CN103141376A - 具有高抗性淀粉低直链淀粉的水稻种质的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有高抗性淀粉低直链淀粉的水稻种质的培育方法。是通过筛选的高抗性淀粉的水稻种质与具有优质高产的水稻种质杂交，获得F1杂种；然后通过花药培养，得到高频的稳定花药培养株系；对花药培养株系进行加倍处理，获得的种子进行抗性淀粉和直链淀粉的鉴定，筛选后获得聚合高抗性淀粉和低直链淀粉的优良性状的高产水稻种质，该方法的培育周期只有两年，而且使得类型的水稻材料愈伤组织的诱导率达到30%以上且分化率为40%，花药培养的平均再生率达到1.2%以上。

Description

具有高抗性淀粉低直链淀粉的水稻种质的培育方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是通过常规育种、生物技术育种以及功能成分的生理鉴定等有机结合，培育一种融合高抗性淀粉的优良食味品质水稻的育种方法。

技术背景

抗性淀粉(RS) 又称为抗酶性淀粉和抗消化淀粉。研究表明，在小肠内，RS 不能被消化吸收和提供葡萄糖，在大肠可被生理性细菌发酵，产生短链脂肪酸和气体。RS 在代谢特性上类似于膳食纤维，通过降低糖尿病患者饭后血糖值、控制体重、有效防止肠道疾病及降血脂等功效，从而降低一些慢性病( 如糖尿病、大肠癌及肥胖等) 的发病风险，并对防便秘、盲肠炎和痔疮也有重要的预防作用（Robertso DM,Bickerton AS, Louise DA,et al   .The American Journal of Clinical Nutrition,2005,82(3):559-567；Morita T, Hayashi J, MotoiH, et al.Journal of  Food Science.2005, 70S:179-185；Le Leu RK, Hu Y, Young GP .Gastroenterology;Digestive Disease Week and the 102nd Annual Meeting of the American Gastroenterological Association[C],2001, 20(5): A667；Birkett AM, Mathers JC, Jones GP, et al  Br J Nutr  2000,84:63-72）。

RS研究开发最初是通过物理化学方法( 压热、微波辐射、脱支等) 从淀粉原料中制备RS产品（徐丹鸿, 徐红华.抗性淀粉制备及其性质研究.粮食与油脂,2005, 4: 9-11），但是这种加工方法，成本高，得到的RS产品价格昂贵。目前国外开展的RS产品研究，多是以玉米、小麦和土豆作为原料，而利用水稻作为RS产品原料的并不多，究其原因是由于水稻虽然含70%-80%的淀粉，在3大粮食作物中淀粉含量最高，但稻米中RS含量很低，热米饭中RS含量一般低于1，冷米饭中RS含量也仅为1.0～2.1％（赵国华．抗性淀粉．粮食与油脂，1999，(2)：3-6），特别对于以优质和高产为育种目标的主推良种，RS就更低。因此，筛选高RS水稻资源是丰富RS原料的有效途径。

目前有关水稻资源筛选RS的工作已经开展，研究表明：高RS水稻资源多来自云南，但是高RS的特色资源多是直链淀粉含量也比较高的籼稻，直链淀粉含量高达20%以上，不仅口感差，表现为垩白率较高、食味品质和蒸煮品质欠佳等严重地影响大米的品质的形状，而且多是农家种，产量潜力很低，多为亩产100kg/亩，（王艳平, 李华勇, 方先文, 林　静，不同来源水稻种质的直链淀粉含量多样性分析，金陵科技学院学报，2010，26（3）：39-42），而且由于RS含量测定的费用较高，批量筛选RS的工作需要大量经费支持，这些已经筛选出的高RS的农家种或地方品种，与现代主产水稻品种中，平均亩产500kg的产量相比，尤其亩产800kg的超级稻品种，均相距甚远，直接利用现有高RS水稻资源的可能性很小，农民种植这些特色资源兴趣也不大，上述原因导致目前高RS水稻产品供应严重匮乏。因此，尽快培育出RS含量高且产量性状优质的高产水稻材料，将是满足功能水稻食品需求的重要手段之一（苏宁, 万向元, 翟虎渠, 等.功能型水稻研究现状和发展趋向.中国农业科学, 2007, 40( 3) : 433-439）。

近几年来，国内外水稻育种者尝试通过化学诱变和辐射诱变等方法，创制富含RS的突变体，但目前并没有报道出生产上可用的材料（郭书巧, 唐海娟, 王州飞.籼粳杂交F1 高效花药培养技术体系的建立.南京农业大学学报.2006, 29(2): 1-5：M．Hofer．In vitro androgenedsis in apple-improvement of the induction phase．Plant Cell Reports，2004(22):365-370），并对RS相关的分子标记进行了初步研究，看出了抗性淀粉与直链淀粉的相关性（牟方贵，闫宗武，冉瑞林，滕建勋，陈永波，杨朝柱，李明辉，吴殿星，水稻抗性淀粉相关SSR标记的初步研究，分子植物育种，2008，6（3）：432—438）；美国路易斯安那州南部研究中心也发明了一种以大米为基质的RS 产品（Darbani B, Eimanifar A, Stewart C. et al．Methods to produce marker-free transgenic plants．Biotechnol J，2007(2)：83-90），但转基因产品目前还存在基因安全性的公众认知度不高以及基因飘逸等潜在的问题，应用起来还有相当距离。因此，常规育种将是当前高RS水稻种质培育的安全和可行的方法之一。  

通过杂交育种，可将高RS材料与优质高产的水稻材料聚合是水稻优良性状聚合的一种重要方法。研究表明高RS材料多为籼稻（王艳平, 李华勇, 方先文, 林　静，不同来源水稻种质的直链淀粉含量多样性分析，金陵科技学院学报，2010，26（3）：39-42），而优良食味品质的水稻多是来源于日本的粳稻，比如江苏最好吃的大米粳稻南粳46（严凤根,丁瑞芬,余建明.粳稻新品种“南粳46”特征特性及苏南地区高产栽培技术.上海农业技术,2011(3):36-37,39），因此，对于聚合高RS和优质高产育种目标，水稻育种工作者将面临地理远源和籼粳杂交常遭遇的育性较低以及白化苗等世界性难题的困饶（Kumari M, Clarke H J, Small I，Siddique KHM. Albinism in plants: a major bottleneck in wide hybridization, androgenesis and doubled haploid culture.Critical Reviews in Plant Sciences,2009,28:393–409），培育的难度非常大。特别是RS含量的筛选需要对精米进行加热熟化等破坏性处理才能进行，这种破坏种子育性的鉴定方法，是在F1代筛选出高RS的水稻材料，无法继续选育，而导致常规选育工作中断；而只能通过常规杂交高世代的分离群体以及回交育种方式选育，不仅大大地增加筛选的水稻材料的工作量，而且又大大增加了RS含量测定的筛选成本，而经过F2代，群体性状严重分离，要想获得稳定的RS水稻种质，必须再经过多次回交等育种方法稳定，这个过程通常需要8-10年，可见，只通过常规杂交育种方法培育高RS功能材料也有很大的局限，尤其是短期要获得稳定、高产和高RS等聚合这3个优良性状的水稻材料，几乎是不可能实现的育种目标。

水稻花药培养技术是快速获得稳定远缘杂交F1代的方法，它可以打破物种的界限进行基因转移，增加遗传多样性。利用花药组织培养具有缩短育种年限优势，同时还可以快速获得符合育种目标的植株，提高育种效率。现阶段，水稻花药组织培养技术还是利用不同品种对外源激素的敏感性的不同而研制出一一对应的花药愈伤组织诱导的独特培养基配方，同时不同基因型材料的花药组织培养力差异巨大，愈伤组织的诱导率及分化率还普遍较低，特别是籼粳杂交子一代的花药培育的再生植株中白化苗的比例也非常高（Kumari M, Clarke H J, Small I，Siddique KHM. Albinism in plants: a major bottleneck in wide hybridization, androgenesis and doubled haploid culture.Critical Reviews in Plant Sciences,2009,28:393–409），目前水稻花药的平均再生率只有0.5%（郭书巧,唐海娟,王州飞.籼粳杂交F1高效花药培养技术体系的建立.南京农业大学学报.2006, 29 (2): 1-5）。水稻花药培养作为常规技术，高效应用到大规模水稻改良还需要技术的优化和提高，目前应用到高RS水稻资源的培育并未见报道。

发明内容  

本发明的目的在于：针对了目前的高RS亲本多为农家种，且是产量低且口感差的籼稻，而口感好的优质高产水稻多为粳稻。鉴于培育优质高产的高RS的水稻材料，将涉及地理远缘、籼粳杂交以及后代分离群体大等问题，而且籼粳杂交子一代水稻花药再生技术仍对基因型的高度依赖（包括因花药愈伤组织诱导率较低，分化率低以及白化苗较高等问题），均对现有高RS水稻材料的改良不相适应。本发明通过高RS亲本材料与优质高产亲本材料的选择，并对其籼粳稻子一代花药培养技术的优化，尤其是通过激素和理化因子的调优等，在2年内提供一种适合籼粳杂交和花药培养相结合的培育高RS高产新品种的水稻育种方法。

本发明的目的是这样实现的：一种具有高抗性淀粉低直链淀粉的水稻种质的培育方法，其特征在于：

a)以至少含有8%的RS的水稻材料为母本，与以直链淀粉含量不超过15%且单株产量不低于40g/株的，符合国标二级优质稻谷标准的水稻材料为父本进行杂交，获得F1杂种；

b)将F1杂种的单核靠边期花穗，即取剑叶抽出0.5-1厘米的花穗，经75%乙醇消毒后，装入塑料袋内，并经2-5天4℃低温预处理后，花药接种在愈伤组织诱导培养基上进行全暗培养，温度为26±1℃，培养约14-21 d后，获得愈伤组织；

c)将花药诱导出愈伤组织通过继代培养基培养后，再通过分化培养基分化为植株，或直接将花药诱导出的愈伤组织通过分化培养基分化为植株，得到稳定的花培株系；

d)花培株系的绿芽长出3叶后，转接入幼苗壮根培养基中生长15 d后，获得根系发达的茁壮试管苗；

e)试管苗经7 d温室练苗，移栽至简易大棚后，生长健壮的小苗15 d左右长出新的分蘖，用秋水仙素在茎节切口涂抹，进行加倍处理，然后移至大田发育成熟，收获二倍体植株结出饱满的种子；

f)将收获的种子在田间种植，到收获期，进行产量性状的考察，并对获得水稻株系的精米进行RS和直链淀粉含量的测定，筛选单株产量不低于40g/株，同时精米中RS大于5%、直链淀粉含量小于15.0%的稳定水稻株系，作为高RS的水稻种质；

所述的愈伤组织诱导培养基为：以N6大量元素、微量元素、有机成分和铁盐为基本组分，附加2，4-二氯苯氧乙酸1-1.5 mg/L +萘乙酸1.5-2.0 mg/L +激动素0.3 mg/L+脱落酸2 mg/L+脯氨酸100 mg/L+水解酪蛋白300 mg/L+白砂糖60g/L+琼脂条8g/L；

所述的继代培养基培养为以M8大量元素、微量元素、有机成分和铁盐为基本组分，白砂糖浓度为50g/L，琼脂条8g/L，附加0.5-1 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，2-2.5 mg/L激动素，2 mg/L脱落酸；

所述的分化培养基为以MS大量元素、微量元素、有机成分和铁盐为基本组分, 白砂糖浓度为30g/L，琼脂条8g/L，设置附加0.2-0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，2-2.5mg/L激动素细胞分裂素，2 -3mg/L脱落酸；

所述的幼苗壮根培养基为以MS大量元素、微量元素、有机成分和铁盐为基本组分，白砂糖浓度为30g/L，琼脂条8g/L；

上述各培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值5.9。

本发明中，所述的至少含有8%的RS的水稻材料是指：扎西玛，或白银单，或花绿丰；所述的直链淀粉含量不超过15%且单株产量不低于40g/株的，符合国标二级优质稻谷标准的水稻材料是指：南粳46，或武育粳3号，或Koshihikar。

本发明中，所述的将花药诱导出愈伤组织通过继代培养基培养后再通过分化培养基分化为植株是指：选取长均为0.5-1 cm、浅黄色、干燥以及颗粒状愈伤组织，在50ml的三角瓶中接入10个愈伤组织块，转入继代培养基，在2000lux的光强下，14h Light/D下培养， 14-21 d后，再选取培养后的浅黄色、干燥且颗粒状的愈伤组织，转入分化培养基培养，21-30d后，开始分化，长出绿芽；所述的直接将花药诱导出的愈伤组织通过分化培养基分化为植株，得到稳定的花培株系是指：选取长均为0.5-1 cm、浅黄色、干燥以及颗粒状愈伤组织，在50ml的三角瓶中接入10个愈伤组织块，接入分化培养基培养，21-30d后，开始分化，长出绿芽。

本发明的优点在于：克服了聚合多个基因可能带来的费用和沉默的不足，结合常规杂交，生理鉴定和花药培养的特点，形成了一种快速有效的植物育种方法。以水稻为例，随着人民生活水平的提高，培育高产优质的功能食品成为未来研究的重要方向，但是特殊的功能食品都是与独特代谢机制有关，是遗传和环境共同作用的结果，即使通过基因工程的现代生物技术也难以改良，而且还存在公众对转基因产品的认知程度，离推广应用还有相当的距离。本方法通过单个功能特征高RS含量与优质高产特征建立的对应关系，将2个材料进行简单的聚合，克服了多基因导入可能带来的沉默，常规单一杂交育种方法的长周期以及植物生态环境差异造成生理性状的不稳定等难题，通过高RS材料与优质高产水稻材料的杂交，通过花药培养，优化花药愈伤组织诱导和分化等培养基配方，快速稳定的获得高RS的水稻种质。本发明不仅花费低，又便于育种者实施，尤其是花药培养方法的优化，在本发明使用的培养基配方范围内，使该杂交F1的花药得到高达32.1%出愈率以及不低于40%分化率，花药培养的平均再生率达到1.2%以上，且整个培育周期只有2年，尤其对地理远源和籼粳杂交水稻F1代材料在花药培养中常遭遇的白化苗高的问题，也有很好的效果。通过本发明可以在2年内获得RS含量不低于5%，直链淀粉不高于15%，且单株产量不低于40g/株的水稻种质，可见，本发明的方法提高了籼粳杂交水稻花药组织培养愈伤诱导率和再生率，开拓了RS功能产品的培育方法，拓宽了通过生物技术改良栽培水稻基因型的范围，并将可能配组或育成新的聚合多个优良性状的优质水稻功能品种，从而提高了水稻生物技术育种效率。

附图说明

图1是不同基本培养基对杂交水稻F1花药愈伤组织诱导率的影响。

图2是不同蔗糖浓度对供试水稻花药愈伤组织出愈率的影响。

图3是不同4℃低温预处理时间对供试水稻花药愈伤诱导率的影响。

图4是不同低温处理条件下不同激素配比对水稻花药出愈率的影响。

图5是籼粳杂交F1水稻花药通过组织培养的再生体系。

图6展示了对籼粳杂交F1进行花药培养的再生体系，其中：a)花药培养在诱导培养基；b)花药培养在培养基上约21 d诱导形成愈伤组织；c)愈伤组织在继代培养；d)愈伤组织培养在再生培养基上约14-21 d出现绿点；e)再生培养基上绿点形成绿芽；f)再生植株。

具体实施方式

实施例1   扎西玛/南粳46的F1的获得

2011年5月在南京用扎西玛为母本，以南粳46为父本，获得500粒杂种F1种子，其中扎西玛是云南的地方品种，测定其大米的PS含量为8%，是高RS特色种质资源；南粳46是江苏省农科院粮作所以优质高产粳稻“武香粳14”为母本，与日本优质粳稻“关东194”杂交，属中熟晚粳稻类型优质高产粳稻品种，直链淀粉含量为15%，产量为50g/ /株。

实施例2  对扎西玛/南粳46的F1使用的各培养基的设计

a) 愈伤组织诱导培养基的设计

基本培养基的选择：

选择以下组分：白砂糖6%，琼脂条8g/L，附加2，4-二氯苯氧乙酸1-3.0 mg/L，萘乙酸 0.5-3.0 mg/L，激动素0.2-0.3 mg/L，设置了30 g/L和60 g/L两个白砂糖浓度，将它们分别与M8、N6和SK3的大量元素、微量元素、有机成分和铁盐成分为基本成分，组成六组分别组成花药愈伤组织诱导培养基。

上述各培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值5.9。

杂交水稻的F1代（由实施例1提供,下同）

试验方法：

2012年3月取供试水稻单核靠边期花穗，经1-10天4℃低温预处理后，花药接种在上述7种不同的愈伤组织诱导培养基上进行同步平行试验，每瓶接种50粒花药，每个处理做20瓶，进行全暗培养，温度为26±1℃，培养约30 d后，获得愈伤组织，计算愈伤组织诱导率：愈伤组织诱导率=（产生的愈伤组织花药/接种的花药数）×100%。

实验结果记录在图1~3中，从图1可以看出，在M8、N6作为基本培养基时，水稻花药愈伤组织诱导率显著高于SK3作为基本培养基的，且M8和N6在诱导水稻花药愈伤组织间，没有显著性差异。本发明实施例中均选用N6作为基本培养基。

由图2可见，比较设置30 g/L和60 g/L的2个蔗糖浓度，施加60g/L的蔗糖出愈率高，本发明实施例中均选用该浓度。

因此，花药愈伤组织诱导培养基中的基本培养基选用N6，白砂糖浓度选择60 g/L。

低温处理时间的选择：

试验方法：

选取水稻材料的低温处理时间是指取单核靠边期的花穗，即将F1杂种的单核靠边期花穗，取剑叶抽出0.5-1厘米的花穗，经75%乙醇消毒后装置塑料袋内，放入4℃冰箱低温处理1-10d后，分别将低温预处理后的花药接种在相同的花药愈伤组织诱导培养基上，每瓶接种50粒花药，每个处理做20瓶，进行全暗培养，温度为26±1℃，培养约30 d后，获得愈伤组织，计算愈伤组织诱导率：愈伤组织诱导率=（产生的愈伤组织花药/接种的花药数）×100%。

由图3可以看出，在不同低温处理天数下，经低温处理2 -5 d，出愈率达到8%，其中低温处理4 d后，出愈率达最高，即达11.82%，因此本发明选用低温预处理天数为2 -5 d。

激素的选择：

图4中各标号表示不同激素组合的水稻花药愈伤组织诱导培养基，其中：

诱导培养基A为：N6+1 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，3mg/L 萘乙酸。

诱导培养基B为：N6+1.5 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，2mg/L 萘乙酸。

诱导培养基C为：N6+1.5 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，2mg/L 萘乙酸,

0.3 mg/L激动素。

诱导培养基D为：N6+2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，1mg/L 萘乙酸。

诱导培养基E为：N6+2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，1mg/L 萘乙酸,

0.3 mg/L激动素。

诱导培养基F为：N6+3 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，1mg/L 萘乙酸。

诱导培养基G为：N6+3 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.5mg/L 萘乙酸,

0.3 mg/L激动素。

各组培养基中添加白砂糖6%，琼脂条8g/L，同时，各培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值5.9。

试验方法：

将F1杂种的单核靠边期花穗，取剑叶抽出0.5-1厘米的花穗，经75%乙醇消毒后装置塑料袋内，经低温预处理后，再用75% 乙醇的表面消毒，除去稻穗外鞘放入灭菌的三角瓶内。先用75%的乙醇消毒5 min, 再用0.1% 的HgCl₂消毒15 min后，再用无菌水漂洗3遍，将消毒的水稻稻穗，剪去颖壳，用镊子将有切口的颖壳，对准三角瓶的瓶口，敲入到不同的花药愈伤组织诱导培养基的三角瓶中，每瓶约50粒，以上操作均在超净工作台上无菌条件下进行。接种好花药的培养基放入培养室内，26℃- 28℃，黑暗条件下培养30 d，计算花药的出愈率，愈伤组织诱导率=（产生的愈伤组织花药/接种的花药数）×100%。

从图4表明，培养基B、C，D在本发明的低温预处理下，花药出愈率均达到10%以上，其中培养基中添加2 mg/L 2,4-D、1 mg/L NAA和0.3 mg/L激动素诱导率最高，达32.14%，本发明实施例中选用浓度范围为1-1.5 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+1.5-2.0 mg/L 萘乙酸+0.3 mg/L激动素。

综合上述数据，确定愈伤组织诱导培养基的最佳方案为：以N6为基本培养基，附加2，4-二氯苯氧乙酸1-1.5 mg/L +萘乙酸1.5-2.0 mg/L +激动素0.3 mg/L+脱落酸2 mg/L+脯氨酸100 mg/L+水解酪蛋白300 mg/L+白砂糖60g/L+琼脂条8g/L。

b) 分化培养基的设计

图5中各标号表示不同激素的分化培养基，其中：

A为：MS+2 mg/L 激动素，2mg/L 脱落酸。

B为：MS +2 mg/L 激动素，3mg/L 脱落酸。

C为：MS +0.2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，2.5mg/L 激动素,2 mg/L脱落酸。

D为：MS +0.5 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，2mg/L激动素,2 mg/L脱落酸。 

所述各组培养基中添加白砂糖6%，琼脂条8g/L，同时，各培养基在高压灭菌前，用氢氧化钠和盐酸调整pH值5.9。

试验方法

将试验组花药诱导愈伤组织的培养基中培养了30天的愈伤组织，选取长均为0.5-1cm、浅黄色、干燥且颗粒状愈伤组织，转入继代培养基光下培养，待增殖14-21 d后，再选取浅黄色、干燥且颗粒状愈伤组织转入分化培养基，21-30d后，开始分化。计算愈伤组织分化率：愈伤组织分化率=（产生的绿芽的愈伤组织/接种的愈伤组织数）×100%。

从图5可见，培养在诱导培养基上愈伤接种到分化培养基14-20d后，带绿芽点的愈伤组织在本发明的分化培养基上即可分化成植株，分化绿芽点，甚至可一步成苗，其中分化培养基A和C的分化率可达45.5%和46.9%。

因此，分化培养基的最佳选择为：以MS大量元素、微量元素、有机成分和铁盐为基本组分, 白砂糖浓度为30g/L，琼脂条8g/L，设置附加0.2-0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，2-2.5mg/L激动素，2 -3mg/L脱落酸。

c)其他培养基的选择：

继代培养基：以M8大量元素、微量元素、有机成分和铁盐为基本组分，白砂糖浓度为50g/L，琼脂条8g/L，附加0.5-1 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，2-2.5 mg/L激动素，2 mg/L脱落酸。

幼苗壮根培养基：以MS大量元素、微量元素、铁盐及有机成分为基本组分，白砂糖浓度为30g/L，琼脂条8g/L。

各培养基在高压灭菌前，用氢氧化钠和盐酸调整pH值5.9。

实施例3  花药诱导愈伤组织

愈伤组织诱导培养基（由实施例2的最佳方案提供）

将F1杂种的单核靠边期花穗，取剑叶抽出0.5-1厘米的花穗，经75%乙醇消毒后装置塑料袋内，经低温预处理3天后，稻穗取出。花药的接种操作均在超净工作台上无菌条件下进行：先用75% 乙醇的表面消毒，除去稻穗外鞘放入灭菌的三角瓶内。先用75%的乙醇消毒5 min, 再用0.1% 的HgCl₂消毒15 min后再用无菌水漂洗3遍，将消毒的水稻稻穗，剪去颖壳，用镊子将有切口的颖壳，对准三角瓶的瓶口，敲入到不同的花药愈伤组织诱导培养基的三角瓶中，每瓶约50粒。接种好的花药的培养基放入培养室内培养，26℃- 28℃，黑暗条件下培养30 d，即可获得浅黄色、干燥和颗粒状愈伤组织，出愈率为35%。

实施例4  愈伤组织的分化培养，获得试管苗

方案1

继代培养基：由实施例2提供。

分化培养基：由实施例2的分化培养基最佳方案提供。

选取长均为0.5-1 cm、浅黄色、干燥且颗粒状愈伤组织（实施例3提供），在50ml的三角瓶中接入10个愈伤组织块，转入继代培养基增殖，愈伤组织转接到继代培养基的操作，均在超净工作台上无菌条件下进行。在2000lux的光强下，14h Light/D下培养， 14-21 d后即可获得大量的愈伤组织，再选取浅黄色、干燥且颗粒状的愈伤组织，转入分化培养基培养，21-30d后，开始分化，长出绿芽，分化率为45%，并形成绿色花培株系。花药培养的再生率约14.8%。

方案2

分化培养基：由实施例2的分化培养基最佳方案提供。

选取长均为0.5-1 cm、浅黄色、干燥、颗粒状愈伤组织，在50ml的三角瓶中接入10个愈伤组织块，接入分化培养基，愈伤组织转接到分化培养基的操作，均在超净工作台上无菌条件下进行，21-30d后，开始分化，长出绿芽，形成花培株系。

花培株系的绿芽长出3叶植株后，转接入幼苗壮根培养基中生长15 d后，为增加植株的生长空间，选用500ml的塑料瓶作为培养器皿，即长出白色健壮的根系，选取根系发达的茁壮绿色试管苗，打开瓶口，加入水没过培养基，让试管苗在培养室内开放的空间内适应3天以上，保证培养基不断水，生长正常的植株即可用于开放空气中自然条件下种植。

实施例5 获得花培水稻的二倍体植株结出饱满的种子

试管苗再经7 天温室练苗，在南京水稻生长的正季-夏季即移栽至简易大棚后，待15 d天后，生长健壮的小苗即可长出新的分蘖，再用秋水仙素在茎节切口涂抹，进行加倍处理，然后移至大田发育成熟，收获二倍体植株结出饱满的种子。如果是在南京冬春季节，则移入温室，保证温度在25度以上，或者转移到同季海南水稻育种基地，大田常规栽培管理，成熟期收获种子。

为了获得稳定的花培材料的种子，花药诱导出的150株绿苗，2012年5月在南京种植，获得48株二倍体的植株，按单株收获种子（植株倍型是按照外部形态判定，单倍体：植株矮小，颖壳小，不结实；二倍体：结实正常；多倍体：植株较大、有芒、不结实或结实率极低）。

实施例6  稳定花药培养株系的高RS的获得

RS含量的测定：准确称取1.0g精米，加3 ml蒸馏水(确保煮后米饭中的水分含量在70%)，沸水中煮30 min，室温下冷却10 min，按照Megazyme RS测定试剂盒方法，加入胰腺α一淀粉酶，37℃水浴振荡消化16 h后，测定RS含量。

试验方法：

2012年10月将南京收获的48株二倍体的材料，分单株系在南京种植，每个株系用3个10L盆钵种植，15粒，每盆种5粒，在田间观察其稳定性发现，所有的株系都是稳定的，没有出现分离，正常田间管理，在收获期，进行产量性状的考察，并对精米进行RS和直链淀粉含量的测定。

结论：将获得的48株二倍体水稻植株，收获水稻种子，进行RS含量的测定，他们均在2-7%之间，证明花药培养是可快速稳定水稻的高RS特性。

进一步考察其产量性状，发现这些高RS材料与产量也有很好的相关性，最后筛选出6株株型良好、具有RS含量不低于5%，直链淀粉不低于19%，籽粒产量与高产亲本南粳46相当的纯系，定名为ZN，（ZN取分别为亲本扎西玛和南粳46的首字母缩写组成），5个株系为ZN-1，ZN-2，ZN-3，ZN-4，ZN-5（结果见表1），表明通过上述方法，快速获得具有RS的稳定材料。

表1 高抗性淀粉花药培养稳定水稻材料的鉴定

品种或组合	直链淀粉含量（%）	RS含量（%）	籽粒产量1000粒重（g）	单株产量（g）
					南粳46	15.0±0.5	0.5±0.04	22.2±1.2	50.06±2.02
扎西玛	28.1±0.6	8.1±0.07	23.4±1.3	20.03±0.56
					ZN-1	15.0±0.4	6.3±0.05	23.7±1.2	45.09±1.5
ZN-2	14.3±0.7	6.4±0.06	22.3±1.5	46.98±1.28
					ZN-3	14.9±0.6	5.1±0.05	22.9±1.6	40.36±1.39
ZN-4	14.7±0.5	5.0±0.05	23.1±1.7	48.6±2.05
					ZN-5	15.0±0.7	5.5±0.04	22.3±1.2	40.9±1.59

从表1可以看出，通过本发明的方法，可以培育出RS含量≧5%、直链淀粉≦15%，且单株产量≧40g/株的稳定水稻种质。

本发明的整个培育周期只有两年。

以上各实施例不是对本发明的具体限制。

Claims (3)

1.一种具有高抗性淀粉低直链淀粉的水稻种质的培育方法，其特征在于：

a）以至少含有8%的抗性淀粉的水稻材料为母本，与以直链淀粉含量不超过15%且单株产量不低于40g/株的，符合国标二级优质稻谷标准的水稻材料为父本进行杂交，获得F1杂种；

b)将F1杂种的单核靠边期花穗，即取剑叶抽出0.5-1厘米的花穗，经75%乙醇消毒后，装在塑料袋内，经2-5天4℃低温预处理后，花药接种在愈伤组织诱导培养基上，进行全暗培养，温度为26±1℃，培养约30 d后，获得愈伤组织；

c)将花药诱导出的愈伤组织通过继代培养基培养后，再通过分化培养基分化为植株，或直接将花药诱导出的愈伤组织通过分化培养基分化为植株，得到稳定的花培株系；

d)花培株系的绿芽长出3叶后，转接入幼苗壮根培养基中生长15 d后，获得根系发达的茁壮试管苗植株；

e)试管苗经7 d温室练苗，移栽至简易大棚后，生长健壮的小苗在15 d左右长出新的分蘖，用秋水仙素在茎节切口涂抹，进行加倍处理，然后移至大田发育成熟，收获二倍体植株结出的饱满种子；

f)将收获的种子在田间种植，到收获期，进行产量性状的考察，并对获得水稻花培株系样品的精米，进行抗性淀粉和直链淀粉含量的测定，筛选单株产量不低于40g/株，同时精米中抗性淀粉大于5%、直链淀粉含量小于15.0%的稳定水稻花培株系，作为培育的高抗性淀粉的水稻种质；

所述的愈伤组织诱导培养基为：以N6大量元素、微量元素、有机成分和铁盐为基本组分，附加2，4-二氯苯氧乙酸1-1.5 mg/L +萘乙酸1.5-2.0 mg/L +激动素0.3 mg/L+脱落酸2 mg/L+脯氨酸100 mg/L+水解酪蛋白300 mg/L+白砂糖60g/L+琼脂条8g/L；

所述的继代培养基为以M8大量元素、微量元素、有机成分和铁盐为基本组分，白砂糖浓度为50g/L，琼脂条8g/L，附加0.5-1 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，2-2.5 mg/L激动素，2 mg/L脱落酸；

所述的分化培养基为以MS大量元素、微量元素、有机成分和铁盐成分为基本组分, 白砂糖浓度为30g/L，琼脂条8g/L，设置附加0.2-0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，2-2.5mg/L激动素，2 -3mg/L脱落酸；

所述的幼苗壮根培养基为以MS大量元素、微量元素、有机成分和铁盐为基本组分，白砂糖浓度为30g/L，琼脂条8g/L；

上述各培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值5.9。

2.根据权利要求1所述的具有高抗性淀粉低直链淀粉的水稻种质的培育方法，其特征在于：所述的至少含有8%抗性淀粉的水稻材料是指：扎西玛，或白银单，或花绿丰；所述的直链淀粉含量不超过15%且单株产量不低于40g/株的，符合国标二级优质稻谷标准的水稻材料是指：南粳46，或武育粳3号，或Koshihikar。

3.根据权利要求1所述的具有高抗性淀粉低直链淀粉的水稻种质的培育方法，其特征在于：所述的将花药诱导出愈伤组织通过继代培养基培养后，再通过分化培养基分化为植株是指：选取长均为0.5-1 cm、浅黄色、干燥以及颗粒状愈伤组织，在50ml的三角瓶中接入10个愈伤组织块，转入继代培养基，在2000lux的光强下，14h Light/D下培养，14-21 d后，再选取培养后的浅黄色、干燥且颗粒状的愈伤组织，转入分化培养基21-30d后，开始分化，长出绿芽；所述的直接将花药诱导出愈伤组织通过分化培养基分化为植株，得到稳定的花培株系是指：选取长均为0.5-1 cm、浅黄色、干燥和颗粒状愈伤组织，在50ml的三角瓶中接入10个愈伤组织块于分化培养基上，21-30d后，开始分化，长出绿芽。

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