JPS63192383A - トウモロコシにおけるフリー・プール・リジン含有量の増加方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 （発明の分野） この発明は、組織培養での選択を通じてトウモロコシに
おけるフリー・プール（ｔｒｅｅ　Ｉ）００１％遊離蓄
猜）・リジン含有量を増加させる方法に関する。

（先行技術の記載） 穀類は植物性蛋白質の主たる供給源である。トウモロコ
シ（ゼア・メイズ・エル、Ｚｅａ　　ｗａｙｓ　　Ｌ、
）は、生産される穀類蛋白全体の約４分の１を占める。

しかしながら、トウモロコシの場合、ある種の必須アミ
ノ酸、特にリジン、メチオニンおよびトリプトファンの
含有量が低い。その結果、バランスのとれた食餌を提供
するためには、食餌中のトウモロコシにこれらのアミノ
酸を含有する食物を補わなければならない。トウモロコ
シに関する植物品種改良の１目標は、種子に存在するリ
ジンおよびトリプトファンの量を増加させることであっ
た。これらのアミノ酸の増加を達成するための少なくと
も２つの方法が考えられ得る。第１の方法は、トウモロ
コシ粒に存在する蛋白質におけるリジンまたはトリプト
ファン含有量を増加させろことである。第２の方法は、
トウモロコシ粒内のフリー・プール・（内在性）リジン
またはトリプトファン含有量を増加させることである。

望ましい方向でのトウモロコシ粒の蛋白質組成の変化に
関する第１の有意義な品種改良成果は、トウモロコシ胚
乳の蛋白質組成を単一遺伝子［オペーク（ｏｐａｑｕｅ
）　−２］により大きく変えることができるというメル
フ等［「サイエンスＪ（Ｓｃ　１ｅｎｃｅ）、１４５巻
、２７９頁（１９６４年）」による発見であった。翌年
、同著者は、同様にトウモロコシ胚乳の蛋白質組成を変
える第２の突然変異遺伝子［フラワリー（ｆ　１ｏｕｒ
ｙ）　−２１を報告した［ネルソン等、「サイエンスＪ
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１５０巻、１４６９頁（１９６５
年）］。またリジンおよびトリプトファンにおける同様
の変化以外にもフラワリー−２は高いメチオニン含有量
を有することが判った。

２種のトウモロコシ突然変異体の種々のアミノ酸組成は
、主に蛋白質フラクションの相対量の修正、すなわちプ
ロラミンの敵方的抑圧およびリジンおよびトリプトファ
ンが豊富な他のフラクションとの置換によることが立証
された［ネルソン等、［ジェネト・アゲロンＪ（Ｇｅｎ
ｅｔ、　Ａｇｒｏｎ、）、２１巻、２０９頁（１９６７
年）］。

農業経済的目標達成および特に収量を考慮すると、オペ
ーク−２は主にその穀粒が軽いため普通のトウモロコシ
より幾分劣ると思われる。オペーク−２が通交系に導入
された集団において、普通の類縁体と比較したオペーク
−２の穀粒のパーセンテージ重量喪失は、通交系により
異なるとしても、５％未満から４０％の範囲で変化する
ことが判った。

オペーク−２種（ストック）は普通のストックよりも一
般に小さくて軽い穀粒を生産するが、オペーク−２型が
普通の同質遺伝子型よりも常に低い収量をもたらすと結
論を下すのは危険であるということが指摘された。デー
タは、変更遺伝子がオペーク−２ホモ接合体における穀
粒のサイズに影響を与えるということを示している。し
たがって、集団の分離に際する適当な選択は、その特性
を改良する上で有効である筈である。他の研究者も同様
の意見であり、オペーク−２穀粒の密度はオペーク−２
が高い密度を示す系統の選択を可能にする遺伝子環境に
より左右されるということを指摘している。

正常なハイブリッドパートナ−よりも一般に低い収量を
有するトウモロコシハイブリッド中にオペーク−２遺伝
子が組み込まれてきた。しかしながら、近年、収量に関
する改良により高リジントウモロコシの使用に再び関心
が高まってきた。

多大な努力の末トウモロコシ蛋白質のリジン含有量を増
加させたが、フリー・プール・リジン含有量を増加させ
ることによるトウモロコシ中のリジン含有量増加に対し
ては殆ど努力は払われなかった。

培養中の細胞からの植物再生は、体細胞交雑の応用、体
細胞クローン変異またはインビトロ選択に上る新品種の
生産および新品種の生産における遺伝子工学の使用に際
して不可欠である。数種のトウモロコシについては組織
培養から植物を再生することはできるが、同様の技術の
使用では再生が達成されなかった品種が多数ある。

近年、植物細胞培養の成功が、植物の生長および発生の
制御における細胞および生物体の各役割の理解に顕著な
影響を及ぼしている。分離された植物細胞がインビトロ
培養に馴染み得ることが判明し、また完全な植物が、体
細胞胚発生物から直接的または器官形成物から間接的に
体細胞組織由来の培養物から再生されている。一般に、
再生経路の選択は、外部因子、特に生長調節因子の操作
により経験的に決定される。ある植物種の初期の研究は
、例えばオーキシンの減少が胚形成の開始を導くように
、外因性オーキシン濃度が体細胞胚発生を制御する主要
因子であることを示唆している。他の種では、一定の平
衡状態のオーキシンおよびサイトカイニンに曝すことが
器官形成（新芽、次いで根）の発生を導く。これらの技
術を用いて幾つかの遺伝子型のトウモロコシが再生され
たが、大部分の遺伝子型のトウモロコシに適用し得る方
法は一般に存在しない。多くの遺伝子型については、不
可能ではなくとも、先の方法を用いて培養することは非
常に困難である。

トウモロコシの組織培養に対する標準方式となっている
方法は、グリーン等、「クロップ・サイエンスＪ（Ｃｒ
ｏｐ　　５ｃｉｅｎｃｅ）１５巻、４１７頁（１９７５
年）に記載されている。この方法において、未分化胚を
ＭＳ無機塩類、シュドラウスのビタミン類およびアミノ
酸類（グリシン、アスパラギン、ナイアシン、チアミン
、ピリドキシンおよびパントテン酸）、２％しょ糖、０
．８％寒天および２゜４−ジクロロフェノキシ酢酸（２
，４−Ｄ）、ｐ−クロロフェノキシ酢酸（ｐ−ＣＰ　Ａ
）、α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２−イソペンチル
アデニン（２−ｉｐ）またはそれらの混合物から選ばれ
るホルモンから成るカルス誘導培地上で培養した。有用
なホルモン濃度は、２１９／Ｑ（Ｄ２．４−Ｄ、並びに
１１１９／（ｌの２．４−Ｄ、４１９／（ｌのＮＡＡお
よび０．０５ｎ／Ｑの２−ｉｐから成る混合物であった
。低いホルモン濃度を有する培地でカルスを継代培養す
ることにより苗木を再生した。次いで０．２５ｇ９／Ｑ
の２．４−Ｄまたはｌ！９／σのＮＡＡおよび０゜０５
ｘｖ／（ｌの２−ｉｐから成る混合物を含む培地で再生
を行った。全ての培養は、継代前に３−４適間隔で照明
下１６時間／無照明下８時間の周期で行なわれた。この
参考文献は、カルス誘導が試験された５つの遺伝子型の
うち１つでは起こらなかったことを報告している。

種々の培地による同様の結果が、フリーリング等、［メ
イディカＪ（Ｍａｙｄｉｃａ）、２１巻、９７頁（１９
７６年）、バシル等、「セオレティカル・アンド・アプ
ライド・ジェネティクスＪ（Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、
　Ｇｅｎｅｔ、）、６６巻、２８５頁（１９８３年）、
エダロ等、「メイディカＪ（Ｍａｙｄｉｃａ）、２６巻
、３９頁（１９８１年）、ルー等、「セオレティカル・
アンド・アプライド・ジェネティクスＪ（Ｔｈｅｏｒ、
　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、）、６２巻、１０９頁（１
９８２年）、ゲーゲンパッハ等、「プロシーディングズ
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシー
ズ・ニーニスエイＪ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ）、７４巻、５１１３頁（１９
７７年）およびグリーン等、「クロップ・サイエンスＪ
（Ｃｒｏｐ　　５ｃｉｅｎｃｅ）、１４巻、５４頁（１
９７４年）により立証された。後者の参考文献はまたカ
ルス誘導に対する遺伝子型の影響を立証している。

この方法は一般的に全トウモロコシ遺伝子型からの植物
再生については不成功であったが、現在大部分の遺伝子
型の再生は培地に２．４−Ｄの代わりにジカンバを用い
ることにより可能である。

公開されたヨーロッパ出願第０１７７７３８号およびダ
ンカン等、「ブランクＪ（Ｐｌａｎｔａ）、１６５巻、
３２２頁（１９８５年）参照。

〔発明の要約〕

この発明は、トウモロコシ種子におけるフリー・プール
・リジン含有量の増加方法およびトウモロコシ植物によ
り生産された種子の平均フリー・プール・リジン含有量
の増加方法に関する。この方法は、リジン類似体の使用
により選択された培養中の組織からの植物の再生を含む
。さらに具体的には、この方法は、 （ａ）無機塩類、ビタミン類、しょ糖およびホルモンを
含むカルス誘導培地でトウモロコシ植物から得られた組
織を培養してカルスを形成させ、（ｂ）無機塩類、ビタ
ミン類、しょ糖、５−２−アミノエチル−Ｌ−システイ
ン（ＡＢＣ）およびホルモンを含む選択培地で前記カル
スを継代培養して、選択されたカルスを製造し、そして
（ｃ）無機塩類、ビタミンおよびしょ糖を含む再生培地
で前記の選択されたカルスを継代培養して植物を再生す
る 段階を含む。

別法として、この方法は、選択培地で継代培養する前に
無機塩類、ビタミン類、しょ糖およびホルモンを含む維
持培地で前記カルスを継代培養する段階をさらに含み得
る。

植物を生長させて種子（Ｒｏを生産し、これを用いてさ
らに植物の発生をもたらすことができる。

〔発明の詳細な記載〕

この発明は、トウモロコシ種子におけるフリー・プール
・リジン含有量の増加方法およびトウモロコシ植物によ
り生産された種子の平均フリー・プール・リジン含有量
の増加方法に関する。この方法は、後述のＡＢＣによる
トウモロコシ組織の組織培養選択を利用する。

この発明は、乾燥種子型ｉ１１グラム当たり少なくとも
約５００μｇのフリー・プール・リジン含有量を有する
トウモロコシ種子に関する。好ましくは、各種子は乾燥
種子重量１グラム当たり少なくとも約６００μｇのフリ
ー・プール・リジンを有する。最も好ましい具体例では
、各種子は乾燥種子重量１グラム当たり少なくとも７０
０μｇのフ・リー・プール・リジンを有する。

さらにこの発明は、各々が乾燥種子重量１グラム当たり
少なくとも約３２５μｇの平均フリー・プール・リジン
含有量を有する種子を生産するトウモロコシ植物に関す
る。好ましくは、各植物は乾燥種子重量１グラム当たり
少なくとも約４００μｇの平均フリー・プール・リジン
含有量を有する種子を生産する。最も好ましくは、平均
フリー、プール・リジン含有量は乾燥種子重量１グラム
当たり少な（とも約５００μｇである。明白にすべきこ
ととして、「平均フリー・プール・リジン含有量」はト
ウモロコシ植物により生産された個々の種子のフリー・
プール・リジン含有量の平均を意味するものとする。

最初の再生植物（Ｒｏ）は、一般にリジン類似体、５−
２−アミノエチル−Ｌ−システイン（ＡＢＣ）の使用に
より選択された培養中の組織から植物を再生することに
より組織培養から生産される。またＡＥＣ選択工程を使
用せずに所望の特徴を満たす植物を分離することも可能
である。以後発生する植物は、Ｒ０植物により生産され
た種子（Ｒ，種子）を発芽させることにより生産され得
る。Ｒ４植物を自家授粉させてＲ３種子を生産すること
ができる。別法として、Ｒ１植物を品種改良プログラム
に組み入れて雑種（ハイブリッド）、通交系（インブレ
ッド）等を生産することができる。親として最初のＲ１
種子を有する植物の任意の世代を用いて雑種または通交
系等を発生させることができる。

例えば、可能ならば再生植物またはそれらの子孫を自家
授粉させる。さらに、再生植物またはそれらの子孫から
得られた花粉を農業経済的に重要な通交系の種子生長植
物と交雑する。場合により、これらの通交系の植物から
得られた花粉を用いて再生植物またはそれらの子孫に授
粉する。最初およびそれ以降の世代の子孫における特性
の分離を評価することにより、特性を遺伝学的特徴とし
て認める。特性を商業的に有用なものとする場合、組織
培養で選択された特性を有する植物において遺伝率およ
び発現性は特に重要である。

多くの相異なる雑種の組合わせが販売に有効なものであ
る場合、高いフリー・プール・リジン含有量を有するト
ウモロコシの商業的価値は非常に大きい。農家は一般的
に成熟度、安定性または他の農業経済的特性といった差
異に基づく１種以上の雑種を育成する。さらに、成熟度
、病気および虫に対する抵抗力のような特性の点で異な
るため、コーンベルトの一部に適合した雑種でも別の部
分には適合しない。このため、多くの雑種の組合わせを
製造し得るためには、高いフリー・プール・リジン含有
量を多数の親系統中に仕込むことが必要である。

フリー・プール・リジン含有量の遺伝的制御を理解すれ
ば、高フリー・プール・リジン遺伝子型は農業経済的に
優れた系統へ最も有効に付加される。これは高フリー・
プール・す、ジン植物を低フリー・プール・リジン植物
と交雑し、世代における遺伝形質のパターンを研究する
ことにより、形質の発現が優性としての発現であるのか
または劣性であるのか、含まれる遺伝子の数、および１
個以上の遺伝子が発現に必要とされる場合に遺伝子間の
可能な相互作用があればこれを確認することが必要であ
る。この遺伝子分析は、低フリー・プール・リジン含有
量ではあるが農業経済的に優れた系統を高フリー・プー
ル・リジン系統に変換するための最初の努力の一部であ
り得る。

変換プロセス（戻し交配）は、原種の高フリー・プール
・リジン系統を正常の優れた系統に交配し、子孫を正常
な親に戻し交配することにより行なわれる。この交配に
よる子孫は、高フリー・プール・リジンをもたらす遺伝
子（複数も可）を伴う植物らあれば伴わない植物もある
状況で分離する。前記の遺伝子を有する植物を再び正常
な親と交配した結果生じた子孫については、高いフリー
・プール・リジンおよび正常な生産性を求めてもう一度
分離する。原種の正常な親が高フリー・プール・リジン
系統に変換されるまで（ただし、正常な親が最初からも
っていた他の重要な特質をすべて有するものとする）こ
れを繰り返す。各々の優れた系統について独立した戻し
交配プログラムの履行、すなわち高フリー・プール・リ
ジン系統への変換を行う。

戻し交配に続いて、優れた商業用雑種を生産する新規系
統および系統の適当な組合わせを高いフリー・プール・
リジン含有量および一連の重要な農業経済的特性に関し
て評価する。典型的な原種の正常の系統および雑種であ
る、高フリー・プール・リジン系統および雑種が生産さ
れる。これは一般的に前記系統または雑種が商業用に育
成される環境条件範囲下では評価を必要とする。高フリ
ー・プール・リジントウモロコシを生産するためには、
雑種トウモロコシの親の両方が高フリー・プール・リジ
ン特性についてホモ接合であることが必要となり得る。

標準的雑種トウモロコシ生産技術を用いて充分に目的を
果たす雑種の親系統を増やし、雑種生産に使用する。

一般に、Ｒ０植物の生産方法は、（ａ）培地でトウモロ
コシ組織を培養してカルスを形成させ、（ｂ）培養培地
でＡＢＣに耐性のあるカルス組織を選択し、そして（ｃ
）選択されたカルスから植物を再生させることを含む。

選択培地へ移す前に所望によりカルスは維持培地で維持
され得る。再生植物を成熟させ、自家授粉させてＲ１種
子を生産する。

Ｒ１種子から発芽したＲ、植物を自家授粉することによ
りＲ２種子を生産する。これ以降の世代ら同様の方法で
得ることができる。

フリー・プール・リジン含有量の増加方法は一般的にＡ
ＥＣによる選択工程を用いるが、選択せずに所望の特徴
を有するトウモロコシ種子および植物を生産することも
可能である。この場合、カルスを選択培地で培養せずに
維持培地で維持する。

この方法は有効ではなく、ＡＥＣによる選択方法よりも
成功頻度が低い。

前記で概略を述べた一般的方法の中で、幾つかの組織培
養シーケンスを用いて所望の特徴を有するトウモロコシ
種子および植物を生産することができる。好ましいシー
ケンスは次のように要約され得る。

第１の好ましいシーケンスでは、下記のようにカルス誘
導培地でカルスを誘導する。次いでカルスを再生培地へ
移す前に６−９継代についてはカルスを維持培地に移す
。次いで植物を土壌に移す。

このシーケンスの間どの段階においても選択は一切行わ
ない。

第２の好ましいシーケンスでは、下記のようにカルスを
カルス誘導培地で誘導する。カルス誘導培地は０−０．
２ミリモルのＡＥＣを含有し得る。

カルス誘導培地がＡＢＣを含まない場合、カルスを選択
培地へ移す前に２−６継代についてはカルスを維持培地
へ移す。カルス誘導培地がＡＥＣを含有する場合、カル
スを維持培地ではなく選択培地へ移す。再生培地へ移す
前に３−８ｖＡ代についてはカルスを選択培地へ移す。

継代を通じて、ＡＥＣの濃度を０．１から３．０ミリモ
ル、好ましくは０．■から１．０ミリモルまたは０．５
から２．０ミリモルへ徐々に増やす。別法として、ＡＢ
Ｃ濃度を徐々に増加させた後、すなわち維持培地へ移し
た後、ＡＢＣ濃度を０に落とし、次いで再生培地へ進め
る前に次の移し換えにおいて１．５−２゜５ミリモル、
好ましくは１．５−２．０ミリモルに高める。植物を土
壌へ移す前に再生培地で２−４継代培養、好ましくは３
継代培養が行なわれ得る。

再生培地は０−０．５ミリモルのＡＢＣを含有し得る。

再生培地でＡＥＣを使用し、再生培地での継代を通して
その濃度を徐々に低下させるのが好ましい。

第３の好ましいシーケンスは、選択培地での継代培養中
、ＡＥＣ濃度を１．０から３．０ミリモル、好ましくは
１．０から２．０ミリモルへ徐々に高めること以外は第
２シーケンスと同様である。

第４の好ましいシーケンスでは、前記と同様にカルスを
カルス誘導培地で誘導する。カルス誘導培地は０−０．
２ミリモルのＡＢＣを含有し得る。

カルス誘導培地がＡＥＣを含まない場合、カルスを選択
培地へ移す前に２−６ｕ代についてはカルスを維持培地
へ移す。カルス誘導培地がＡＥＣを含む場合、カルスを
選択培地へ移す。カルスを再生培地へ移す前に３−８９
代についてはカルスを選択培地へ移す。ＡＢＣ濃度は１
−３４１！代、好ましくは２継代については０．２５−
０．５ミリモルであり得、１−２ｕ代、好ましくはｌ継
代につい−ｃ、よ２，０−３．０ミリモル、好ましくは
２．０ミリモルに高める。次いでＡＢＣ濃度を０．５ミ
リモルに落とし、３−６＠！代、好ましくは４継代にわ
たってｔ、ｏ−ｔ、ｓミリモルに徐々に高める。

別法として、濃度を徐々に高めた後、すなわち維持培地
へ移した後、ＡＥＣ濃度を０に落とし、再生培地へ進め
る前に次の移し換えの際１．５−２゜０ミリモルに高め
る。植物を土壌へ移す萌、再生培地で２−４ｕ代、好ま
しくはａｖＡ代培養を行い得る。再生培地は０−０．５
ミリモルのＡＥＣを含有し得る。再生培地でＡＥＣを使
用し、再生培地での継代培養を通して徐々に濃度を下げ
るのが好ましい。

前記の好ましいシーケンスは、この明細書中に記載され
た教義に従い当業界の技術範囲内で修正され得る。幾つ
かの修正としては、（ａ）ある種の培地での移し換え数
の削減、（ｂ）シーケンスへの他の培地の追加、（ｃ）
当業界でよく知られている他の基礎培地の使用、（ｄ）
維持培地への移し換えの削除、（ｅｌ）選択工程全体に
わたる維持培地への移し換えの追加、（ｒ＞ｍ代持続時
間の削減、（９）各培地での移し換え数の増加および（
ｈ）ＡＥＣの配列における修飾が挙げられる。

カルス形成の開始における使用に好ましい植物組織は未
分化胚である。高レベルのリジンを有する植物からの未
分化胚を使用するのが好ましい。

かかるトウモロコシ系統には、クロウズ・ハイブリッド
・コーン・カンパニー（イリノイ）の１００７．１００
８、！Ｏ１Ｏおよび１０１２系統がある。胚の長さが１
　、０−２　、０　ｍｍ、好ましくは１゜５ｉｍである
場合、授粉後約ｔｏ−１７日目に未分化胚をトウモロコ
シ穂軸から分離する。トウモロコシ穂軸を採取して表面
殺菌する。未分化胚を各校から分離する。ＡＥＣを非含
有または含有し得るカルス誘導培地上で胚を培養する。

胚の軸を培地と接触させる、すなわち盾形（ｓｃｕｔｅ
ｌｌａｒ）側を上方にして胚を培養する。

カルス誘導培地は、無機塩類、ビタミン類およびしょ糖
を含有する。無機塩類は多量要素および微量要素を含む
。カルス誘導培地に用いられる多量要素は次の化合物で
あり得る。すなわち、硫酸マグネシウム、塩化カルシウ
ム、燐酸−カリウム、硝酸カリウムおよび硫酸アンモニ
ウム。カルス誘導培地に含まれる微量要素は、ホウ酸、
硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ヨウ化カリウム、硫酸鉄（ｎ
）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ジナトリウム
、モリブデン酸（Ｖｌ）ナトリウム、硫酸銅（ＩＩ）お
よび塩化コバルトである。無機塩類のこの組合わせはＲ
６無機塩類として当業界で公知であり、前記塩類は修飾
されることにより銅、コバルトおよびモリブデンの無機
塩類を含む。無機塩類の他の組合わせもまたカルス誘導
に悪影響がない限り使用され得る。無機塩類の組合わせ
の例にはＭＳ、ヘラ−（Ｈｅｌｌｅｒ）、ニチｚ　（Ｎ
ｉｔｓｃｈ）およびニチェ、Ｂ５およびホワイト（Ｗｈ
ｉｔｅ）があるが、これらに限定されるわけではない。

１リツトルのカルス誘導培地の製造に使用される多量要
素および微量要素の好ましい看は次の通りである。硫酸
マグネシウム７水和物１Ｂ５ｘ＠、塩化カルシウム２水
和物１６６１９、燐酸−カリウム４００屓９、硝酸カリ
ウム２８３０ｍｇ、硫酸アンモニウム４６３ｘｇ、ホウ
酸１．６ｊ！９、硫酸マンガン１水和物４．４ｍｇ、硫
酸亜鉛７水和物１　、５　ｘｇ、ヨウ化カリウム０．８
３ｍｇ、硫酸鉄（■）７水和物２７．８ｍｇ、ＥＤＴＡ
ジナトリウム３７．３ｍｇ、モリブデン酸（Ｖｌ）ナト
リウム２水和物０．２５Ｎ９、硫酸銅（■）５水和物０
．０２５ｘｙおよび塩化コバルト６水和物０．０２５１
９゜ またカルス誘導培地はビタミン類を含有する。

使用されるビタミン類には、ミオイノシトール、ニコチ
ン酸、グリシン、ピリドキシン、チアミンおよびパント
チネートがある。１リツトルのカルス誘導培地の製造に
使用されるビタミン類の量は次の通りである。ミオイノ
シトール１００ｍｇ、ニコチン酸０　、５　Ｒ９，グリ
シン２肩９、ピリドキシン塩酸塩０　、５　ｘｇ、チア
ミン塩酸塩１　、０１９およびパントテン酸カルシウム
０．２５１１ｇ。

第１の培地は２−６％、好ましくは３％のしょ糖および
ゲル化剤例えば寒天またはゲルライト（商標、ケルコ・
コマーシャル・デベロップメント、ピー・オー・ボック
ス２３０７６、サンジエゴ、カリフォルニア）を含む。

約０．７８％の濃度でバクトーアガーを用いるのが好ま
しい。オートクレーブの使用前にはこの培地はｐＨ５，
５−６，０であり、ｐＨ５、８が好ましい。

上記成分に加えて、カルス誘導培地はまたホルモンを含
む。この明細書で使用されている「ホルモン」は、植物
または植物組織に対して調節効果を有する天然または合
成化合物をすべて包含する。

この発明におｉするカルス誘導に有用なホルモンは２．
４−Ｄである。２．４−Ｄは単独または別のホルモン、
例えば２，４．５−トリクロロフェノキシ酢酸（２，４
，５−Ｔ）またはゼアチンと組合わせて使用され得る。

他のホルモン類、例えば公開されたヨーロッパ出願第０
１７７７３８号および共に出願中の米国出願第８６５４
３１号（１９８６年５月２１日出願）に記載されている
ホルモン類も使用され得る。ホルモンの量は確実なカル
ス形成に充分な量である。一般的に、約２−３　ｚｇ／
Ｑの２．４−Ｄで充分であり、２ｖ／Ｑが好ましい。ゼ
アチンまたは２，４．５−Ｔも存在する場合、それらは
２−３麓９／（１，好ましくは約２ｏ／Ｑの量で使用さ
れ得る。

カルス誘導培地はまた低濃度のＡＢＣを含有し得る。こ
の培地にはＡＥＣの存在しない方が好ましい。ＡＢＣが
存在する場合、０．０５−０．２ミリモル濃度を用いる
のが好ましい。

未分化胚をカルス誘導培地上に置き、２−５週間、好ま
しくは３−４週間１臼当たり１６時間の光周期の拡散光
中で培養する。この期間に、胚に脱分化およびカルス形
成が起こる。カルス誘導培地で未分化胚を培養後、カル
スを維持培地または選択培地上に移し、継代培養する。

一般的に、維持培地と選択培地の違いは後者がＡＥＣを
含むという点だけである。カルスは選択培地に移される
前に３−６継代については維持培地上で培養され得る。

カルスは再生培地に移される前に３−８ｕ代については
選択培地で培養され得る。カルスは１０−７０日毎に新
鮮な維持または選択培地に移される。

維持および選択培地は、カルスの維持に充分な量の無機
塩類、ビタミン類、しょ糖およびホルモンを含有する。

無機塩類およびビタミン類はカルス誘導培地における記
載と同様である。カルス誘導培地の場合と同様に、培地
の機能に悪影響を及ぼさない無機塩類の様々な組合わせ
が使用され得る。しょ糖濃度は３−６％、好ましくは３
％である。ホルモンは一般的に２−３　ｘｇ／Ｑ、好ま
しくは２Ｒ９／（ｌの濃度の２．４−Ｄであるが、他の
物質も前記と同様に使用され得る。０．７８％のバタト
ーアガーを用いて培地を凝固させる。

さらに維持および選択培地はＬ−グルタミンおよびクエ
ン酸を含有し得る。これらの成分が使用される場合、ｌ
Ｏミリモルのし一グルタミンおよび５ミリモルのクエン
酸濃度を用いるのが好ましい。

される選択培地はＡＢＣを含有する。選択培地における
ＡＥＣ濃度は０．１−３．０／Ｑモル、好ましくは０．
１−２．０／Ｑモルの範囲であり得る。

ＡＥＣｉ１度は選択プロセス中に変化するが、これにつ
いては後記の通りである。

選択シーケンスを完了後、選択カルスを再生培地上に置
く。１個またはそれ以上の再生培地が使用され得、約５
−４０日１に新鮮な再生培地への移し換えを行う。一般
的に、２−４回の移し換えが行なわれ得る。

再生培地は無機塩類、ビタミン類およびしょ糖を含有す
る。無機塩類はカルス誘導培地の場合と同じ、すなわち
Ｎ６塩類であり得、またはそれらはＭＳ無機塩類であり
得る。Ｎ６塩類を使用する方が好ましい。

また再生培地もビタミン類を含有する。使用され得るビ
タミン類は、（ａ）チアミン、ニコチン酸、ピリドキシ
ンおよびグリシン、または（ｂ）チアミン、グリシンお
よびミオイノシトールである。（ａ）ビタミン類はこの
明細書ではＮ６ビタミン類＋グリシンのことであり、（
ｂ）ビタミン類はこの明細書ではビタミンＧのことであ
る。１リツトルの再生培地の製造に使用されるビタミン
の量は次の通りである。すなわち、（ａ）Ｎ６ビタミン
については、チアミン塩酸塩１ＩＩ９、ニコチン酸０　
、５　ｍｇ、ピリドキシン塩酸塩０．５１およびグリシ
ン２ｍｇ、並びに（ｂ）ビタミンＧについては、チアミ
ン塩酸塩１ｍｇ、グリシン２１１ｇおよびミオイノシト
ール１００３１９゜ 好ましくは再生培地は２−６％のしょ糖を含有し、ゲル
化物質はバクトーアガーまたはゲルライト（各々約０．
７８％または約０．２２％）であり得る。

再生培地はｏ、ｔ−ｏ、ｓｏミリモルの濃度でＡＥＣを
含有し得る。再生周期巾約５−４０日１に行なわれる移
し換えの間ＡＥＣ濃度を低下させるのが好ましい。再生
培地はまたホルモンを含有し得る。ホルモンを使用する
場合、１種またはそれ以上のサイトカイニンを使用する
のが好ましい。

ホルモンは、（ａ）０．２−０．５１９／１２のインド
ール酢酸（ＩＡＡ）および０．４−１．５ｉ＋９／１２
のベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、好ましくはそれぞ
れ０゜３１９／ＱオヨＣ１Ｌ、Ｏｔｘｇ／Ｑ１またハソ
れぞれ０．３１１９ＩＱおよび０　、５　ｍ９／Ｑ、ま
たはそれぞれ０．２５１９／（ｌおよび１．０ＪＩ９／
１２．　（ｂ）０．２−０．５１９／（２のＩＡＡおよ
び０．８−１．５ｘｙ／Ｉ２のＢＡＰ、好ましくはそれ
ぞれ０．３ｚｇ／Ｑおよび１　、０　ｘｇ／（１゜並び
に（ｃ）０．１　＝０．３ｘｇ／（ｌの２．４−Ｄ、０
．０５−０．２ｘ９／ＱのＢＡＰおよび０．２−０．５
１！９／Ｑのジベレリン酸（ＧＡ３）、好ましくはそれ
ぞれ０゜２ｊＩ９／Ｉ２．０　、　Ｉ　ｏ／（ｌおよび
０．３５ＪＩ９／Ｑから成る混合物から選択され得る。

植物が再生および定着後、それらを一部鉢植え用土壌お
よび一部バーミキュライトを内包する管に移す。前記の
管に移し替える前に植物からゲル化物質を洗い落とす。

植物を約４−４０日１鉢植え用の土壌を含む１２″植木
鉢に移し、温室に置く。前記の培養および後記実施例に
おける培養はすべて約２４℃で拡散光１６時間／暗闇８
時間の周期により行なわれる。

幾つかの場合に、前記方法に従い得られた植物により生
産されたＲ１種子は低いフリー・プール・リジン含有量
を示した。しかしながら、これらのＲ１種子から発芽し
た植物は、乾燥種子重量１グラム当たり少なくとも３２
５μｇの平均フリー・プール・リジン含有量を有するＲ
ｔ種子を生産した。すなわち、Ｒ８種子のフリー・プー
ル・リジン含有量が低くても、最終的な所望の特性を得
ることは可能であることを示している。所望の特性を有
する植物および種子を得るためには数世代の植物が必要
とされ得ることを証明している。

以下、非限定的実施例によりこの発明についてさらに記
載する。

〔実施例〕

実施例１ 溶液の調製 後でさらに詳述する培地の製造用に下記のストック溶液
または溶剤を調製した。

１、ＯＰＡ反応混合物 ２．６９のホウ酸を９０ｘＱの脱イオン水に溶かすこと
によりＯＰＡ反応混合物を調製した。Ｋ　Ｏ１−１の４
５％溶液を用いてｐＨを１０，４に調節した。

２００μｇの２−メルカプトエタノール、次いで３００
μＱのブリージー３５を加えた。ブリージー３５を加え
ることにより、０ＰＡ−リジン複合体を安定させた［［
アナリテイカル・バイオケミストリーＪ（Ａｎａｌ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　１０１巻、６１頁（１９８０年）
］。５Ｏｘ９のフルオロパ（Ｆ　１ｕｏｒｏｐａ、ピア
ス（Ｐｉｅｒｃｅ）からの０ＰＡ）をｌｘ（のメタノー
ルに溶かし、次いでホウ酸塩溶液に加えた。脱イオン水
を用いて容量を１００１１２に調節した。ＯＰＡ反応混
合物を４℃に保ち、２週間後に廃棄して低Ｌ１基底ピー
クを確保した。

２、ＡＢＣストック溶液 ５．０２９のＡＢＣを５００　＊Ｑ（Ｄ脱イオン水に溶
かすか、または１．００４９のＡＥＣを１００ｊ１１２
の脱イオン水に溶かすことによりＡＢＣの５００ミリモ
ルストック溶液を調製した。ＩＮ−ＫＯＨを用いてＰＨ
を５．８に調節した。

３、ホルモン類 （Ａ）２．４−Ｄ、　　５Ｑｊ１１ｉ１の２．４−Ｄを
１００蛙の脱イオン水に溶かすことにより０．５ｘ９／
ｚＮストツク溶液を調製した。

（Ｂ）ＩＡＡ、５０ｍｇのＩＡＡを１００ｘ１２の脱イ
オン水に溶かすことにより０　、５　ｎ／ｚ（ｌストッ
ク溶液を調製した。

（Ｃ）ＢＡＰ、５０ｍｇのＢＡＰを１００ｘ（！の脱イ
オン水に溶かすことにより０　、５　ｎ／ｍＱストック
溶液を調製した。

（Ｄ）ゼアチン。１０ｏのゼアチンを１００１１２の脱
イオン水に溶かすことにより０　、１　ｍｇ／ｘＱスト
ック溶液を調製した。

（Ｅ）ＧＡｓ。１６．７麗９のＧ　Ａ　ｓを１００ｊＩ
Ｑの脱イオン水に溶かすことにより０．１６７ｊ＋９／
ｘ（２ストツク溶液を調製した。

（Ｆ）２，４．５−Ｔｏ　５０所の２．４．５−Ｔを１
００ｙｉＱの脱イオン水に溶かすことによりＱ　、　５
１１９／村ストツク溶液を調製した。

４、ビタミン類 （＾）Ｎ６ビタミン類 １００１１９のチアミン塩酸塩、５０ＩＩｇのニコチン
酸、５０Ｒ９のピリドキシン塩酸塩および２００１９　
　゛のグリシンを１００１７２の脱イオン水に溶かすこ
とにより、Ｎ６ビタミン類の１００ＯＸストツク溶液を
調製した。

（Ｂ）ビタミンＧ １００ｏのチアミン塩酸塩、２００ｘｆのグリシンおよ
び１０９のミオイノシトールを１００１Ｑの脱イオン水
に溶かすことにより、ビタミンＧの１０００Ｘストツク
溶液を調製した。

（Ｃ）ビタミン類 １００３１ｇのチアミン塩酸塩、５０ｘｙのピリドキシ
ン塩酸塩、５０ｍｇのニコチン酸、２００３！９のグリ
シン、１０ｇのミオイノシトールおよび２５１９のパン
トテン酸カルシウムを１００１１Ｉ２の脱イオン水に溶
かすことにより、Ｎ６ビタミン類の１０００Ｘストツク
溶液を調製した。ＩＮのＫＯＨを用いてｐｉ（を５，８
に調節した。

５、アミノ酸 （Ａ）グルタミン ３．６５９のし一グルタミンを１００ｉｃの脱イオン水
に溶かすことにより、２５０ミリモルのストック溶液を
調製した。ＩＮのＫ　ＯＨによりｐＨを５゜８に調節し
た。

（Ｂ）クエン酸 １９．２９のクエン酸無水物を１００ｉＱの脱イオン水
に溶かすことにより、１モルのストック溶液を調製した
。ＩＮのＫＯＨによりｐＨを５．８に調節した。

６、無機塩類 （Ａ）修飾Ｎ６ １８５０１１９の硫酸マグネシウム７水和物、１６６０
ｎの塩化カルシウム２水和物、４．０ｇの燐酸−カリウ
ム、４．６３９の硫酸アンモニウム、２８．３ｇの硝酸
カリウム、！６即のホウ酸、４４ｊＩ９の硫酸マンガン
−水和物、１５屑９の硫酸亜鉛７水和物、８１９のヨウ
化カリウム、２７８１９の硫酸鉄（■）７水和物、３７
３ｕのＥＤＴＡジナトリウム、２．５所のモリブデン酸
（Ｖｌ）ナトリウム２水和物、０．２５ｍｇの硫酸銅（
■）５水和物および０．２５ｘｙの塩化コバルト６水和
物を３００ｉ＋ｌＪの脱イオン水に溶かすことにより、
修飾Ｎ６塩類の２０Ｘストツク溶液を調製した。次いで
容量を５００３１ｇにして５０酎のアリコートに分けた
。

（Ｂ）ＭＳ ｌＯパッケージのＭＳ塩類を非緩衝状態で（ギブコのカ
タログ番号６００−１１１７）５００！＋１２の脱イオ
ン水に溶かすことにより、ＭＳ塩類の２０Ｘストツク溶
液を調製した。ストック溶液を５０ｘＱのアリコートに
分けた。

実施例２ 培地の製造 １．２Ｄ／Ｚ３Ｓ。

コノ培地は、３０９のしょ糖、５０ｍ９の２０Ｘ修飾Ｎ
６塩類および４ｘ（ｌの２．４−Ｄストック溶液を６０
０ｊ１１２の脱イオン水に加えることにより製造した。

脱イオン水を用いて容量を９７９ｘＱにした。ＩＮのＫ
　ＯＨによりｐＨを５，８に調節し、７゜８９のバクト
ーアガーを加え、混合物をオートクレーブ処理した。２
０ｘ（ｌのゼアチンストック溶液およびＩＲＱのビタミ
ンストック溶液を滅菌濾過し、冷却培地に加え、ペトリ
皿に注いだ。

２．１０Ｔ３Ｓ。

この培地は、３０ｇのしょ糖、５０１１２の２０Ｘ修飾
Ｎ６塩類、４ｍ１２の２．４−Ｄストック溶液および４
，４ｚＱの２．４．５−Ｔストック溶液を６００１１２
の脱イオン水に加えることにより製造した。

脱イオン水を用いて容量を９９９峠にし、ＩＮのＫＯＨ
によりｐ）（を５．８に調節し、７．８９のバクトーア
ガーを加え、混合物をオートクレーブ処理した。１ｘＱ
のビタミンストック溶液を滅菌濾過し、冷却培地に加え
、ベトリ皿に注いだ。

３．３ＨＭ。

コノ培地は、３０ｇのしよ糖、５０ｘＱの２０Ｘ修飾Ｎ
６塩類および４ｉ６の２．４−Ｄストック溶液を６００
ｍ１２の脱イオン水に加えることにより製造した。さら
に脱イオン水を追加して容量を９５４ｘＱにした。ＩＮ
のＫＯＨによりｐＨを５．８に調節し、７．８ｇのバク
トーアガーを加えた。混合物を２０分間２０ｐｓｉおよ
びピ２１″ＣＣ２５０°Ｆ）でオートクレーブ処理した
。４０ｉＣのグルタミンストック溶液、５ｍ１２のクエ
ン酸ストック溶液および１Ｈのビタミンストック溶液を
各々０．２２ミクロンのミリポア膜または０．２ミクロ
ンのゲルマンフィルターにより滅菌濾過し、次いで冷却
培地に加え、ペトリ皿に注いだ。

４、Ａｏ、２Ｎ。

この培地は、オートクレーブ処理の前に容量を９５、　
Ｏｙｔ（ｌとすること以外は３ＨＭの場合と同様に製造
した。４Ｒ１２のＡＥＣストック溶液を滅菌濾過し、グ
ルタミン、クエン酸およびビタミン類と一緒に冷却培地
に加えた。

５、Ａｏ、２５Ｎ０ この培地は、オートクレーブ処理の前に容量を９４９３
１１２とし、５ｊＩＱのＡＥＣストック溶液を使用する
こと以外は前記と同様に製造した。

６、Ａｏ、５Ｎ。

この培地は、オートクレーブ処理の前に容量を９４４ｘ
Ｑとし、ｌＯ酎のＡＥＣストック溶液を使用すること以
外は前記と同様に製造した。

７、ＡＩＮ。

この培地は、オートクレーブ処理の前に容量を９３４　
ｍ（ｌとし、２０村のＡＥＣストック溶液を使用するこ
と以外は前記と同様に製造した。

８、Ａ２Ｎ。

この培地は、オートクレーブ処理の前に容量を９１４ｍ
１２とし、４０酎のＡＢＣストック溶液を使用すること
以外は前記と同様に製造した。

９、Ａｏ、０５Ｎ。

この培地は、１ｘＱのＡＥＣストック溶液を使用し、最
初の容量を９５３１１２とすること以外は前記Ａ０．２
Ｎの場合と同様に製造した。

１０、Ａｏ、ＩＮ。

この培地は、２酎のＡＥＣストック溶液を使用し、最初
の容量を９５２ｍ１２とすること以外は前記Ａ０．２Ｎ
の場合と同様に製造した。

１１．２Ｎ３゜ この培地は、３０９のしょ糖、５０ＲＱの２０Ｘ修飾Ｎ
６塩類および４ｘＱの２．４−Ｄストック溶液を６００
ｙ１２の脱イオン水に加えることにより製造した。さら
に脱イオン水を追加して容量を９９９ｊ１１２にした。

ＩＮのＫＯＨによりｐＨを５．８に調節し、７．８９の
バクトーアガーを加えた。混合物を前記と同様にオート
クレーブ処理した。１１１１２のビタミンストック溶液
を滅菌濾過し、冷却培地に加え、ペトリ皿に注いだ。

１２．２Ｎ６゜ この培地は、３０９ではなく６０９のしょ糖を加えるこ
と以外は２Ｎ３の場合と同様に製造した。

１３．３Ｎ３゜ この培地は、４＊Ｑではなく６３１１２の２．４−Ｄス
トック溶液を加えること以外は２Ｎ３の場合と同様に製
造した。

１４．３Ｎ０ この培地は、３０ｇのしよ糖、５０酎の２０Ｘ修飾Ｎ６
塩類および４ｗ（ｌの２．４−Ｄストック溶液を６００
ｍ１２の脱イオン水に加えることにより製造した。さら
に脱イオン水を追加して容量を９５４ｘＱにした。ＩＮ
のＫＯＨによりｐＨを５．８に調節し、７．７９のバク
トーアガーを加えた。混合物をオートクレーブ処理した
。４０ｉＱのグルタミンストック溶液、５酎のクエン酸
ストック溶液およびＩｚ（ｌのビタミンストック溶液を
滅菌濾過し、冷却培地に加えた。この培地をベトリ皿に
注いだ。

１５、　ＭＡＣ１５゜ この培地は、オートクレーブ処理の前に容量を９６９ｓ
＋ｅとすること以外は２Ｎ３の場合と同様に製造した。

３０ｚＱのＡＢＣストック溶液を滅菌濾過し、ビタミン
類と一緒に冷却培地に加えた。次いで培地をペトリ皿に
注いだ。

Ｌ６．ＭＡＣ２０゜ この培地は、オートクレーブ処理の前に容量を９５９ｊ
＋１２トし、４０肩Ｒ（７）ＡＥＣストック溶液を使用
すること以外はＭＡＣ１５の場合と同様に製造した。

１７、　ＭＡＣ１０゜ この培地は、オートクレーブ処理前の容量を９７９ｘＱ
とし、３０ｉＱでＧｉなく２０ｊＩＮのＡＢＣストック
溶液を使用すること以外はＭＡＣ１５の場合と同様に製
造した。

１ｇ、ＲＭｌ、５゜ この培地は、６０９のしょ糖、５０ＲＱの２０Ｘ修飾Ｎ
６塩類およびｌｊ＋１２のビタミンストック溶液を６０
０ｉ１２の脱イオン水に加えることにより製造した。脱
イオン水を加えることにより容量を９９０ｘＮにした。

ＩＮのＫＯＨｔ、：よりｐＨを５．８に調節し、２．２
ｇのゲルライトを加えた。混合物をオートクレーブ処理
した。１Ｏｉ１２のＡＥＣストック溶液を滅菌濾過し、
冷却培地に加えた。次いでこの混合物をペトリ皿に注い
だ。

１９、ＲＭ２．２５゜ この培地は、２０９のしょ糖、５０Ｒｕ）２０Ｘ修飾Ｎ
６塩類、０　、６　ｘ（ｌのＩＡＡストック溶液、２　
、　Ｏｘ（ｌのＢＡＰストック溶液および１ｘＱのビタ
ミンＧストック溶液を６００酎の脱イオン水に加えるこ
とにより製造した。脱イオン水を加えることにより容量
を９９５ｉｆｆにした。ＩＮのＫＯＨによりｐＨを５．
８に調節し、２．２９のゲルライトを加えた。混合物を
オートクレーブ処理し、５１１２のＡＥＣストック溶液
を滅菌濾過し、冷却培地に加えた。次いでこの混合物を
ペトリ皿に注いだ。

２０、ＲＭ（２）。

この培地は、容量をＩＱとし、ＡＥＣを加えないこと以
外はＲＭ２．２５の場合と同様に製造した。

２１、ＲＭｌ、２５゜ この培地は、オートクレーブ処理前に容量を９９５ｍ１
２とし、ｌＯ酎ではなく５峠のＡＥＣストック溶液を使
用すること以外はＲＭｌ、５の場合と同様に製造した。

２２、　　ＨＶ　１２　Ａ。

この培地は、２０９のしょ糖、！パッケージのギブコＭ
Ｓ塩類（カタログ番号５００−１１７）、０　、４　ｍ
Ｑの２．４−Ｄストック溶液および０．２ｘ＆のＢＡＰ
ストック溶液を６００１１２の脱イオン水に加えること
により製造した。脱イオン水を加えることにより容量を
９９２．９３１１２にした。ＩＮのＫＯＨによりｐＨを
５．８に調節し、２９のゲルライトを加えた。混合物を
オートクレーブ処理した。

５村のＡＥＣストック溶液および２Ａｘ（ｌのＧ　Ａ　
３ストツク溶液を各々滅菌濾過し、冷却培地に加えた。

次いでこの混合物をペトリ皿に注いだ。

２３、ＲＲＭ。

この培地は、１５９のしよ糖、５０ｔｘＱの２０ＸＭＳ
塩類、ｋｘＱのビタミンＧストック溶液および０．２村
の２．４−Ｄストック溶液を６００ｘＱの脱イオン水に
加えることにより製造した。脱イオン水を加えることに
より容量をＩＱにし、ＩＮのＫＯＨによりｐＨを５．８
に調節した。８．５９のバクトーアガーを加えた。混合
物をオートクレーブ処理し、植物および組織培養容器（
フロー°ジェネラル・カンパニーのカタログ番号２６−
７２１−０７）中に注いだ。

２４、ＲＲＭＩ。

この培地は、容量を９９８蛙とすること以外はＲＲＭの
場合と同様に製造した。２ｘＱのＡＥＣストック溶液を
滅菌濾過し、注ぐ前に冷却培地に加えた。

２５、ＩＢＭ。

コノ培地は、３０ｇのしょ糖、５０ｘＱ（１）２０ＸＭ
Ｓ塩類、１ｘＱのビタミンＧストック溶液、０゜６ｊ！
ｕ）ＩＡＡストック溶液および２ｉ１２ノＢＡＰＸドツ
ク溶液を６００１の脱イオン水に加えることにより製造
した。脱イオン水を加えることにより容量をｔａとした
。ＩＮのＫＯＨによりｐＨを５゜８に調節し、８．３９
のバクトーアガーを加えた。

混合物を加熱して寒天を溶カル、試験管の３分の１を満
たすまで試験管に注いだ。次いで試験管を前記と同様に
オートクレーブ処理した。

２６．１８Ｍ７゜ この培地は、２ｘＱのＢＡＰストック溶液の代わりに１
ｊＩＱのＢＡＰストック溶液を用いること以外はＩＢＭ
の場合と同様に製造した。

２７、ＩＢＭ１２゜ この培地は、０．６１ｇではなく　０．５３ＩσのＩＡ
Ａストック溶液を用いること以外はＩＢＭの場合と同様
に製造した。

実施例３ 未分化胚の分離 未分化胚を授粉の１０−１７日後、長さ１１−２Ｒ，好
ましくは１．５ｘｍの時点でクロウズ・ハイブリッド・
コーン・カンパニー（ミルフォード、イリノイ）の１０
０７．１Ｏ０８，１０１０または１０１２系統のトウモ
ロコシ穂軸から分離した。

穂軸を採取し、漂白剤および１滴のりキノックス（ｌｉ
ｑｕｉｎｏｘ、商標、アルコノックス社、ニューヨーク
、ニューヨーク、ブロードウェイ８５３）デタージェン
トの２０％溶液中で２０分間表面殺菌した。滅菌脱イオ
ン水で穂軸をリンスした。各位の先を解剖用メスにより
薄く切り、胚乳を掬うことにより未分化圧を分離した。

次いテ未分化胚を取り出し、後述するように、胚の軸を
培地と接触させる、スナわち層形側を上にした状態で所
望の培地上に置いた。

実施例４ 基本的培養条件およびトウモロコシの生長前記に従い分
離された未分化圧をベトリ皿に入れたカルス形成開始用
の培地に胚の軸が培地と接触、すなわち層形側を上にし
て置いた。２　Ｄ／Ｚ３Ｓ、１０Ｔ３Ｓ、Ａｏ、０５Ｎ
、Ａｏ、２Ｎ１３Ｎおよび２Ｎ６を含む様々な培地をカ
ルス形成開始用に使用した。培養はすべて約２４℃で拡
散光１６時間／暗闇８時間の周期により行なわれた。

未分化圧を新鮮な培地に移す前に約２１〜約３２日間培
養した。新鮮な培地への移し替えは普通約６〜約６７日
後に行なわれた。後で詳細に述べるように、様々なシー
ケンスの培地を使用した。一般的に、ＡＢＣ含有培地で
一定の期間カルスを選択し、次いで植物を再生させた。

ＲＭｌ、５、ＲＭ２．２５、ＲＭｌ、２５、ＲＭ（２）
、ＲＲＭＳ　１８Ｍ１２．１８Ｍ７、ＲＲＭＩおよびＨ
１２Ａを含む幾つかの再生培地を用いて再生を行った。

後でさらに詳述するが、１種またはそれ以上の前記培地
のシーケンスを使用した。植物が得られた後、それらを
キューブに入れられた土壌に移した。

この土壌はバーミキュライトおよび鉢植え用土壌のｌ：
ｌ混合物から成るものであった。約４〜約３０日後、標
準苗床鉢植え用土壌を含有する１２″鉢に各植物を移し
、温室に入れた。

植物を温室で生育し、自家授粉させた。Ｒ８種子を集め
、フリー・プール・リジン含有量を測定した。またＲ、
種子を野外研究用苗床に植えた。

Ｒ１植物を自家授粉させ、Ｒ２種子を集めた。

実施例５ 培養シーケンス 前記に従い分離された未分化圧を培養し、下記の要領で
植物を再生した。培養はすべて拡散光１６時間／暗闇８
時間の周期により行なわれた。

１．１０１２系統（組織培養対照） 未分化圧を３Ｎ培地で培養した。次のシーケンスに上り
カルスを移し、植物を再生した。すなわち、２６日後３
Ｎ培地、６７日後３Ｎ培地、２１日１ａＮＭ培地、３２
日１ａＮＭ培地、２８日１ａＮＭ培地、２９日１ａＮＭ
培地、２８日１ａＮＭ培地、２９日後手Ｍ（２）培地、
■８日役牛ューブおよび２９日１ｌ２″鉢。１植物をＣ
Ｚ９Ｃ２２Ｃ＊として同定した。この植物から得られた
Ｒ１種子をフリー・プール・リジンに関して測定した。

２．１００７系統 未分化圧をＡｏ、２Ｎ培地で培養した。次のシーケンス
に上りカルスを移し、植物を再生した。

すなわち、２１日後手０．２５Ｎ培地、２５日後手０．
５Ｎ培地、３０日後手ＩＮ培地、２５日後手ＩＮ培地、
２２日後手Ｖ１２Ａ培地、７後手ＩＢＭ７培地、２３日
後手ＲＭ培地、５３日後手ューブおよび１３日１ｌ２″
鉢。ｌ植物をＣＺＩ４１８Ａ６として同定し、Ｒ１種子
をフリー・プール・リジンに関して測定した。

３．１０１２系統 未分化圧を３Ｎ培地で培養した。次のシーケンスに上り
カルスを移し、植物を再生した。すなわち、３１日後３
Ｎ培地、３２日後３Ｎ培地、３５日後３Ｎ培地、１９日
後手０．２５Ｎ培地、３３８後Ａ０．２５Ｎ培地、２８
日後手０．５Ｎ培地、２９日後手０．５Ｎ培地、２９日
後手ＩＮ培地、３１日後手ＩＮ培地、１１日後手ＩＮ培
地、１９日後手Ｍ１．２５培地、９８後ＲＭ２．２５培
地、２９日後手ＲＭ培地、１２日後手ューブおよび７８
後１２’鉢。ｌ植物をＣＺ９Ｄ１５Ｇとして同定した。

４．１０１２系統 未分化胚を３Ｎ培地で培養した。次のシーケンスに上り
カルスを移し、植物を再生した。すなわち、２８日後３
Ｎ培地、２８日後３Ｎ培地、３０日後３Ｎ３培地、３７
日後３Ｎ培地、１９日後手Ｏ，２５Ｎ培地、３３日後手
０．２５Ｎ培地、２８日後手０．５Ｎ培地、２９日後手
０．５Ｎ培地、２４日後手ＩＮ培地、２６日後手ＩＮ培
地、２１日後手ＩＮ培地、１９日後手Ｍ１．２５培地、
９８後ＲＭ２．２５培地、６８後ＩＢＭ１２培地、１３
日後手ＲＭ培地、２３日後手ューブおよび１３日後手２
″鉢。１植物をＣＺ９Ａ３ＢＩＢ９として同定した。同
じシーケンスによりＣＺ９Ａ３Ｂ１Ｂ９として同定した
第２の植物が生産された。

これらの２Ｎの植物から得られたＲ１種子をフリー・プ
ール・リジンに関して測定した。第３の植物をＣＺ９Ａ
３ＢＩＢ９として同定した。第３植物から得られたＲ１
種子を生長させ、Ｒｔ種子をフリー・プール・リジンに
関して測定した。

５．１０１２系統 未分化胚を３Ｎ培地で培養した。次のシーケンスに上り
カルスを移し替え、植物を再生した。すなわち、２６日
後３Ｎ培地、３０日後３Ｎ培地、３７日後３Ｎ培地、１
９日後手０．２５Ｎ培地、３３日後手０．２５Ｎ培地、
２１日後手２Ｎ培地、３３日後手０．５Ｎ培地、１６日
後手０．５Ｎ培地、２５日後手ＩＮ培地、３３日後手Ｉ
Ｎ培地、１９日後手Ｍ１．２５培地、９８後ＲＭ２．２
５．１６日後手ＲＭ培地、１２日後手ューブおよび２２
日後手２″鉢。幾つかの相異なる植物を、ＣＺ９Ｂ９Ａ
ＩＡＩ、ＣＺ９Ｂ９ＡＩＡ６、ＣＺ９Ｂ９ＡＩＢ５、Ｃ
Ｚ９Ｂ９ＡＩＢ３０、ＣＺ９Ａ３Ａ４−３、ＣＺ９Ａ３
Ａ４−６およびＣＺ９Ｃ２７Ｃ２Ａ４として同定した。

これらの植物から得られたＲ３種子をフリー・プール・
リジンに関して測定した。ざらにＣＺ９Ｇ２７Ｃ２Ａ１
７として同定した植物を用いてＲ２種子を生産し、フリ
ー・プール・リジンに関して測定した。

６．１０１・０系統 未分化胚を２Ｎ６培地で培養した。次のシーケンスに上
りカルスを移し、植物を再生した。すなわち、３２日後
２Ｎ６培地、２７日後２Ｎ３培地、１１日後手ＮＭ培地
、２７日後手ＮＭ培地、３３日後手０．５Ｎ培地、４１
日後手０．５Ｎ培地、２８日後手ＩＮ培地、２６日後手
ＩＮ培地、５１日後ＭＡＣ２０培地、３２日後ＭＡＣ１
５培地、４４日後手Ｍ１．５培地、７８後ＲＭ２．２５
培地、３３日後手ＲＭＩ培地、３２日後手ューブおよび
４８後１２″鉢。２種の植物を、各々ｃｚｔｔｃ８Ａ２
ＤおよびＣＺＩ　ＩＣ８Ａ２Ｅとして同定した。これら
の植物から得られたＲ３種子をフリー・プール・リジン
に関して測定した。

７．１０１０系統 未分化胚を２　Ｄ／Ｚ　３　Ｓ培地で培養した。次のシ
ーケンスに上りカルスを移し、植物を再生した。

すなわち、３２日後２Ｎ６培地、２７日後２Ｎ３培地、
１１日後手ＮＭ培地、２７日後手ＮＭ培地、３３日後手
０．５Ｎ培地、４１日後手０．５Ｎ培地、２９日後手Ｉ
Ｎ培地、２３日後手ＩＮ培地、２６日後手ＩＮ培地、５
１日後ＭＡＣ２０培地、３０日後２Ｎ３培地、３２日後
ＭＡＣ１５培地、４４日後手Ｍ１．２５培地、７８後Ｒ
Ｍ２．２５培地、３３日後手ューブおよび２２日後手２
″鉢。４種の相異なる植物を、ＣＺ１１Ｃ１９ＡＩＡＩ
Ｂ１ＣＺｌＩＣ１９Ｂ２Ａ７、ＣＺＩ　ＩＣ１９Ｂ２Ａ
８およびＣＺＩ　１ｃ１９Ｂ２Ａ１０として同定した。

Ｒ１種子をフリー・プール・リジンに関して測定した。

８．１０１０系統 未分化胚を１ＯＴ３ｓ培地（ＣＺ１１Ｃ１８）または２
　Ｄ／Ｚ　３　Ｓ培地（ＣＺ１１Ｃ１９）で培養した。

次のシーケンスに上りカルスを移し、植物を再生した。

すなわち、３２日後２Ｎ６培地、２７後手２Ｎ３培地、
ｌ１日後人ＮＭ培地、２７日８ａＮＭ培地、３３日８Ａ
０．５Ｎ培地、４１日後人０．５Ｎ培地、２９日８ＡＩ
Ｎ培地、２３日８Ａ０．５Ｎ培地、２６日８Ａ０．５Ｎ
培地、５１日後ＭＡＣ１０培地、３０日後２Ｎ３培地、
３２日後ＭＡＣ１５培地、４４日後人Ｍ１．５培地、７
８後ＲＭ２．２５培地、３３日後人ＲＭＩ培地、２２日
後手ューブおよび４８後１２″鉢。５種の植物を、ＣＺ
１１Ｃ１８ＢＩＣ１，ＣＺＩＩＣ１８Ｂ２ＣＩ、ＣＺＩ
　１ｃ１９ＡＩＢＩＢ、ＣＺＩＩＣ１９ＡＩＢＩＣおよ
びＣＺ１１Ｃ１９ＡＩＢ２Ｂとして同定した。Ｒ，種子
をフリー・プール・リジンに関して測定した。

９．１０１０系統 未分化胚を２Ｎ６培地で培養し、た。次のシーケンスに
上りカルスを移し、植物を再生した。すなわち、３２日
後２Ｎ６培地、２７日後２Ｎ３培地、１１日後手ＮＭ培
地、２７日８ａＮＭ培地、３３日８ａＮＭ培地、４８日
後人ＩＮ培地、３２日８ＡＩＮ培地、１３日８ＡＩＮ培
地、３５日後人１Ｎ培地、５２日後ＭＡＣ２０培地、３
０日後２Ｎ３培地、３２日後ＭＡＣ１５培地、４４日後
人Ｍ１．２５培地、７８後ＲＭ２．２５培地、３３日後
人ＲＭＩ培地、２２日後手ューブおよび１４日８ｌ２″
鉢。ｌ植物をＣＺ１１０９Ｃ２として同定し、Ｒ１種子
をフリー・プール・リジンに関して測定した。

１０．１００８系統 未分化胚をＡｏ、５Ｎで培養した。次のシーケンスによ
りカルスを移し、植物を再生した。すなわち、３６日後
手Ｏ，ｌＮ培地、３３日後人Ｏ９２５Ｎ培地、２２日８
Ａ０．５Ｎ培地、３２日８ＡＩＮ培地、２３日８ＡＩＮ
培地、２８日８ＡＩＮ培地、２０日８ＲＭ１．２５培地
、８後手ＲＭ２．２５培地、６８後ＩＢＭ７培地、１３
日８ＲＲＭ培地、２４日後手ューブおよび１１日８ｌ２
″鉢。

１植物をＣＺ１３ＦＣＩ−１６として同定し、これを用
いてＲ１種子を生産した。Ｒ１種子をフリー・プール・
リジンに関して測定した。

前記と同じ手順に従い、次の植物も得られた。

すなわち、ＣＺ９Ｄ１５Ｄ２、ＣＺ９Ｃ２７Ａ１−８、
ＣＺ９Ｃ２７Ｃ２Ａ７、ＣＺ９Ｃ２７Ｃ２Ａ９、ＣＺ９
Ｃ２７Ｃ２Ａ１８Ａ、ＣＺ９Ｃ２２ＡＩＢＩＨＳ　ＣＺ
９Ａ２０Ｃ１１Ｓ　ＣＺ９ＢＢ４８Ｂ、ＣＺ９ＨＨ２Ａ
、ＣＺＩ　ＩＣ１８Ｂ２Ｃ６、ＣＺｌＩＣ８Ａ２ＧＳ　
ＣＺｌＩＣ２ＯＡＩ％　Ｃ２１１に８Ｂ２ｃ、ＣＺ１１
Ｃ１９ＡＩＢ１およびＺＩＩ０ 実施例６ トウモロコシ種子の遊離リジン分析 非破壊的単一種子測定法を用いてこの発明のトウモロコ
シ種子の内在性遊離リジン（内在性フリー・プール・リ
ジン）含有量を測定した。この測定法では、トウモロコ
シ粒を滅菌水に２４時間浸した。浸した後、胚を傷付け
ぬように注意深く幾つかの胚乳を解剖用メスで摘出した
。胚を後で植えることができるように清潔な管中に入れ
た。果皮を摘出した胚乳の周囲から除去し、廃棄した。

胚乳の断片をすり鉢に入れ、乳棒で充分に粉砕した。微
粉状の胚乳を１時間１００℃で焼いて乾燥させた。４０
幻の乾燥粉末をマイクロフユージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ
）管に加えた。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）の５％溶液を
各試料に加えて最終濃度１０μｍ２（ＴＣＡ）１０（組
織）を得た。混合物を充分混合し、室温で少なくとも３
０分間置き、好ましくは連続的に振り混ぜた。試料をｌ
Ｏ分間冷室マイクロフユージ中で回転させた。３０μＱ
の上清を除去し、小さなガラス管または新しいマイクロ
フユージ管に加えた。次いで９０μＱのＯＰＡ反応混合
物を加え、管内を＾状にして混合した。

次いで混合物を直ちに逆相高圧液体クロマトグラフィー
にかけて０ＰＡ−アミノ酸誘導体を分離シタ。パーキン
−エルマーＣ１８カラム（粒子サイズ３μ）を使用した
。５０μｇの試料を試料ループに注入してループを確実
に満たした。３０％アセトニトリルおよび７０％５０ミ
リモルの燐酸カリウム、ｐＨ６，５から成る溶媒により
ｌ　、５１９７分の流速で０ＰＡ−アミノ酸誘導体を溶
離した。０ＰＡ−アミノ酸誘導体は３４０ｎｍの吸光度
により検出された。データ集めを０．１分目で開始し、
９分目で完了した。検出いき値は１．００であり、最小
ピーク幅は９．５であった。領域拒絶いき値は２０００
であり、垂直目盛りは２０−θミリボルトであった。適
当な対照測定法を行うことにより、完全なリジン抽出、
ＯＰＡ誘導体化および検出感度を確保した。

個々の種子のフリー・プール・リジン含有量および個々
の植物から得られた種子の平均フリー・プール・リジン
含有量をそれぞれ第１表および第２表に示す。

第１表 実施例５で生産されｊ＝植物から得られた各種子のフリ
ー・プール・リジン含有量 去しバ五Ｖμｍ員扱刊記吋 植物の名称　　　　Ｒ，Ｐｕ子　　　　　Ｒ１子ＣＺ１
４１８Ａ６　　　　　５５５．６１　　　　　　　−一
６７６．００　　　　　　　　　　　−一５３１．００
＋＋ ＣＺ９Ｃ２２Ｃ傘　　　　　ｓｏｓ、ｏｏ　　　　　　
　　＋＋ＣＺ９Ｄ１５Ｃ１−３５１４，９５＋＋ｓｏｔ
、ｏｏ　　　　　　　　　　　　＋＋８００．００　　
　　　　　　　　　−−ＣＺ９Ａ３ＢＩＢ９　　　　５
１０．ＯＯ−−ＣＺ９Ａ３ＢＩＢ１１　　　　５６５．
００　　　　　　　　＋＋ＣＺ９Ｂ９ＡＩＡ６　　　　
５０４．０８　　　　　　　−７１８．００　　　　　
　　　　　　−一〇２９Ｂ９ＡＩＢＳ　　　　　？１９
．３９　　　　　　　−ＣＺ９Ｂ９ＡＩＢ３Ｑ　　　　
　６？３＋２３　　　　　　　−７０２．００　　　　
　　　　　　　＋＋７３５．００　　　　　　　　　　
　＋＋７３７．０（１＋＋ ＣＺ９Ａ３Ａ４−３　　　　　５３４．１８　　　　　
　　　＋＋５５１．００　　　　　　　　　　　＋＋Ｃ
ＺＧＡ３Ａ４−６　　　　　８８８．７？　　　　　　
　　−−５２９，００−＋ ５１０．００　　　　　　　　　　　＋＋６５３．００
　　　　　　　　　　　＋＋ＣＺ９Ｃ２７Ｃ２Ａ４　　
　　６５５．００　　　　　　　−ＣＺ１１Ｃ８Ａ２Ｄ
　　　　　５２４．ＯＢ　　　　　　　　−＋５０４．
０６　　　　　　　　　　　　＋＋ＣＺ１１Ｃ８Ａ２Ｅ
　　　　　　　　５４９．１３　　　　　　　　　　−
一〇２１１Ｃ１９ＡＩＡＩＢ　　　　　５０３．７６　
　　　　　　　　　−−５２３．０４　　　　　　　　
　　　−−ｓｏｏ、ｏｖ　　　　　　　　　　　　＝Ｃ
Ｚ１１Ｃ１９ＡＩＢ２Ｂ　　　　　５２５．０７　　　
　　　　　　　−−６８１．５５　　　　　　　　　　
　　＝５３２．００　　　　　　　　　　　−−ＣＺｌ
ｌＣ１９Ｂ２Ａ７　　　　　５８０．７４　　　　　　
　　　　　　＝５５０．０９　　　　　　　　　　　　
＝６９３．８８　　　　　　　　　　　　＝５６６．３
２　　　　　　　　　　　　＝ＣＺｌｌＣ１９Ｂ２Ａ８
　　　　　５２４，８？　　　　　　　　　　　−−６
５６，０６−一 〇ＺｌＩＣ１９Ｂ２ＡＩＯ６５２，６８−−５２７、Ｑ
８　　　　　　　　　　　　＝６６４．０８　　　　　
　　　　　−−５３７．６５　　　　　　　　　　　−
−ＣＺｌｌＣｌＢＢＩＣｌ　　　　　　５４９．３０　
　　　　　　　　　−６４４．７３　　　　　　　　　
　　　＋−８８９，６４＋＋ ＣＺ１１Ｃ１８Ｂ２Ｃ１５６６，１２−−ＣＺｌＩＣ１
９ＡＩＢＩＡ　　　　　５Ｑ４．８４　　　　　　　　
　　−ＣＺ１１Ｃ１９ＡＩＢＩＢ　　　　　５２０．１
３　　　　　　　　　　−−６７４．８１　　　　　　
　　　　　−−ＣＺ１１Ｃ１９ＡＩＢＩＣ５０５，３５
＝ＣＺｌＩＣ９Ｃ２５Ｑ２．ＳＬ　　　　　　　　　　
　−−ＣＺ１３ＦＩＣ１−１６−５９３，０５−６３４
，５６ ＣＺ９Ａ３ＢＩＡ８　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　５２９．７２ＣＺ９Ｃ２７Ｃ２Ａ１７−４９９
．４１−５２１．６５ 第２表 実施例５で生産された植物から得られた種子の平均フリ
ー・プール・リジン含有量 ＣＺ１４１８Ａ６　　　　　　　　４６４．０９　　　
　　　　　　　　−−Ｃ１９Ｃ２２Ｃ”　　　　　　　
　　４１０．４４　　　　　　　　　　　−−ＣＺ９Ｃ
２２ＡＩＢ１１（３３１，３１−−ＣＺ９Ａ２０Ｃ１１
３４−６，５２−−ＣＺ９Ｄ１５Ｃ１−３５６２，４９
−−ＣＺ９Ｂ９ＡＩＡ１　　　　　　　４４１．０４　
　　　　　　　　　　　＋＋ＣＺ９Ｂ９ＡＩＡｓ　　　
　　　　　ｓｎ、６９　　　　　　　　　　　＋＋ＣＺ
９Ｂ９ＡＩＢ５　　　　　　　４２５．３５　　　　　
　　　　　　＋＋ＣＺ９Ｂ９ＡＩＢ３０　　　　７１１
．８１　　　　　　　　＋−ＣＺ９Ａ３Ａ４−３　　　
　　４７３．５５　　　　　　　　＋＋ＣＺ９Ａ３Ａ４
−６　　　　　６４５．１９　　　　　　　　＋−ＣＺ
９Ｃ２７Ｃ２Ａ４　　　　　　３３０．１２　　　　　
　　　　　　−−ＣＺ９ＢＢ４８Ａ　　　　　　　　　
３２９．４９　　　　　　　　　　　−−Ｃ２９ＨＨ２
Ａ　　　　　　　　　３３３．２８　　　　　　　　　
　　−−ＣＺｌＩＣＢＡ２Ｄ　　　　　　　　４４３．
２５　　　　　　　　　　　−−ＣＺ１１Ｃ８Ａ２Ｅ　
　　　　　　　４２０．１３　　　　　　　　　　　−
−ＣＺ１１Ｃ８Ａ２Ｇ　　　　　　　　４０１．５７　
　　　　　　　　　　−−ＣＺ１１Ｃ１９ＡＩＡ１Ｂ　
　　　　４８３．２１　　　　　　　　　　　−−ＣＺ
１１Ｃ１９ＡＩＢ２Ｂ　　　　　　５４１．８９　　　
　　　　　　　　−−Ｃ２１１Ｃ１９Ｂ２Ａ７　　　　
　５９７．７６　　　　　　　　　　　−−ＣＺ１１Ｃ
１９Ｂ２Ａ８　　　　　４６６．１４　　　　　　　　
　　　−−ＣＺ１１Ｃ１９Ｂ２Ａ１０　　　　　５９５
Ｊ？　　　　　　　　　　　　−−ＣＺ１１Ｃ２０Ａ１
　　　　　　　３５９．４９　　　　　　　　　　　−
−ＣＺＩＩＫ８Ｂ２Ｇ　　　　　　　３６４．８７　　
　　　　　　　　−−Ｃ２１１Ｃ１８ＢＩＣ１６２５，
７８−一〇Ｚ１１０１８Ｂ２Ｃ１４６２，９９−−ＣＺ
１１Ｃ１９ＡＩＢＩＢ　　　　　４６２．１３　　　　
　　　　　　−−ＣＺ１１Ｃ１９ＡＩＢＩＣ３７７，１
０−−ＣＺ１１Ｃ１９ＡＩＢＩＤ　　　　　４１８．１
９　　　　　　　　　　−−ＣＺ１１Ｃ９Ｃ２４２７，
５０−− ＣＺＩＩ　　　　　　　　　　　　４４４．７０　　　
　　　　　　　　−−ＣＺ１３ＦＩＣ１−１６−５４０
，２８ＣＺ９Ｄ１５Ｄ２　　　　　　　　　　　　　　
　　　３４２．７０ＣＺ９Ｃ２７Ａ１−８−４２７．１
０ ＣＺ９Ａ３ＢＩＢ９−３２７．１４ ＣＺ９Ａ３ＢＩＡ６−３９１．４６ ＣＺ９Ｃ２？Ｃ２Ａ９−３７６．４７ ＣＺ９Ｃ２７Ｃ２Ａ１７　　　　　−−　　　　　　　
　　４５０．３５ＣＺ９Ｃ２７Ｃ２Ａ１８Ａ−３５８，
１２ＣＺ９Ｃ２７Ｃ２Ａ？−３６１，２５ 出発系統のリジン含有量を第３表に示す。

１１表 出発系統のリジン含有量 １００７　　　　　　　５．００　　　　　　２５．１
２１２．５０ １６．３０ ２２．５９ ６９．２１ １００８　　　　　　　真９８．００　　　　　　２５
７．２８２６７．００ ２７８．００ １８２．２８ ３６１．１３ １０１０　　　　　３３１．９６　　　　　２８１．１
８１８８．７２ ２２０．３０ ３０４．７７ ２８４．６２ ３７２．１３ ３５６．５１ ３０３．９５ ４３４．８９ １８８．９０ ２７２．８５ １４７．０４ ３２０．３９ ２７１．０５ ２００．９０ ２５７．１５ ２３５．７９ ３１０．０８ ３０８．３３ ３１３．２２ １０１２　　　　　１４６．６０　　　　　１４２．２
６１００．４０ １６５．８２ ７４．７４ ２２３．７５ 前記の表は、それぞれ乾燥組織重量１グラム当たり少な
くとも５００μｇのフリー・プール・リジン含有量を有
するトウモロコシ種子および乾燥組織重量１グラム当た
り少なくとも３２５μｇの平均フリー・プール・リジン
含有量を有する種子を生産するトウモロコシ植物の生産
性を示す。

クロウの９９２系統（ＣＺ９Ｄ１５Ｃ１−３）およびク
ロウの１０８５系統（ＣＺ９Ａ３Ａ４−６）の種子は、
１９８６年８月５日にイン・ビトロ・インターナシジナ
ル・インコーホレイテッド（リンチカム、メリーランド
２１０９０）に寄託され、それぞれ指定番号ＩＶＩ−１
０１１４およびＩＶｌ−１０１１５が与えられた。

この発明を実施態様と結びつけて記載したが、発明をさ
らに修正することが可能であることはいうまでもない。

この出願は、一般的に本発明の原理に従う本発明のあら
ゆる変形、用途および適用を包含するものとし、本発明
と関係のある技術範囲内の既知および常用実施形態の範
囲内でこの明細書内容を発展させた方法をすべて包含す
るものである。

特許出願人　サンジエン・チクノロシーズ、コーポレイ
ション

Claims (56)

【特許請求の範囲】
1. （１）トウモロコシにおけるフリー・プール・リジン含
   有量の増加方法であって、 （ａ）無機塩類、ビタミン類、しょ糖およびホルモンを
   含むカルス誘導培地でトウモロコシ植物から得られた組
   織を培養してカルスを形成させ、（ｂ）無機塩類、ビタ
   ミン類、しょ糖、Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システイ
   ンおよびホルモンを含む選択培地で前記カルスを継代培
   養することにより、Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システ
   インに耐性を示すカルスを製造し、そして （ｃ）無機塩類、ビタミンおよびしょ糖を含む再生培地
   で前記耐性カルスを継代培養して植物を再生することに
   より、トウモロコシ種子のフリー・プール・リジン含有
   量を、乾燥種子重量１グラム当たり少なくとも約５００
   μｇに高めるか、またはトウモロコシ植物により生産さ
   れた種子の平均フリー・プール・リジン含有量を乾燥種
   子重量１グラム当たり少なくとも約３２５μｇに高める
   ことを含む方法。
2. （２）さらに （ａ’）選択培地で継代培養する前に無機塩類、ビタミ
   ン類、しょ糖およびホルモンを含む維持培地で前記カル
   スを継代培養することによりカルスを維持する 段階を含む、特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）組織を未分化胚から入手する、特許請求の範囲第
   １項記載の方法。
4. （４）組織を未分化胚から入手する、特許請求の範囲第
   ２項記載の方法。
5. （５）選択培地における３−８継代培養段階を含む、特
   許請求の範囲第１項記載の方法。
6. （６）維持培地における２−６継代培養段階を含む、特
   許請求の範囲第２項記載の方法。
7. （７）選択培地における３−８継代培養段階を含む、特
   許請求の範囲第６項記載の方法。
8. （８）継代培養中、選択培地におけるＳ−２−アミノエ
   チル−Ｌ−システイン濃度を約０．１ミリモルから約３
   ．０ミリモルへ徐々に高める、特許請求の範囲第５項記
   載の方法。
9. （９）濃度を約０．５ミリモルから約３．０ミリモルに
   高める、特許請求の範囲第８項記載の方法。
10. （１０）濃度を約１．０ミリモルから約３．０ミリモル
    に高める、特許請求の範囲第８項記載の方法。
11. （１１）継代培養中、選択培地におけるＳ−２−アミノ
    エチル−Ｌ−システイン濃度を約０．１ミリモルから約
    ３．０ミリモルへ徐々に高める、特許請求の範囲第７項
    記載の方法。
12. （１２）濃度を約０．５ミリモルから約３．０ミリモル
    に高める、特許請求の範囲第１１項記載の方法。
13. （１３）濃度を約１．０ミリモルから約３．０ミリモル
    に高める、特許請求の範囲第１１項記載の方法。
14. （１４）選択培地のＳ−２−アミノエチル−Ｌ−システ
    イン濃度を、１−３継代培養段階については約０．２５
    −０．５０ミリモル、１−２継代培養段階については約
    ２．０−３．０ミリモル、および最終継代培養段階につ
    いては約０．５ミリモルから約１．０−１．５ミリモル
    へ段階的に高める、特許請求の範囲第５項記載の方法。
15. （１５）選択培地のＳ−２−アミノエチル−Ｌ−システ
    イン濃度を、１−３継代培養段階については約０．２５
    −０．５０ミリモル、１−２継代培養段階については約
    ２．０−３．０ミリモル、および最終継代培養段階につ
    いては約０．５ミリモルから約１．０−１．５ミリモル
    へ段階的に高める、特許請求の範囲第７項記載の方法。
16. （１６）Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン濃度を
    徐々に増加させた後、１継代培養段階において０ミリモ
    ルに落とし、次いで１継代培養段階において約１．３−
    ２．５ミリモルに高める、特許請求の範囲第８項記載の
    方法。
17. （１７）Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン濃度を
    徐々に増加させた後、１継代培養段階において０ミリモ
    ルに落とし、次いで１継代培養段階において約１．５−
    ２．５ミリモルに高める、特許請求の範囲第１１項記載
    の方法。
18. （１８）再生培地における２−４継代培養段階を含む、
    特許請求の範囲第１項記載の方法。
19. （１９）再生培地における２−４継代培養段階を含む、
    特許請求の範囲第２項記載の方法。
20. （２０）選択培地における３−８継代培養段階を含む、
    特許請求の範囲第１８項記載の方法。
21. （２１）維持培地における２−６継代培養段階を含む、
    特許請求の範囲第１８項記載の方法。
22. （２２）選択培地における３−８継代培養段階を含む、
    特許請求の範囲第２１項記載の方法。
23. （２３）継代培養段階中、選択培地におけるＳ−２−ア
    ミノエチル−Ｌ−システイン濃度を約０．１ミリモルか
    ら約３．０ミリモルへ徐々に高める、特許請求の範囲第
    ２０項記載の方法。
24. （２４）濃度を約０．５ミリモルから約３．０ミリモル
    に高める、特許請求の範囲第２３項記載の方法。
25. （２５）濃度を約１．０ミリモルから約３．０ミリモル
    に高める、特許請求の範囲第２３項記載の方法。
26. （２６）継代培養段階中、選択培地におけるＳ−２−ア
    ミノエチル−Ｌ−システイン濃度を約０．１ミリモルか
    ら約３．０ミリモルへ徐々に高める、特許請求の範囲第
    ２２項記載の方法。
27. （２７）濃度を約０．５ミリモルから約３．０ミリモル
    に高める、特許請求の範囲第２６項記載の方法。
28. （２８）濃度を約１．０ミリモルから約３．０ミリモル
    に高める、特許請求の範囲第２７項記載の方法。
29. （２９）選択培地のＳ−２−アミノエチル−Ｌ−システ
    イン濃度を、１−３継代培養段階については約０．２５
    −０．５０ミリモル、１−２継代培養段階については約
    ２．０−３．０ミリモル、および最終継代培養段階につ
    いては約０．５ミリモルから約１．０−１．５ミリモル
    へ徐々に高める、特許請求の範囲第２０項記載の方法。
30. （３０）選択培地のＳ−２−アミノエチル−Ｌ−システ
    イン濃度を、１−３継代培養段階については約０．２５
    −０．５０ミリモル、１−２継代培養段階については約
    ２．０−３．０ミリモル、および最終継代培養段階につ
    いては約０．５ミリモルから約１．０−１．５ミリモル
    へ徐々に高める、特許請求の範囲第２２項記載の方法。
31. （３１）Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン濃度を
    徐々に増加させた後、１継代培養段階において０ミリモ
    ルに落とし、次いで１継代培養段階において約１．５−
    ２．５ミリモルに高める、特許請求の範囲第２３項記載
    の方法。
32. （３２）Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン濃度を
    徐々に増加させた後、１継代培養段階において０ミリモ
    ルに落とし、次いで１継代培養段階において約１．５−
    ２．５ミリモルに高める、特許請求の範囲第２６項記載
    の方法。
33. （３３）さらに再生培地がＳ−２−アミノエチル−Ｌ−
    システインを含む、特許請求の範囲第２３項記載の方法
    。
34. （３４）さらに再生培地がＳ−２−アミノエチル−Ｌ−
    システインを含む、特許請求の範囲第２６項記載の方法
    。
35. （３５）さらに再生培地がＳ−２−アミノエチル−Ｌ−
    システインを含む、特許請求の範囲第２９項記載の方法
    。
36. （３６）さらに再生培地がＳ−２−アミノエチル−Ｌ−
    システインを含む、特許請求の範囲第３０項記載の方法
    。
37. （３７）さらに再生培地がＳ−２−アミノエチル−Ｌ−
    システインを含む、特許請求の範囲第３１項記載の方法
    。
38. （３８）さらに再生培地がＳ−２−アミノエチル−Ｌ−
    システインを含む、特許請求の範囲第３２項記載の方法
    。
39. （３９）Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン濃度を
    ０．５ミリモルから０．１ミリモルへ徐々に減少させる
    、特許請求の範囲第３３項記載の方法。
40. （４０）Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン濃度を
    ０．５ミリモルから０．１ミリモルへ徐々に減少させる
    、特許請求の範囲第３４項記載の方法。
41. （４１）Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン濃度を
    ０．５ミリモルから０．１ミリモルへ徐々に減少させる
    、特許請求の範囲第３５項記載の方法。
42. （４２）Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン濃度を
    ０．５ミリモルから０．１ミリモルへ徐々に減少させる
    、特許請求の範囲第３６項記載の方法。
43. （４３）Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン濃度を
    ０．５ミリモルから０．１ミリモルへ徐々に減少させる
    、特許請求の範囲第３７項記載の方法。
44. （４４）Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン濃度を
    ０．５ミリモルから０．１ミリモルへ徐々に減少させる
    、特許請求の範囲第３８項記載の方法。
45. （４５）再生培地がさらに１種またはそれ以上のサイト
    カイニンを含む、特許請求の範囲第２３項記載の方法。
46. （４６）再生培地がさらに１種またはそれ以上のサイト
    カイニンを含む、特許請求の範囲第２６項記載の方法。
47. （４７）再生培地がさらに１種またはそれ以上のサイト
    カイニンを含む、特許請求の範囲第２９項記載の方法。
48. （４８）再生培地がさらに１種またはそれ以上のサイト
    カイニンを含む、特許請求の範囲第３０項記載の方法。
49. （４９）再生培地がさらに１種またはそれ以上のサイト
    カイニンを含む、特許請求の範囲第３１項記載の方法。
50. （５０）再生培地がさらに１種またはそれ以上のサイト
    カイニンを含む、特許請求の範囲第３２項記載の方法。
51. （５１）再生培地がさらに１種またはそれ以上のサイト
    カイニンを含む、特許請求の範囲第３３項記載の方法。
52. （５２）再生培地がさらに１種またはそれ以上のサイト
    カイニンを含む、特許請求の範囲第３４項記載の方法。
53. （５３）再生培地がさらに１種またはそれ以上のサイト
    カイニンを含む、特許請求の範囲第３５項記載の方法。
54. （５４）再生培地がさらに１種またはそれ以上のサイト
    カイニンを含む、特許請求の範囲第３６項記載の方法。
55. （５５）再生培地がさらに１種またはそれ以上のサイト
    カイニンを含む、特許請求の範囲第３７項記載の方法。
56. （５６）再生培地がさらに１種またはそれ以上のサイト
    カイニンを含む、特許請求の範囲第３８項記載の方法。