JPS6147121A - 大豆再生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ（Ｌ、）Ｍｅｒ
ｒｉｌｌ　）再生の一般的方法および該方法により生産
された植物に関する。さらに詳しくは、本発明は多くの
大豆品種についての大豆苗木再生用の組織および細胞培
養の使用に関する。本発明はまたこの方法に用いられる
培地に関する。

先行技術の説明 培養細胞からの植物再生は、体細胞ハイブリッド形成の
適用、体細胞クローン変異による新品種の生産および新
品種生産における遺伝子工学の使用のために必須である
。植物は多数の穀物種の単一細胞から再生できるが、大
豆についての努力は一般的に成功していない。

近年、植物細胞培養の成功が植物の成長および発育の調
節における細胞および生物の各役割に重々 植物細胞がｉｎ　ｖｉｔｒｏ　で培養し易いということ
が証明され、完全な植物が体細胞胚形成を通じて直接的
に、または器官形成を通じて間接的に体細胞由来の培養
から再生できた時に支持された。一般に、再生経路の選
択は外的因子、特に成長調節因子の操作により経験的に
決められる。ある植物種の初期の研究は、外因性オーキ
シン濃度が体細胞胚形成を調節する主要素であり、その
減少が胚形成の開始を誘導することを示唆している。他
の種では、一定バランスのオーキシンおよびサイトカイ
ニンへの暴露が器官形成（苗条（５ｈｏｏｔ　）　、次
いで根）を誘導する。しかし、そのような操作は豆科植
物種子（大豆）においては、苗木形成を誘導しない。

アルファルファ、クローバ−および大豆の親類の野生多
年化種であるグリシン・キャネ・センス（Ｇｌｙｃｉｎ
ｅ　ｃａｎｅｓｃｅｎｓ　）を含む種々の豆科植物の外
植、カルスまたは浮遊培養からの苗条または苗木を形成
させる近年の成功にもかかわらず、大豆（Ｇｌｙｃｉｎ
ｅ　ｍａｘ　）の組織培養からの植物再生は、多くの大
豆変種に適用可能な一般的再生可能方法では達成されて
いない。グリシン・マツクス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ
）における苗条または苗木の形成は、胚軸スライス、子
葉芽の操作および不完全なまたは異常な体細胞胚形成か
らの若枝生産に限定されている。浮遊培養からの胚形成
は後期魚雷型段階まで進行する。しかし、組織学的実験
は、該胚が異常であり健全に組織された茎端分裂組織を
欠落していることを示した。そのような構造は時々ネオ
モルフ（ｎｅｏｍｏｒｐｈｓ　）と命名される。組織培
養からの苗木形成がグリシン、マックス（Ｇｌγｃｉｎ
ｅｍａｘ）で達成されたという一報告がなされている。

しかし、この報告は偶発的出来事であり一般的方法では
ないように見える。この報告を以下にさらに検討する。

７４１Ｊ　’／ブスら（Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ　ｅｔ　ａｌ
　）は、プラント・セル・ティッシュ・オルガン・カル
チャ（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｏｒｇａ
ｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　）　Ｌ　、　１２３（１９８１）
　　で細胞懸濁液中または寒天上での大豆の体細胞胚形
成を記載している。彼らは、Ｌ２培地でのカルス開始に
胚軸または上胚軸組織を利用した。細胞懸濁培養はＳＬ
２培地中のカルス組織から開始された。該細胞懸濁培養
は、球状および心臓型胚または苗条芽を形成できる付加
カルスを生産するために使用することができた。体細胞
胚または苗条芽の形成は、ｌ　ＯＯＰＰｍのカゼイン加
水分解物、２．２５μＭの２．４−ジクロロフェノキシ
酢酸（２，４−Ｄ）、０．１μＭのアブシジン酸（ＡＢ
Ａ）、０．１μＭの２−イソプロピル−４−ジメチルア
ミノ−５−メチルフェニル−１−ピペリジンカルボキシ
メチルクロリド（ＡＭ０１６）８）および１５μＭのア
デニンまたは０．４６μＭのカイネチンのどちらか一方
を補足した基礎ＳＬ２またはＬ２培地を使用することで
再生可能であった。体細胞胚または苗条芽は形成された
が、どの品種のグリシン・マツクス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　
ｍａｘ　）についても植物は得られなかった。

ワイルドホルムら（Ｗｉｌｄｈｏｌｍ　ｅｔ　ａｌ　）
は、プラント・セ／Ｌ／　・Ｌ／ポー）　（Ｐｌａｎｔ
　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　）２．１９（１９８３）
で胚軸または子葉から得られたグリシン・キャンセフ　
ス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｃａｎｅｓｃｅｎｓ　）カルスか
らの苗条形成を記載している。板形成は起こらなかった
ので、苗木は得られなかった。該方法はグリシン・マツ
クス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ　）　（大豆）が組織源
である場合には苗条を生じなかった。

グリシン・キー？　７　セフ　ス（Ｇｌｙｃｒｎｅ　ｃ
ａｎｅｓｃｅｎｓ　）組織培葉からの苗条形成は、０．
５ｍｇ／ｌのα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）含有Ｂ５基
礎培地、ついで、一連の０．５　ｍｙ／ｌのインドール
酢酸（ＩＡＡ）および５ｎｑ／ｉのベンジルアデニン（
ＢＡ）含有ＭＳ基礎培地、そして最後に０．５〜／ＩＢ
Ａ含有ＭＳ基礎培地を用いるカルス誘導によって達成さ
れた。

ガムボルグら（Ｇａｍｂｏｒｇ　Ｃｔ　ａｌ　）は、プ
ラント・セル・レボ−）　（Ｉ’１ａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　
Ｒｅｐｏｒｔｓ　）　２．２０ｍｇ（１９８３ａ）でグ
リシ７−７　ックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）の３品
種（試験された７品種から）を含むいくつかのグリシン
（Ｇｌｙｃｉｎｅ　）種の細胞浮遊培養からの体細胞胚
形成を開示している。使用した胚誘導培地はＳＬの主要
塩、Ｂ５の微量栄養分およびビタミン、１０　ｍｙ／ｌ
のカザミノ酸、１５μＭのアデニン硫酸塩、０．２μＭ
のピクロラムおよび０．（１２）５〜ｏ、２５μＭのＡ
Ｍ０１６）８からなっていた。

ピクロラムは胚誘導に必要であり、０．５〜２．０μＭ
の２．４−Ｄで置き換えられうることが見出された。オ
ーキシンピクロラムまたは２．４−Ｄの代わりにオーキ
シン、ＮＡＡ、ＩＡＡまたはインドール−３−ブタン酸
（ＩＢＡ）を使用した場合、胚は誘導されなかった。胚
が誘導された後、それらをサイトカイニン（ゼアチンま
たはＢＡ）、オーキシン（ピクロラム）およびジベレリ
ン酸（ＧＡ３）の種々の組合せを含むＳＬ培地から成る
胚成長培地に移した。形成された胚は心臓型構造になる
が、該誘導培地ではこの段階をこえて発育することはで
きなかった。成長培地への移動は根の形成を生じたが、
苗条は形成されなかった。ＭＳ培地の使用またはアブシ
ジン酸、ココナツツミルクの添加またはオスモル濃度の
変化はそれ以上の発育を生じなかった。

ガムボルグら（Ｇａｍｂｏｒｇ　ｅｔ　ａｌ　）　ハブ
ラント・セ／Ｌｚ・ｔ／デポ−（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ
　Ｒｅｐｏｒｔｓ　）　２　、２１３（１９８３ｂ）で
グリシン・タバシナ（Ｇｌｙｃｉｎｅｔａｂａｃｉｎａ
　）およびグリシン・ソジャ（Ｇｌｙｃｉｎｅｓｏｊａ
　）の細胞培養と、大豆グリシン・マツクス（Ｃｒｌｙ
ｃｉｎｅ　ｍａｘ　）品種（ＣＶ、）ウィリアムス（Ｗ
ｉｌｌｉａｍｓ　）　８２の葉組織からの原形質体の調
製を記載している。該原形質体はガムボルグ（Ｇａｍｂ
ｏｒｇ）らの方法（１９８３ａ）により心臓型胚の形成
を誘導しうる細胞を形成した。後者の文献におけるよう
に、該方法からは苗木は形成されなかった。

クリスチャンソンら（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ　ｅｔ
　ａｌ　）はサイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　２２２
　、６３２　（１９８３）テ大豆グリシン・マツクス（
エル）メリルＣＶ、ミツチｘ　ル（Ｃｙｌｙｃｉｎｅ　
ｍａｘ（Ｌ、）Ｍｅｒｒｉｌｌ　ｃｖ、　Ｍｉｔｃｈｅ
ｌｌ）の細胞浮遊培養からの苗木の再生を開示している
。

これは偶発的出来事の結果であり、クローン組織の一部
から生じたと見うけられる。未成熟胚を無菌的に２．５
〜３．０側のさやから取り出し、胚軸を１〜２顛の断片
に切断した。カルス形成を誘導するために、これらの断
片を固体培地に置いた。この培地はＭＳ塩、０．５＋＋
ｗ／ｚのニコチン酸、０．５４／／のピリドキシン、１
００ｍｇ／ｌのチアミン、１００ｍｇ／ｌのイノシトー
ル、２％のシュークロースおよび５ｓ／ｌの２．４−Ｄ
からなっていた。固くて、もろくない組織を新培地へ移
すために選び、゛固く１、　　緑色で光沢があり異常な
胚を生じる組織系とした。

カルス組織を誘導培地からＮ−修正培地゛に移し、次い
で、誘導培地へもどした場合、小さな胚で覆われた１つ
の例外的組織片を得た。Ｎ−修正培地は、ＭＳ塩の２つ
の窒素塩が２０ｍＭのクエン酸アンモニウムで置き換え
られた誘導培地からなっていた。０、Ｏ０５＊／／のＩ
ＢＡおよび０．２ＩｎＩ／ｚのＢＡを含む培地への該胚
の移動は苗条の形成を生じた。０．１ｍｇ／ｌのＩＡＡ
を含む基礎培地への該苗条の移動は苗木を生産するため
の板形成を生じた。

この方法は大豆品種再生に一般的に適用できるとは思え
ない。それよりも、再現できない゛かもしれない偶発的
でき事であったと思われる。この分析を支持するものは
、該胚形成組織源にある。クリスチャンソン（Ｃｈｒｉ
ｓｔｉａｎｓｏｎ　）らは、胚を有する「１つの例外的
組織断片」が得られたと述べている。多数から開始して
１つだけ得られたのだから、これは偶発的でき事であり
自然のクローナンであったにちがいないことを意味して
いる。

先行文献は、一般的で再生可能である組織および細胞培
養からの大豆グリシン・マツクス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍ
ａｘ）の再生の方法を記載していない。

先行文献は、単一カルスによる単一の出来事による代わ
りに多数の誘導されたカルスによる再生胚の形成を生じ
る方法を記載していない。本発明は、゛　大豆グリシン
・マツクス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ　）の品種再生に
広く一般的に適用できる方法の最初の例である。

大豆植物および種子はこの方法で生産される。

この方法から生じた大豆植物は、体細胞クローン変異の
結果、出発植物材料と異りうる。該経路は、さらに変異
を与えるための種々の選択方法の適用を可能にする点で
も有用である。生産される植物は通常の育成計画に使用
されうる。

発明の要約 本発明の方法は、誘導培地上で大豆植物の組織からカル
スおよび胚形成を誘導する段階、胚成熱培地上で胚を成
熟させる段階、苗条形成培地上で苗条を形成する段階お
よび根形成培地上で根を形成する段階から成る。

さらに詳しくは、本発明は、 （ａ）カルス形成および胚形成を確実にするのに十分な
量の無機塩、ビタミン、シュークロースおよびホルモン
から成る第１培地上で大豆植物から得られた組織を培養
し、 （ｂ）胚成熱を確実にするために十分な量の無機塩、ビ
タミン、シュークロースおよびホルモンかう成る第２培
地上で胚を継代培養し、 （Ｃ）苗条形成を確実にするために十分な量の無機塩、
ビタミン、シュークロースおよびホルモンからなる第３
培地上で成熟胚を継代培養し、（ｄｌｌ影形成確実にす
るために十分な量の無機塩、ビタミンおよびシュークロ
ースから成る第４培地上で苗条を継代培養する 段階から成ることを特徴とする。

組織源は好ましくはグリシン・マツクス（エル。

）メリ／Ｌ／　（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ（Ｌ、）Ｍｅ
ｒｒｉｌｌ　）の品種からの未熟胚である。適当な品種
にはフオレスト、コーソイ７９、ミツチェル４５０、エ
バンス、グノムおよびノースラップキング（Ｆｏｒｒｅ
ｓむ、　ｃｏｒｓｏｙ７９　、　Ｍｉｔｃｈｅｌｌ　４
５０　、　Ｅｖａｎｓ　、　Ｇｎｏｍｅ、　ａｎｄ　Ｎ
ｏｒｔｈ−ｒｕｐ　Ｋｉｎｇ　）品種５−１８−８４−
８０３２−２３　が包含される。各基礎培地は、好まし
くは、ＭＳ無機塩、ニツチエ（Ｎｉｔｓｃｈ）のビタミ
ン、ミオイノシトールおよびシュークロースを含む。本
方法に使用される各培地は５．５〜６．０のｐＨを有す
る。

発明の詳細 な説明は細胞または組織培養の使用Ｉこよる大豆（グリ
シ７−　？　ッ／ｙ　ス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ　）
　）の再生方法に関する。この方法では、土壌に埋め成
長して成熟させることのできる再生大豆苗木が得られる
。本発明はまた、この方法で得られる大豆植物およびこ
の植物から得られる種子にも関する。

一般に、該方法は（ａ）培地上で大豆植物組織を培養し
てカルスおよび胚を生産し、（ｂ）培地上で該胚を培養
し、胚を成熟させ、（０該成熟胚を培地上で培養して苗
条を生成させ、（ｄ）該苗条を培地上で培養して根を生
じさせ、これにより植物または苗木を形成させることか
らなる。各培地は無機塩、ビタミンおよびシュークロー
スを含有する。さらに、各培地は、例えば胚形成、苗条
形成などの所望の結果を達成するために異る構成のホル
モンを含有する。

カルスおよび胚形成の開始に使用するのに好ましい植物
組織は未成熟胚である。該未成熟胚は大豆植物から定期
的に収穫されるさやから分離される。さやは通常、長さ
が１．５〜２．５鋼の大きさに達した時収穫される。さ
やの表面を滅菌する。胚を無菌的に取り出し、以下、第
１培地と呼ぶカルス誘導および胚形成培地で平板培養す
る。胚は長さ０．５〜３ｆｉである。長さが１〜２ｆｉ
である胚を使用するのが好ましい。もし胚が１餌より小
さいと第１培地で平板培養する前に成熟させねばならな
い。

第１培地は無機塩、ビタミンおよびシュークロースから
成る。該無機塩は多量要素および微量要素から成る。第
１培地に使用する多量要素は次の化合物、すなわち、硫
酸マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸二水素カリウ
ム、硝酸カリウムおよび硝酸アンモニウムであってよい
。第１培地に含まれる微量要素はホウ酸、硫酸マンガン
、硫酸亜鉛、モリブデン酸■す）　ＩＪウム、硫酸銅（
ＩＤ、塩化コバルト、ヨウ化カリウム、硫酸鉄（ＩＩ）
およびＥＤＴＡニナ）　ＩＪウム塩である。この無機塩
の配合はＭＳ無機塩として当業界で知られている。第１
培地において、ＭＳ塩は標準ＭＳ無機塩より多くノ鉄お
よびＥＤＴＡが含まれるように修飾されている。

第１培地１１を調製するために使用される多量要素およ
び微量要素の好ましい量は次のとおりである。硫酸マグ
ネシウム％加物３７０−ｙ、塩化カルシウム２水加物４
４０　ｑ％　リン酸二水素カリウム１７０哩、硝酸カリ
ウム１９．００　哩、硝酸アンモニウム１６５０Ｉ＋＋
２、ホウ酸６．２哩、硫酸マンガン１水加物１６．９〜
、硫酸亜鉛７水加物８．６■、モリブデン酸■ナトリウ
ム２水加物０．２５ｍｇ、硫酸銅（■）５水加物０．（
１２）５ｓｖ、塩化コバルト６水加物０．（１２）５−
ｙ、ヨウ化カリウム０．８３ｑ、硫酸鉄（Ｉｔ）７水加
物４１．７−＋ｙおよびＥＤＴＡニナトリウム塩５５．
９ｍｙ。

第１培地はまたビタミンを含有する。使用するビタミン
にはミオイノシトール、ニコチン酸、クリシン、ピリド
キシン、チアミン、葉酸およびビオチンが包含される。

ミオイノシトールを除くこれらのビタミンはニツチエの
ビタミンとして当業界で知られている。このニツチエの
ビタミンはチアミンを多く含むように修飾されている。

第１培地１１を調製するために使用されるビタミンの量
は次のとおりである。ミオイノシトール１００ｓ＋ｒ、
ニコチン酸５ｓｙ、グリシン２岬、ピリドキシン塩酸塩
０．５ｓ＋ｙ、チアミン塩酸塩０．９ｑ。

葉酸０．５ｍｇおよびビオチン０．０５＋＋ｖ０第１培
地はシュークロース２〜３％、好ましくは２％および寒
天またはケルコ・コマーシャル・デベｏ　’７プメント
（Ｋｅｌｃｏ　Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ）のゲルライ）　（Ｇｅ１ｒｉｔｅ、商標）の
ようなゲル化剤を含む。ゲルライトを０．２％の濃度で
使用するのが好ましい。該培地は５．５〜６．０のｐＨ
１好ましくは５．８のｐＨを有する。

前記成分に加えて、第１培地はまたホルモンも含む。カ
ルス誘導および胚形成に有用であるホルモンは２．４−
ＤまたはＩＡＡおよび２．４−Ｄの混合物から成る群か
ら選択できるということが判明しへ存在させるホルモン
の量はカルスおよび胚形に 成を確実するために十分な量である。一般に、０．５△ 〜１０ＩＩｖ／ｌの２．４−Ｄまたは１〜３ＩＩＩｆ／
ｌのＩＡＡと３〜ｌ　Ｏｍｙ／　／の２．４−Ｄの組合
わせが十分である。好ましくは、３〜１０〜／ｌの２．
４−Ｄ、１〜３ｍｇ／ｌのＩＡＡと３ｒｎｙ／ｌの２．
４−Ｄの組合せ、または３ｍｙ／ｌのＩＡＡと３ｍｇ／
ｌ、５ｍｇ／ｌまたは１０〜／ｌ　ノ２．４−Ｄの組合
わせを第１培地にホルモンとして使用する。ＡＢＡをＩ
ＡＡおよび２．４−Ｄの混合物へ加えることも可能であ
る。これには、前記ＩＡＡおよび２．４−Ｄ（７）組合
せとともに０．１〜１．０μＭ、好ましくは１．０μＭ
のＡＢＡを使用するのが好ましい。該培地はミクロポー
ラス膜沖過で滅菌されたＩＡＡ以外の全成分をオートク
レーブ処理することにより滅菌される。

未成鶏胚を第１培地で平板接種し、７〜７０日開明新開
明所する。この間に胚は脱分化、カルス形成および胚形
成を受ける。カルスおよび胚は、通常カルスの状態およ
び胚の成熟に従って移し変える。カルスの状態および胚
の成熟は組織の色および形により判断する。正常な胚成
長の通常の段階を経た明緑色の胚を得るのが望ましい。

もし胚が衰えているように見えたら移し変える。例えば
、もし淡緑色か白色になるかまたは正常に発育していな
いと見えたら胚を移し変える。胚を有するカルスは、成
長が遅くなったら新しい第１培地に移し変えることがで
きる。

もし、未成鶏胚が長さ１ｆｉ以下ならば、第１培地上で
平板培養する前に胚を成熟させ石のが好ましい。この成
熟は胚成長培地上で該胚を成長させることにより達成さ
れる。該胚成長培地は無機塩、ビタミン、アミノ酸およ
びシュークロースから成る。該無機塩は第１培地につい
て記載したのと同じである。該ビタミンは、胚成長培地
に４０００Ｃｌのミオイノシトールが使用される以外は
第１培地について記載したのと同じである。

胚成長培地はまたアミノ酸を含む。該アミノ酸はアラニ
ン、グルタミン、セリン、トリプトファン、プロリンお
よびアルギニンである。特に断らない限り、アミノ酸は
全てＬ−型である。１１の培地を調製するために使用さ
れるアミノ酸の好ましい量は、アラニン１０００　哩、
グルタミン８００ｍｇ、セリン１６０ｑ、トリプトファ
ン５０哩、プロリン５７５Ｔｎｇおよびアルギニン８７
０−ｖである。

これらのアミノ酸の量の半分を使用することも可能であ
る。

胚成長培地は１０〜１２％のシュークロースおよび寒天
またはゲルライトのようなゲル化剤を含む。ゲルライト
を０．２％の濃度で使用するのが望ましい。該培地は５
．５〜６．０のＰＨ１好ましくは５．８のｐＨを有する
。

胚成長培地はさらにホルモンを含む。胚成長に有用なホ
ルモンはＩＡＡ、アデニン硫酸塩およびＡＢＡの混合物
、またはＩＡＡ、ｔ−ゼアチンおよびＡＢＡの混合物で
あるということが判明した。

０．１〜０．５　！ｎ９／ｌのＩＡＡ、０．１〜１．０
４／／のアデニン硫酸塩および０．１〜５．０μＭのＡ
ＢＡまたは０．１〜０．５１１ｙ／　ｉのＩＡＡ、０．
１〜０．５ｍｇ／ｌのし一ゼアチンおよび０．１〜５．
０μＭのＡＢＡが使用できる。

胚成長培地中のホルモンとしてＯ，ｌ＋＋＋ｙ／ｚのＩ
ＡＡ。

１ｍｇ／ｊのアデニン硫酸塩および５μＭのＡＢＡまた
は０．１ｍｇ／ｊのＩＡＡ、０．２ｍｇ／ｌの【−ゼア
チンおよび５μＭのＡＢＡのどちらかを使用することが
好ましい。もしホルモンがＩＡＡ、アデニン硫酸塩およ
びＡＢＡであるならば１２％のシュークロースおよび全
量のアミノ酸の混合物を使用するのが好ましい。その他
のホルモンの配合としては、１０％のシュークロースお
よび全量または半量のアミノ酸混合物を使用するのが好
ましい。

該培地は膜濾過で滅菌されたＩＡＡおよび【−ゼアチン
以外の全成分をオートクレーブ処理により滅菌する。胚
が１〜２ｆｉの大きさに達するまで明所においてこの培
地上で成長させ、その時点で第１培地上に平板接種する
。

第１培地上で胚を培養した後、胚は以下で第２培地と呼
ぶ成熟培地上に移し変えられ、継代培養することにより
成熟させることができる。胚を存するカルスを明所にお
いて第２培地上で２０〜７５日、好ましくは、約３０日
開維代培養する。完全な成熟を得るため、この期間に新
しい培地へ該成熟胚を移し変えることが必要な場合もあ
る。

胚を成熟させるために使用できる第２培地は、以下で第
２培地Ａ、Ｅと呼ぶ５つの異なる培地から成る群から選
択することができる。各第２培地は２〜３％、好ましく
は、２％のシュークロースおよびゲル化剤、好ましくは
０．２％ゲルライトを含む。ｐＨは５．５〜６．０、好
ましくは５．８である。

各培地は膜沖過で滅菌されたＩＡＡおよびｔ−ゼアチン
以外をオートクレーブ処理により滅菌する。

第２培地Ａは、前調整した第１培地から成る。

第１培地は胚を有する成長カルスにより前調整する。こ
の培地を使用する時、該カルスはもとの位置から１〜２
備（好ましくは１　ａｍ　）離れた位置へ移し変える。

第２培地Ｂは無機塩、ビタミンおよびホルモンから成る
。該無機塩およびビタミンは第１培地で使用したものと
同じである。使用できるホルモンは次の群から選択され
る。（１）３〜５〜／１．好ましくは、５ｍｉ／ｌの２
．４−Ｄ、［２１１〜３　ｍｅ／　ｌ、好ましくは、２
ｍｇ／ｌのＩＡＡおよび３〜５ｍｇ／ｌ、好ましくは、
３ＷＮＩ／ｌの２．４−Ｄ、＋３１１．０〜２．０ｔｍ
ｇ／ｌ、好ましくは、１〜／ｌのＩＡＡおよび０．５〜
１．０〜／ｌ、好ましくは、１ｍｇ／／の【−ゼアチン
、Ｆ４１１．０〜２．０〜／ｌ、好ましくは１ｍｇ／ｌ
のＩＡＡおよび１５〜３０μＭ、［しくは、３０μＭの
アデニン硫酸塩、（５）３〜５　ｍｙ／　ｌ　、好まし
くは３ｍｇ／ｌの２．４−Ｄ、　１〜３ｍｇ／１１好ま
しくは２ｍｇ／ｌのＩＡＡおよび０．１〜１．０μＭ、
好ましくは１．０μＭのＡＢＡ０第２培地Ｃは無機塩、
ビタミン、カゼイン加水分解物およびホルモンから成る
。無機塩およびビタミンは第１培地で使用したものと同
じである。

カゼイン加水分解物は、商業的に利用でき当業界で公知
のカゼイン酵素加水分解物である。それは１００〜１０
００ｍｇ／１．好ましくは１００ＴＮＩ／７の量で存在
させる。この培地に使用するホルモンは１．０〜２．０
ｍｇ／ｌのＩＡＡ、Ｑ、５〜１．０ｍｇ／ｌのむ一ゼア
チン、４０または２５０ｎＭのピクロラムおよび０．１
〜５．０μＭのＡＢＡの混合物である。１ｍｇ／ｌのＩ
ＡＡ、１呵／ｌの【−ゼアチン、４０または２５０ｎＭ
のピクロラムおよび０．１μＭのＡＢＡを使用するのが
好ましい。

第２培地りは無機塩、ビタミンおよびホルモンから成る
。ビタミンはニツチエのビタミンが修飾されていない以
外第１培地で使用したものと同じである。すなわち、Ｑ
、　５　岬／　ｌのチアミン塩酸塩だけを使用している
。無機塩は、硝酸カリウムおよび硝酸アンモニウムの代
わりにクエン酸アンモニウムが使用されている以外は第
１培地におけると同じものである。クエン酸アンモニウ
ムは、好ましくは、２０ｍＭの量で使用される。ホルモ
ンは１．０〜２．０ｍｇ／ｌ、好ましくは、１呵／ｌの
ＩＡＡおよび１５〜３０μＭ、好ましくは１５μＭのア
デニン硫酸塩である。

第２培地Ｅは無機塩、ビタミン、カゼイン加水分解物お
よびホルモンから成る。無機塩およびビタミンは第２培
地りで使用したものと同じである。

カゼイン加水分解物は第２培地Ｃで使用したものと同じ
である。この培地で使用するホルモンは、１、０〜２．
０　ｍｙ／　ｔのＩ　ＡＡ　、　０．５〜１．０　ｍｙ
／ｌのｔ−ゼアチン、４０〜２５０　ｎＭのピクロラム
およびＯ３１〜５．０μＭのＡＢＡを含む。１ツ／ｌの
ＩＡＡ、１〜／ｌの【−ゼアチン、４０ｎＭのピクロラ
ムおよび０．１μＭのＡＢＡを使用するのが好ましい。

緩慢な成熟のために成熟しつつある胚を新しい培地に移
し変えることが必要な場合、最初の成熟に使用されなか
った培地の１つを使用するのが好ましい。例えば、第２
培地Ａを最初に使用した場合、次いで必要に応じて第２
培地Ｂ、Ｈのどれかを使用するのが好ましい。通常、胚
は明所において２０〜７５日間、好ましくは約３０日間
用いる各第２培地上で継代培養する。

第２培地上で成長後、成熟胚は次いで以下に第３培地と
呼ぶ苗条形成培地に移し変える。第３培地は第１培地と
同じ無機塩およびビタミンを含む。

さらに、この培地は苗条形成を確実にするホルモンを含
む。ＩＢＡおよびＢＡの混合物またはＩＡＡおよびアデ
ニン硫酸塩の混合物が苗条形成に有用であることが判明
した。一般に、０．００１〜０．０５ｍｙ／　／のＩＢ
Ａおよび０．１〜０．５　ｍｙ／　ｔのＢＡまたは１．
０〜３．０〜／ｌのＩＡＡおよび１５〜６０μＭのアデ
ニン硫酸塩が使用される。０．　Ｏ０５ｍｙ／ｌのＩ　
ＢＡ。

および０．２ｍｇ／ｌのＢＡまたは３巧／ｌのＩＡＡお
よび３０μＭまたは６０μＭのどちらか一方のアデニン
硫酸塩を使用するのが好ましい。ＩＢＡおよびＢＡ混合
物へのジベレリン酸の添加は、遅成長胚の苗条伸長およ
び成熟を促進することも判明した。

この例では、０．１μＭのジベレリン酸を使用するのが
好ましい。さらに、０．０５ｍｇ／ｌのＩＡＡ、０．０
５ｍｇ／ｌのＢＡおよび０．１μＭのＧＡ３の混合物が
この成熟のために使用できることが判明した。

第３培地は、第１培地と同量のシュークロース、すなわ
ち、２〜３％、好ましくは、２％のシュークロースおよ
びゲル化剤を含むのが好ましい。また、この培地も膜濾
過で滅菌されたＩＡＡおよびＧＡ３以外オートクレーブ
処理により滅菌される。

苗条が形成したら、以下に第４培地と呼ぶ根形成培地に
移し変える。この移し変えは普通、胚を第３培地上で２
０〜８０日間、好ましくは約３０日開維代培養した後に
なされる。この期間に該物質を新しい培地に移し変える
ことが必要な場合もある。もし移動が行なわれるならば
、これ、らは３０〜４５日後、好ましくは３０日後に行
なうことができる。移動は通常、もし苗条が適正に伸長
しなかった時に行なわれる。すなわち、苗条が２組の葉
を有しない場合、第４培地に移植する前に新たな第３培
地または２分の１の濃度の無機塩、還元チアミンおよび
ミオイノシトールを含み他の成分は同じである修飾第３
培地に移し変える。ジベレリン酸を用いる場合、修飾第
３培地を使用するのが好ましい。さらに、ＧＡ３を成熟
のために使用することが好ましい。

根形成培地はホルモンを含んでいてもよいし含まなくて
もよい。該培地は第１培地と同じ無機塩およびビタミン
を含む。ホルモンを存在させる時、０．１〜１．０　＃
／　ｌのＩＢＡまたは０．１〜１．０　ｍｙ／　ｌのＩ
’ＡＡを用いる。第４培地へ移し変える前に修飾第３培
地を用いる場合、２分の１の濃度の無機塩、還元チアミ
ンおよびミオイノシトールを含み他の成分は同じである
修飾第４培地を使用するのが好ましい。第４培地はまた
、寒天またはゲルライトのようなゲル化剤を含む。ゲル
ライトを０．２５％の濃度で使用するのが好ましい。１
％〜３％、好ましくは２％のシュークロースが使用され
る。この培地は５．５〜６，０のｐＨ１好ましくは５．
８のｐＨを有する。該培地は、ＩＡＡが使用される場合
を除いてオートクレーブ処理により滅菌する。ＩＡＡは
前記と同様にして滅菌する。

根が形成した後、苗木は何時でも土壌に移植される。こ
れは、一般に、苗条を明所において第４培地で２０〜６
０日間、好ましくは約３０日開維代培養した後に行なわ
れる。この期間に該材料を新しい培地へ移し変えること
が必要な場合もある。

移し変えは新しい第４培地または全成分がもとの第４培
地での２分の１の濃度で存在する修飾第４培地に対して
行なうことができる。苗木は、十分湿った高湿度室に入
れた土壌へ移すことにより移植する。苗木が定着したら
高湿度室から取り出し土壌に移植し、成長させて成熟さ
せ、種子を生産させる。

この方法は大豆の多くの品種の組織から苗木を再生する
のに有効である。該方法はグリシン・マツクス（エル）
メリル・ジーブイ・フオレスト、コーソイ７９、ミツチ
ェル４５０、エバンス、クノムおよびノースラップキン
グ品種Ｓ−１８−８４−８０３２（１２）３から苗木を
再生するのに有効である。

晩生植物、すなわち、正常な発育経路に沿ってゆっくり
と発達する胚に対してはより多くの移し変えを必要とす
ることが判明した。

実施例 つぎＬに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する
が、これらに限定されるものではない。

これらの実施−例において、特に断らない限り、明所で
の培養は１日当たり１６時間の光周期を有する。光中、
２５〜２９℃での培養をいう。特に断らない限り、８時
間の晴朗の間の温度は２３〜２４℃である。

実施例１ 溶液の調製 次の貯蔵液または溶液を以下にさらに詳記する培地作成
時に使用するために調製した。

１．無機塩 Ａ、鉄およびＥＤＴＡ修飾ＭＳ この溶液は、使用直前に８００１１Ｉｌの蒸留脱イオン
水にシュークロースヲ含まない１パツクのムラシゲ（Ｍ
ｕｒａｓｈｉｇｅ　）最小有機物培地（ギブコ・ラボラ
トリーズ・カタログ（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓｃａｔａｌｏｇ）ｋ５１０−３１１８）を溶解す
ることにより調製した。少量の蒸留脱イオン水を使用し
てそのパックを洗い出した。さらに、５−の鉄およびＥ
ＤＴＡ貯蔵液を加えた。この包装された培地は１００ｍ
ｇのミオイノシトールおよび０．４岬のチアミン塩酸塩
を含有していた。

Ｂ、鉄およびＥＤＴＡ修飾半量ＭＳ この溶液は使用直前に前記の方法でシュークロースを含
まない半パックのムラシゲ最小有機物培地を溶解するこ
とにより調製した。１０．ｆの鉄およびＥＤＴＡ貯蔵液
を使用した。包装された培地は１００ｍｇのミオイノシ
トールおよび０．４ｑのチアミン塩酸塩を含有しており
、最終毒はミオイノシトール５０ｍｇおよびチアミン塩
酸塩０．２ｍｇであった。

Ｃ，クエン酸アンモニウム、鉄およびＥ　ＤＴＡ修飾Ｍ
Ｓ この溶液は使用直前に２０−のミオイノシトール貯蔵液
、ｌｏｍのＭＳ微量塩貯蔵液、１５−の鉄およびＥＤＴ
Ａ貯蔵液および１００．Ｒ１の塩化カルシウム貯蔵液を
クエン酸アンモニウム修飾ＭＳ多量塩貯蔵液に加えるこ
とにより調製した。他に記載していない貯蔵液は次のよ
うにして調製した。

（１）ミオイノシトールの５０Ｘ貯蔵液は２５００ＨＶ
のミオイノシトールを５００−の蒸留脱イオン水に溶解
することにより調製した。

＋２１Ｍ５微量塩の１００ｘ貯蔵液は次の成分を５００
４の蒸留脱イオン水に溶解することにより調製した。

（３）クエン酸アンモニウム修飾ＭＳ多量塩の　Ｉ　Ｏ
Ｘ貯蔵液は３，７ｙの硫酸マグネシウム７水化物、１．
７りのリン酸二水素カリウムおよび４５．２４ｙのクエ
ン酸二アンモニウムを１０００．ｚの蒸留脱イオン水に
溶解することにより調製した。

（４）塩化カルシウムのＩＯＸ貯蔵液は４．４ｙの塩化
カルシウム２水化物を１０００−の蒸留脱イオン水に溶
解することにより調製した。

２、ビタミン ビタミンの１００Ｘ貯蔵液は次の成分を５００−の蒸留
脱イオン水に溶解することにより調製した。

３、アミノ酸 アミノ酸の５０Ｘ貯蔵液は次の成分を５００１１Ｉｅの
蒸留脱イオン水に溶解することにより調製した。

該貯蔵液は培地を調製するために使用するまて１０＋ｄ
づつ凍結した。

４、鉄およびＥＤＴＡ 鉄およびＥＤＴＡの１００ｘ貯蔵液は１．３９ｙの硫酸
鉄（ＩＤ７水加物および１．８６ｙのＥＤＴＡ二ナトリ
ウムを５００−の蒸留脱イオン水に溶解して調製した。

５、ホルモン （Ａ）ＡＢＡの１ｍＭ貯蔵液は、２６．４１１ｙのＡＢ
Ａを２０Ｔｎｌの１Ｍ炭酸水素ナトリウムに溶解し、蒸
留脱イオン水で１００−に希釈することにより調製した
。

（Ｂ）ＢＡの１ｍｐ／４貯蔵液は、１００哩のＢＡを２
０＃ＩｅのＩＮ水酸化ナトリウムに溶解し、蒸留脱イオ
ン水でｌ　００　ａｒｅに希釈することにより調製した
。

（Ｃ）２．４−Ｄの１号智貯蔵液は、１００ｍｇの２．
４−りを２０．ｆの７０％エタノールに溶解し、蒸留脱
イオン水で１００ａｆｆに希釈することにより調製した
。

（鞠ＩＢＡの１号匂貯蔵液は１００ｍｇのＩＢＡを２０
、ｇの７０％エタノールに溶解し、蒸留脱イオン水で１
００−に希釈することにより調製した。

（Ｅ）アデニン硫酸塩の１５ｍＭ貯蔵液は、２７３ｍｇ
のアデニン硫酸塩を２０ｄのＩＮ水酸化ナトリウムに溶
解し、蒸留脱イオン水で１００−に希釈することにより
調製した。

（Ｆ〕（−ゼアチンの１−貯蔵液は、１００哩のの【−
ゼアチンを５−の５Ｎ塩酸に溶解し、蒸留脱イオン水で
ｌｏｏｓｇに希釈することにより調製した。

（ｑピクロラムの１ｙＭ貯蔵液は、０．（１２）４■の
ピクロラムを２０−の温蒸留脱イオン水に溶解し、蒸留
脱イオン水で１００−に希釈することにより調製した。

嘱ＩＡＡの１−貯蔵液は、１００ηのＩＡＡを２０ｗｔ
の７０％エタノールに溶解し、蒸留脱イオン水で１００
艷に希釈することにより調製した。

該貯蔵液はアルミ箔で包んだ瓶に入れ冷蔵庫に保存した
。該溶液は１〜２力月毎に新しく調製した。

（ＤＧＡ３の１ｍＭ貯蔵液は、３４．６−ｙのＧＡ３を
２０艷の無水エタノールに溶解し、蒸留脱イオン水で１
００．Ｚに希釈することにより調製した。

実施例２ 培地の調製 １゜胚成長培地 胚成長培地は、２０−のアミノ酸貯蔵液および１０−の
ビタミン貯蔵液を鉄およびＥＤＴＡ修飾ＭＳに加えるこ
とにより調製した。１２０ｇのシュークローズおよび２
ｙのゲルライトをこの混合液に溶解した。５−のＡＢＡ
貯蔵液および０．３７ｍ１のアデニン硫酸塩貯蔵液を加
え、容量を蒸留脱イオン水で１１にした。ＩＮ塩酸また
はＩＮ水酸化ナトリウムを用いてｐＨを５．８に調節し
た。次いで、該混合液を１８ｐｓｉで１５分間オートク
レーブにかけた。培地を冷却している間に、０．２２μ
ミリポア・メンブレンを通過させて滅菌した０、１−の
ＩＡＡ貯蔵液を加えた。次いで該培地をペトリ皿に注い
だ。

成長培地中のホルモン濃度を変化させるため、使用する
貯蔵液の量を適宜調節した。例えば、５μＭの代わりに
２μＭのＡＢＡが所望の場合、２ＷｌのＡＢＡ貯蔵液を
使用した。【−ゼアチンをアデニン硫酸塩の代わりに使
用する場合、滅菌後その適当量を冷却培地に加えた。該
滅菌はＩＡＡと同様に膜ρ過により行なった。例えば、
０．２　ｔ＊／ｌが所望の場合、０．２−の（−ゼアチ
ン貯蔵液を使用した。

２、第１培地またはカルスおよび胚形成培地第１培地は
、１０−のビタミン貯蔵液を鉄およびＥＤＴＡ修飾ＭＳ
に加えることにより調製した。

２０）のシュークロースおよび２ｙのゲルライトをこの
混合液に溶解した。０．５４の２．４−Ｄ貯蔵液を加え
、容量を蒸留脱イオン水で１１にした。

ＩＮ塩酸またはＩＮ水酸化ナトリウムでｐＨを５．８に
調節した。該混合液をＩ　Ｂ　ｐｓｉで１５分間オート
クレーブにかけた。該冷却培地をペトリ皿に注いだ。

異なる濃度の２．４−Ｄを含有する第１培地を調製する
ため、使用する貯蔵液の量を適宜調節した。

例えば、０．５ｓ／ｚの代わりに１０＋＋＋ｙ／ｌの２
．４−Ｄが所望の場合、１０−の２．４−Ｄ貯蔵液を使
用した。

ホルモンとして２．４−ＤおよびＩＡＡの混合物または
ＩＡＡ、ＡＢＡおよび２．４−Ｄの混合物を含む第１培
地を調製するため、所望の濃度にする量゛の２．４−Ｄ
または２．４−ＤおよびＡＢＡを前記と同様に加えた。

該ＩＡＡ貯蔵液を前記と同様に滅菌し、所望濃度にする
ための量を冷却培地に加えた。例えば、所望濃度が３ｍ
ｇ／ｌの２．４−Ｄおよび２＃／／のＩＡＡの場合、３
−の２．４−Ｄ貯蔵液を該培地に加え、２−のＩＡＡ貯
蔵液を該冷却培地に加えた。

３、第２培地または胚成熱培地 Ａ、第２培地Ａ 第２培地Ａは前調整した第１培地により調製した。第１
培地は前記と同様にして調製した。胚を第１培地で平板
培養し、３０日間成長させた。第２培地Ａは、カルス成
長の１〜２ヌの範囲内の培地であった。

Ｂ、第２培地Ｂ 第２培地Ｂは、１０−のビタミン貯蔵液を鉄およびＥＤ
ＴＡ修飾ＭＳに加えることにより調製した。２０ｙのシ
ュークロースおよび２ｆのゲルライトをこの混合液に溶
解した。５−の２．４−Ｄ貯蔵液を加え、蒸留脱イオン
水で容量を１１にした。

ＩＮ塩酸またはＩＮ水酸化す）　ＩＪウムでｐＨを５．
８に調節した。該混合物を１８　Ｐｓｉで１５分間オー
トクレーブにかけた。冷却培地をペトリ皿に注いだ。

異なる濃度の２．４−Ｄを有する第２培地Ｂを調製する
ため、使用する貯蔵液の皿を適宜調節した。

例えば、５ｍｇ／／の代わりに３号勺の２．４−Ｄが所
望の場合、３ｄの２．４＝Ｄ貯蔵液を使用した。

ホルモンとして２．４−ＤおよびＩＡＡの混合物または
ＩＡＡ、２．４−ＤおよびＡＢＡの混合物を含む第２培
地Ｂを調製するため、所望濃度にするための量の２．４
−Ｄまたは２．４−ＤおよびＡＢＡを前記と同様にして
加えた。ＩＡＡ貯蔵液は前記と同様に滅菌し、所望濃度
にするための量を冷却培地に加えた。例えば、所望濃度
が３ｍｙ／ｌの２．４−Ｄおよび２４／ｌのＩＡＡの場
合、３ｍｇＩ／の２．４−Ｄ貯蔵液を該培地に加え、２
−のＩＡＡ貯蔵液を該冷却培地に加えた。

ホルモンとしてＩＡＡおよびｔ−ゼアチンの混合物を含
む第２培地Ｂを調製するため、該培地は２．４−Ｄ貯蔵
液を加えないこと以外は前記と同様にして調製した。Ｉ
ＡＡの貯蔵液および【−ゼアチンの貯蔵液は、ＩＡＡに
ついて前記したのと同様にして膜濾過により各々滅菌し
、所望濃度になる量を該冷却培地に加えた。例えば、所
望濃度が１〜句のＩＡＡおよび１ｍｌ／ｌの【−ゼアチ
ンの場合、ｌ　ｌｌｅのＩＡＡ貯蔵液および１ｄの【−
ゼアチン貯蔵液を該冷却培地に加えた。

ホルモンとしてＩＡＡおよびアデニン硫酸塩の混合物を
含む第２培地Ｂを調製するため、所望量のアデニン硫酸
塩貯蔵液を２．４−Ｄ貯蔵液のかわりに加える以外は前
記と同様にして該培地を調製した。滅菌したＩＡＡ貯蔵
液を該冷却培地に所望量加えた。例えば、所望濃度が１
＋＋＋ｙ／／のＩＡＡおよび３０ｙＭのアデニン硫酸塩
の場合、該培地の調製において、オートクレーブ処理前
に２ｄのアデニン硫酸塩貯蔵液を加え、ｌＴＲ１の滅菌
したＩＡＡ貯蔵液を該冷却培地に加えた。

Ｃ０第２培地Ｃ 第２培地Ｃはｌ　Ｑ　ｍｅのビタミン貯蔵液を鉄および
ＥＤＴＡ修飾ＭＳに加えることにより調製した。

２０ｙのシュークロース、１００ｓｐのカゼイン加水分
解物（ディフコのｉｆｃｏ）ブランド・ビタミン不含カ
ザミノ酸）および２２のゲルライトをこの培地に加えた
。０．２５艷のピクロラム貯蔵液および０．ｌＷｌのＡ
ＢＡ貯蔵液を加え、蒸留脱イオン水を用いて容量を１１
にした。ｐ　Ｉ−１試験紙を用いてＩＮ塩酸またはＩＮ
水酸化すｌ−ＩＪウムを用いてＰＨを５．８に調節した
。該混合液を１３ｐｓｉで１５分間オートクレーブにか
けた。前記と同様にして各々滅菌した１−のＩＡＡ貯蔵
液および１ｄの【−ゼアチン溶液を該冷却培地に加え、
次い”でペトリ皿に注いだ。

異なる濃度のホルモン成分を有する第２培地Ｃは、その
他の培地成分について前記したのと同様の方法で調製し
た。

Ｄ、第２培地り 第２培地りは１０−のビタミン貯蔵液をクエン酸アンモ
ニウム、鉄およびＥＤＴＡ修飾ＭＳに加えることにより
調製した。２０ｙのシュークロースおよび２ｆのゲルラ
イトをこの混合液に溶解した。１．１のアデニン硫酸塩
貯蔵液を加え、蒸留脱イオン水を用いて全量を１１にし
た。ｐＨはＩＮ塩酸またはＩＮ水酸化す）　ＩＪウムを
用いて５．８に調節した。該混合液はＩ　Ｂ　ｐｓｉで
１５分間オートクレーブにかけた。前記と同様にして滅
菌した１ｄのＩＡＡ貯蔵液を該冷却培地に加え、次いで
ペトリ皿に注いだ。第２培地りのＩＡＡおよびアデニン
硫酸塩濃度を変化させたい場合、これは前記の方法で行
なった。

Ｅ、第２培地Ｅ 第２培地Ｅは、クエン酸アンモニウム、鉄およびＥＤＴ
Ａ修飾ＭＳを第２培地Ｃの鉄およびＥＤＴＡ修飾ＭＳの
代わりに使用する以外は第２培地Ｃで記載したと同様に
調製した。

４、第３培地または苗木形成培地 第３培地は、１０−のビタミン貯蔵液を鉄およびＥＤＴ
Ａ修飾ＭＳに加えることにより調製した。

２（１２）のシュークロースおよび２ｙのゲムライトを
この混合液に溶解した。０．２−のＢＡ貯蔵液およびｏ
、ｏｏｓｌｌｅのＩＢＡ貯蔵液を加え、蒸留脱イオン水
を用いて容量を１１にした。ｐ　Ｉ−ＩはＩＮ塩酸また
はＩＮ水酸化ナトリウムを用いて５．８に調節した。次
いで該混合液をＩＢ　ｐｓｉで１５分間オートクレーブ
にかけた。そして、該冷却培地をペトリ皿に注いだ。Ｉ
ＢＡおよびＢＡｉ度を変化させたい場合、前記の方法で
行なった。

ＢＡおよびＩＢＡの代わりにＩＡＡおよびアデニン硫酸
塩を含む第３培地を調製するため、４　ｘｎｅのアデニ
ン硫酸塩貯蔵液をＢＡおよびＩＢＡの代　　。

わりに加えた。前記のようにして滅菌した３ｄのＩＡＡ
貯蔵液をペトリ皿に注ぐ前に該冷゛却培地に加えた。所
望ならば、前記のようにして濃度を変化させた。

この培地は、また鉄およびＥｏＴＡ＠細Ｍｓの代わりに
鉄およびＥＤＴＡ修飾半量ＭＳを使用して調製した。

５、第４培地または板形成培地 第４培地は、Ｌｏｔ／のビタミン貯蔵液を鉄およびＥＤ
ＴＡ修飾ＭＳに加えることにより調製した。

２０ｆのシュークロースおよび２．５２のゲルライトを
この混合液に溶解した。そして蒸留脱イオン水を用いて
容量を１１にした。ｐＨはＩＮ塩酸またはＩＮ水酸化ナ
トリウムを用いて５．８に調節した。該混合液は、ｌ　
８ｐｓｉで１５分間オートクレーブにかけることにより
滅菌した。冷却培地をペトリ皿に注いだ。

この培地は、また鉄およびＥＤＴＡ修飾ＭＳの代わりに
鉄およびＥＤＴＡ修飾半ｆｆ１Ｍ５を使用して調製した
。

実施例３ 大豆再生 さやが長さ１．５〜２．５（至）である時に、大豆、グ
リシン・マツクス（エル、）メリル・ジーブイ・エバ７
ス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ（Ｌ、）Ｍｅｒｒｉｌｌ　
ｃｖ、、Ｅｖａｎｓ　）のさやから未成熟胚を分離した
。この品種の大豆は、イリノイ州、アルバーナのイリノ
イ大学農学部のニッケル博士から入手した。大豆さやを
毎朝集めて、１８オンス無菌瓶に入れた。別々に使用し
た表面滅菌剤は次のとおりであった。７０％エタノール
（１分間）、５０％濃厚クロりツクス（Ｃ１ｏｒｏｘ、
商標）（８分間）および蒸留脱イオン水洗浄３回。滅菌
さやを滅菌ベトＩＪ皿（１０００ｍＸ２５　ｍ　）の上
部に置いた。各さやを個々に、はさみで切断した。胚珠
（１さや当たり３〜４）を注意深くさやからペトリ皿（
滅菌）の底に押し出した。１対の鉗子およびさぐり針を
各胚珠から未成熟胚を取り出すために使用した。該胚を
ペトリ皿に入れた第１培地上に平板接種した。この培地
は、ホルモンとして０．５ｍｇの２．４−Ｄを用いて前
記のように調製した。該ペトリ皿を明所に置き、カルス
および胚を形成するため７０日間培養七た。

この時、胚を有する各カルスは、１〜勺の【−ゼアチン
、１キリのＩＡＡ、２５０ｎＭのピクロラムおよび０．
１ｙＭのＡＢＡを使用して前記のように調製した第２培
地Ｃに移し変えた。該カルスを明所において７２日間、
この培地で培養した。

次いで、成熟胚を有するカルスは、１嘴りのＩＡＡおよ
び１５μＭのアデニン硫酸塩を使用して、実施例２に記
載したように調製した第２培地りに移し変えた。胚を有
する該カルスを明所において４６日間この培地で培養し
た。該胚は苗条を形成した。

苗条を有する該カルスは、前記のように調製したペトリ
皿に入れた第４培地に移し変えた。苗条は、明所におい
て３０日間この培地で培養した。

この期間に、苗条は根を形成した。

蒸留脱イオン水を用いて、苗木の根からゲルライトを洗
い落した。次いで、該苗木を１クオート・メイスン（Ｍ
ａｓｏｎ）ジャー内の土壌に移し変えた。メイスン・ジ
ャーの底を滅菌活性炭で覆った。

オートクレーブにかけたバーミキュライト、パーライト
および鉢植え土壌の等量混合物を４インチ該炭上に置い
た。苗木を該土壌中に植え付け、土壌を蒸留脱イオン水
を用いて十分に湿らせた。パラフィルム（Ｐａｒａｆｉ
ｌｍ　）をジャー上に置き、パラフィルムの上からキャ
ップをネジ込んだ。次いで、ジャムを１日当たり１６時
間の光周期を有する２４”Ｃのバーシバ／ｌ／　（Ｐｅ
ｒｃｉｖａｌ　）成長室内に置いた。

１２日後、ジャーを成長室から取り出し、温室内のセー
ター・ボックス（ｓｗｅａｔｅｒ　ｂｏｘ　）に入れた
。

２番目のセーター・ボックスを１番目のセーター・ボッ
クス上に垂直に置き、その上に紙タオルを置いて拡散日
光を供給した。温室は日中２９°Ｃ±３°Ｃの温度、夜
間２１℃±２℃の温度を符し、１日当たり１６時間の光
周期を有した。１週間後、パラフィルムをジャーから取
り除いた。４日後、再生植物を等量のバーミキュライト
、パーライトおよび鉢植え土壌を含む６インチの鉢へ移
植し、セーター・ボックスに戻した。再生植物は開花し
発育した胚珠を含むさやを形成した。

実施例４ 大豆再生 未成熟胚を前記のように分離して、１０　ｗｌＩ／ｌの
２．４−Ｄを含む第１培地で平板培養した。該平板は、
明所で７日間培養した。次いで胚を有するカルスを２＃
ｌＦ／／のＩＡＡ、ｌμＭのＡＢＡおよび３ツ／ｌの２
．４−Ｄを含む第２培地に移し変え、明所で３８日間培
養した。

この時点で、胚を有する各カルスを１　ｍｙ／ｌのＩＡ
Ａおよび３０μＭのアデニン硫酸塩を含む第２培地Ｂに
移し変えた。該平板は、明所において３４日間２５〜２
９℃で培養した。この時点で、成熟胚を有する各カルス
を０．２ｍｇ／ｌのＢＡおよび０．００５ｍｙ／ｌのＩ
ＢＡを含む第３培地に移し変えた。苗条を有する各カル
スを第４培地に移し変える前に、該平板は２９日間明所
で培養した。

明所で培養して２７日後、苗木を取り出し、前記のよう
に１クオート・メイスン・ジャー内に入れた。次いで、
該ジャーを２４℃で１日当たり１６時間の光周期を有す
るパーシバル成長室内に置いた。

実施例５ 大豆再生 グリシン・マツクス（エル、）メリル・ジーブイ・ノー
スラップ・キング（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ　（Ｌ、）
Ｍｅｒｒｉｌｌｃｖ、Ｎｏｒｔｈｒｕｐ　Ｋｉｎｇ　）
品種Ｓ−１８−８４−８０３２−２３からの未成熟胚を
前記のように分離し、２．０ｍｙ／ｚの２．４−Ｄを含
む第１培地で平板培養した。

該平板を明所で５８日間培養した。次いで、胚を有する
各カルスを１＊／ｊのＩＡＡおよび１ｅＴｈｌのｔ−ゼ
アチンを含む第２培地に移し変えた。明所で培養して４
７日後、成熟胚を有する各カルスを３　ｍｇ／ｌのＩＡ
Ａおよび３０μＭのアデニン硫酸塩を含む第３培地に移
し変え、明所で４７日間培養した。この時点で苗条を有
する各カルスを第４培地に移し変え、明所で５８日間培
養した。次いで、苗木を取り出し、前記のように１クオ
ート・メイスン・ジャー内に入れた。次いで、該ジャー
をパーシバル成長室に置いた。

実施例６ 大豆再生 グリシン・マツクス（エル、）メリル・ジーブイ・：ｌ
−７４（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ（Ｌ、）　Ｍｅｒｒｉ
ｌｌ　ｃｖ、Ｃｏｒｓｏｙ）７９からの未成熟胚は、前
記のように分離した。

この品種はニッケル博士から入手した。該胚は、１０　
ｍｇ／ｌの２．４−Ｄを含む第１培地で平板培養した。

そして１０日間明所で培養した。次いで、胚を有する各
カルスを５ｆ！Ｉ／ｌの２．４−Ｄを含む第２培地Ｂに
移し変え、明所で培養した。２０日後、胚を有する各カ
ルスを１呵／ｌのＩＡＡ、１　ｔｒｙ／ｌの【−ゼアチ
ン、４０　ｎＭのピクロラムおよび０．１μＭのＡＢＡ
を含む第２培地に郡し変えて、５２日間明所で培養した
。次いで、成熟胚を有する各カルスを３＋＋＋ｙ／／の
ＩＡＡおよび６０μＭのアデニン硫酸塩を含む第３培地
に移し変えた。明所で４５日間培養した後、発育した苗
条を有する各カルスは、根を伸長させるために０．２ｖ
ｑ／ｚのＢＡおよび０、　ＯＯ５Ｎ／／のＩＢＡを含む
第３培地に移し変えた。

これらは３１日間明所で培養し、次いで第４培地ニ移シ
変えた。苗条を有する該カルスは、根ヲ形成するために
この培地で明所で培養した。

実施例７ 大豆再生 未成鶏胚を実施例６に記載したように分離し、１０　ｍ
Ｗ／ｌの２．４−Ｄを含む第１培地で平板培養した。そ
れらは、２＃Ｉ／ｌのＩＡＡおよび３ｍｇＩ／ｌの２゜
４−Ｄを含む第２培地に移し変える前に、明所で８日間
培養した。胚を有する各カルスは、明所で３７日間培養
することによりこの培地で成熟した。

成熟胚を有する各カルスは、０．２ｖｙ／ｌのＢＡおよ
びＯ，ＯＯ５−ｙ／ｌのＩＢＡを含む第３培地に移し変
えた。この培地での培養は、３２日後に新しい培地に移
し変えて、明所で６３日間行った。次いで、発育した苗
条を有する各カルスは、ムラシゲ最小有機物培地の２分
の１の濃度を含む第３培地で平板培養した。これらは、
苗条を伸長させるためこの培地で明所において培養した
。

実施例８ 大豆再生 未成鶏胚を実施例６に記載したように分離し、１０　ｍ
ｇ／ｌの２．４−Ｄを含む第１培地で平板培養した。明
所で８日培養した後、胚を有する各カルスは、２ｑ／／
のＩＡＡおよび３−ｖ’ｔの２．４−Ｄを含む第２培地
Ｂに移し変えた。これらは、明所で３７日間培養し、次
いで１Ｎ／ＺのＩＡＡ、ｌｑ／／のｔ−ゼアチン、４　
Ｑ　ｎＭのピクロラムおよび０．１μＭのＡＢＡを含む
第２培地Ｅに移し変えた。成熟胚を存する各カルスは、
３２日後０．２　ｍｇ／ｌのＢＡおよび０．００５４／
／のＩＢＡを含む第３培地に移し変えた。明所で３１日
間培養した後、発育した苗条を有する各カルスは、ムラ
シゲ最小有機物培地の２分の１の濃度を含む第３培地に
移し変えた。

これらは、苗条を伸長させるために明所においてこの培
地で培養した。

実施例９ 大豆再生 グリシン・マツクス（エル、）メリル・ジーブイ・フオ
Ｌ／７．ト（Ｇｌｙｃｉｎｅ＝ｍａｘ（Ｌ、）Ｍｅｒｒ
ｉｌｌ　ｃｖ、Ｆｏｒｒｅｓｔ）からの未成妬胚を前記
したように分離した。この品種はミシシッピイ州、スト
ーンビルの米国農務省、アグリカルチュラル・リサーチ
・サービス、ソイビーン・プロダクション・リサーチの
ハートビック博士のｒ、Ｈａｒｔｗｉｇ　）より入手し
た。該胚を２．０　Ｉｌｌ／ｌの２．４−Ｄを含む第１
培地で平板培養し、明所で４８日間培養した。次いで、
胚を有する各カルスは、１ｖｙ／ｌのＩＡＡおよび１５
μＭのアデニン硫酸塩を含む第２培地りに移し変えた。

明所において５５日間この培地で培養した後、成熟胚を
有する各カルスは、０．２−ｖ’ｔのＢＡおよび０．０
０５ＷＶ′４’のＩＢＡを含む第３培地に移し変えた。

次いで、苗条を有する各カルスは、第４培地へ移し変え
明所で１３日間培養した。この期間に、それらは２分の
１の濃度の無機塩、ビタミンおよびシュークロースを有
する第４培地に移し変え、根を形成させるため明所で培
養した。

実施例１０ 大豆再生 グリシン・マツクス（エル、）メリル・ジ−ブイグノム
（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ（Ｌ、）Ｍｅｒｒｉｌｌ　ｃ
ｖ、Ｇｎｏｍｅ）からの未成鶏胚は前記のように分離し
た。この品種はニッケル博士から入手した。該胚は一５
５ｆｍｇ／ｌの２．４−Ｄを含む第１培地で平板培養し
、明所で５６日間培養した。次いで、胚を有する各カル
スは、１１１のＩＡＡ、１ｍｇＩ／ｌのＬ−ゼアチン、
４０ｎＭのピクロラムおよび０．１μＭのＡＢＡを含む
第２培地Ｅに移し変えた。明所で５９日間培奄した後、
成熟胚を有する各カルスは、Ｏ，’２ｎｙ／ｌのＢＡお
よびＯ，ＯＯ５Ｎ／／のＩＢＡを含む第３培地に移し変
えた。この培地での培養は、４３日後に新しい培地に移
し変えて、明所で７７日間行った。

次いで、発育した苗条を有する各カルスは、２分の１の
濃度のムラシゲ最小有機物および１％シュークロースを
含む第３培地に置いた。これらは、苗条を伸長させるた
め明るい場所で培養した。

実施例１１ 大豆再生 グリシン・マツクス（エル、）メリル・ジ−ブイエバ７
　ス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ（Ｌ、）　Ｍｅｒｒｉｌ
ｌ　ｃｖ、　Ｅｖａｎｓ）からの１．Ｏｎ＋より小さい
未成黙秘は、前記のように分離した。該胚は、２０　ｗ
ｉｔのアミノ酸混合物を使用して前記のように調製した
０、１〜勺のＩＡＡ、１ｍｇ７ｔのアデニン硫酸塩およ
び５μＭのＡＢＡを含む胚成長培地で平板培養し、明所
で２１日間培養した。次いで、胚を有する各カルスは、
３ｍｇ／ｌのＩＡＡ、３ψ′ｌの２．４−Ｄおよび１μ
ＭのＡＢＡを含む第２培地に移し変えた。明所で８７日
間培養した後、成鶏胚を有する各カルスは、ｏ、ｏｏｓ
■／ｌのＩＡＡおよび０．２ｍｇ／ｌのＢＡを含む調整
第３培地に移し変えた。この培地での培養は、０．１μ
ＭのＧＡ３と同じホルモンを含む新しい培地への移動を
伴い、明所で４１日間行った。これらは、苗条を成熟さ
せるため明所で培養した。

以上、本発明をその具体例を用いて詳しく説明したが、
明らかなごとく、本発明の精神を逸脱しない範囲で種々
の修飾が可能であり、これらも本発明範囲のものである
。

特許出願人　　サンジエン・テクノロジイズ・コーポレ
イション

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）カルスおよび胚形成を確実にするのに十分
   な量の無機塩、ビタミン、シュークロースおよび、２，
   ４−Ｄ、２，４−ＤとＩＡＡの混合物および２，４−Ｄ
   、ＩＡＡとＡＢＡの混合物から成る群から選択されたホ
   ルモンから成る第１培地で大豆植物から得られた組織を
   培養し、 （ｂ）胚を有する前記カルスを胚成熱に十分な量の無機
   塩、ビタミン、シュークロースおよび（１）２，４−Ｄ
   、（２）２，４−ＤおよびＩＡＡの混合物、（３）ＩＡ
   Ａおよびｔ−ゼアチンの混合物、（４）ＩＡＡおよびア
   デニン硫酸塩の混合物、（５）ＩＡＡ、ｔ−ゼアチン、
   ピクロラムおよびＡＢＡの混合物、および（６）２，４
   −Ｄ、ＩＡＡおよびＡＢＡの混合物から成る群から選択
   されたホルモンから成る第２培地で継代培養し、 （ｃ）成熟胚を有する前記カルスを、苗条形成に十分な
   量の無機塩、ビタミン、シュークロース、およびＩＢＡ
   およびＢＡの混合物、ＩＡＡおよびアデニン硫酸塩の混
   合物、ＩＢＡ、ＢＡおよびＧＡ＿３の混合物、およびＩ
   ＡＡ、ＢＡおよびＧＡ＿３の混合物から成る群から選択
   されたホルモンから成る第３培地で継代培養し、 （ｄ）苗条を有する前記カルスを、次の成分、（１）無
   機塩、（２）ビタミン、（３）シュークロース、および
   （４）根形成を確実にするのに十分な量のＩＡＡおよび
   ＩＢＡから成る群から選択されたホルモン（ただし前記
   無機塩、ビタミンおよびシュークロースは常に存在する
   ）のうちの少なくとも３つから成る第４培地で継代培養
   する 段階から成ることを特徴とする、細胞または組織培養か
   ら大豆苗木を再生する方法。
2. （２）該組織が未成熟胚から得られる前記第（１）項の
   方法。
3. （３）大豆植物が、グリシン・マツクス（エル）メリル
   （Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ（Ｌ）ｍｅｒｒｉｌｌ）のノ
   ースラツプキング（Ｎｏｒｔｈｒｕｐ　Ｋｉｎｇ）品種
   Ｓ−１８−８４−８０３２−２３、フオレスト（Ｆｏｒ
   ｒｅｓｔ）、コーソイ（Ｃｏｒｓｏｙ）７９、エバンス
   （Ｅｖａｎｓ）、グノム（Ｇｎｏｍｅ）およびミツチエ
   ル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）４５０品種から選択される前記
   第（１）項または第（２）項記載の方法。
4. （４）未成熟胚が前記第１培地で培養する前に、または
   前記第１培地で培養する代わりに胚成長培地で最初に成
   長させられる前記第（２）項または第（３）項の方法。
5. （５）該ホルモン濃度が、 ［１］第１培地中、０．５〜１１ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ
   、１〜３ｍｇ／ｌのＩＡＡおよび３〜１０ｍｇ／ｌの２
   ，４−Ｄの混合物、または１〜３ｍｇ／ｌのＩＡＡ、３
   〜１０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄおよび０．１〜１．０μＭ
   のＡＢＡの混合物、 ［２］第２培地中、３〜５ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、１〜
   ３ｍｇ／ｌのＩＡＡおよび３〜５ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ
   の混合物、１．０〜２．０ｍｇ／ｌのＩＡＡおよび０．
   ５〜１．０ｍｇ／ｌのｔ−ゼアチンの混合物、１．０〜
   ２．０ｍｇ／ｌのＩＡＡおよび１５〜３０μＭのアデニ
   ン硫酸塩の混合物、１．０〜２．０ｍｇ／ｌのＩＡＡ、
   ０．５〜１．０ｍｇ／ｌのｔ−ゼアチン、４０〜２　５
   ０ｎＭのピクロラムおよび０．１〜５．０μＭのＡＢＡ
   の混合物、または３〜５ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、１〜３
   ｍｇ／ｌのＩＡＡおよび０．１〜１．０μＭのＡＢＡの
   混合物、 ［３］第３培地中、０．１〜０．５ｍｇ／ｌのＢＡおよ
   び０．００１〜０．０５ｍｇ／ｌのＩＢＡの混合物、１
   ．０〜３．０ｍｇ／ｌのＩＡＡおよび１５〜６０μＭの
   アデニン硫酸塩の混合物、０．１〜０．５ｍｇ／ｌのＢ
   Ａ、０．００１〜０．０５ｍｇ／ｌのＩＢＡおよび０．
   １μＭのＧＡ＿３の混合物、または０．０　５ｍｇ／ｌ
   のＩＡＡ、０．０５ｍｇ／ｌのＢＡおよび０．１μＭの
   ＧＡ＿３の混合物、 ［４］前記第４培地がホルモンを含む時、前記第４培地
   中に０．１〜１．０ｍｇ／ｌのＩＡＡまたは０．１〜１
   ．０ｍｇ／ｌのＩＢＡ、 である前記第（１）項〜第（４）項いずれか１つの方法
   。
6. （６）該ホルモン濃度が、 ［１］第１培地中、３〜１０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、１
   〜３ｍｇ／ｌのＩＡＡおよび３ｍｇ／ｌの２，４−Ｄの
   混合物、３ｍｇ／ｌのＩＡＡおよび５ｍｇ／ｌの２，４
   −Ｄの混合物、３ｍｇ／ｌのＩＡＡおよび１０ｍｇ／ｌ
   の２，４−Ｄの混合物、１〜３ｍｇ／ｌのＩＡＡ、３ｍ
   ｇ／ｌの２，４−Ｄおよび１．０μＭのＡＢＡの混合物
   、３ｍｇ／ｌのＩＡＡ、５ｍｇ／ｌの２，４−Ｄおよび
   １．０μＭのＡＢＡの混合物、または３ｍｇ／ｌのＩＡ
   Ａ、１０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄおよび１．０μＭのＡＢ
   Ａの混合物、 ［２］第２培地中、５ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、２ｍｇ／
   ｌのＩＡＡおよび３ｍｇ／ｌの２，４−Ｄの混合物、１
   ｍｇ／ｌのＩＡＡおよび１ｍｇ／ｌのｔ−ゼアチンの混
   合物、１ｍｇ／ｌのＩＡＡおよび３０μＭのアデニン硫
   酸塩の混合物、１ｍｇ／ｌのＩＡＡおよび１５μＭのア
   デニン硫酸塩の混合物、１ｍｇ／ｌのＩＡＡ、１ｍｇ／
   ｌのｔ−ゼアチンおよび４０ｎＭのピクロラムおよび０
   ．１μＭのＡＢＡの混合物、１ｍｇ／ｌのＩＡＡ、１ｍ
   ｇ／ｌのｔ−ゼアチン、２５０ｎＭのピクロラムおよび
   ０．１μＭのＡＢＡの混合物、または３ｍｇ／ｌの２，
   ４−Ｄ、２ｍｇ／ｌのＩＡＡおよび１．０μＭのＡＢＡ
   の混合物、［３］第３培地中、０．００５ｍｇ／ｌのＩ
   ＢＡおよび０．２ｍｇ／ｌのＢＡの混合物、３ｍｇ／ｌ
   のＩＡＡおよび３０μＭのアデニン硫酸塩の混合物、３
   ｍｇ／ｌのＩＡＡおよび６０μＭのアデニン硫酸塩の混
   合物、０．００５ｍｇ／ｌのＩＢＡ、０．２ｍｇ／ｌの
   ＢＡおよび０．１μＭのＧＡ＿３の混合物、または０．
   ０５ｍｇ／ｌのＩＡＡ、０．０５ｍｇ／ｌのＢＡおよび
   ０．１μＭのＧＡ＿３の混合物、［４］第４培地中、０
   ．５ｍｇ／ｌのＩＡＡまたは０．５ｍｇ／ｌのＩＢＡ、 である前記第（４）項の方法。
7. （７）第１、第２、第３および第４培地において、シュ
   ークロースの濃度が２％およびｐＨが５．８である前記
   第（１）〜第（６）項いずれか１つの方法。
8. （８）第１、第３および第４培地における前記無機塩が
   、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸二水素カ
   リウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、ホウ酸、硫
   酸マンガン、硫酸亜鉛、モリブデン酸（VI）ナトリウム
   、硫酸銅（II）、塩化コバルト、ヨウ化カリウム、硫酸
   鉄（II）およびＥＤＴＡ二ナトリウム塩から成る前記第
   （１）〜第（７）項いずれか１つの方法。
9. （９）前記無機塩が、鉄およびＥＤＴＡの濃度が当初の
   １５０％となるように修飾したＭＳ無機塩である前記第
   （８）項の方法。
10. （１０）第２培地における前記無機塩が硫酸マグネシウ
    ム、塩化カルシウム、リン酸二水素カリウム、ホウ酸、
    硫酸マンガン、硫酸亜鉛、モリブデン酸（VI）ナトリウ
    ム、硫酸銅（II）、塩化コバルト、ヨウ化カリウム、硫
    酸鉄（II）、ＥＤＴＡ二ナトリウム塩ならびにクエン酸
    アンモニウム、および硝酸カリウムおよび硝酸アンモニ
    ウムの混合物から成る群から選択された窒素源である前
    記第（１）〜第（９）項いずれか１つの方法。
11. （１１）前記無機塩が、窒素源が硝酸カリウムおよび硝
    酸アンモニウムである時、鉄およびＥＤＴＡの濃度がも
    との１５０％となるように修飾されたＭＳ無機塩であり
    、あるいは前記無機塩が、窒素源がクエン酸アンモニウ
    ムである時、鉄およびＥＤＴＡ濃度がもとの１５０％と
    なるるように修飾されたＭＳ無機塩であり、２０ｍＭの
    クエン酸アンモニウムを硝酸カリウムおよび硝酸アンモ
    ニウムの代りに用いる前記第（１０）項の方法。
12. （１２）第２培地がさらにカゼイン加水分解物から成る
    前記第（７）または第（８）項の方法。
13. （１３）第１、第２、第３および第４培地において前記
    ビタミンがミオイノシトール、ニコチン酸、グリシン、
    ピリドキシン、チアミン、葉酸およびビオチンから成る
    前記第（１）項〜第（１２）項いずれか１つの方法。
14. （１４）前記ビタミンが、窒素源が硝酸カリウムおよび
    硝酸アンモニウムである時、１００ｍｇ／ｌのミオイノ
    シトールおよびチアミン濃度がもとの１５０％となるよ
    うに修飾されたニツチエ（Ｎｉｔｓｃｈ）のビタミンで
    あり、窒素源がクエン酸アンモニウムである時、１００
    ｍｇ／ｌのミオイノシトールおよびニツチエのビタミン
    である前記第（１３）項の方法。
15. （１５）前記第（１）項〜第（１４）項いずれか１つの
    方法により生産された植物。
16. （１６）前記第（１５）項の植物から生産された種子。