CN113337535A - 一种在液体高糖培养基中抑制农杆菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在液体高糖培养基中抑制农杆菌的方法。农杆菌介导的遗传转化体系中，液体培养基中农杆菌的生长能否被抑制是实验成功的要素。在高糖液体培养基中，农杆菌的过度繁殖很难被控制，成为影响转化的限制因素。为了抑制农杆菌在液体培养基中的过度繁殖，本发明使用溶菌酶消化农杆菌的细胞壁，再使用头孢噻肟、羧苄青霉素、特美汀抑制甚至杀死裸露的农杆菌菌体。本发明可高效、稳定地抑制NLN13高糖液体培养基中的农杆菌，克服了液体培养基中农杆菌过度繁殖难以控制的缺点，保障了遗传转化顺利进行。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域，具体为一种在液体高糖培养基中抑制农杆菌的方法。
背景技术
随着植物游离小孢子培养技术日渐成熟，小孢子及小孢子胚的遗传转化正成为热点。游离小孢子一般培养于高糖的液体培养基中。在液体环境里，农杆菌的过度繁殖很难被控制，成为转化后再生的限制因素。研发高糖液体培养基中抑制农杆菌的方法，是转化成功的关键。细菌的细胞壁可被溶菌酶降解，去除细胞壁后的裸露菌体对抗生素十分敏感。基于这一原理，利用溶菌酶消化农杆菌的细胞壁，再使用头孢噻肟，羧苄青霉素，特美汀等抗生素杀死裸露的农杆菌菌体，是控制液体培养基中农杆菌过度繁殖的重要思路。
发明内容
针对相关技术中的问题，本发明提出一种在液体高糖培养基中抑制农杆菌的方法，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题，本发明的目的是为游离小孢子的遗传转化研究、转基因DH系的建立提供技术支撑。农杆菌的细胞壁中含有纤维素；去除细胞壁后的裸露菌体对抗生素十分敏感。因此，利用溶菌酶消化农杆菌的细胞壁，再使用抗生素杀死裸露的农杆菌菌体，是控制液体培养基中农杆菌过度繁殖的重要思路。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种在液体高糖培养基中抑制农杆菌的方法，使用纤维素酶降解小孢子外壁，溶菌酶消化农杆菌的细胞壁，再使用头孢噻肟，羧苄青霉素，特美汀抑制裸露的农杆菌菌体。
一种在液体高糖培养基中抑制农杆菌的方法，包括以下具体步骤：
步骤一：植株现蕾后，选择健壮植株的花序，26-32个花蕾为一组，放置在100ml小烧杯中；
步骤二：对步骤一中的花蕾用体积分数为70％的乙醇进行表面消毒，所述消毒的时间为20-30s，然后用2％Bleach溶液消毒12-15min，所述Bleach 溶液的组分由次氯酸钙和水组成；
步骤三：将步骤二中经过消毒后的花蕾再用无菌水洗涤3-4次，依次 1-3min、4-8min和9-12min，再加入少量NLN液体培养基，并用无菌研棒碾压花蕾，直至碾压出小孢子；
步骤四：对步骤三中碾压后的花蕾用30-45μm孔径的尼龙网进行过滤，除去残余组织；再对沉淀物加4-6mL B5洗涤培养基，充分摇晃洗涤，80-120rpm 离心，重复三次；弃去上清液，所得黄色沉淀物即为纯净小孢子；
步骤五：通过血球计数板对步骤四中的纯净小孢子计数细胞密度，保持小孢子悬浮液体积为10ml，细胞密度约40×103个·mL-1；
步骤六：向小烧杯中依次加入纤维素酶和溶菌酶；
步骤七：再向小烧杯中依次加入头孢噻肟和羧苄青霉素，并观察小烧杯中小孢子胚的生长发育是否被抑制；
步骤八：然后向小烧杯中依次加入卡那霉素和PPT，并观察小孢子胚的生长发育是否被影响；
步骤九：吸取OD值为1.0的农杆菌1ul加入10ml含有不同浓度纤维素酶的小孢子悬浮液中，10-4稀释，以每皿1.0mL小孢子悬浮液分装入直径为 30mm的无菌一次性培养皿内，用封口膜封口；
步骤十：将步骤九中的无菌一次性培养皿放入32℃恒温箱中，精确热激处理22-26h，温差不超过0.1℃；
步骤十一：热激后的小孢子再转移至22-28℃，静置暗培养一周，转化后的一周内，通过荧光体视解剖镜持续跟踪荧光标记的表达情况；
步骤十二：一周后，收集小孢子，用0.01％溶菌酶洗涤一次，消化农杆菌细胞壁，再用含有300mg/L特美汀的NLN13洗涤两次，最后用含有特美汀100mg/L以及相应抗生素的NLN13培养基25℃持续暗培养，每周更换新鲜培养基；
步骤十三：3周后，在培养皿边缘处发现子叶形小孢子胚，在解剖镜下，统计小孢子胚的数量，并计算小孢子胚胎发生率，待再生出植株后，通过报告基因的PCR条带，确定转化子，统计转化效率。
优选的，步骤七中，所述头孢噻肟浓度梯度为：0、50、100、200mg/L，所述羧苄青霉素浓度梯度为0、125、250、500mg/L。
优选的，步骤六中，所述纤维素酶的质量百分终浓度梯度设置为0、 0.0035％、0.007％、0.014％、0.07％、0.12％、0.35％，所述溶菌酶的质量百分终浓度为0、0.01％、0.5％、1.25％。
优选的，步骤八中，所述卡那霉素的浓度梯度为0、25、50、100mg/L，所述PPT的浓度梯度为0、7.5、15、90mg/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明为一种在液体高糖培养基中抑制农杆菌的方法，使用溶菌酶消化农杆菌的细胞壁，再使用头孢噻肟、羧苄青霉素、特美汀抑制甚至杀死裸露的农杆菌菌体，本发明可高效、稳定地抑制NLN13高糖液体培养基中的农杆菌，克服了液体培养基中农杆菌过度繁殖难以控制的缺点，保障了遗传转化顺利进行。
附图说明
图1是本发明中的纤维素酶浓度梯度对FT小孢子胚在NLN13中的影响；
图2是本发明中的溶菌酶浓度梯度对FT小孢子胚在NLN13中的影响；
图3是本发明中的PPT浓度梯度对FT小孢子胚在NLN13中的影响；
图4是本发明中的kanamycin浓度梯度对FT小孢子胚在NLN13中的影响；
图5是本发明中的Cefotaxime浓度梯度对FT小孢子胚在固体培养基上的影响；
图6是本发明中的Carbenicillin浓度梯度对FT小孢子胚在NLN13液体培养基上的影响；
图7是本发明中的Carbenicillin和timentin共同浓度梯度对FT小孢子胚在NLN13中的影响；
图8是本发明的侵染后2d小孢子GFP荧光检测结果；
图9是本发明的平板上转化后的小孢子胚。
具体实施方式
一种在液体高糖培养基中抑制农杆菌的方法，使用纤维素酶降解小孢子外壁，溶菌酶消化农杆菌的细胞壁，再使用头孢噻肟，羧苄青霉素，特美汀抑制裸露的农杆菌菌体。
一种在液体高糖培养基中抑制农杆菌的方法，包括以下具体步骤：
步骤一：植株现蕾后，选择健壮植株的花序，26-32个花蕾为一组，放置在100ml小烧杯中；
步骤二：对步骤一中的花蕾用体积分数为70％的乙醇进行表面消毒，所述消毒的时间为20-30s，然后用2％Bleach溶液消毒12-15min，所述Bleach 溶液的组分由次氯酸钙和水组成，具体的，在消毒的过程中，将小烧杯进行震动，赶走花蕾表面气泡，确保除菌效果；
步骤三：将步骤二中经过消毒后的花蕾再用无菌水洗涤3-4次，依次 1-3min、4-8min和9-12min，再加入少量NLN液体培养基，并用无菌研棒碾压花蕾，直至碾压出小孢子；
步骤四：对步骤三中碾压后的花蕾用30-45μm孔径的尼龙网进行过滤，除去残余组织；再对沉淀物加4-6mL B5洗涤培养基，充分摇晃洗涤，80-120rpm 离心，重复三次；弃去上清液，所得黄色沉淀物即为纯净小孢子；
步骤五：通过血球计数板对步骤四中的纯净小孢子计数细胞密度，保持小孢子悬浮液体积为10ml，细胞密度约40×103个·mL-1；
步骤六：向小烧杯中依次加入纤维素酶和溶菌酶，所述纤维素酶的质量百分终浓度梯度设置为0、0.0035％、0.007％、0.014％、0.07％、0.12％、0.35％，所述溶菌酶的质量百分终浓度为0、0.01％、0.5％、1.25％，具体的，纤维素酶用于降解小孢子外壁，溶菌酶用于降解农杆菌的细胞壁，溶菌酶可消化农杆菌的细胞壁，使得抗生素抑制农杆菌的效果增强；
步骤七：再向小烧杯中依次加入头孢噻肟和羧苄青霉素，并观察小烧杯中小孢子胚的生长发育是否被抑制，所述头孢噻肟浓度梯度为：0、50、100、 200mg/L，所述羧苄青霉素浓度梯度为0、125、250、500mg/L，具体的，头孢噻肟和羧苄青霉素可以抑制农杆菌的生长、繁殖；
步骤八：然后向小烧杯中依次加入卡那霉素和PPT，并观察小孢子胚的生长发育是否被影响，所述卡那霉素的浓度梯度为0、25、50、100mg/L，所述 PPT的浓度梯度为0、7.5、15、90mg/L；
步骤九：吸取OD值为1.0的农杆菌1ul加入10ml含有不同浓度纤维素酶的小孢子悬浮液中，10-4稀释，以每皿1.0mL小孢子悬浮液分装入直径为 30mm的无菌一次性培养皿内，用封口膜封口；
步骤十：将步骤九中的无菌一次性培养皿放入32℃恒温箱中，精确热激处理22-26h，温差不超过0.1℃；
步骤十一：热激后的小孢子再转移至22-28℃，静置暗培养一周，转化后的一周内，通过荧光体视解剖镜持续跟踪荧光标记的表达情况；
步骤十二：一周后，收集小孢子，用0.01％溶菌酶洗涤一次，消化农杆菌细胞壁，再用含有300mg/L特美汀的NLN13洗涤两次，最后用含有特美汀 100mg/L以及相应抗生素的NLN13培养基25℃持续暗培养，每周更换新鲜培养基；
步骤十三：3周后，在培养皿边缘处发现子叶形小孢子胚，在解剖镜下，统计小孢子胚的数量，并计算小孢子胚胎发生率，待再生出植株后，通过报告基因的PCR条带，确定转化子，统计转化效率。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
请参阅图1-图9所示，本发明提供一种在液体高糖培养基中抑制农杆菌的方法的技术方案：
在本实施例中，芸苔属植物FT小孢子采自荷兰瓦赫宁根大学研究中心 klima试验场。
1、试材准备
(1)将种子催芽，露白后，2～4℃低温处理20天，在温室中将萌动种子播于穴盘，在开花期取材。
2、小孢子粗提液制备
步骤一：植株现蕾后，选择健壮植株的花序，30个花蕾为一组，放置在 100ml小烧杯中；
步骤二：对步骤一中的花蕾用体积分数为70％的乙醇进行表面消毒，所述消毒的时间为20s，然后用2％Bleach溶液消毒13min，所述Bleach溶液的组分由次氯酸钙和水组成；
步骤三：将步骤二中经过消毒后的花蕾再用无菌水洗涤3次，依次2min、 5min和11min，再加入少量NLN液体培养基，并用无菌研棒碾压花蕾，直至碾压出小孢子；
步骤四：对步骤三中碾压后的花蕾用35μm孔径的尼龙网进行过滤，除去残余组织；再对沉淀物加5mL B5洗涤培养基，充分摇晃洗涤，90rpm离心，重复三次；弃去上清液，所得黄色沉淀物即为纯净小孢子；
步骤五：通过血球计数板对步骤四中的纯净小孢子计数细胞密度，保持小孢子悬浮液体积为10ml，细胞密度约40×103个·mL-1；
3、纤维素酶、溶菌酶、抗生素浓度梯度设置
步骤一：向小烧杯中依次加入纤维素酶和溶菌酶，所述纤维素酶的质量百分终浓度梯度设置为0、0.0035％、0.007％、0.014％、0.07％、0.12％、0.35％，所述溶菌酶的质量百分终浓度为0、0.01％、0.5％、1.25％；
步骤二：再向小烧杯中依次加入头孢噻肟和羧苄青霉素，并观察小烧杯中小孢子胚的生长发育是否被抑制，所述头孢噻肟浓度梯度为：0、50、100、 200mg/L，所述羧苄青霉素浓度梯度为0、125、250、500mg/L；
步骤三：然后向小烧杯中依次加入卡那霉素和PPT，并观察小孢子胚的生长发育是否被影响，所述卡那霉素的浓度梯度为0、25、50、100mg/L，所述 PPT的浓度梯度为0、7.5、15、90mg/L。
4、农杆菌介导的遗传转化
吸取OD值为1.0的农杆菌1ul加入10ml含有不同浓度纤维素酶的小孢子悬浮液中，10-4稀释，以每皿1.0mL小孢子悬浮液分装入直径为30mm的无菌一次性培养皿内，用封口膜封口。
5、热激处理与暗培养
步骤一：将无菌一次性培养皿放入32℃恒温箱中，精确热激处理24h，温差不超过0.1℃；
步骤二：热激后的小孢子再转移至25℃，静置暗培养一周，转化后的一周内，通过荧光体视解剖镜持续跟踪荧光标记的表达情况。
6、抑菌处理
步骤一：一周后，收集小孢子，用0.01％溶菌酶洗涤一次，消化农杆菌细胞壁，再用含有300mg/L特美汀的NLN13洗涤两次，最后用含有特美汀 100mg/L以及相应抗生素的NLN13培养基25℃持续暗培养，每周更换新鲜培养基；
步骤二：3周后，可在培养皿边缘处发现子叶形小孢子胚，在解剖镜下，统计小孢子胚的数量，并计算小孢子胚胎发生率，待再生出植株后，通过报告基因的PCR条带，确定转化子，统计转化效率，转移至MS固体培养基，成苗后进行基因型检测。
本发明通过使用溶菌酶消化农杆菌的细胞壁，再使用头孢噻肟、羧苄青霉素、特美汀抑制甚至杀死裸露的农杆菌菌体。本发明可高效、稳定地抑制 NLN13高糖液体培养基中的农杆菌，克服了液体培养基中农杆菌过度繁殖难以控制的缺点，保障了遗传转化顺利进行。
在图8中，A：DAPI染色对照，B：GFP荧光信号。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“同轴”、“底部”、“一端”、“顶部”、“中部”、“另一端”、“上”、“一侧”、“顶部”、“内”、“前部”、“中央”、“两端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置”、“连接”、“固定”、“旋接”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种在液体高糖培养基中抑制农杆菌的方法，其特征在于，使用纤维素酶降解小孢子外壁，溶菌酶消化农杆菌的细胞壁，再使用头孢噻肟，羧苄青霉素，特美汀抑制裸露的农杆菌菌体。
2.根据权利要求1所述的一种在液体高糖培养基中抑制农杆菌的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
步骤一：植株现蕾后，选择健壮植株的花序，26-32个花蕾为一组，放置在100ml小烧杯中；
步骤二：对步骤一中的花蕾用体积分数为70％的乙醇进行表面消毒，所述消毒的时间为20-30s，然后用2％Bleach溶液消毒12-15min，所述Bleach溶液的组分由次氯酸钙和水组成；
步骤三：将步骤二中经过消毒后的花蕾再用无菌水洗涤3-4次，依次1-3min、4-8min和9-12min，再加入少量NLN液体培养基，并用无菌研棒碾压花蕾，直至碾压出小孢子；
步骤四：对步骤三中碾压后的花蕾用30-45μm孔径的尼龙网进行过滤，除去残余组织；再对沉淀物加4-6mL B5洗涤培养基，充分摇晃洗涤，80-120rpm离心，重复三次；弃去上清液，所得黄色沉淀物即为纯净小孢子；
步骤五：通过血球计数板对步骤四中的纯净小孢子计数细胞密度，保持小孢子悬浮液体积为10ml，细胞密度约40×103个·mL-1；
步骤六：向小烧杯中依次加入纤维素酶和溶菌酶；
步骤七：再向小烧杯中依次加入头孢噻肟和羧苄青霉素，并观察小烧杯中小孢子胚的生长发育是否被抑制；
步骤八：然后向小烧杯中依次加入卡那霉素和PPT，并观察小孢子胚的生长发育是否被影响；
步骤九：吸取OD值为1.0的农杆菌1ul加入10ml含有不同浓度纤维素酶的小孢子悬浮液中，10-4稀释，以每皿1.0mL小孢子悬浮液分装入直径为30mm的无菌一次性培养皿内，用封口膜封口；
步骤十：将步骤九中的无菌一次性培养皿放入32℃恒温箱中，精确热激处理22-26h，温差不超过0.1℃；
步骤十一：热激后的小孢子再转移至22-28℃，静置暗培养一周，转化后的一周内，通过荧光体视解剖镜持续跟踪荧光标记的表达情况；
步骤十二：一周后，收集小孢子，用0.01％溶菌酶洗涤一次，消化农杆菌细胞壁，再用含有300mg/L特美汀的NLN13洗涤两次，最后用含有特美汀100mg/L以及相应抗生素的NLN13培养基25℃持续暗培养，每周更换新鲜培养基；
步骤十三：3周后，在培养皿边缘处发现子叶形小孢子胚，在解剖镜下，统计小孢子胚的数量，并计算小孢子胚胎发生率，待再生出植株后，通过报告基因的PCR条带，确定转化子，统计转化效率。
3.根据权利要求2所述的一种在液体高糖培养基中抑制农杆菌的方法，其特征在于，步骤七中，所述头孢噻肟浓度梯度为0、50、100、200mg/L，所述羧苄青霉素浓度梯度为0、125、250、500mg/L。
4.根据权利要求2所述的一种在液体高糖培养基中抑制农杆菌的方法，其特征在于，步骤六中，所述纤维素酶的质量百分终浓度梯度设置为0、0.0035％、0.007％、0.014％、0.07％、0.12％、0.35％，所述溶菌酶的质量百分终浓度为0、0.01％、0.5％、1.25％。
5.根据权利要求2所述的一种在液体高糖培养基中抑制农杆菌的方法，其特征在于，步骤八中，所述卡那霉素的浓度梯度为0、25、50、100mg/L，所述PPT的浓度梯度为0、7.5、15、90mg/L。
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