DE69535181T2

DE69535181T2 - Öl-körper proteine als träger von hochwertigen peptiden in pflanzen

Info

Publication number: DE69535181T2
Application number: DE69535181T
Authority: DE
Inventors: Maurice Calgary MOLONEY
Original assignee: SemBioSys Genetics Inc
Current assignee: SemBioSys Genetics Inc
Priority date: 1994-12-30
Filing date: 1995-12-21
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2015-12-22
Also published as: BR9600006A; BR9600006B1; US5650554A; AU709141B2; AR000610A1; CA2208751C; IL116578A0; CA2208751A1; EP0871749B1; AU4295096A; ATE336586T1; WO1996021029A1; EP0871749A1; DE69535181D1; ZA9510999B

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden in Pflanzen.
Hintergrund der Erfindung
Es wurden viele sehr unterschiedliche Verfahren für die Herstellung interessierender und kommerziellen Wert besitzender rekombinanter Moleküle getestet. Die verschiedenen Organismen, die als Wirte für die Expression von Fremdproteinen in Erwägung gezogen wurden, umfassen einzellige Organismen, wie Bakterien und Hefen, Zellen und Zellkulturen von Tieren, Pilzen und Pflanzen und ganze Organismen, wie Pflanzen, Insekten und transgene Tiere.
Pflanzen stellen ein überaus wirkungsvolles und wirtschaftliches Mittel zur Erzeugung rekombinanter Proteine dar, da sie mit geringem Kostenaufwand in großem Maßstab gezüchtet werden können und nun die meisten kommerziell wichtigen Spezies transformiert werden können. Obwohl die Expression von Fremdproteinen klar demonstriert wurde, war die Entwicklung von Systemen mit kommerziell machbaren Expressionsniveaus in Verbindung mit kostengünstigen Abtrennungstechniken beschränkt.
Der Erfinder des vorliegenden Patents hat ein Verfahren zur Erzeugung rekombinanter Proteine in Pflanzen entwickelt, welches in der veröffentlichten PCT-Anmeldung Nr. WO 93/21320 beschrieben ist, die durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist.
Die Anmeldung Nr. WO 93/21320 beschreibt die Verwendung eines Oleosingens, um die Expression eines Polypeptids auf einen Ölkörper in einer Wirtszelle zu richten. Insbesondere umfaßte das Verfahren das Transformieren einer Pflanzenwirtszelle mit einer chimären DNA-Sequenz, umfassend (i) einen ausreichenden Teil eines Oleosingens, um das Zielen auf einen Ölkörper bereitzustellen, und (ii) eine das interessierende Polypeptid codierende DNA. Die transformierten Pflanzenzellen werden gezüchtet, und das interessierende Polypeptid wird als ein Fusionsprotein mit dem Oleosinprotein in den Ölkörpern des Samens exprimiert. Um das Polypeptid zu gewinnen, werden die Ölkörper aus dem Samen isoliert und gespalten, um das Polypeptid-Oleosin-Fusionsprotein freizusetzen. Das Polypeptid kann dann von dem Oleosin abgespalten werden. Die einzigartigen Merkmale sowohl des Oleosinproteins als auch des Expressionsmusters von Oleosin werden verwendet, um ein Mittel zum Synthetisieren kommerziell wichtiger Proteine in einem Maße bereitzustellen, was unter Verwendung konventioneller Systeme zur Proteinherstellung schwierig, wenn nicht unmöglich zu erreichen ist. Die Verwendung von Pflanzen zur Herstellung von interessierenden Proteinen erlaubt die Ausnutzung der Fähigkeit von Pflanzen zur Energieaufnahme und beschränkter Nährstoffzufuhr, um Proteine herzustellen. Die Menge und die Ausbeute an Material, die die Produktion in Pflanzen mit sich bringt, erlaubt eine Anpassung der Technik zur Verwendung bei der Herstellung einer Vielzahl von Polypeptiden von kommerziellem Interesse.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat nun geeignete Verbesserungen und neue Anwendungsmöglichkeiten des Verfahrens zur Herstellung rekombinanter Polypeptide, wie es in der WO 93/21320 beschrieben ist, entwickelt.
Die Verarbeitung einer großen Vielzahl von Materialien unter Verwendung von Enzymen besitzt ein enormes kommerzielles Potential. Die vorliegende Erfindung liefert Verfahren zur Herstellung rekombinanter Enzyme in großen Mengen, die durch Abtrennen der Ölkörperfraktion von zellulären Komponenten getrennt werden können.
Die Erfindung liefert somit Verfahren für die Trennung rekombinanter Proteine von Wirtszellkomponenten durch Abtrennen der Ölkörperfraktion und anschließende Freisetzung des rekombinanten Proteins durch spezifische Spaltung der rekombinanten Protein-Oleosin-Fusion. Optional kann eine Spaltungsstelle vor dem N-Terminus und hinter dem C-Terminus des interessierenden Polypeptids liegen, was eine Spaltung und Aufteilung des Fusionspolypeptids in die dieses bildenden Peptide mittels Phasentrennung erlaubt. Dieses System der Herstellung findet Anwendung bei der Herstellung vieler Proteine und Peptide, wie denjenigen mit pharmazeutischen, enzymatischen, rheologischen und adhäsiven Eigenschaften.
Zusätzlich zur Herstellung und Isolation von rekombinanten Proteinen aus Pflanzen betrachtet die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Verbesserung und zum Schutz von Ernten. Die Nährstoffqualität von Samen wurde durch die Zugabe von Proteinen mit großen Mengen an essentiellen Aminosäuren (DeClercq et al., 1990, Plant Physiol. 94:970–979) und Enzymen, wie Lauroyl-ACP-Thioesterase aus Umbellularia californica, die die Lipidzusammensetzung beeinflussen (US-Patent 5,298,421), verbessert. Bis heute wurden diese Modifikationen von Samen nur unter Verwendung von Samenspeicher-Genpromotoren, die ihnen innewohnende Beschränkungen aufweisen können, vorgenommen. Die Verwendung von regulatorischen Sequenzen von Oleosin liefert ein zusätzliches Mittel, um solche Modifikationen zu erzielen.
Insektenbefall und Pilzerkrankungen von Erntepflanzen stellen zwei der Hauptursachen für Ernteausfälle dar. Eine Reihe von Strategien in Abhängigkeit von der Transformation und Expression rekombinanter Proteine in Pflanzen für den Schutz von Pflanzen vor Insekten und Pilzen wurde verbessert (Lamb et al., 1992, Bio/Technology 11:1436–1445). Diese Strategien werden durch die Expression von Peptidinhibitoren von Verdauungsenzymen von Insekten, wie dem Trypsininhibitor aus der Kuhbohne (Hoffman et al., 1992, J. Economic Entomol. 85:2516–1522), Bakterien- oder Spinnenproteintoxine (Gordon und Zlotkin, 1993, FEBS Lett., 315:125–128) und die Expression von Chitinaseenzymen für den Verdau von Pilzzellwänden (Broglie et al., 1991, Science 254:5035, 1194–1197, Benhamou et al., 1993, Plant Journal 2:295–305; Dunsmuir et al., 1993, In Advances in molecular genetics of plant-microbe interactions, Band 2, S. 567–571, Nester, E.W. und Verma, D.P.S., Hrsg.), beispielhaft veranschaulicht. Die Verwendung von Oleosinproteinen zur Lokalisierung spezifischer Polypeptide, die einen Ernteschutz ermöglichen, erlaubt die Entwicklung neuer Strategien zum Schutz empfindlicher keimender Samen.
Die Verwendung von Oleosinen, deren Expression auf Pollen beschränkt ist, erlaubt es, die Funktion der Pollen so zu verändern, daß sie die männliche Fertilität spezifisch kontrollieren. Man kann Promotorsequenzen aus solchen Oleosinen verwenden, um rekombinante Proteine, die die Funktion von Pollen verändern, spezifisch zu exprimieren. Ein solches Beispiel ist die Verwendung solcher Promotoren zur Kontrolle der Expression neuer Erkennungsproteine, wie der Selbstinkompatibilitätsproteine. Zusätzliche Verwendungsmöglichkeiten, einschließlich der Expression von Oleosin-Fusionsproteinen in Pollen, die für Pollen toxisch sind, werden in Betracht gezogen. Samenspezifische Oleosine können verwendet werden, um die weibliche Fertilität zu verändern.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung und Freisetzung eines rekombinanten Polypeptids aus einem rekombinanten Fusionspolypeptid, welches mit einer Pflanzen-Ölkörperfraktion assoziiert ist, während der Samenkeimung und des Wachstums der Pflanzensämlinge, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: a) Einführen einer ersten chimären DNA-Sequenz in eine Pflanzenzelle, wobei die Sequenz folgendes umfaßt: 1) eine erste DNA-Sequenz, die in der Lage ist, die in der Pflanzenzelle stattfindende Transkription 2) einer zweiten DNA-Sequenz zu regulieren, wobei die zweite DNA-Sequenz ein rekombinantes Fusionspolypeptid codiert und folgendes umfaßt: (i) eine DNA-Sequenz, die einen ausreichenden Anteil eines Ölkörperproteingens codiert, um das Zielen des rekombinanten Fusionspolypeptids auf einen Ölkörper bereitzustellen, welche im Leserahmen mit (ii) einer DNA-Sequenz, die ein rekombinantes Polypeptid codiert, und (iii) einer Linker-DNA-Sequenz, die eine Aminosäuresequenz codiert, die speziell durch enzymatische Mittel spaltbar ist, assoziiert ist, wobei die Linker-DNA-Sequenz (iii) zwischen der DNA-Sequenz (i), die das Ölkörperprotein codiert, und der DNA-Sequenz (ii), die das rekombinante Polypeptid codiert, angeordnet ist, und 3) eine dritte DNA-Sequenz, die eine Terminationsregion codiert, b) sequentielles oder gleichzeitiges Einführen einer zweiten chimären DNA-Sequenz in das Genom der Pflanze, wobei die Sequenz folgendes umfaßt: 1) eine erste DNA-Sequenz, die in der Lage ist, speziell während der Saatkeimung und des Saatwachstums die Transkription 2) einer zweiten DNA-Sequenz zu regulieren, die ein bestimmtes Enzym codiert, das in der Lage ist, die Linker-DNA-Sequenz der ersten chimären DNA-Sequenz zu spalten, und 3) eine dritte DNA-Sequenz, die eine Terminationsregion codiert, c) Regenerieren einer Pflanze aus der Pflanzenzelle und Züchten der Pflanze unter Erzeugung von Samen, wobei das rekombinante Fusionspolypeptid exprimiert wird und mit Ölkörpern assoziiert ist, und d) Zulassen der Keimung der Saat, wobei das Enzym in der zweiten chimären DNA-Sequenz exprimiert wird und das rekombinante Polypeptid aus dem rekombinanten Fusionspolypeptid, welches mit den Ölkörpern assoziiert ist, während der Saatkeimung und des frühen Sämlingswachstums spaltet.
Es kann hier auf die oben beschriebenen chimären DNA-Sequenzen Bezug genommen werden.
Zur Information wird eine chimäre DNA-Sequenz gelehrt, die in Verbindung mit einem Ölkörper einer Wirtszelle exprimiert werden kann und folgendes umfaßt: 1) eine erste DNA-Sequenz, die in der Lage ist, die in der Wirtszelle stattfindende Transkription 2) einer zweiten DNA-Sequenz zu regulieren, wobei die zweite Sequenz ein rekombinantes Fusionspolypeptid codiert und (i) eine DNA-Sequenz umfaßt, die einen ausreichenden Teil eines Ölkörperproteingens codiert, um das Zielen des rekombinanten Fusionspolypeptids auf eine Lipidphase bereitzustellen, die im Leserahmen mit (ii) einer DNA-Sequenz, die das rekombinante Polypeptid codiert, verknüpft ist, und 3) eine dritte DNA-Sequenz, die eine in der Wirtszelle funktionsfähige Terminationsregion codiert.
Zusätzlich wird hierin auch auf eine Pflanze, eine Pflanzenzelle oder einen Pflanzensamen Bezug genommen, die bzw. der irgendeine der hier gelehrten chimären DNA-Sequenzen enthält.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine schematische Darstellung der Arten von Ölkörper-Protein-Fusionen, die als Verfahren der Erfindung zur Fusion von Ölkörperproteingenen mit fremde Polypeptide codierenden Genen in Betracht gezogen werden. IA ist eine C-terminale Fusion eines gewünschten Polypeptids mit einem Ölkörperprotein, IB ist eine N-terminale Fusion eines gewünschten Polypeptids mit einem Ölkörperprotein, IC ist eine innere Fusion eines gewünschten Polypeptids in einem Ölkörperprotein und ID ist eine translationale Fusion zwischen Dimeren des gewünschten Polypeptids, eingeschlossen zwischen zwei im wesentlichen vollständigen Ölkörperprotein-Zielsequenzen. Jede Fusion ist in einer linearen schematischen Form und in der vorhergesagten Ausgestaltung bei spezifischer Verknüpfung mit dem Ölkörper gezeigt. Sowohl in der linearen als auch in der mit dem Ölkörper assoziierten Form ist die Ölkörper codierende Sequenz, die das Protein spezifisch auf den Ölkörper ausrichtet, als einzelne dünne Linie gezeigt, ein ausgefüllter Kreis stellt ein Proteaseerkennungsmotiv dar, eine Wellenlinie stellt einen nativen C- oder N-Terminus eines Ölkörperproteins dar, und eine eingesetzte Codierungsregion wird durch ein offenes Viereck dargestellt. Der Ölkörper ist als ein einfacher Kreis dargestellt.
2 zeigt die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO:1) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:2) eines Ölkörperproteingens, welches ein 18 kDa großes Oleosin aus Arabidopsis thaliana codiert. Die Intronsequenz ist in Kleinbuchstaben wiedergegeben. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz ist in Einbuchstabencode gezeigt.
3 zeigt eine schematische Darstellung der Konstruktion von pOleoP1.
4 zeigt die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO:3) eines cDNA-Klons von Oleosin aus B. napus und die vorhergesagte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:4).
5 beschreibt die Konstruktion einer Oleosin/GUS-Fusion für die Expression in E. coli.
BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Verfahren und Zusammensetzungen für ein neues Mittel zur Herstellung rekombinanter Proteine und Peptide, die leicht von Wirtszellkomponenten getrennt werden können, bereitgestellt. Gemäß weiteren Ausführungsformen der Erfindung werden Verfahren und Zusammensetzungen für neue Verwendungen von durch diese Verfahren hergestellten rekombinanten Proteinen bereitgestellt.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren und Zusammensetzungen für ein neues Mittel zur Herstellung rekombinanter Proteine und Peptide in Wirtszellen, die leicht von anderen Wirtszellkomponenten getrennt werden können, bereitgestellt. Die Reinigung des rekombinanten Proteins, falls erforderlich, ist stark vereinfacht. Die rekombinante DNA, die das interessierende Protein codiert, kann ein Teil eines natürlich vorkommenden Gens oder ein ganzes natürlich vorkommendes Gen aus irgendeiner Quelle sein, sie kann eine synthetische DNA-Sequenz sein oder sie kann eine Kombination aus natürlich vorkommenden und synthetischen Sequenzen sein. Das vorliegende Verfahren umfaßt die Stufen der Herstellung einer Expressionskassette, umfassend eine erste DNA-Sequenz, die die Transkription einer zweiten DNA-Sequenz, welche einen ausreichenden Teil eines Ölkörperproteingens codiert, regulieren kann, um das Zielen auf einen Ölkörper bereitzustellen, und eine mit dieser zweiten DNA-Sequenz fusionierte dritte DNA-Sequenz, die das interessierende Protein, das interessierende Polypeptid oder die interessierende RNA codiert, die Auslieferung und Einbringung der Expressionskassette in eine Wirtszelle, die Herstellung eines transformierten Organismus oder einer Zellpopulation, worin das chimäre Genprodukt exprimiert wird, und die Gewinnung eines chimären Genproteinprodukts durch spezifische Verknüpfung mit einem Ölkörper. Das interessierende Peptid ist für gewöhnlich ein fremdes Polypeptid, welches normalerweise weder in der Wirtszelle exprimiert wird noch in Verknüpfung mit dem Ölkörper vorliegt.
Die transformierten Wirtszellen können aus irgendeiner Quelle, einschließlich Pflanzen, Pilzen, Bakterien und Tieren, stammen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Pflanze und das chimäre Produkt wird exprimiert und zu den Ölkörpern des Samens verlagert.
Die Verwendung eines Ölkörperproteins als Träger oder zielendes Vehikel liefert einen einfachen Mechanismus zur Gewinnung rekombinanter Proteine. Das mit dem Ölkörper verknüpfte chimäre Protein oder die rekonstituierte Ölkörperfraktion wird in einer einzigen Stufe (wie Zentrifugation oder Flotation) von der Masse zellulärer Komponenten abgetrennt, und das Protein ist auch während der Extraktion vor Zersetzung geschützt, da die Abtrennung auch den Kontakt der rekombinanten Proteine mit nicht-spezifischen Proteasen reduziert.
Die Erfindung betrachtet die Verwendung rekombinanter Proteine, insbesondere von Enzymen, die mit Oleosinen fusioniert und mit Ölkörpern assoziiert sind, oder rekonstituierter Ölkörper für die Umwandlung von Substraten in wäßrige Lösungen nach dem Mischen von Ölkörperfraktionen und Substratlösungen. Die Verknüpfung des rekombinanten Enzyms mit dem Ölkörper erlaubt die anschließende Gewinnung des rekombinanten Enzyms durch einfache Mittel (Zentrifugation und Flotation) und die darauf folgende wiederholte Verwendung.
Gemäß weiteren Ausführungsformen der Erfindung werden Verfahren und Zusammensetzungen für die Freisetzung rekombinanter Proteine und Peptide, die mit Oleosinproteinen fusioniert sind, welche speziell mit isolierten Ölkörper- oder rekonstituierten Ölkörperfraktionen assoziiert sind, bereitgestellt. Das vorliegende Verfahren umfaßt die Stufen der Herstellung einer Expressionskassette, umfassend eine erste DNA-Sequenz, die in der Lage ist, die Transkription einer zweiten DNA-Sequenz zu regulieren, welche einen ausreichenden Teil eines Ölkörperproteingens, wie Oleosin, codiert, um das Zielen auf einen Ölkörper bereitzustellen, und eine dritte DNA-Sequenz, die über eine Linker-DNA-Sequenz, welche eine Aminosäuresequenz codiert, die durch eine spezifische Pro tease oder durch chemische Behandlung spaltbar ist, mit der zweiten DNA-Sequenz fusioniert ist, wobei die dritte Sequenz das interessierende Protein, das interessierende Polypeptid oder die interessierende RNA codiert, so daß das interessierende Protein durch die Wirkung des spezifischen chemischen Mittels oder der Protease von der isolierten Ölkörperfraktion abgespalten werden kann.
Für Ausführungsformen der Erfindung, bei denen die Spaltung rekombinanter Proteine, die mit Oleosinen fusioniert sind, welche mit Samenölkörpern assoziiert sind, in keimenden Samen betrachtet wird, wird die Expressionskassette, die das oben beschriebene rekombinante Proteingen enthält, so modifiziert, daß sie ein zusätzliches zweites rekombinantes DNA-Molekül enthält, umfassend eine erste DNA-Sequenz, die in der Lage ist, die Expression in Pflanzen, insbesondere in keimenden Samen, spezieller in Keimblättern oder anderen Ölkörper enthaltenden Samengeweben zu regulieren, und unter der Kontrolle dieser regulatorischen Sequenz eine DNA-Sequenz, die ein Proteaseenzym codiert, insbesondere ein bestimmtes Proteaseenzym, welches die rekombinanten chimären Proteine, die mit den Ölkörpern assoziiert sind, spalten kann, um ein interessierendes Protein oder Peptid aus dem Ölkörper freizusetzen, und eine funktionale transkriptionale und translationale Terminationsregion in Pflanzen. Es ist wünschenswert, das zweite rekombinante DNA-Molekül so zu konstruieren, daß die erste und die zweite rekombinante DNA-Sequenz für die einfache Substitution irgendeines aus einer Vielzahl proteolytischer Enzyme, die verwendet werden können, um mit Ölkörpern assoziierte chimäre Proteine zu spalten, durch eine Mehrfachklonierungsstelle verknüpft sind.
Für einen Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie von Pflanzen, der Genetik oder der Pflanzenzucht liegt es auf der Hand, daß eine zu der obigen Modifikation der Expressionskassette, um die Freisetzung von interessierenden Proteinen und Peptiden in keimenden Samen zu erlauben, gleichwertige Wirkung unter Verwendung ähnlicher Mittel erzielt werden kann. Beispielsweise ist es möglich, daß das erste rekombinante DNA-Molekül und das zweite rekombinante DNA-Molekül, wie sie oben beschrieben wurden, in zwei voneinander unabhängigen Expressionskassetten enthalten sein können, die unabhängig voneinander in das Genom einer Pflanze eingebracht werden. Zusätzlich ist es möglich, eine erste rekombinante Pflanze, die das erste rekombinante DNA-Molekül in ihrem Genom integriert enthält, mit einer zweiten rekombinanten Pflanze, die die zweite rekombinante DNA in ihrem Genom integriert enthält, sexuell zu kreuzen, um Samen zu produzieren, die sowohl das erste als auch das zweite rekombinante DNA-Molekül enthalten.
Für Ausführungsformen der Erfindung, bei denen das rekombinante Protein in Pflanzensamen hergestellt und potentiell aus diesen gewonnen werden soll, umfaßt die Expressionskassette im allgemeinen in der Transkriptionsrichtung 5'-3' eine erste rekombinante DNA-Sequenz, umfassend eine transkriptionale und translationale regulatorische Region, die zur Expression in Pflanzen, insbesondere in sich entwickelnden Samen, spezieller Keimblättern oder anderen Samengeweben, die Ölkörper oder Triglyceridspeicher aufweisen, wie das Perikarp oder die Kutikula, in der Lage ist, und eine zweite rekombinante DNA-Sequenz, die ein chimäres Peptid oder Protein codiert, umfassend einen ausreichenden Teil eines ölkörperspezifischen Proteins, um das Zielen auf einen Ölkörper bereitzustellen, ein interessierendes Protein und eine funktionale transkriptionale und translationale Terminationsregion in Pflanzen. Ebenfalls kann ein Intron oder können mehrere Introns in der das ölkörperspezifische Protein codierenden Sequenz oder in der codierenden Sequenz des interessierenden Proteins vorliegen. Das chimäre Peptid oder Protein kann auch eine Peptidsequenz umfassen, die das ölkörperspezifische Protein und das interessierende Peptid oder Protein, das durch chemische oder enzymatische Mittel spezifisch gespalten werden kann, verknüpft. In wünschenswerter Weise ist die DNA-Expressionskassette so aufgebaut, daß die erste und die zweite rekombinante DNA-Sequenz durch eine Mehrfachklonierungsstelle miteinander verbunden werden, um die einfache Substitution alternativer zweiter rekombinanter DNA-Sequenzen, umfassend die auf die Ölkörper zielende Sequenz und irgendeines aus einer Vielzahl interessierender Proteine oder Peptide, die exprimiert und auf Ölkörper in Samen ausgerichtet werden sollen, zu erlauben.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird die Expressionskassette in einer solchen Form in eine Wirtszelle eingebracht, so daß die Expressionskassette stabil in das Genom der Wirtszelle aufgenommen wird. Dementsprechend ist es offensichtlich, daß man die Expressionskassette auch als Teil einer rekombinanten DNA-Sequenz einbringen kann, die zur Replikation und/oder Expression in der Wirtszelle in der Lage ist, ohne daß eine Integration in das Wirtschromosom erforderlich ist. Beispiele hierfür sind in einer Vielzahl von Vektoren zu finden, wie beispielsweise in viralen oder Plasmidvektoren, die zur Replikation und Expression von Proteinen in der Wirtszelle in der Lage sind. Ein spezielles Beispiel sind Plasmide, die einen Replikationsursprung tragen und die eine große Kopienzahl erlauben, wie die pUC-Serie von E. coli-Plasmiden, wobei die Plasmide zusätzlich so modifiziert sind, daß sie einen induzierbaren Promotor, wie den LacZ-Promotor, der durch Galactose oder IPTG induzierbar ist, enthalten.
Für Ausführungsformen der Erfindung, bei denen die Herstellung und Gewinnung des rekombinanten Proteins aus Nicht-Pflanzenzellen in Betracht gezogen wird, wird die oben beschriebene Expressionskassette so modifiziert, daß sie eine erste rekombinante DNA-Sequenz, umfassend eine transkriptionale und translationale regulatorische Sequenz, die zur Expression in der für die Herstellung vorgesehenen Wirtszelle oder dem Organismus in der Lage ist, umfaßt. Promotorregionen, die in Zellen von Mikroorganismen, Pilzen, Insekten und Tieren hochgradig aktiv sind, sind in der Literatur zu irgendeiner in Betracht gezogenen Wirtsspezies gut beschrieben und können kommerziell erhältlich sein oder mittels Standardverfahren, wie sie einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, erhalten werden. Es liegt auf der Hand, daß ein Mittel zur Einführung des rekombinanten Moleküls in die Wirtszelle bestimmte infektiöse Einheiten, wie Viren, sind, die den Wirt, welcher so modifiziert wurde, daß er die zu exprimierende rekombinante DNA enthält, infizieren können.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird in Erwägung gezogen, daß auch andere Proteine als Pflanzenoleosine und Proteine mit Homologie zu Pflanzenoleosinen, die speziell mit Triglyceriden, Ölen, Lipiden, Fettkörpern oder irgendwelchen hydrophoben zellulären Einschlüssen im Wirtsorganismus oder mit verdünnten Pflanzenölkörpern assoziiert sein können, mit einem rekombinanten Protein fusioniert und in der in Betracht gezogenen Weise verwendet werden können. Ein zu Pflanzenoleosinen und Ölkörpern funktionell äquivalentes System in Bakterien wurde beschrieben (Pieper-Fürst et al., 1994, J. Bacteriol. 176:4328–4337). Weitere Proteine aus zusätzli chen Quellen, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf Pilze, Insekten oder Tiere mit äquivalenten regulatorischen und zielenden Eigenschaften können einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sein oder von diesem entdeckt werden.
Von besonderem Interesse für die transkriptionale und translationale Regulation des ersten rekombinanten DNA-Moleküls in Pflanzen ist eine regulatorische Sequenz (Promotor) eines Ölkörperproteingens, vorzugsweise eines in dikotyledonen Ölsamen exprimierten Ölkörperproteingens. Es wurde herausgefunden, daß die Expression dieser Gene in dikotyledonen Ölsamen viel früher stattfindet als bislang angenommen wurde und wie es in der Literatur berichtet wird. So sind diese Promotoren und stromaufwärts liegende Elemente dieser Gene für eine Vielzahl von Verwendungszwecken, einschließlich der Modifikation des Stoffwechsels während Phasen der Embryogenese, die der Ansammlung von Speicherproteinen vorangehen, wertvoll. Alternativ kann der Promotor auch einen Promotor, welcher zur konstitutiven Expression in der ganzen Pflanze in der Lage ist, oder einen Promotor, der eine verstärkte Expression in Geweben oder Organen zeigt, die mit der Ölsynthese assoziiert sind, umfassen. Von speziellerem Interesse ist ein Promotor, der ein Ölkörperprotein auf hohem Niveau exprimiert. Viele Pflanzenspezies sind tetraploid oder hexaploid und können zahlreiche Kopien funktionaler Ölkörperproteingene enthalten. Da es bevorzugt ist, ein Gen zu erhalten, welches durch einen Promotor kontrolliert wird, der im Vergleich zu anderen Ölkörperproteingenen innerhalb der gleichen Spezies auf hohem Niveau exprimiert wird, kann es vorteilhaft sein, eine diploide Spezies als Quelle für Ölkörperproteingene auszuwählen. Ein Beispiel ist die diploide, zu den Kreuzblütlern gehörende Pflanze Arabidopsis thaliana, wobei nur zwei oder drei Ölkörperproteingene mittels Southern-Blot-Analyse detektiert werden, wohingegen die Samen Ölkörperproteine enthalten, die einen hohen Prozentanteil des Gesamtproteins ausmachen.
Der Grad der evolutionären Beziehung zwischen der für die Isolation eines Promotors ausgewählten Pflanzenspezies und der für die Ausführung der Erfindung ausgewählten Pflanzenspezies ist möglicherweise unkritisch. Die universelle Verwendbarkeit der meisten Pflanzengene und die Promotorfunktion in dikotyledonen Spezies wurde in der Literatur ausführlich demonstriert. Zusätzlich wurde auch in einem bestimmten Maße die Erhaltung der Funktion zwischen den Genen monokotyledoner und dikotyledoner Pflanzen gezeigt. Für einen Fachmann auf dem Gebiet liegt es auf der Hand, daß die Funktion irgendeines gegebenen Promotors in irgendeiner ausgewählten Spezies vor der Ausführung der Erfindung mit einfachen Mitteln, wie der vorübergehenden Expression von Markergen-Promotor-Fusionen in isolierten Zellen oder intakten Geweben, getestet werden kann. Die Promotorregion umfaßt typischerweise mindestens von 100 bp 5' zur Translationsstartstelle der das Strukturgen codierenden Sequenz bis zu 2,5 kb 5' von der gleichen Translationsstartstelle.
Von besonderem Interesse als Quelle von DNA codierenden Sequenzen, die das Zielen auf ein Ölkörperprotein bereitstellen können, sind Ölkörperproteingene, die aus Arabidopsis oder Brassica napus erhältlich sind, die die Expression des interessierenden Proteins in Samen bereitstellen (siehe Taylor et al., 1990, Planta 181:18–26). Die Regionen und Aminosäuresequenzen, die notwendig sind, um das Zielen auf den Ölkörper bereitzustellen, liegen in dem hochgradig hydrophoben zentralen Bereich der Ölkörperproteine. Die abgeleitete Aminosäuresequenz, die notwendig ist, um das Zielen auf den Ölkörper für ein Ölkörperprotein aus Arabidopsis thaliana bereitzustellen, wie sie in SEQ ID NO:5 gezeigt ist, ist folgende:
Die Aminosäuren von etwa 25-101 machen die zentrale hydrophobe Domäne aus.
Um weitere Ölkörperproteingene mit den gewünschten Charakteristika zu identifizieren, wobei ein Ölkörperprotein isoliert wurde oder ist, kann das Protein teilweise sequenziert werden, so daß eine Sonde für die Identifizierung von mRNA ausgestaltet werden kann. Eine solche Sonde ist besonders wertvoll, wenn sie so ausgestaltet wird, daß sie auf die codierende Region der zentralen hydrophoben Domäne zielt, die bei verschiedenen Spezies stark konserviert ist. Folglich kann eine DNA- oder RNA-Sonde für diese Region besonders geeignet sein, um codierende Sequenzen für Ölkörperproteine aus anderen Pflanzenspezies zu identifizieren. Um die Konzentration der mRNA weiter zu steigern, kann cDNA hergestellt werden, und die cDNA kann mit mRNA oder cDNA aus keine Ölkörper produzierenden Zellen subtrahiert werden. Die restliche cDNA kann dann verwendet werden, um unter Verwendung einer geeigneten, aus Pflanzenzellen hergestellten Bibliothek das Genom hinsichtlich komplementärer Sequenzen zu untersuchen. Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen an die cDNA hybridisieren, können dann isoliert werden.
In einigen Fällen kann, wie es oben beschrieben ist, eine Ölkörperproteingensonde (konservierte Region) direkt zum Screenen einer genomischen cDNA-Bibliothek und zum Identifizieren von Sequenzen, die an die Sonde hybridisieren, eingesetzt werden. Die Isolierung kann auch mittels einer standardmäßigen immunologischen Technik zum Screenen einer samenspezifischen cDNA-Expressionsbibliothek durchgeführt werden. Antikörper können unter Verwendung des von Taylor et al. (1990, Planta, 181:18–26) beschriebenen Reinigungsverfahrens und des Protokolls zur Antikörperherstellung für Ölkörperproteine leicht erhalten werden. Das Screenen einer cDNA-Expressionsbibliothek unter Verwendung von Antikörpern wird im wesentlichen unter Verwendung der Techniken von Huynh et al. (1985, in DNA Cloning, Band 1, A Practical Approach, Hrsg. D.M. Glover, IRL Press, S. 49–78) durchgeführt. Die Bestätigung der Sequenz wird durch die stark konservierte zentrale hydrophobe Region vereinfacht (siehe 1). Die DNA-Sequenzierung nach dem Verfahren von Sanger et al. (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463–5467) oder Maxam und Gilbert (1980, Meth. Enzymol., 65:497–560) kann mit allen mutmaßlichen Klonen durchgeführt werden und es können Homologiesuchen durchgeführt werden. Die Homologie der die zentrale hydrophobe Domäne codierenden Sequenzen zwischen verschiedenen Spezies beträgt sowohl auf der Aminosäureebene als auch auf der Nukleotidebene typischerweise 70%. Wenn ein Antikörper verfügbar ist, kann die Bestätigung der Sequenzidentität auch mittels Hybridauswahl- und Translationsexperimenten mit mRNA-Präparaten aus Samen durchgeführt werden, wie es von Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, 2. Aufl., Cold Spring Harbour Press, S. 8–49 bis 8–51) beschrieben wird.
Aus Samen hergestellte cDNA-Klone können unter Verwendung von cDNA-Sonden, die aus den konservierten codierenden Regionen irgendeines verfügbaren Ölkörperproteingens hergestellt wurden (z.B. Bowman-Vance und Huang, 1987, J. Biol. Chem., 262:11275–11279), gescreent werden. Es werden Klone ausgewählt, die eine im Vergleich zu Sämlings-cDNAs stärkere Hybridisierung an Samen-DNAs aufweisen. Das Screening wird wiederholt, um unter Verwendung des direkten Antikörper-Screenings oder von Hybridauswahl und Translation eine bestimmte cDNA zu identifizieren, die mit Ölkörpern aus sich entwickelnden Samen assoziiert ist. Die zu der spezifischen cDNA komplementäre mRNA fehlt in anderen getesteten Geweben. Die cDNA wird dann verwendet, um eine genomische Bibliothek und ein ausgewähltes Fragment, welches an die betreffende cDNA hybridisiert, zu screenen. Von besonderem Interesse für die transkriptionale und translationale Regulation des zweiten rekombinanten DNA-Moleküls in Pflanzen ist eine regulatorische Sequenz (Promotor) aus einem Gen, welches während der Keimung von Samen und der frühen Wachstumsstadien eines Sämlings exprimiert wird, insbesondere einem Gen, welches ein hohes Niveau der Expression im Stadium der Mobilisierung von Samenspeicherreserven zeigt, spezieller die Promotorsequenz aus den glyoxisomalen Enzymen Isocitratlyase oder Malatsynthetase. Informationen betreffend die genomischen Klone von Isocitratlyase und Malatsynthetase aus Brassica napus und Arabidopsis, die isoliert und beschrieben wurden, wurden veröffentlicht (Comai et al., 1989, Plant Cell 1:293–300) und können von einem Fachmann auf dem Gebiet unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren verwendet werden, um ein funktionales Promotorfragment zu isolieren. Weitere Enzyme, die am Stoffwechsel von Lipiden oder anderen Samenreserven während der Keimung beteiligt sind, können auch als eine Quelle für äquivalente regulatorische Proteine dienen.
Für die Herstellung rekombinanter Protein-Oleosin-Fusionen in heterologen Systemen, wie Tier-, Insekten- oder Mikrobenspezies, werden Promotoren für die maximale Expression in diesen Zellen, Geweben oder Organen zur Herstellung rekombinanter Proteine ausgewählt. Die Erfindung wird für eine Verwendung in einer Vielzahl von Organismen, einschließlich Tieren, besonders denjenigen, die Milch produzieren, wie Kühen oder Ziegen, wirbellosen Tieren, wie Insekten, insbesondere Insekten, die in großem Umfang gezüchtet werden können, spezieller denjenigen Insekten, die mit rekombinanten Baculoviren infiziert werden können, die so modifiziert wurden, daß sie Oleosin-Fusionsproteine exprimieren, Pilzzellen, wie Hefen und Bakterienzellen, in Betracht gezogen, die genetisch so verändert werden können, daß sie Fremdproteine exprimieren. Promotorregionen, die in Viren, Mikroorganismen, Pilzen, Insekten und Tieren sehr aktiv sind, sind in der Literatur gut beschrieben und können kommerziell erhältlich sein oder können mittels Standardverfahren, die einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, erhalten werden. Vorzugsweise sind alle funktionalen transkriptionalen und translationalen Elemente der Initiationskontrollregion von dem gleichen Gen abgeleitet oder wurden aus dem gleichen Gen erhalten.
Für diejenigen Anwendungen, bei denen die Expression des rekombinanten Proteins von extrachromosomalen Elementen abgeleitet ist, kann man ein Replikon auswählen, welches eine hohe Kopienzahl aufrechterhält, um die Expression zu maximieren. Alternativ oder zusätzlich zu Replikons mit hoher Kopienzahl kann man die rekombinante DNA-Sequenz so weiter modifizieren, daß sie bestimmte, die Transkription oder Translation verstärkende Sequenzen enthält, um die maximale Expression des Fremdproteins in Wirtszellen sicherzustellen.
Das Niveau der Transkription sollte ausreichend sein, um eine Menge von RNA zu liefern, die zu einem modifizierten Samen, einer modifizierten Zelle, einem modifizierten Gewebe, Organ oder Organismus führen kann. Der Begriff "modifiziert" soll einen im Vergleich zu dem äquivalenten nicht-transformierten Material, beispielsweise einem Material, in dessen Genom die betreffende Expressionskassette nicht vorhanden ist, detektierbar unterschiedlichen Phänotyp eines Samens, einer Zelle, eines Gewebes, eines Organs oder eines Organismus bedeuten. Es sei angemerkt, daß die RNA auch eine "Antisense-RNA" sein kann, die einen Phänotyp durch Inhibition der Expression eines bestimmten Gens verändern kann.
Die Ligation der die zielende Sequenz codierenden DNA-Sequenz mit dem das interessierende Polypeptid codierenden Gen kann auf verschiedene Arten, einschließlich terminaler Fusionen, interner Fusionen und polymerer und konkatamerer Fusionen erfolgen. In allen Fällen dienen die Fusionen dazu, eine Störung des korrekten Leserahmens des Ölkörperproteins zu vermeiden und den Einschluß jeglicher Stopsignale für die Translation an den oder in der Nähe der Verbindungs stellen zu vermeiden. Die verschiedenen Arten terminaler und interner Fusionen sind zusammen mit einer Darstellung von Ausgestaltungen in vivo in 1 gezeigt.
In vielen der beschriebenen Fälle umfaßt die Ligation des das Peptid codierenden Gens vor zugsweise einen Linker, der ein Proteasezielmotiv codiert. Dies erlaubt die Freisetzung des Peptids, sobald es als Fusionsprotein extrahiert wurde. Potentielle Spaltungsstellen, die eingesetzt werden können, sind Erkennungsmotive für Thrombin (Leu-Val-Pro-Arg-Gly, SEQ ID NO:6) (Fujikawa et al., 1972, Biochemistry 11:4892–4899), Faktor Xa (Phe-Glu-Gly-Arg-aa, SEQ ID NO:7) (Nagai et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7252–7255) oder Collagenase (Pro-Leu-Gly-Pro, SEQ ID NO:8) (Scholtissek und Grosse, 1988, Gene 62:55–64). Zusätzlich können für Verwendungen, bei denen das Fusionsprotein ein Peptidhormon enthält, welches bei Aufnahme freigesetzt wird, die Proteaseerkennungsmotive so ausgewählt werden, daß sie die Spezifität von Darmproteasen widerspiegeln, um die Freisetzung des Peptids zu vereinfachen.
Für diejenigen Verwendungszwecke, bei denen eine chemische Abspaltung des Polypeptids von dem Ölkörperfusionsprotein eingesetzt werden soll, kann man die Aminosäuresequenz des Ölkörperproteins so verändern, daß potentielle Stellen für die chemische Abspaltung aufgenommen oder eliminiert werden. Beispielsweise kann man die internen Methioninreste in dem Arabidopsis-Oleosin an den Positionen 11 und 117 durch ortsspezifische Mutagenese eliminieren, um so ein Gen zu konstruieren, welches ein Oleosin codiert, das keine internen Methioninreste enthält. Durch Erzeugung einer N-terminalen Fusion mit dem modifizierten Oleosin über den in dem Arabidopsis-Oleosin bereits vorliegenden N-terminalen Methioninrest kann man das interessierende Polypeptid unter Verwendung von Cyanogenbromid abspalten, vorausgesetzt, daß in dem Polypeptid keine internen Methionine vorhanden sind. Für andere chemische Abspaltungsmittel können ähnliche Strategien eingesetzt werden. Es sei angemerkt, daß eine Vielzahl von Strategien, einschließlich einer Kombination aus chemischer Modifikation und enzymatischer Spaltung, für die Spaltung eingesetzt werden kann.
Durch geeignete Manipulationen, wie Restriktion, Rückverdau oder Auffüllen von Überhängen, um stumpfe Enden, Ligation von Linkern oder dergleichen bereitzustellen, können komplementäre Enden der Fragmente zum Verbinden und für die Ligation bereitgestellt werden. Bei Ausführung der verschiedenen Stufen wird die Klonierung eingesetzt, um die Menge an DNA zu vervielfältigen und eine Analyse der DNA zu erlauben, um sicherzustellen, daß die Vorgänge richtig abgelaufen sind. Es ist eine große Vielzahl von Klonierungsvektoren verfügbar, wobei der Klonierungsvektor ein in E. coli funktionales Replikationssystem und einen Marker, der die Selektion der transformierten Zellen erlaubt, enthält. Beispielhafte Vektoren umfassen pBR332, die pUC-Serie, die M13mp-Serie, pACYC184 usw. für die Manipulation der primären DNA-Konstrukte. Somit kann die Sequenz an (einer) geeigneten Restriktionsstelle(n) in den Vektor eingefügt werden, das resultierende Plasmid kann verwendet werden, um den E. coli-Wirt zu transformieren, die E. coli-Zellen können in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet werden, die Zellen können geerntet und lysiert werden und das Plasmid kann gewonnen werden. Die Analyse kann eine Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse, Elektroforese oder dergleichen umfassen. Nach jeder Manipulation kann die in dem endgültigen Konstrukt zu verwendende DNA-Sequenz restringiert und mit der nächsten Sequenz verbunden werden, wobei jedes der Teilkonstrukte in das gleiche Plasmid oder in unterschiedliche Plasmide kloniert werden kann.
Die Art und Weise, in der das Ölkörperprotein und das zu exprimierende Protein fusioniert werden, kann entweder eine N-terminale, eine C-terminale oder eine interne Fusion sein. Die Auswahl ist abhängig von der Verwendung. Beispielsweise können C-terminale Fusionen wie folgt erzeugt werden: Ein genomischer Klon eines Ölkörperproteingens, welches vorzugsweise 100 bp 5' zur Translationsstartstelle enthält, wird in ein Plasmidvehikel kloniert, welches zur Replikation in einem geeigneten Bakterienwirt in der Lage ist (z.B. pUC oder pBR322 in E. coli). Eine Restriktionsstelle liegt in der Region, die den hydrophilen C-terminalen Abschnitt des Gens codiert. In einem Pflanzen-Ölkörperprotein von etwa 18 kDa, wie dem Arabidopsis-Oleosin, erstreckt sich diese Region typischerweise von den Codons 125 bis zum Ende des Klons. Die ideale Restriktionsstelle ist einzigartig; dies ist jedoch nicht absolut notwendig. Wenn sich in dieser Region keine passende Restriktionsstelle befindet, kann durch ortsspezifische Mutagenese eine solche Stelle eingebracht werden. Die einzige große Einschränkung bei der Einbringung dieser Stelle besteht darin, daß sie 5' zum Translationsstopsignal des Ölkörperproteinklons angeordnet werden muß.
Nach Einsetzen dieses veränderten Klons kann ein synthetischer Oligonukleotidadapter hergestellt werden, der die codierende Sequenz für eine Proteaseerkennungsstelle, wie Pro-Leu-Gly-Pro, oder ein Multimer davon enthält. Dies ist die Erkennungsstelle für die Protease Collagenase. Der Adapter wird so hergestellt, daß er einen 4-Basen-Überhang am 5'-Ende, der mit der Restriktionsstelle am 3'-Ende des Ölkörperproteinklons kompatibel ist, einen 4-Basen-Überhang am 3'-Ende des Adapters, um die Ligation an die das Fremdpeptid codierende Sequenz zu erleichtern, und, falls notwendig, zusätzliche Basen liefert, um sicherzustellen, daß es beim Übergang zwischen der das Ölkörperprotein codierenden Sequenz, der Proteaseerkennungsstelle und der das Fremdpeptid codierenden Sequenz nicht zu Verschiebungen im Leseraster kommt. Das abschließende Ligationsprodukt enthält ein nahezu vollständiges Ölkörperproteingen, eine codierende Sequenz für das Collagenaseerkennungsmotiv und die gewünschte, das Polypeptid codierende Region zusammen in einem einzigen Leserahmen.
Ein ähnlicher Ansatz wird für N-terminale Fusionen verwendet. Das hydrophile N-terminale Ende von Ölkörperproteinen erlaubt die Fusion von Peptiden an den N-Terminus und stellt gleichzeitig sicher, daß das Fremdpeptid auf der äußeren Oberfläche des Ölkörpers gehalten wird. Diese Ausgestaltung kann aus ähnlichen Ausgangsmaterialien konstruiert werden, wie sie für C-terminale Fusionen verwendet werden, erfordert jedoch die Identifikation einer geeigneten Restriktionsstelle in der Nähe der Translationsstartstelle des Ölkörperproteingens. Eine geeignete Stelle kann ohne irgendeine Veränderung der codierenden Sequenz durch die Einbringung einer eine einzelne Base umfassenden Änderung genau 5' vom Startcodon (ATG) in vielen Pflanzen-Ölkörperproteingenen erzeugt werden. In den bislang untersuchten Pflanzen-Ölkörperproteinen ist die zweite Aminosäure Alanin, deren Codon mit einem "G" beginnt. Der A-C-Übergang bei diesem bestimmten "G" liefert eine Nco I-Stelle. Zur Veranschaulichung einer solchen Modifikation wird der Sequenzzusammenhang unten gezeigt:
3' .. TC TCA ACA ATG GCA ... Karotten-Ölkörperprotein (SEQ ID NO:9)
3' .. CG GCA GCA ATG GCG ... Mais-Ölkörperprotein, 18 kDa (SEQ ID NO:10)
Eine Veränderung einer einzigen Base an dem Adenin vor dem "ATG" liefert in beiden Fällen CCATGG, was eine Nco I-Stelle ist. Somit bringt die Modifikation dieser Base unter Verwendung der ortsspezifischen Mutagenese eine Nco I-Stelle ein, die direkt für die Einfügung einer codierenden DNA-Sequenz verwendet werden kann, unter der Annahme, daß keine weiteren Nco I-Stellen in der Sequenz vorhanden sind. Alternativ können andere Restriktionsstellen verwendet oder eingebracht werden, um Kassettenvektoren zu erhalten, die ein geeignetes Mittel zum Einbringen fremder DNA bereitstellen.
Die codierende Sequenz für das Fremdpeptid kann eine Vorbereitung erfordern, die ihre Ligation direkt in die eingebrachte Restriktionsstelle erlaubt. Beispielsweise kann die Einbringung einer codierenden Sequenz in die Nco I-Stelle, die in die oben beschriebenen, das Ölkörperprotein codierenden Sequenzen eingebracht wurde, die Erzeugung kompatibler Enden erfordern. Dies kann typischerweise eine Modifikation einer oder zweier Basen mittels ortsspezifischer Mutagenese erfordern, um eine Nco I-Stelle um die Translationsstartstelle des Fremdpeptids herum zu erzeugen. Dieses Peptid wird dann unter Verwendung von Nco I und eines zweiten Enzyms, welches in der Nähe des Translationsstopsignals des Ziels schneidet, von seinem Klonierungsvehikel abgetrennt. Wiederum unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren kann eine zweite geeignete Stelle mittels ortsspezifischer Mutagenese eingebracht werden. Von Qu und Huang (1990, a.a.O.) wurde vorgeschlagen, daß das N-terminale Methionin während der Verarbeitung des Pflanzen-Ölkörperproteins in vivo entfernt werden könnte und daß das hierzu unmittelbar stromabwärts liegende Alanin acyliert werden könnte. Um dieser Möglichkeit Rechnung zu tragen, kann es notwendig sein, die Met-Ala-Sequenz am N-terminalen Ende des Proteins zurückzubehalten. Dies wird unter Verwendung einer Vielzahl von Strategien, die in oder nach dem Ala-Codon eine geeignete Restriktionsstelle in die codierende Sequenz einbringen, leicht bewerkstelligt.
Die aus diesen N-terminalen Fusionen resultierenden Konstrukte enthalten eine Ölkörperprotein-Promotorsequenz, eine innerhalb des Leserahmens liegende Fusion einer hochwertigen Peptidcodierenden Sequenz mit ihrem eigenen ATG als Startsignal, falls notwendig, in den ersten Codons des Ölkörperproteingens und den Rest des Ölkörperproteingens und einen Terminator.
Ein dritter Fusionstyp umfaßt das Anordnen einer hochwertigen Peptid-codierenden Sequenz intern zu der codierenden Sequenz des Ölkörperproteins. Diese Art der Fusion erfordert die gleiche Strategie wie bei N-terminalen Fusionen, kann jedoch nur mit Modifikationen in Regionen mit geringer Konservierung funktional sein, da angenommen wird, daß Regionen mit hoher Konservierung in diesen Ölkörperproteinen für das Zielen des reifen Proteins wesentlich sind. Ein Hauptunterschied bei dieser Art der Fusion ist die Notwendigkeit flankierender Proteaseerkennungsstellen für die Freisetzung des Proteins. Dies bedeutet, daß es anstelle der bislang beschriebenen einzelnen Proteaseerkennungsstelle notwendig ist, daß das interessierende Protein von einer oder mehreren Kopien der Proteaseerkennungsstelle flankiert wird.
Verschiedene Strategien sind von der jeweiligen Verwendung und der DNA-Sequenz der eingefügten codierenden Region abhängig und sind für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich. Das bevorzugte Verfahren besteht darin, synthetische Oligonukleotide als Linker zu verwenden, um die von geeigneten Restriktionsstellen oder Linkern flankierte hochwertige Peptid-codierende Sequenz einzubringen. Die Orientierung wird unter Verwendung einer asymmetrisch angeordneten Restriktionsstelle in der hochwertigen Peptid-codierenden Sequenz überprüft.
Das interessierende rekombinante Polypeptid, das mittels irgendeines der hier beschriebenen speziellen Verfahren als Oleosin-Fusion hergestellt werden soll, kann irgendein Peptid oder Protein sein. Beispielsweise können Proteine verwendet werden, die den Aminosäuregehalt von Samen verändern. Diese umfassen Gene, die Proteine codieren, die reich an essentiellen Aminosäuren oder an Aminosäuren, die bei Diäten beschränkend wirken, insbesondere Arginin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan und Valin, sind. Speicherproteine, wie das 10 kDa große Zein von Zea mays mit hohem Lysingehalt oder das 2S-Paranuß-Speicherprotein mit hohem Methioningehalt, können verwendet werden. Alternativ können synthetische oder modifizierte Speicherproteine, wie Peptide, die Polylysin oder Polyphenylalanin codieren, oder Fusionen einer oder mehrerer codierender Regionen, die reich an essentiellen Aminosäuren sind, verwendet werden. Proteine können auch geeignete Zusatzstoffe für Tierfutter codieren. Diese Proteine können Enzyme für die Modifikation des Phytatgehalts von Mehl, wie Phytase, spezieller Phytase aus neuen Quellen und mit neuen Wirkungen, sein. Die Proteine können auch Hormone, wie Wachstumshormone oder Rinder-Somatotropin, codieren, die geeignet sind, um die Produktivität zu steigern. Die Proteine können auch Peptide codieren, die für die Aquakultur geeignet sind.
Die Proteine können auch diejenigen sein, wie sie für verschiedene industrielle Verfahren verwendet werden. Beispiele solcher Proteine umfassen Chitinase, Glucoseisomerase, Collagenase, Amylase, Xylanase, Zellulase, Lipase, Chymosin, Rhenin oder verschiedene Proteasen oder Proteaseinhibitoren. Es ist auch möglich, interessierende Proteine für die Kosmetikindustrie zu exprimieren, wie beispielsweise Collagen, Keratin oder verschiedene andere Proteine zur Verwendung bei der Formulierung von Kosmetika. Für die Nahrungsmittelindustrie geeignete Proteine können ebenfalls synthetisiert werden, wie beispielsweise Süßungsmittel-Proteine, wie Thaumatin, und andere geschmacksverstärkende Proteine. Proteine mit Adhäsionseigenschaften können ebenfalls verwendet werden.
Von besonderem Interesse sind diejenigen Proteine oder Peptide, die möglicherweise einen therapeutischen oder diagnostischen Wert haben. Diese Proteine umfassen Antigene, wie Virushüllproteine oder Proteine in den Zellwänden von Mikroben oder Toxinproteine oder verschiedene andere antigene Peptide, Peptide mit direktem therapeutischem Wert, wie Interleukin-1-β, das Antikoagulationsmittel Hirudin, Blutgerinnungsfaktoren und bakterizide Peptide, Antikörper, insbesondere einen Einzelketten-Antikörper, umfassend eine translationale Fusion der VH- oder VL-Ketten eines Immunglobulins. Menschliches Wachstumshormon kann ebenfalls erzeugt werden. Die Erfindung ist nicht durch die Quelle oder die Verwendung des rekombinanten Polypeptids beschränkt.
Die das interessierende Polypeptid codierende DNA-Sequenz kann synthetisch, natürlich abgeleitet oder eine Kombination daraus sein. In Abhängigkeit von der Art oder Quelle der das interessierende Polypeptid codierenden DNA-Sequenz kann es wünschenswert sein, die DNA-Sequenz mit Codons zu synthetisieren, die die Präferenz des Organismus, in welchem die Expression stattfindet, repräsentieren. Für eine Expression in Pflanzenspezies kann man von Pflanzen bevorzugte Codons verwenden. Die von Pflanzen bevorzugten Codons können anhand der in den Proteinen, die in der betreffenden interessierenden Pflanzenspezies als Wirtspflanze in der größten Menge exprimiert werden, am häufigsten vorkommenden Codons bestimmt werden.
Die verwendete Terminationsregion ist in erster Linie eine einfach zu verwendende Region, da in vielen Fällen die Terminationsregionen relativ austauschbar zu sein scheinen. Die Terminationsregion kann für die Transkriptionsinitiationsregion nativ sein, sie kann für die das interessierende Polypeptid codierende DNA-Sequenz nativ sein oder sie kann von einer anderen Quelle abgeleitet sein. Geeignete Terminationsregionen für die Expression in Pflanzenzellen sind aus dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens erhältlich, wie beispielsweise die Terminationsregionen von Octopinsynthase und Nopalinsynthase. Terminationssignale für die Expression in anderen Organismen sind in der Literatur gut bekannt.
Für die Einbringung von DNA in Wirtszellen steht eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Beispielsweise können die chimären DNA-Konstrukte unter Verwendung von standardmäßigen Agrobacterium-Vektoren durch ein Transformationsprotokoll, wie es beispielsweise von Moloney et al., 1989, Plant Cell Rep., 8:238–242, oder Hinchee et al., 1988, Bio/Technol., 6:915–922, beschrieben ist, oder unter Verwendung anderer Techniken, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, in Wirtszellen eingebracht werden, die aus dikotyledonen Pflanzen, wie Tabak, und Öl produzierenden Spezies, wie Brassica napus, erhalten wurden. Beispielsweise wurden der Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen intensive Untersuchungen gewidmet, und sie ist in EPA-Seriennummer 120516, Hoekema et al., 1985, Kapitel V, in: The Binary Plant Vector System, Offset-drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Knauf et al., 1983, Genetic Analysis of Host Range Expression by Agrobacterium, S. 245, in: Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction, Puhler, A., Hrsg., Springer-Verlag, NY, und An et al., 1985, EMBO J., 4:277–284, ausführlich beschrieben. In geeigneter Weise können Explantate mit A. tumefaciens oder A. rhizogenes kultiviert werden, um die Übertragung des Transkriptionskonstrukts auf die Pflanzenzellen zu ermöglichen. Nach der Transformation unter Verwendung von Agrobacterium werden die Pflanzenzellen zur Selektion in einem geeigneten Medium dispergiert, anschließend werden der Kallus, Sprosse und schließlich Jungpflanzen gewonnen. Der Agrobacterium-Wirt beherbergt ein Plasmid, welches die vir-Gene umfaßt, die für die Übertragung der T-DNA auf die Pflanzenzellen notwendig sind. Für die Injektion und die Elektroporation (siehe unten) können unschädlich gemachte Ti-Plasmide (denen die Tumorgene, insbesondere die T-DNA-Region, fehlen) in die Pflanzenzelle eingebracht werden.
Die Verwendung von Techniken ohne Agrobacterium gestattet die Verwendung der hier beschriebenen Konstrukte, um eine Transformation und Expression in einer großen Vielzahl monokotyledoner und dikotyledoner Pflanzen und anderer Organismen zu erhalten. Diese Techniken sind insbesondere geeignet für Spezies, die in einem Transfektionssystem mit Agrobacterium schwer zu bearbeiten sind. Weitere Techniken zur Genübertragung umfassen die Biolistik (Sanford, 1988, Trends in Biotech., 6:299–302), die Elektroporation (Fromm et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5824–5828, Riggs und Bates, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5602–5606) oder die PEG-vermittelte DNA-Aufnahme (Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet., 199:169–177).
In einer speziellen Anwendung, wie z.B. auf Brassica napus, sind die Wirtszellen, die so ausgerichtet sind, daß sie rekombinante DNA-Konstrukte aufnehmen, typischerweise von Kotyledonenstielen abgeleitet, wie es von Moloney et al. (1989, Plant Cell Rep., 8:238–242) beschrieben wird. Weitere Beispiele unter Verwendung kommerziell erhältlicher Ölsamen umfassen die Transformation von Keimblättern in Sojabohnenexplantaten (Hinchee et al., 1988, Bio/Technology, 6:915–922) und die Transformation von Baumwollstielen (Umbeck et al., 1981, Bio/Technology, 5:263–266).
Nach der Transformation werden die Zellen, beispielsweise in Form von Blattscheiben, in selektivem Medium gezüchtet. Sobald sich Sprosse zu bilden beginnen, werden diese abgetrennt und auf Bewurzelungsmedium gegeben. Nachdem sich ausreichend Wurzeln gebildet haben, werden die Pflanzen in Boden überführt. Mutmaßlich transformierte Pflanzen werden dann hinsichtlich des Vorhandenseins eines Markers getestet. Southern-Blot-Analyse wird unter Verwendung einer geeigneten Sonde, wie z.B. eines Oleosingens aus A. thaliana, an genomischer DNA durchgeführt, um zu zeigen, daß die Integration der gewünschten Sequenzen in das Wirtszellgenom stattgefunden hat.
Die Expressionskassette ist für die Selektion in Pflanzenzellen normalerweise mit einem Marker verbunden. In geeigneter Weise kann der Marker Resistenz gegen ein Herbizid, z.B. Phosphinthricin oder Glyphosat, oder spezieller ein Antibiotikum, wie Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin, Chloramphenicol oder dergleichen, sein. Der bestimmte verwendete Marker ist ein Marker, der die Selektion transformierter Zellen im Vergleich zu Zellen, in die die rekombinante DNA nicht eingebracht wurde, erlaubt.
Das Fusionspeptid in der wie oben beschrieben hergestellten Expressionskassette wird zumindest bevorzugt in sich entwickelnden Samen exprimiert. Dementsprechend läßt man transformierte Pflanzen, die gemäß konventioneller Methoden gezüchtet wurden, Samen bilden. Siehe beispielsweise McCormick et al. (1986, Plant Cell Reports, 5:81–84). Northern-Blot-Analyse kann unter Verwendung einer geeigneten Gensonde mit RNA, isoliert aus Gewebe, von dem erwartet wird, daß die Transkription darin stattfindet, wie z.B. einem Keimblatt, durchgeführt werden. Die Größe der Transkripte kann dann mit der vorhergesagten Größe für das Fusionsproteintranskript verglichen werden.
Dann werden Ölkörperproteine aus dem Samen isoliert, und es werden Analysen durchgeführt, um zu bestimmen, ob das Fusionspeptid exprimiert wurde. Die Analysen können beispielsweise mittels SDS-PAGE durchgeführt werden. Das Fusionspeptid kann unter Verwendung eines Anti körpers gegen den Oleosinteil des Fusionspeptids detektiert werden. Die Größe des erhaltenen Fusionspeptids kann dann mit der vorhergesagten Größe des Fusionsproteins verglichen werden.
Zwei oder mehrere Generationen transgener Pflanzen können gezüchtet und entweder gekreuzt oder mit sich selbst vermehrt werden, um die Identifikation von Pflanzen und Stämmen mit den gewünschten phänotypischen Charakteristika, einschließlich der Produktion rekombinanter Proteine, zu erlauben. Es kann wünschenswert sein, die Homozygotie der rekombinante Proteine produzierenden Pflanzen, Stämme oder Zuchtlinien sicherzustellen, um eine kontinuierliche Weitervererbung des Merkmals der Rekombinanz zu gewährleisten. Verfahren zur Selektion homozygoter Pflanzen sind Fachleuten auf dem Gebiet der Pflanzenzucht gut bekannt und umfassen die wiederholte Vermehrung mit sich selbst und Selektion und die Kultur von Antheren und Mikrosporen. Homozygote Pflanzen können auch durch Transformation haploider Zellen oder Gewebe erhalten werden, gefolgt von der Regeneration haploider Jungpflanzen, die anschließend unter Verwendung einer Reihe bekannter Mittel (z.B. Behandlung mit Colchicin oder anderen Mikrotubuli zerstörenden Mitteln) in diploide Pflanzen umgewandelt werden.
Das gewünschte Protein kann unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken, einschließlich der Verwendung eines wäßrigen gepufferten Extraktionsmediums und eines Mittels zum Mahlen, Aufbrechen oder Pulverisieren oder anderweitigem Stören der Zellen der Samen, aus Samen extrahiert werden, der vorzugsweise für das eingebrachte Merkmal homozygot ist. Die extrahierten Samen können dann (beispielsweise mittels Zentrifugation oder Sedimentation des Breis) in drei Fraktionen aufgeteilt werden: ein Sediment oder ein unlösliches Pellet, einen wäßrigen Überstand und eine aufschwimmende Schicht, die Samenspeicherlipid und Ölkörper enthält. Diese Ölkörper enthalten sowohl native Ölkörperproteine als auch chimäre Ölkörperproteine, wobei letztere das Fremdpeptid enthalten. Die Ölkörper werden von den wasserlöslichen Proteinen getrennt und in wäßrigem Puffer resuspendiert.
Wenn ein Linker, der ein Proteaseerkennungsmotiv enthält, in die Expressionskassette aufgenommen wurde, wird eine für das Erkennungsmotiv spezifische Protease zu dem Resuspensionspuffer zugegeben. Dadurch wird das benötigte Peptid in die wäßrige Phase freigesetzt. Eine zweite Zentrifugationsstufe verflüssigt die verarbeiteten Ölkörper mit den daran angehängten Proteinen nun wieder und ergibt eine wäßrige Lösung des freigesetzten Peptids oder Proteins. Das Fremdpeptid kann auch durch Inkubieren der Ölkörperfraktion mit einer anderen Ölkörperfraktion, die die spezifische, mit Oleosin fusionierte Protease enthält, aus den Ölkörpern freigesetzt werden. Auf diese Weise wird das Proteasespaltungsenzym mit den Ölkörpern, die das Fusionsprotein mit der Proteaseerkennungsstelle enthielten, entfernt, und es verbleibt ein durch Protease nicht kontaminiertes Produkt. Das gewünschte Peptid kann je nach seinen Eigenschaften und der gewünschten Verwendung präzipitiert, chemisch modifiziert oder lyophilisiert werden.
Bei bestimmten Verwendungen kann das Protein in der Lage sein, eine Selbstfreisetzung zu durchlaufen. Beispielsweise durchläuft das proteolytische Enzym Chymosin eine Selbstaktivierung von einem Vorläufer zu einer aktiven Protease, indem der Vorläufer Bedingungen mit niedrigem pH-Wert ausgesetzt wird. Die Aussetzung des Chymosin-Vorläufer/Oleosin-Fusionsproteins an Bedin gungen mit niedrigem pH-Wert aktiviert das Chymosin. Wenn eine Chymosinerkennungsstelle zwischen der Proteinsequenz von Oleosin und Chymosin enthalten ist, kann das aktivierte Chymosin dann die Fusionsproteine spalten. Dies ist ein Beispiel der Selbstfreisetzung, die durch Manipulation der für die Enzymaktivität erforderlichen Bedingungen kontrolliert werden kann. Zusätzliche Beispiele können von dem Erfordernis spezifischer Cofaktoren, die hinzugefügt werden können, wenn eine Selbstspaltung erwünscht ist, abhängig sein. Diese können Ionen, spezifische chemische Cofaktoren, wie NADH oder FADH, ATP oder andere Energiequellen oder Peptide, die zur Aktivierung bestimmter Enzyme in der Lage sind, umfassen. In bestimmten Anwendungsfällen ist es möglicherweise nicht notwendig, das chimäre Protein von dem Ölkörperprotein zu entfernen. Eine solche Anwendung umfaßt Fälle, bei denen das Fusionspeptid ein Enzym beinhaltet, welches gegenüber N- oder C-terminalen Fusionen tolerant ist und seine Aktivität beibehält; solche Enzyme könnten ohne weitere Spaltung und Reinigung verwendet werden. Das chimäre Enzym/Ölkörperprotein wird mit Substrat als ein Fusionsprotein in Kontakt gebracht. Es ist auch möglich, die Ölkörper erneut zu verwenden, um zusätzliches Substrat als eine Form eines immobilisierten Enzyms zu verarbeiten. Dieses spezielle Verfahren findet Anwendung bei der chargenweisen Verarbeitung verschiedener Substanzen. Das Verfahren ist auch für die enzymatische Entgiftung von kontaminiertem Wasser oder Gewässern geeignet, wo die Einbringung von frei diffundierbarem Enzym unerwünscht sein kann. Das Verfahren erlaubt die Gewinnung des Enzyms mit der Entfernung der Ölkörper. Es ist, falls dies gewünscht ist, auch möglich, das Enzym-Ölkörper-Fusionsprotein unter Verwendung einer Immunoaffinitätssäule, umfassend einen immobilisierten Antikörper gegen das Ölkörperprotein mit hohem Titer, zu reinigen.
Weitere Verwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung sind die folgenden. Ölkörperproteine machen einen großen Prozentanteil des gesamten Samenproteins aus, so daß es möglich ist, den Samen mit bestimmten wünschenswerten Eigenschaften, wie hohem Lysingehalt, hohem Methioningehalt und dergleichen, anzureichern, indem einfach dafür gesorgt wird, daß das Fusionsprotein reich an der (den) gewünschten Aminosäure(n) ist; dies könnte vor allem bei der Modifikation von Korn und Getreiden, die entweder direkt oder indirekt als Futter- bzw. Nahrungsmittelquelle für Vieh, einschließlich Rindern, Geflügel und Menschen verwendet werden, von besonderem Interesse und Nutzen sein. Möglicherweise kann als das Fusionspeptid ein Enzym aufgenommen werden, welches die nachfolgende Verarbeitung des Öls oder des Mehls beim herkömmlichen Auspressen und der Extraktion von Ölsamen unterstützen kann, beispielsweise durch Aufnahme eines thermostabilen lipidmodifizierenden Enzyms, welches bei den erhöhten Temperaturen des Auspressens, die zur Verarbeitung von Samen verwendet werden, aktiv bleibt und somit das extrahierte Triglycerid oder Proteinprodukt aufwertet. Weitere Verwendungsformen des Fusionsproteins umfassen die Verwendung zur Verbesserung der agronomischen Gesundheit der Ernte. Beispielsweise könnte ein insektizides Protein oder ein Teil eines für einen landwirtschaftlichen Schädling, wie einer Pilzzellwand oder -membran, spezifischen Immunglobulins, mit dem Ölkörperprotein gekoppelt werden und so den Befall des Samens durch einen bestimmten Pflanzenschädling reduzieren.
Möglicherweise ist das Polypeptid/Protein selbst wertvoll und könnte extrahiert und, falls gewünscht, weiter gereinigt werden. Alternativ kann das Polypeptid/Protein oder sogar die mRNA selbst verwendet werden, um auf den sich entwickelnden Samen einen neuen biochemischen Phänotyp zu übertragen. Neue Phänotypen könnten solche Modifikationen, wie eine veränderte Zusammensetzung des Samenproteins oder des Samenöls, eine gesteigerte Produktion bereits bestehender wünschenswerter Produkte oder Eigenschaften und die Reduzierung oder gar Unterdrückung eines unerwünschten Genprodukts unter Verwendung von Antisense-, Ribozym- oder Cosuppressionstechniken, beinhalten (Izant und Weintraub, 1984, Cell 36:1007–1015, Hazelhoff und Gerlach, 1988, Nature 334:585–591, Napoli et al., 1990, Plant Cell, 2:279–289). Obwohl eine Ausführungsform der Erfindung die Verwendung der regulatorischen Sequenz in zu den Kreuzblütlern gehörenden Pflanzen in Erwägung zieht, ist es aufgrund der weitgehenden Konservierung von Oleosingenen möglich, den Promotor in einer breiten Vielzahl von Pflanzenspezies zu verwenden. Beispielsweise könnte der Promotor in verschiedenen anderen dikotyledonen Spezies sowie auch in einer monokotyledonen Pflanze verwendet werden. Eine Reihe von Studien hat gezeigt, daß die räumliche und zeitliche Regulation der Gene dikotyledoner Pflanzen bei Expression in einem monokotyledonen Wirt konserviert werden kann. Es wurde gezeigt, daß das rbcS-Gen aus der Tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102:991–1000) und das Pin2-Gen aus der Kartoffel (Xu et al., 1993, Plant Physiol. 101:683–687) in einem monokotyledonen Wirt aktiv sind, der mit ihrem Expressionsmuster konsistent ist, wie es in dem Wirt, aus dem sie abgeleitet wurden, beobachtet wurde. Studien haben auch gezeigt, daß die Expression einiger dikotyledoner Promotoren in monokotyledonen Wirten durch die Aufnahme eines von einem monokotyledonen Gen abgeleiteten Introns im codierenden Bereich des eingebrachten Gens gesteigert werden kann (Xu et al., 1994, Plant Physiol. 106:459–467). Alternativ ist es dem Fachmann gemäß der in dieser Beschreibung ausgeführten Verfahren und in Anbetracht der weitgehenden Konservierung von Oleosingenen leicht möglich, Oleosingene aus einer Vielzahl von Wirtspflanzen zu isolieren.
Es wird erwartet, daß die gewünschten Proteine in allen embryonalen Geweben exprimiert werden, obwohl in verschiedenen Geweben der embryonalen Achse und der Keimblätter eine unterschiedliche zelluläre Expression detektiert werden kann. Diese Erfindung hat viele Verwendungsmöglichkeiten, einschließlich der Verbesserung des intrinsischen Werts von Pflanzensamen durch die Ansammlung veränderter Polypeptide oder neuer rekombinanter Peptide oder durch die Aufnahme oder Eliminierung eines Stoffwechselschritts. In ihrer einfachsten Ausführungsform kann die Verwendung dieser Erfindung zu einer gesteigerten Proteinqualität (beispielsweise erhöhte Konzentrationen von essentiellen oder seltenen Aminosäuren), einer gesteigerten Lipidqualität durch Modifikation der Fettsäurezusammensetzung oder einer gesteigerten oder erhöhten Kohlehydratzusammensetzung führen. Die Erfindung kann auch verwendet werden, um einen Samenphänotyp, wie die Farbe der Samenschale, oder sogar die Entwicklung von Samen zu kontrollieren. In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, ein Gen zu exprimieren, welches die Samenentwicklung in einem bestimmten Stadium stoppt, was zur Erzeugung von "samenlosen" Früchten oder Samen, die große Mengen an Vorläufern reifer Samenprodukte enthalten, führt. Die Extraktion dieser Vorläufer kann in diesem Fall vereinfacht werden.
Weitere Verwendungsformen umfassen die Aufnahme von Fusionsproteinen, die Antigene oder Impfstoffe gegen Krankheiten enthalten. Diese Anwendung kann insbesondere für Verbesserungen in der Gesundheitspflege bei Fischen oder anderen Wildtieren relevant sein, die nicht durch konventionelle Mittel bewertbar ist, da die ausgepreßten Samen direkt in eine geeignete Nahrungs- bzw. Futtermittelquelle umgewandelt werden können. Weitere Verwendungsformen umfassen die Zugabe von Phytase, um die Nährstoffeigenschaften von Samen für monogastrische Tiere durch die Freisetzung von Phosphat aus gespeichertem Phytat zu verbessern, die Zugabe von Chlorophyllase, um eine unerwünschte Kontamination der Samenöle, insbesondere von Canolaöl, mit Chlorophyll zu reduzieren, und die Zugabe von Enzymen, um Antimetaboliten, Pigmente oder Toxine in Samen zu reduzieren. Zusätzlich kann das Fusionsprotein ein insektizides oder fungizides Protein, wie Magainin oder Secropin, oder einen Teil eines für einen landwirtschaftlichen Schädling, wie z.B. eine Pilzzellwand oder -membran, spezifischen Immunglobulins umfassen, das bzw. der an das Ölkörperprotein gekoppelt ist und dadurch die Beständigkeit des Samens gegen Verderben vor und nach der Ernte verbessert.
Anwendungsmöglichkeiten für chimäre Proteine, die mit der Ölkörperfraktion assoziiert sind, umfassen wie oben Enzyme, die gegenüber N- oder C-terminalen Fusionen tolerant sind und die Aktivität beibehalten. Mit Ölkörpersuspensionen assoziierte Enzyme können mit einfachen oder komplexen, Enzymsubstrate enthaltenden Lösungen gemischt werden. Nach der Umwandlung der Substrate in Produkte wird die Enzym-Oleosin-Fusion mittels Zentrifugation und Flotation leicht gewonnen und kann unbegrenzt wiederverwendet werden.
Die folgenden Beispiele werden lediglich zu Veranschaulichungszwecken angegeben und sollen nicht beschränkend sein.
Beispiel 1: Isolation von Pflanzen-Oleosingen. Ölkörperproteine können aus einer Vielzahl von Quellen isoliert werden. Die Isolation eines Ölkörperproteingens (Oleosin) aus der Pflanzenspezies Arabidopsis thaliana wird hier beschrieben. Ähnliche Verfahren können von einem Fachmann auf dem Gebiet verwendet werden, um Ölkörperproteine aus anderen Quellen zu isolieren. In diesem Beispiel wurde ein Oleosingen aus Brassica napus (beschrieben von Murphy et al., 1991, Biochim. Biophys. Acta 1088:86–94) verwendet, um eine in dem Lambda-Klonierungsvektor EMBL 3A (erhalten von Stratagene Laboratories) konstruierte genomische Bibliothek von A. thaliana (Sorte Columbia) unter Verwendung von Standardtechniken zu screenen. Das Screening führte zu der Isolierung eines Klons von EMBL 3A (bezeichnet als Klon 12.1) mit einem 15 kb langen genomischen Fragment, welches ein Oleosingen von A. thaliana enthält. Die codierende Region des Oleosingens ist in einem 6,6 kb langen Kpn I-Restriktionsfragment dieses 15 kb langen Fragments enthalten. Das 6,6 kb lange Kpn I-Restriktionsfragment wurde weiter kartiert, und ein 1,8 kb langes Nco I/Kpn I-Fragment, welches das Oleosingen einschließlich ungefähr 850 Nukleotide der 5'-Sequenz enthielt, die komplette codierende Sequenz und die 3'-Region wurden isoliert. Diese 1,8 kb lange Fragment wurde am Ende aufgefüllt und an die Sma I-Stelle von RFM13mp19 subkloniert. Das 1,8 kb lange Insert wurde mit einer Reihe standardmäßiger Restriktionsenzyme weiter verdaut und für die Sequenzierung in M13mp19 subkloniert. Standardmäßige Klonierungsverfahren wurden gemäß Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press) durchgeführt. Die Nukleotidsequenz wurde bestimmt, und die 1,8 kb lange Sequenz des Oleosingens aus A. thaliana ist in 2 und SEQ ID NO:1 gezeigt. Diese bestimmte DNA-Sequenz codiert ein 18 kDa großes Oleosingen aus A. thaliana. Die codierende Region enthält ein einzelnes Intron. Dieses Gen wurde für die Konstruktion rekombinanter Proteinexpressionsvektoren verwendet. Das Gen kann auch zum Screenen genomischer Bibliotheken anderer Spezies verwendet werden.
Beispiel 2: Modifikation eines nativen Oleosins für die Expression heterologer Proteine. Das in Beispiel 1 beschriebene DNA-Fragment, welches das Oleosingen und regulatorische Elemente enthält, wurde in eine Expressionskassette zur Verwendung mit einer Vielzahl fremder/alternativer Gene eingebracht. Das nachfolgend Beschriebene veranschaulicht die an dem nativen Oleosingen, insbesondere dem Promotor und der codierenden Region, aus A. thaliana vorgenommene Modifikation, um dieses Gen zur Veranschaulichung der Erfindung zu verwenden. Es wird in Betracht gezogen, daß eine Vielzahl von Techniken verwendet werden kann, um rekombinante Moleküle zu erhalten; dementsprechend dient dieses Beispiel lediglich der Veranschaulichung und soll nicht beschränkend sein. Das in Beispiel 1 beschriebene Oleosingen aus A. thaliana wurde als ein 1803 bp langes Fragment, flankiert durch Nco I- und Kpn I-Stellen, in einen mit pPAW4 bezeichneten Vektor kloniert. Das Plasmid pPAW4 ist ein Klonierungsvehikel, das von dem Plasmid pPAW1 abgeleitet ist, welches ein Bluescript-Plasmid (Clonetech Laboratories) ist und ein Acetolactatsynthase- (ALS-)Gen aus Brassica napus enthält (Wiersma et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 219:413–420). Um pPAW4 zu konstruieren, wurde das Plasmid pPAW1 mit Kpn I verdaut. Die verdaute DNA wurde Agarosegelelektroforese unterzogen, und das Fragment, welches das Rückgrat des Bluescript-Plasmidvektors und einen 677 Basenpaare langen Abschnitt des ALS-Gens aus B. napus enthielt, wurde isoliert und erneut ligiert. Dieses Plasmid enthält die folgenden eindeutigen Restriktionsstellen in dem Insert: Pst I, Nco I, Hind III und Kpn I. Dieses Plasmid wurde mit pPAW4 bezeichnet. Das 1803 bp lange Nco I-Kpn I-Oleosingenfragment aus Arabidopsis wurde zwischen den Nco I- und Kpn I-Stellen in pPAW4 kloniert. Das resultierende Plasmid enthielt zusätzlich zu den Bluescript-Plasmidsequenzen ein von dem ALS-Gen aus B. napus abgeleitetes 142 bp langes Pst I-Nco I-Fragment und das ganze 1803 bp lange Oleosingen aus Arabidopsis. Das 142 bp lange Pst I-Nco I-Fragment liegt infolge des Klonierungsansatzes nur als "Stuffer"-Fragment vor und wird in Oleosin-Expressionskonstrukten nicht verwendet.
Das resultierende Plasmid wurde verwendet, um das Oleosingen aus Arabidopsis weiter zu modifizieren. Ortsspezifische Mutagenese wurde verwendet, um Nukleotidänderungen an den Positionen –2, –1 und +4 in der in 2 gezeigten DNA-Sequenz einzubringen. Die vorgenommenen Änderungen waren die folgenden: A zu T (Nukleotidposition –2), A zu C (Nukleotidposition –1) und G zu A (Nukleotidposition +4). Diese Nukleotidänderungen erzeugen eine 6 Nukleotide umfassende Bsp HI-Restriktionsendonukleasestelle an den Nukleotidpositionen –2 bis +4. Die Bsp HI-Stelle (T/CATGA) umschließt das ATG-Initiationscodon und liefert ein zurückgesetztes Ende, das mit Nco I kompatibel ist. Eine zweite Modifikation wurde durch Verdau mit den Enzymen Eco RV und Msc I vorgenommen, welche ein 658 bp langes Fragment freisetzten, das den größten Teil der codierenden Sequenz des nativen Oleosins enthielt. Dieser Verdau hinterließ stumpfe Enden sowohl an der Eco RV- als auch an der Msc I-Stelle. Der geschnittene Vektor wurde in Gegenwart eines Oligonukleotidlinkers rezirkularisiert, welcher die folgenden eindeutigen Restriktionsstellen enthält: Hind III, Bgl II, Sal I, Eco RI und Cla I. Das rezirkularisierte Plasmid enthielt alle 5'-regulatorischen Sequenzen des Oleosingens, eine Transkriptionsstartstelle und ein in eine Bsp HI-Stelle eingebettetes Initiationscodon. Einunddreißig Basen stromabwärts hiervon befindet sich ein kurzer Polylinker, der eindeutige Restriktionsstellen enthält. Dieses Plasmid wurde mit pOleoP1 bezeichnet. Die Restriktionskartierung dieses Konstrukts ist in 3 gezeigt.
Bei der Einbringung irgendeiner DNA-Sequenz in pOleoP1 erfordert diese bestimmte Kassette, daß die fremde DNA-Sequenz eine Bsp HI- oder eine Nco I-Stelle an der anfänglichen ATG-Position aufweist oder daß sie so modifiziert wurde, daß sie eine solche aufweist. Dies gewährleistet die Aufrechterhaltung des Abstands zwischen der "Kappen"-Stelle und dem Initiationscodon. Alternativ können Restriktionsstellenlinker hinzugefügt werden, um die Einbringung in die Kassette zu erleichtern. Die gleiche Restriktionsstelle kann für die Stelle der Einbringung des 3'-Endes des Gens ausgewählt werden, oder Linker können hinzugefügt werden, um geeignete Stellen einzubringen. Das komplette chimäre Konstrukt wird dann unter Verwendung des geeigneten Restriktionsenzyms (der geeigneten Restriktionsenzyme) abgetrennt und in einen geeigneten Pflanzen-Transformationsvektor eingebracht.
Beispiel 3: Verwendung des Oleosinpromotors aus Arabidopsis zum Kontrollieren der Expression in heterologen Pflanzenspezies. Um die Expression des Oleosinpromotors zu zeigen und um die Menge der 5'-regulatorischen Region zu bestimmen, die für die Expression in transgenen Pflanzen notwendig ist, wurde eine kleine Anzahl von DNA-Konstrukten hergestellt, die die 5'-Transkriptions-Initiationsregion des Oleosingens aus Arabidopsis, die mit der codierenden Region für β-Glucuronidase (GUS) verbunden ist, enthalten. Diese Konstrukte wurden unter Verwendung von PCR hergestellt. Die Konstrukte werden entsprechend der Menge der darin enthaltenen 5'-Region von Oleosin ausgestaltet, beispielsweise umfaßt das 2500-Konstrukt ungefähr 2500 Basenpaare der 5'-Region von Oleosin. Die Konstrukte wurden in Brassica napus und Tabak eingebracht, und die Expression des β-Glucuronidase-(GUS-)Gens wurde gemessen, wie es unten ausführlich beschrieben ist. Die Konstrukte wurden unter Verwendung standardmäßiger molekularbiologischer Techniken, einschließlich Restriktionsenzymverdau, Ligation und Polymerasekettenreaktion (PCR), hergestellt. Zur Veranschaulichung der verwendeten Techniken wird die Konstruktion des 800-Konstrukts ausführlich beschrieben.
Um ein DNA-Fragment, welches ungefähr 800 Basenpaare der 5'-Transkriptions-Initiationsregion des Oleosingens aus Arabidopsis enthält, in einer Ausgestaltung zu erhalten, die für die Ligation an eine GUS codierende Sequenz geeignet ist, wurde PCR verwendet. Um die notwendige PCR-Vervielfältigung durchzuführen, wurden zwei Oligonukleotidprimer synthetisiert (Milligen-Biosearch, Cyclone DNA-Syntheseautomat). Der erste Primer, der 5'-Primer, wurde mit GVR10 bezeichnet und hatte die folgende Sequenz (ebenfalls gezeigt in SEQ ID NO:11):
5'-CACTGCAGGAACTCTCTGGTAA-3' (GVR10)
Die kursiv gedruckten Basen entsprechen den Nukleotidpositionen -833 bis -817 in der in 2 gezeigten Sequenz. Die Pst I-Stelle ist unterstrichen. Die zusätzlichen Nukleotide 5' zu dieser Sequenz in dem Primer sind nicht identisch mit dem Oleosingen, wurden jedoch mit aufgenommen, um eine Pst I-Stelle am 5'-Ende des Vervielfältigungsprodukts anzuordnen.
Der zweite Primer, der 3'-Primer, wird mit ALP 1 bezeichnet und hat die folgende Sequenz (ebenfalls gezeigt in SEQ ID NO:12):
5'-CTACCCGGGATCCTGTTTACTAGAGAGAATG-3' (ALP 1)
Dieser Primer enthält das exakte Komplement (dargestellt in Kursivdruck) zu der in 2 gezeigten Sequenz von den Basen -13 bis -30. Zusätzlich enthält er weitere 13 Basen am 5'-Ende, die hinzugefügt wurden, um zwei (einander überlappende) Restriktionsstellen, Sma I (Erkennung CCCGGG) und Bam HI (Erkennung GGATCC), am 3'-Ende des Vervielfältigungsprodukts bereitzustellen, um die Klonierung des PCR-Fragments zu vereinfachen. Sowohl die Sma I- als auch die Bam HI-Stelle sind unterstrichen; die Bam HI-Stelle ist durch doppelte Unterstreichung dargestellt.
Diese beiden Primer wurden in einer PCR-Vervielfältigungsreaktion verwendet, um ein DNA-Fragment zu erzeugen, welches die Sequenz zwischen den Nukleotiden -833 und -13 des Oleosingens enthält, das nun eine Pst I-Stelle am 5'-Ende und Sma I- und Bam HI-Stellen am 3'-Ende enthält. Die Matrize bildete der genomische Oleosinklon 12.1, der in Beispiel 1 beschrieben wurde.
Das Vervielfältigungsprodukt wurde mit OLEO p800 bezeichnet und wurde mittels eines Gels gereinigt und mit Pst I verdaut. Das Produkt des Verdaus wurde mittels eines Gels gereinigt und unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase am Ende aufgefüllt und dann unter Erzeugung eines stumpfendigen Fragments mit Sma I geschnitten. Dieses Fragment wurde unter Erhalt des Plasmids pUC OLEOp800 in die Sma I-Stelle von pUC19 kloniert. Dieses Plasmid enthielt das Insert in einer solchen Orientierung, daß das Ende des vervielfältigten Fragments, das die Pst I-Stelle enthielt, proximal zu der einzigartigen Hind III-Stelle in dem pUC19-Klonierungsvektor ist und das Ende des vervielfältigten Fragments, welches die Sma I- und die Bam HI-Stelle enthält, proximal zu der einzigartigen Eco RI-Stelle in pUC19 ist. Dieser Subklon enthält nun ungefähr 800 Basenpaare der 5'-regulatorischen Region des Oleosingens aus Arabidopsis.
Die in dem Plasmid pUC OLEOp800 enthaltene Promotorregion wurde mit dem Reportergen GUS fusioniert. Dies wurde durch Substitution der Oleosin-Promotorregion durch einen mit einem GUS-Gen fusionierten Hitzeschockpromotor in dem Plasmid HspGUS1559 bewerkstelligt. HspGUS1559 ist ein Plasmid, das als binärer Vektor in Agrobacterium verwendet wird, abgeleitet von dem Vektor pCGN 1559 (MacBride und Summerfeldt, 1990, Plant Molecular Biology, 14, 269– 276), mit einem Insert, welcher den Hitzeschockpromotor (flankiert durch Bam HI-Stellen), den offenen Leserahmen für β-Glucuronidase und einen Nopalinsynthaseterminator (abgeleitet von pB1221, Jefferson, R.A. in Cloning Vectors, 1988, Hrsg. Pouwels, P., Enger-Valk, B.E., Brammer, W.J., Elsevier Science Pub BV, Amsterdam Abschnitt VII, Ai11) enthält. Das binäre Plasmid HspGUS1559 wurde mit Bam HI verdaut, was zur Freisetzung des Hitzeschockpromotors führte und die Einfügung eines Bam HI-Fragments an seiner Stelle erlaubte. pUC OLEOp800 wurde dann unter Erhalt eines durch Bam HI-Stellen flankierten Promotorfragments mit Bam HI geschnitten. Dieses Fragment wurde unter Erhalt des binären Transformationsvektors pOLEOp8000US1559 von Agrobacterium in die Bam HI-Stellen des Plasmids HspGUS1559 kloniert. Die anderen Konstrukte wurden durch das gleiche PCR-Verfahren hergestellt, wie es oben beschrieben wurde, unter Verwendung der geeigneten Primer zur Vervielfältigung des -2500-Fragments, des -1200-Fragments, des -600-Fragments oder des -200-Fragments. Diese Plasmide wurden verwendet, um Brassica napus und Tabak zu transformieren. GUS-Expressionsassays (Jefferson, R.A., 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387–405) wurden mit den sich entwickelnden Samen und sich nicht reproduzierenden Pflanzenteilen als Kontrollen durchgeführt. Die mit Brassica napus erzielten Ergebnisse, die als spezifische Aktivität des GUS-Enzyms ausgedrückt sind, sind in Tabelle I gezeigt. Die mit Tabak erzielten Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt. Die gezeigte Expression von GUS ist ein Durchschnittswert, der aus ungefähr fünf Samen von jeder von ungefähr fünf verschiedenen transgenen Pflanzen erhalten wurde.
Diese Ergebnisse zeigen, daß das Oleosinfragment von -833 bis -813, das in dem 800-Konstrukt verwendet wurde, ausreichende Informationen enthält, um die spezifische Expression eines Reportergens in Keimen von transgener Brassica napus bereits im Herzstadium zu steuern, und daß der Oleosinpromotor aus Arabidopsis in der Lage ist, die Transkription in anderen Pflanzen als Arabidopsis zu steuern.
Es sei angemerkt, daß die hier gezeigte spezifische Expression nicht von Wechselwirkungen mit dem nativen Terminator eines 3'-Endes des Oleosingens abhängig ist. In diesem Beispiel wurde der 3'-Oleosinpromotor durch einen von dem Nopalinsynthasegen von Agrobacterium abgeleiteten Terminator ersetzt. Somit ist die Sequenz in dem 800-Konstrukt ausreichend, um das gewünschte Expressionsprofil unabhängig von Hilfssequenzen zu erzielen.
Beispiel 4: Verwendung des Oleosinpromotors und codierender Sequenzen zur Steuerung von Fusionsproteinen zu der Ölkörperfraktion von Samen. In diesem Beispiel haben wir eine transgene Pflanze hergestellt, die unter der Kontrolle des Ölkörperpromotors Fusionsproteine exprimiert, die sich mit Ölkörpern verknüpfen. Die enzymatischen Eigenschaften der eingefügten codierenden Sequenzen bleiben während der Fusion mit dem Oleosin erhalten. In diesem Beispiel verwenden wir das von dem Mikroorganismus E. coli abgeleitete Enzym β-Glucuronidase, das unter der Kontrolle des Oleosinpromotors aus Arabidopsis mit der Oleosin codierenden Region fusioniert war (bezeichnet als eine Oleosin/GUS-Fusion). Um eine innerhalb des Leserahmens liegende GUS-Fusion mit dem Oleosin aus Arabidopsis zu erzeugen, wurden zwei Zwischenplasmide konstruiert, die als pOThromb und pGUSNOS bezeichnet werden.
Das Plasmid pOThromb umfaßt die 5'-regulatorische Region von Oleosin, die Oleosin codierende Sequenz, wobei der Carboxyterminus des Proteins durch Zugabe einer Thrombin-Spaltungsstelle modifiziert wurde. Das Plasmid pGUSNOS enthält die das GUS-Enzym codierende Region, gefolgt von dem Polyadenylierungssignal des nos-Terminators. Diese beiden Plasmide wurden verbunden, um ein Fusionsprotein zu erzeugen, welches aus dem Oleosinprotein besteht, das mittels eines Linkerpeptids, welches von der Endoprotease Thrombin erkannt wird, mit dem GUS-Enzym fusioniert ist.
Diese Plasmide wurden unter Verwendung von PCR und den unten gezeigten spezifischen Primern konstruiert. Für die Konstruktion von pOThromb wurde ein Linkeroligonukleotid mit der Bezeichnung GVR01 synthetisiert, welches die folgende (in SEQ ID NO:13 gezeigte) DNA-Sequenz hat:
Diese DNA-Sequenz enthält von den Nukleotiden 27–62 Sequenzen, die zum 3'-Ende der Arabidopsis-Oleosin codierenden Sequenz komplementär sind, von den Nukleotiden 12–26 Sequenzen, die Aminosäuren codieren, die die codierende Region für eine Thrombin-Spaltungsstelle, LVPRGS, umfassen, und von den Nukleotiden 5–14 die Sequenz für die Restriktionsstellen Bam HI und Nco I. Ein zweiter Primer, der als GVR10 bezeichnet wird, wurde ebenfalls synthetisiert und bestand aus der folgenden DNA-Sequenz (die auch in SEQ ID NO:11 gezeigt ist):
Diese DNA-Sequenz enthält von den Nukleotiden 5–24 Sequenzen, die zu den Oleosin 5'-flankierenden Sequenzen -834 und -814 homolog sind. Diese beiden Primer wurden verwendet, um die Promotorregion (0,8 kb) des Oleosingens aus Arabidopsis zu vervielfältigen, die in dem in Beispiel 1 beschriebenen Klon 12.1 enthalten ist. Das resultierende Fragment wurde am Ende aufgefüllt und in die Sma I-Stelle von pUC19 kloniert. Dieses Plasmid wurde mit pOThrom bezeichnet und enthielt die Oleosinpromotorregion, die Oleosin codierende Sequenz, gefolgt von einer Spaltungsstelle für das Enzym Thrombin und Restriktionsstellen für die Insertion der β-Glucuronidase (im folgenden GUS).
Um eine innerhalb des Leserahmens liegende Fusion von GUS mit der Oleosin codierenden Region aus Arabidopsis, die nun in pOThrom enthalten war, zu erzeugen, wurde ein GUS-Gen mit der geeigneten Restriktionsstelle unter Verwendung von PCR konstruiert. Ein als GVR20 bezeichne tes Oligonukleotid wurde synthetisiert, welches die folgende DNA-Sequenz (auch gezeigt in SEQ ID NO:14) enthielt:
Dieses Oligonukleotid enthält von den Nukleotiden 9–29 Sequenzen, die zu dem GUS-Gen komplementär sind, und von den Nukleotiden 3–12 die Sequenz für die Restriktionsstellen Bam HI und Nco I, um das Klonieren zu vereinfachen. Um diese Restriktionsstellen zu erzeugen, wurde das vierte Nukleotid der GUS-Sequenz von T zu G verändert, wodurch das TTA-Codon (Leu) zu GTA (Val) geändert wurde. Der zweite verwendete Primer war der universelle Sequenzierungsprimer, welcher die folgende DNA-Sequenz (auch gezeigt in SEQ ID NO:15) umfaßte:
GVR20 und der universelle Sequenzierungsprimer wurden verwendet, um die GUS-Nopalinsynthase-Terminatorregion aus dem Plasmid pBI 121 (Clonetech Laboratories) zu vervielfältigen. Dieses Fragment wurde am Ende aufgefüllt und in die Sma I-Stelle von pUC19 kloniert. Dieses Plasmid wurde mit pGUSNOS bezeichnet.
Das Plasmid pOThromb wurde mit Pst I und Nco I verdaut, pGUSNOS wurde mit Nco I und Xba I verdaut. Die Inserts dieser beiden Plasmide wurden gleichzeitig in pCGN1559 ligiert, welches mit Xba I und Pst I geschnitten wurde, um das Plasmid pCGOBPGUS zu erzeugen. Das Plasmid pCGOBPGUS enthielt in der nachstehenden Reihenfolge die 5'-regulatorische Region von Oleosin aus Arabidopsis, die Oleosin codierende Region, eine kurze Aminosäuresequenz am Carboxyende der Oleosin codierenden Sequenz, umfassend eine Thrombin-Proteaseerkennungsstelle, und die codierende Region für das β-Glucuronidasegen, gefolgt von dem Polyadenylierungssignal des nos-Terminators. Das durch dieses bestimmte DNA-Konstrukt codierte Fusionsprotein wird als ein Oleosin/GUS-Fusionsprotein bezeichnet.
Das Plasmid pCGOBPGUS wurde mit Pst I und Kpn I verdaut, die in die Pst I- und Kpn I-Stellen von pCGN1559 kloniert waren, was zu dem Plasmid pCGOBPGUS führte, das als binärer Vektor in Transformationsexperimenten mit Agrobacterium verwendet wurde, um transgene B. napus zu erzeugen. Samen von transgener Brassica napus wurden erhalten und hinsichtlich GUS-Aktivität getestet. Die transformierten Samen zeigten GUS-Aktivität, die speziell mit der Ölkörperfraktion assoziiert war. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle III gezeigt. Die Daten zeigen die spezifische Fraktionierung des GUS-Enzyms an die Ölkörperfraktion. Dieses Beispiel veranschaulicht die Expression und das spezifische Zielen eines von Bakterien abgeleiteten Enzyms auf die Ölkörperfraktion transgener Pflanzen.
Ein Fachmann auf dem Gebiet erkennt, daß verschiedene Modifikationen des obigen Verfahrens vorgenommen werden können. Beispielsweise kann ein konstitutiver Promotor verwendet wer den, um die Expression eines Oleosin/GUS-Fusionsproteins zu kontrollieren. Insbesondere kann der 35S-Promotor auch verwendet werden, um die Expression der oben beschriebenen Oleosin/GUS-Fusion zu kontrollieren, indem in dem Vektor pCGOBPGUS der Oleosinpromotor aus Arabidopsis durch den 35S-Promotor von CaMV (erhältlich aus dem Vektor pBI 221.1, Clonetech Laboratories) ersetzt wird. Der resultierende Vektor kann in der nachstehenden Reihenfolge den CaMV-35S-Promotor, die Oleosin codierende Region, eine kurze Aminosäuresequenz am Carboxyende der Oleosin codierenden Sequenz, umfassend eine Thrombin-Proteaseerkennungsstelle, die codierende Region für das β-Glucuronidasegen, gefolgt von dem Polyadenylierungssignal des nos-Terminators, enthalten. Dieses Plasmid kann in Bin 19 eingefügt werden, und das resultierende Plasmid kann in Agrobacterium eingebracht werden. Der resultierende Stamm kann verwendet werden, um B. napus zu transformieren. Die Aktivität von GUS kann in der Ölkörperfraktion gemessen werden.
Beispiel 5: Spaltung von Oleosin-Fusionsproteinen. In Beispiel 4 wurde gezeigt, daß die in dem Oleosin enthaltene Zielinformation ausreichend ist, um die Oleosin/GUS-Fusion auf den Ölkörper zu richten. Das Oleosin/GUS-Fusionsprotein enthält eine Aminosäuresequenz (LVPRGS), die das Oleosin von GUS trennt. Diese Sequenz wird von der Protease Thrombin erkannt, welche diese Peptidsequenz nach dem Aminosäurerest Arginin (R) spaltet. Die transgenen Samen, die diese Oleosin/GUS-Fusionen enthielten, wurden verwendet, um den allgemeinen Nutzen eines solchen Verfahrens zur Abspaltung eines fremden Peptids von intakten Ölkörpern, die Oleosin/Fremdpeptid-Fusionsproteine enthalten, zu zeigen. Die Ölkörperfraktion, die das Oleosin/GUS-Fusionsprotein enthielt, wurde in Thrombin-Spaltungspuffer resuspendiert, welcher sich aus 50 mM Tris (pH 8,0), 150 mM NaCl, 2,5 mM CaCl₂, 2% Triton X-100 und 0,5% Sarcosyl zusammensetzte. Das Enzym Thrombin wurde zugegeben, und die Probe wurde für jeweils 30 Minuten auf 45°C, 50°C und 55°C gehalten. Nach dieser Inkubation wurden die Ölkörper gewonnen und hinsichtlich GUS-Aktivität getestet. Die enzymatische Aktivität von GUS wurde nach dieser Spaltung und der Entfernung der Ölkörper in der wäßrigen Phase gefunden. Dies ist in Tabelle IV gezeigt. Eine Western-Blot-Analyse bestätigte die Abspaltung des Enzyms GUS von dem Oleosin/GUS-Fusionsprotein. Dieses Beispiel veranschaulicht die Spaltung und Gewinnung eines aktiven Enzyms aus einer Oleosin/Enzym-Fusion nach der Biosynthese und Gewinnung des Enzyms in der Ölkörperfraktion transgener Pflanzen.
Beispiel 6: Verwendung von Fusionsproteinen als wiederverwendbare immobilisierte Enzyme. In diesem Beispiel wurden Oleosin/GUS-Fusionsproteine, die mit Ölkörpern assoziiert waren, als immobilisierte Enzyme für die Biokonversion von Substraten verwendet. Hierbei wurde die Tatsache ausgenutzt, daß die Eigenschaften der Enzyme bei der Fusion mit dem Oleosin erhalten bleiben und daß das Oleosin sehr spezifisch und stark mit den Ölkörpern assoziiert ist, selbst wenn die Ölkörper aus Samen extrahiert werden. In diesem Beispiel wird gezeigt, daß die Fusionsenzyme aufgrund ihrer Verknüpfung mit den Ölkörpern wiederholt verwendet und leicht gewonnen werden können. Um die wiederverwendbare und stabile GUS-Aktivität der transgenen Samen zu zeigen, wurden transgene Ölkörper aus reifen trockenen Samen wie folgt isoliert. Die transgenen Samen von Brassica napus, die ein Oleosin/GUS-Fusionsprotein enthielten, wurden in Extraktionspuffer A, der aus 0,15 M Tricin-KOH, pH 7,5, 10 mM KCl, 1 mM MgCl₂ und 1 mM EDTA, 4°C bestand, gemahlen, und kurz vor der Verwendung wurde Saccharose bis zu einer Endkonzentration von 0,6 M zugegeben. Die gemahlenen Samen in Extraktionspuffer wurden vor Zentrifugation für 10 Minuten bei 5000 × g bei 4°C durch vier Schichten Käsetuch filtriert. Die in Form einer Oberflächenschicht vorliegenden Ölkörper wurden gewonnen und in Puffer A, der 0,6 M Saccharose enthielt, resuspendiert. Diese Lösung wurde mit einem gleichen Volumen an Puffer A, enthaltend 0,1 M Saccharose, überlagert und bei 18.000 × g für 20 Minuten zentrifugiert. Dieses Verfahren wurde mit der gereinigten Ölkörperfraktion (die die Ölkörper und die Oleosin/GUS-Fusionsproteine enthielt) zweimal wiederholt, und diese wurde in Puffer A, der 1 mM p-Nitrophenyl-β-D-glucuronid, ein Substrat für das Enzym GUS, enthielt, resuspendiert. Nach der Inkubation wurde die Umwandlung des farblosen Substrats in das gelbe p-Nitrophenol als ein Anzeichen für GUS-Aktivität in den Suspensionen von transgenen Ölkörpern verwendet. Dies zeigte, daß die Aktivität des Enzyms bei der Fusion mit dem Oleosinprotein erhalten bleibt und daß das Enzym, während es an die Ölkörper angehängt ist, für Substrat erreichbar ist. Die Ölkörper wurden wie oben beschrieben gewonnen. Nach Entfernung der Ölkörper blieb kein GUS-Enzym in der wäßrigen Phase zurück. Die Ölkörper wurden dann zu frischem Substrat zugegeben. Wenn man die Ölkörper mit frischem Substrat reagieren ließ, zeigte sich eine Umwandlung des Substrats. Dieser Prozeß wurde viermal wiederholt, ohne daß es zu einem Verlust an GUS-Aktivität kam. In parallelen quantitativen Experimenten wurde die Menge an Methylumbelliferylglucuronid (MUG), umwandelt in Methylumbelliferon, mittels Fluorimetrie bestimmt, und die Ölkörper wurden mittels Flotationszentrifugation gewonnen und zu einem neuen Teströhrchen, welches MUG enthielt, zugegeben. Der verbleibende Puffer wurde hinsichtlich restlicher GUS-Aktivität untersucht. Dieses Verfahren wurde mehrere Male wiederholt. Das Enzym GUS zeigte nach viermaliger Verwendung 100% Aktivität und blieb stabil mit der Ölkörperfraktion assoziiert. Diese Ergebnisse sind in Tabelle V gezeigt. Diese Experimente zeigen die Immobilisierung und Gewinnung des aktiven Enzyms nach Substratumwandlung. Die Stabilität der Aktivität von GUS in teilweise gereinigten Ölkörpern wurde durch Messen der GUS-Aktivität der Ölkörpersuspension in mehreren aufeinanderfolgenden Wochen bestimmt. Die Halbwertszeit der Aktivität von GUS beträgt mehr als 3 Wochen, wenn die Ölkörper in Extraktionspuffer bei 4°C gelagert werden.
Beispiel 7: Expression von IL-1-β als Fusionsprotein. Um den Nutzen der Erfindung weiter zu veranschaulichen, wurde das menschliche Protein Interleukin 1-b (IL-1-β) für die Biosynthese gemäß dem Verfahren ausgewählt. IL-1-β besteht aus 9 Aminosäuren (aa), Val-Gln-Gly-Glu-Glu-Ser-Asn-Asp-Lys (Antoni et al., 1986, J. Immunol. 137:3201–3204, SEQ ID NO:16). Die Strategie für die Biosynthese bestand darin, dieses aus neun Aminosäuren bestehende Protein am Carboxyterminus des nativen Oleosinproteins einzubringen. Die Strategie umfaßte weiterhin die Aufnahme einer Proteaseerkennungsstelle, um die Abspaltung von IL-1-β von dem Oleosinprotein, während es mit den Ölkörpern fusioniert war, zu erlauben. Um dies zu erreichen, wurde eine Erkennungsstelle für die Endoprotease Faktor Xa in das Konstrukt aufgenommen. Die Protease Faktor Xa kann eine Proteinsequenz spalten, die die Aminosäuresequenz Ile-Glu-Gly-Arg enthält. Die Spaltung findet nach dem Argininrest statt. Auf Basis dieser Sequenzen wurde ein Oligonukleotid synthetisiert, welches 18 Nukleotide der 3'-codierenden Region des Oleosins aus A. thaliana (Basenposition 742–759, codiert die letzten sechs Aminosäuren des nativen Proteins), einen Alaninrest (als Ergebnis der Ersetzung des TAA-Stopcodons des nativen Oleosins durch ein GCT-Codon für Alanin), die codierende Sequenz für die Spaltung durch Faktor Xa (vier Codons für die Aminosäuren Ile-Glu-Gly-Arg), gefolgt von der codierenden Sequenz für IL-1-β enthielt. Das Oligonukleotid umfaßte weiterhin ein TAA-Stopcodon nach dem Lysinrest von IL-1-β am Carboxyterminus, und benachbart zu diesem Stopcodon wurde eine Sal I-Restriktionsstelle hinzugefügt. Die IL-1-β codierende Sequenz wurde unter Verwendung einer optimalen Codonverwendung für das Oleosin aus B. napus und A. thaliana ausgestaltet. Für Fachleute auf dem Gebiet liegt es auf der Hand, daß eine maximale Expression erwartet wird, wenn die Codonverwendung des rekombinanten Proteins zu der anderer Gene paßt, die in der gleichen Pflanze oder dem gleichen Pflanzengewebe exprimiert werden. Dieses Oligonukleotid wurde in das Oleosingen aus Arabidopsis eingebracht. Das modifizierte Oleosingen wurde mit Pst I und Sal I geschnitten und unter Erhalt des Plasmids mit der Bezeichnung pCGOBPILT mit dem nos-Terminator verknüpft. Dieses Plasmid enthält in der nachstehenden Reihenfolge den Oleosinpromotor aus Arabidopsis, die Oleosin codierende Sequenz, einschließlich des Introns, und die IL-1-β codierende Region, die durch eine Faktor Xa-Proteaseerkennungsstelle und das Polyadenylierungssignal des nos-Terminators am Carboxyterminus des Oleosinproteins angehängt ist. Dieses Konstrukt wurde in das binäre Plasmid Bin 19 (Bevan, M., 1984, Nucl. Acids Res. 12:8711–8721) eingefügt, und das resultierende Plasmid wurde in Agrobacterium eingebracht. Der resultierende Stamm wurde verwendet, um B. napus und Tabakpflanzen zu transformieren.
Die Oleosin/IL-1-β-Fusion war stabil in die Genome von Tabak und B. napus integriert. Die Northern-Analyse von embryonaler RNA, die aus verschiedenen transformierten Tabakpflanzen isoliert worden war, zeigte die Ansammlung von Arabidopsis-Oleosin/IL-1-β-mRNA.
Ölkörperproteine aus transformierten Tabaksamen wurden hergestellt, und eine Western-Blot-Analyse wurde durchgeführt. Ein gegen ein 22 kDa großes Oleosin aus B. napus gezüchteter Antikörper wurde verwendet, um die Arabidopsis-Oleosin/IL-1-β-Fusion in den Tabaksamen zu detektieren. Dieser Antikörper erkennt alle großen Oleosine in B. napus und A. thaliana. Zusätzlich erkennt dieser Antikörper die Oleosine aus Tabak. In den aus transformierten Tabaksamen extrahierten Oleosinen erkannte der Antikörper ein 20 kDa großes Protein, welches das Oleosin/IL-1-β-Fusionsprotein repräsentiert. Dieses Fusionsprotein war in den nicht transformierten Tabaksamen nicht vorhanden. Diese Ergebnisse zeigen die Ansammlung der Oleosin/IL-1-β-Fusion in Tabak. Eine ähnliche Expression und Ansammlung ist in Brassica napus zu beobachten, die mit dem Oleosin/IL-1-β-Fusionsgen transformiert wurde. Diese Ergebnisse veranschaulichen weiterhin beispielhaft die Nützlichkeit des Verfahrens für die Expression heterologer Proteine in Pflanzen.
Beispiel 8: Expression von Oleosin/Hirudin-Fusionsgen in B. napus. Zur weiteren Veranschaulichung der Erfindung wurde das Protein Hirudin, abgeleitet vom Blutegel (einem Gliederwurm), synthetisiert und mit Oleosin fusioniert. Hirudin ist ein Antikoagulans, welches in den Speicheldrüsen des Blutegels Hirudo medicinalis produziert wird (Dodt et al., 1984, FEBS Lett., 65:180–183). Das Protein wird als Vorläuferprotein synthetisiert (Harvey et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1084–1088) und in ein aus 65 Aminosäuren bestehendes reifes Protein eingebracht. Das Hirudingen wurde erneut synthetisiert, um die Codonverwendung der Oleosingene aus Brassica und Arabidopsis widerzuspiegeln, und mit dem C-terminalen Ende des Oleosingens aus Arabidopsis wurde ein Fusionsgen erzeugt. Die Gensequenzen für Oleosin und Hirudin wurden durch Codons für eine Aminosäuresequenz, die eine Faktor Xa-Endoproteasespaltungsstelle codierte, getrennt. Das resultierende Plasmid wurde mit pCGOBHIRT bezeichnet. Dieses Plasmid enthält in der nachstehenden Reihenfolge die Promotorregion des Oleosingens aus Arabidopsis, die codierende Sequenz des Oleosinproteins, einschließlich des Introns, eine Faktor Xa-Spaltungsstelle und das erneut synthetisierte Hirudingen, gefolgt von dem Polyadenylierungssignal des nos-Terminators. Dieses Konstrukt wurde in das binäre Plasmid Bin 19 eingeführt, und das resultierende Plasmid wurde in Agrobacterium eingebracht. Der resultierende Stamm wurde verwendet, um B. napus und Tabak zu transformieren.
Die Arabidopsis-Oleosin/Hirudin-Fusion (OBPHIR) wurde stabil in die Genome von N. tabacum bzw. B. napus integriert. Die Northern-Analyse embryonaler RNA, die aus verschiedenen mit OBPHIR transformierten Pflanzen isoliert worden war, zeigte die Ansammlung von OBPHIR-mRNA in Samen von B. napus. Monoklonale Antikörper, die gegen Hirudin gezüchtet worden waren, bestätigten die stabile Ansammlung der Oleosin/Hirudin-Fusion in den Samen transformierter Pflanzen. Transgene Samen, die eine Oleosin/Hirudin-Fusion enthielten, wurden nach einem Jahr der Lagerung bei Raumtemperatur getestet. Es war keine Zersetzung des Oleosin/Hirudin-Proteins zu beobachten, was die Stabilität von Hirudin in intakten Samen zeigt.
Das Hirudin kann unter Verwendung der in das Fusionsprotein eingebauten Faktor Xa-Spaltungsstelle von dem Oleosin abgespalten werden. Bei Behandlung der Ölkörperfraktion transgener Samen von Brassica napus wurde aktives Hirudin freigesetzt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle VI gezeigt. Dieses Beispiel veranschaulicht die Nützlichkeit der Erfindung bei der Herstellung heterologer Proteine mit therapeutischem Wert aus Nicht-Pflanzenquellen.
Beispiel 9: Fusion von Fremdproteinen mit dem N-Terminus von Oleosin. In diesem Beispiel wurde ein Fremdprotein durch Fusion mit dem N-Terminus des Oleosins mit der Oleosin codierenden Region verbunden. Zur Veranschaulichung des Verfahrens wurde das Enzym GUS innerhalb des Leserahmens mit der das Oleosin aus Arabidopsis codierenden Region, wie in Beispiel 1 beschrieben, fusioniert. Um dies zu erreichen, wurden vier DNA-Komponenten unter Erhalt einer GUS-Oleosin-Fusion unter der Kontrolle des Oleosinpromotors ligiert. Diese waren die folgenden: die 5'-regulatorische Region von Oleosin, die GUS codierende Region, die Oleosin codierende Region und die nos ter-Transkriptionsterminationsregion. Diese vier DNA-Komponenten wurden wie folgt konstruiert: Die erste dieser Komponenten umfaßte den mittels PCR unter Verwendung von Primern, die geeignete Restriktionsstellen einbrachten, isolierten Oleosinpromotor. Der 5'-Primer wurde mit OleoPromK bezeichnet und umfaßte die folgende Sequenz (auch gezeigt als SEQ ID NO:17):
Dieser Primer erzeugt eine geeignete Kpn I-Stelle in der 5'-Region des Promotors. Der 3'-Primer umfaßte die folgende Sequenz (auch gezeigt als SEQ ID NO:18):
Dieser Primer erzeugt eine geeignete Cla I-Stelle am Ende der untranslatierten Leader-Sequenz der transkribierten Oleosinsequenz direkt vor dem ATG-Initiationscodon in der nativen Oleosinsequenz. Diese beiden Primer wurden verwendet, um eine modifizierte Promotorregion aus dem nativen Oleosingen aus Arabidopsis zu vervielfältigen. Nach der Reaktion wurde das Vervielfältigungsprodukt mit Kpn I und Cla I verdaut unter Erhalt eines 870 bp langen Fragments, welches den Oleosinpromotor und die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz enthielt. Dieses Promotorfragment wird als Kpn-PleoP-Cla bezeichnet und wurde in die Kpn 2-Cla I-Stellen eines standardmäßigen Subklonierungsvektors, der mit pBS bezeichnet wird, ligiert.
Die zweite konstruierte DNA-Komponente war die GUS codierende Region, die so modifiziert wurde, daß sie die geeigneten Restriktionsstellen und eine Faktor Xa-Spaltungsstelle einbrachte. Um dies zu erreichen, wurde die GUS codierende Region in dem Vektor PBI 221 als Matrize in einer PCR-Reaktion unter Verwendung der folgenden Primer verwendet. Der 5'-Primer wurde mit 5'-GUS-Cla bezeichnet und umfaßte die folgende Sequenz (auch gezeigt als SEQ ID NO:19):
Der 3'-Primer wurde als 3'-GUS-FX-Bam bezeichnet und umfaßte die folgende Nukleotidsequenz (auch gezeigt als SEQ ID NO:20):
Dieses zweite Oligonukleotid codiert auch vier Aminosäuren, die die Aminosäuresequenz I-E-G-R spezifizieren, die Erkennungsstelle für die Endoproteaseaktivität von Faktor Xa. Das Vervielfältigungsprodukt mit ungefähr 1,8 kb Länge umfaßt eine GUS codierende Region, flankiert durch eine Cla I-Stelle am 5'-Ende und anstelle des GUS-Terminationscodons eine kurze Nukleotidsequenz, die die vier Aminosäuren codiert, welche die Spaltungsstelle der Faktor Xa-Endoproteaseaktivität umfassen. Auf diese Aminosäurecodons folgt eine Restriktionsstelle für Bam HI. Die Isolierung des Oleosin codierenden Region wurde ebenfalls unter Verwendung von PCR durchgeführt. Um diese dritte DNA-Komponente zu isolieren, wurde der genomische Klon von Oleosin aus Arabidopsis als Matrize in einer Reaktion verwendet, die die folgenden beiden Primer enthielt. Der erste dieser Primer wird als 5'-Bam-Oleo bezeichnet und hat die folgende Sequenz (auch gezeigt als SEQ ID NO:21):
Der zweite Primer wird als 3'-Oleo-Xba bezeichnet und hat die folgende Sequenz (auch gezeigt als SEQ ID NO:22):
Die Vervielfältigung des genomischen Klons mittels PCR lieferte eine Oleosin codierende Region, flankiert durch eine Bam HI-Stelle am 5'-Ende und eine Xba 1-Stelle am 3'-Ende. Diese codierende Sequenz wurde in die Bam HI- und Xba I-Stelle des Subklonierungsvektors pBS subkloniert.
Die vierte DNA-Komponente umfaßte die Transkriptionsterminationsregion von Nopalinsynthase (nos ter), isoliert aus dem Vektor pBI 221 als ein stumpfendiges Sst I-EcoRI-Fragment, das in die stumpfendige Hind III-Stelle von pUC 19 kloniert war. Dieser Subklon hat eine Xba I-Stelle am 5'-Ende und eine Hind III-Stelle am 3'-Ende.
Als eine erste Stufe des Zusammensetzens dieser vier DNA-Komponenten wurden die Oleosin codierende Region und nos ter zuerst durch Ligation des Bam HI-Xba I-Fragments der Oleosin codierenden Region mit dem Xba I-Hind III-Fragment von nos ter in mit Bam HI-Hind III verdautem pUC19 verbunden. Dieses Konstrukt lieferte einen Subklon, der die mit nos ter verbundene Oleosin codierende Region umfaßte. Als zweite Stufe beim Zusammensetzen der DNA-Komponenten wurde die Oleosinpromotorregion dann durch Ligation des Kpn I-Cla I-Oleosinpromotorfragments mit dem Cla I-Bam HI-Fragment der GUS codierenden Region, die so modifiziert war, daß sie die Faktor Xa-Erkennungsstelle enthielt, und Subklonieren dieser ligierten Fragmente in pUC19, das mit Kpn I und Bam HI geschnitten war, mit der modifizierten GUS codierenden Region verbunden.
Um alle vier DNA-Komponenten zusammenzusetzen, wurde der mit der GUS codierenden Region fusionierte Kpn I-Bam HI-Oleosinpromotor mit dem aus der Bam HI-Hind III-Oleosin codierenden Region und nos ter bestehenden Fragment in einer Dreierligation mit dem mit Kpn HI-Hind III verdauten binären Transformationsvektor PCGN1559 aus Agrobacterium ligiert. Der resultierende Transformationsvektor wurde mit pCGYGONI bezeichnet und wurde in Agrobacterium tumefaciens EHA 101 mobilisiert und verwendet, um B. napus zu transformieren. Es wurden transformierte Pflanzen erhalten, die man in Treibhäuser brachte und Samen bilden ließ. Die Samen wurden analysiert, wie es von Holbrook et al. (1991, Plant Physiology, 97:1051–1058) beschrieben ist, und es wurden Ölkörper erhalten. Western-Blot-Analyse wurde verwendet, um die Einfügung des GUS-Oleosin-Fusionsproteins in die Ölkörpermembrane zu zeigen. In diesen Experimenten waren mehr als 80% des GUS-Oleosin-Fusionsproteins mit der Ölkörperfraktion assoziiert. Es wurde keine Zersetzung des Fusionsproteins beobachtet. Dieses Beispiel veranschaulicht die Nützlichkeit des Verfahrens für die Expression und Gewinnung von Fremdproteinen, die mit dem N-Terminus von Oleosin fusioniert sind.
ZUSÄTZLICHE ANWENDUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Die obigen Beispiele beschreiben verschiedene Proteine, die mit Oleosin fusioniert und in den Ölkörpern in den Samen von Pflanzen, wie Brassica napus, exprimiert werden können. Die obige Beschreibung liefert auch das Verfahren zur Herstellung solcher transgener Pflanzen. Daher kann ein Fachmann auf dem Gebiet das oben Beschriebene leicht modifizieren, um Fusionsproteine herzustellen, die jegliches gewünschte Protein oder Polypeptid, das mit Oleosin fusioniert ist, enthalten. Mehrere Beispiele anderer Proteine, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können, sind unten angegeben.

a) Expression von Oleosin/Collagenase-Fusionsproteinen in B. napus. Das bakterielle Collagenasegen von Vibrio alginolyticus (Takeuchi et al., 1992, Biochemical Journal, 281:703–708) kann mit dem Carboxyterminus des Oleosingens aus Arabidopsis fusioniert werden. Dieses Plasmid kann in der nachstehenden Reihenfolge die Promotorregion des Oleosingens aus Arabidopsis, die codierende Sequenz des Oleosinproteins, einschließlich des Introns, eine Faktor Xa-Spaltungsstelle und das Collagenasegen, gefolgt von dem Polyadenylierungssignal des nos-Terminators enthalten. Das Konstrukt kann in das binäre Plasmid Bin 19 eingefügt werden, und das resultierende Plasmid wurde in Agrobacterium eingebracht. Der resultierende Stamm wurde verwendet, um B. napus und Tabak zu transformieren. Das Enzym Collagenase wurde mit der Ölkörperfraktion in transgenen Samen gewonnen.
b) Produktion von Oleosin/Xylanase-Proteinen in B. napus. Das Xylanasegen von Trichoderma viride (Gormes, I., Gormes, J., Steiner, W. und Esterbauer, H., 1992, Applied Microbiology and Biotechnolgy, 36:5, 701–707) kann mit dem Carboxyterminus des Oleosingens aus Arabidopsis fusioniert werden. Dieses Plasmid kann in der nachstehenden Reihenfolge die Promotorregion des Oleosingens aus Arabidopsis, die codierende Sequenz des Oleosinproteins, einschließlich des Introns, eine Collagenasespaltungsstelle und das Xylanasegen, gefolgt von dem Polyadenylierungssignal des nos-Terminators enthalten. Das Konstrukt kann in das binäre Plasmid Bin 19 eingefügt werden, und das resultierende Plasmid wurde in Agrobacterium eingebracht. Der resultierende Stamm kann verwendet werden, um B. napus zu transformieren. Das Enzym Xylanase wird mit der Ölkörperfraktion in transgenen Samen gewonnen. Das Enzym Xylanase kann durch Behandlung mit Collagenase weiter gereinigt werden, um das Enzym Xylanase aus dem Oleosinprotein zu entfernen.
c) Kombination zweier Oleosin-Fusionsproteine, um ein Proteinprodukt aus Ölkörpern freizusetzen. Zwei verschiedene Oleosin-Fusionen, die mit Ölkörpern assoziiert sind, können als ein Mittel verwendet werden, um ein Endprodukt zu erhalten. Beispielsweise kann eine transgene B. napus erhalten werden, die ein Gen enthält, welches das Enzym GUS umfaßt, das mit dem Carboxyterminus von Oleosin, getrennt durch eine Collagenase-Proteaseerkennungsstelle, fusioniert ist. Ölkörper können aus dem Samen dieser Pflanze erhalten werden. Diese Ölkörper können mit den oben beschriebenen Ölkörpern, die mit Oleosin fusionierte Collagenase enthalten, gemischt werden. Die Collagenaseaktivität der Ölkörper mit Oleosin/Collagenase-Fusionsprotein können das Enzym GUS aus den Ölkörpern mit Oleosin/GUS-Fusionsproteinen freisetzen. Das Enzym GUS verbleibt nach Entfernen der Ölkörper in der wäßrigen Phase. Das Enzym Collagenase oder kontaminierende Oleosine bleiben nicht mit dem gereinigten Enzym GUS assoziiert, was die Nützlichkeit der Erfindung zum einfachen Erhalten gereinigter Proteine veranschaulicht.
d) Expression eines Oleosin/Phytase-Fusionsproteins in B. napus. Eine mikrobielle Phytase aus einem Aspergillus kann auf Basis der veröffentlichten Sequenz (van Gorcom et al., europäische Patentanmeldung 90202565.9, Veröffentlichungsnummer 0 420 358 A1) isoliert werden. Dieses Gen kann unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken mit dem Carboxyterminus des Oleosinproteins fusioniert werden, und eine Collagenase erkennende Proteasespaltungsstelle kann aufgenommen werden, um die Abtrennung der Phytase von dem Ölkörper zu gestatten, falls dies gewünscht ist. Das Konstrukt kann in der nachstehenden Reihenfolge die Promotorregion des Oleosingens aus Arabidopsis, die codierende Sequenz des Oleosinproteins, einschließlich des Introns, eine Collagenasespaltungsstelle und das Phytasegen, gefolgt von dem Polyadenylierungssignal des nos-Terminators enthalten. Das Konstrukt kann in das binäre Plasmid Bin 19 eingefügt werden, und das resultierende Plasmid kann in Agrobacterium eingebracht werden. Der resultierende Stamm kann verwendet werden, um B. napus zu transformieren. Der Samen der transgenen Pflanzen weist Phytaseaktivität auf. Die Phytaseaktivität wird mit der Ölkörperfraktion assoziiert. Die Phytaseaktivität ist geeignet zur Verbesserung von Mehl zur Fütterung monogastrischer Tiere. Die Phytase kann durch Behandlung mit Collagenase, wie unter a) beschrieben, gereinigt werden, oder der transgene Samen kann als Futtermittelzusatz verwendet werden.
e) Expression eines Oleosin/Chymosin-Fusionsproteins. Das Enzym Chymosin kann als ein Oleosin-Fusionsprotein exprimiert werden, indem die codierende Sequenz für Chymosin (wie beispielsweise von Alford et al., 1987, US-Patent Nr. 4,666,847, beschrieben) wie oben beschrieben mit dem Oleosinprotein verbunden wird. Das Konstrukt kann verwendet werden, um B. napus zu transformieren.
f) Expression von Oleosin/Glucose-Isomerase. Das Enzym Glucoseisomerase kann als ein Oleosin-Fusionsprotein exprimiert werden, indem die codierende Sequenz für das Enzym (wie beispielsweise von Wilhelm Hollenberg, 1985, Nucl. Acid. Res., 13:5717–5722, beschrieben) wie oben beschrieben mit dem Oleosinprotein verbunden wird. Das Konstrukt kann verwendet werden, um B. napus zu transformieren.
g) Expression einer Oleosin/Zein-Speicherprotein-Fusion. Um ein günstigeres Nährstoffgleichgewicht für Tierfutter bereitzustellen, kann ein Fusionsprotein zwischen dem 10 kDa großen Zeinprotein (Kirihara et al., 1988, Gene, 71:359–370) aus Mais, welches einen hohen Methioningehalt aufweist, und der Oleosin codierenden Region konstruiert werden. Das Fusionskonstrukt kann unter Verwendung von Standardtechniken hergestellt werden, die sich am C-Terminus der Oleosin codierenden Region mit dem Codon für die Aminosäure 22 der codierenden Sequenz für das 10 kDa große Zein verbinden. Das Konstrukt kann am Codon 151 der Zeinsequenz enden. Das Konstrukt kann in der nachstehenden Reihenfolge die Promotorregion des Oleosingens aus Arabidopsis, die codierende Sequenz des Oleosinproteins, einschließlich des Introns, die Codons 22–151 des 10 kDa großen Zeingens, gefolgt von dem Polyadenylierungssignal des nos-Terminators enthalten. Das Konstrukt kann in das binäre Plasmid Bin 19 eingefügt werden, und das resultierende Plasmid kann in Agrobacterium eingebracht werden. Der resultierende Stamm kann verwendet werden, um B. napus zu transformieren.
h) Expression eines Oleosin-Fusionsproteins mit hohem Lysingehalt. Um den Lysingehalt transgener Samen zu steigern, kann ein Polylysin-Oligonukleotid zu dem C-Terminus des Oleosingens hinzugefügt werden. Beispielsweise kann ein repetitives Oligonukleotid, welches eine Polylysin codierende Sequenz codiert, hergestellt werden, indem man ein (AAG)₂₀-Oligonukleotid, welches an den C-Terminus des Oleosingens gebunden ist, durch Ersetzen der Hirudin codierenden Sequenz, die in dem pCBOGHIRT-Plasmid enthalten ist, welches oben in Beispiel 8 beschrieben wurde, durch das Polylysin-Oligonukleotid unter Verwendung zusammenhängender Restriktionstermini synthetisiert. Das Konstrukt kann in der nachstehenden Reihenfolge die Promotorregion des Oleosingens aus Arabidopsis, die codierende Sequenz des Oleosinproteins, einschließlich des Introns, 20 Codons für die Aminosäure Lysin, gefolgt von dem Polyadenylierungssignal des nos-Terminators enthalten. Das Konstrukt kann in das binäre Plasmid Bin 19 eingefügt werden, und das resultierende Plasmid kann in Agrobacterium eingebracht werden. Der resultierende Stamm kann verwendet werden, um B. napus zu transformieren.
i) Expression eines fungiziden Proteins als Oleosin-Fusionsprotein. Als weiteres Beispiel der Erfindung kann ein Oleosin-Fusionsprotein konstruiert werden, das ein Protein codiert, welches für Pilze toxisch ist. Beispielsweise kann das Gen für das Enzym Chitinase, das aus Tabak isoliert wurde (Melchers et al., 1994, Plant Journal, 5:469–480), unter der Kontrolle des nativen Oleosinpromotors mit dem C-Terminus von Oleosin fusioniert werden. In diesem Konstrukt kann ein Oligonukleotid enthalten sein, welches eine Collagenaseerkennungsstelle codiert, die zwischen der Oleosin codierenden Region und der Chitinase codierenden Region liegt. Die Expression dieses Konstrukts führt zur Herstellung eines Oleosin/Chitinase-Fusionsproteins, aus dem das Enzym Chitinase durch Behandlung mit Collagenase aus dem Oleosin freigesetzt werden kann. Zu diesem Konstrukt kann ein zweites chimäres Gen hinzugefügt werden, welches während der Samenkeimung zur Expression des Enzyms Collagenase in der Lage ist. Dieses zweite Gen kann ungefähr 1,5 kb der 5'-Promotorregion für Isocitratlyase, die Collagenase codierende Sequenz von Vibrio alginolyticus (Takeuchi et al., 1992, Biochemical Journal, 281:703–708) und den nos-Terminator umfassen. Isocitratlyase ist ein glyoxysomales Enzym, welches während der frühen Stadien der Samenkeimung unter transkriptionaler Kontrolle exprimiert werden kann (Comai et al., 1989, The Plant Cell, 1:293–300). Dieses zweite Konstrukt exprimiert daher während der Keimung des Samens und der Mobilisierung der Ölkörperreserven Collagenase. Die Expression von Isocitratlyase ist auf die Keimung beschränkt und findet nicht in sich entwickelnden Samen statt. Dieses zweite Gen, welches mit dem Oleosin/Chitinase-Gen verbunden ist, kann in den binären Vektor Bin 19 eingefügt werden. Der resultierende Vektor kann in Agrobacterium eingebracht und verwendet werden, um Brassica napus-Pflanzen zu transformieren. Es sei angemerkt, daß die beiden Gene auch unabhängig voneinander oder in zwei verschiedene Pflanzen eingebracht werden können, die dann durch sexuelle Kreuzung vereinigt werden. Samen von transgenen Pflanzen werden gesammelt und hinsichtlich Resistenz gegen Pilze getestet.
j) Expression eines Oleosin-Fusionsproteins, welches Schutz vor Insektenbefall liefert. Als ein weiteres Beispiel der Erfindung kann ein Oleosin-Fusionsprotein konstruiert werden, welches ein Protein codiert, das für Fraßinsekten toxisch ist. Beispielsweise kann das Gen für den Trypsininhibitor aus der Kuhbohne (Hilder et al., 1987, Nature, 330:160–163) verwendet werden, um das in i) beschriebene Chitinasegen zu ersetzen. Die Expression dieses Konstrukts führt zur Erzeugung eines Oleosin/Trypsininhibitor-Fusionsproteins, aus dem der Trypsininhibitor durch Behandlung mit Collagenase aus dem Oleosin freigesetzt werden kann. Durch Ersetzen des Chitinasegens in i) durch den Trypsininhibitor enthält das Konstrukt auch das Collagenasegen unter der Kontrolle des für die Keimung spezifischen Promotors aus dem Isocitratlyasegen. Dieses Konstrukt kann in den binären Vektor Bin 19 eingefügt werden. Der resultierende Vektor kann in Agrobacterium eingebracht und verwendet werden, um Brassica napus-Pflanzen zu transformieren. Samen von transgenen Pflanzen wurden gesammelt und hinsichtlich Resistenz gegen Insektenbefall getestet.
k) Expression eines Enzyms zur Veränderung sekundärer Metaboliten in Samen. Um bestimmte sekundäre Metaboliten in dem Samen zu verändern, kann ein Tryptophandecarboxylase (TDC) codierendes Enzym in Form einer Fusion mit Oleosin im Samen exprimiert werden. Dieses bestimmte Enzym (DeLuca et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2582–2586) wandelt Tryptophan in Tryptamin um und führt zu einer Erschöpfung der von Tryptophan abgeleiteten Glucosinolate. Dadurch verringert sich die Menge der nicht nahrungsgeeigneten Glucosinolate in dem Samen, und dies liefert ein Mittel zur weiteren Reduzierung der Produktion von Glucosinolaten in zu den Kreuzblütlern gehörenden Pflanzenspezies. Um dies zu erreichen, kann ein Fusionsprotein zwischen dem TDC-Gen und der Oleosin codierenden Region konstruiert werden. Das Konstrukt kann in der nachstehenden Reihenfolge die Promotorregion des Oleosingens aus Arabidopsis, die codierende Sequenz des Oleosinproteins, einschließlich des Introns, das TDC-Gen, gefolgt von dem Polyadenylierungssignal des nos-Terminators enthalten. Das Konstrukt kann in das binäre Plasmid Bin 19 eingefügt werden, und das resultierende Plasmid kann in Agrobacterium eingebracht werden. Der resultierende Stamm kann verwendet werden, um B. napus zu transformieren.

EXPRESSION IN PROKARYONTEN
Beispiel 10: Isolierung einer B. napus-Oleosin-cDNA. Das in Beispiel 1 beschriebene Oleosingen aus Arabidopsis enthält ein Intron und ist als solches nicht für die Verwendung in einem prokaryontischen Expressionssystem geeignet. Um Oleosinfusionen in einem Mikroorganismus, wie Bakterien, zu exprimieren, muß eine von Introns freie codierende Sequenz verwendet werden. Um dies zu erzielen, wurde eine B. napus-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von Standardtechniken hergestellt und verwendet, um Oleosin-cDNAs zu isolieren. Vier Klone wurden erhalten und mit pcDNA#7, pcDNA#8, pcDNA#10 und pcDNA#12 bezeichnet. Diese cDNA-Klone wurden teilsequenziert, und ein Klon, pcDNA#8, wurde vollständig sequenziert. Alle Klone zeigten ein hohes Maß an Identität zu Oleosinen. pcDNA#10 war identisch mit pcDNA#12, unterschied sich jedoch von pcDNA#8 und pcDNA#7. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des Inserts von pcDNA#8 ist dem Oleosin aus Arabidopsis sehr ähnlich und ist in 4 gezeigt. Diese codierende Region von Oleosin kann verwendet werden, um andere Oleosingene zu isolieren oder um Oleosinfusionen in prokaryontischen Systemen zu exprimieren. Sie liefert aufgrund der Fähigkeit des Proteins (Oleosin) zur spezifischen Wechselwirkung mit Ölkörperfraktionen von Pflanzenextrakten auch eine geeignete codierende Region für die Fusion mit verschiedenen anderen Promotoren für die heterologe Expression von Fremdpeptiden.
Beispiel 11: Expression eines Oleosin/GUS-Fusionsgens in dem heterologen Wirt E. coli. Um die Erfindung weiter zu veranschaulichen, wurde ein Oleosin/GUS-Fusionsgen in dem E. coli-Stamm JM109 exprimiert. Die in Beispiel 10 beschriebene Oleosin-cDNA pcDNA#8 wurde mit Nco I verdaut und in die Nco I-Stelle von pKKGUS, einem Expressionsvektor, der den mit GUS fusionierten LacZ-Promotor enthielt, ligiert. Das Plasmid pKKGUS wurde durch Hinzufügen der GUS codierenden Region zu dem Vektor pKK233 (Pharmacia) unter Erzeugung des Plasmids pKKoleoGUS und des An tisense-Konstrukts pKKoeloGUS konstruiert. Dieses Konstrukt ist in 5 gezeigt. Diese Plasmide wurden in den E. coli-Stamm JM109 eingebracht, und die Expression wurde durch IPTG induziert. Die E. coli-Zellen wurden auf die Messung der GUS-Aktivität vorbereitet. In Bakterienzellen, die den Vektor pKKGUS enthielten, war nach Zugabe von IPTG eine starke Induzierung von GUS-Aktivität zu beobachten. In Zellen, die pKKoleoGUS enthielten, war nach Zugabe von IPTG eine ähnlich starke Induzierung von GUS-Aktivität zu beobachten. In Zellen, die pKKoeloGUS (GUS in Antisense-Orientierung) enthielten, wurde nach der Zugabe von IPTG keine Induzierung über dem Hintergrund beobachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Oleosin/GUS-Fusion in Bakterien aktiv ist. Obwohl die für das Fusionsprodukt beobachtete Aktivität geringer ist als bei dem nicht fusionierten Produkt, wurde die Oleosin codierende Sequenz für die Expression in Bakterien nicht optimiert. Für Fachleute auf dem Gebiet liegt es auf der Hand, daß eine einfache Modifikation von Codons oder anderen Sequenzen, wie Ribosombindungsstellen, eingesetzt werden könnte, um die Expression zu steigern. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengefaßt.
Das Fusionsprotein kann unter Verwendung der Fähigkeit des Oleosinteils des Fusionsproteins, sich spezifisch mit Ölkörpern zu verknüpfen, aus der Masse an zellulärem Material isoliert werden.
Tabelle I. Expression von chimären Promotorkonstrukten von Oleosin aus Arabidopsis in transgener Brassica napus.
Oleosinpromotor-GUS-Fusionen wurden wie in Beispiel 3 beschrieben konstruiert.
Enthalten sind GUS-Werte, die aus einer nicht transformierten Kontrollpflanze erhalten wurden. Ein (–) zeigt an, daß das Gewebe nicht getestet wurde. Die Einheiten sind Pikomol Methylumbelliferon (Produkt) pro mg Protein pro Minute.
Tabelle II. Expression von chimären Promotorkonstrukten von Oleosin aus Arabidopsis in transgenem Tabak (Nicotiana tabacum).
Oleosinpromotor-GUS-Fusionen wurden wie in Beispiel 3 beschrieben konstruiert.
Enthalten sind GUS-Werte, die aus einer nicht transformierten Kontrollpflanze erhalten wurden. Die Einheiten sind Pikomol von Methylumbelliferon (Produkt) pro mg Protein pro Minute.
Tabelle III. Spezifische Aufteilung von GUS/Oleosin-Fusionen in Ölkörper bei Expression in transgenen Brassica napus-Pflanzen.
Die Pflanzen wurden mit einem Oleosin/GUS-Fusionsprotein unter der Kontrolle des Oleosinpromotors aus Arabidopsis transformiert. Transformierte Samen wurden erhalten und fraktioniert. Die anfängliche Fraktionierung bestand aus Mahlen der Samen in 1,5 ml Puffer A, bestehend aus 15 mM Tricin-KOH, pH 7,5, 10 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 100 mM Saccharose, gefolgt von Zentrifugation bei 14.000 × g für 15 Minuten bei 4°C. Hieraus wurden drei Fraktionen erhalten, bestehend aus einer aufschwimmenden Ölkörperschicht, einer wäßrigen Schicht und einem Pellet. Die Ölkörperfraktion wurde gewonnen und hinsichtlich GUS-Aktivität getestet. Die verbleibende wäßrige Phase wurde für 2 Stunden bei 100.000 × g weiter zentrifugiert. Das Pellet und der Überstand aus dieser Zentrifugation wurden ebenfalls hinsichtlich GUS-Aktivität getestet. Die Einheiten sind nmol MU pro mg Protein pro Min.
Tabelle IV. Abspaltung des Enzyms GUS aus Oleosin/GUS-Fusionen, die mit Ölkörpern assoziiert sind, die von transgener Brassica napus abgeleitet sind, die ein Oleosin/GUS-Fusionsprotein enthält.
Ölkörper, die ein Oleosin/GUS-Fusionsprotein enthielten, wurden einer Spaltung unter Verwendung der Endopeptidase Thrombin unterzogen, wie es in Beispiel 5 beschrieben ist. Die gezeigten Werte sind die Aktivität von GUS vor und nach der Abspaltung mit Thrombin. Die Werte sind auch als ein Prozentanteil der gesamten Aktivität des freigesetzten GUS nach der Enzymfusion angegeben. Die Einheiten sind nmol Methylumbelliferon pro mg Protein/Min.
Tabelle V. Wiederverwendung der Aktivität der mit den Ölkörpern assoziierten Enzyme.
Ölkörper, die ein Oleosin/GUS-Protein enthielten, wurden aus den Samen transgener Brassica napus isoliert. Die Ölkörper wurden zu dem fluorimetrischen GUS-Substrat MUG zugegeben und für eine Stunde miteinander umgesetzt. Die Ölkörper wurden dann gewonnen und in ein neues Röhrchen gegeben, welches das Substrat enthielt, und erneut für eine Stunde miteinander umgesetzt. Dieser Prozeß wurde insgesamt viermal wiederholt. Die Tabelle veranschaulicht die wieder verwendbare Aktivität des Enzyms GUS, solange es noch mit den Ölkörpern assoziiert ist. Die Werte wurden auf 100% als die GUS-Aktivität ursprünglicher Ölkörperisolate normalisiert.
Tabelle VI. Gewinnung von aktivem Hirudin nach der Synthese von Hirudin in Pflanzensamen.
Ölkörper, die ein Hirudin/GUS-Fusionsprotein enthielten, wurden gemäß dem Verfahren isoliert und mit dem Endoprotease-Faktor Xa-Inhbitionstest unter Verwendung von N-p-Tosyl-gly-pro-arg-p-Nitroanilid (Sigma) behandelt. Die Aktivität von Hirudin wurde unter Verwendung eines Thrombins in dem Verfahren von Dodt et al. (1984, FEBS Lett., 65, 180–183) gemessen. Die Aktivität von Hirudin ist in Thrombineinheiten pro Test in Gegenwart von 255 μg an Ölkörperproteinen und auch in Antithrombineinheiten pro mg Ölkörperprotein ausgedrückt.
Tabelle VII: Expression von aktiven Oleosin/GUS-Fusionen in E. coli.
Wie es in Beispiel 22 beschrieben wurde, wurden Oleosin/GUS-Fusionen in E. coli exprimiert. Die Zellen wurden gezüchtet, mit IPTG induziert, und die Aktivität von GUS wurde gemessen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren für die Herstellung und Freisetzung eines rekombinanten Polypeptids aus einem rekombinanten Fusionspolypeptid, welches mit einem Ölkörperanteil einer Pflanze assoziiert ist, während der Saatkeimung und des Wachstums von Pflanzensämlingen, wobei das Verfahren umfaßt: a) Einführen einer ersten chimären DNA-Sequenz in eine Pflanzenzelle, wobei die Sequenz folgendes umfaßt: 1) eine erste DNA-Sequenz, die in der Lage ist, die in der Pflanzenzelle stattfindende Transkription 2) einer zweiten DNA-Sequenz zu regulieren, wobei die zweite DNA-Sequenz ein rekombinantes Fusionspolypeptid codiert und folgendes umfaßt: (i) eine DNA-Sequenz, die einen ausreichenden Anteil eines Ölkörperproteingens codiert, um das Zielen des rekombinanten Fusionspolypeptids auf einen Ölkörper bereitzustellen, welche im Leserahmen mit (ii) einer DNA-Sequenz, die ein rekombinantes Polypeptid codiert, und (iii) einer Linker-DNA-Sequenz, die eine Aminosäuresequenz codiert, die speziell durch enzymatische Mittel spaltbar ist, assoziiert ist, wobei die Linker-DNA-Sequenz (iii) zwischen der DNA-Sequenz (i), die das Ölkörperprotein codiert, und der DNA-Sequenz (ii), die das rekombinante Polypeptid codiert, angeordnet ist, und 3) eine dritte DNA-Sequenz, die eine Terminationsregion codiert, b) sequentielles oder gleichzeitiges Einführen einer zweiten chimären DNA-Sequenz in das Genom der Pflanze, wobei die Sequenz folgendes umfaßt: 1) eine erste DNA-Sequenz, die in der Lage ist, speziell während der Saatkeimung und des Saatwachstums die Transkription 2) einer zweiten DNA-Sequenz zu regulieren, die ein bestimmtes Enzym codiert, das in der Lage ist, die Linker-DNA-Sequenz der ersten chimären DNA-Sequenz zu spalten, und 3) eine dritte DNA-Sequenz, die eine Terminationsregion codiert, c) Regenerieren einer Pflanze aus der Pflanzenzelle und Züchten der Pflanze unter Erzeugung von Samen, wobei das rekombinante Fusionspolypeptid exprimiert wird und mit Ölkörpern assoziiert ist, und d) Zulassen der Keimung der Saat, wobei das Enzym in der zweiten chimären DNA-Sequenz exprimiert wird und das rekombinante Polypeptid aus dem rekombinanten Fusionspolypeptid, welches mit den Ölkörpern assoziiert ist, während der Saatkeimung und des frühen Sämlingswachstums spaltet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanze dikotyledon ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanze aus der Familie Brassicaceae stammt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Sequenz (i) der zweiten DNA-Sequenz (2) ein Oleosin ist, welches aus einer Pflanze aus der Familie Brassicaceae erhältlich ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Sequenz (i) der zweiten DNA-Sequenz (2) ein Oleosin ist, welches aus Arabidopsis thaliana erhältlich ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die DNA-Sequenz (i) die als SEQ ID NO:1 dargestellte Sequenz hat.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die DNA-Sequenz (i) ein Polypeptid mit der in SEQ ID NO:5 gezeigten Aminosäuresequenz codiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste DNA-Sequenz (1) einen Oleosin-Promotor umfaßt, welcher von Arabidopsis thaliana abgeleitet ist.