditas sequências de promotor específicas de tecido podem ser empregadas na prática da presente invenção. Os clones de cDNA provenientes de um tecido em particular podem ser isolados e aqueles clones que são expressados especificamente neste tecido são identificados, por exemplo, usando Northern blotting. Preferivelmente, o gene isolado não está presente em um alto número de cópias, mas é relativamente abundante em tecidos específicos. O promotor e os elementos de controle dos correspondentes clones genômicos podem, então, ser localizados usando técnicas bem conhecidas pelos versados na técnica.
[0120] Um ácido nucleico de aciltransferase BAHD pode ser combinado com o promotor por métodos padrões para produzir um cassete de expressão, por exemplo, da forma descrita em Sambrook et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. Second Edition (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (1989); MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. Third Edition (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (2000)). Em resumo, um plasmídeo que contém um promotor, tal como o promotor 35S CaMV, pode ser construído da forma descrita em Jefferson (Plant Molecular Biology Reporter 5:387-405 (1987)) ou obtido a partir de Clontech Lab em Palo Alto, Califórnia (por exemplo, pBI121 ou pBI221). Tipicamente, estes plasmídeos são construídos para ter múltiplos sítios de clonagem com especificidade para diferentes enzimas de restrição à jusante do promotor. Os ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD podem ser subclonados à jusante do promotor usando enzimas de restrição e posicionados para garantir que o DNA seja inserido em orientação apropriada em relação ao promotor, de forma que o DNA possa ser expressado como RNA sentido. Uma vez que o ácido nucleico de aciltransferase BAHD for operativamente ligado a um promotor, o cassete de expressão assim formado pode ser subclonado em um plasmídeo ou outro vetor (por exemplo, um vetor de expressão).
[0121] Em algumas modalidades, um clone de cDNA que codifica uma proteína de aciltransferase BAHD é isolado a partir de um tecido vegetal selecionado, ou um ácido nucleico que codifica uma proteína de aciltransferase BAHD mutante ou modificada é preparado por métodos disponíveis ou da forma aqui descrita. Por exemplo, o ácido nucleico que codifica uma proteína de aciltransferase BAHD mutante ou modificada pode ser qualquer ácido nucleico com uma região de codificação que hibridiza em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17 e que tem atividade de aciltransferase BAHD. Usando endonucleases de restrição, a íntegra da sequência de codificação para a aciltransferase BAHD é subclonada à jusante do promotor em uma orientação sentido 5’ a 3’.
[0122] Sequências de Alvejamento: Adicionalmente, os cassetes de expressão podem ser construídos e empregados para alvejar os ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD em um compartimento intracelular em células vegetais ou para direcionar uma proteína codificada para o ambiente extracelular. Isto pode, no geral, ser alcançado pela associação de uma sequência de DNA que codifica uma sequência de peptídeo de trânsito ou sinal com a sequência de codificação do ácido nucleico de aciltransferase BAHD. O peptídeo de trânsito, ou sinal, resultante irá transportar a proteína para um destino intracelular, ou extracelular, em particular, respectivamente, e pode, então, ser removido pós-tradução. Os peptídeos de trânsito agem pela facilitação do transporte de proteínas através de membranas intracelulares, por exemplo, vacúolo, vesícula, plastídeo e membranas mitocondriais, enquanto que os peptídeos sinais direcionam as proteínas através da membrana extracelular. Pela facilitação do transporte da proteína para o interior dos compartimentos no interior ou no exterior da célula, estas sequências podem aumentar o acúmulo de um produto de gene em particular em um local em particular. Por exemplo, veja a Patente US
5.258.300.
[0123] Sequências 3′: Quando o cassete de expressão precisar ser introduzido em uma célula vegetal, o cassete de expressão também pode incluir opcionalmente sequências de DNA regulatório vegetal não traduzidas 3′ que agem como um sinal para terminar a transcrição e permitir a poliadenilação do mRNA resultante. A sequência de DNA regulatório não traduzida 3′ inclui preferivelmente de cerca de 300 a 1.000 pares de base de nucleotídeo e contém sequências de terminação transcricionais e translacionais vegetais. Por exemplo, os elementos 3′ que podem ser usados incluem aqueles derivados do gene nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., (1983) Nucleic Acid Research. 11:369-385), ou as sequências terminadoras para a transcrição T7 proveniente do gene octopina sintase de Agrobacterium tumefaciens, e/ou a extremidade 3′ dos genes inibidores de protease I ou II provenientes da batata ou do tomate. Outros elementos 3′ conhecidos pelos versados na técnica também podem ser empregados. Estas sequências regulatórias não traduzidas 3′ podem ser obtidas da forma descrita em An (Methods in Enzymology. 153:292 (1987)). Muitas tais sequências regulatórias não traduzidas 3′ já estão presentes em plasmídeos disponíveis a partir de origens comerciais, tal como Clontech, Palo Alto, Califórnia. As sequências regulatórias não traduzidas 3′ podem ser operativamente ligadas ao terminal 3′ dos ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD por métodos padrões.
[0124] Sequências de Marcador Selecionáveis e Triáveis: A fim de melhorar a identificação de transformantes, um gene marcador selecionável ou triável pode ser empregado com os ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD expressáveis. Os “genes marcadores” são genes que transmitem um fenótipo distinto para as células que expressam o gene marcador e, assim, permitem que tais células transformadas sejam distinguidas das células que não têm o marcador. Tais genes podem codificar um marcador tanto selecionável quanto triável, dependendo se o marcador confere um traço que pode-se ‘selecionar’ por meios químicos, isto é, através do uso de um agente seletivo (por exemplo, um herbicida, antibiótico, ou similares), ou se o mesmo é simplesmente um traço que pode-se identificar através da observação ou teste, isto é, por ‘triagem’ (por exemplo, o traço locus R). Certamente, muitos exemplos de genes marcadores adequados são conhecidos na tecnologia e podem ser empregados na prática da invenção.
[0125] Também são incluídos nos termos genes marcadores selecionáveis ou triáveis genes que codificam um “marcador secretável” cuja secreção pode ser detectada como um meio de identificação ou seleção para células transformadas. Exemplos incluem marcadores que codificam um antígeno secretável que pode ser identificado por interação de anticorpo, ou enzimas secretáveis que podem ser detectadas por sua atividade catalítica. As proteínas secretáveis caem em inúmeras classes, incluindo pequenas proteínas difundíveis detectáveis, por exemplo, por ELISA; e proteínas que são inseridas ou aprisionadas na parede celular (por exemplo, proteínas que incluem uma sequência líder, tal como aquela encontrada na unidade de expressão de extensina ou PR-S de tabaco).
[0126] Em relação a marcadores secretáveis selecionáveis, o uso de um gene que codifica um polipeptídeo que torna-se sequestrado na parede celular, em que o polipeptídeo inclui um epítopo exclusivo, pode ser vantajoso. Um antígeno marcador secretado como este pode empregar uma sequência de epítopo que irá prover baixa base em tecido vegetal, uma sequência promotor-líder que transmite eficientes expressão e alvejamento através da membrana plasmática, e pode produzir a proteína que é ligada na parede celular e, ainda, é acessível a anticorpos. Uma proteína de parede normalmente secretada modificada para incluir um epítopo exclusivo irá satisfazer tais exigências.
[0127] O exemplo de proteínas adequadas para modificação desta maneira inclui extensina ou glicoproteína rica em hidroxiprolina (HPRG). Por exemplo, o HPRG de milho (Stiefel et al. (1990) The Plant Cell. 2:785-793) é bem caracterizado em termos de biologia molecular, expressão, e estrutura da proteína e, portanto, pode ser prontamente empregado. Entretanto, qualquer uma de uma variedade de extensinas e/ou glicina-rico proteínas de parede (Keller et al. (1989) EMBO J. 8:1309-1314) pode ser modificada pela adição de um sítio antigênico para criar um marcador triável.
[0128] Inúmeros outros genes marcadores selecionáveis e/ou triáveis possíveis serão aparentes aos versados na técnica, além daquele aqui apresentado a seguir. Portanto, será entendido que a discussão aqui exposta é exemplar em vez de exaustiva. À luz das técnicas aqui reveladas e das técnicas recombinantes gerais que são conhecidas na tecnologia, a presente invenção permite prontamente a introdução de qualquer gene, incluindo genes marcadores, em uma célula destinatária para gerar uma célula vegetal transformada, por exemplo, uma célula monocotiledônea ou uma célula dicotiledônea.
[0129] Possíveis marcadores selecionáveis para uso em conexão com a presente invenção incluem, mas sem limitações, um gene neo (Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-188) que codifica para resistência à canamicina e pode ser selecionado para usar canamicina, G418, e similares; um gene bar que codifica para resistência a bialafos; um gene que codifica uma proteína EPSP sintase alterada (Hinchee et al., (1988) Bio/Technology. 6:915-922), assim, conferindo resistência a glifosato; um gene nitrilase, tal como bxn proveniente de Klebsiella ozaenae que confere resistência a bromoxinila (Stalker et al. (1988) Science. 242:419-423); um gene acetolactato sintase mutante (ALS) que confere resistência a imidazolinona, sulfonilureia ou outros produtos químicos inibidores de ALS (Pedido de Patente Europeu 154.204 (1985)); um gene DHFR resistente a metotrexato (Thillet et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:12500-12508); um gene dalapão dealogenase que confere resistência ao dalapão de herbicida; ou um gene antranilato sintase que sofreu mutação que confere resistência a 5-metil triptofano. Quando um gene EPSP sintase mutante for empregado, benefício adicional pode ser realizado através da incorporação de um peptídeo de trânsito cloroplasto, CTP, adequado (Pedido de Patente Europeu 0 218 571 (1987)).
[0130] Uma modalidade ilustrativa de um gene marcador selecionável capaz de ser usado em sistemas para selecionar transformantes é o gene que codifica a enzima fosfinotricina acetiltransferase, tal como o gene bar proveniente de Streptomyces hygroscopicus ou o gene pat proveniente de Streptomyces viridochromogenes (Patente US 5.550.318). A enzima fosfinotricina acetil transferase (PAT) inativa o ingrediente ativo no herbicida bialafos, fosfinotricina (PPT). PPT inibe glutamina sintetase, (Murakami et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 205:42-50; Twell et al. (1989) Vegetal Physiol. 91:1270-1274) causando rápido acúmulo de amônia e morte celular. O sucesso no uso deste sistema seletivo em conjunto com monocotiledôneas foi surpreendente em virtude das principais dificuldades que foram relatadas na transformação de cereais (Potrykus (1989) Trends Biotech. 7:269-273).
[0131] Os marcadores triáveis que podem ser empregados incluem, mas sem limitações, um gene β-glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos; um gene locus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos antocianina (cor vermelha) em tecidos vegetais (Dellaporta et al., In: Chromosome Structure and Function: Impact of th New Concepts, 18 Stadler Genetics Symposium, J.P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum Press) pp. 263-282 (1988)); um gene β-lactamase (Sutcliffe (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75:3737-3741), que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene xylE (Zukowsky et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:1101) que codifica um catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos; um gene α-amilase (Ikuta et al. (1990) Bio/technology 8:241-242); um gene tirosinase (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714) que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina em DOPA e dopaquinona que, por sua vez, condensa para formar o composto facilmente detectável melanina; um gene β-galactosidase, que codifica uma enzima para a qual há substratos cromogênicos; um gene luciferase (lux) (Ow et al. (1986) Science 234:856-859), que permite a detecção de bioluminescência; ou um gene aequorina (Prasher et al. (1985) Biochem. Biophys.
Res. Comm. 126:1259-1268), que pode ser empregado em detecção de bioluminescência sensível a cálcio, ou um gene de proteína fluorescente verde ou amarela (Niedz et al. (1995) Plant Cell Reports. 14:403).
[0132] Por exemplo, genes provenientes do complexo do gene R do milho podem ser usados como marcadores triáveis. O complexo do gene R em milho codifica uma proteína que age para regular a produção de pigmentos antocianina na maior parte da semente e do tecido vegetal. As linhagens de milho podem ter um, ou até quatro, R alelos que combinam para regular a pigmentação de uma maneira de desenvolvimento e específica de tecido. Um gene proveniente do complexo do gene R não prejudica as células transformadas. Assim, um gene R introduzido em tais células irá causar a expressão de um pigmento vermelho e, se estavelmente incorporado, pode ser visualmente pontuado como um setor vermelho. Se uma linha de milho conduzir alelos dominantes para genes que codificam os intermediários enzimáticos na passagem biossintética de antocianina (C2, A1, A2, Bz1 e Bz2), mas conduzir um alelo recessivo no locus R, a transformação de qualquer célula a partir desta linha com R irá resultar na formação de pigmento vermelho. Linhas exemplares incluem Wisconsin 22 que contém o alelo rg-Stadler e TR112, um derivado de K55 que é r-g, b, Pl. Alternativamente, qualquer genótipo de milho pode ser utilizado se os alelos C1 e R forem introduzidos em conjunto.
[0133] As regiões regulatórias do gene R podem ser empregadas em constructos quiméricos a fim de prover mecanismos para controlar a expressão de genes quiméricos. Mais diversidade de expressão fenotípica é conhecida no locus R do que em qualquer outro locus (Coe et al., in Corn and Corn Improvement, eds. Sprague, G.F. & Dudley, J.W. (Am. Soc. Agron., Madison, WI), pp. 81-258 (1988)). É contemplado que as regiões regulatórias obtidas a partir das regiões 5′ para o gene R estrutural podem ser úteis no direcionamento da expressão de genes, por exemplo, resistência a inseto, resistência a seca, tolerância a herbicida, ou outras regiões de codificação de proteína. Com os propósitos da presente invenção, acredita-se que qualquer um dos vários membros da família do gene R pode ser empregado com sucesso (por exemplo, P, S, Lc, etc.). Entretanto, um que pode ser usado é Sn (particularmente, Sn:bol3). Sn é um membro dominante do complexo do gene R e é funcionalmente similar aos loci R e B, em que Sn controla a deposição específica de tecido dos pigmentos antocianina em certas mudas e células vegetais, portanto, seu fenótipo é similar a R.
[0134] Um marcador triável adicional contemplado para uso na presente invenção é luciferase de vaga-lume, codificada pelo gene lux. A presença do gene lux em células transformadas pode ser detectada usando, por exemplo, filme de raio X, contagem de cintilação, espectrofotometria fluorescente, câmeras de vídeo de baixa luminosidade, câmeras de contagem de fótons, ou luminometria multipoços. Também é concebido que este sistema pode ser desenvolvido para triagem de população para bioluminescência, tal como em placas de cultura de tecido, ou até mesmo para a íntegra da triagem de vegetal.
[0135] Outras Sequências Opcionais: Um cassete de expressão da invenção também pode compreender adicionalmente DNA de plasmídeo. Os vetores de plasmídeo incluem sequências de DNA adicionais que proveem fáceis seleção, amplificação, e transformação do cassete de expressão em células procarióticas e eucarióticas, por exemplo, vetores derivados de pUC, tais como vetores derivados de pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pUC23, pUC119, e pUC120, pSK, vetores derivados de pGEM, vetores derivados de pSP, ou vetores derivados de pBS. As sequências de DNA adicionais incluem origens de replicação para prover replicação autônoma do vetor, genes marcadores selecionáveis adicionais, preferivelmente, que codificam resistência a antibiótico ou a herbicida, múltiplos sítios de clonagem exclusivos que proveem para que múltiplos sítios insiram sequências de DNA ou genes codificados no cassete de expressão e sequências que intensificam a transformação das células procarióticas e eucarióticas.
[0136] Um outro vetor que é usado para a expressão nas células tanto vegetal quanto procarióticas é o plasmídeo Ti binário (revelado em Schilperoort et al., Patente US 4.940.838) da forma exemplificada pelo vetor pGA582. Este vetor de plasmídeo Ti binário foi previamente caracterizado por An (Methods in Enzymology 153:292 (1987)) e está disponível por Dr. An. Este vetor de Ti binário pode ser replicado em bactéria procariótica, tais como E. coli e Agrobacterium. Os vetores de plasmídeo de Agrobacterium podem ser usados para transferir o cassete de expressão para as células vegetais dicotiledôneas e, sob certas condições, para as células monocotiledôneas, tais como células de arroz. Os vetores de Ti binários preferivelmente incluem as bordas direita e esquerda do T-DNA de nopalina para prover a eficiente transformação da célula vegetal, um gene marcador selecionável, múltiplos sítios de clonagem exclusivos nas regiões da borda T, a replicação colE1 da origem e um replicão de ampla faixa de hospedeiro. Os vetores de Ti binários que conduzem um cassete de expressão da invenção podem ser usados para transformar as células tanto procarióticas quanto eucarióticas, mas são preferivelmente usados para transformar as células vegetais dicotiledôneas.
[0137] Triagem In Vitro dos Cassetes de Expressão: Uma vez que o cassete de expressão é construído e subclonado em um plasmídeo adequado, o mesmo pode ser triado para a capacidade de inibir substancialmente a tradução de um mRNA que codifica para uma proteína de armazenamento de semente por métodos padrões, tal como tradução apreendida híbrida. Por exemplo, para a seleção ou tradução apreendida híbridas, uma sequência de DNA anti-sentido pré-selecionada é subclonada em um SP6/T7 contendo plasmídeos (suprido por ProMega Corp.). Para a transformação de células vegetais, os vetores adequados incluem plasmídeos, tal como aqui descrito. Tipicamente, a tradução com apreensão híbrida é um ensaio in vitro que mede a inibição da tradução de um mRNA que codifica uma proteína de armazenamento de semente em particular. Este método de triagem também pode ser usado para selecionar e identificar sequências de DNA anti-sentido pré-selecionadas que inibe a tradução de uma família ou uma subfamília de genes da proteína zeína. Como um controle, o correspondente cassete de expressão sentido é introduzido em vegetais e o fenótipo submetido a ensaio.
[0138] Liberação de DNA das Moléculas de DNA nas Células Hospedeiras: A presente invenção, no geral, inclui etapas direcionadas à introdução dos ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD, tal como um cDNA pré-selecionado que codifica a enzima aciltransferase BAHD selecionada, em uma célula destinatária para criar uma célula transformada. Em algumas instâncias, a frequência de ocorrência de células que acomodam DNA exógeno (estrangeiro) pode ser baixa. Além do mais, é mais provável que nem todas as células destinatárias que recebem os segmentos ou sequências de DNA resultem em uma célula transformada em que o DNA é estavelmente integrado no genoma vegetal e/ou expressado. Algumas podem mostrar apenas a expressão do gene inicial e transiente. Entretanto, certas células provenientes de virtualmente qualquer espécie dicotiledônea ou monocotiledônea podem ser estavelmente transformadas, e estas células regeneradas em vegetais transgênicos, através da aplicação das técnicas aqui reveladas.
[0139] Um outro aspecto da invenção é um vegetal com lignina contendo conteúdo do conjugado de monolignol éster modificado, em que o vegetal tem um ácido nucleico de aciltransferase BAHD introduzido. O vegetal pode ser um monocotiledôneo ou um dicotiledôneo. Um outro aspecto da invenção inclui células vegetais (por exemplo, células embriônicas ou outras linhas de célula) que podem regenerar vegetais transgênicos e/ou sementes férteis. As células podem ser derivadas tanto a partir de monocotiledôneos quanto a partir de dicotiledôneos. Exemplos adequados de espécie de vegetal incluem gramíneas (switchgrass, sorgo, etc.), madeiras macias, madeiras duras, trigo, arroz, Arabidopsis, tabaco, milho, soja, sorgo, e similares. Em algumas modalidades, o vegetal ou a célula é um vegetal ou uma célula monocotiledônea. Por exemplo, o vegetal ou a célula pode ser um vegetal ou uma célula tipo madeira macia, ou um vegetal ou uma célula tipo milho. Em algumas modalidades, o vegetal ou a célula é um vegetal ou uma célula dicotiledônea. Por exemplo, o vegetal ou a célula pode ser um vegetal ou uma célula tipo madeira dura. A(s) célula(s) pode(m) estar em uma cultura de célula em suspensão ou pode(m) estar em uma parte do vegetal intacta, tal como um embrião imaturo, ou em um tecido vegetal especializado, tal como calo, tais como calo Tipo I ou Tipo II.
[0140] A transformação das células vegetais pode ser conduzida por qualquer um de inúmeros métodos conhecidos pelos versados na técnica. Exemplos são: Transformação por transferência de DNA direta para as células vegetais por eletroporação (Patente US 5.384.253 e Patente US 5.472.869; Dekeyser et al. (1990) The Plant Cell 2:591-602); transferência de DNA direta para células vegetais por precipitação com PEG (Hayashimoto et al. (1990) Plant Physiol. 93:857-863); transferência de DNA direta para células vegetais por bombardeamento de microprojétil (McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926; Gordon-Kamm et al. (1990) The Plant Cell 2:603-618; Patente US 5.489.520; Patente US 5.538.877; e Patente US 5.538.880) e transferência de DNA para células vegetais por meio da infecção com Agrobacterium. Métodos, tais como bombardeamento de microprojétil ou eletroporação, podem ser realizados com DNA “nu” em que o cassete de expressão pode ser simplesmente conduzido em qualquer vetor de clonagem de plasmídeo derivado de E. coli. No caso de vetores virais, é desejável que o sistema retenha funções de replicação, mas careça de funções para indução de doença.
[0141] Um método para transformação de dicotiledônea, por exemplo, envolve a infecção de células vegetais com Agrobacterium tumefaciens usando o protocolo disco da folha (Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231). Monocotiledôneas, tal como Zea mays, podem ser transformadas por meio de bombardeamento de microprojétil de tecido de calo embriogênico ou embriões imaturos, ou por eletroporação seguindo degradação enzimática parcial da parede celular com uma enzima contendo pectinase (Patente US 5.384.253; e Patente US 5.472.869). Por exemplo, as linhas de célula embriogênica derivadas a partir de embriões imaturos de Zea mays podem ser transformadas por tratamento de partícula acelerado, da forma descrita por Gordon-Kamm et al. (The Plant Cell 2:603-618 (1990)) ou Patente US
5.489.520; Patente US 5.538.877 e Patente US 5.538.880, citados anteriormente. Embriões imaturos excisados também podem ser usados como o alvo para a transformação antes da indução, seleção e regeneração da cultura de tecido, da forma descrita na publicação PCT WO 95/06128. Além do mais, métodos para transformação de vegetais monocotiledôneos utilizando Agrobacterium tumefaciens foram descritos por Hiei et al. (Patente Europeia 0 604 662, 1994) e Saito et al. (Patente Europeia 0 672 752, 1995).
[0142] Métodos, tais como bombardeamento de microprojétil ou eletroporação, são realizados com DNA “nu”, em que o cassete de expressão pode ser simplesmente conduzido em qualquer vetor de clonagem de plasmídeo derivado a partir de E. coli. No caso de vetores virais, é desejável que o sistema retenha funções de replicação, mas careça de funções para indução de doença.
[0143] A escolha da fonte de tecido vegetal para transformação irá depender da natureza do vegetal hospedeiro e do protocolo de transformação. As fontes de tecido usadas incluem calo, suspensões, células de cultura, protoplastos, segmentos de folha, segmentos de tronco, borlas, pólen, embriões, hipocótilos, segmentos de tubérculo, regiões meristemáticas, e similares. A fonte de tecido é selecionada e transformada, de forma que a mesma retenha a capacidade de regenerar a íntegra de vegetais férteis seguindo a transformação, isto é, contenha as células totipotentes. Calo e embriões imaturos de milho embriônico Tipo I ou Tipo II são fontes de tecido de Zea mays preferidas. Tecidos similares podem ser transformados para espécie de madeira macia ou madeira dura. A seleção de fontes de tecido para transformação de monocotiledôneas é descrita com detalhes na publicação PCT WO 95/06128.
[0144] A transformação é realizada sob condições direcionadas para o tecido vegetal de escolha. As células ou o tecido vegetal é exposto ao DNA ou ao RNA que conduz os ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD por um efetivo período de tempo. O mesmo pode variar de um pulso de eletricidade de menos do que um segundo para eletroporação até um cocultivo de 2-3 dias na presença de células de Agrobacterium que portam plasmídeo. Os tampões e o meio usados também irão variar com a fonte de tecido vegetal e o protocolo de transformação. Muitos protocolos de transformação empregam uma camada alimentadora de células de cultura suspensas (tabaco ou milho doce negro do México, por exemplo) na superfície das placas de meio sólido, separada por um disco de papel de filtro estéril a partir das células ou tecidos vegetais que são transformados.
[0145] Eletroporação: Quando se desejar introduzir DNA por meio de eletroporação, é contemplado que o método de Krzyzek et al. (Patente US 5.384.253) pode ser vantajoso. Neste método, certas enzimas de degradação de parede celular, tais como enzimas de degradação de pectina, são empregadas para tornar as células destinatárias alvos mais suscetível à transformação por eletroporação do que as células não tratadas. Alternativamente, as células destinatárias podem se tornar mais suscetíveis à transformação, por enrolamento mecânico.
[0146] Para efetuar a transformação por eletroporação, pode-se tanto empregar tecidos friáveis, tais como culturas de célula em suspensão, ou calo embriogênico, quanto, alternativamente, pode-se transformar embriões imaturos ou outros tecidos organizados diretamente. As paredes celulares das células ou órgãos pré- selecionados podem ser parcialmente degradadas pela exposição das mesmas às enzimas de degradação de pectina (pectinases ou pectoliases), ou pelo enrolamento mecânico das mesmas de uma maneira controlada. Tais células, então, serão receptivas à captação de DNA por eletroporação, que pode ser realizada neste estágio, e células transformadas, então, identificadas por um protocolo de seleção ou triagem adequado dependente da natureza do DNA inovadoramente incorporado.
[0147] Bombardeamento de microprojétil: Um método vantajoso método adicional para distribuir segmentos de DNA em transformação para células vegetais é bombardeamento de microprojétil. Neste método, micropartículas podem ser revestidas com DNA e distribuídas no interior das células por uma força de propulsão. As partículas exemplares incluem aquelas compostas por tungstênio, ouro, platina, e similares.
[0148] É contemplado que, em algumas instâncias, a precipitação de DNA sobre partículas de metal não será necessária para a liberação de DNA para uma célula destinatária usando bombardeamento de microprojétil. Em uma modalidade ilustrativa, células BMS não embriogênicas foram bombardeadas com células intactas da bactéria E. coli ou Agrobacterium tumefaciens contendo plasmídeos com os genes tanto β-glucuronidase quanto bar engenheirados para expressão em milho. Bactérias foram inativadas por desidratação de etanol antes do bombardeamento. Um baixo nível de expressão transiente do gene β-glucuronidase foi observado 24-48 horas seguinte à liberação de DNA. Além do mais, transformantes estáveis contendo o gene bar foram recuperados seguinte ao bombardeamento com células tanto E. coli quanto Agrobacterium tumefaciens. É contemplado que as partículas podem conter DNA, em vez de serem revestidas com DNA. Portanto, é proposto que as partículas podem aumentar o nível de liberação de DNA, mas não é, nas e das mesmas, necessário introduzir DNA nas células vegetais.
[0149] Uma vantagem de bombardeamento de microprojétil, além de o mesmo ser um meio efetivo da transformar reprodutivelmente estavelmente monocotiledôneas, é que o isolamento de protoplastos (Christou et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:3962-3966), a formação de células parcialmente degradadas, ou a susceptibilidade à infecção por Agrobacterium não são exigidos. Uma modalidade ilustrativa de um método para distribuir DNA em células de milho pela aceleração é um Sistema de Liberação de Partícula por Biolística, que pode ser usado para propelir partículas revestidas com DNA ou células através de uma tela, tal como uma tela de aço inoxidável ou Nytex, sobre uma superfície de filtro coberta com células de milho cultivadas em suspensão (Gordon-Kamm et al. (1990) The Plant Cell 2:603-618). A tela dispersa as partículas, de forma que as mesmas não sejam distribuídas para as células destinatárias em grandes agregados. Acredita-se que uma tela de intervenção entre o aparelho de projétil e as células a serem bombardeadas reduz o tamanho do agregado de projétil e pode contribuir para uma frequência mais alta de transformação, pela redução do dano infligido nas células destinatárias por um projétil agregado.
[0150] Para o bombardeamento, células em suspensão são preferivelmente concentradas em filtros ou meio de cultura sólido. Alternativamente, embriões imaturos ou outras células alvos podem ser arranjadas no meio de cultura sólido. As células a serem bombardeadas são posicionadas em uma distância apropriada abaixo da placa de parada de macroprojétil. Se desejado, uma ou mais telas também ficam posicionadas entre o dispositivo de aceleração e as células a serem bombardeadas. Através do uso das técnicas aqui apresentadas pode-se obter até 1.000 ou mais focos de células que expressam transientemente um gene marcador. O número de células em um foco que expressa o produto de gene exógeno 48 horas pós-bombardeamento varia frequentemente de cerca de 1 a 10 e média de cerca de 1 a 3.
[0151] Na transformação de bombardeamento, pode-se otimizar as condições de cultura pré-bombardeamento e os parâmetros de bombardeamento para produzir os números máximos de transformantes estáveis. Os parâmetros tanto físico quanto biológico para bombardeamento podem influenciar a frequência de transformação. Os fatores físicos são aqueles que envolvem manipular o DNA/microprojétil precipitado ou aqueles que afetam o caminho e a velocidade tanto dos macro quanto dos microprojéteis. Os fatores biológicos incluem todas as etapas envolvidas na manipulação de células antes e imediatamente depois do bombardeamento, o ajuste osmótico de células alvos para ajudar a aliviar o trauma associado com o bombardeamento, e também a natureza da transformação do DNA, tais como DNA linearizado ou DNA de plasmídeo superbobinado intacto.
[0152] Pode-se desejar ajustar vários parâmetros de bombardeamento em estudos de pequena escala para otimizar completamente as condições e/ou para ajustar os parâmetros físicos, tais como distância de hiato, distância de voo, distância do tecido, e pressão do hélio. Também pode-se minimizar os fatores de redução de trauma (TRFs) pela modificação das condições que influenciam o estado fisiológico das células destinatárias e que podem, portanto, influenciar as eficiências de transformação e integração. Por exemplo, o estado osmótico, a hidratação de tecido e o estágio subcultura ou ciclo celular das células destinatárias podem ser ajustados para a transformação ideal. A execução de tais ajustes de rotina será conhecida pelos versados na técnica.
[0153] Um Exemplo de Produção e Caracterização de Milho Transgênico Estável: Depois de efetuar a liberação de um ácido nucleico de aciltransferase BAHD nas células destinatárias por qualquer um dos métodos discutidos anteriormente, as células transformadas podem ser identificadas para cultivo e regeneração do vegetal adicionais. Da forma supramencionada, a fim de melhorar a capacidade de identificar transformantes, pode-se desejar empregar um gene marcador selecionável ou triável como os, ou além dos, ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD expressáveis. Neste caso, pode-se, então, no geral, ensaiar a população celular potencialmente transformada pela exposição das células a um agente ou agentes seletivos, ou triar as células para o traço do gene marcador desejado.
[0154] Seleção: Uma modalidade exemplar dos métodos para identificar as células transformadas envolve expor as culturas bombardeadas a um agente seletivo, tais como um inibidor metabólico, um antibiótico, um herbicida ou similares. As células que foram transformadas e integraram estavelmente um gene marcador conferindo resistência ao agente seletivo usado irão crescer e dividir em cultura. As células sensíveis não serão suscetíveis a cultura adicional.
[0155] Para usar o sistema seletivo bar-bialafos ou EPSPS-glifosato, o tecido bombardeado é cultivado por cerca de 0-28 dias em meio não seletivo e subsequentemente transferido para meio que contém a partir de cerca de 1-3 mg/L de bialafos ou cerca de 1-3 mM de glifosato, conforme apropriado. Embora as faixas de cerca de 1-3 mg/L de bialafos ou cerca de 1-3 mM de glifosato possam ser empregadas, é proposto que as faixas de pelo menos cerca de 0,1-50 mg/L de bialafos ou pelo menos cerca de 0,1-50 mM de glifosato irão encontrar utilidade na prática da invenção. O tecido pode ser colocado em qualquer suporte poroso, inerte, sólido ou semissólido para bombardeamento, incluindo, mas sem limitações, os filtros e o meio de cultura sólido. Bialafos e glifosato são providos como exemplos de agentes adequados para seleção de transformantes, mas a técnica desta invenção não é limitada aos mesmos.
[0156] Um exemplo de um traço de marcador triável é o pigmento vermelho produzido sob o controle do locus R no milho. Este pigmento pode ser detectado pelo cultivo de células em um suporte sólido que contém meio nutriente capaz de suportar o crescimento neste estágio e selecionar as células a partir de colônias (agregados visíveis de células) que são pigmentadas. Estas células podem ser cultivadas adicionalmente, tanto em suspensão quanto em meio sólido. O locus R é usado para a seleção de transformantes a partir de embriões imaturos bombardeados. De uma maneira similar, a introdução dos genes C1 e B irá resultar em células e/ou tecidos pigmentados.
[0157] A enzima luciferase também é usada como um marcador triável no contexto da presente invenção. Na presença do substrato luciferina, as células que expressam luciferase emitem luz que pode ser detectada em filme fotográfico ou de raio X, em um luminômetro (ou contador de cintilação líquida), por dispositivos que intensificam a visão noturna, ou por uma câmera de vídeo altamente sensível à luz, tal como uma câmera de contagem de fótons. Todos estes ensaios são não destrutivos e as células transformadas podem ser cultivadas adicionalmente seguindo a identificação. A câmera de contagem de fótons é especialmente valiosa já que a mesma permite que identifiquem-se células ou grupos de células específicos que estão expressando luciferase e manipulem-se os mesmos em tempo real.
[0158] É adicionalmente contemplado que as combinações de marcadores triáveis e selecionáveis podem ser usadas para identificação de células transformadas. Por exemplo, a seleção com um composto de inibição de crescimento, tais como bialafos ou glifosato, em concentrações abaixo daquelas que causam 100% de inibição seguida pela triagem de tecido em crescimento para expressão de um gene marcador triável, tal como luciferase, irá permitir que recuperem-se transformantes a partir de tipos de célula ou tecido que não são suscetíveis à seleção individualmente. Em uma modalidade ilustrativa, calo embriogênico Tipo II de Zea mays L. pode ser selecionado com níveis subletais de bialafos. O tecido lentamente em crescimento foi subsequentemente triado para a expressão do gene luciferase e transformantes podem ser identificados.
[0159] Regeneração e Produção de Semente: Células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo, ou células que foram pontuadas positivas em um ensaio de triagem, são cultivadas em meio que suporta regeneração de vegetais. Um exemplo de um regulador de crescimento que pode ser usado para tais propósitos é dicamba ou 2,4-D. Entretanto, outros reguladores de crescimento podem ser empregados, incluindo NAA, NAA + 2,4-D ou, talvez, até mesmo picloram. A melhoria do meio destas e semelhantes maneiras pode facilitar o crescimento das células em estágios de desenvolvimento específicos. O tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores de crescimento até que tecido suficiente esteja disponível para começar os esforços de regeneração do vegetal, ou seguindo repetidas rodadas de seleção manual, até que a morfologia do tecido seja adequada para regeneração, pelo menos duas semanas, então, transferida para meio conducente para a maturação de embrióides. Culturas são tipicamente transferidas a cada duas semanas neste meio. O desenvolvimento de broto sinaliza o tempo para transferir para meio que carece de reguladores de crescimento.
[0160] As células transformadas, identificadas pela seleção ou triagem e cultivadas em um meio apropriado que suporta regeneração, podem, então, ser permitidas a maturar em vegetais. Plântulas em desenvolvimento são transferidas para mistura de crescimento de vegetal sem solo, e endurecidas, por exemplo, em uma câmara ambientalmente controlada em cerca de 85% de umidade relativa, cerca de 600 ppm de CO2, e em cerca de 25-250 microeinsteins/seg∙m2 de luz. Vegetais podem ser maturados tanto em uma câmara de crescimento quanto em estufa. Vegetais são regenerados de cerca de 6 semanas até 10 meses depois que um transformante for identificado, dependendo do tecido inicial. Durante a regeneração, células são crescidas no meio sólido em vasos de cultura de tecido. As modalidades ilustrativas de tais vasos são placas de Petri e Plant Con™. Vegetais em regeneração podem ser crescidos em cerca de 19 °C até 28 °C. Depois que os vegetais em regeneração tiverem alcançado o estágio de desenvolvimento broto e raiz, os mesmos podem ser transferidos para uma estufa para crescimento e teste adicionais.
[0161] Os vegetais maduros são, então, obtidos a partir de linhas de célula que são conhecidas por expressar o traço. Em algumas modalidades, os vegetais regenerados são autopolinizados. Além do mais, o pólen obtido a partir dos vegetais regenerados pode ser cruzado para semear vegetais crescidos de linhas congênitas agronomicamente importantes. Em alguns casos, pólen proveniente dos vegetais destas linhas congênitas é usado para polinizar vegetais regenerados. O traço é geneticamente caracterizado pela avaliação da segregação do traço na progênie das primeira e posterior gerações. A hereditariedade e expressão em vegetais de traços selecionados na cultura de tecido são de importância em particular se os traços precisarem ser comercialmente úteis.
[0162] Vegetais regenerados podem ser repetidamente cruzados em vegetais congênitos a fim de introgredir os ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD no genoma dos vegetais congênitos. Este processo é referido como conversão por retrocruzamento. Quando um número suficiente de cruzamentos no pai congênito recorrente tiver sido concluído a fim de produzir um produto do processo de conversão por retrocruzamento que é substancialmente isogênico com o pai congênito recorrente, exceto pela presença dos ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD introduzidos, o vegetal é autopolinizado pelo menos uma vez a fim de produzir um congênito convertido por retrocruzamento em homozigoto contendo os ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD. A progênie destes vegetais são verdadeiras procriações.
[0163] Alternativamente, a semente proveniente de vegetais monocotiledôneos transformados regenerados a partir da cultura de tecidos transformada é crescida no campo e autopolinizada para gerar vegetais de verdadeira procriação.
[0164] Semente proveniente dos vegetais transgênicos férteis pode, então, ser avaliada pela presença e/ou expressão dos ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD (ou da enzima aciltransferase BAHD). Vegetal transgênico e/ou tecido de semente podem ser analisados pela expressão de aciltransferase BAHD usando métodos padrões, tais como eletroforese em gel de poliacrilamida SDS, cromatografia líquida (por exemplo, HPLC) ou outros meios de detecção de um produto da atividade de aciltransferase BAHD.
[0165] Uma vez que uma semente transgênica que expressa a sequência de aciltransferase BAHD e com uma modificação no conteúdo do monolignol éster conjugado na lignina do vegetal for identificada, a semente pode ser usada para desenvolver vegetais de verdadeira procriação. Os vegetais de verdadeira procriação são usados para desenvolver uma linha de vegetais com uma modificação no conteúdo do monolignol éster conjugado na lignina do vegetal ao mesmo tempo em que ainda mantém outros desejáveis traços agronômicos funcionais. Adição do traço do conteúdo do conjugado de monolignol éster modificado na lignina do vegetal pode ser alcançada por retrocruzamento com este traço e com vegetais que não exibem este traço e pelo estudo do padrão de herança em gerações de segregação. Aqueles vegetais que expressam o traço alvo de uma maneira dominante são preferivelmente selecionados. O retrocruzamento é realizado pelo cruzamento dos vegetais transgênicos férteis originais com um vegetal proveniente de uma linha congênita que exibe desejáveis características agronômicas funcionais, ao mesmo tempo em que não necessariamente expressam o traço do conteúdo do conjugado de monolignol éster modificado na lignina do vegetal. As progênies resultantes são, então, retrocruzadas com o pai que expressa o traço do conteúdo do conjugado de monolignol éster modificado. A progênie proveniente deste cruzamento também irá segregar, de forma que partes da progênie conduzam o traço e partes não. Este retrocruzamento é repetido até uma linha congênita com os desejáveis traços agronômicos funcionais, e com expressão do traço envolvendo conteúdo do conjugado de monolignol éster modificado na lignina do vegetal. Tal expressão do conteúdo do conjugado de monolignol éster modificado na lignina do vegetal pode ser expressada de uma maneira dominante.
[0166] Subsequente ao retrocruzamento, os inovadores vegetais transgênicos podem ser avaliados para um conteúdo do conjugado de monolignol éster modificado incorporado na lignina do vegetal. Isto pode ser feito, por exemplo, pela análise NMR da íntegra das paredes de célula vegetal (Kim, H., and Ralph, J. (2010) Solution-state 2D NMR of ball-milled plant cell wall gels in DMSO-d6/pyridine-d5. Org. Biomol. Chem.
8(3):576-591; Yelle, D.J., Ralph, J., and Frihart, C.R. (2008) Characterization of non- derivatized plant cell walls using high-resolution solution-state NMR spectroscopy. Magn. Reson. Chem. 46(6):508-517; Kim, H., Ralph, J., and Akiyama, T. (2008) Solução-state 2D NMR of Ball-milled Plant Cell Wall Gels in DMSO-d6. BioEnergy Research 1(1):56-66; Lu, F., and Ralph, J. (2003) Non-degradative dissolution and acetylation of ball-milled plant cell walls; high-resolution solution-state NMR. Plant J. 35(4):535-544). Os inovadores vegetais transgênicos também podem ser avaliados por uma bateria de características agronômicas funcionais, tais como alojamento, dureza do cerne, rendimento, resistência a doença, resistência a pestes de inseto, resistência a seca, e/ou resistência a herbicida.
[0167] Vegetais que podem ser melhorados por estes métodos incluem, mas sem limitações, vegetais de óleo e/ou amido (canola, batatas, lupinos, girassol e semente de algodão), vegetais forrageiros (alfafa, trevo e festuca), grãos (milho, trigo, cevada, aveia, arroz, sorgo, milheto e centeio), gramíneas (switchgrass, gramínea de pradaria, gramínea de trigo, capim Sudão, sorgo, vegetais que produzem palha), madeira macia, madeira dura e outros vegetais lenhosos (por exemplo, aqueles usados para a produção de papel, tais como espécies de álamo, espécies de pinheiro, e eucalipto). Em algumas modalidades, o vegetal é uma gimnosperma. Exemplos de vegetais usados para produção de polpa e papel incluem a maior parte das espécies de pinheiro, tais como pinus taeda, pinheiro do Labrador, pinheiro do sul, pinheiro Radiata, abeto, abeto de Douglas, e outros. Madeiras duras que podem ser modificadas da forma aqui descrita incluem álamo tremedor, álamo, eucalipto, e outros. Vegetais usados para fazer biocombustíveis e etanol incluem milho, gramíneas (por exemplo, miscanto, switchgrass, e similares), bem como árvores, tais como álamo, álamo tremedor, salgueiro, e similares. Vegetais usados para gerar forragem de laticínio incluem legumes, tais como alfafa, bem como gramíneas de forragem, tais como bromus e bluestem.
[0168] Determinação de Tecidos Vegetais Estavelmente Transformados: Para confirmar a presença dos ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD nos vegetais em regeneração, ou sementes ou progênie derivada a partir do vegetal regenerado, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaio biológico molecular disponível aos versados na técnica, tais como Southern e Northern blotting e PCR; ensaio bioquímico, tal como detecção da presença de um produto de proteína, por exemplo, por meios imunológicos (ELISAs e Western blots) ou por função enzimática; ensaios de parte do vegetal, tais como ensaios da folha, da semente ou da raiz; e, também, pela análise do fenótipo da íntegra do vegetal regenerado.
[0169] Enquanto que as técnicas de análise de DNA podem ser conduzidas usando DNA isolado a partir de qualquer parte de um vegetal, RNA apenas pode ser expressado em tipos de células ou tecido em particular e, portanto, RNA para análise pode ser obtido a partir destes tecidos. As técnicas PCR também podem ser usadas para detecção e quantificação do RNA produzido a partir dos ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD introduzidos. PCR também é usado para transcrever de forma reversa RNA em DNA, usando enzimas, tal como transcriptase reversa, e, então, este DNA pode ser amplificado através do uso de técnicas PCR convencionais. A informação adicional sobre a natureza do produto de RNA pode ser obtida por Northern blotting. Esta técnica irá demonstrar a presença de uma espécie de RNA e dá informação sobre a integridade deste RNA. A presença ou a ausência de uma espécie de RNA também podem ser determinadas usando hibridizações dot ou slot blot Northern. Estas técnicas são modificações de Northern blotting e também demonstram a presença ou a ausência de uma espécie de RNA.
[0170] Embora Southern blotting e PCR possam ser usados para detectar o ácido nucleico de aciltransferase BAHD em questão, os mesmos não proveem a informação quanto a se o segmento DNA de pré-selecionado está sendo expressado. A expressão pode ser avaliada pela identificação especificamente dos produtos de proteína dos ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD introduzidos ou avaliação das mudanças fenotípicas promovidas por sua expressão.
[0171] Ensaio para a produção e a identificação de proteínas específicas pode fazer uso de propriedades físico-química, estrutural, funcional ou outras propriedades das proteínas. Propriedades físico-química ou estrutural exclusivas permitem que as proteínas sejam separadas e identificadas por procedimentos eletroforéticos, tal como eletroforese em gel nativa ou de desnaturação ou focalização isoelétrica, ou por técnicas cromatográficas, tais como troca de íons, cromatografia líquida ou cromatografia de exclusão de gel. As estruturas exclusivas de proteínas individuais oferecem oportunidades para uso de anticorpos específicos para detectar sua presença em formatos, tal como um ensaio ELISA. As combinações de abordagens podem ser empregadas com especificidade ainda maior, tal como Western blotting, em que os anticorpos são usados para localizar produtos de gene individuais que foram separados por técnicas eletroforéticas. Técnicas adicionais podem ser empregadas para confirmar absolutamente a identidade da aciltransferase BAHD, tal como avaliação por sequenciamento de aminoácido seguindo purificação. Os exemplos desta aplicação também proveem procedimentos de ensaio para detecção e quantificação da atividade de aciltransferase BAHD. Outros procedimentos podem ser adicionalmente usados.
[0172] A expressão de um produto de gene também pode ser determinada pela avaliação dos resultados fenotípicos de sua expressão. Este ensaio também pode tomar muitas formas, incluindo, mas sem limitações, a análise de mudanças na composição química, morfologia, ou propriedades fisiológicas do vegetal. A composição química pode ser alterada pela expressão dos segmentos de DNA pré- selecionados que codificam proteínas de armazenamento que mudam a composição do aminoácido e podem ser detectados pela análise do aminoácido.
[0173] A expressão de XMTs em um vegetal irá modular ou alterar os conjugados de monolignol éster no vegetal, tal como na lignina do vegetal. Por exemplo, aumentar um pBMT, um FMT, um PMT, um AMT, e/ou um BMT irá aumentar a quantidade absoluta ou a proporção relativa de monolignol p-hidroxibenzoatos, monolignol ferulatos, monolignol p-coumaratos, monolignol acetatos, e/ou monolignol benzoatos, respectivamente, no vegetal, tal como na lignina do vegetal.
[0174] Aumentar a atividade de pBMT em um vegetal pode ter um ou mais dos seguintes efeitos ou vantagens: aumentar a produção de pBA, que pode ser isolado para venda como um produto químico tipo commodity; controlar a produção de pBA de uma maneira específica de tecido para otimizar a produção de pBA, ao mesmo tempo em que não impacta a quantidade de biomassa que afeta os rendimentos do açúcar que pode ser isolado a partir da biomassa; produz um tipo inovador de molécula hidroliticamente digestível em vegetais (por exemplo, monolignol vanilato e/ou monolignol siringato); e aumentar a resistência fúngica, microbiana e a inseto.
[0175] Aumentar a atividade de FMT em um vegetal pode ter um ou mais dos seguintes efeitos ou vantagens: aumentar a produção de monolignol ferulato para aumentar a digestibilidade hidrolítica da lignina em vegetais; controlar a produção e a especificidade de tecido do monolignol ferulato; aumentar a digestibilidade e melhorar a polpação; e aumentar a resistência fúngica, microbiana e a inseto.
[0176] Aumentar a atividade de PMT em um vegetal pode ter um ou mais dos seguintes efeitos ou vantagens: aumentar a produção de monolignol p-coumarato (ligado em metabólito ou parede celular); controlar a produção e a especificidade de tecido de monolignol p-coumarato; e aumentar a resistência fúngica, microbiana, e a inseto.
[0177] Aumentar a função BMT e a atividade de utilidade em um vegetal pode ter um ou mais dos seguintes efeitos ou vantagens: aumentar a produção de BA (ligado a metabólito ou parede celular); controlar a produção e a especificidade de tecido de BA; e aumentar a resistência fúngica, microbiana e a inseto. INIBIÇÃO, KNOCKDOWN, OU KNOCKOUT DE ACILTRANSFERASES
[0178] Ácidos nucleicos que codificam aciltransferases BAHD podem ser alvejados para inibição, knockdown ou knockout. Tais ácidos nucleicos podem incluir um ácido nucleico que pode hibridizar seletivamente em um DNA com uma sequência SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17, e/ou um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18, e/ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da aciltransferase BAHD que compreende uma sequência substancialmente idêntica à sequência de aminoácido SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18, e/ou um ácido nucleico que codifica uma aciltransferase BAHD com pelo menos cerca de 50% de pelo menos uma atividade de aciltransferase BAHD de uma aciltransferase BAHD com a sequência de aminoácido SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18.
[0179] Métodos para inibir, realizar knockdown ou knockout ácidos nucleicos que codificam aciltransferases BAHD são descritos a seguir e na Publicação US 2016/0046955, que é aqui incorporada pela referência.
[0180] Ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD que são endógenos em várias espécies de células vegetais, sementes e vegetais podem ser alvejados para knockout por mutação usando tecnologia mutagênica ou recombinante. Além do mais, ácidos nucleicos inibitórios que são homólogos, idênticos e/ou complementares a qualquer um dos ácidos nucleicos SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17 de aciltransferase BAHD podem ser usados para inibir a expressão de uma aciltransferase BAHD.
[0181] São aqui providos vegetais mutantes de knockout PMT parcial ou completo e células vegetais de knockout PMT parcial ou completo. “Knockout” significa que um vegetal tem uma mutação em um gene de aciltransferase BAHD endógeno que substancialmente reduz ou deleta a expressão da função da proteína codificada pelo gene, se comparado com um vegetal tipo selvagem que não tem tal mutação. Por exemplo, uma mutação de knockout pode reduzir a expressão de aciltransferase BAHD em cerca de 80%, ou em 90%, ou em 95%, ou em 98%, ou em 99%, ou em 100%.
[0182] “Knockdown” significa que a expressão ou a função de um gene endógeno é parcialmente suprimida. Knockdown pode ser alcançado pela mutação do gene endógeno de forma que uma proteína com reduzida função seja expressada, ou pela introdução de um RNA inibitório que reduz a produção da proteína ativa. Por exemplo, um knockdown pode reduzir a expressão de aciltransferase BAHD em pelo menos 10%, ou em 20%, ou em 30%, ou em 40%, ou 50%, ou em 60%, ou em 70%. Embora knockdown seja, no geral, entendido por reduzir apenas parcialmente a função de um gene, a expressão de aciltransferase BAHD pode ser reduzida pela introdução de um ácido nucleico inibitório em cerca de 95%.
[0183] Vegetais, células vegetais e sementes podem ter a mutação de knockout e/ou knockdown. Vegetais, células vegetais e sementes também podem ter um ácido nucleico inibitório que reduz a expressão de aciltransferase BAHD. Ácidos nucleicos de aciltransferase BAHD inibitórios podem levar à completa ou parcial redução da expressão de aciltransferase BAHD. As sequências de ácido nucleico que podem facilitar knockout parcial e completo de aciltransferase BAHD em células vegetais e vegetais também são aqui providas, e são referidas como ácidos nucleicos de mutação de aciltransferase BAHD.
[0184] As moléculas de ácido nucleico de aciltransferase BAHD de knockout ou knockdown mutantes endógenas podem incluir uma ou mais mutações, tais como uma ou mais mutações pontuais, mutações sem sentido, mutações de códão de terminação, mutações de inserção, mutação de deleção, mutações de deslocamento e/ou mutações de sítio de união. Basicamente, um ácido nucleico de aciltransferase BAHD de knockout ou knockdown endógeno pode incluir qualquer mutação que resulta em pouca ou nenhuma expressão da proteína de aciltransferase BAHD, ou em expressão de uma proteína de aciltransferase BAHD que tem pelo menos uma inserção, deleção e/ou substituição de aminoácido em relação à proteína tipo selvagem resultante em uma proteína de aciltransferase BAHD não funcional ou nenhuma proteína de aciltransferase BAHD em absoluto. Tais mutações resultam em um alelo de aciltransferase BAHD de knockout parcial ou completo. Entretanto, é entendido que é mais provável que as mutações em certas partes da proteína resultem em uma proteína de aciltransferase BAHD não funcional, tais como mutações que levam a proteínas truncadas. Tais proteínas truncadas podem ter um ou mais dos resíduos de aminoácido funcionais ou partes significativas dos domínios funcionais deletados ou substituídos.
[0185] Assim, em uma modalidade, as sequências de ácido nucleico compreendendo uma ou mais das mutações supradescritas são providas (em forma isolada), bem como vegetais, células vegetais, partes de vegetal e sementes de vegetal compreendendo endogenamente tais sequências. Alelos de aciltransferase BAHD mutantes podem ser gerados (por exemplo, induzidos por mutagênese química ou recombinante) e/ou identificados usando uma faixa de métodos disponíveis na tecnologia (por exemplo usando métodos com base em PCR para amplificar partes ou a íntegra do DNA ou cDNA genômico de aciltransferase BAHD mutante).
[0186] Alelos de aciltransferase BAHD mutantes podem ser gerados e/ou identificados usando uma faixa de métodos disponíveis. Por exemplo, knockout parcial ou completo da função aciltransferase BAHD pode ser induzido por mutagênese química ou insercional, tecnologia recombinante, e outras técnicas disponíveis. Mutágenos, tais como etil metanossulfonato, radiação, transformação de T-DNA mediada por Agrobacterium tumefaciens, mutagênese de transpóson, alvejamento mediado por nuclease de dedo de zinco (ZFN) de genes naturais por recombinação homóloga, e variações dos mesmos podem ser usados. Em algumas modalidades, o Rapid Trait Development System (RTDS™) desenvolvido por Cibus pode ser empregado (veja, página da Internet em cibus.com). As modalidades adicionais incluem o uso de CRISPR/Cas9. Veja Liu et al. (Liu X, Wu S, Xu J, Sui C, Wei J. (2017) Application of CRISPR/Cas9 in plant biology. Acta Pharm Sin B. 7(3):292-302).
[0187] Sementes de vegetal ou células vegetais compreendendo um ou mais alelos de aciltransferase BAHD mutantes podem ser geradas e identificadas usando outros métodos, tal como o método “Delete-a-gene™” que emprega PCR para triar os mutantes de deleção gerados por rápida mutagênese de nêutron (revisado por Li and Zhang, 2002, Funct Integr Genomics 2:254-258), pelo método TILLING (Alvejamento de Lesões Locais Induzida Em Genomas) que identifica mutações pontuais induzidas por EMS usando cromatografia líquida de alto desempenho por desnaturação (DHPLC) para detectar mudanças de par base por análise de heteroduplex (McCallum et al. (2000) Nat Biotech 18:455; McCallum et al. (2000) Plant Physiol. 123:439-442; etc.). Da forma mencionada, TILLING usa triagem de alta produtividade para mutações (por exemplo, usando clivagem Cel 1 de heteroduplexes de DNA tipo mutante-selvagem e detecção usando um sistema de gel de sequenciamento). O uso de TILLING para identificar vegetais ou partes de vegetal compreendendo um ou mais alelos de aciltransferase BAHD mutantes e métodos para gerar e identificar tais vegetais, órgãos de vegetal, tecidos e sementes é aqui abrangido.
[0188] Os métodos aqui providos também podem incluir uma ou mais das seguintes etapas: mutagenizar células ou sementes de vegetais (por exemplo, mutagênese de EMS, inserção de T-DNA, mutação por meio de inserção recombinante ou substituição de sequências defeituosa), conjugação de indivíduos vegetais ou DNA vegetal, amplificação PCR de uma região de interesse, formação de heteroduplex e detecção de alta produtividade, identificação de um vegetal ou DNA mutantes, e/ou sequenciamento de produtos de ácido nucleico mutantes. Entende-se que outros métodos de mutagênese e seleção também podem ser usados para gerar tais vegetais mutantes.
[0189] Em vez de induzir mutações nos alelos de aciltransferase BAHD, os alelos mutantes naturais (espontâneos) podem ser identificados por métodos disponíveis na tecnologia. Por exemplo, ECOTILLING pode ser usado (Henikoff et al. (2004), Plant Physiology 135(2):630-6) para triar uma pluralidade de vegetais ou partes de vegetal pela presença de alelos de aciltransferase BAHD mutantes naturais. Quanto às técnicas de mutagênese expostas, espécies são triadas de forma que o alelo de aciltransferase BAHD identificado possa ser subsequentemente introduzido em outra espécie, tais como qualquer um daqueles aqui listados, por cruzamento (cruzamentos inter ou intraespecífico) e seleção. Em ECOTILLING, polimorfismos naturais em linhas de procriação ou espécies relacionadas são triados pela metodologia TILLING supradescrita, em que indivíduos ou conjugações de vegetais são usados para amplificação PCR do alvo de aciltransferase BAHD, formação de heteroduplex e análise de alta produtividade. Isto pode ser seguido pela seleção de vegetais individuais com uma mutação exigida que pode ser usada subsequentemente em um programa de procriação para incorporar o alelo mutante desejado.
[0190] Os alelos mutantes identificados podem ser sequenciados e a sequência pode ser comparada com o alelo tipo selvagem para identificar a(s) mutação(ões). Opcionalmente, se um alelo mutante funciona como um alelo mutante de aciltransferase BAHD de knockout parcial ou completo pode ser testado da forma aqui descrita. Usando esta abordagem, uma pluralidade de alelos de aciltransferase BAHD mutantes (e vegetais compreendendo um ou mais dos mesmos) podem ser identificados. Os alelos mutantes desejados podem, então, ser combinados com os alelos tipo selvagem desejados pelos métodos de cruzamento e seleção. Um único vegetal compreendendo o número desejado de aciltransferase BAHD mutante e o número desejado de alelos de aciltransferase BAHD tipo selvagem e ou knockout é gerado.
[0191] Os alelos ou vegetais de aciltransferase BAHD mutantes compreendendo alelos de aciltransferase BAHD mutantes podem ser identificados ou detectados por métodos disponíveis na tecnologia, tais como sequenciamento direto, ensaio com base em PCR ou ensaio com base em hibridização. Alternativamente, os métodos também podem ser desenvolvidos usando a informação de sequência específica de alelo de aciltransferase BAHD mutante específico aqui provida. Tais métodos de detecção alternativos incluem métodos de detecção de amplificação de sinal linear com base em clivagem invasiva de estruturas de ácido nucleico em particular, também conhecida como tecnologia Invader™ (da forma descrita, por exemplo, em Patente US 5.985.557 “Invasive Cleavage of Nucleic Acids”, Patente US 6.001.567 “Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage”, aqui incorporadas pela referência), métodos de detecção com base em RT-PCR, tal como Taqman, ou outros métodos de detecção, tal como SNPlex. Em resumo, na tecnologia Invader™, a sequência de mutação alvo pode ser, por exemplo, hibridizada com um primeiro oligonucleotídeo de ácido nucleico rotulado compreendendo a sequência de nucleotídeo da sequência de mutação ou uma sequência que abarca a região de associação entre a região de flanqueamento 5′ e a região de mutação e com um segundo oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de flanqueamento 3′ imediatamente à jusante e adjacente à sequência de mutação, em que o primeiro e o segundo oligonucleotídeos sobrepõem em pelo menos um nucleotídeo. A estrutura duplex ou triplex que é produzida por esta hibridização permite a clivagem de sonda seletiva com uma enzima (Cleavase ®) que deixa a sequência alvo intacta. A sonda rotulada clivada é subsequentemente detectada, potencialmente, por meio de uma etapa intermediária resultante em amplificação de sinal adicional.
[0192] Seguindo a mutagênese, os vegetais são crescidos a partir de sementes tratadas, ou regenerados a partir das células tratadas usando técnicas disponíveis. Por exemplo, sementes mutagenizadas podem ser plantadas de acordo com procedimentos de crescimento convencionais e, seguinte a autopolinização, a semente é formada nos vegetais. Alternativamente, plântulas haplóide dobradas podem ser extraídas a partir do microesporo ou das células de pólen tratadas para formar imediatamente os vegetais homozigotos. As sementes formadas em decorrência de tal autopolinização ou as sementes provenientes de gerações subsequentes podem ser coletadas e triadas pela presença de alelos de aciltransferase BAHD mutantes, usando técnicas que estão disponíveis na tecnologia, por exemplo, técnicas com base em reação de cadeia polimerase (PCR) (amplificação dos alelos de aciltransferase BAHD) ou técnicas com base em hibridização, por exemplo, análise Southern blot, triagem de biblioteca BAC, e similares, e/ou sequenciamento direto de alelos de aciltransferase BAHD. Para triar a presença de mutações pontuais (por exemplo, Polimorfismos de Nucleotídeo Individual ou SNPs) em alelos de aciltransferase BAHD mutantes, métodos de detecção de SNP disponíveis podem ser usados, por exemplo, técnicas com base em oligoligação,
técnicas com base em extensão de base individual, tal como pirossequenciamento, ou técnicas com base em diferenças em sítios de restrição, tal como TILLING.
[0193] A invenção também provê ácidos nucleicos inibitórios que podem reduzir a expressão e/ou a tradução de aciltransferases BAHD em vegetal ou células vegetais. Em outras modalidades, a invenção provê mutação de ácidos nucleicos que podem knockout a expressão de uma aciltransferase BAHD em um vegetal ou uma célula vegetal. O ácido nucleico inibitório pode, por exemplo, reduzir a expressão de uma aciltransferase BAHD em qualquer quantidade, tais como, por exemplo, em 2%, 5%, 10%, 20%, 40% ou mais do que 40%.
[0194] Em uma modalidade, um ácido nucleico inibitório pode ser um oligonucleotídeo que irá hibridizar em um ácido nucleico de aciltransferase BAHD sob condições intracelular, fisiológica ou rigorosa. O oligonucleotídeo é capaz de reduzir a expressão de um ácido nucleico que codifica a aciltransferase BAHD. Um ácido nucleico que codifica uma aciltransferase BAHD pode ser DNA genômico, bem como RNA mensageiro. O ácido nucleico inibitório pode, por exemplo, ser incorporado em um vetor de plasmídeo ou DNA viral. O ácido nucleico inibitório pode ser de fita única ou de fita dupla, circular ou linear. O ácido nucleico inibitório também pode ter uma estrutura de tronco-laço.
[0195] Um ácido nucleico mutante pode, por exemplo, ter dois segmentos que são complementares a um gene de aciltransferase BAHD alvejado. Um ácido nucleico mutante como este pode hibridizar por meio destes dois segmentos em um gene de aciltransferase BAHD endógeno em uma célula vegetal e substituir ou realizar mutação nos segmentos do gene de aciltransferase BAHD endógeno. Por exemplo, um ácido nucleico mutante pode incluir dois segmentos, referidos como segmento A e segmento B, que são separadamente selecionados a partir de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de aciltransferase BAHD aqui descritas, com um segmento de ácido nucleico de aciltransferase não BAHD entre os segmentos A e B. A sequência de ácido nucleico de aciltransferase não BAHD tem pelo menos um nucleotídeo que pode substituir pelo menos um nucleotídeo in vivo em uma aciltransferase BAHD vegetal endógena. O segmento B é selecionado a partir de uma região que é à jusante (3′) à sequência do segmento A. Os segmentos A e B têm, cada qual, separadamente, cerca de 15-50 nucleotídeos de comprimento, ou cerca de 16-40 nucleotídeos de comprimento, ou cerca de 17-30 nucleotídeos de comprimento, ou cerca de 18-25 nucleotídeos de comprimento, ou qualquer número de nucleotídeos de comprimento entre 15-50 nucleotídeos.
[0196] O segmento de aciltransferase não BAHD te pelo menos um nucleotídeo de comprimento. Entretanto, o segmento de aciltransferase não BAHD também pode ter 1-10.000 nucleotídeos de comprimento, ou 1-1.000 nucleotídeos de comprimento, ou 1-100 nucleotídeos de comprimento, ou 1-50 nucleotídeos de comprimento, ou 1- 20 nucleotídeos de comprimento, ou 5-50 nucleotídeos de comprimento, ou qualquer valor ou faixa numérica entre 1-10.000 nucleotídeos de comprimento.
[0197] Um ácido nucleico mutante como este pode introduzir mutações pontuais no gene de aciltransferase BAHD endógeno, ou o mesmo pode substituir partes completas do gene de aciltransferase BAHD endógeno.
[0198] Os ácidos nucleicos inibitórios ou mutantes podem ser polímeros de nucleotídeos de ribose ou nucleotídeos de desoxirribose. Por exemplo, ácidos nucleicos inibitórios e/ou mutantes podem incluir nucleotídeos de ocorrência natural, bem como nucleotídeos sintéticos, modificado ou pseudonucleotídeos. Os ácidos nucleicos inibitórios e/ou mutantes podem incluir nucleotídeos modificados, tais como fosforotiolatos; nucleotídeos contendo 2′-O-alquila, e nucleotídeos com um rótulo detectável, tal como 32P, biotina ou digoxigenina. Os ácidos nucleicos inibitórios e mutantes podem incluir ácido nucleico de peptídeo (PNA), ácido nucleico travado (LNA) e sequências de nucleotídeo de morfolino.
[0199] Tais ácidos nucleicos inibitórios ou mutantes podem ser de comprimentos variados. Por exemplo, um oligonucleotídeo inibitório pode ter mais do que 13 nucleotídeos, ou mais do que 14 nucleotídeos, ou mais do que 15 nucleotídeos, ou mais do que 16 nucleotídeos, ou mais do que 17 nucleotídeos de comprimento. Ácidos nucleicos mutantes podem ser de comprimento similar, mas são frequentemente mais longos do que os ácidos nucleicos inibitórios. Por exemplo, um ácido nucleico mutante pode ter mais do que 30 nucleotídeos de comprimento.
[0200] Um ácido nucleico inibitório ou mutante que pode reduzir a expressão e/ou a atividade de um ácido nucleico de aciltransferase BAHD pode incluir segmentos que são completamente complementares e/ou completamente idênticos ao ácido nucleico de aciltransferase BAHD (por exemplo, um DNA ou RNA). Alternativamente, alguma variabilidade entre as sequências pode ser permitida. Um ácido nucleico inibitório ou mutante que pode inibir ou knockout um ácido nucleico de aciltransferase BAHD pode hibridizar no ácido nucleico de aciltransferase BAHD sob condições intracelulares ou sob condições de hibridização rigorosas. Por exemplo, um ácido nucleico inibitório ou mutante pode ser suficientemente complementar para inibir a expressão de, ou para recombinar e substituir, um ácido nucleico de aciltransferase BAHD endógeno. As condições intracelulares se referem às condições, tais como temperatura, pH e concentrações de sal, tipicamente encontradas no interior de uma célula, por exemplo, uma célula vegetal viva.
[0201] Ácidos nucleicos inibitórios (por exemplo, oligonucleotídeos) e/ou ácidos nucleicos mutantes podem incluir, por exemplo, 2, 3, 4, ou 5 ou mais trechos de nucleotídeos contíguos que são precisamente complementares a uma sequência de codificação de ácido nucleico de aciltransferase BAHD, cada qual separado por um trecho de nucleotídeos contíguos que não são complementares às sequências de codificação adjacentes, podem inibir a função de um ácido nucleico de aciltransferase BAHD. No geral, cada trecho de nucleotídeos contíguos tem pelo menos 4, 5, 6, 7, ou 8 ou mais nucleotídeos de comprimento. Sequências de intervenção não complementares podem ter 1, 2, 3, ou 4 nucleotídeos de comprimento. Os versados na técnica podem usar facilmente o ponto de fusão calculado de um oligonucleotídeo ou ácido nucleico hibridizado em um ácido nucleico alvo para estimar o grau de divergência que será tolerado para inibir ou realizar mutação da expressão de um ácido nucleico alvo em particular.
[0202] Ácidos nucleicos inibitórios incluem, por exemplo, ribozimas, ácidos nucleicos anti-sentido, RNA interferente, microRNA, pequeno RNA interferente (siRNA), e combinações dos mesmos.
[0203] Uma molécula de ácido nucleico anti-sentido é tipicamente de fita única que é complementar ao ácido nucleico alvo (um ácido nucleico que codifica uma aciltransferase BAHD). O ácido nucleico anti-sentido pode funcionar de uma maneira dependente de enzima ou, mais frequentemente, por bloqueio estérico. O bloqueio estérico anti-sentido, que são independentes de RNase-H, interfere com a expressão do gene ou outros processos celulares dependentes de mRNA pela ligação em um mRNA alvo e atrapalhar outros processos.
[0204] Um oligonucleotídeo anti-sentido pode ser complementar a um ácido nucleico sentido que codifica uma proteína de aciltransferase BAHD. Por exemplo, o mesmo pode ser complementar à fita de codificação de uma molécula de cDNA de fita dupla ou complementar a uma sequência de mRNA. O mesmo pode ser complementar à íntegra de uma fita de codificação ou apenas a uma parte da mesma. O mesmo também pode ser complementar à íntegra ou parte da região de não codificação de um ácido nucleico que codifica uma proteína de aciltransferase BAHD. A região de não codificação inclui as regiões 5′ e 3′ que flanqueiam a região de codificação, por exemplo, as sequências 5′ e 3′ não traduzidas. Um oligonucleotídeo anti-sentido tem, no geral, pelo menos seis nucleotídeos de comprimento, mas pode ter cerca de 8, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 nucleotídeos de comprimento. Oligonucleotídeos mais longos também podem ser usados.
[0205] Um oligonucleotídeo anti-sentido pode ser preparado usando métodos conhecidos na tecnologia, por exemplo, pela expressão a partir de um vetor de expressão que codifica o oligonucleotídeo anti-sentido ou a partir de um cassete de expressão. Por exemplo, um ácido nucleico anti-sentido pode ser gerado simplesmente pela inversão da região de codificação de um mRNA, desse modo, permitindo que uma sequência regulatória (por exemplo, um promotor) transcreva a fita de DNA “errada”. A transcrição assim produzida é um RNA anti-sentido, que irá se ligar e inativar o RNA produzido pelo gene normal.
[0206] A interferência de RNA (também referida como “interferência mediada por RNA”) (RNAi) é um mecanismo efetivo pelo qual a expressão do gene pode ser reduzida ou eliminada. Foi observado que RNA de fita dupla (dsRNA) ou RNA de fita única medeiam a redução, que é um processo multietapas (para detalhes de métodos e composições de RNA de fita única veja Martinez et al. Cell 110(5):563 (2002)). O dsRNA ativa os mecanismos de vigilância da expressão do gene pós-transcricional que parecem funcionar para defender as células de infecção viral e atividade de transpóson (Fire et al. (1998) Nature 391:806-811; Grishok et al. (2001) Cell 106:23- 34; Ketting et al. (1999) Cell 99:133-141; Lin and Avery (1999) Nature 402:128-129; Montgomery et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:15502-15507; Sharp and Zamore (2000) Science 287:2431-2433; Tabara et al. (1999) Cell 99:123-132). A ativação destes mecanismos alveja mRNA complementar de dsRNA maduro para destruição. O RNA de fita dupla reduz a expressão do gene ao qual o dsRNA corresponde.
[0207] Por exemplo, RNAi pode ser feito a partir de dois oligonucleotídeos que consistem em sequências parcialmente complementares. Os oligonucleotídeos podem ser feitos recombinantemente, por exemplo, a partir de um ou dois cassetes de expressão e/ou vetores de expressão.
[0208] O RNAi tem algumas vantagens, incluindo alta especificidade, facilidade de movimento através das membranas celulares, e prolongada infra-regulação do gene alvejado. (Fire et al., 1998; Grishok et al., 2000; Ketting et al., 1999; Lin et al., 1999; Montgomery et al., 1998; Sharp et al., 2000; Tabara et al., 1999). Além do mais, foi mostrado que o dsRNA silencia genes em uma ampla faixa de sistemas, incluindo vegetais, protozoários, fungos, C. elegans, Trypanasoma, Drosophila, e mamíferos (Grishok et al., 2000; Sharp (1999) Genes Dev. 13:139-141; Sharp et al., 2000; Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-498).
[0209] Pequenos RNAs interferentes (siRNAs) ou RNAs de grampo curto (shRNAs) também podem ser usados para reduzir especificamente a expressão de aciltransferase BAHD de maneira tal que o nível de polipeptídeos da aciltransferase
BAHD seja reduzido. Os siRNAs são moléculas de RNA de fita dupla que medeiam o silenciamento genético pós-transcricional de uma maneira específica de sequência. Veja, por exemplo, Hamilton & Baulcombe Science 286(5441):950-952 (1999); Veja também a página da Internet em www.ambion.com/techlib/hottopics/rnai/rnai_may2002_print.html (recuperado pela última vez em 10 de maio de 2006). Uma vez incorporado em um complexo de silenciamento induzido por RNA, o siRNA medeia a clivagem da transcrição do mRNA endógeno homólogo guiando o complexo para a transcrição do mRNA homólogo, que é, então, clivado pelo complexo.
[0210] Por exemplo, siRNA pode ser feito a partir de dois oligonucleotídeos parcialmente ou completamente complementares. Alternativamente, pode ser empregado o RNA de grampo curto (shRNA) que é um oligonucleotídeo que forma uma região de fita dupla pela dobra sobre si mesmo por meio de uma volta de grampo apertada. O siRNA e/ou o shRNA podem ter identidade de sequência, complementariedade de sequência e/ou ser homólogo a qualquer região da transcrição de mRNA da aciltransferase BAHD. A região da homologia ou da complementariedade sequência pode ter 50 nucleotídeos ou menos de comprimento, menos do que 45 nucleotídeos, menos do que 40 nucleotídeos, menos do que 35 nucleotídeos, menos do que 30 nucleotídeos, ou menos do que 25 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a região de homologia ou complementariedade de sequência de um siRNA ou shRNA pode ter cerca de 21 a 23 nucleotídeos de comprimento.
[0211] SiRNA é, tipicamente, de fita dupla e pode ter saliências 3′ de dois nucleotídeos, por exemplo, dinucleotídeos UU salientes em 3′. Os métodos para desenhar siRNAs são conhecidos pelos versados na técnica. Veja, por exemplo, Elbashir et al. Nature 411:494-498 (2001); Harborth et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 13:83-106 (2003). Tipicamente, um sítio alvo que começa com AA, tem saliências 3′ UU para as fitas de siRNA tanto sentido quanto anti-sentido, e com um conteúdo G/C aproximado de 50% sendo selecionado. SiRNAs podem ser quimicamente sintetizados, criados por transcrição in vitro, ou expressados a partir de um vetor de expressão de siRNA ou um cassete de expressão PCR. Veja, por exemplo, a página da Internet em www.ambion.com).
[0212] Quando um shRNA for expressado a partir de um vetor de expressão ou um cassete de expressão PCR, o inserto que codifica o shRNA pode ser expressado como uma transcrição de RNA que dobra em um grampo de shRNA. Assim, a transcrição de shRNA pode incluir uma sequência de siRNA sentido que é ligada a suas sequências de siRNA anti-sentido complementares reversas por uma sequência espaçadora que forma o laço do grampo, bem como uma sequência de Us na extremidade 3’. O laço do grampo pode ser de vários comprimentos. Por exemplo, o laço pode ter 3 a 30 nucleotídeos em comprimento, ou 3 a 23 nucleotídeos de comprimento. Os exemplos de sequências de nucleotídeo para o laço incluem AUG, CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU, CCACACC e UUCAAGAGA.
[0213] Os SiRNAs também podem ser produzidos in vivo pela clivagem de RNA de fita dupla introduzida diretamente ou por meio de um transgene ou vírus.
[0214] O ácido nucleico inibitório também pode ser uma ribozima. Uma ribozima é uma molécula de RNA com atividade catalítica e é capaz de clivar um ácido nucleico de fita única, tal como um mRNA que tem uma região homóloga. Veja, por exemplo, Cech Science 236:1532-1539 (1987); Cech Ann. Rev. Biochem. 59:543-568 (1990); Cech Curr. Opin. Struct. Biol. 2:605-609 (1992); Couture and Stinchcomb Trends Genet. 12:510-515 (1996). Uma ribozima pode ser usada para clivar cataliticamente uma transcrição de mRNA da aciltransferase BAHD e, desse modo, inibir a tradução do mRNA. Veja, por exemplo, Haseloff et al., Patente US 5.641.673. Uma ribozima com especificidade para um ácido nucleico de aciltransferase BAHD pode ser desenhada com base nas sequências de nucleotídeo aqui descritas. Os métodos de desenho e construção de uma ribozima que pode clivar uma molécula de RNA em trans de uma maneira altamente específica de sequência foram desenvolvidos e descritos na tecnologia. Veja, por exemplo, Haseloff et al., Nature 334:585-591 (1988). Uma ribozima pode ser alvejada em um RNA específico pela engenharia de uma região de “hibridização” discreta na ribozima. A região de hibridização contém uma sequência complementar ao RNA alvo que habilita a ribozima a hibridizar especificamente com o alvo. Veja, por exemplo, Gerlach et al., EP 321.201. A sequência alvo pode ser um segmento de cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, ou 50 nucleotídeos contíguos selecionados a partir de um ácido nucleico com qualquer uma das sequências de SEQ ID NO:16, 18, 19, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 47-63 e 64. As sequências complementares mais longas podem ser usadas para aumentar a afinidade da sequência de hibridização para o alvo. As regiões de hibridização e clivagem da ribozima podem ser integralmente relacionadas; assim, mediante a hibridização no RNA alvo através das regiões complementares, a região catalítica da ribozima pode clivar o alvo. Assim, uma ribozima existente pode ser modificada para alvejar um mRNA da aciltransferase BAHD pela modificação da região de hibridização da ribozima para incluir uma sequência que é complementar à aciltransferase BAHD alvo. Alternativamente, um mRNA que codifica uma aciltransferase BAHD pode ser usado para selecionar um RNA catalítico com uma atividade de ribonuclease específica a partir de um agrupamento de moléculas de RNA. Veja, por exemplo, Bartel & Szostak Science 261:1411-1418 (1993).
[0215] Os ácidos nucleicos inibitórios e mutantes podem ser gerados por meios recombinantes, por exemplo, pela expressão a partir de um cassete de expressão ou vetor de expressão. Alternativamente, os ácidos nucleicos inibitórios ou mutantes também podem ser preparados pela síntese química usando nucleotídeos de ocorrência natural, nucleotídeos modificados ou quaisquer combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, estes ácidos nucleicos são feitos a partir de nucleotídeos modificados ou ligações não fosfodiéster, por exemplo, que são desenhadas para aumentar a estabilidade biológica do ácido nucleico ou para aumentar a estabilidade intracelular do duplex formado entre os ácidos nucleicos inibitórios ou mutantes e os ácidos nucleicos endógenos. Os nucleotídeos de ocorrência natural incluem os nucleotídeos de ribose ou desoxirribose adenosina, guanina, citosina, timina e uracila. Os exemplos de nucleotídeos modificados incluem 5-fluorouracila, 5-bromouracila, 5-
clorouracila, 5-iodouracila, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carbóxi- hidroximetil) uracila, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5- carboximetilaminometiluracila, di-hidrouracila, β-D-galactosilqueosina, inosina, N6- isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2- metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7- metilguanina, 5-metilaminometiluracila, 5-metoxiaminometil-2-tiouracila, β-D- manosilqueosina, 5′-metoxicarboximetiluracila, 5-metoxiuracila, 2-metiltio-N6- isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, wibutoxosina, pseudouracila, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-metiluracila, metiléster do ácido uracil-5-oxacético, ácido uracil-5-oxacético, 5-metil-2-tiouracila, 3-(3-amino-3-N- 2-carboxipropil) uracila, (acp3)w, e 2,6-diaminopurina. Assim, os ácidos nucleicos inibitórios ou mutantes podem incluir nucleotídeos modificados, bem como nucleotídeos naturais, tais como combinações de nucleotídeos de ribose e desoxirribose, e ácidos nucleicos inibitórios ou mutantes da invenção podem ser de qualquer comprimento suficiente para inibir ou realizar mutação de um ácido nucleico endógeno.
[0216] A inibição, realização de knockdown ou knockout de XMTs em um vegetal irão modular ou alterar os conjugados de monolignol éster no vegetal, tal como na lignina do vegetal. Por exemplo, a inibição, realização de knockdown ou knockout de um pBMT, um FMT, um PMT, um AMT, e/ou um BMT irão diminuir a quantidade absoluta ou a proporção relativa de monolignol p-hidroxibenzoatos, monolignol ferulatos, monolignol p-coumaratos, monolignol acetatos, e/ou monolignol benzoatos, respectivamente, no vegetal, tal como na lignina do vegetal.
[0217] A diminuição da atividade de pBMT, de PMT, de AMT, e/ou de BMT em um vegetal pode aumentar a digestibilidade hidrolítica da lignina em vegetais pelo aumento da incorporação de monolignol ferulato na lignina em decorrência da redução da competição da passagem metabólica envolvida com a incorporação de monolignol ferulato. A diminuição da atividade de FMT em um vegetal pode auxiliar na produção de monolignol vanilato e/ou monolignol siringato.
[0218] A lignina é um copolímero com três subunidades primárias: p-hidroxifenila (H), guaiacil (G), e siringil (S), derivadas a partir dos álcoois p-coumarílico, coniferílico e sinapílico dos monômeros de lignina coletivamente conhecidos como monolignóis (ML). Em alguns vegetais, uma parte dos monolignóis forma conjugados de éster através de seu grupo -hidróxi, os mesmos sendo chamados conjugados de monolignol (ou conjugados de monolignol éster). Estes conjugados de monolignol são formados por uma subclasse específica de transferases acil BAHD conhecida como coenzima X A monolignol transferases (XMTs), em que X-CoA é o tioéster de uma molécula contendo carboxilado. Foi mostrado que a introdução de conjugados de monolignol em vegetais que não produzem os mesmos nativamente, ou o aumento da quantidade destas subunidades, pode reduzir a recalcitrância da biomassa vegetal e/ou aumentar a quantidade de compostos “limitados” (Rinaldi et al. (2016) Paving the way for lignin valorisation: Recent Advances in Bioengineering, Biorefining e Catalysis. Angew Chem Int Ed Engl. 55(29):8164-8215).
[0219] A tecnologia de zip-lignina foi desenvolvida nos últimos anos como um método para melhorar a eficiência de conversão da biomassa pela redução da recalcitrância na direção da desconstrução da lignina. Isto foi demonstrado funcionar em álamo pela introdução de um gene FMT proveniente de Angelica sinensis (Wilkerson et al. (2014) Monolignol ferulate transferase introduces chemically labile linkages into the lignin backbone. Science 344:90-93). FMT faz monolignol ferulatos pelo acoplamento de monolignóis no feruloil-CoA por meio de uma ligação de éster; os monolignol ferulatos são, por sua vez, incorporados em ligninas resultando na introdução de ligações de éster na cadeia principal do polímero de lignina.
[0220] Um método de valorização é aumentar a quantidade de compostos facilmente limitados para conversão para cima em produtos químicos tipo commodity, tais como ácido p-hidroxibenzóico e ácido benzóico. Estes conjugados de monolignol representam passagens competitivas na produção de monolignol ferulatos. Redução da produção de benzoatos ou p-hidroxibenzoatos pode levar a um agrupamento aumentado de substratos para a formação de zip-lignina. Alternativamente, a supressão da produção de monolignol ferulatos pode aumentar a quantidade de p- hidroxibenzoato nas paredes celulares, aumentando o rendimento em potencial na limitação de produtos químicos tipo commodity.
[0221] As mudanças na expressão de monolignol transferase alteram os metabólitos do vegetal. Estas alterações podem produzir linhas vegetais com melhor resistência a doença (fúngica ou bacteriana) e/ou a inseto.
[0222] As sequências genéticas foram obtidas a partir de NCBI GenBank. Comparações da sequência de proteína foram feitas com NCBI BLAST+ 2.5.0 usando definições padrões. A identidade de sequência é relatada tanto como um percentual, bem como uma fração, em que o numerador é o número de resíduos idênticos, e o denominador é o comprimento da região combinada.
[0223] Os genes foram sintetizados por GenScript Corporation (Piscataway, NJ) e clonados no vetor de expressão livre de célula de germe de trigo, pEU (Sawasaki, T., Hasegawa, Y., Tsuchimochi, M., Kasahara, Y. and Endo, Y. (2000) Construction of an efficient expression vector for coupled transcription/translation in a wheat germ cell- free system. Nucleic Acids Symposium Series, 9-10), que contém um promotor de SP6 e uma sequência intensificadora de ômega proveniente do vírus do mosaico do tabaco. O DNA de plasmídeo foi purificado a partir de E. coli usando um kit de purificação comercial, então, tratado com proteinase K e repurificado para remover a atividade de RNAse residual e para concentrar o DNA. Todos os genes sintetizados para teste incluíram uma sequência ATGGGA adicional na extremidade 5’ da sequência de codificação XMT nativa, desse modo, introduzindo uma metionina e uma glicina no N-terminal de cada proteína expressada.
[0224] O RNA mensageiro foi preparado pela adição de 1,6 U de SP6 RNA polimerase e 1 U de inibidor de RNasin RNase (Promega Corporation, Madison, WI) no DNA de plasmídeo (0,2 mg/mL ou superior) na presença de 2,5 mM, cada qual, de UTP, CTP, ATP, e GTP e 20 mM acetato de magnésio, 2 mM HCl de espermidina, 10 mM DTT, e 80 mM de HEPES-KOH, pH 7,8. As reações de transcrição foram incubadas em 37 °C por 4 h e visualmente monitoradas pela aparição de subprodutos de pirofosfato insolúveis, que são indicativos de transcrição bem-sucedida.
[0225] As enzimas ativas foram produzidas usando um método bicamada de tradução livre de célula de germe de trigo previamente relatado (Makino, S., Beebe, E.T., Markley, J.L. and Fox, B.G. (2014) Cell-free protein synthesis for functional and structural studies. Methods in Molecular Biology, 1091:161-178). Em resumo, uma mistura de reação de tradução que consiste em 60 OD de extrato de germe de trigo (CellFree Sciences, Matsuyama, Japão), 0,04 mg/mL de creatina quinase, 0,3 mM de cada aminoácido, 12,6 mM de HEPES-KOH, pH 7,8, 52,6 mM de acetato de potássio, 1,3 mM de acetato de magnésio, 0,2 mM de HCl de espermidina, 2,1 mM de DTT, 0,6 mM de ATP, 0,13 mM de GTP, 8,4 mM de creatina fosfato, e 0,003% de azida de sódio foi preparado e combinado com transcrição não purificada fresca em uma razão de 4 partes de mistura da reação por 1 parte de transcrição. Uma camada de alimentação foi preparada consistindo em 0,3 mM de cada aminoácido, 24 mM de HEPES-KOH, pH 7,8, 100 mM de acetato de potássio, 2,5 mM de acetato de magnésio, 0,4 mM de HCl de espermidina, 4 mM de DTT, 1,2 mM de ATP, 0,25 mM de GTP, 16 mM de creatina fosfato, e 0,005% de azida de sódio, da qual 125 µL foram adicionados nos poços de uma placa de 96 poços em base U. 25 µL da mistura de reação de tradução mais densa foram cuidadosamente dispostos em camadas abaixo da camada de alimentação, formando uma bicamada. A placa foi vedada e incubada em 22 °C por 18 h. Os 150 µL da reação bicamada completamente difundida foram, então, coletados e usados para análise de expressão por SDS-PAGE, e triagem da atividade.
[0226] A mistura de enzima foi triada pela atividade com acetil-CoA, benzoil-CoA, p-hidroxibenzoil-CoA, feruloil-CoA, e p-coumaroil-CoA, e todos os três monolignóis (álcool hidroxicinamílico, coniferílico, e sinapílico). As enzimas foram testadas em bateladas de dez enzimas contra cada substrato CoA e todos os três monolignóis, junto a controles positivo e negativo, seguindo o procedimento previamente relatado (Withers, S., Lu, F., Kim, H., Zhu, Y., Ralph, J. and Wilkerson, C.G. (2012) Identification of a grass-specific enzyme that acylates monolignols with p-coumarate. Journal of Biological Chemistry, 287:8347-8355). Se os resultados positivos foram observados com um ou mais substratos CoA e os três monolignóis, as enzimas na batelada foram testadas individualmente pela atividade. Para reações individuais, o ensaio foi iniciado pela adição de 10 L de tradução livre de célula de germe de trigo contendo uma das enzimas em uma concentração de 1,5-2 M em uma reação contendo 50 mM tampão de fosfato de sódio, pH 6, 1 mM de ditiotreitol (DTT), 1 mM de tioéster CoA, 1 mM de mistura de monolignol (cada monolignol em concentração de 1 mM), e água deionizada em um volume final de 50 L. Depois de uma incubação de 30 minutos, a reação foi interrompida pela adição de um igual volume de 100 mM ácido hidroclórico. Os produtos da reação foram solubilizados pelo ajuste da solução em metanol 50%. Um ensaio idêntico com nenhuma enzima adicionada foi realizado para cada reação. As amostras foram filtradas através de filtros de 0,2 m antes da análise por LC-MS. As reações em batelada foram processadas de uma maneira similar, mas o volume da reação foi escalado até dez vezes para acomodar os dez volumes de diferentes enzimas que foram adicionadas.
[0227] Os ensaios de competição foram usados para certificar quais substratos de CoA são preferivelmente usados pelas enzimas para acoplar com monolignóis. HIDRÓLISE ALCALINA BRANDA PARA QUANTIFICAR NÍVEIS DE P-
[0228] A determinação de ácidos carboxílicos ligados no éster foi realizada em WCW livre de extrato usando hidrólise alcalina branda (2 M NaOH, 20 h em temperatura ambiente), seguindo procedimentos previamente publicados (Ralph, J., Hatfield, R.D., Quideau, S., Helm, R.F., Grabber, J.H. and Jung, H.-J.G. (1994) Pathway of p-coumaric acid incorporation into maize lignin as revealed by NMR. Journal of the American Chemical Society 116:9448-9456).
[0229] A identificação das enzimas monolignol aciltransferase e previsão de sua atividade exigiam previamente a elucidação dos genes candidatos através da identificação de enzimas isoladas ou expressão de RNA. A expressão do gene candidato era, então, alterada no vegetal através de sua supressão / sobre-expressão em vegetais geneticamente engenheirados ou testando a enzima heterologamente expressada em sistemas de germe de trigo, levedura, ou E. coli livres de célula e alimentando a enzima com os substratos de interesse. Esta é uma tarefa demorada que era realizada um gene de cada vez e, frequentemente, com resultados negativos. Aqui, utilizaram-se técnicas de identificação e triagem de gene paralelo para identificar potenciais genes com atividade in vivo para atividade de monolignol transferase. Primeiro, identificou-se um agrupamento de genes candidatos (todos aqueles com um motivo conservado prevendo atividade de aciltransferase) do genoma do álamo. Então, otimizaram-se as sequências para síntese e produziram-se as enzimas usando o extrato de germe de trigo livre de célula. As atividades das enzimas foram determinadas através de triagem de conjugações de 10 enzimas com cofatores em potencial (monolignóis e acil-CoAs) para a produção de conjugados de monolignol por métodos LCMS. As conjugações de enzima com manifestações positivas foram sinalizadas, e as 10 enzimas no grupo sinalizado foram individualmente testadas para a atividade para identificar quais enzimas estavam ativas (e com quais substratos).
[0230] Em paralelo, usou-se uma abordagem mais tradicional de identificação de candidatos a gene. Análises químicas foram usadas para triar a espécie de vegetal e cultivares para identificar vegetais que têm os mais alto e mais baixo níveis do produto químico de interesse (por exemplo, p-hidroxibenzoato). Os dados foram, então, referenciados de forma cruzada em relação à expressão de RNA para os mesmos vegetais para determinar genes candidatos.
[0231] Nove XMTs putativos foram identificados: XMT1, XMT2, XMT3, XMT4, XMT5, XMT6, XMT7, XMT8, e XMT9. Um dos mesmos funcionou com ampla atividade de XMT (XMT1), quatro funcionaram primariamente como FMTs (XMT4, XMT7, XMT8, e XMT9), e três funcionaram primariamente como pBMTs (XMT2, XMT3, e XMT6).
[0232] XMT1 mostrou ter todas as atividades de pBMT FMT, de PMT, de AMT e de BMT. Um ensaio de competição demonstrou quantidades iguais de atividade como um pBMT e FMT, com menos atividade como um BMT e nenhuma atividade detectável como um AMT ou um PMT.
[0233] XMT4, XMT7, XMT8, e XMT9 funcionaram primariamente como FMTs. XMT9 funcionou exclusivamente como um FMT. Tanto XMT 7 quanto XMT 8 mostraram adicionalmente alguma atividade de PMT, e XMT4 mostrou adicionalmente alguma atividade de PMT e de BMT. Para XMT4, XMT7 e XMT8, os resultados dos ensaios de competição mostraram uma preferência muito forte para feruloil-CoA como um substrato em relação a p-coumaroil-CoA e/ou benzoil-CoA.
[0234] XMT2, XMT3, e XMT6 funcionaram primariamente como pBMTs. XMT6 funcionou exclusivamente como um pBMT. XMT2 e XMT3 mostraram adicionalmente funcionalidade BMT e AMT. Em ensaios de competição, tanto XMT2 quanto XMT3 funcionaram preferivelmente como pBMTs.
[0235] As figuras 7A e B sumarizam algumas das atividades supramencionadas dos XMTs.
[0236] Estruturalmente, os XMTs caíram em dois grupos principais com base na identidade de sequência e nos motivos nas sequências de aminoácido. XMT1, XMT2, XMT3, XMT4, XMT5, e XMT6 formaram o primeiro grupo. XMT7, XMT8, e XMT9 formaram o segundo grupo. XMT7 e XMT8 formaram um subgrupo no segundo grupo. Veja as figuras 3A-6. As identidades de sequência entre os XMTs (sequências de aminoácido nativas, isto é, sem a metionina e a glicina adicionadas no N-terminal) são mostradas na Tabela 1.
TABELA 1. IDENTIDADES DE SEQUÊNCIA ENTRE AS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDO XMT NATIVAS.* XMT1 XMT2 XMT3 XMT4 XMT5 XMT6 XMT7 XMT8 XMT9 XMT1 100% 97,2% 96,7% 93,8% 88,2% 78,5% 33,0% 32,8% 31,0% 466/46 453/46 451/46 437/46 411/46 361/46 146/44 132/40 137/44 6 6 6 6 6 0 3 3 2 XMT2 97,2% 100% 99,1% 94,0% 89,7% 78,7% 33,2% 32,0% 31,0% 453/46 466/46 462/46 437/46 418/46 362/46 147/43 141/44 137/44 6 6 6 6 6 0 3 0 2 XMT3 96,7% 99,1% 100% 93,6% 89,5% 78,3% 33,2% 33,2% 31,2% 451/46 462/46 466/46 436/46 417/46 360/46 147/43 147/43 138/44 6 6 6 6 6 0 3 3 2 XMT4 93,8% 94,0% 93,6% 100% 86,9% 76,5% 33,2% 32,7% 31,2% 437/46 437/46 436/46 466/46 405/46 361/46 147/43 144/44 137/44 6 6 6 6 6 0 3 0 2 XMT5 88,2% 89,7% 89,5% 86,9% 100% 76,5% 31,8% 31,9% 31% 411/46 418/46 417/46 405/46 466/46 354/46 142/47 141/44 136/44 6 6 6 6 6 3 7 2 2 XMT6 78,5% 78,7% 78,3% 76,5% 76,5% 100% 30,6% 31,5% 29,0% 361/46 362/46 360/46 361/46 354/46 470/47 137/44 138/43 128/44 0 0 0 0 3 0 7 8 2 XMT7 33,0% 33,2% 33,2% 33,2% 31,8% 30,6% 100% 75,9% 46,7% 146/44 147/43 147/43 147/43 142/47 137/44 432/43 328/43 203/43 3 3 3 3 7 7 2 2 2 XMT8 32,8% 32,0% 31,7% 32,7% 31,9% 31,5% 75,9% 100% 47,9% 132/40 141/44 140/44 144/44 141/44 138/43 328/43 444/44 207/43 3 0 2 0 2 8 2 4 2 XMT9 31,0% 31,0% 31,2% 31,2% 31% 29,0% 46,7% 47,9% 100%
*Tabela é simétrica quanto à diagonal.
[0237] Para determinar a atividade in planta, XMT1, XMT2, XMT3, e XMT6 foram sobre-expressados em álamo usando promotores ubíquos e específicos de tecido. A transformação mediada por Agrobacterium de álamo híbrido (Populus alba grandidentata P39) foi realizada de acordo com protocolos de transformação padrões, da forma detalhada em Wilkerson et al. (Wilkerson et al. (2014) Monolignol ferulate transferase introduces chemically labile linkages into the lignin backbone. Science 344:90-93). Os genes XMT foram clonados em uma versão nativa do vetor de expressão vegetal pK7WG2 (Karimi M, Inzé D, Depicker A. (2002) GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science 7(5):193-195) contendo o promotor 35S, uma versão modificada contendo a sequência de promotor de cinamato-4-hidroxilase (C4H) de Arabidopsis, e uma versão modificada contendo a sequência de promotor CesA específicas de parede celular secundária (Wilkerson et al. (2014) Monolignol ferulate transferase introduces chemically labile linkages into the lignin backbone. Science 344:90-93) para acionar a expressão dos vários genes XMT. Estes plasmídeos foram transferidos para a linhagem EHA105 de Agrobacterium tumefaciens, que foi usada na transformação de discos de folha de álamo. Depois de 2 dias de cocultivo com Agrobacterium, seguido por 4–8 semanas de formação de calo sob seleção com canamicina, brotos transgênicos foram recuperados e propagados em cultura de tecido. Seguinte a confirmação da inserção de gene pela triagem do DNA genômico e expressão do gene por PCR quantitativo em tempo real, as linhas de álamo transgênico foram transferidas para o solo em uma estufa e crescidas por 4 meses antes de colheita.
[0238] A atividade de XMT6 foi caracterizada no álamo. Tecido de xilema em árvores transgênicas expressando XMT6 sob o controle do promotor 35S ubíquo ou do promotor C4H específico de xilema (passagem biossintética de lignina) foi analisado pelas mudanças na quantidade de conjugados de p-hidroxibenzoato (pHBA)
monolignol. A hidrólise alcalina do terreno e do tecido de xilema extraído do solvente mostrou níveis significativamente mais altos de pHBA em três eventos com o promotor 35S e dois eventos com o promotor C4H, se comparada com as árvores de controle P39 (figuras 8A e 8B). A derivação seguida por clivagem redutiva (DFRC), um método degradativo químico, e análise de ressonância magnética nuclear bidimensional (2D NMR), corroborou com estes resultados. Estes resultados indicam que XMT6 exibe atividade de p-BMT in planta (figura 9).
[0239] XMT2 sob o controle de cada um dos promotores 35S, CesA, e C4H também aumentaram similarmente pHBA no álamo, particularmente, na fração de parede celular.
[0240] As atividades de XMT1 e XMT3 in planta serão similarmente caracterizadas. É previsto que XMT1 irá mostrar atividade de p-BMT, de PMT, de FMT, de BMT, e/ou de AMT in planta e que XMT3 irá mostrar atividade de p-BMT e/ou de BMT in planta.
[0241] Os genes que expressam XMT1, XMT2, XMT3, e XMT6 também foram transformados em Arabidopsis, que não produz naturalmente os conjugados de monolignol (ou estão presentes em níveis muito baixos). Quando maduro, o Arabidopsis transgênico será examinado por análises químicas, tal como Derivação Seguida por Clivagem Redutiva (DFRC) (Regner, M., Bartuce, A., Padmakshan, D., Ralph, J. and Karlen, S.D. (2018) Reductive cleavage method for quantitation of monolignols and low-abundance monolignol conjugates. ChemSusChem 11:1600- 1605), hidrólise alcalina (Karlen, S.D., Smith, R.A., Kim, H., Padmakshan, D., Bartuce, A., Mobley, J.K., Free, H.C.A., Smith, B.G., Harris, P.J. and Ralph, J. (2017) Highly decorated lignins occur in leaf base cell walls of the Canary Island date palm Phoenix canariensis. Plant Physiology 175:1058-1067; Smith, D.C.C. (1955) p- Hydroxybenzoates groups in the lignin of Aspen (Populus tremula). Journal of the Chemical Society 2347) e 2D-NMR (Mansfield, S.D., Kim, H., Lu, F. and Ralph, J. (2012) Whole plant cell wall characterization using solution-state 2D-NMR. Nature Protocols, 7:1579-1589) para quantificar o conteúdo de benzoato, p-hidroxibenzoato,
p-coumarato, e ferulato da lignina. Antecipa-se que estas enzimas irão funcionar como pBMTs in planta, o que deve ser indicado com um aumento significativo na produção e incorporação de pBA no polímero de lignina.
[0242] XMT4, XMT7, XMT8, e XMT9 serão similarmente transformados em Arabidopsis e sobre-expressados em álamo. É previsto que a atividade de FMT in vitro irá corresponder às mudanças na produção e incorporação de ferulato na lignina in planta.
[0243] É previsto que os vários XMTs aqui descritos tenham certas atividades e vantagens em vegetais.
[0244] Como uma transferase universal, é previsto que XMT1 tenha diversas vantagens in planta em relação a outras transferases. A transferase universal irá gerar vegetais que são previstos por ter uma proporção maior de metabólitos solúveis e fenólicos ligados em parede celular que podem ser afunilados para um único composto na digestão microbiana para produtos com valor adicionado. Finalmente, os conjugados fenólicos, por diferentes mecanismos, intensificam a digestibilidade da parede celular por celulases (e polissacaridases, no geral), antecipa-se que um gene como esta ainda irá produzir linhas vegetais com digestibilidade melhorada, mas irão permitir que o vegetal sintonize seus tipos de acilação de lignina de acordo com seus próprios critérios.
[0245] É previsto que as p-BMT transferases seletivas, tal como XMT6, aumentem a quantidade de p-hidroxibenzoato, mas não alterem o nível de outros fenólicos. Isto é importante na redução de impurezas indesejadas nos extratos vegetais para gerar uma fonte renovável de p-hidroxibenzoato.
[0246] É previsto que a atividade da transferase seletiva para benzoato tanto substituído quanto insubstituído, exibida por XMT2 e XMT3, habilite a engenharia de linhas vegetais que contêm elevados níveis de p-hidroxibenzoato, benzoato, e outros derivados de benzoato. Isto, por sua vez, irá aumentar o valor da biomassa como uma fonte de benzoatos renováveis.
[0247] É previsto que a seletividade para a atividade de FMT, exibida por XMT9,
auxilie na geração de vegetais apenas com conjugados de ferulato. Isto é crucial para maximizar o efeito que a tecnologia zip-lignina tem na melhoria da digestão da parede celular. Isto também é essencial para produzir apenas um tipo de ácido fenólico para reduzir o custo para a produção em escala comercial concebida de ácido ferúlico ou outros ácidos fenólicos.
[0248] É previsto que a seletividade para atividades de PMT e de FMT, exibida por XMT7 e XMT8, gere vegetais que têm a máxima quantidade da funcionalidade de ácido cinâmico. Isto é desejável como um meio para reduzir a recalcitrância da parede celular e aumentar os títulos no afunilamento dos extratos vegetais fenólicos através de conversão para cima microbiana em fontes renováveis tanto de combustíveis líquidos quanto de produtos químicos tipo commodity (por exemplo, precursores de plástico e farmacêutico).
[0249] É previsto que a seletividade mais folgada, principalmente, para atividade de FMT, da forma exibida por XMT4, é vantajosa em vegetais que produzem derivados tanto de cinamato quanto de benzoato (por exemplo, palmeiras, álamos e salgueiros). Esta transferase irá reduzir a recalcitrância da parede celular através de níveis mais altos de tecnologia de zip-lignina, mas, também contém níveis mais altos de fenólicos que podem ser afunilados através de conversão para cima microbiana em produtos de valor adicionado.
[0250] Pretende-se que as seguintes declarações da invenção sumarizem alguns aspectos da invenção de acordo com a descrição exposta dada na especificação.
[0251] 1. Um ácido nucleico isolado ou recombinante que codifica uma aciltransferase BAHD, em que o ácido nucleico codifica um polipeptídeo da aciltransferase BAHD que compreende uma sequência substancialmente idêntica a SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18, e/ou em que o ácido nucleico pode hibridizar seletivamente em um DNA com uma sequência SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17.
[0252] 2. O ácido nucleico isolado da declaração 1, em que o ácido nucleico hibridiza seletivamente em um DNA com uma sequência SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17 sob condições de hibridização rigorosas.
[0253] 3. O ácido nucleico isolado da declaração 2, em que as condições de hibridização rigorosas compreendem uma lavagem em 0,1 x SSC, 0,1% SDS em 65 °C.
[0254] 4. O ácido nucleico isolado de qualquer uma das declarações 1-3, em que o ácido nucleico que hibridiza seletivamente em um DNA com uma sequência SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17 tem pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17.
[0255] 5. O ácido nucleico isolado de qualquer uma das declarações 1-4, em que o ácido nucleico codifica uma aciltransferase BAHD que pode catalisar a síntese de um conjugado de monolignol éster.
[0256] 6. O ácido nucleico isolado da declaração 5, em que o monolignol é álcool coniferílico, álcool p-coumarílico, álcool sinapílico ou uma combinação dos mesmos.
[0257] 7. O ácido nucleico isolado de qualquer uma das declarações 1-6, em que o ácido nucleico codifica um polipeptídeo da aciltransferase BAHD com uma sequência substancialmente idêntica a SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18.
[0258] 8. O ácido nucleico isolado de qualquer uma das declarações 1-7, em que o ácido nucleico codifica uma aciltransferase BAHD que pode catalisar a síntese de um conjugado de monolignol éster com pelo menos cerca de 50% da atividade de uma aciltransferase BAHD com a sequência SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID
NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18.
[0259] 9. Uma célula vegetal transgênica que compreende o ácido nucleico isolado de qualquer uma das declarações 1-8.
[0260] 10. Um vegetal transgênico que compreende a célula vegetal da declaração 9 ou o ácido nucleico isolado de qualquer uma das declarações 1-8.
[0261] 11. Um cassete de expressão que compreende o ácido nucleico de aciltransferase BAHD de qualquer uma das declarações 1-8, operativamente ligado a um promotor funcional em uma célula hospedeira.
[0262] 12. O cassete de expressão da declaração 11, que compreende adicionalmente um gene marcador selecionável.
[0263] 13. O cassete de expressão das declarações 11 ou 12, compreendendo adicionalmente DNA de plasmídeo.
[0264] 14. O cassete de expressão de qualquer uma das declarações 11-13, em que o cassete de expressão é em um vetor de expressão.
[0265] 15. O cassete de expressão de qualquer uma das declarações 11-14, em que o promotor é um promotor funcional durante desenvolvimento ou crescimento do vegetal.
[0266] 16. O cassete de expressão de qualquer uma das declarações 11-15, em que o promotor é um promotor 8 de sintase de celulose específico da parede celular secundária específica de xilema de álamo, um promotor específico de lignina C4H de Arabidopsis, promotor do vírus do mosaico de couve-flor, promotor Z10 proveniente de um gene que codifica um proteína zeína 10 kD, promotor Z27 proveniente de um gene que codifica uma proteína zeína 27 kD, gene rbcS da ervilha ou promotor de actina proveniente do arroz.
[0267] 17. Uma célula vegetal que compreende o cassete de expressão de qualquer uma das declarações 11-16.
[0268] 18. A célula vegetal da declaração 17, em que a célula vegetal é uma célula monocotiledônea.
[0269] 19. A célula vegetal da declaração 17, em que a célula vegetal é uma célula de milho, grama ou madeira macia.
[0270] 20. A célula vegetal da declaração 17, em que a célula vegetal é uma célula dicotiledônea.
[0271] 21. A célula vegetal da declaração 17, em que a célula vegetal é uma célula de madeira dura.
[0272] 22. Um vegetal que compreende o cassete de expressão de qualquer uma das declarações 11-16.
[0273] 23. O vegetal da declaração 22, em que o vegetal é uma monocotiledônea.
[0274] 24. O vegetal da declaração 22, em que o vegetal é uma grama, um milho ou uma madeira macia.
[0275] 25. O vegetal da declaração 22, em que o vegetal é uma gimnosperma.
[0276] 26. O vegetal da declaração 22, em que o vegetal é uma dicotiledônea.
[0277] 27. O vegetal da declaração 22, em que a dicotiledônea é uma madeira dura.
[0278] 28. Um método para incorporar conjugados de monolignol éster na lignina de um vegetal, compreendendo: a) transformar estavelmente células vegetais com o cassete de expressão de qualquer uma das declarações 11-16 para gerar células vegetais transformadas; b) regenerar as células vegetais transformadas em pelo menos um vegetal transgênico, em que a aciltransferase BAHD é expressada em pelo menos um vegetal transgênico em uma quantidade suficiente para incorporar conjugados de monolignol éster na lignina do vegetal transgênico.
[0279] 29. O método da declaração 28, em que o vegetal transgênico é fértil.
[0280] 30. O método das declarações 28 ou 29, compreendendo adicionalmente recuperar sementes transgênicas a partir do vegetal transgênico, em que as sementes transgênicas compreendem o ácido nucleico que codifica uma aciltransferase BAHD.
[0281] 31. O método de qualquer uma das declarações 28-30, em que o vegetal é uma monocotiledônea.
[0282] 32. O método de qualquer uma das declarações 28-31, em que o vegetal é uma grama, um milho ou uma madeira macia vegetal.
[0283] 33. O método de qualquer uma das declarações 28-32, em que o vegetal é uma gimnosperma.
[0284] 34. O método da declaração 28, em que o vegetal é uma dicotiledônea.
[0285] 35. O método da declaração 34, em que a dicotiledônea vegetal é uma madeira dura.
[0286] 36. O método de qualquer uma das declarações 28-35, compreendendo adicionalmente procriar um vegetal transgênico fértil para produzir um vegetal progênie que tem um conteúdo alterado de conjugados de monolignol éster na lignina do vegetal progênie em relação ao correspondente vegetal não transformado.
[0287] 37. O método de qualquer uma das declarações 28-36, compreendendo adicionalmente procriar um vegetal transgênico fértil para produzir um vegetal progênie que tem um conteúdo alterado de conjugados de monolignol éster na lignina do vegetal progênie como um traço dominante ao mesmo tempo em que ainda mantém características agronômicas funcionais em relação ao correspondente vegetal não transformado.
[0288] 38. O método de qualquer uma das declarações 28-37, em que a célula vegetal transformada é transformada por um método selecionado a partir do grupo que consiste em eletroporação, microinjeção, bombardeamento de microprojétil, e encapsulação lipossômica.
[0289] 39. O método de qualquer uma das declarações 28-38, compreendendo adicionalmente transformar estavelmente a célula vegetal com pelo menos um gene marcador selecionável.
[0290] 40. Um vegetal transgênico fértil que tem um maior percentual de conjugados de monolignol éster na lignina do vegetal, cujo genoma é estavelmente transformado pelo ácido nucleico de qualquer uma das declarações 1-8, em que o ácido nucleico é operativamente ligado a um promotor funcional em uma célula hospedeira, e em que o ácido nucleico de aciltransferase BAHD é transmitido através de um ciclo sexual normal completo do vegetal transgênico para a próxima geração.
[0291] 41. O vegetal da declaração 40, em que o vegetal é uma monocotiledônea.
[0292] 42. O vegetal da declaração 40, em que o vegetal é uma grama, um milho ou uma madeira macia.
[0293] 43. O vegetal da declaração 40, em que o vegetal é uma gimnosperma.
[0294] 44. O vegetal da declaração 40, em que o vegetal é uma dicotiledônea.
[0295] 45. O vegetal da declaração 40, em que o conteúdo de conjugados de monolignol éster na lignina do vegetal é alterado em relação ao correspondente vegetal não transformado.
[0296] 46. O vegetal de qualquer uma das declarações 40-45, em que o percentual de conjugados de monolignol éster na lignina do vegetal é aumentado em pelo menos 1% em relação ao correspondente vegetal não transformado.
[0297] 47. O vegetal de qualquer uma das declarações 40-46, em que o percentual de conjugados de monolignol éster na lignina do vegetal é aumentado em pelo menos 2-5% em relação ao correspondente vegetal não transformado.
[0298] 48. Uma lignina isolada a partir de um vegetal transgênico que compreende o nucleico isolado de qualquer uma das declarações 1-8.
[0299] 49. Um método de fazer um produto proveniente de um vegetal transgênico que compreende: (a) prover ou obter um vegetal transgênico que inclui um ácido nucleico isolado que codifica uma aciltransferase BAHD que compreende o nucleico isolado de qualquer uma das declarações 1-8; e (b) processar os tecidos do vegetal transgênico sob condições suficientes para digerir a lignina; e, desse modo, gerar o produto a partir do vegetal transgênico, em que os tecidos do vegetal transgênico compreendem lignina que tem um conteúdo alterado de conjugados de monolignol éster em relação a um correspondente vegetal não transformado.
[0300] 50. O método da declaração 49, em que as condições suficientes para digerir a lignina compreendem condições suficientes para clivar ligações de éster.
[0301] 51. O método das declarações 49 ou 50, em que as condições suficientes para digerir a lignina compreendem condições moderadamente alcalinas.
[0302] 52. O método de qualquer uma das declarações 49-51, em que as condições suficientes para digerir a lignina compreendem colocar em contato os tecidos do vegetal transgênico com amônia por um tempo e uma temperatura suficientes para clivar ligações de éster.
[0303] 53. O método de qualquer uma das declarações 49-52, em que as condições suficientes para digerir a lignina não irão clivar substancialmente nenhuma das ligações de éter e carbono-carbono em lignina proveniente de um vegetal correspondente que não contém o ácido nucleico isolado que codifica a aciltransferase BAHD.
[0304] 1A. Um vegetal transgênico que compreende um knockdown ou knockout do gene de aciltransferase BAHD endógeno do vegetal.
[0305] 3A. O vegetal transgênico da declaração 1A, em que o gene de aciltransferase BAHD endógeno pode hibridizar em um ácido nucleico com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, e SEQ ID NO:17.
[0306] 4A. O vegetal transgênico da declaração 1A, em que o gene de aciltransferase BAHD endógeno tem pelo menos 50% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, e SEQ ID NO:17.
[0307] 5A. O vegetal transgênico da declaração 1A, em que o knockdown ou o knockout é uma mutação selecionada a partir do grupo que consiste em uma mutação de ponto, uma deleção, uma mutação pontual, uma inserção ou uma mutação sem sentido no gene de aciltransferase BAHD endógeno.
[0308] 6A. O vegetal transgênico da declaração 1A, em que a mutação de knockdown ou de knockout compreende uma mutação de ponto, uma deleção, uma mutação pontual, uma inserção ou uma mutação sem sentido no gene de aciltransferase BAHD endógeno que codifica um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência em uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, e SEQ ID NO:18.
[0309] 7A. O vegetal transgênico da declaração 1A, em que a expressão de pelo menos um ácido nucleico inibitório que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação a ambas as fitas de um ácido nucleico que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, e SEQ ID NO:17 compreende o knockdown ou o knockout.
[0310] 8A. O vegetal transgênico da declaração 1A, em que o knockdown ou o knockout reduz a atividade de aciltransferase BAHD no vegetal.
[0311] 9A. O vegetal transgênico da declaração 1A, em que o knockdown ou o knockout reduz a acilação de monolignóis, em que os monolignóis são selecionados a partir do grupo que consiste em álcool p-coumarílico, álcool coniferílico e álcool sinapílico.
[0312] 10A. O vegetal transgênico da declaração 1A, em que o knockdown ou o knockout reduz a produção de pelo menos um tipo de conjugado de monolignol éster
[0313] 11A. O vegetal transgênico da declaração 1A, em que o vegetal é fértil.
[0314] 12A. Uma ou mais sementes provenientes do vegetal transgênico da declaração 1A.
[0315] 13A. Um ácido nucleico inibitório que compreende um DNA ou um RNA que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação a ambas as fitas de um ácido nucleico que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3,
SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, e SEQ ID NO:17.
[0316] 14A. Um cassete de expressão que compreende o ácido nucleico inibitório da declaração 13A operativamente ligado a um promotor funcional em uma célula hospedeira.
[0317] 15A. Uma célula isolada ou recombinante que compreende o ácido nucleico inibitório da declaração 17A ou o cassete de expressão da declaração 14A.
[0318] 16A. A célula isolada ou recombinante da declaração 15A, que é um micro- organismo ou uma célula vegetal.
[0319] 17A. Um vegetal transgênico que compreende a célula isolada ou recombinante da declaração 16A.
[0320] 18A. Um método de incorporação de monolignol ferulatos na lignina de um vegetal que compreende: a) obter uma ou mais células vegetais com um knockout ou knockdown do gene de aciltransferase BAHD endógeno das células vegetais; b) regenerar uma ou mais das células vegetais em pelo menos um vegetal transgênico.
[0321] 19A. Um método de inibição da expressão e/ou da tradução de RNA da aciltransferase BAHD em uma célula vegetal que compreende: a) fazer contato ou transformar as células vegetais com o cassete de expressão da declaração 14A para gerar células vegetais transformadas; b) regenerar as células vegetais transformadas em pelo menos um vegetal transgênico, em que um ácido nucleico inibitório adaptado para inibir a expressão e/ou a tradução de um mRNA da aciltransferase BAHD é expressado em pelo menos um vegetal transgênico em uma quantidade suficiente para incorporar monolignol ferulatos na lignina do vegetal transgênico.
Claims (27)
1. Ácido nucleico recombinante, caracterizado por compreender um segmento de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da aciltransferase BAHD com pelo menos 80% de identidade de sequência do aminoácido em relação a SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18.
2. Ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o segmento de ácido nucleico codificar um polipeptídeo da aciltransferase BAHD com pelo menos 95% de identidade de sequência do aminoácido em relação a SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:18.
3. Ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o segmento de ácido nucleico codificar: um polipeptídeo da aciltransferase BAHD com pelo menos 95% de identidade de sequência do aminoácido em relação a SEQ ID NO:2 que exibe atividade de p-hidroxibenzoil-CoA:monolignol transferase (pBMT), atividade de feruloil-coenzima A (CoA):monolignol transferase (FMT), atividade de p-coumaroil- CoA:monolignol transferase (PMT), atividade de acetil-CoA:monolignol transferase (AMT), atividade de benzoil-CoA:monolignol transferase (BMT), ou qualquer combinação dos mesmos; um polipeptídeo da aciltransferase BAHD com pelo menos 95% de identidade de sequência do aminoácido em relação a SEQ ID NO:4 que exibe atividade de pBMT, atividade de AMT, atividade de BMT, ou qualquer combinação das mesmas; um polipeptídeo da aciltransferase BAHD com pelo menos 95% de identidade de sequência do aminoácido em relação a SEQ ID NO:6 que exibe atividade de pBMT, atividade de AMT, atividade de BMT, ou qualquer combinação das mesmas; um polipeptídeo da aciltransferase BAHD com pelo menos 95% de identidade de sequência do aminoácido em relação a SEQ ID NO:8 que exibe atividade de FMT, atividade de PMT, atividade de BMT, ou qualquer combinação das mesmas; um polipeptídeo da aciltransferase BAHD com pelo menos 95% de identidade de sequência do aminoácido em relação a SEQ ID NO:12 que exibe atividade de pBMT; um polipeptídeo da aciltransferase BAHD com pelo menos 95% de identidade de sequência do aminoácido em relação a SEQ ID NO:14 que exibe atividade de FMT, atividade de PMT, ou qualquer combinação das mesmas; um polipeptídeo da aciltransferase BAHD com pelo menos 95% de identidade de sequência do aminoácido em relação a SEQ ID NO:16 que exibe atividade de FMT, atividade de PMT, ou qualquer combinação das mesmas; ou um polipeptídeo da aciltransferase BAHD com pelo menos 95% de identidade de sequência do aminoácido em relação a SEQ ID NO:18 que exibe atividade de FMT.
4. Ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o segmento de ácido nucleico codificar um polipeptídeo da aciltransferase BAHD com pelo menos 95% de identidade de sequência do aminoácido em relação a SEQ ID NO:2 que exibe atividade de p-hidroxibenzoil- CoA:monolignol transferase (pBMT), atividade de feruloil-coenzima A (CoA):monolignol transferase (FMT), atividade de p-coumaroil-CoA:monolignol transferase (PMT), atividade de acetil-CoA:monolignol transferase (AMT), e atividade de benzoil-CoA:monolignol transferase (BMT).
5. Ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o segmento de ácido nucleico codificar um polipeptídeo da aciltransferase BAHD com pelo menos 95% de identidade de sequência do aminoácido em relação a SEQ ID NO:4 que exibe atividade de pBMT, atividade de AMT, e atividade de BMT.
6. Ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1,
caracterizado por o segmento de ácido nucleico codificar um polipeptídeo da aciltransferase BAHD com pelo menos 95% de identidade de sequência do aminoácido em relação a SEQ ID NO:6 que exibe atividade de pBMT, atividade de AMT, e atividade de BMT.
7. Ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o segmento de ácido nucleico codificar um polipeptídeo da aciltransferase BAHD com pelo menos 95% de identidade de sequência do aminoácido em relação a SEQ ID NO:8 que exibe atividade de FMT, atividade de PMT, e atividade de BMT.
8. Ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o segmento de ácido nucleico codificar um polipeptídeo da aciltransferase BAHD com pelo menos 95% de identidade de sequência do aminoácido em relação a SEQ ID NO:12 que exibe atividade de pBMT.
9. Ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o segmento de ácido nucleico codificar um polipeptídeo da aciltransferase BAHD com pelo menos 95% de identidade de sequência do aminoácido em relação a SEQ ID NO:14 que exibe atividade de atividade de FMT e de PMT.
10. Ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o segmento de ácido nucleico codificar um polipeptídeo da aciltransferase BAHD com pelo menos 95% de identidade de sequência do aminoácido em relação a SEQ ID NO:16 que exibe atividade de atividade de FMT e de PMT.
11. Ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o segmento de ácido nucleico codificar um polipeptídeo da aciltransferase BAHD com pelo menos 95% de identidade de sequência do aminoácido em relação a SEQ ID NO:18 que exibe atividade de FMT.
12. Ácido nucleico recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, caracterizado por o segmento de ácido nucleico ser operativamente ligado a um elemento genético heterólogo.
13. Ácido nucleico recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, caracterizado por o segmento de ácido nucleico ser um cDNA.
14. Ácido nucleico recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, caracterizado por o polipeptídeo ter uma ou mais substituições de aminoácido conservadoras em relação a cada um de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, e SEQ ID NO:18.
15. Ácido nucleico recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14, caracterizado por o segmento de ácido nucleico ser operativamente ligado a um promotor heterólogo.
16. Ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o promotor ser um promotor funcional ou ativo durante o desenvolvimento ou o crescimento do vegetal.
17. Ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o promotor ser um promotor funcional ou ativo em tecidos lenhosos de um vegetal.
18. Ácido nucleico recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, caracterizado por o ácido nucleico recombinante ser compreendido em um cassete de expressão.
19. Ácido nucleico recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18, caracterizado por o ácido nucleico recombinante ser compreendido em uma célula recombinante.
20. Ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a célula recombinante ser um micro-organismo ou uma célula vegetal.
21. Ácido nucleico recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-20, caracterizado por a célula recombinante ser compreendida em um vegetal.
22. Ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o genoma do vegetal ser estavelmente transformado com o ácido nucleico recombinante.
23. Ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o ácido nucleico recombinante ser transmitido através de um ciclo sexual normal completo do vegetal para a próxima geração.
24. Ácido nucleico recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18, caracterizado por o ácido nucleico recombinante ser compreendido em uma semente de vegetal.
25. Método para modificar o conteúdo de conjugados de monolignol éster na lignina em um vegetal, caracterizado por compreender: (a) plantar a semente de vegetal como definido na reivindicação 23; e (b) cultivar um vegetal germinado a partir da semente de vegetal, para, desse modo, modificar o conteúdo dos conjugados de monolignol éster na lignina no vegetal.
26. Método, caracterizado por compreender: (a) transformar estavelmente células vegetais com o ácido nucleico recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1-18 para gerar células vegetais transformadas; e (b) regenerar as células vegetais transformadas em pelo menos um vegetal transgênico.
27. Vegetal transgênico fértil, caracterizado por ter um conteúdo modificado dos conjugados de monolignol éster na lignina do vegetal, cujo genoma é estavelmente transformado com o ácido nucleico recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1-18, em que o ácido nucleico recombinante é transmitido através de um ciclo sexual normal completo do vegetal transgênico para a próxima geração.
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