CN110982835A - 一种减少农杆菌转化过程中大麦、青稞小孢子愈伤污染的方法 - Google Patents

一种减少农杆菌转化过程中大麦、青稞小孢子愈伤污染的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体是一种减少农杆菌转化过程中大麦、青稞小孢子愈伤污染、结块的方法，是在农杆菌侵染大麦或青稞小孢子愈伤过程中，加入L‑半胱氨酸共培养，在侵染后加入Timentin接续培养。本发明优点在于：本发明针对农杆菌转化大麦或青稞小孢子技术中的农杆菌长期存在的污染问题做出改良，在培养基中同时加入L‑半胱氨酸显著减少农杆菌侵染中和侵染后的愈伤的结块。可以显著增加侵染后的愈伤产量和绿苗数，使农杆菌转化大麦或青稞小孢子愈伤技术更加高效。这项改良技术可应用于大麦、青稞单倍体育种、单倍体转化。

Description

一种减少农杆菌转化过程中大麦、青稞小孢子愈伤污染的 方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体地说，是一种减少农杆菌转化过程中大麦、青稞小孢子愈伤污染、结块的方法。
背景技术
转基因相对以自然突变和染色体重组为主的常规育种方法，可在短时间内定向培育出抗病抗逆性强、产量高、品质好的作物品种，减少化学农药的使用，符合生态环境保护的长远利益。转基因是分子生物学的发展出来能和传统育种方法互补的分子育种手段。
植物小孢子(Microspore)是由花粉母细胞经减数分裂后形成的四分体产生的单倍体性细胞，在离体胁迫条件下可以由原有的配子体发育途径转向孢子体发育途径，经胚胎发育形成完整植株。利用植物小孢子进行基因转化，可以获得高频再生植株，同时转入基因通过染色体自然加倍可以快速纯合、稳定。因此，小孢子是优良的转基因受体。
大麦、青稞是世界第四大禾谷类作物，生长周期短，环境适应性强，种植范围广。近年来，大麦已完成全基因组测序，并建成高密度遗传图谱，这将推动大麦重要基因的定位和克隆。随着大麦基因组信息的不断完善，需要对大量的目标基因开展功能研究。大麦转基因技术是实现基因功能验证的重要一环，同时将成为作物育种的重要方法。Kumlehn等(2006)报道了一种农杆菌转化大麦小孢子的方法，但是其操作复杂，在实际操作中愈伤污染率较高。
关于一种减少农杆菌转化过程中大麦小孢子愈伤污染、结块的方法目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术上的缺陷，提供一种减少农杆菌转化过程中大麦、青稞小孢子愈伤污染、结块的方法。本发明通过是在农杆菌侵染大麦或青稞小孢子愈伤过程中，加入L-半胱氨酸共培养，在侵染后加入Timentin接续培养。添加L-半胱氨酸后，愈伤污染、结块的平均培养皿数相对不添加L-半胱氨酸的培养皿显著降低，甚至无污染、结块。为大麦、青稞单倍体转化提供了更高效的方法。
本发明的第一方面，提供一种减少农杆菌转化过程中大麦、青稞小孢子愈伤污染、结块的方法，是在大麦或青稞小孢子培养10-12天时使用农杆菌侵染小孢子愈伤，同时在培养基中加入800mg/L的L-半胱氨酸和99mg/L的乙酰丁香酮共培养20-25h，用培养基清洗3-5次，加入含400mg/L的Timentin和99mg/L的乙酰丁香酮的培养基接续培养。
进一步的，在大麦或青稞小孢子培养11天时接种农杆菌进行侵染，此时大麦、青稞小孢子开始形成愈伤组织。
进一步的，所述的农杆菌菌株为LBA4404。该菌株毒性较低，适合小孢子转化。
进一步的，所述的农杆菌LBA4404 OD600为0.6。此时农杆菌处于对数生长期，活性较强。
进一步的，所述的共培养时间为24h。时间过长会导致不可逆的污染，时间过短导致农杆菌质粒无法整合到植物基因组。
进一步的，所述的培养基是以N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L MES、400mg/L水解干酪素、1600mg/L谷氨酰胺，pH5.8。
进一步的，所述的共培养后，使用离心法用培养基清洗农杆菌3次。
进一步的，所述的Timentin为替门汀，所述的Timentin在诱导培养基中的浓度为400mg/L。浓度过低无法抑制农杆菌生长。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的减少农杆菌转化过程中大麦、青稞小孢子愈伤污染、结块的方法，包括以下步骤：
大麦或青稞小孢子培养11天时接种农杆菌LBA4404(OD600＝0.6)菌株进行侵染，在培养基中同时加入800mg/L的L-半胱氨酸和99mg/L的乙酰丁香酮，共培养24h，使用培养基清洗农杆菌3次，加入含400mg/L的Timentin和99mg/L的乙酰丁香酮的培养基接续培养。
本发明的第二方面，提供如上所述一种减少农杆菌转化过程中大麦或青稞小孢子愈伤污染、结块的方法在大麦或青稞遗传育种改良中的应用。
本发明的第三方面，提供一种如上所述减少农杆菌转化过程中大麦或青稞小孢子愈伤污染、结块的方法在大麦或青稞分子生物学研究中的应用。
本发明优点在于：
1、在农杆菌侵染大麦或青稞小孢子愈伤过程中，加入L-半胱氨酸，增强愈伤的抗氧化能力；在侵染后加入Timentin，有效抑制农杆菌生长。在侵染过程中，加入L-半胱氨酸后愈伤的污染率降低到11.1％；在侵染后，加入Timentin，愈伤污染率降低到0。
2、本发明针对农杆菌转化大麦或青稞小孢子技术中的农杆菌长期存在的污染问题做出改良，在培养基中同时加入L-半胱氨酸显著减少农杆菌侵染中愈伤的污染，在培养基中加入Timentin显著减少侵染后愈伤的污染。可以显著增加侵染后的愈伤产量和绿苗数，使农杆菌转化大麦或青稞小孢子愈伤技术更加高效。这项改良技术可应用于大麦或青稞单倍体育种、单倍体转化。
附图说明
图1.加入不同浓度L-半胱氨酸大麦小孢子愈伤污染率比较(t-test，p<0.05)。
图2.加入不同Timentin大麦小孢子愈伤污染率比较(t-test，p<0.05)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：大麦材料花30幼苗
种植大麦材料花30于盆钵中(大麦品种花30是由上海市农业科学院生物技术研究所细胞工程研究室培育的优良大麦品种，国内种植面积较广，种子由上海市农业科学院细胞工程研究室保存)，待幼苗生长至二叶一心期时，人工气候室培养，植株培养条件为：温度晚上18℃，白天20℃；湿度65％；12小时光照，12小时黑暗。
实施例2：大麦材料花30小孢子培养
选取低温处理和对照植株幼穗中部小花小孢子发育处于单核早-中期的大麦穗子，剪去叶片(保留上部两片叶子基部约1.5cm)，用干净的湿纱布包好幼穗，放入保鲜袋中保湿，标明取材日期和数量等，放入4℃冰箱中进行2～4周低温预处理。经过低温处理的材料取花苞游离小孢子，小孢子游离参照陆瑞菊等方法(参考文献：陆瑞菊,黄剑华，等，秋水仙碱对大麦离体培养小孢子存活与成苗的影响。植物生理学报，2001，27(2)：135～140)。每个试管接4个穗子的花苞，加入12ml提取液(甘露醇60g/L+CaCl2 1.1g/L+MES 0.976g/L+秋水仙碱20mg/L，pH 5.8)，用高速分散器超速旋切。把旋切好的悬浮液，用300目筛网过滤，滤液以700rpm，5min低速离心，重复3次，收集小孢子。收集到的小孢子用提取液于25℃、黑暗中预处理2d后再纯化培养小孢子。培养前小孢子用诱导培养基(N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L MES、400mg/L水解干酪素+1600mg/L谷氨酰胺，pH5.8)洗涤1次，密度调节至1.0×105/m1，取1.5ml(约1.5×105个)小孢子悬浮液接种于培养皿(30×15mm)中，Parafilm封口，25℃，暗培养。
实施例3：农杆菌转化大麦材料花30小孢子愈伤
小孢子培养至11天时，每1.5mL的含约1.5×105个小孢子愈伤悬浮液使用20μL的含1.5×106农杆菌LBA4404(OD600＝0.6)溶液侵染所述小孢子愈伤，同时加入800mg/L的L-半胱氨酸和99mg/L的乙酰丁香酮，共培养24小时，用诱导培养基清洗三次。
加入1.5ml的含400mg/L的Timentin和99mg/L的乙酰丁香酮的诱导培养基，继续暗培养。
实施例4：不同浓度L-半胱氨酸对大麦小孢子愈伤污染的影响
在农杆菌侵染小孢子时，分别加入不同浓度的L-半胱氨酸(0、600mg/L、700mg/L、800mg/L、900mg/L)和99mg/L的乙酰丁香酮，共培养24小时。结果表明，未添加L-半胱氨酸时，小孢子污染率最高，为55.6％；加入800mg/LL-半胱氨酸时，小孢子污染率最低，为11.1％(图1)。
实施例5：不同浓度Timentin对大麦小孢子愈伤污染的影响
在清洗农杆菌后，诱导培养基中分别加入不同浓度的Timentin(100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L)，结果表明，随着Timentin浓度升高，污染率逐渐降低，加入400mg/LTimentin时，转化后小孢子愈伤污染率最低，为0(图2)。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (9)

1.一种减少农杆菌转化过程中大麦、青稞小孢子愈伤污染、结块的方法，其特征在于，是在大麦或青稞小孢子培养10-12天时使用农杆菌侵染小孢子愈伤，同时在培养基中加入800mg/L的L-半胱氨酸和99mg/L的乙酰丁香酮共培养20-25h，用培养基清洗3-5次，加入含400mg/L的Timentin和99mg/L的乙酰丁香酮的培养基接续培养。
2.根据权利要求1所述的减少农杆菌转化过程中大麦、青稞小孢子愈伤污染、结块的方法，其特征在于，在大麦或青稞小孢子培养11天时接种农杆菌进行侵染。
3.根据权利要求1所述的减少农杆菌转化过程中大麦、青稞小孢子愈伤污染、结块的方法，其特征在于，所述的农杆菌菌株为LBA4404。
4.根据权利要求3所述的减少农杆菌转化过程中大麦、青稞小孢子愈伤污染、结块的方法，其特征在于，所述的农杆菌LBA4404 OD600为0.6。
5.根据权利要求1所述的减少农杆菌转化过程中大麦、青稞小孢子愈伤污染、结块的方法，其特征在于，所述的共培养时间为24h。
6.根据权利要求1所述的减少农杆菌转化过程中大麦、青稞小孢子愈伤污染、结块的方法，其特征在于，所述的培养基是以N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L MES、400mg/L水解干酪素、1600mg/L谷氨酰胺，pH5.8。
7.根据权利要求1所述的减少农杆菌转化过程中大麦、青稞小孢子愈伤污染、结块的方法，其特征在于，包括以下步骤：
大麦或青稞小孢子培养11天时接种农杆菌LBA4404菌株进行侵染，在培养基中同时加入800mg/L的L-半胱氨酸和99mg/L的乙酰丁香酮，共培养24h，使用培养基清洗农杆菌3次，加入含400mg/L的Timentin和99mg/L的乙酰丁香酮的培养基接续培养。
8.一种如权利要求1-7任一所述的减少农杆菌转化过程中大麦、青稞小孢子愈伤污染、结块的方法在大麦或青稞遗传育种改良中的应用。
9.一种如权利要求1-7任一所述的减少农杆菌转化过程中大麦、青稞小孢子愈伤污染、结块的方法在大麦或青稞分子生物学研究中的应用。
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