CN105830922A - 一种促进白菜小孢子胚发生和直接成苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种促进白菜小孢子胚发生和直接成苗的方法，以解决现有小孢子培养技术中小孢子胚胎发生率低、直接成苗率低、培养周期长的问题。通过向诱导培养基NLN中添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂—曲古抑菌素A(TSA，TrichostatinA)，以提高白菜小孢子胚胎发生率和直接成苗率。在添加0.025μM~0.10μM TSA的NLN诱导培养基中，白菜的小孢子胚胎发生率提高了1.46~2.48倍，直接成苗率提高了1.12~1.39倍。培养基为NLN培养基+0.025μM~0.10μM TSA+130 g·L‑1蔗糖+100μL灭菌后的琼脂糖0.5g·L‑1、活性炭10g·L‑1的混合液。

Description

一种促进白菜小孢子胚发生和直接成苗的方法
技术领域
本发明涉及白菜游离小孢子培养方法，属于细胞育种技术领域，是一种促进白菜小孢子胚发生和直接成苗的方法。
背景技术
白菜（Brassica rapa. ssp. chinensisL.）属典型的十字花科异花传粉植物，有显著的杂种优势。要利用优势杂交育种必须先纯化亲本，传统的连续自交方式所需的时间较长，费工、费力；利用游离小孢子培养方法获得纯合体的时间只需要一年，即节省了时间，又减轻了工作量，并且通过这种方式培育出的再生植株不仅可以创制出新的育种材料，而且植株的世代间稳定性强，杂种优势也强。近几十年国内外一些研究者关于十字花科蔬菜游离小孢子培养做了大量工作，致力于优化小孢子成胚和胚状体成苗体系，但目前尚有许多基因型小孢子的胚胎发生率低以及胚状体成苗率低，限制了这一技术在实际育种工作中的应用范围。
TSA是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，其通过抑制去乙酰化酶的活性来提高组蛋白的乙酰化程度，目前有关TSA的应用主要是在临床抗肿瘤药物或动物胚胎上的作用，其与细胞分化和细胞增殖有关。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过改良白菜游离小孢子培养的培养基配方促进白菜小孢子的胚胎发生及直接成苗的方法，以建立高效的白菜游离小孢子培养体系，为育种工作奠定基础。
本发明提供的促进白菜小孢子胚胎发生及直接成苗的方法，包括如下步骤：
1.选取白菜小孢子发育时期在单核靠边期至双核早期的花蕾，此时花蕾的特征为花瓣长度与花药长度的比值在1/2～3/4之间，用流水冲洗花蕾2～3次后，将花蕾放入灭过菌的100mL烧杯内，用浓度75%乙醇溶液表面灭菌30s，0.1% HgCl2溶液表面灭菌6～8min，无菌水洗涤3次，每次5min，再加入10～15mL含130 g·L-1蔗糖的B5液体培养基，用无菌研棒挤压花蕾，使小孢子游离出来。将含有小孢子的悬浮液先用300目细胞筛过滤，再用500目的细胞筛过滤，收集滤液于50mL离心管中，1000～1200 rpm离心3 min。弃上清液，加入10～15mL含130 g·L-1蔗糖的B5液体培养基，1000～1200 rpm离心3 min，所得沉淀物即为纯净的小孢子。
2.将游离出纯净的小孢子沉淀物用常规的NLN培养基进行稀释培养。在稀释时使细胞密度保持在1×105～2×105个/mL(用血球计数板计数)，将每5 mL小孢子悬浮液分装入为60 mm×15 mm的无菌玻璃培养皿内， 每皿添加100μL灭菌后的琼脂糖0.5g·L-1、活性炭10g·L-1的混合液；添加用二甲基亚砜（DMSO）溶解过滤灭菌后的不同浓度TSA（0、0.025、0.050、0.075、0.100μM）。用石蜡膜封口后，先在33℃恒温箱中热激处理1d，再转至25℃下静置暗培养，9～10天后肉眼可见球型胚，连同培养皿转移到25℃摇床上暗培养，摇床转数为50rpm。
3.在接种小孢子后第18天转接胚状体到添加30 g·L-1蔗糖，7.5 g·L-1琼脂，0.1g·L-1活性炭的MS培养基上，其pH为5.8～6.0，高温湿热灭菌。接种量为每100mL广口三角瓶含50mL培养基接种3～5个胚状体；于25±1℃，16h小时光照/天条件下培养；15～20天后胚状体发育为根、茎、叶明显健壮的小苗。
4.B5培养基配方：pH 5.8～5.84，溶剂为超纯水，溶质及其终浓度分别为(NH4)2SO40.134g·L-1，KNO3 0.25g·L-1，CaCl2·2H2O 0.15g·L-1，MgSO4·7H2O 0.25g·L-1，NaH2PO4·H2O 0.15g·L-1，MnSO4·4H2O 0.01g·L-1，ZnSO4·7H2O 0.002g·L-1，H3BO30.003g·L-1，Na2MnO4·2H2O 0.00025g·L-1，KI 0.00075g·L-1，CuSO4·5H2O 0.000025g·L-1，CoCl2·6H2O 0.000025g·L-1，VB1 0.01g·L-1，VB6 0.001g·L-1，烟酸0.001g·L-1，肌醇0.1g·L-1，Na2EDTA 0.0373g·L-1，FeSO4·7H2O 0.0278g·L-1，蔗糖130g·L-1，高温湿热灭菌。
5.NLN培养基配方：pH 5.8～5.84，溶剂为超纯水，溶质及其终浓度分别为Ca(NO3)2·4H2O 0.025g·L-1，MgSO4·7H2O 0.0625g·L-1，KNO3 0.0625g·L-1，KH2PO40.0625g·L-1，MnSO4·4H2O 0.0223g·L-1，ZnSO4·7H2O 0.0086g·L-1，H3BO3 0.0062g·L-1，KI 0.00083g·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.00025g·L-1，CuSO4·5H2O 0.000025g·L-1，CoCl2·6H2O 0.000025g·L-1，盐酸硫胺素0.005g·L-1，盐酸吡哆醇0.0005g·L-1，肌醇0.1g·L-1，烟酸0.005g·L-1，叶酸0.0005g·L-1，甘氨酸0.002g·L-1，生物素0.00005g·L-1，Na2EDTA0.0373g·L-1，FeSO4·7H2O 0.0278g·L-1，蔗糖130 g·L-1，谷胱甘肽0.03g·L-1，L—丝氨酸0.1g·L-1，L—谷氨酰胺0.8g·L-1，过滤灭菌。
6.MS培养基配方：pH 5.8，溶剂为蒸馏水，溶质及其终浓度分别为NH4NO31.65g·L-1，KH2PO4 0.17g·L-1，KNO3 1.9g·L-1，MgSO4·7H2O 0.37g·L-1，CaCl2 0.33g·L-1，MnSO4·4H2O 0.0169g·L-1，H3BO3 0.0062g·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.00025g·L-1，CuSO4·5H2O 0.000025g·L-1，CoCl2·6H2O 0.000025g·L-1，KI 0.00083g·L-1，ZnSO4·7H2O0.0086g·L-1 ，盐酸硫胺素0.0004g·L-1，盐酸吡哆素0.0005g·L-1，烟酸0.0005g·L-1，肌醇0.1g·L-1，甘氨酸0.002g·L-1，Na2EDTA 0.0373g·L-1，FeSO4·7H2O 0.0278g·L-1，蔗糖30g·L-1，琼脂5.5g·L-1，活性炭0.1 g·L-1，高温湿热灭菌。
本发明的积极效果：
1.通过在胚状体诱导阶段在NLN诱导培养基中添加0.025μM ~0.10μM TSA，促进了白菜的小孢子胚胎发生，小孢子胚胎发生率最高达25.14胚/蕾，比对照提高了1.46 ~ 2.48倍。
2.从接种白菜小孢子到获得再生植株只需要35天左右，在添加0.025μM TSA的NLN诱导培养基中，白菜的直接成苗率最高，达到了81.51%，在添加0.05μM TSA的NLN诱导培养基中，白菜的直接成苗率次之，达到了78.33%，比对照提高了1.12~1.39倍。
3.操作简单易行，只需在诱导阶段加入特定浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂—曲古抑菌素A(TSA)，既可以对小孢子的胚发生产生促进作用，又可以对胚状体成苗产生促进作用。
附图说明
图1 为白菜华冠基因型NLN培养基中加入0.025μM TSA产生的胚状体。
图2为接种到MS培养基上的胚状体。
图3为胚状体直接成苗。
具体实施方式
下述实施例所述方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例所述试剂，如无特殊说明均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的培养基同发明内容中的B5，NLN，MS培养基。
本发明所述的白菜小孢子培养方法主要过程包括：
一、游离小孢子培养过程
选取白菜小孢子发育时期在单核靠边期至双核早期的花蕾，此时花蕾的特征为花瓣长度与花药长度的比值在1/2～3/4之间，用流水冲洗花蕾2～3次后，将花蕾放入灭过菌的100mL烧杯内，用75%乙醇溶液表面灭菌30s，0.1% HgCl2溶液表面灭菌6～8min，无菌水洗涤3次，每次5min，再加入10～15mL含130 g·L-1蔗糖的B5液体培养基，用无菌研棒挤压花蕾，使小孢子游离出来。将含有小孢子的悬浮液先用300目细胞筛过滤，再用500目的细胞筛过滤，收集滤液于50mL离心管中，1000～1200 rpm离心3 min。弃上清液，加入10～15mL含130g·L-1蔗糖的B5液体培养基，1000～1200 rpm离心3 min，所得沉淀物即为纯净的小孢子。
将游离出纯净的小孢子沉淀物用常规的NLN培养基进行稀释培养。在稀释时使细胞密度保持在1×105～2×105个/mL(用血球计数板计数)，将每5 mL小孢子悬浮液分装入为60 mm×15 mm的无菌玻璃培养皿内, 每皿添加100μL灭菌后的琼脂糖0.5g·L-1、活性炭10g·L-1的混合液。用石蜡膜封口后，先在33℃恒温箱中热激处理1d，再转至25℃下静置暗培养，9～10天后肉眼可见球型胚，连同培养皿转移到25℃摇床上暗培养，摇床转数为50rpm。
在接种小孢子后第18天转接胚状体到添加30 g·L-1蔗糖，7.5 g·L-1琼脂，0.1g·L-1活性炭的MS培养基上，其pH为 5.8～6.0，高温湿热灭菌，平均每3d观察一次，记录每个胚的成长情况，同时对直接成苗、次生胚、愈伤组织的数目进行统计。
二、组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA的处理
向NLN培养基中加入不同浓度的TSA，浓度为0、0.025、0.05、0.075、0.1μM。用石蜡膜封口后，先在33℃恒温箱中热激处理1d，再转至25℃下静置暗培养，至肉眼可见胚状体后，再转移到摇床上（50rpm）继续暗培养。21d后统计胚状体数目，小孢子胚诱导率以每个花蕾产生胚状体数表示。
本发明经试验研究，其结果报告如下：
1材料：供试白菜品种3个，包括沃尔918、华冠和博雅。
2试验方法及培养基
2.1试验方法同（一、游离小孢子培养过程）。
2.2 NLN培养基：添加130 g·L-1蔗糖，pH为5.8。添加的组蛋白去乙酰化酶抑制剂——曲古抑菌素A(TSA)的处理，且过滤灭菌：TSA处理：浓度为0、0.025、0.05、0.075、0.1μM。MS培养基，添加30g·L-1蔗糖，7.5g·L-1琼脂，0.1 g·L-1活性炭，pH 为5.8，高温湿热灭菌。
3试验结果
3.1 TSA对白菜沃尔918、华冠和博雅基因型小孢子胚发生的影响（见图1、2）：
TSA对于白菜小孢子的胚胎发生有促进作用，与对照组相比，对于白菜沃尔918、华冠和博雅基因型小孢子胚胎发生率分别提高了2.31、1.46、2.48倍（表1），TSA对于白菜沃尔918基因型促进作用的最适浓度为0.075μM，小孢子胚胎发生率可达到5.47胚·蕾-1，对白菜华冠基因型最适浓度为0.05μM，小孢子胚胎发生率为8.54胚·蕾-1，对于白菜博雅基因型，TSA的最适浓度为0.025μM，小孢子胚胎发生率为25.14胚·蕾-1。
表1 TSA对白菜小孢子胚胎发生的影响
Table 1 Effect of TSA on formation of microspore-derived embryos inpakchoi
注：不同小写字母为差异达显著(α= 0.05)水平
Note: The mean values that are followed by the different letters aresignificant at the 5% level
3.2 NLN诱导培养基中加入TSA对白菜沃尔918、华冠和博雅基因型小孢子胚状体成苗的影响（见图3）
表2 NLN诱导培养基中TSA浓度对沃尔918、华冠和博雅基因型胚状体成苗的影响
Table 2 The effects of SAHA on the plant regeneration in NLN medium
注：不同小写字母为差异达显著(α= 0.05)水平
Note: The mean values that are followed by the different letters aresignificant at the 5% level
在NLN诱导培养基中加入TSA，对3种基因型白菜成苗有促进作用（表2）。对白菜沃尔918基因型，当TSA浓度为0.075μM时，直接成苗率最高可达到69.28%，比对照提高了1.39倍；对白菜华冠基因型，加入的TSA的浓度为0.05μM时，胚状体直接成苗率较高，可达到78.33%，比对照提高了1.17倍。 白菜博雅基因型，当TSA的浓度为0.025μM， 直接成苗率为81.51%，比对照提高了1.12倍。

Claims (2)

1.一种促进白菜小孢子胚发生和直接成苗的方法，其特征包括如下步骤：
（1）小孢子培养
采用常规白菜游离小孢子培养方法分离纯化小孢子，用含TSA的浓度为0.025μM ~0.10 μM NLN培养基培养小孢子，小孢子密度为1×105～2×105个/mL NLN培养基；将每5 mL小孢子悬浮液分装入为60 mm×15 mm的无菌玻璃培养皿内, 每皿添加100μL灭菌后的琼脂糖0.5g·L-1、活性炭10g·L-1的混合液，用石蜡膜封口后，先在33℃恒温箱中热激处理1d，再转至25℃下静置暗培养，至肉眼可见胚状体后，再转移到转数为50rpm的摇床上继续暗培养；
（2）胚状体成苗
在接种小孢子后第18天转接胚状体到添加30 g·L-1蔗糖，7.5 g·L-1琼脂，0.1 g·L-1活性炭的MS培养基上，其pH为 5.8～6.0，高温湿热灭菌；接种量为每100mL广口三角瓶含50mL培养基接种5个胚状体；于25±1℃，16h小时光照/天条件下培养；15～20天后胚状体发育为根、茎、叶明显健壮的小苗。
2.根据权利要求1所述促进白菜小孢子胚发生和直接成苗的方法，其特征是：含TSA的NLN培养基为NLN培养基+0.025μM ~0.10μM TSA+130 g·L-1蔗糖+100μL灭菌后的琼脂糖0.5g·L-1、活性炭10g·L-1的混合液。
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