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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Tierernährung. Spezifisch
bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Identifizierung und
Verwendung von Genen, die für
verschiedene Enzyme kodieren, welche im Metabolismus von Phytat
in Pflanzen involviert sind, und auf die Verwendung dieser Gene
und von Mutanten davon, um in Nahrungsmitteln und Futtermitteln
die Phytatkonzentrationen zu verringern und/oder die Konzentrationen
an Nicht-Phytat-Phosphor
zu erhöhen.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Rolle von Phosphor in der Tierernährung ist gut anerkannt. Achtzig
Prozent des Phosphors im Körper
von Tieren wird im Skelett, das dem Tier die Struktur bereitstellt,
gefunden. Zwanzig Prozent des Phosphors in Tieren kann in Weichteilen
gefunden werden, wo es eine Bestandteilsverbindung ist und daher
in einer großen
Reihe von biochemischen Reaktionen involviert ist. Zum Beispiel
ist Phosphor für
die Synthese und Aktivität
von DNA, RNA, Phospholipiden und einigen B-Vitaminen erforderlich.
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Obgleich
Phosphor für
gesunde Tiere essentiell ist, ist auch anerkannt, dass nicht der
gesamte Phosphor in Futter bioverfügbar ist. Phytinsäuresalze
(d. h. Phytate) sind die Hauptspeicherform von Phosphor in Pflanzen.
Siehe z. B. „Chemistry
and Application of Phytic Acid: an Overview", Phytic Acid: Chemistry and Application;
Graf, Hrsg.; Pilatus Press: Minneapolis, MN, S. 1–21; (1986).
Phytate sind die Hauptform von Phosphor in Samen, wobei sie typischerweise
50% bis 80% des Samen-Gesamtphosphors ausmachen.
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In
Mais und Sojabohnen macht Phytat etwa 60% bis 80% des gesamten Phosphors
aus. Wenn Nahrung auf Samenbasis von Nicht-Wiederkäuern verzehrt
wird, bildet die verzehrte Phytinsäure mit mehreren nutritional
wichtigen Mineralstoffen im Intestinaltrakt Salze. Eine Ausscheidung
dieser Salze reduziert die Retention und Nutzung, d. h. die Bioverfügbarkeit
des Phosphor- und Mineralstoffgehalts der Nahrung. Folglich kann dies
zu Mineralmangel sowohl bei Menschen als auch bei Tieren, die die
oben genannten Samen als Nahrung verwenden, führen. Siehe z. B. McCance,
et al., Biochem. J., 29: 4269 (1935); Edman, Cereal Chem., 58: 21 (1981).
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Phytat,
eine wichtige Phosphorquelle, wird von monogastrischen Tieren nicht
metabolisiert. Phytinsäure
wird in der Tat als anti-nutritionaler Faktor angesehen, da sie
die Bioverfügbarkeit
von Proteinen und Mineralstoffen durch Chelatbildung reduziert;
siehe z. B. Cheryan, „Phytic
Acid Interactions in Food Systems", CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 13:
297–335
(1980).
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Phytat
verursacht nicht einfach eine Verringerung bei der Nährstoffverfügbarkeit.
Der Phytat-gebundene Phosphor in Tierabfall trägt zur Oberflächen- und
Grundwasserverschmutzung bei. Siehe z. B. Jongbloed, et al., Nether.
J. Ag. Sci. 38: 567 (1990).
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Da
der Phytatgehalt von Samen einen Einfluss auf Nahrungs-, Phosphor-
und Mineralstoffretention und auf die Umgebung hat, wurden mehrere
Ansätze
vorgeschlagen, um diesen negativen Einfluss zu reduzieren. Ansätze umfassen
die Entfernung von Nahrungsmittelphytat durch Intervention nach
der Ernte und genetische Reduzierung des Samenphytatgehalts.
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Verfahren
zur Nahrungsmittelprozessierung nach der Ernte, die Phytinsäure entweder
physikalisch oder durch Fermentation entfernen, werden z. B. von
Indumadhavi, et al., Int. J. Food Sci. Tech. 27: 221 (1992) offenbart.
Das Hydrolysieren von Phytinsäure
ist ein nützlicher
Ansatz, um den Nährwert
vieler Pflanzennahrungsmittel zu erhöhen. Phytasen, wie unten ausführlicher
diskutiert wird, katalysieren die Umwandlung von Phytinsäure in Inositol
und anorganisches Phosphat. Phytase-produzierende Mikroorganismen
umfassen Bakterien und Hefen. Siehe z. B. Power, et al., J. Bacteriol.
151: 1102–1108
(1982); Segueilha, et al., Biotechnol. Lett. 15(4): 399–404 (1993)
und Nayini, et al., Lebensm. Wiss. Technol. 17: 24–26 (1984).
Die Verwendung von Phytasen, Phytinsäure-spezifischen Phosphohydrolasen,
typischerweise mikrobieller Herkunft, als Nahrungsergänzungsmittel
wird von Nelson, et al., J. Nutr. 101: 1289 (1971) offenbart. Alle
derzeitig bekannten Nach-Ernte-Techniken involvieren zusätzliche
Arbeitssschritte und Ausgaben, um die mit Phytat verbundenen Probleme
zu umgehender genetische Ansatz involviert eine Entwicklung von
Nutzpflanzengermplasma, das vererbbare Reduktionen bei der Samenphytinsäure besitzt.
Eine vererbbare quantitative Variation bei der Samenphytinsäure wurde
unter Linien mehrerer Nutzpflanzenspezies beobachtet. Siehe Raboy,
in: Inositol Metabolism in Plants, Moore D. J., et al., (Herausg.)
Alan R. Liss, New York, S. 52–73;
(1990).
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Allerdings
wurde festgestellt, dass diese Variation in hohem Maße und positiv
mit einer Variation bei weniger wünschenswerten Charakteristika
korreliert ist; daher könnte
eine Züchtung
auf reduzierte Samen-Phytinsäure
unter Verwendung traditioneller Züchtungsverfahren in Germplasma
mit unerwünschten
korrelierten Charakteristika resultieren. Bis heute gab es keine
Berichte über
kommerziell akzeptables Maisgermplasma mit niedrigem Phytinsäuregehalt,
das durch einen solchen Ansatz produziert wurde.
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Bei
der genetischen Veränderung
von Phytat wurde eine natürliche
Variabilität
für Phytat
und freiem Phosphor untersucht. Siehe Raboy, V. und D. B. Dickinson,
Crop Sci. 33: 1300–1305
(1993) und Raboy, V. et al., Maydica 35: 383–390 (1990). Während eine
gewisse Variabilität
für Phytinsäure beobachtet
wurde, gab es keine entsprechende Änderung beim Nicht-Phytat-Phosphor. Außerdem wurde
eine sortenabhängige
Variabilität,
die nur zwei Prozent der Variation darstellte, beobachtet, wohingegen
98% der Variation beim Phytat Umweltfaktoren zugeschrieben wurde.
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Wie
oben erwähnt
wurde, haben Studien mit Sojabohnen und anderen Nutzpflanzen gezeigt,
dass eine Veränderung
der genetischen Expression von Phytat durch Züchtungsverfahren mit rekurrenter
Selektion mit unerwünschten
Resultaten korreliert sein kann. Siehe Raboy, V. D. B. Dickinson
und F. E. Below, Crop Sci. 24: 431–434 (1984); Raboy, V., F.
E. Below und D. B.
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Dickinson;
J. Hered. 80: 311–315
(1989); Raboy, V., M. M. Noaman, G. A. Taylor und S. G. Pickett: Crop.
Sci. 31: 631–635;
(1991).
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Obgleich
vorgeschlagen wurde, dass eine Blockierung bei der Phytinsäureakkumulation
bei der Herstellung von Germplasma mit niedrigem Phytinsäuregehalt
ohne die Einführung
der unerwünschten
korrelierten Reaktionen wertvoll sein könnte (Siehe Raboy, et al.,
Crop. Sci. 33: 1300 (1993)), zeigte die Verwendung eines solchen
traditionellen Mutantenselektionsansatzes in einigen Fällen, dass
sich Homozygozitie für
Mutanten, die mit substantiellen Reduktionen bei der Phytinsäure assoziiert
sind, auch als letal erweist.
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Myoinositol
wird in drei Schritten aus Glucose produziert, wobei die Enzyme
Hexokinase (EC 2.7.1.1), L-Myoinositol-1-phosphat-Synthase (EC 5.5.1.4)
und L-Myoinositol-1-phosphat-Phosphatase
(EC 3.1.3.25) involviert sind. Der Biosyntheseweg, der zu Phytat
führt ist
komplex und nicht vollständig
geklärt.
Ohne eine Bindung an eine bestimmte Theorie der Phytatbildung eingehen
zu wollen, wird angenommen, dass die Synthese durch eine Reihe von
einer oder mehreren aus ADP-Phosphotransferasen, ATP-abhängigen Kinasen
und Isomerasen vermittelt sein kann. Es wurde eine Reihe von Zwischenprodukten
isoliert, einschließlich
z. B. 2- und 3-Monophosphate,
1,3- und 2,6-Diphosphate, 1,3,5- und 2,5,6-Triphosphate, 1,3,5,6-
und 2,3,5,6-Tetraphosphate und 1,2,4,5,6- und 1,2,3,4,6-Pentaphosphate.
Es wurden einige unbedeutende Zyklen der Dephosphorylierung und
Rephosphorylierung der P5- und P6-Formen beschrieben, ebenso wie ein Zyklus,
der G6P → Myoinositol-1-phosphat → Myoinositol
involviert; der letzte Schritt ist vollständig reversibel, was anzeigt,
dass die Kontrolle des metabolischen Flusses durch diesen Weg bedeutend
ist. Diese Erfindung unterscheidet sich von den voran gehenden Ansätzen dahingehend,
dass sie Werkzeuge und Reagenzien bereitstellt, die es dem Fachmann
durch die Anwendung von inter alia transgenen Methodologien ermöglichen,
den metabolischen Fluss bezüglich
des Phytinsäurewegs
zu beeinflussen. Dieser Einfluss kann entweder anabolisch oder katabolisch
sein, womit gemeint ist, dass der Einfluss zur Verringerung des
Flusses, der aus der Biosynthese von Phytinsäure resultiert, und/oder zur
Erhöhung
des Abbaus (d. h. Katabolismus von Phytinsäure) wirken kann. Durch diese
Erfindung wird eine Kombination beider Ansätze in Betracht gezogen.
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Wie
oben erwähnt
wurde, kann einmal gebildetes Phytat durch Phosphohydrolasen, insbesondere 3-Phytasen,
die typischerweise in Mikroorganismen gefunden werden, und 6-Phytasen, die dominante
Form in Pflanzen, dephosphoryliert werden.
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Nach
dem anfänglichen
Ereignis sind beide Enzyme fähig,
Phytat sukzessive zu freiem Inositol zu dephosphorylieren.
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Dementsprechend
gab es auch Berichte, dass Pflanzen mit Konstrukten transformiert
werden können, welche
ein Gen umfassen, das für
Phytase kodiert. Siehe Pen, et al., PCT-Publikation
WO 91/14782 . Transgene Samen oder
Pflanzengewebe, die Phytasen exprimieren, können dann als Nahrungsergänzungsmittel verwendet
werden. Allerdings wurde diese Anmeldung nicht gemacht, um Samen-Phytinsäure zu reduzieren.
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Basierend
auf dem Vorangehenden gibt es den Bedarf, den nutritionalen Gehalt
von Pflanzen, insbesondere von Mais und Sojabohnen, zu verbessern,
indem Nicht-Phytat-Phosphor erhöht
wird und Samenphytat verringert wird, und zwar ohne andere offensichtliche
oder substantielle nachteilige Wirkungen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, Pflanzen,
insbesondere transgenen Mais, bereitzustellen, die erhöhte Konzentrationen
an Nicht-Phytat-Phosphor ohne die entsprechenden schädlichen
Wirkungen haben.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
von Pflanzen, insbesondere von transgenem Mais, die reduzierte Konzentrationen
an Phosphor in der Form von Phytat ohne entsprechende schädliche Wirkungen
haben.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
von transgenen Pflanzenlinien mit dominanten, vererbbaren Phänotypen,
die in Züchtungsprogrammen
einsetzbar sind, die zur Produktion kommerzieller Produkte mit verbesserter
Phosphorverfügbarkeit
und reduziertem Phytat konzipiert sind.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Verbesserung
der Tierleistung durch Fütterung
von Tieren mit Pflanzen und Teilen davon, insbesondere mit Samen,
mit erhöhtem
nutritionalem Wert.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
von Pflanzensamen, insbesondere Getreidesamen bzw. Maissamen und
dem resultierenden Essen, die in einer geringeren Umweltkontamination
resultieren, wenn sie ausgeschieden werden, als dies derzeit verwendete
Samen tun.
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Diese
und andere Aufgaben der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung
leicht ersichtlich werden.
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Isoliertes
Polynucleotid, kodierend für
ein Polypeptid mit Myoinositol-1-phosphat-Synthase-Aktivität und umfassend
- (a) eine Polynucleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das
die Sequenz SEQ ID NO: 11 umfasst oder ein Komplement davon;
- (b) eine Polynucleotidsequenz mit einer Nucleinsäuresequenz,
amplifiziert aus einer Zea-mays-Nucleinsäurebibliothek unter Verwendung
der Primer von SEQ ID NOs: 12–13;
- (c) ein Polynucleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu SEQ
ID NO: 10, wobei die %-Sequenzidentität auf der gesamten kodierenden
Region basiert und durch das GAP-Programm bestimmt wird, wobei Gap
Creation Penalty = 50 und Gap Extension Penalty = 3; und
- (d) eine Polynucleotidsequenz, die für ein Fragment eines Polypeptids
mit der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 11 kodiert, wobei das Fragment eine Deletion von
1 bis 10 Aminosäuren
hat;
oder ein Komplement von (a) oder (c).
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden Polypeptide, die als neue Phytat-Biosyntheseenzyme identifiziert
wurden, bereitgestellt.
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Es
wird ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, das Myoinositol-1-phosphat-Synthase-Aktivität hat und eine
Aminosäuresequenz
umfasst, die wenigstens 90% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 11 hat, wobei
diese Prozent-Sequenzidentität
auf der gesamten Sequenz basiert und durch das GAP-Programm bestimmt
wird, wobei Gap Creation Penalty = 12 und Gap Extension Penalty
= 4.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darüber hinaus
darin, Polynucleotide bereitzustellen, die für Mais-Myoinositol-1-phosphat-Synthase
kodieren.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
dieses Aspekts der Erfindung umfasst das Polynucleotid die Regionen,
die für
Myoinositol-1-phosphat-Synthase kodieren.
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In
einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden
die Polypeptide aus Zea Mays isoliert.
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Gemäß diesem
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Polynucleotid bereitgestellt,
das eine Sequenz einer Nucleinsäure
hat, amplifiziert aus einer Zea mays-Nucleinsäurebibliothek unter Verwendung
der Primer von SEQ ID NOs: 12–13.
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Gemäß diesem
Aspekt der Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle, die für Myoinositol-1-phosphat-Synthaseenzyme,
insbesondere solche aus Zea mays, kodieren, mRNAs, cDNAs, genomische DNAs
und in weiteren Ausführungsformen
dieses Aspekts der Erfindung biologisch nützliche Varianten, Analoga
oder Derivate davon oder Fragmente davon, einschließlich Fragmente
der Varianten, Analoga und Derivate, bereitgestellt.
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Weitere
Ausführungsformen
der Erfindung sind natürlich
auftretende allelische Varianten der Nucleinsäuremoleküle in der Sequenz, vorausgesetzt
sie kodieren für
Myoinositol-1-phosphat-Synthase.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines Verfahrens zur Herstellung der Polypeptide, Polypeptidfragmente,
Varianten und Derivate, Fragmenten der Varianten und Derivate und
Analoga der vorstehenden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
dieses Aspekts der Erfindung werden Verfahren zur Herstellung der
Myoinositol-1-phosphat-Synthase-Polypeptide bereitgestellt, umfassend
Kultivieren von Wirtszellen, die exprimierbar darin eingebaut ein
Polynucleotid haben, unter Bedingungen zur Expression von Myoinositol-1-phosphat-Synthaseenzymen
im Wirt und dann Gewinnen des exprimierten Polypeptids.
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Gemäß einer
anderen Aufgabe der Erfindung werden Produkte, Zusammensetzungen,
Verfahren und Methoden, die die vorstehend genannten Polypeptide
und Polynucleotide verwenden, zu Zwecken, die Forschungszwecke,
biologische Zwecke und landwirtschaftliche Zwecke einschließen, bereitgestellt.
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Weitere
Aufgaben, Merkmale, Vorzüge
und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus der
folgenden Beschreibung klar werden. Es sollte jedoch selbstverständlich sein,
dass die folgende Beschreibung und die spezifischen Beispiele, obgleich
sie bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung beschreiben, lediglich zum Zwecke der Erläuterung
angeführt
werden. Verschiedene Änderungen
und Modifikationen innerhalb des Geistes und des Umfangs der offenbarten
Erfindung werden dem Fachmann beim Lesen der folgenden Beschreibung
und beim Lesen der anderen Teile der vorliegenden Offenbarung klar
werden.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Diese
Anmeldung beansprucht gemäß 35 U.S.C.
120 die Priorität
der U.S. Ser. Nrn. 60/053,371, eingereicht am 18. Juli 1997; 60/053,944,
eingereicht am 28. Juli 1997; 60/055,526, eingereicht am 8. August 1997,
60/055,446 und 60/085,852, eingereicht am 18. Mai 1998.
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Diese
Erfindung bezieht sich zum Teil auf neu identifizierte Polynucleotide
und Polypeptide; Varianten und Derivate dieser Polynucleotide und
Polypeptide; Verfahren zur Herstellung dieser Polynucleotide und
dieser Polypeptide und auf Varianten und Derivate und Antagonisten
dieser Polypeptide und auf Verwendungen dieser Polynucleotide, Polypeptide,
Varianten, Derivate und Antagonisten. In dieser Hinsicht und in
anderer Hinsicht bezieht sich die Erfindung insbesondere auf Polynucleotide
und Polypeptide des Phytat-Stoffwechselwegs, insbesondere bezüglich Myoinositol-1-phosphat-Synthase
und Gene, die dieselbe kodieren.
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Übersicht über Ausdrücke
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Die
folgenden veranschaulichenden Erläuterungen werden angeführt, um
das Verständnis
bestimmter Ausdrücke,
die hierin häufig
verwendet werden, insbesondere in den Beispielen, zu erleichtern.
Die Erläuterungen
werden aus Gründen
der Zweckdienlichkeit angeführt
und sind für
die Erfindung nicht beschränkend.
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PHYTAT-BIOSYNTHESEENZYM-BINDUNGSMOLEKÜL, wie der
Ausdruck hierin verwendet wird, bezieht sich auf Moleküle oder
Ionen, die spezifisch an Phytat-Biosyntheseenzym-Polypeptide
oder -Polynucleotide der vorliegenden Erfindung binden oder mit
diesen Wechselwirken, einschließlich
z. B. Enzymsubstrate, Zellmembrankomponenten und klassische Rezeptoren.
Die Bindung zwischen Polypeptiden der Erfindung und solchen Molekülen, einschließlich Bindungs-
oder Wechselwirkungsmoleküle,
kann ausschließlich
für Polypeptide
der Erfindung sein, was bevorzugt ist oder kann für Polypeptide
der Erfindung hochspezifisch sein, was auch bevorzugt ist, oder
kann für
eine Gruppe von Proteinen hochspezifisch sein, welche Polypeptide
der Erfindung beinhaltet, was bevorzugt ist, oder sie kann für mehrere
Gruppen von Proteinen, von denen wenigstens eine ein Polypeptid
der Erfindung umfasst, spezifisch sein. Bindungsmoleküle umfassen
auch Antikörper und
von Antikörpern
abgeleitete Reagenzien, die spezifisch an Polypeptide der Erfindung
binden.
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GENETISCHES
ELEMENT, wie der Ausdruck hierin verwendet wird, bezieht sich im
Allgemeinen auf ein Polynucleotid, das eine Region umfasst, die
für ein
Polypeptid kodiert, oder auf eine Polynucleotidregion, die die Replikation,
Transkription oder Translation oder andere Prozesse, die für die Expression
des Polypeptids in einer Wirtszelle wichtig sind, reguliert, oder
ein Polynucleotid, das sowohl eine Region, die für ein Polypeptid kodiert, als
auch eine Region, die funktionell damit verknüpft ist, die die Expression
steuert, umfasst. Genetische Elemente können in einem Vektor enthalten
sein, der als episomales Element repliziert, d. h. als ein Molekül, das physikalisch
vom Wirtszellgenom unabhängig
ist. Sie können
innerhalb von Plasmiden enthalten sein. Genetische Elemente können auch
in einem Wirtszellgenom umfasst werden, nicht in ihrem natürlichen
Zustand, sondern stattdessen nach Manipulation z. B. unter anderem
Isolierung, Klonierung und Einführung
in eine Wirtszelle in der Form von gereinigter DNA oder in einem
Vektor.
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WIRTSZELLE,
wie der Ausdruck hierin verwendet wird, ist eine Zelle, die durch
eine exogene Polynucleotidsequenz transformiert oder transfiziert
wurde, oder zur Transformation oder Transfektion fähig ist.
Exogene Polynucleotidsequenz ist so definiert, dass sie eine nicht
natürlicherweise
in der Zelle vorkommende Sequenz bezeichnet. Diese beinhaltet eine
Transformation, um zusätzliche
Kopien eines endogenen Polynucleotids einzuarbeiten.
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IDENTITÄT und SIMILARITÄT, wie die
Ausdrücke
hierin verwendet werden und wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind,
sind Beziehungen zwischen zwei Polypeptidsequenzen oder zwei Polynucleotidsequenzen,
wie sie durch Vergleichen der Sequenzen bestimmt werden. Auf dem
Fachgebiet bedeutet Identität
auch den Sequenz-Verwandtheitsgrad zwischen zwei Polypeptid- oder
zwei Polynucleotidsequenzen, wie der durch Übereinstimmung zwischen zwei
Strängen
solcher Sequenzen bestimmt wird. Sowohl Identität als auch Similarität können in
einfacher Weise errechnet werden (Computational Molecular Biology,
Lesk, A. M., Herausg. Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing:
Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Herausg. Academic
Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part
I, Griffin, A. M. und Griffin, H. G., Herausg. Humana Press, New
Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje,
G., Academic Press, 1987; und Sequence Analysis Primer, Gribskov,
M. und Devereux, J. Herausg., M Stockton Press, New York, 1991).
Verfahren, die üblicherweise
eingesetzt werden, um Identität
oder Similarität
zwischen zwei Sequenzen zu bestimmen, umfassen, sind aber nicht
beschränkt
auf, die, die in Carillo, H. und Lipman, D., SIAM J. Applied Math.,
48: 1073 (1988) offenbart sind. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung
der Identität sind
so konzipiert, dass sie die größte Übereinstimmung
zwischen den zwei untersuchten Sequenzen ergeben. Verfahren zur
Bestimmung von Identität
und Similarität
sind in Computerprogramme eingearbeitet. Typische Computerprogramm-Verfahren
zur Bestimmung von Identität
und Similarität
zwischen zwei Sequenzen umfassen das GCG-Programm Paket (Devereux,
J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984); BLASTP, BLASTN,
FASTA und TFASTA (Atschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403
(1990)).
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Für Zwecke
der Definition der vorliegenden Erfindung wird das Gap-Programm
verwendet. Der für
das Gap-Programm verwendete Algorithmus ist der von Needleman und
Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443–453 [1970]).
Die verwendeten Parameter sind wie folgt: für Nucleotid vergleiche ist die
Gap Creation Penalty = 50, Gap Extension Penalty = 3; für Aminosäurevergleiche
ist die Gap Creation Penalty = 12, die Gap Extension Penalty = 4.
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ISOLIERT,
wie der Ausdruck hierin verwendet wird, bedeutet „durch
Menschenhand" aus
dem natürlichen
Zustand verändert,
d. h. dass sie (eine Sequenz), wenn sie in der Natur auftritt, verändert wurde
oder aus ihrer ursprünglichen
Umgebung entfernt wurde oder beides. Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes Polynucleotid
oder Polypeptid, das natürlicherweise
in einem lebenden Organismus in seinem natürlichen Zustand ist, nicht „isoliert", allerdings ist
dasselbe Polynucleotid oder Polypeptid, das von den gleichzeitig
vorliegenden Materialien seines natürlichen Zustands abgetrennt
ist, nach dem hierin verwendeten Ausdruck „isoliert". Was z. B. Polynucleotide angeht, so
bedeutet der Ausdruck isoliert, dass das Polynucleotid aus dem Chromosom
und der Zelle in dem/der es natürlicherweise
auftritt, abgetrennt ist. Als Teil der Isolierung oder nach der
Isolierung können
solche Polynucleotide an andere Polynucleotide, z. B. DNAs, für eine Mutagenese angefügt werden,
um Fusionsproteine zu bilden, und beispielsweise zur Reproduktion
oder Expression in einem Wirt. Die isolierten Polynucleotide können, allein
oder verknüpft
mit anderen Polynucleotiden, z. B. Vektoren, in Wirtszellen in Kultur
oder in ganzen Organismen eingeführt
werden. Eingeführt
in Wirtszellen, in Kultur oder in ganze Organismen, werden solche
DNAs noch isoliert sein, wie der Ausdruck hierin verwendet wird, da
sie nicht in ihrer natürlich
vorkommenden Form oder Umgebung wären. Entsprechend können die
Polynucleotide und Polypeptide in einer Zusammensetzung, z. B. Mediumformulierungen,
Lösungen
zur Einführung von
Polynucleotiden oder Polypeptiden, z. B. in Zellen, Zusammensetzungen
oder Lösungen
für chemische oder
enzymatische Reaktionen, die z. B. keine natürlich vorkommenden Zusammensetzungen
sind, auftreten und darin isolierte Polynucleotide oder Polypeptide
innerhalb der Bedeutung dieses Ausdrucks, wie er hierin verwendet
wird, bleiben.
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LIGATION,
wie der Ausdruck hierin verwendet wird, bezieht sich auf den Prozess
der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei oder mehr
Polynucleotiden, die am häufigsten
doppelsträngige DNAs
sind. Techniken zur Ligation sind auf dem Fachgebiet gut bekannt
und Protokolle zur Ligation werden in Standardlaborhandbüchern und
Literaturstellen beschrieben, z. B. in Sambrook et al., MOLECULAR
CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2. Ausgabe; Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) und Maniatis et al.,
S. 146, die unten zitiert werden.
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OLIGONUCLEOTID(E),
wie der Ausdruck hierin verwendet wird, bezieht sich auf kurze Polynucleotide.
Oft bezieht sich der Ausdruck auf einzelsträngige Desoxyribonucleotide,
er kann sich aber ebenso auf einzel- oder doppelsträngige Ribonucleotide,
RNA:DNA-Hybride und doppelsträngige
DNAs unter anderen beziehen. Oligonucleotide, z. B. einzelsträngige DNA-Sonden-Oligonucleotide,
werden oft durch chemische Verfahren, z. B. solche, die an automatisierten
Oligonucleotid-Synthesizern durchgeführt werden, synthetisiert.
Allerdings können
Oligonucleotide durch eine Vielzahl anderer Verfahren hergestellt
werden, einschließlich
in vitro-DNA-Rekombination-vermittelte
Techniken und durch Expression von DNAs in Zellen und Organismen.
Zunächst
werden chemisch synthetisierte DNAs typischerweise ohne 5'-Phosphat erhalten.
Die 5'-Enden solcher Oligonucleotide
sind keine Substrate für
Phosphodiesterbindungsbildung durch Ligationsreaktionen, die DNA-Ligasen
verwenden, die typischerweise zur Bildung von rekombinanten DNA-Molekülen verwendet
werden. Wenn eine Ligation von solchen Oligonucleotiden erwünscht ist,
kann ein Phosphat durch Standardtechniken, z. B. solche, die eine
Kinase und ATP verwenden, angefügt
werden. Das 3'-Ende
eines chemisch synthetisierten Oligonucleotids hat im Allgemeinen
eine freie Hydroxylgruppe und wird in Gegenwart einer Ligase, z.
B. T4-DNA-Ligase leicht eine Phosphodiesterbindung mit einem 5'-Phosphat eines anderen
Polynucleotids, z. B. eines anderen Oligonucleotids, bilden. Wie
gut bekannt ist, kann diese Reaktion selektiv verhindert werden,
wenn dies gewünscht
ist, indem die 5'-Phosphate des anderen
Polynucleotids (der anderen Polynucleotide) vor Ligation entfernt
werden.
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PLASMIDE,
wie der Ausdruck hierin verwendet wird, werden hierin im Allgemeinen
mit dem kleinen Buchstaben p, der vorgestellt ist und/oder auf den
Großbuchstaben
und/oder Nummern folgen, nach Standardkonventionen der Namensgebung,
die dem Fachmann geläufig
sind, bezeichnet. Ausgangsplasmide, die hierin offenbart sind, sind
entweder im Handel verfügbar,
allgemein zugänglich
oder können
aus verfügbaren
Plasmiden durch Routineanwendung gut bekannter veröffentlichter
Verfahren konstruiert werden. Viele Plasmide und andere Klonierungs-
und Expressionsvektoren, die gemäß der vorliegenden
Erfindung eingesetzt werden können,
sind dem Fachmann gut bekannt und in einfacher Weise verfügbar. Darüber hinaus
können
Fachleute in einfacher Weise eine Reihe von anderen Plasmiden, die
zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind, konstruieren. Die
Eigenschaften, die Konstruktion und die Verwendung solcher Plasmide
sowie anderer Vektoren in der vorliegenden Erfindung werden dem
Fachmann aus der vorliegenden Offenbarung klar werden.
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POLYNUCLEOTID(E),
wie der Ausdruck hierin verwendet wird, bezieht sich im Allgemeinen
auf ein beliebiges Polyribonucleotid oder Polydesoxyribonucleotid,
welches unmodifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA
sein kann. So beziehen sind Polynucleotide, wie der Ausdruck hierin
verwendet wird, unter anderem auf einzel- und doppelsträngige DNA,
DNA, die ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen oder einzel-,
doppel- und tripelsträngigen Regionen
ist, einzel- und doppelsträngige
RNA und RNA, die ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen
ist, auf Hybridmoleküle,
die DNA und RNA umfassen, die einzelsträngig oder typischer doppelsträngig oder
tripelsträngig,
oder ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen sein kann.
Außerdem
bezieht sich Polynucleotid, wie der Ausdruck hierin verwendet wird,
auf Tripelstrang-Regionen, die RNA oder DNA, oder beide, RNA und
DNA, umfassen. Die Stränge
in solchen Regionen können
aus demselben Molekül
oder aus verschiedenen Molekülen
gebildet sein. Die Regionen können
alle aus einem oder mehreren der Moleküle umfassen, involvieren aber
typischerweise nur eine Region aus einigen der Moleküle. Eines
der Moleküle
einer Tripelhelix-Region ist oft ein Oligonucleotid. Wie der Aus druck
Polynucleotid hierin verwendet wird, umfasst er DNAs oder RNAs,
wie sie oben beschrieben wurden, die eine oder mehrere modifizierte
Basen enthalten. Somit sind DNAs oder RNAs mit Hauptketten, die aus
Gründen
der Stabilität
oder aus anderen Gründen
modifiziert sind, „Polynucleotide", wie der Ausdruck
hierin beabsichtigt ist. Darüber
hinaus sind DNAs oder RNAs, die ungewöhnliche Basen, z. B. Inosin,
oder modifizierte Basen, z. B. tritylierte Basen, um gerade zwei
Beispiele zu nennen, umfassen, Polynucleotide entsprechend der Verwendung
des Ausdruckes hierin. Es wird anerkannt werden, dass eine große Vielzahl
von Modifikationen an DNA und RNA durchgeführt wurden, die vielen den
Fachmann bekannten nützlichen
Zwecken dienen. Der Ausdruck Polynucleotid, wie er hierin verwendet
wird, umfasst solche chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifizierten
Formen von Polynucleotiden, wie auch die chemischen Formen von DNA
und RNA, die für
Viren und Zellen, einschließlich
inter alia, einfache und komplexe Zellen, charakteristisch sind.
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POLYPEPTIDE,
wie der Ausdruck hierin verwendet wird, umfasst alle Polypeptide,
wie sie unten beschrieben werden. Die Grundstruktur von Polypeptiden
ist gut bekannt und wurde in unzähligen
Lehrbüchern und
anderen Publikationen des Fachgebiets beschrieben. In diesem Kontext
wird der Ausdruck hierin verwendet, um ein beliebiges Peptid oder
Protein zu benennen, das zwei oder mehr Aminosäuren umfasst, die in einer linearen
Kette durch Peptidbindungen aneinander gebunden sind. Der Ausdruck,
wie er hierin verwendet wird, bezieht sich sowohl auf kurze Ketten,
die üblicherweise
auf dem Fachgebiet auch als Peptide, Oligopeptide und Oligomere
bezeichnet werden, als auch auf längere Ketten, die im Allgemeinen
auf dem Fachgebiet als Proteine, von denen es viele Typen gibt,
bezeichnet werden. Es wird einzusehen sein, dass Polypeptide oft andere
Aminosäuren
als die 20 Aminosäuren,
die üblicherweise
als die 20 natürlich
auftretenden Aminosäuren bezeichnet
werden, enthalten und dass viele Aminosäuren, einschließlich der
terminalen Aminosäuren,
in einem gegebenen Polypeptid entweder durch natürliche Prozesse, z. B. Prozessierung
und andere post-translationale Modifikationen, aber auch durch chemische
Modifikationstechniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, modifiziert
sein können.
Selbst die üblichen
Modifikationen, die natürlicherweise
in Polypeptiden auftreten, sind zu zahlreich, um hier erschöpfend aufgelistet
zu werden, sie sind allerdings in Basistexten und in detaillierteren
Monographien sowie in der umfangreichen Forschungsliteratur gut
beschrieben und sie sind dem Fachmann gut bekannt. Unter den bekannten
Modifikationen, die in Polypeptiden der Erfindung vorliegen können, sind,
um einige wenige typische zu nennen, Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung,
Amidierung, kovalente Bindung von Flavin, kovalente Bindung einer
Häm-Gruppierung,
kovalente Bindung eines Nucleotids oder Nucleotidderivats, kovalente
Bindung eines Lipids oder Lipidderivats, kovalente Bindung von Phosphatdiylinositol,
Vernetzung, Cyclisierung, Disulfidbindungsbildung, Demethylierung,
Bildung von kovalenten Vernetzungen, Bildung von Cystin, Bildung
von Pyroglutamat, Formylierung, gamma-Carboxylierung, Glycosylierung, GPI-Anker-Bildung,
Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidation,
proteolytische Prozessierung, Phosphorylierung, Prenylierung, Ra cemisierung,
Selenoylierung, Sulfatierung, Transfer-RNA-vermittelte Addition
von Aminosäuren
an Proteine, z. B. Arginylierung, und Ubiquitinierung. Solche Modifikationen
sind dem Fachmann gut bekannt und sind detailliert in der wissenschaftlichen
Literatur beschrieben. Einige besonders gängige Modifikationen, Glycosylierung,
Lipidbindung, Sulfatierung, gamma-Carboxylierung von Glutaminsäureresten,
Hydroxylierung und ADP-Ribosylierung z. B. sind in den meisten Grundlagentexten,
z. B. in PROTEINS – STRUCTURE
AND MOLECULAR PROPERTIES; 2. Ausgabe, T. E. Creighton, W. H. Freeman
and Company, New York (1993) beschrieben. Über dieses Thema sind viele
detaillierte Übersichtsartikel
verfügbar,
z. B. jene, die von Wold F., Posttranslational Protein Modifications:
Perspectives and Prospects, S. 1–12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT
MODIFICATION OF PROTEINS; B: C. Johnson, Herausg., Academic Press,
New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626–646 (1990)
und Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications
and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48–62 (1992) bereitgestellt wurden.
Es wird einzusehen sein, wie es auch bekannt und wie es oben angegeben
wurde, dass Polypeptide nicht immer ganz linear sind. Zum Beispiel
können
Polypeptide als Resultat einer Ubiquitinierung verzweigt sein und
sie können
mit oder ohne Verzweigung ringförmig
sein, im Allgemeinen als Resultat posttranslationaler Ereignisse,
einschließlich
eines natürlichen
Prozessierungsereignisses, und Ereignisse, die aus menschlicher
Manipulation resultieren, die nicht natürlich auftreten. Ringförmige, verzweigte
und verzweigte ringförmige
Polypeptide können
durch einen nicht-translationalen natürlichen Prozess und auch durch
vollständig
synthetische Verfahren synthetisiert werden. Modifikationen können irgendwo
in einem Polypeptid, einschließlich
der Peptidhauptkette, der Aminosäureseitenketten
und des Amino- oder Carboxylterminus, auftreten. In der Tat ist
eine Blockierung der Amino- oder Carboxylgruppe in einem Polypeptid
oder von beiden durch eine kovalente Modifikation bei natürlich vorkommenden
und synthetischen Polypeptiden gängig
und solche Modifikationen können
auch in Polypeptiden der vorliegenden Erfindung vorliegen. Beispielsweise
wird der Amino-terminale
Rest von Polypeptiden, die in E. coli oder anderen Zellen hergestellt
werden, vor einer proteolytischen Prozessierung fast invariabel
N-Formylmethionin sein. Während
einer posttranslationalen Modifikation des Peptids kann ein Methioninrest
am NH2-Terminus deletiert werden. Dementsprechend
zieht diese Erfindung die Verwendung sowohl der Methionin-enthaltenden als
auch der Methionin-freien Amino-terminalen Varianten des Proteins
der Erfindung in Betracht. Die Modifikationen, die in einem Polypeptid
auftreten, werden oft eine Funktion dessen sein, wie es hergestellt
wird. Für
Polypeptide, die durch Exprimieren eines klonierten Gens in einem
Wirt hergestellt werden, werden die Natur und das Ausmaß der Modifikationen
zum großen
Teil z. B. durch die post-translationale Modifikationskapazität der Wirtszelle
und die in der Polypeptidaminosäuresequenz
vorliegenden Modifikationssignale bestimmt werden. Wie es z. B.
gut bekannt ist, tritt eine Glycosylierung oft nicht in Bakterienwirten,
wie z. B. E. coli, auf. Wenn demnach eine Glycosylierung gewünscht wird, sollte
ein Polypeptid in einem glycosylierenden Wirt, im Allgemeinen in
einer Eukaryotenzelle, exprimiert werden. Ähnliche Betrachtungen finden
auf andere Modifikationen Anwendung. Es wird einzusehen sein, dass derselbe
Modifikationstyp zu demselben Grad oder zu variierendem Grad an
mehreren Stellen in einem gegebenen Polypeptid vorliegen kann. Ein
gegebenes Polypeptid kann auch viele Modifikationstypen enthalten.
Im Allgemeinen umfasst der Ausdruck Polypeptid, wie er hierin verwendet
wird, alle derartigen Modifikationen, insbesondere solche, die in
Polypeptiden vorliegen, die durch Exprimieren eines Polynucleotids
in einer Wirtszelle synthetisiert werden.
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Der
Ausdruck TRANSFORMATION, wie er hierin verwendet wird, ist das Verfahren,
durch welches eine Zelle durch exogene DNA „transformiert" wird, wenn solche
exogene DNA ins Innere der Zellmembran eingeführt wurde. Exogene DNA kann
in chromosomale DNA, die das Genom der Zelle bildet, integriert
(kovalent gebunden) werden oder nicht. In Prokaryoten und Hefen
z. B. kann die exogene DNA an einem episomalen Element, z. B. einem
Plasmid, gehalten werden. Was höhere
eukaryotische Zellen angeht, so ist eine stabil transformierte oder
transfizierte Zelle eine, in welcher die exogene DNA in das Chromosom
so integriert wurde, dass sie durch Tochterzellen durch Chromosomenreplikation
vererbt wird. Diese Stabilität
wird durch die Fähigkeit
der eukaryotischen Zelle, Zelllinien oder Klone zu entwickeln, die
aus einer Population von Tochterzellen bestehen, die die exogene
DNA enthalten, bewiesen.
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VARIANTE(N)
von Polynucleotiden oder Polypeptiden, wie der Ausdruck hierin verwendet
wird, sind Polynucleotide oder Polypeptide, die sich von einem Referenz-Polynucleotid
bzw. -Polypeptid unterscheiden. Varianten in diesem Sinne werden
unten und an anderer Stelle in der vorliegenden Offenbarung detaillierter beschrieben.
Was Polynucleotide angeht, so sind im Allgemeinen Differenzen so
limitiert, dass die Nucleotidsequenzen der Referenz und der Variante
insgesamt ziemlich ähnlich
und in vielen Regionen identisch sind. Wie unten angegeben ist,
können Änderungen
in der Nucleotidsequenz der Variante stumm sein. D. h., sie können die
Aminosäuren,
die durch das Polynucleotid kodiert werden, nicht verändern. Wenn
Veränderungen auf
stumme Änderungen
dieses Typs begrenzt sind, wird eine Variante ein Polypeptid mit
derselben Aminosäuresequenz
wie die Referenz kodieren. Wie auch unten angegeben ist, können Änderungen
in der Nucleotidsequenz der Variante die Aminosäuresequenz eines Polypeptids,
das durch das Referenz-Polynucleotid kodiert wird, ändern. Solche
Nucleotidänderungen
können
in Aminosäuresubstitutionen,
-additionen, -deletionen, -fusionen und in Verkürzungen des durch die Referenzsequenz
kodierten Polypeptids resultieren, wie es unten diskutiert werden
wird. Was Polypeptide im Allgemeinen angeht, sind Differenzen so
limitiert, dass die Sequenzen der Referenz und der Variante insgesamt
ziemlich ähnlich
und in vielen Regionen identisch sind. Ein variantes Polypeptid
und ein Referenz-Polypeptid können
sich in der Aminosäuresequenz
durch eine oder mehrere Substitutionen, Additionen, Deletionen,
Fusionen und Verkürzungen,
die in beliebiger Kombination vorliegen können, unterscheiden.
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Der
Ausdruck GERMPLASMA, wie er hierin verwendet wird, bedeutet einen
Satz von genetischen Einheiten, die in einem herkömmlichen
Züchtungsprogramm
unter Entwicklung neuer Pflanzenvarietäten verwendet werden können.
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Der
Ausdruck TRANSGEN MIT HOHEM PHOSPHORGEHALT, wie er hierin verwendet
wird, bedeutet eine Einheit, die als Resultat einer rekombinanten
genetischen Manipulation Samen mit einer vererbbaren Verringerung
beim prozentualen Gehalt an Phytinsäure und/oder Erhöhung des
prozentualen Gehalts an Nicht-Phytat-Phosphor produziert.
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PHYTINSÄURE, wie
der Ausdruck hierin verwendet wird, bedeutet Myoinositol-Tetraphosphorsäure, Myoinositol-Pentaphosphorsäure und
Myoinositol-Hexaphosphorsäure.
Als Salz mit Kationen ist Phytinsäure „Phytat".
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NICHT-PHYTAT-PHOSPHOR,
wie der Ausdruck hierin verwendet wird, bedeutet Gesamtphosphor
minus Phytatphosphor.
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NICHT-WIEDERKÄUER-TIER
bedeutet ein Tier mit einem einfachen Magen, aufgeteilt in die Ösophagus-,
Kardia-, Fundus- und Pylorus-Regionen. Ein Nicht-Wiederkäuer-Tier
umfasst außerdem
eine Tierspezies ohne einen funktionellen Pansen. Ein Pansen ist
ein Abschnitt des Verdauungssystems, in dem Futtermittel/Nahrung
eingeweicht wird und einem Verdau durch Mikroorganismen unterworfen
wird, bevor es/sie durch den Verdauungstrakt geht. Dieses Phänomen tritt
bei einem Nicht-Wiederkäuer-Tier
nicht auf. Der Ausdruck Nicht-Wiederkäuer-Tier
umfasst, ist aber nicht beschränkt
auf, Menschen, Schweine, Geflügel,
Katzen und Hunde.
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Wie
oben angegeben wurde, bezieht sich die vorliegende Erfindung unter
anderem auf neue Phytinsäure-Stoffwechselpolypeptide
und Polynucleotide, die dieselben kodieren, wie es detaillierter
unten beschrieben wird. Polypeptide, die für die Praxis dieser Erfindung
besonders nützlich
sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, D-Myoinositol-3-phosphat-Synthase,
Myoinositol-1-phosphat-Synthase (auch als INO1 bezeichnet), Phosphatidylinositol-4-phosphat-5-Kinase, Signal
-transduzierende Inositolpolyphosphat-5-Phosphatase (SIP-110), Myoinositol-monophosphatase-3,
Myoinositol-1,3,4-triphosphat-5/6-Kinase, 1D-Myoinositoltrisphosphat-3-Kinase B, Myoinositolmonophosphatase-1,
Inositolpolyphosphat-5-Phosphatase, 1D-Myoinositoltrisphosphat-3-Kinase,
Phosphatidylinositol-3-Kinase, Phosphatidylinositol-4-Kinase, Phosphatidylinositolsynthase,
Phosphatidylinositol-Transferprotein, Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat-5-Phosphatase,
Myoinositol-Transporter, Phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase
C und Maisphytase.
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Die
Nucleinsäuren
und Fragmente davon, die für
die oben genannten Enzyme kodieren, sind einsetzbar, um Enzym-defiziente
Transgene zu erzeugen. Zum Beispiel kann ein einzelnes Gen oder
Genfragment (oder Kombinationen von verschiedenen Genen) in eine
geeignete Expressionskassette eingebaut werden (unter Verwendung
z. B. des Globulin-1-Promotors für
eine Embryo-bevorzugte Expression oder des nativen Promotors, assoziiiert
mit dem für
das Enzym kodierenden Gen) und zusammen mit einem geeigneten selektierbaren
Marker (z. B. des Herbizid-PAT) so in Mais transformiert werden,
dass die Expression der endogenen Gene verstummt.
-
Relevante
Literatur, die die Anwendung von Homologie-abhängigen Gen-Silencing beschreibt,
umfasst: Jorgensen, Trends Biotechnol 8 (12): 340–344 (1990),
Flavell, Proc. Nat'l.
-
Acad.
Sci. (USA) 91: 3490–3496
(1994); Finnegan et al., Bio/Technology 12: 883–888 (1994); Neuhuber et al.,
Mol. Gen. Genet. 244: 230–241
(1994). Alternativ kann ein anderer Ansatz zum Gen-Silencing der unter
Verwendung der Antisense-Technik sein (Rothstein et al. in Osf.
Surv. Plant Mol. Cell. Biol. 6: 221–246 (1989)).
-
Die
Erfindung bezieht sich insbesondere auf Polypeptide und Polynucleotide
von neuen Phytat-Biosyntheseenzymgenen. Die Erfindung bezieht sich
speziell auf Zea mays-Phytat-Biosyntheseenzyme,
die die Nucleotid- bzw. Aminosäuresequenzen,
die unten angegeben sind, haben.
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Polynucleotide
-
Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Polynucleotide
bereitgestellt, die für die
Phytat-Biosyntheseenzyme kodieren, die die unten angegebene abgeleitete
Aminosäuresequenz
haben.
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Unter
Verwendung der hierin bereitgestellten Information, z. B. die unten
angegebenen Polynucleotidsequenzen, kann ein Polynucleotid der vorliegenden
Erfindung, das für
Phytat-Biosyntheseenzympolypeptide kodiert,
unter Verwendung von Standard-Klonierungs- und Screening-Verfahren
erhalten werden. Um das Polynucleotid, das für das Protein kodiert, unter
Verwendung der unten angegebenen DNA-Sequenzen zu erhalten, können Oligonucleotidprimer
synthetisiert werden, die komplementär zu der bekannten Polynucleotidsequenz
sind. Diese Primer können
dann in einer PCR eingesetzt werden, um das Polynucleotid aus einer
Matrize zu amplifizieren, welche von mRNA oder genomischer DNA,
isoliert aus Pflanzenmaterial, stammt. Die resultierenden amplifizierten
Produkte können
dann in im Handel erhältliche
Klonierungsvektoren, z. B. die TA-Reihe von Vektoren von InVitrogen,
kloniert werden. Durch Sequenzieren der einzelnen so identifizierten Klone
mit Sequenzierungsprimern, die aus der ursprünglichen Sequenz entwickelt
wurden, ist es dann möglich,
die Sequenz in beide Richtungen auszudehnen, um die Vollgensequenz
zu bestimmen. Eine derartige Sequenzierung wird unter Verwendung
von denaturierter doppelsträngiger
DNA durchgeführt,
welche aus einem Plasmidklon hergestellt wurde. Geeignete Techniken
sind in Maniatis, T., Fritsch, E. F. und Sambrock, J. in MOLECULAR
CLONING, A Laboratory Manual (2. Aufl. 1989 Cold Spring Harbor Laboratory.
Siehe Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70)
beschrieben. Abs veranschaulichend für die Erfindung wurden die
unten angegebenen Polynucleotide aus einer cDNA-Bibliothek zusammengefügt, welche
z. B. aus keimenden Maissamen stammt.
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Myoinositol-1-phosphat-Synthase
der vorliegenden Erfindung ist strukturell mit anderen Proteinen
der Myoinositol-1-phosphat-Synthasefamilie verwandt, wie es durch
Vergleichen der vorliegenden Sequenz, die Myoinositol-1-phosphat-Synthase
kodiert, mit in der Literatur angegebenen Sequenzen gezeigt wird.
Eine bevorzugte DNA-Sequenz ist unten angegeben. Sie enthält ein offenes
Leseraster, das für
ein Protein von etwa 510 Aminosäureresten
mit einem abgeleiteten Molekulargewicht von etwa 59,7 kDa (berechnet
als die Anzahl der Aminosäurereste
X 117) kodiert. Das Protein weist größte Homologie zu Myoinositol-1-phosphat-Synthase auf.
Die vorliegende Myoinositol-1-phosphat-Synthase hat etwa 88% Identität und etwa
92% Similarität
mit der Aminosäuresequenz
von Myoinositol-1-phosphat-Synthase aus Mesembryantherium cristallium
und 78,7% Identität
auf dem Nucleinsäurelevel
(diese Prozentangaben basieren aus einem Vergleich lediglich der
kodierenden Sequenz voller Länge,
d. h. ATG bis Stoppkodon).
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Myoinositolmonophosphatase-3
ist strukturell mit anderen Proteinen der Myoinositolmonophosphatase-3-Familie
verwandt, die durch Vergleichen der vorliegenden Sequenz, die für Myoinositolmonophosphatase-3
kodiert, mit der in der Literatur angegebenen Sequenz gezeigt wird.
Eine DNA-Sequenz ist unten angegeben. Sie enthält ein offenes Leseraster,
das für
ein Protein mit etwa 267 Aminosäureresten
mit einem abgeleiteten Molekulargewicht von etwa 31,2 kDa (berechnet
als die Anzahl der Aminosäurereste
X 117) kodiert. Eine neue Myoinositolmonophosphatase-3, die durch
Homologie zwischen der unten angegebenen Aminosäuresequenz und bekannten Aminosäuresequenzen
von anderen Proteinen, z. B. Myoinositolmonophosphatase-3 aus Lycopersicum
esulentum, identifiziert wurde, hatte 76,1% Identität/81,1%
Similarität
auf dem Aminosäurelevel
und 67,9% Identität
auf dem Nucleinsäurelevel
(diese Prozentangaben basieren auf einem Vergleich nur der kodierenden
Sequenz voller Länge,
d. h. ATG bis Stoppkodon).
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Myoinositol-1,3,4-trisphosphat-5/6-Kinase
ist strukturell mit anderen Proteinen der Myoinositol-1,3,4-trisphosphat-5/6-Kinasefamilie
verwandt, die durch einen Vergleich der Sequenz, die für die vorliegende
Inositol-1,3,4-trisphosphat-5/6-Kinase kodiert, mit der in der Literatur
angegebenen Sequenz gezeigt wird. Unten ist eine DNA-Sequenz gezeigt.
Sie enthält
ein offenes Leseraster, das für
ein Protein mit etwa 353 Aminosäureresten
mit einem abgeleiteten Molekulargewicht von etwa 41,3 kDA kodiert
(berechnet als die Anzahl von Aminosäureresten X 117). Das Protein
weist größte Homologie
zu Myoinositol-1,3,4-trisphosphat-5/6-Kinase aus Homo sapiens auf.
Die unten angegebene Myoinositol-1,3,4-trisphosphat-5/6-Kinase hat etwa
34% Identität
und etwa 43,4% Similarität
mit der Aminosäuresequenz
von Myoinositol-1,3,4-trisphosphat-5/6-Kinase
aus Homo sapiens. (Die oben offenbarten Prozentangaben basieren
auf einem Vergleich lediglich der kodierenden Sequenz voller Länge, d.
h. ATG bis Stoppkodon).
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Eine
Phosphatidylinositol-3-Kinase-Sequenz ist unten angegeben. Sie enthält ein offenes
Leseraster, das für
ein Protein mit etwa 803 Aminosäureresten
mit einem abgeleiteten Molekulargewicht von etwa 94,1 kDa (berechnet
als die Anzahl an Aminosäureresten
X 117) kodiert. Das Protein weist größte Homologie zu Phosphatidylinositol-3-Kinase
aus Glycine max. auf. Homologie zwischen Aminosäuresequenzen, die in den folgenden
Sequenzen angegeben sind und bekannten Aminosäuresequenzen von anderen Proteinen,
z. B. Phosphatidylinositol-3-Kinase
aus Glycine max. ist 78% Identität/84%
Similarität
auf dem Aminosäurelevel
und 73% Identität
auf dem Nucleinsäurelevel
(diese Prozentangaben basieren auf einem Vergleich lediglich der
kodierenden Sequenz voller Länge,
d. h. ATG bis Stoppkodon), basierend auf dem unten definierten Gap-Programm.
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Polynucleotide
der vorliegenden Erfindung können
in Form von RNA, z. B. mRNA, oder in Form von DNA, einschließlich z.
B. cDNA und genomischer DNA, erhalten durch Klonierung oder produziert
durch chemische Synthesetechniken oder durch eine Kombination davon,
sein. Die DNA kann doppelsträngig
oder einzelsträngig
sein. Einzelsträngige
DNA kann der kodierende Strang sein, auch bekannt als der Sense-Strang, oder
kann der nicht-kodierende Strang, auch als der Antisense-Strang
bezeichnet, sein.
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Die
kodierende Sequenz, die das Polypeptid kodiert, kann identisch zu
der kodierenden Sequenz der unten gezeigten Polynucleotide sein.
Sie kann auch ein Polynucleotid mit einer unterschiedlichen Sequenz sein,
das als Resultat der Redundanz (Degeneriertheit) des genetischen
Codes die unten gezeigten Polypeptide kodiert. Wie unten noch ausgiebiger
diskutiert werden wird, sind diese alternativen kodierenden Sequenzen
eine wichtige Quelle für
Sequenzen zur Kodonoptimierung.
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Polynucleotide
der vorliegenden Erfindung, die für die unten aufgelisteten Polypeptide
kodieren, können
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf: die kodierende Sequenz für
das reife Polypeptid selbst; die kodierende Sequenz für das reife
Polypeptid und zusätzliche
kodierende Sequenzen, z. B. solche, die für eine Leader- oder sekretorische
Sequenz, z. B. eine Pre- oder Pro- oder Prepro-Proteinsequenz, kodieren;
die kodierende Sequenz des reifen Polypeptids mit oder ohne die
vorstehend genannten zusätzlichen
kodierenden Sequenzen zusammen mit zusätzlichen nicht-kodierenden
Sequenzen, einschließlich
z. B., aber nicht beschränkt
auf, nicht-kodierende 5'-
und 3'-Sequenzen,
z. B. die transkribierten, nicht-translatierten Sequenzen, die bei
der Transkription (einschließlich
Terminierungssignale zum Beispiel), Ribosomenbindung eine Rolle spielen,
mRNA-Stabilitätselemente
und zusätzliche
kodierende Sequenzen, die zusätzliche
Aminosäure
kodieren, z. B. solche, die zusätzliche
Funktionalitäten
bereitstellen.
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Die
DNA kann auch Promotorregionen umfassen, die die Funktion haben,
die Transkription der mRNA, welche Phytat-Biosyntheseenzyme der
Erfindung kodiert, zu steuern. Solche Promotoren können unabhängig nützlich sein,
um die Transkription von heterologen Genen in rekombinanten Expressionssystemen
zu steuern. Heterolog ist als eine Sequenz definiert, die nicht
natürlicherweise
mit der Promotorsequenz auftritt. Während die Nucleotidsequenz
für die
Promotorsequenz heterolog ist, kann sie für den Pflanzenwirt homolog
oder nativ oder heterolog oder fremd sein.
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Darüber hinaus
kann das Polypeptid an eine Markersequenz, z. B. ein Peptid, fusioniert
sein, welches eine Reinigung des fusionierten Polypeptids erleichtert.
In bestimmten Ausführungsformen
dieses Aspekts der Erfindung ist die Markersequenz ein Hexahistidinpeptid,
z. B. das tag, das in dem pQE-Vektor (Qiagen, Inc.) und der pET-Reihe
von Vektoren (Novagen), unter anderen, von denen viele im Handel
erhältlich
sind, bereitgestellt wird. Wie bei Gentz et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA)
86: 821–824
(1989) zum Beispiel beschrieben wird, sorgt Hexahistidin für eine zweckdienliche
Reinigung des Fusionsproteins. Das Ha-tag kann auch verwendet werden,
um Fusionsproteine zu erzeugen, und entspricht einem Epitop, das
vom Influen za-Hämagglutininprotein
abgeleitet ist, das zum Beispiel in Wilson et al., Cell 37: 767
(1984) beschrieben wurde.
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Nach
dem Vorstehenden umfasst der Ausdruck „Polynucleotid, das für ein Polypeptid
kodiert", wie er hierin
verwendet wird, Polynucleotide, welche eine Sequenz, die für ein Polypeptid
der vorliegenden Erfindung, insbesondere einer Pflanze und in ganz
besonderer Weise für
Zea mays-Phytat-Biosyntheseenzyme mit der unten angegebenen Aminosäuresequenz,
kodiert. Der Ausdruck umfasst Polynucleotide, umfassend eine einzelne
kontinuierliche Region oder diskontinuierliche Regionen, die für das Polypeptid
kodieren, (z. B. unterbrochen durch integrierte Phagen- oder Insertionssequenz
oder Editing) zusammen mit zusätzlichen
Regionen, die auch kodierende und/oder nicht-kodierende Sequenzen
enthalten können.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf Varianten der vorliegenden
Polynucleotide, die für
Fragmente, Analoga und Derivate der Polypeptide mit der unten angegebenen
abgeleiteten Aminosäuresequenz
kodieren. Eine Variante des Polynucleotids kann eine natürlich vorkommende
Variante, z. B. eine natürlich
vorkommende allelische Variante, sein oder kann eine Variante sein,
von der nicht bekannt ist, dass sie natürlich vorkommt. Solche nicht-natürlich vorkommenden
Varianten des Polynucleotids können
durch Mutagenesetechniken einschließlich solcher, die auf Polynucleotide,
Zellen oder Organismen angewendet werden, hergestellt werden.
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Unter
Varianten sind in dieser Hinsicht Varianten, die sich von den vorstehend
genannten Polynucleotiden durch Nucleotidsubstitutionen, -deletionen
oder -additionen unterscheiden. Die Substitutionen können ein
Nucleotid oder mehrere Nucleotide involvieren. Die Varianten können in
kodierenden oder nicht-kodierenden Regionen oder beiden verändert sein.
Veränderungen
in den kodierenden Regionen können
konservative oder nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen, -deletionen
oder -additionen produzieren.
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Unter
den besonders bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung sind in dieser Hinsicht Polynucleotide, die für Polypeptide
mit den unten angegebenen Aminosäuresequenzen
kodieren, Varianten, Analoga, Derivate und Fragmente davon.
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Bevorzugter
in dieser Hinsicht sind Polynucleotide, die für Phytat-Biosyntheseenzym-Varianten, -analoga,
-derivate und Fragmente und Varianten, Analoga und Derivate der
Fragmente kodieren, die die unten angebenen Aminosäuresequenzen
haben, in denen mehrere, wenige, 1 bis 10, 1 bis 5, 1 bis 3, 2,
1 oder keine Aminosäurereste
substituiert, deletiert oder addiert sind, und zwar in beliebiger
Kombination. Besonders bevorzugt unter diesen sind stumme Substitutionen,
Additionen und Deletionen, die die Eigenschaften und Aktivitäten der
Phytat-Biosyntheseenzyme
nicht verändern.
Diesbezüglich
besonders bevorzugt sind konservative Substitutionen. Am stärksten bevorzugte
sind Polynucleotide, die für
Polypeptide mit der unten angegebenen Aminosäuresequenz kodieren, und zwar
ohne Substitutionen.
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Weiter
bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung sind Polynucleotide, die zu wenigstens 90% identisch
zu einem Polynucleotid sind, das für Myoinositol-1-phosphat-Synthase- polypeptid mit der
unten angegebenen Aminosäuresequenz
kodiert, und Polynucleotide, die zu solchen Polynucleotiden komplementär sind.
Unter diesen besonders bevorzugten Polynucleotiden sind solche mit
wenigstens 95%, 98% oder wenigstens 99% besonders bevorzugt.
-
Darüber hinaus
sind besonders bevorzugte Ausführungsformen
diesbezüglich
Polynucleotide, welche für
Polypeptide kodieren, die im Wesentlichen dieselbe biologische Funktion
oder Aktivität
wie das reife Polypeptid, das durch die unten angegebenen Polynucleotide
kodiert wird, beibehalten oder sogar eine Verringerung bei der biologischen
Funktion oder Aktivität
aufweisen.
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf Polynucleotide,
die an die oben beschriebenen Sequenzen hybridisieren. Diesbezüglich bezieht
sich die vorliegende Erfindung speziell auf Polynucleotide, die unter
stringenten Bedingungen an die hier oben beschriebenen Polynucleotide
hybridisieren. Der Ausdruck „stringente
Bedingungen", wie
er hierin verwendet wird, bedeutet, dass eine Hybridisierung nur
auftreten wird, wenn es mindestens 95% und vorzugsweise mindestens
97% Identität
zwischen den Sequenzen gibt.
-
Die
Ausdrücke „stringente
Bedingungen" oder „stringente
Hybridisierungsbedingungen" umfassen eine
Bezugnahme auf Bedingungen, unter denen eine Sonde zu einem detektierbar
größeren Grad
als andere Sequenzen (z. B. wenigstens 2fach über dem Hintergrund) an ihre
Targetsequenz hybridisieren wird. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und
werden unter verschiedenen Umständen
unterschiedlich sein. Indem die Stringenz der Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen
kontrolliert wird, können
Targetsequenzen identifiziert werden, die zu 100% komplementär zu der
Sonde sind (homologous probing). Alternativ können Stringenzbedingungen so
eingestellt werden, dass sie eine gewisse Fehlpaarung in den Sequenzen
zulassen, so dass niedrigere Similaritätsgrade detektiert werden (heterologous
probing). Im Allgemeinen hat eine Sonde eine Länge von weniger als etwa 1000
Nucleotiden, vorzugsweise weniger als 500 Nucleotiden.
-
Typischerweise
werden stringente Bedingungen solche sein, in denen die Salzkonzentration
kleiner als etwa 1,5 M Na-Ionen, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0
M Na-Ionenkonzentration (oder Konzentration anderer Salze) bei pH
7,0 bis 8,3 ist und die Temperatur wenigstens etwa 30°C für kurze
Sonden (z. B. 10 bis 50 Nucleotide) und wenigstens etwa 60°C für lange
Sonden (z. B. größer als
50 Nucleotide) ist. Stringente Bedingungen können auch mit Zusatz von Destabilisierungsmitteln,
z. B. Formamid, erreicht werden. Beispielhafte Bedingungen niedriger
Stringenz umfassen Hybridisierung unter Verwendung einer Pufferlösung mit
30 bis 35% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei
37°C und
einen Waschschritt in 1 × bis
2 × SSC (20 × SSC =
3,0 M NaCl/0,3 M Trinatriumcitrat) bei 50 bis 55°C. Beispielhafte Bedingungen
moderater Stringenz umfassen Hybridisierung in 40 bis 45% Formamid,
1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C
und einen Waschschritt in 0,5 × bis
1 × SSC
bei 55 bis 60°C.
Beispiele für
Bedingungen hoher Stringenz umfassen Hybridisierung in 50% Formamid,
1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C
und einen Waschschritt in 0,1 × SSC
bei 60 bis 65°C.
-
Spezifität ist typischerweise
die Funktion von Nach-Hybridisierungs-Waschschritten, wobei die
kritischen Faktoren die Ionenstärke
und die Temperatur der Endwaschlösung
sind. Für
DNA-DNA-Hybride kann die Tm aus der Gleichung
von Meinkoth und Wahl genähert
werden:
Anal. Biochem., 138: 267–284 (1984): Tm =
81,5°C +
16,6 (log M) + 0,41 (%GC) – 0,61
(%Form) – 500/L,
worin M die Molarität
von einwertigen Kationen ist, %GC der prozentuale Anteil von Guanosin-
und Cytosin-Nucleotiden in der DNA ist, %Form der Prozentwert an
Formamid in der Hybridisierungslösung
ist und L die Länge des
Hybrids in Basenpaaren ist. Tm ist die Temperatur
(bei definierter Ionenstärke
und definiertem pH), bei der 50% einer komplementären Targetsequenz
an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. Tm wird
um etwa 1°C
für jedes
1% Fehlpaarung reduziert; so können
Tm Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen
so eingestellt werden, dass eine Hybridisierung an Sequenzen der
gewünschten
Identität
erfolgt. Wenn z. B. Sequenzen mit ≥ 90%
Identität
gesucht werden, kann die Tm 10°C gesenkt
werden. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass
sie etwa 5°C
unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm)
für die
spezifische Sequenz und ihr Komplement bei einer definierten Ionenstärke und
bei definiertem pH sind. Allerdings können stark stringente Bedingungen
eine Hybridisierung und/oder einen Waschschritt bei 1, 2, 3 oder
4°C unter
dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) verwenden.
Moderat stringente Bedingungen können
eine Hybridisierung und/oder einen Waschschritt 6, 7, 8, 9 oder
10°C unter
dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) nutzen;
Bedingungen niedriger Stringenz können eine Hybridisierung und/oder
einen Waschschritt 11, 12, 13, 14, 15 oder 20°C unter dem thermischen Schmelzpunkt
(Tm) verwenden. Unter Verwendung der Gleichung,
Hybridisierungs- und Waschzusammensetzungen und der gewünschten
Tm wird der Fachmann verstehen, dass Variationen
bei der Stringenz der Hybridisierung und/oder Waschlösungen inhärent beschrieben
sind. Wenn der gewünschte
Grad der Fehlpaarung in einer Tm von kleiner
als 45°C
(wässrige
Lösung)
oder 32°C
(Formamidlösung)
resultiert, ist es bevorzugt, die SSC-Konzentration zu erhöhen, so
dass eine höhere
Temperatur verwendet werden kann. Eine ausgiebige Anleitung für die Hybridisierung
von Nucleinsäuren
wird in Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization
with Nucleic Acid Probes, Teil 1, Kapitel 2 "Overview of principles of hybridization
and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York (1993); und Current
Protocols in Molecular Biology, Kapitel 2, Ausubel, et al., Herausg.,
Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995) gefunden.
-
Wie
außerdem
hierin bezüglich
Polynucleotidassays der Erfindung diskutiert wurde, können z.
B. Polynucleotide der Erfindung, wie sie oben diskutiert wurden,
als Hybridisierungssonde für
RNA, cDNA und genomische DNA verwendet werden, um Volllängen cDNAs
und genomische Klone, die Phytat-Biosyntheseenzyme kodieren, zu
isolieren und um cDNA und genomische Klone von anderen Genen, die
hohe Sequenzsimilarität
zu den Genen haben, zu isolieren. Solche Sonden werden im Allgemeinen
wenigstens 15 Basen umfassen. Vorzugsweise werden solche Sonden
wenigstens 30 Basen haben und können
wenigstens 50 Basen haben. Besonders bevorzugte Sonden werden wenigstens
30 Basen haben und werden 50 Basen oder weniger haben.
-
Die
Polynucleotide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung können als
Forschungsreagenzien und Materialien zur Entdeckung von transgenen
Maispflanzen mit hohem Phosphorgehalt verwendet werden. Die Polynucleotide
der Erfindung sind Oligonucleotide, die sich von den unten angegebenen
Sequenzen ableiten, die als PCR-Primer in dem hierin beschriebenen
Verfahren zur Bestimmung, ob die hierin identifizierten Gene ganz
oder teilweise in Phytinsäure-akkumulierendem
Gewebe transkribiert werden oder nicht, verwendet werden.
-
Die
Polynucleotide können
für ein
Polypeptid, das das reife Protein plus zusätzliche Amino- oder Carboxyl-terminale
Aminosäuren
oder Aminosäuren
im Inneren des reifen Polypeptids (z. B. wenn die reife Form mehr
als eine Polypeptidkette hat) ist, kodieren. Solche Sequenzen können unter
anderem eine Rolle beim Prozessieren eines Proteins von einem Vorläufer bis
zu einer reifen Form spielen, können
den Proteintransport ermöglichen,
können
die Proteinhalbwertszeit verlängern
oder verkürzen
oder können
eine Manipulation eines Proteins für einen Assay oder für eine Produktion
erleichtern. Die zusätzlichen
Aminosäuren
können
durch celluläre
Enzyme aus dem reifen Protein prozessiert werden, wie es im Allgemeinen
in vivo der Fall ist.
-
Ein
Vorläuferprotein,
das die reife Form des Polypeptids an eine Prosequenz oder mehrere
Prosequenzen fusioniert hat, kann eine inaktive Form des Polypeptids
sein. Wenn Prosequenzen entfernt werden, werden solche inaktiven
Vorläufer
im Allgemeinen aktiviert. Einige der Prosequenzen oder alle Prosequenzen können vor
Aktivierung entfernt werden. Im Allgemeinen werden solche Vorläufer Proproteine
genannt.
-
Zusammengefasst,
ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann für ein reifes
Protein, ein reifes Protein plus eine Leadersequenz (was als Preprotein
bezeichnet werden kann), einen Vorläufer eines reifen Proteins
mit einer Prosequenz oder mehreren Prosequenzen, die nicht die Leadersequenzen
eines Preproteins sind, oder ein Preprotein, welches ein Vorläufer für ein Proprotein
ist, das eine Leadersequenz und eine oder mehrere Prosequenzen hat,
die im Allgemeinen während
Prozessierungsschritten entfernt werden, welche aktive und reife
Formen des Polypeptids produzieren, kodieren.
-
Polypeptide
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf Polypeptide, die
die unten angegebenen abgeleiteten Aminosäuresequenzen haben.
-
Die
Erfindung bezieht sich auch auf Fragmente, Analoga und Derivate
dieser Polypeptide. Die Ausdrücke „Fragment", „Derivat" und „Analogon" bedeuten, wenn sie
sich auf die Polypeptide beziehen, ein Polypeptid, das im Wesentlichen
dieselbe biologische Funktion oder Aktivität wie ein solches Polypeptid
beibehält. Fragmente,
Derivate und Analoga, die wenigstens 90% der Aktivität der nativen
Phytat-Biosyntheseenzyme beibehalten, sind bevorzugt. Fragmente,
Derivate und Analoga, die wenigstens 95% der Aktivität der nativen Polypeptide beibehalten,
sind bevorzugt. Somit umfasst ein Analogon ein Proprotein, das durch
Abspaltung des Proproteinteils unter Produktion eines aktiven reifen
Polypeptids aktiviert werden kann.
-
Das
Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein rekombinantes Polypeptid,
ein natürliches
Polypeptid oder ein synthetisches Polypeptid sein. In bestimmten
bevorzugten Ausführungsformen
ist es ein rekombinantes Polypeptid.
-
Das
Fragment, Derivat oder Analogon der Polypeptide unten kann sein:
(i) eines, in dem einer oder mehrere der Aminosäurereste mit einem konservierten
oder nicht-konservierten Aminosäurerest
(vorzugsweise einem konservierten Aminosäurerest) ersetzt ist/sind und
ein solcher ersetzter Aminosäurerest
kann durch den genetischen Code kodiert sein oder nicht, oder (ii)
eines, in dem einer oder mehrere der Aminosäurereste eine Substituentengruppe
umfasst/umfassen oder (iii) einer, in dem das reife Polypeptid mit
einer anderen Verbindung verbunden ist, z. B. einer Verbindung zur
Erhöhung
der Halbwertszeit des Polypeptids (z. B. Polyethylenglykol) oder
(iv) eines, in dem die zusätzlichen
Aminosäuren
mit dem reifen Polypeptid fusioniert sind, z. B. eine Leader- oder
sekretorische Sequenz oder eine Sequenz, die zur Reinigung des reifen
Polypeptids verwendet wird, oder eine Proproteinsequenz. Es wird
davon ausgegangen, dass solche Fragmente, Derivate und Analoga von
einem Fachmann nach den Lehren hierin erhalten werden können.
-
Nach
den besonders bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung in dieser Hinsicht sind Polypeptide, die die Aminosäuresequenz
von Phytat-Biosyntheseenzymen haben, die unten angegeben ist, Varianten, Analoga,
Derivate und Fragmente davon sowie Varianten, Analoga und Derivate
der Fragmente.
-
Unter
bevorzugten Varianten sind solche, die sich von einer Referenz durch
konservative Aminosäuresubstitutionen
unterscheiden. Derartige Substitutionen sind solche, die eine gegebene
Aminosäure
in einem Polypeptid durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen Charakteristika ersetzen.
Als konservative Substitutionen bzw. Austausche werden Austausche
untereinander unter den aliphatischen Aminosäuren Ala, Val, Leu und Ile
angesehen. Ein gegenseitiger Austausch der Hydroxylreste Ser und
Thr, der Austausch der sauren Reste Asp und Glu, ein Austausch zwischen
den Amidresten Asn und Gln, ein Austausch der basischen Reste Lys
und Arg und Austausch unter den aromatischen Resten Phe, Tyr.
-
In
dieser Hinsicht sind außerdem
Varianten, Analoga, Derivate und Fragmente sowie Varianten, Analoga
und Derivate der Fragmente besonders bevorzugt, die die unten angegebene
Aminosäuresequenz
haben, in denen mehrere, wenige, 1 bis 10, 1 bis 5, 1 bis 3, 2,
1 oder keine Aminosäurereste
ersetzt, deletiert oder addiert sind, und zwar in beliebiger Kombination.
Unter diesen sind stumme Substitutionen, Additionen und Deletionen
speziell bevorzugt, welche die Eigenschaften und Aktivitäten der
Phytat-Biosyntheseenzyme nicht verändern. Besonders bevorzugt
in dieser Hinsicht sind konservative Substitutionen. Am stärksten bevorzugt
sind Polypeptide mit den unten angegebenen Aminosäuresequenzen
ohne Substitutionen bzw. Austausche.
-
Die
Polypeptide und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung werden
vorzugsweise in einer isolierten Form bereitgestellt und sind vorzugsweise
bis zur Homogenität
gereinigt.
-
Die
Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen Myoinositol-1-phosphat-Synthasepolypeptid (insbesondere
das reife Polypeptid), wie auch Polypeptide, die eine größere als
95%ige Identität
(98% Similarität)
zu dem Polypeptid haben, wie es oben bei Needleman und Wunsch beschrieben
wird, und die bevorzugter wenigstens 98% haben und auch Teile von
solchen Polypeptiden umfassen, bei denen ein solcher Teil des Polypeptids
im Allgemeinen wenigstens 30 Aminosäuren und bevorzugter wenigstens
50 Aminosäuren
enthält.
-
Vektoren, Wirtszellen, Expression
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Vektoren, die die Polynucleotide
der vorliegenden Erfindung umfassen, auf Wirtszellen, die die Vektoren
der Erfindung einarbeiten, und auf die Produktion von Polypeptiden
der Erfindung durch rekombinante Techniken bzw. Rekombinationstechniken.
-
Wirtszellen
können
genetisch manipuliert werden, so dass sie die Polynucleotide einarbeiten
und Polypeptide der vorliegenden Erfindung exprimieren. Beispielsweise
können
die Polynucleotide unter Verwendung gut bekannter Techniken der
Infektion, Transduktion und Transfektion, Transvektion und Transformation in
Wirtszellen eingeführt
werden. Die Polynucleotide können
allein oder mit anderen Polynucleotiden eingeführt werden. Solche anderen
Polynucleotide können
unabhängig
eingeführt
werden, co-eingeführt
oder verbunden mit den Polynucleotiden der Erfindung eingeführt werden.
-
So
können
z. B. Polynucleotide der Erfindung mit einem anderen, getrennten
Polynucleotid, das für einen
selektierbaren Marker kodiert, unter Verwendung von Standardtechniken
für Co-Transfektion
und Selektion in zum Beispiel Pflanzenzellen in Wirtszellen transfiziert
werden. In diesem Fall werden die Polynucleotide im Allgemeinen
stabil in das Wirtszellgenom eingebaut werden.
-
Alternativ
können
die Polynucleotide an einen Vektor, der einen selektierbaren Marker
enthält,
zur Vermehrung in einer Wirtszelle gebunden werden. Das Vektorkonstrukt
kann auch durch die vorstehend erwähnten Techniken in Wirtszellen
eingeführt
werden. Im Allgemeinen wird ein Plasmidvektor als DNA in einem Präzipitat,
z. B. ein Calciumphosphatpräzipitat,
oder in einem Komplex mit einem geladenen Lipid eingeführt. Eine Elektroporation
kann auch verwendet werden, um Polynucleotide in einen Wirt einzuführen. Wenn
der Vektor ein Virus ist, kann es in vitro gepackt werden oder kann
in eine Verpackungszelle eingeführt
werden und das verpackte Virus kann in Zellen transduziert werden.
Es ist eine weite Vielzahl von Techniken, die zur Herstellung von
Polynucleotiden und zur Einführung
von Polynucleotiden in Zellen entsprechend diesem Aspekt der Erfindung
geeignet sind, gut bekannt und für
einen Fachmann Routine. Solche Techniken sind in Sambrook et al.,
oben zitiert, das für
viele Laborhandbücher,
die diese Techniken detailliert darstellen, beispielhaft ist, ausführlich als Übersicht
dargestellt.
-
Vektoren
-
Nach
diesem Aspekt der Erfindung kann der Vektor z. B. ein Plasmidvektor,
ein einzelsträngiger
oder doppelsträngiger
Phagenvektor, ein einzelsträngiger
oder doppelsträngiger
RNA- oder DNA-Virusvektor sein. Solche Vektoren können als
Polynucleotide, vorzugsweise DNA, durch gut bekannte Techniken zur
Einführung von
DNA und RNA in Zellen eingeführt
werden. Die Vektoren können
im Fall von Phagenvektoren und viralen Vektoren als verpacktes oder
eingekapseltes Virus durch gut bekannte Techniken zur Infektion
und Transduktion in Zellen eingeführt werden und vorzugsweise
wird dies durchgeführt.
Virale Vektoren können
Replikations-kompetent oder Replikations-defektiv sein. In dem letztgenannten
Fall wird im Allgemeinen eine virale Vermehrung nur in komplementierenden
Wirtszellen erfolgen.
-
In
bestimmter Hinsicht sind unter Vektoren die zur Expression von Polynucleotiden
und Polypeptiden der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Im Allgemeinen
umfassen solche Vektoren cis-wirkende Kontrollregionen, die zur
Expression in einem Wirt wirksam sind, funktionell mit dem zu exprimierenden
Polynucleotid verknüpft.
Geeignete trans-wirkende Faktoren werden entweder durch den Wirt
geliefert, durch einen komplementierenden Vektor geliefert oder
durch den Vektor selbst nach Einführung in den Wirt geliefert.
-
In
bestimmten diesbezüglich
bevorzugten Ausführungsformen
sorgen die Vektoren für
eine bevorzugte Expression. Eine solche bevorzugte Expression kann
eine induzierbare Expression oder eine Expression vornehmlich in
bestimmten Zelltypen oder beides, induzierbar und Zell-bevorzugt,
sein. Unter induzierbaren Vektoren sind Vektoren, die zur Expression
durch Umweltfaktoren, die leicht zu manipulieren sind, z. B. Temperatur
und Nährstoffadditive,
induziert werden können,
besonders bevorzugt. Eine Vielzahl von Vektoren, die nach diesem
Aspekt der Erfindung geeignet sind, einschließlich konstitutiver und induzierbarer
Expressionsvektoren zur Verwendung in prokaryotischen und eukaryotischen
Wirten, sind gut bekannt und werden routinemäßig vom Fachmann verwendet.
Solche Vektoren umfassen unter anderen chromosomale, episomale und von
Virus abgeleitete Vektoren, z. B. Vektoren, die von bakteriellen
Plasmiden, Bakteriophagen, Transposonen, aus Hefeepisomen, aus Insertionselementen,
aus chromosomalen Hefeelementen, aus Viren, z. B. Baculoviren, Papova-Viren,
z. B. SV40, Vaccinia-Viren,
Adenoviren, Geflügelpockenviren,
Pseudorabis-Virus und Retroviren, abgeleitet sind und Viren, die
von Kombinationen davon abgeleitet sind, z. B. solche die von Plasmid
und Bakteriophagen-genetischen Elementen, z. B. Cosmiden und Phagemiden,
abgeleitet sind, und binäre
Elemente, die für
Agrobacterium-vermittelte Transformationen eingesetzt werden. Alle
können
zur Expression gemäß diesem
Aspekt der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Im Allgemeinen
kann ein beliebiger Vektor, der zur Aufrechterhaltung, Vermehrung
oder Expression von Polynucleotiden geeignet ist, zur Expression
eines Polypeptids in einem Wirt zur Expression in dieser Hinsicht
eingesetzt werden.
-
Die
folgenden Vektoren, die im Handel verfügbar sind, werden als Beispiele
angeführt.
Unter Vektoren, die zur Verwendung in Bakterien bevorzugt sind,
sind pQE70, pQE60 und pQE-9, erhältlich
von Qiagen; pBS-Vektoren, Phagescript-Vektoren, Bluescript-Vektoren,
pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, verfügbar von Stratagene; und ptrc99a,
pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, erhältlich von Pharmacia. Unter
bevorzugten eukaryotischen Vektoren sind pWLNEO, pSV2CAT, pOG44,
pXT1 und pSG, erhältlich
von Stratagene; und pSVK3, pBPV, pMSG und pSVL, erhältlich von
Pharmacia. Verwendbare binäre
Pflanzenvektoren umfassen BIN19 und seine Derivate, erhältlich von
Clontech. Diese Vektoren werden lediglich zur Erläuterung
der vielen im Handel verfügbaren
und gut bekannten Vektoren, die dem Fachmann zur Verwendung gemäß diesem
Aspekt der Erfindung zur Verfügung
stehen, aufgelistet. Es wird einzusehen sein, dass jedes andere
Plasmid oder jeder andere Vektor, das/der z. B. zur Einführung, Aufrechterhaltung,
Vermehrung oder Expression eines Polynucleotids oder Polypeptids
der Erfindung in einem Wirt geeignet ist, nach diesem Aspekt der
Erfindung eingesetzt werden kann.
-
Im
Allgemeinen werden Expressionskonstrukte Stellen zur Transkriptionsinitiation
und -termination und in der transkribierten Region einer Ribosomenbindungsstelle
zur Translation enthalten. Der kodierende Teil der reifen Transkripte,
die durch die Konstrukte exprimiert werden, wird ein die Translation
initiierendes AUG am Beginn und ein Terminationskodon, das geeigneterweise
am Ende des Polypeptids, das translatiert werden soll, positioniert
ist, umfassen.
-
Außerdem können die
Konstrukte Kontrollregionen enthalten, die eine Expression regulieren
wie auch hervorrufen. In Übereinstimmung
mit vielen allgemein praktizierten Verfahren werden solche Regionen
im Allgemeinen wirken, indem sie die Transkription steuern, z. B.
unter anderen Transkriptionsfaktoren, Repressorbindungsstellen und
Terminierung. Zur Sekretion des translatierten Proteins in das Lumen
des endoplasmatischen Reticulums, in den periplasmatischen Raum
oder in die extracelluläre
Umgebung können
geeignete Sekretionssignale in das exprimierte Polypeptid eingebaut
werden. Diese Signale können
für das
Polypeptid endogen sein oder sie können heterologe Signale sein.
-
Im
Allgemeinen werden rekombinante Expressionsvektoren Replikationsursprünge, einen
Promotor, der von einem hoch exprimierten Gen abgeleitet ist, um
die Transkription einer stromabwärts
gelegenen Struktursequenz zu steuern, und einen selektierbaren Marker,
um eine Isolierung von Vektor-enthaltenden Zellen nach Exposition
gegenüber
dem Vektor zu erlauben, umfassen.
-
Die
Transkription der DNA, die für
die Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodiert, durch höhere Eukaryoten
kann erhöht
werden, indem eine Enhancersequenz in den Vektor insertiert wird.
Enhancer sind cis-wirkende DNA-Elemente, üblicherweise mit etwa 10 bis
300 bp, die zur Erhöhung
der transkriptionalen Aktivität
eines Promotors in einem gegebenen Wirtszelltyp wirken. Beispiele
für Enhancer
umfassen den SV40-Enhancer, der an der späten Seite des Replikationsursprungs
bei bp 100 bis 270 lokalisiert ist, den Enhancer des Cytomegalovirusearly-Promotors,
den Polyoma-Enhancer auf der späten
Seite des Replikationsursprungs und die Adenovirus-Enhancer. Weitere
Enhancer, die in der Erfindung einsetzbar sind, um die Transkription
des eingeführten
DNA-Segments zu erhöhen,
umfassen inter alia virale Enhancer wie die innerhalb des 35S-Promotors,
wie bei Odell et al., Plant Mol. Biol. 10: 263–72 (1988) beschrieben, und
einen Enhancer aus einem Opingen, wie von Fromm et al., Plant Cell
1: 977 (1989) beschrieben.
-
Unter
den bekannten eukaryotischen Promotoren, die in dieser Hinsicht
geeignet sind, sind der CMV-immediate-early-Promotor, der HSV-Thymidinkinase-Promotor,
die frühen
und späten
SV40-Promotoren, die Promotoren von retroviralen LTRs, z. B. die
des Rous-Sarkoma-Virus
(„RSV"), Metallothionein-Promotoren,
z. B. der Maus-Metallothionein-I-Promotor, und verschiedene Pflanzenpromotoren,
z. B. Globulin-1. Wenn verfügbar,
können
die nativen Promotoren der Phytat-Biosyntheseenzymgene verwendet
werden.
-
Wie
oben erwähnt
wurde, ist die DNA-Sequenz im Expressionsvektor funktionell mit
einer geeigneten Expressionskontrollsequenz bzw. mit geeigneten
Expressionskontrollsequenzen, einschließlich z. B. einem Promotor
zur Steuerung der mRNA-Transkription, verknüpft. Typische Beispiele für prokaryotische
Promotoren umfassen den Phage lambda PL-Promotor, die E. coli lac-,
trp- und tac-Promotoren, um nur wenige der gut bekannten Promotoren
zu nennen.
-
Was
Pflanzen angeht, so umfassen Beispiele für samenspezifische Promotoren
Promotoren von Samenspeicherproteinen, welche diese Proteine in
hoch regulierter Weise in Samen exprimieren (Thompsen et al., BioEssays;
10: 108; (1989), z. B. für
dicotyledone Pflanzen, Bohnen-β-phaseolin-Promotor,
einen Napin-Promotor, einen β-Conglycinin-Promotor
und einen Sojabohnenlecithin-Promotor. Z. B. für monocotyledone Pflanzen umfassen
Promotoren, die in der Durchführung
der Erfindung nützlich
sind, allerdings ohne Beschränkung
darauf, einen Mais-15-kD-Zein-Promotor, einen 22 kD-Zein-Promotor,
einen γ-Zein-Promotor,
einen Wachspromotor, einen Shrunken-1-Promotor, einen Globulin-1-Promotor
und den Shrunken-2-Promotor. Dem
Fachmann sind jedoch noch andere Promotoren, die bei der Durchführung der
Erfindung einsetzbar sind, bekannt.
-
Weitere
Beispiele für
geeignete Promotoren sind der Promotor für die kleine Untereinheit von
Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase, Promotoren aus tumorinduzierenden
Plasmiden von Agrobacterium tumefaciens, z. B. die Nopalinsynthase-
und Octopinsynthase-Promotoren und virale Promotoren, z. B. die
Blumenkohlmosaikvirus (CaMV)-19S- und -35S-Promotoren oder der Braunwurz-Mosaikvirus-35S-Promotor.
-
Es
wird einzusehen sein, dass zahlreiche nicht erwähnte Promotoren zur Verwendung
gemäß diesem Aspekt
der Erfindung geeignet sind und gut bekannt sind und von einem Fachmann
in einer Weise, die durch die Diskussion und die Beispiele hierin
veranschaulicht ist, verwendet werden können. Beispielsweise zieht diese
Erfindung die Verwendung der nativen Phytat-Biosyntheseenzym-Promotoren
in Betracht, um die Expression des Enzyms in einer rekombinanten
Umgebung zu steuern.
-
Vektoren
zur Vermehrung und Expression werden im Allgemeinen selektierbare
Marker umfassen. Solche Marker können
auch zur Amplifikation geeignet sein oder die Vektoren können zusätzliche
Marker zu diesem Zweck enthalten. In dieser Hinsicht enthalten die
Expressionsvektoren vorzugsweise ein oder mehrere selektierbare
Markergene, um ein phänotypisches
Merkmal zur Selektion von transformierten Wirtszellen bereitzustellen.
Bevorzugte Marker umfassen Dihydrofolatreduktase oder Neomycinresistenz
für eukaryotische Zellkultur
und Tetracyclin- oder Ampicillinresistenzgene zum Kultivieren von
E. coli und anderen Prokaryoten. Kanamycin- und Herbizid-Resistenzgene
(PAT und BAR) sind in Pflanzensystemen allgemein verwendbar.
-
Selektierbare
Markergene in physikalischer Proximität zu dem eingeführten DNA-Segment werden verwendet,
um eine Gewinnung von transformierten Zellen entweder durch positive
genetische Selektion oder Screening zu gewinnen. Die selektierbaren
Markergene erlauben auch die Aufrechterhaltung von Selektionsdruck
auf eine transgene Pflanzenpopulation, um sicherzustellen, dass
das eingeführte
DNA-Segment und seine kontrollierenden Promotoren und Enhancer durch
die transgene Pflanze beibehalten werden.
-
Viele
der üblicherweise
verwendeten positiven selektierbaren Markergene zur Pflanzentransformation wurden
aus Bakterien isoliert und kodieren für Enzyme, die ein selektives
chemisches Agens, welches ein Antibiotikum oder ein Herbizid sein
kann, metabolisch detoxifizieren. Andere positive Selektionsmarkergene
kodieren für
ein verändertes
Target, das gegenüber
dem Inhibitor unempfindlich ist.
-
Ein
bevorzugtes Selektionsmarkergen zur Pflanzentransformation ist das
BAR- oder PAT-Gen, das mit dem Selektionsmittel Bialaphos verwendet
wird. Spencer et al., T. Thero. Appl'd Genetics 79, 625–631, (1990). Ein anderes nützliches
Selektionsmarkergen ist das Neomycinphosphotransferase II (nptll)-Gen,
isoliert aus Tn5, das Resistenz gegen Kanamycin verleiht, wenn es
unter die Kontrolle von Pflanzenregulationssignalen gestellt wird.
Fraley et al., Proc. Nat'l
Acad. Sci. (USA) 80: 4803 (1983). Das Hygromycinphosphotransferasegen,
das Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin verleiht, ist ein
weiteres Beispiel für
einen verwendbaren selektierbaren Marker. Vanden Elzen et al., Plant
Mol. Biol. 5: 299 (1985). Zusätzliche
positive selektierbare Markergene bakterieller Herkunft, die Resistenz
gegenüber
Antibiotika verleihen, umfassen die Gene für Gentamycinacetyltransferase,
Streptomycinphosphotransferase, Aminoglycosid-3'-adenyltransferase und die Bleomycinresistenzdeterminante.
Hayford et al., Plant Physiol. 86: 1216 (1988); Jones et al., Mol.
Gen. Genet. 210: 86 (1987); Svab et al., Plant Mol. Biol. 14: 197
(1990); Hille et al., Plant Mol. Biol. 7: 171 (1986).
-
Andere
positive selektierbare Markergene zur Pflanzentransformation sind
nicht bakterieller Herkunft. Diese Gene umfassen Mausdihydrofolatreduktase,
Pflanzen-5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatsynthase und Pflanzenacetolactatsynthase
Eichholtz et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13: 67 (1987); Shah et
al., Science 233: 478 (1986); Charest et al., Plant Cell Rep. 8:
643 (1990).
-
Eine
weitere Klasse von verwendbaren Markergenen zur Pflanzentransformation
mit der DNA-Sequenz erfordert ein Screening von vermutlich transformierten
Pflanzenzellen anstelle einer direkten genetischen Selektion von
transformierten Zellen auf Resistenz gegenüber einer toxischen Substanz,
z. B. einem Antibiotikum. Diese Gene sind besonders nützlich,
um das räumliche
Expressionsmuster der DNA-Sequenz in spezifischen Geweben quantitativ
zu bestimmen oder sichtbar zu machen und werden häufig als
Reportergene bezeichnet, da sie zur Untersuchung der Genexpression
an ein Gen oder eine Genregulatorsequenz fusioniert werden können. Üblicherweise
verwendete Gene mm Screening von vermutlich transformierten Zellen
umfassen das Gen für β-Glucuronidase
(GUS), β-Galactosidase,
Luciferase und Chloramphenicolacetyltransferase. Jefferson, Plant
Mol. Biol. Rep. 5: 387 (1987); Teeri et al., EMBO J. 8: 343 (1989);
Koncz et al., Proc. Nat'l
Acad. Sci. (USA) 84: 131 (1987); De Block et al., EMBO J. 3: 1681
(1984). Ein anderer Ansatz für
die Identifizierung von relativ seltenen Transformationsevents war
die Verwendung eines Gens, das für
einen dominanten konstitutiven Regulator des Zea mays-Anthocyanin-Pigmentierungswegs
kodiert (Ludwig et al., Science 247: 449 (1990)).
-
Die
geeignete DNA-Sequenz kann durch eine beliebige einer Vielzahl gut
bekannter und Routinetechniken in den Vektor insertiert werden.
Im Allgemeinen wird eine DNA-Sequenz zur Expression an einen Expressionsvektor
gebunden, indem die DNA-Sequenz und der Expressionsvektor mit einer
Restriktionsendonuclease oder mehreren Restriktionsendonucleasen
gespalten werden und die Restriktionsfragmente dann unter Verwendung
einer T4-DNA-Ligase zusammengefügt
werden. Die Sequenz kann in Vorwärts-
oder Rückwärtsorientierung
insertiert werden. Verfahren zur Restriktion und Ligation, die zu
diesem Zweck eingesetzt werden können,
sind dem Fachmann gut bekannt und für diesen Routine. In dieser
Hinsicht geeignete Verfahren und Verfahren zur Konstruktion von
Expressionsvektoren unter Verwendung alternativer Techniken, die
dem Fachmann auch gut bekannt sind und für diesen Routine sind, sind
detailliert in Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY
MANUAL, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York (1989) ausgeführt.
-
Polynucleotide
der Erfindung, die für
die heterologe strukturelle Sequenz eines Polypeptids der Erfindung
kodieren, werden im Allgemeinen unter Verwendung von Standardtechniken
in den Vektor insertiert, so dass sie funktionell mit dem Promotor
zur Expression verknüpft
sind. Das Polynucleotid wird so positioniert werden, dass die Transkriptionsstartstelle
geeigneterweise 5' zu
einer Ribosomenbindungsstelle lokalisiert ist. Die Ribosomenbindungsstelle
wird 5' zu dem AUG
sein, das die Translation des zu exprimierenden Polypeptids initiiert.
Im Allgemeinen wird es keine anderen offenen Leseraster geben, die
mit einem Initiationskodon, üblicherweise
AUG, beginnen und zwischen der Ribosomenbindungsstelle und dem Initiationskodon
liegen. Im Allgemeinen wird es auch ein Translationsstoppkodon am
Ende des Polypeptids geben und es wird ein Polyadenylierungssignal
in Konstrukten zur Verwendung in eukaryotischen Zellen geben. Ein
Transkriptionsterminationssignal, das geeigneterweise am 3'-Ende der transkribierten
Region angeordnet ist, kann ebenfalls in dem Polynucleotidkonstrukt
enthalten sein.
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Der
Vektor, der die geeignete DNA-Sequenz, wie sie an anderer Stelle
hierin beschrieben wurde, sowie einen geeigneten Promotor und andere
geeignete Kontrollsequenzen enthält,
kann in einen geeigneten Wirt eingeführt werden, indem eine Vielzahl
von gut bekannten Techniken, die zur Expression eines gewünschten
Polypeptids darin geeignet sind, verwendet werden. Die vorliegende
Erfindung bezieht sich auch auf Wirtszellen, die die oben beschriebenen
diskutierten Konstrukte enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere Eukaryotenzelle,
z. B. eine Säuger- oder Pflanzenzelle,
oder eine niedere Eukaryotenzelle, z. B. eine Hefezelle, sein oder
die Wirtszelle kann eine Prokaryotenzelle, z. B. eine Bakterienzelle,
sein.
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Die
Einführung
des Konstrukts in die Wirtszelle kann durch Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte
Transfektion, Mikroinjektion, kationische Lipidvermittelte Transfektion,
Elektroporation, Transduktion, „Scrape Loading", ballistische Einführung, Infektion
oder andere Verfahren erfolgen. Solche Verfahren sind in vielen
Standard-Laborhandbüchern, z.
B. in Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) und
Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Ausg.,
Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)
beschrieben.
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Repräsentative
Beispiele für
geeignete Wirte umfassen Bakterienzellen, z. B. Streptococci-, Staphylococci-,
E. coli, Streptomyces- und Salmonella typhimurium-Zellen; Pilzzellen,
z. B. Hefezellen und Aspergillus-Zellen, Insektenzellen, z. B. Drosophila
S2- und Spodoptera Sf9-Zellen; Tierzellen, z. B. CHO-, COS- und Bowes-Melanomzellen;
und Pflanzenzellen. Es sind Wirte für eine große Vielfalt von Expressionskonstrukten gut
bekannt und der Fachmann wird nach der vorliegenden Offenbarung
leicht fähig
sein, einen Wirt zum Exprimieren eines Polypeptids gemäß diesem
Aspekt der vorliegenden Erfindung auszuwählen.
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Die
gentechnisch manipulierten Wirtszellen können in einem herkömmlichen
Nährmedium,
das in geeigneter Weise modifiziert werden kann, um inter alia Promotoren
zu aktivieren, Transformanten zu selektieren oder Gene zu amplifizieren,
kultiviert werden. Kulturbedingungen, z. B. Temperatur, pH und dergleichen,
die vorher mit der zur Expression ausgewählten Wirtszelle verwendet
wurden, werden im Allgemeinen zur Expression von Polypeptiden der
vorliegenden Erfindung geeignet sein, was dem Fachmann auf diesem
Gebiet klar sein wird.
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Konstrukte
in Wirtszellen können
in herkömmlicher
Weise eingesetzt werden, um das durch die rekombinante Sequenz kodierte
Genprodukt zu produzieren. Alternativ können die Polypeptide der Erfindung
synthetisch durch herkömmliche
Peptid-Synthesizer produziert werden.
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Reife
Proteine können
in Säugerzellen,
Hefe-, Bakterien- oder anderen Zellen unter der Kontrolle von geeigneten
Promotoren exprimiert werden. Zellfreie Translationssysteme können auch
verwendet werden, um solche Proteine zu produzieren, wobei RNAs,
die von den DNA-Konstrukten
der vorliegenden Erfindung abgeleitet sind, verwendet werden.
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Nach
Transformation eines geeigneten Wirtsstamms und Wachstum des Wirtsstamms
zu einer geeigneten Zelldichte wird, wenn der ausgewählte Promotor
induzierbar ist, dieser durch geeignete Mittel (z. B. Temperaturverschiebung
und Exposition gegenüber
einem chemischen Inducer) induziert und die Zellen werden für einen
weiteren Zeitraum kultiviert.
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Zellen
werden dann typischerweise durch Zentrifugation geerntet, durch
physikalische oder chemische Mittel gebrochen und der resultierende
Rohextrakt wird zur weiteren Reinigung zurückgehalten. Mikrobielle Zellen,
die in der Expression von Proteinen verwendet werden, können durch
ein beliebiges herkömmliches
Verfahren, einschließlich
Gefrier-Auftau-Cycling, Beschallung, mechanisches Brechen oder durch
Verwendung von zelllysierenden Mitteln gebrochen werden, wobei solche
Verfahren dem Fachmann gut bekannt sind.
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Wie
oben angegeben wurde, stellt die vorliegende Erfindung Vektoren
bereit, die fähig
sind, Phytat-Biosyntheseenzyme unter der Kontrolle von geeigneten
Promotoren zu exprimieren. Im Allgemeinen sollten die Vektoren in
Pflanzenzellen funktionell sein. Gelegentlich kann es vorteilhaft
sein, Vektoren zu haben, die in E. coli funktionell sind (z. B.
Produktion von Protein zur Entwicklung von Antikörpern, DNA-Sequenzanalyse,
Konstruktion von Inserts, Herstellung von Mengen an Nucleinsäuren und
Proteinen). Vektoren und Verfahren zum Klonieren und zur Expression
in E. coli werden oben diskutiert und z. B. in Sambrook et al. (supra)
und in Ausubel et al. (supra).
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Vektoren,
die in Pflanzen funktionell sind, sind vorzugsweise binäre Plasmide,
die von Agrobacterium-Plasmiden abgeleitet sind. Solche Vektoren
sind fähig,
Pflanzenzellen zu transformieren. Diese Vektoren enthalten linke
und rechte Grenzsequenzen, die zur Integration in das Wirts(Pflanzen)-Chromosom
erforderlich sind. Mindestens zwischen diesen Grenzsequenzen ist
das zu exprimierende Gen unter Kontrolle eines Promotors. In bevorzugten
Ausführungsformen
sind auch ein selektierbarer Marker und ein Reportergen enthalten.
Um einfach ausreichende Mengen an Vektor zu erhalten, ist ein bakterieller
Ursprung, der die Replikation in E. coli erlaubt, bevorzugt.
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In
bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
enthält
der Vektor ein Reportergen und die Strukturgene dieser Erfindung.
Das Reportergen sollte eine einfache Bestimmung von Transformation
und Expression erlauben. Das GUS (β-Glucuronidase)-Gen ist bevorzugt
(
U.S. Patent Nr. 5,268,463 ).
Andere Reportergene, z. B. β-Galactosidase,
Luciferase, GFP und dergleichen, sind im Kontext dieser Erfindung
ebenfalls geeignet. Verfahren und Substrate zum Analysieren der
Expression jedes dieser Gene sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Das Reportergen sollte unter der Kontrolle eines Promotors, der
in Pflanzen funktionell ist, sein. Solche Promotoren umfassen den
CaMV-35S-Promotor, den Mannopinsynthase-Promotor, den Ubiquitin-Promotor und
den DNA-J-Promotor.
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Der
Vektor enthält
vorzugsweise einen selektierbaren Marker zur Identifizierung von
Transformanten. Der selektierbare Marker kann unter geeigneten Bedingungen
einen Wachstumsvorteil verleihen. Im Allgemeinen sind selektierbare
Marker Wirkstoffresistenzgene, z. B. Neomycinphosphotransferase.
Andere Wirkstoffresistenzgene sind dem Fachmann bekannt und können leicht
eingesetzt werden. Der selektierbare Marker hat einen verknüpften konstitutiven
oder induzierbaren Promotor und eine Terminationssequenz, einschließlich einer
Polyadenylierungssignalsequenz.
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Außerdem sind
in den Vektor vorzugsweise ein bakterieller Replikationsursprung
und ein selektierbarer Marker für
Bakterien enthalten. Von den verschiedenen Ursprüngen (z. B. coI-EI, fd-Phage) ist
ein coIEI-Replikationsursprung bevorzugt. Am bevorzugtesten ist
der Ursprung aus den pUC-Plasmiden, der eine hohe Kopienzahl ermöglicht.
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Ein
allgemeiner Vektor, der zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung
geeignet ist, basiert auf pBI121 (
U.S.
Patent Nr. 5,432,081 ), einem Derivat von pBIN19. Andere
Vektoren wurden beschrieben (
U.S. Patent
Nr. 4,536,475 ) oder können
auf der Basis der hierin angegebenen Richtlinien konstruiert werden.
Das Plasmid pBI121 enthält
eine linke und rechte Grenzsequenz zur Integration in ein Pflanzenwirtschromosom. Diese
Grenzsequenzen flankieren zwei Gene. Eines ist ein Kanamycin-Resistenzgen
(Neomycinphosphotransferase), gesteuert durch einen Nopalinsynthase-Promotor
und unter Verwendung einer Nopalinsynthase-Polyadenylierungsstelle.
Das zweite ist das E. coli-GUS-Gen unter Kontrolle des CaMV-35S-Promotors
und polyadenyliert unter Verwendung einer Nopalinsynthase-Polyadenylierungsstelle.
Das Plasmid pBI121 enthält auch
einen bakteriellen Replikationsursprung und einen selektierbaren
Marker.
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In
bestimmten Ausführungsformen
kann der Vektor die hierin identifizierten Strukturgene unter der Kontrolle
eines Promotors enthalten. Der Promotor kann der native Promotor,
assoziiert mit den Strukturgenen selbst, oder ein starker konstitutiver
Promotor, z. B. der CaMV-35S-Promotor,
sein. Andere Elemente, die für eine
optimale Expression bevorzugt sind (z. B. Transkriptionsterminationsstelle,
Enhancer, Spleißstelle)
können
ebenfalls enthalten sein. Die Gene können alternativ als Fusionsproteine
mit z. B. einem Reportergen exprimiert werden.
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Pflanzentransformationsverfahren
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Wie
oben diskutiert wurde, stellt die vorliegende Erfindung auch Verfahren
zur Herstellung einer Pflanze, die ein fremdes Gen exprimiert, bereit,
umfassend die Schritte (a) Einführen
eines Vektors, wie er oben beschrieben wurde, in eine embryogene
Pflanzenzelle, wobei der Vektor ein fremdes Gen in einer exprimierbaren
Form enthält,
und (b) Produzieren einer Pflanze aus der embryogenen Pflanzenzelle,
wobei die Pflanze das fremde Gen exprimiert.
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Vektoren
können
durch ein beliebiges von mehreren Verfahren in Pflanzenzellen eingeführt werden. Beispielsweise
kann DNA als ein Plasmid durch Agrobacterium in Co-Kultivierung
oder durch Beschuss eingeführt
werden. Andere Transformationsverfahren umfassen Elektroporation,
CaPO4-vermittelte Transfektion und dergleichen.
Vorzugsweise wird DNA zunächst
in Agrobacterium transfiziert und anschließend in Pflanzenzellen eingeführt. Am
bevorzugtesten wird die Transfektion durch Co-Kultivierung erreicht.
Zum Teil hängt die
Wahl von Transformationsverfahren von der zu transformierenden Pflanze
ab.
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Phytat-Biosynthesepolypeptide
können
aus rekombinanten Zellkulturen durch gut bekannte Verfahren, einschließlich Ammoniumsulfat-
oder Ethanolpräzipitation,
Säureextraktion,
Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulosechromatographie,
hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie,
Hydroxyapatitchromatographie und Lectinchromatographie, gewonnen
und gereinigt werden. Am bevorzugtesten wird Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(„HPLC") zur Reinigung verwendet.
Gut bekannte Techniken zur Proteinrückfaltung können verwendet werden, um die
aktive Konformation zu regenerieren, wenn das Polypeptid während der
Isolierung oder Reinigung denaturiert wird.
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Polypeptide
der vorliegenden Erfindung umfassen natürlich gereinigte Produkte,
Produkte aus chemischen Syntheseverfahren und Produkte, die durch
rekombinante Techniken aus einem Prokaryoten- oder Eukaryoten-Wirt
produziert werden, einschließlich
z. B. bakterielle, Hefe-, höhere
Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellen.
In Abhängigkeit
von dem Wirt, der bei einem rekombinanten Produktionsverfahren verwendet wird,
können
die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glycosyliert sein oder
können
nicht-glycosyliert sein. Außerdem
können
Polypeptide der Erfindung auch einen modifizierten Anfangsmethioninrest
enthalten, in einigen Fällen
als Resultat von Wirt-vermittelten Prozessen.
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Es
ist einzusehen, dass das Gen, das das Polypeptid von Interesse exprimiert, „Kodonoptimiert" werden muss, um
eine effiziente Expression eines bestimmten Wirts zu beeinflussen.
So befasst sich diese Erfindung mit der Selektion der bestimmten
Kodon-optimierten Sequenz für
die bestimmte Wirtszelle von Interesse aus den unten angegebenen
Sequenzen.
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Andere
Gene von Interesse können
während
derselben Transformationsereignisse „gestapelt” werden. Zum Beispiel können andere
Gene von Interesse Resistenz gegenüber einer Krankheit, einem
Schädling oder
einem Herbizid verleihen oder die Futter- und Nahrungsmittelqualität der Pflanze
oder des Samens verbessern, z. B. erhöhte oder veränderte Ölexpression
oder veränderte
Protein- oder Kohlenhydratexpression.
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Regeneration von transformierten
Pflanzen
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Nach
einer Transformation ist eine Regeneration involviert, um aus transformierten
Zellen eine ganze Pflanze zu erhalten. Techniken zum Regenerieren
von Pflanzen aus Gewebekultur, z. B. transformierten Protoplasten
oder Callus-Zelllinie sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe zum
Beispiel Phillips, et al.; Plant Cell Tissue Organ Culture; Bd.
1: S. 123; (1981); Patterson et al.; Plant Sci.; Bd. 42; S. 125
(1985); Wright, et al.; Plant Cell Reports; Bd. 6: S. 83; (1987);
und Barwale, et al.; Planta; Bd. 167; S. 473 (1986); von denen jede hier
durch Bezugnahme als in ihrer Gesamtheit aufgenommen gilt. Die Auswahl
eines geeigneten Verfahrens liegt im Rahmen des Fachwissens eines
Fachmanns.
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Es
wird erwartet, dass die transformierten Pflanzen in traditionellen
Züchtungsprogrammen,
einschließlich
TOPCROSS-Bestäubungssystemen,
wie in
U.S. 5,706,603 und
U.S. 5,704,160 offenbart,
verwendet werden.
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Polynucleotid-Assays
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Diese
Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung der Phytat-Biosyntheseenzym-Polynucleotide in
einem Marker, um ein Züchtungsprogramm
zu unterstützen,
wie es z. B. in der PCT-Publikation
US89/00709 beschrieben
ist. Die DNA kann direkt zur Detektion verwendet werden oder kann
enzymatisch unter Verwendung der PCR vor einer Analyse amplifiziert
werden. PCR (Saiki et al., Nature, 324: 163–166 (1986)). RNA oder cDNA
kann in der gleichen Weise verwendet werden. Als Beispiel können PCR-Primer,
die zu der Nucleinsäure
komplementär
ist, die für
die Phytat-Biosyntheseenzyme kodieren, verwendet werden, um das
Vorliegen und die Expression des Phytat-Biosyntheseenzyms zu identifizieren
und zu analysieren. Unter Verwendung einer PCR kann eine Charakterisierung
des Gens, das in einem bestimmten Gewebe oder einer bestimmten Pflanzenvarietät vorliegt,
durch Analyse des Genotyps des Gewebes oder der Varietät durchgeführt werden.
Beispielsweise können
Deletionen und Insertionen durch eine Änderung in der Größe des amplifizierten
Produktes im Vergleich zum Genotyp einer Referenzsequenz detektiert
werden. Punktmutationen können identifiziert
werden, indem amplifizierte DNA an radioaktiv markierte Phytat-Biosyntheseenzym-RNA
oder alternativ radioaktiv markierte Phytat-Biosyntheseenzym-Antisense-DNA-Sequenzen
hybridisiert. Perfekt übereinstimmende
Sequenzen können
von fehlgepaarten Duplices durch RNase-A-Verdau oder durch Differenzen bei
den Schmelztemperaturen unterschieden werden.
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Sequenzdifferenzen
zwischen einem Referenzgen und Genen, die Mutationen haben, können auch durch
direkte DNA-Sequenzierung gezeigt werden. Außerdem können klonierte DNA-Segmente
als Sonden verwendet werden, um spezifische DNA-Segmente zu detektieren.
Die Sensitivität
solcher Verfahren kann durch geeignete Verwendung von PCR oder eines
anderen Amplifikationsverfahrens stark erhöht werden. Beispielsweise wird
ein Sequenzierungsprimer mit doppelsträngigem PCR-Produkt oder einem
einzelsträngigen Matrizenmolekül, das durch
modifizierte PCR erzeugt wurde, verwendet. Die Sequenzbestimmung
wird durch herkömmliche
Verfahren mit radioaktiv markiertem Nucleotid oder durch automatische
Sequenzierverfahren mit fluoreszenten Tags durchgeführt.
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Eine
genetische Typisierung von verschiedenen Pflanzenvarietäten auf
der Basis von DNA-Sequenzdifferenzen kann durch Detektion einer
Veränderung
in der elektrophoretischen Mobilität von DNA-Fragmenten in Gelen
mit oder ohne Denaturierungsmittel erreicht werden. Kleine Sequenzdeletionen
und Insertionen können
durch Hochauflösungs-Gelelektrophorese
sichtbar gemacht werden. DNA-Fragmente unterschiedlicher Sequenzen
können
an denaturierenden Formamid-Gradientengelen unterschieden werden,
in denen die Mobilitäten
verschiedener DNA-Fragmente im Gel bei verschiedenen Positionen
entsprechend ihrer spezifischen Schmelz- oder Partialschmelztemperaturen
verzögert
werden (siehe z. B. Myers et al., Science, 230: 1242 (1985)).
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Sequenzänderungen
an spezifischen Stellen können
auch durch Nukleaseschutzassays, z. B. RNase- und S1-Schutz, oder
das chemische Spaltungsverfahren gezeigt werden (z. B. Cotton et
al., Proc. Nat'l
Acad. Sci., (USA), 85: 4397–4401
(1985)).
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So
kann die Detektion einer spezifischen DNA-Sequenz durch Verfahren,
z. B. Hybridisierung, RNase-Schutz, chemische Spaltung, direkte
DNA-Sequenzierung oder die Verwendung von Restriktionsenzymen (z.
B. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen
(„RFLP") und Southern-Blotting
genomischer DNA) erreicht werden.
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Zusätzlich zu
der herkömmlicheren
Gelelektrophorese und der DNA-Sequenzierung können Mutationen auch durch
in situ-Analyse detektiert werden.
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Eine
Mutation kann zum Beispiel durch einen DNA-Sequenzierungs-Assay
festgestellt werden. Proben werden durch Verfahren prozessiert,
die auf dem Fachgebiet bekannt sind, um die RNA zu fangen. Ein erster
cDNA-Strang wird aus den RNA-Proben synthetisiert, indem ein Oligonucleotidprimer
zugegeben wird, der aus Sequenzen besteht, die an eine Region an
der mRNA hybridisieren. Es werden reverse Transkriptase und Desoxynucleotide
zugesetzt, um die Synthese des ersten cDNA-Strangs zu ermöglichen.
Primersequenzen werden auf der Basis der DNA-Sequenzen der Phytat-Biosyntheseenzyme
der Erfindung synthetisiert. Die Primersequenz besteht im Allgemeinen
aus wenigstens 15 fortlaufenden Basen und kann wenigstens 30 oder sogar
50 fortlaufende Basen enthalten.
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Zellen,
die Mutationen oder Polymorphismen im Gen der vorliegenden Erfindung
tragen, können
auf dem DNA-Level durch eine Vielzahl von Techniken detektiert werden.
Die DNA kann direkt zur Detektion eingesetzt werden oder kann enzymatisch
unter Verwendung von PCR (Saiki et al., Nature, 324: 163–166 (1986)) vor
einer Analyse amplifiziert werden. RT-PCR kann auch verwendet werden,
um Mutationen zu detektieren. Es ist besonders bevorzugt RT-PCR
in Verbindung mit automatischen Detektionssystemen, z. B. GeneScan, zu
verwenden. RNA oder cDNA kann zu demselben Zweck, PCR oder RT-PCR,
eingesetzt werden. Zum Beispiel können PCR-Primer, die komplementär zu der
Nucleinsäure
sind, die für
Phytat-Biosyntheseenzyme kodiert, verwendet werden, um Mutationen
zu identifizieren und zu analysieren. Beispiele für repräsentative
Primer sind unten in Tabelle 1 gezeigt. Zum Beispiel können Deletionen
und Insertionen durch eine Änderung
in der Größe des amplifizierten
Produktes im Vergleich zu dem normalen Genotyp detektiert werden.
Punktmutationen können
durch Hybridisierung von amplifizierter DNA an radioaktiv markierte
RNA- oder alternativ radioaktiv markierte Antisense-DNA-Sequenzen identifiziert
werden. Während
perfekt übereinstimmende
Sequenzen von fehlgepaarten Duplices durch RNase-A-Verdau oder durch
Differenzen in den Schmelztemperaturen unterschieden werden können, werden
Punktmutationen vorzugsweise durch Sequenzanalyse identifiziert.
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Primer,
die zur Detektion von Mutationen oder Polymorphismen in Myoinositol-1-phosphat-Synthase-Gen
verwendet wurden:
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Primer,
die zur Detektion von Mutationen oder Polymorphismen im Myoinositol-Monophosphatase-3-Gen
verwendet wurden:
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Primer,
die zur Detektion von Mutationen oder Polymorphismen im Myoinositol-1,3,4-triphosphat-5/6-Kinase-Gen
verwendet wurden:
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Primer,
die zur Detektion von Mutationen oder Polymorphismen im Phosphatidylinositol-3-Kinase-Gen verwendet
wurden:
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Die
obigen Primer können
zum Amplifizieren von Phytat-Biosyntheseenzym-cDNA oder genomischen Klonen,
isoliert aus einer Probe, die aus einer einzelnen Pflanze stammt,
verwendet werden. Die obigen Primer können 1, 2, 3 oder 4 Nucleotide
von dem 5'- und/oder
dem 3'-Ende entfernt haben.
Die Primer können
verwendet werden, um das Gen zu amplifizieren, das aus dem Individuum
isoliert wurde, so dass das Gen dann verschiedenen Techniken zur
Klärung
der DNA-Sequenz unterworfen werden kann. Auf diese Weise können Mutationen
in der DNA-Sequenz
identifiziert werden.
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Polypeptid-Assays
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf diagnostische Assays,
z. B. quantitative und diagnostische Assays zum Detektieren der
Level von Phytat-Biosyntheseenzymen in Zellen und Geweben, einschließlich Bestimmung
der normalen und abnormalen Level. So kann zum Beispiel ein erfindungsgemäßer diagnostischer
Assay zum Detektieren der Expression von Phytat-Biosyntheseenzymen
im Vergleich zu normalen Kontrollgewebeproben verwendet werden,
um inakzeptable Expressionslevel zu detektieren. Assaytechniken, die
verwendet werden können,
um die Level an Polypeptiden der vorliegenden Erfindung in einer
Probe, die aus einer Pflanzenquelle stammt, zu bestimmen, sind dem
Fachmann gut bekannt. Solche Assayverfahren umfassen Radioimmunoassays,
kompetitive Bindungsassays, Western Blot-Analyse und ELISA-Assays. Unter diesen
werden ELISAs häufig
bevorzugt. Ein ELISA-Assay umfasst zunächst Herstellen eines für das Polypeptid
spezifischen Antikörpers,
vorzugsweise eines monoklonalen Antikörpers. Zusätzlich wird im Allgemeinen
ein Reporterantikörper
hergestellt, der an den monoklonalen Antikörper bindet. Der Reporterantikörper ist an
ein detektierbares Reagens, z. B. ein radioaktives, fluoreszentes
oder enzymatisches Reagens, in diesem Beispiel Meerrettichperoxidaseenzym,
gebunden.
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Um
einen ELISA-Assay durchzuführen,
wird eine Probe aus einem Wirt entfernt und auf einem festen Träger, z.
B. eine Polystyrolschale, der die Proteine in der Probe bindet,
inkubiert. Freie Proteinbindungsstellen an der Schale werden dann
bedeckt, indem mit einem nicht-spezifischen
Protein, z. B. Rinderserumalbumin, inkubiert wird. Als Nächstes wird
der monoklonale Antikörper
in der Schale inkubiert, wobei die monoklonalen Antikörper während dieser
Zeit an Phytat-Biosyntheseenzyme, die an die Polystyrolschale gebunden
sind, binden. Ungebundener monoklonaler Antikörper wird mit Puffer ausgewaschen.
Der Reporterantikörper,
der an Meerrettichperoxidase gebunden ist, wird in die Schale gegeben,
was in der Bindung des Reporterantikörpers an einem beliebigen monoklonalen
Antikörper,
der an Phytat-Biosyntheseenzym gebunden ist, resultiert. Dann wird
ungebundener Reporterantikörper
ausgewaschen. Dann werden Reagenzien für die Peroxidaseaktivität, einschließlich eines
kolorimetrischen Substrats, in die Schale gegeben. Immobilisierte
Peroxidase, verknüpft mit
einem Phytat-Biosyntheseenzym
durch die primären
und sekundären
Antikörper,
produziert ein gefärbtes Reaktionsprodukt.
Die in einem gegebenen Zeitraum entwickelte Farbmenge gibt die Menge
an Phytat-Biosyntheseenzym an, die in der Probe vorliegt. Quantitative
Resultate werden typischerweise durch Bezug zu einer Standardkurve
erhalten.
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Es
kann ein Kompetitionsassay verwendet werden, in dem Antikörper, die
spezifisch für
Phytat-Biosyntheseenzyme sind, an einen festen Träger gebunden
sind, und markiertes Enzym, das von dem Wirt stammt, über den
festen Träger
geleitet wird, und die detektierte Markierungsmenge, die an den
festen Träger gebunden
ist, kann zu einer Menge an Phytat-Biosyntheseenzym in der Probe in Korrelation
gesetzt werden.
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Antikörper
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Die
Polypeptide, ihre Fragmente oder andere Derivate oder Analoga davon
oder Zellen, die sie exprimieren, können als Immunogene eingesetzt
werden, um Antikörper
dagegen zu produzieren. Diese Antikörper können zum Beispiel polyklonale
oder monoklonale Antikörper
sein. Die vorliegende Erfindung umfasst auch chimäre, Einzelketten-
und humanisierte Antikörper,
wie auch Fab-Fragmente oder das Produkt einer Fab-Expressionsbibliothek.
Es können
verschiedene Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, für die Produktion
von solchen Antikörpern
und Fragmenten eingesetzt werden.
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Antikörper, die
gegen die Polypeptide, die einer Sequenz der vorliegenden Erfindung
entsprechen, erzeugt wurden, können
durch direkte Injektion der Polypeptide in ein Tier oder durch Verabreichung
der Polypeptide an ein Tier, vorzugsweise ein nicht-menschliches
Tier, erhalten werden. Der so erhaltene Antikörper wird dann die Polypeptide
selbst binden. Auf diese Weise kann sogar eine Sequenz, die nur
für ein
Fragment des Polypeptids kodiert, verwendet werden, um Antikörper zu
erzeugen, die das ganze native Polypeptid binden. Solche Antikörper können dann
eingesetzt werden, um das Polypeptid aus Gewebe, das jenes Polypeptid exprimiert,
zu isolieren.
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Zur
Herstellung von monoklonalen Antikörpern kann jede Technik, welche
Antikörper
bereitstellt, die durch kontinuierliche Zelllinienkulturen produziert
werden, verwendet werden. Beispiele umfassen die Hybridom-Technik
(Kohler, G. und Milstein, C., Nature 256: 495–497 (1975)), die Trioma-Technik,
die humane B-Zell-Hybridom-Technik (Kozbor et al., Immunoloy Today
4: 72 (1983)) und die EBV-Hybridom-Technik, um humane monoklonale
Antikörper
zu produzieren (Cole et al., S. 77–96 in MONOCLONAL ANTIBODIES
AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985)).
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Hybridomzelllinien,
die den monoklonalen Antikörper
sekretieren, sind ein weiterer Aspekt dieser Erfindung.
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Techniken,
die für
die Produktion von Einzelketten-Antikörpern beschrieben wurden (
U.S. Patent Nr. 4,946,778 ),
können
angepasst werden, um Einzelketten-Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser
Erfindung zu produzieren. Auch transgene Mäuse oder andere Organismen,
z. B. andere Säuger,
können
verwendet werden, um humanisierte Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte
dieser Erfindung zu exprimieren.
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Die
oben beschriebenen Antikörper
können
verwendet werden, um Klone, die das Polypeptid exprimieren, zu isolieren
oder zu identifizieren oder um das Polypeptid der vorliegenden Erfindung
zu reinigen, und zwar durch Bindung des Antikörpers an einen festen Träger zur
Isolierung und/oder Reinigung durch Affinitätschromatographie.
-
Polypeptidderivate
umfassen antigen oder immunologisch äquivalente Derivate, die einen
besonderen Aspekt dieser Erfindung bilden.
-
Der
Ausdruck „antigen äquivalentes
Derivat", wie er
hierin verwendet wird, umfasst ein Polypeptid oder sein Äquivalent,
welches spezifisch durch bestimmte Antikörper erkannt wird, welche,
wenn sie gegen das Protein oder Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung
entwickelt wurden, die unmittelbare physikalische Wechselwirkung
zwischen dem Antikörper
und seinem verwandten Antigen stören.
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Das
Polypeptid, z. B. ein Antigen oder immunologisch äquivalentes
Derivat oder ein Fusionsprotein davon, wird als Antigen verwendet,
um eine Maus oder ein anderes Tier, z. B. Ratte, Meerschweinchen,
Ziege, Kaninchen, Schaf, Rind oder Huhn, zu immunisieren. Das Fusionsprotein
kann Stabilität
für das
Polypeptid bereitstellen. Das Antigen kann z. B. durch Konjugation
mit einem immunogenen Trägerprotein,
z. B. Rinderserumalbumin (BSA) oder Schlüssellochnapfschneckenhämocyanin
(KLH), assoziiert sein. Alternativ kann ein multiple antigenic peptide,
das mehrere Kopien des Proteins oder Polypeptids umfasst, oder ein
antigen oder immunologisch äquivalentes
Polypeptid davon ausreichend antigen sein, um die Immunogenität zu verbessern,
so dass die Verwendung eines Trägers
vermieden wird.
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Alternativ
könnte
die Phagen-Display-Technik genutzt werden, um Antikörpergene
mit Bindungsaktivitäten
zu dem Polypeptid auszuwählen,
und zwar entweder aus Repertoires von PCR-amplifizierten v-Genen von
Lymphozyten aus Menschen, die auf anti-Fbp durchgemustert wurden,
oder aus naiven Bibliotheken (McCafferty, J et al., (1990), Nature
348: 552–554; Marks,
J. et al., (1992) Biotechnology 10: 779–783). Die Affinität dieser
Antikörper
kann auch durch Ketten-Shuffling verbessert werden (Clackson, T.
et al., (1991) Nature 352: 624–628).
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Der
Antikörper
sollte erneut auf hohe Affinität
zu dem Polypeptid und/oder Fusionsprotein durchgemustert werden.
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Wie
oben erwähnt
wurde, kann ein Fragment des endgültigen Antikörpers hergestellt
werden.
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Der
Antikörper
kann entweder ein intakter Antikörper
mit M, von etwa 150.000 oder ein Derivat davon, z. B. ein Fab-Fragment
oder ein Fv-Fragment, sein, wie z. B. bei Sierra A. und Pluckthun,
A., Science 240: 1038–1040
(1988) beschrieben. Wenn zwei Antigen-bindende Domänen vorliegen,
kann jede Domäne
gegen ein anderes Epitop gerichtet sein, wobei dieser Antikörper als „bispezifischer" Antikörper bezeichnet
wird.
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Der
Antikörper,
wie er oben genannt wurde, kann durch herkömmliche Mittel hergestellt
werden, z. B. durch die etablierte monoklonale Antikörper-Technologie
(Kohler, G. und Milstein, C., Nature, 256: 495–497 (1975)) oder unter Verwendung
rekombinanter Mittel, z. B. Kombinationsbibliotheken, wie es z.
B. in Huse, W. D. et al., Science 246: 1275–1281 (1989) beschrieben ist.
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Vorzugsweise
wird der Antikörper
durch Expression eines DNA-Polymers, das für den Antikörper kodiert, in einem geeigneten
Expressionssystem, wie es z. B. oben für die Expression von Polypeptiden
der Erfindung beschrieben wurde, hergestellt. Die Wahl des Vektors
für das
Expressionssystem wird zum Teil durch den Wirt bestimmt, der eine
prokaryotische Zelle, z. B. E. coli (vorzugsweise Stamm B) oder
Streptomyces sp., oder eine eukaryotische Zelle, z. B. eine Maus-C127-,
Mausmyelom-, humane HeLa-, chinesische Hamstereierstock-, filamentöser oder
unicellulärer
Pilz- oder Insektenzelle sein kann. Der Wirt kann auch ein transgenes Tier
oder eine transgene Pflanze sein, wie es z. B. in Hiatt, A. et al.,
Nature 340: 76–78
(1989) beschrieben ist. Geeignete Vektoren umfassen Plasmide, Bakteriophagen,
Cosmide und rekombinante Viren, die zum Beispiel von Baculoviren
und Vaccinia abgeleitet sind.
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Das
Fab-Fragment kann auch aus seinem monoklonalen Elternantikörper durch
Behandlung mit einem Enzym, z. B. unter Verwendung von Papain, um
den Fab-Teil von dem Fc-Teil zu spalten, hergestellt werden.
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Phytat-Biosyntheseenzym-Bindungsmoleküle und Assays
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Diese
Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Identifizierung
von Molekülen,
z. B. Bindungsmolekülen
bzw. bindenden Molekülen,
die die Phytat-Biosyntheseenzyme binden. Gene, die für Proteine
kodieren, die die Enzyme binden, z. B. Bindungsproteine, können durch
zahlreiche Verfahren identifiziert werden, die dem Fachmann bekannt
sind, z. B. Liganden-Panning
und FACS-Sorting. Solche Verfahren sind in vielen Laborhandbüchern beschrieben,
z. B. in Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Kapitel
5 (1991).
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Zum
Beispiel kann eine Expressionsklonierung zu diesem Zweck verwendet
werden. Zu diesem Zweck wird polyadenylierte RNA aus einer Zelle,
die die Phytat-Biosyntheseenzyme exprimiert, hergestellt, eine cDNA-Bibliothek
wird aus dieser RNA erzeugt, die Bibliothek wird in Pools aufgeteilt
und die Pools werden individuell in Zellen transfiziert, die das
Enzym nicht exprimieren. Die transfizierten Zellen werden dann einem markierten
Enzym ausgesetzt. Das Enzym kann durch eine Vielzahl gut bekannter
Techniken, einschließlich Standardverfahren
der Radioiodierung oder des Einschlusses einer Erkennungsstelle
für eine
ortsspezifische Proteinkinase, markiert sein. Nach Exposition werden
die Zellen fixiert und die Enzymbindung wird bestimmt. Diese Verfahren
werden zweckmäßigerweise
auf Glasobjektträgern
durchgeführt.
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Es
werden Pools von cDNA identifiziert, die Phytat-Biosyntheseenzym-bindende
Zellen produziert hatten. Sub-Pools wurden aus diesen Positiven
hergestellt, in Wirtszellen transfiziert und wie oben beschrieben durchgemustert.
Unter Verwendung eines Verfahrens mit wiederholtem Sub-Pooling und
Re-Screening kann/können
ein einzelner Klon oder mehrere einzelne Klone identifiziert werden,
die für
das vermeintliche Bindungsmolekül
kodieren.
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Alternativ
kann ein markierter Ligand an einen Zellextrakt, z. B. eine Membran
oder einen Membranextrakt, hergestellt aus Zellen, die ein Molekül exprimieren,
das z. B. ein Bindungsmolekül
bindet, Photoaffinitäts-gebunden
werden. Vernetztes Material wird durch Polyacrylamidgelelektrophorese
("PAGE") aufgetrennt und
auf einem Röntgenfilm
belichtet. Der markierte Komplex, der die Ligandbindung enthält, kann
ausgeschnitten werden, in Peptidfragmente aufgetrennt werden und
einer Proteinmikrosequenzierung unterworfen werden.
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Die
aus einer Mikrosequenzierung erhaltene Aminosäuresequenz kann verwendet werden,
um einzigartige oder degenerierte Oligonucleotidsonden zu entwickeln,
um cDNA-Bibliotheken durchzumustern, um Gene zu identifizieren,
die für
das vermeintliche Bindungsmolekül
kodieren.
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Polypeptide
der Erfindung können
auch verwendet werden, um eine Phytat-Biosyntheseenzym-Bindungskapazität von Phytat-Biosyntheseenzym-Bindungsmolekülen, z.
B. Bindungsmolekülen,
in Zellen oder zellfreien Präparationen
zu bestimmen.
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Polypeptide
der Erfindung können
auch verwendet werden, um die Bindung an kleinen Molekülsubstraten
und Liganden in z. B. Zellen, zellfreien Präparationen, chemischen Bibliotheken
und natürlichen
Produktgemischen zu bestimmen. Diese Substrate und Liganden können natürliche Substrate
und Liganden sein oder können
strukturelle oder funktionelle Mimetika sein.
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Antikörper gegen
Phytat-Biosyntheseenzym stellen eine nützliche Klasse von Bindungsmolekülen dar, auf
die sich diese Erfindung bezieht.
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Antagonisten-Assays und Moleküle
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Die
Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Screening von
Verbindungen, um solche zu identifizieren, die die Wirkung von Phytat-Biosyntheseenzymen
auf Zellen, z. B. ihre Wechselwirkung mit Substratmolekülen, verstärken oder
blockieren. Ein Antagonist ist eine Verbindung, die die natürlichen
biologischen Funktionen der Enzyme vermindert.
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Potentielle
Antagonisten umfassen kleine organische Moleküle, Peptide, Polypeptide und
Antikörper, die
an ein Polypeptid der Erfindung binden und dadurch seine Aktivität inhibieren
oder auslöschen.
Potentielle Antagonisten können
auch kleine organische Moleküle,
ein Peptid, ein Polypeptid, z. B. ein nah verwandtes Protein oder
ein Antikörper
sein, das/der an dieselben Stellen eines Bindungsmoleküls bindet,
z. B. ein Bindungsmolekül,
ohne dass Phytat-Biosyntheseenzym-induzierte
Aktivitäten
induziert werden; dadurch wird die Wirkung des Enzyms verhindert,
indem das Enzym von einer Bindung ausgeschlossen wird.
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Potentielle
Antagonisten umfassen ein kleines Molekül, das an die Bindungsstelle
des Polypeptids bindet und diese besetzt, wodurch eine Bindung an
celluläre
Bindungsmoleküle,
z. B. Bindungsmoleküle,
verhindert wird, so dass eine normale biologische Aktivität verhindert
wird. Beispiele für
kleine Moleküle
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf, kleine organische Moleküle,
Peptide oder peptidartige Moleküle.
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Andere
potentielle Antagonisten umfassen Moleküle, die die Expression des
Gens, das für
Phytat-Biosyntheseenzyme kodiert, beeinträchtigt (z. B. Transaktivierungsinhibitoren).
Andere potentielle Antagonisten umfassen Antisense-Moleküle. Die
Antisense-Technik kann eingesetzt werden, um die Genexpression durch Antisense-DNA
oder -RNA oder durch Doppel- oder
Tripelhelixbindung zu kontrollieren. Antisense-Techniken werden
z. B. in Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES
AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton,
FL (1988) diskutiert. Eine Tripelhelixbildung wird zum Beispiel
in Lee et al., Nucleic Acids Research 6: 3073 (1979); Cooney et
al., Science 241: 456 (1988): und Dervan et al., Science 251: 1360
(1991) diskutiert. Die Verfahren basieren auf der Bindung eines
Polynucleotids an eine komplementäre DNA oder RNA. Beispielsweise
kann der 5'-kodierende
Teil eines Polynucleotids, das für
das reife Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, verwendet
werden, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid
mit einer Länge
von etwa 10 bis 40 Basenpaaren zu entwickeln. Es wird ein DNA-Oligonucleotid entwickelt,
das komplementär
zu einer Region des Gens ist, das in der Transkription involviert
ist, wodurch eine Transkription und die Produktion von Phytat-Biosyntheseenzymen
verhindert wird. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert in
vivo an die mRNA und blockiert eine Translation des mRNA-Moleküls zu Phytat-Biosyntheseenzymen.
Die oben beschriebenen Oligonucleotide können auch an Zellen abgegeben
werden, so dass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden
kann, um so die Produktion von Phytat-Biosyntheseenzymen zu inhibieren.
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Die
Antagonisten können
z. B. verwendet werden, um die Phytatlevel zu reduzieren und/oder
den verfügbaren
Phosphor in Pflanzenzellen zu erhöhen.
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Beispiele
-
Die
vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter
beschrieben. Die Beispiele werden lediglich angeführt, um
die Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen
zu erläutern. Diese
beispielhaften Ausführungen
geben keine Beschrän kungen
oder Umschreibungen des Rahmens der offenbarten Erfindung wieder,
obgleich sie bestimmte spezifische Aspekte der Erfindung veranschaulichen.
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Bestimmte
hierin verwendete Ausdrücke
sind in der voran stehenden Beschreibung erläutert.
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Alle
Beispiele wurden unter Verwendung von Standardtechniken, die dem
Fachmann gut bekannt sind und für
ihn Routine sind, ausgeführt,
außer
sie sind an anderer Stelle detailliert beschrieben. Routinetechniken der
Molekularbiologie der folgenden Beispiele können durchgeführt werden,
wie es in Standard-Laborhandbüchern
beschrieben ist, z. B. in Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY
MANUAL, 2. Ausg.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, N. Y. (1989).
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Alle
Teile und Mengen, die in den folgenden Beispielen angegeben sind,
sind Gewichtsteile oder Gewichtsmengen, wenn nichts anderes spezifiziert
ist.
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Wem
nicht anderes angegeben ist, wurde eine Größentrennung von Fragmenten
in den Beispielen unten unter Verwendung von Agarose-Standardtechniken
und Polyacrylamidgelelektrophorese ("PAGE")
gemäß Sambrook
et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Ausg.; Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) und zahlreichen
anderen Literaturstellen, z. B. Goeddel et al., Nucleic Acids Res.
8: 4057 (1980), durchgeführt.
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Wenn
nichts anderes beschrieben ist, wurden Ligationen unter Verwendung
von Standardpuffern, -inkubationstemperaturen und -zeiten annähernd äquimolaren
Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente und etwa 10 Einheiten T4-DNA-Ligase
("Ligase") pro 0,5 Mikrogramm
DNA durchgeführt.
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Beispiel 1: Isolierung von DNA, die für neue Proteine
kodiert, aus Zea mays
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Das
Polynucleotid, das die Myoinositol-1-phosphat-Synthase-DNA-Sequenz
hat, wurde aus der Sequenzierung einer Bibliothek von cDNA-Klonen
erhalten, die aus Maisembryos hergestellt worden waren, welche 15
Tage nach Bestäubung
isoliert worden waren. Das Polynucleotid mit der Myoinositol-monophosphatase-3-DNA-Sequenz
wurde aus der Sequenzierung einer Bibliothek von cDNA-Klonen erhalten,
die aus unreifen Maisähren
hergestellt worden waren. Das Polynucleotid mit der Myoinositol-1,3,4-triphosphat-5,6-Kinase-DNA-Sequenz wurde
aus der Sequenzierung einer Bibliothek von cDNA-Klonen erhalten,
die aus Maissamenschösslingen
hergestellt worden waren. Das Polynucleotid mit der Phosphatidylinositol-3-Kinase-DNA-Sequenz
wurde aus der Sequenzierung einer Bibliothek von cDNA-Klonen erhalten,
die aus keimenden Maissamen hergestellt worden waren. Die Gesamt-RNA
wurde unter Verwendung von Standardprotokollen aus diesem Gewebe
isoliert und durch Selektion mit Oligo-dT bezüglich mRNA angereichert, wiederum durch
Standardprotokolle. Diese mRNA wurde dann als Matrize verwendet,
um komplementäre
DNA (cDNA) unter Verwendung des Enzyms reverse Transkriptase nach
herkömmlichen
Verfahren zu synthetisieren. Der resultierende cDNA-Strang wurde
dann in doppelsträngige
cDNA-Stücke konvertiert
und in den Klonierungsvektor pSPORT ligiert, wobei herkömmliche
Ligations/Transformationsverfahren verwendet wurden. Dann wurde
einzelne Kolonien ausgewählt
und Plasmid-DNA aus jeder hergestellt. Diese Plasmid-DNA wurde dann denaturiert
und als Matrize in Didesoxynucleotid-Sequenzierungsreaktionen eingesetzt.
Durch Sequenzierung der einzelnen so identifizierten Klone mit Sequenzierungsprimern,
die aus der ursprünglichen
Sequenz entwickelt wurden, ist es dann möglich, die Sequenz in beiden
Richtungen zu verlängern,
um die volle Gensequenz zu bestimmen. Geeignete Techniken werden
von Maniatis, T., Fritsch, E. F. und Sambrook et al. MOLECULAR CLONING:
A LABORATORY MANUAL, 2. Ausg.; Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) beschrieben. (Siehe Screening By
Hybridization 1.90 and Sequencing Denatured Double-Stranded DNA
Templates 13.70). Die Sequenzen wurden mit solchen Sequenzen verglichen,
die in öffentlichen
Datenbanken (d. h. Genbank) verfügbar
sind, um Homologien/Genidentifizierung zu bestimmen. In einigen
Fällen wurden
die Sequenzierungsdaten von zwei oder mehr Klonen, die überlappende
DNA-Segmente enthalten, verwendet, um die fortlaufende DNA-Sequenz
unten zu konstruieren.
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Beispiel 2: Konstruktion von Expressionskassetten
für Homologie-abhängiges Gen-Silencing von Phytat-Biosyntheseenzym-Expression
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Um
Manipulationen dieses Merkmals in herkömmlichen Züchtungsprogrammen zu erleichtern,
wird die oben beschriebene Expressionskassette im homologen Gen-Silencing
(d. h. Knockout) der endogenen Phytat-Biosyntheseenzym-Polynucleotide
durch Verwendung des Embryo-bevorzugten Promotors Globulin-1 verwendet,
um die Expression der Gene zu steuern.
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Pflanzenexpressionskassetten
werden unter Verwendung des Embryo-bevorzugten Promotors Globulin-1
hergestellt, um die Expression der Phytat-Biosyntheseenzym-Polynucleotide
zu steuern. Globulin-1-Terminationssequenzen sind in dieser Kassette
ebenfalls enthalten. Die gesamte Expressionskassette wird in einem
pUC-basierten Plasmidvektor zur einfachen Manipulation E. coli kloniert.
Dieses Konstrukt wird durch Partikelbeschuss-Transformation von
Mais in Verbindung mit enem anderen Expressionkonstrukt, das einen selektierbaren
Marker umfasst (z. B. Pat, PHP8092 → Ubi::mo-PAT::ubi), verwendet.
Für eine
Agrobacterium-vermittelte Transformation wird ein Plasmid in einen
geeigneten binären
Vektor, der sowohl linke als auch rechte Grenzsequenzen enthält, gebracht,
um einen DNA-Transfer in das Targetgenom zu erleichtern.
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Dieses
Polynucleotid, das für
die erfindungsgemäßen Polypeptide
kodiert, resultiert, wenn es in Pflanzen nicht-funktionell gemacht
wird, in einer Verringerung der Phytinsäure und einer Erhöhung der
Nicht-Phytat-Phosphorlevel. Dies kann durch das transponible Element
Mu bewiesen werden. Es wird bestätigt,
dass Maislinien ein Mu-Element in die kodierende Region der Phytat-Biosyntheseenzym-Polynucleotide
insertiert haben. Es wurden ausgedehnte genetische Arbeiten an diesem
Phänotyp
durchgeführt,
wobei bewiesen wurde, dass er als Homozygot rezessives Merkmal auf
die Nachkommenschaft übertragen
wird.
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Beispiel 3: Transformation von Mais
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Die
erfindungsgemäßen Polynucleotide,
die in einem Vektor enthalten sind, werden durch Partikelbeschuss
in embryogenen Maiskallus transformiert. Transgene Maispflanzen
werden durch Beschuss von embryogen ansprechenden unreifen Embryos
mit Wolframpartikeln, assoziiert mit DNA-Plasmiden, produziert. Die
Plasmide bestehen aus einem selektierbaren und einem nicht-selektierbaren
Markergen.
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Partikelherstellung
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Fünfzehn mg
Wolframpartikel (General Electric), 0,5 bis 1,8 μ, vorzugsweise 1 bis 1,8 μ und am bevorzugtesten
1 μ, werden
zu 2 ml konzentrierter Salpetersäure
gegeben. Diese Suspension wurde bei 0°C für 20 Minuten beschallt (Branson
Sonifier Modell 450, 40% Output, konstanter Arbeitszyklus). Wolframpellets werden
durch Zentrifugation bei 10.000 UpM (Biofuge) für eine Minute pelletisiert
und der Überstand
wird entfernt. Zwei Milliliter steriles destilliertes Wasser werden
zu dem Pellet gegeben, und es wird eine kurze Beschallung verwendet,
um die Partikel wieder zu suspendieren. Die Suspension wird pelletisiert,
ein Milliliter absolutes Ethanol wird zu den Pellets gegeben und
es wird eine kurze Beschallung verwendet, um die Partikel wieder
zu suspendieren. Spülen,
Pelletisieren und Resuspendieren der Partikel wird zwei weitere
Male mit sterilem destilliertem Wasser durchgeführt und die Partikel werden
in zwei Milliliter sterilem destilliertem Wasser resuspendiert.
Die Partikel werden in 250 ml-Aliquots aufgeteilt und gefroren gelagert.
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Herstellung einer Partikel-Plasmid-DNA-Assoziation
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Der
Vorrat an Wolframpartikeln wird kurz in enem Wasserbad-Beschallungsgerät (Branson
Sonifier Modell 450, 20% Output, konstanter Arbeitszyklus) beschallt
und 50 ml werden in ein Mikrozentrifugenröhrchen transferiert. Äquimolare
Mengen an selektierbarer und nicht-selektierbarer Plasmid-DNA werden
zu einer End-DNA-Menge von 0,1 bis 10 mg in 10 ml Gesamtvolumen
zu den Partikeln gegeben und kurz beschallt. Vorzugsweise wird 1
mg Gesamt-DNA verwendet. Spezifischerweise werden 4,9 ml PHP 8092
(Ubiquitin::ubiquitin intron::mo-PAT::35S CaMV, 6.329 kbp)) plus
5,1 ml (globulin1::mi1ps::globulin1), worin Phytat-Biosyntheseenzym-Polynucleotid
mi1ps ersetzen kann, beides mit 0,1 mg/ml in TE-Puffer, dieser Partikelsuspension zugesetzt.
Fünfzig
Mikroliter steriles wässriges
2,5 M CaCl2 werden zugegeben und das Gemisch
wird kurz beschallt und mit einem Vortex-Gerät behandelt. Zwanzig Mikroliter
steriles wässriges
0,1 M Spermidin werden zugesetzt und das Gemisch wird kurz beschallt
und mit einem Vortex-Gerät
behandelt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur für 20 Minuten bei intermittierender
kurzer Beschallung inkubiert. Die Partikelsuspension wird zentrifugiert,
und der Überstand
wird entfernt. Zweihundertfünfzig
Mikroliter absolutes Ethanol werden zu dem Pellet gegeben, gefolgt
von einer kurzen Beschallung. Die Suspension wird pelletisiert,
der Überstand
wird entfernt, und es werden 60 ml absolutes Ethanol zugesetzt.
Die Suspension wird kurz beschallt, bevor die Partikel-DNA-Agglomeration
auf Makroträger
geladen wird.
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Vorbereitung von Gewebe
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Unreife
Embryos der Maisvarietät
High Type II sind das Target für
eine Partikelbeschuss-vermittelte Transformation. Dieser Genotyp
ist die F1 von zwei reinrassigen genetischen
Linien, Eltern A und B, die aus der Züchtung von zwei bekannten Maisinzuchtlinien,
A188 und B73, stammen. Beide Eltern werden bezüglich hoher Kompetenz der somatischen
Embryogenese nach Armstrong et al., Maize Genetics Coop. News 65:
92 (1991) ausgewählt.
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Ähren von
F1-Pflanzen werden einer Selbstung unterzogen
oder einer Geschwisterkreuzung unterzogen und Embryos werden aseptisch
aus sich entwickelnden Caryopsen herausgeschnitten, wenn das Scutellum
erstmals trüb
wird. Diese Stufe tritt in Abhängigkeit
von den Wachstumsbedingungen etwa 9–13 Tage nach der Bestäubung und
im Allgemeinen etwa 10 Tage nach der Bestäubung auf. Die Embryos sind
etwa 0,75 bis 1,5 Millimeter lang. Ähren werden für 30 Minuten
mit 20–50%
Clorox oberflächensterilisiert,
worauf sich drei Spülungen
mit sterilem destilliertem Wasser anschließen.
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Unreife
Embryos werden mit dem Scutellum nach oben gerichtet auf embryogenem
Induktionsmedium, umfassend N6-Basalsalze, Eriksson-Vitamine, 0,5
mg/l Thiamin·HCl,
30 g/l Saccharose, 2,88 g/l L-Prolin, 1 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 2 g/l
Gerite und 8,5 mg/l AgNO3, kultiviert. Chu
et al., Sci. Sin. 18: 659 (1975); Eriksson, Physiol. Plant 18: 976
(1965). Das Medium wird durch Autoklavieren bei 121°C 15 Minuten sterilisiert
und in 100 × 25
mm-Petrischalen verteilt. AgNO3 wird Filter-sterilisiert
und zu dem Medium nach Autoklavieren gegeben. Die Gewebe werden
in vollständiger
Dunkelheit bei 28°C
kultiviert. Nach etwa 3 bis 7 Tagen, am üblichsten nach etwa 4 Tagen,
quillt das Scutellum des Embryos auf das Doppelte seiner ursprünglichen
Größe, und
die Hervorschwellungen an der koleorhizalen Oberflächen des
Scutellum zeigten den Beginn von embryogenem Gewebe an. Bis zu 100%
der Embryos zeigten diese Reaktion, am üblichsten ist jedoch die embryogene
Antworthäufigkeit
etwa 80%.
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Wenn
die embryogene Antwort beobachtet wird, werden die Embryos auf ein
Medium transferiert, das aus Induktionsmedium besteht, das so modifiziert
ist, dass es 120 g/l Saccharose enthält. Die Embryos werden mit
dem koleorhizalen Pol, dem embryogen reagierenden Gewebe, nach oben
aus dem Kulturgewebe orientiert. Zehn Embryos pro Petrischale werden
in der Mitte einer Petrischale in einem Bereich mit etwa 2 cm Durchmesser
lokalisiert. Die Embryos werden für 3–16 Stunden, vorzugsweise für 4 Tage,
in vollständiger
Dunkelheit bei 28°C
auf diesem Medium gehalten, unmittelbar vor einem Beschuss mit Partikeln,
die mit Plasmid-DNAs assoziiert sind, welche die selektierbaren
und nicht-selektierbaren Markergene enthalten.
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Um
den Partikelbeschuss von Embryos durchzuführen, werden die Partikel-DNA-Agglomerate unter Verwendung
einer DuPont PDS-1000-Partikelbeschleunigungsvorrichtung beschleunigt.
Die Partikel-DNA-Agglomeration wird kurz beschallt und 10 ml werden
auf Makroträger
abgeschieden und das Ethanol wird verdampfen gelassen. Der Makroträger wird auf
einen Edelstahlstoppschirm unter Reißen eines Polymerdiaphragmas
(rupture disk) beschleunigt. Das Reißen erfolgt durch komprimiertes
Helium. Die Geschwindigkeit der Partikel-DNA-Beschleunigung wird
auf der Basis des Bruchdrucks der Reißscheibe bestimmt. Drücke der Reißscheibe
bzw. rupture disks von 200 bis 1800 psi werden bevorzugt, wobei
650 bis 1100 psi bevorzugt sind, und etwa 900 psi äußerst bevorzugt
sind. Mehrere Disks werden verwendet, um einen Bereich von Reißdrücken herzustellen.
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Das
Bord, das die Platte mit Embryos enthält, wird 5,1 cm unterhalb des
Bodens der Makroträgerplattform
platziert (Bord #3). Um einen Partikelbeschuss von kultivierten
unreifen Embryos durchzuführen,
werden eine Reißscheibe
und ein Makroträger
mit getrockneten Partikel-DNA-Agglomeraten in der Vorrichtung angeordnet.
Der He-Druck, der an die Vorrichtung abgegeben wird, wird auf 200
psi über
dem Bruchdruck der Reißscheibe
eingestellt. Eine Petrischale mit den Targetembryos wird in die
Vakuumkammer gestellt und in den projizierten Weg der beschleunigten
Partikel lokalisiert. In der Kammer wird ein Vakuum, vorzugsweise
von etwa 28 in Hg erzeugt. Nach Betrieb der Vorrichtung wird das
Vakuum entspannt und die Petrischale wird entfernt.
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Beschossene
Embryos bleiben während
des Beschusses und 1 bis 4 Tage danach auf dem osmotisch eingestellten
Medium. Die Embryos werden auf Selektionsmedium transferiert, bestehend
aus N6-Basalsalzen, Eriksson-Vitaminen, 0,5 mg/l Thiamin·HCl, 30
g/l Saccharose, 1 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 2 g/l Gerite, 0,85 mg/l
Ag NO3 und 3 mg/l Bialaphos (Herbiace Meiji), transferiert. Bialaphos
wird Filter-sterilisiert zugesetzt. Die Embryos werden in Intervallen
von 10 bis 14 Tagen auf frisches Selektionsmedium subkultiviert. Nach
etwa 7 Wochen proliferiert embryogenes Gewebe, vermutlich sowohl
mit selektierbaren als auch mit nicht-selektierbaren Markergenen
transformiert, aus etwa 7% der beschossenen Embryos. Vermeintlich
transgenes Gewebe wird gewonnen und das Gewebe, das von einzelnen
Embryonen stammt, wird bezüglich
eines Ereignisses betrachtet und wird unabhängig auf Selektionsmedium vermehrt.
Zwei Zyklen der klonalen Vermehrung werden nach visueller Selektion
bezüglich
der kleinsten fortlaufenden Fragmente von organisiertem embryogenem
Gewebe erreicht.
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Eine
Gewebeprobe aus jedem Ereignis wird prozessiert, um DNA zu gewinnen.
Die DNA wird mit Restriktionsendonuklease eingeschränkt und
mit Primersequenzen sondiert, die entwickelt wurden, um DNA-Sequenzen,
die mit Phytat-Biosyntheseenzymen und dem Nicht-Phytat-Biosyntheseenzym-Teil des Plasmids überlappen,
zu amplifizieren. Embryogens Gewebe mit amplifizierbarer Sequenz
wird zur Pflanzenregeneration gebracht.
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Zur
Regeneration von transgenen Pflanzen wird embryogenes Gewebe in
einem Medium, umfassend MS-Salze und Vitamine (Murashige & Skoog, Physiol.
Plant 15: 473 (1962)), 100 mg/l Myoinositol, 60 mg/l Saccharose,
3 g/l Gerite, 0,5 mg/l Zeatin, 1 mg/l Indol-3-essigsäure, 26,4
ng/l cis-trans-Abscissinsäure
und 3 mg/l Bialaphos, in 100 X 25 mm-Petrischalen subkultiviert
und im Dunkeln bei 28°C
inkubiert, bis die Entwicklung von gut geformten, reifen somatischen
Embryos zu sehen ist. Dies erfordert etwa 14 Tage. Gut geformte somatische
Embryos sind trüb
und cremefarben und bestehen aus einem identifizierbaren Scutellum
und Koleoptile. Die Embryos werden einzeln auf Keimmedium, umfassend
MS-Salze und Vitamine, 100 mg/l Myoinositol, 40 g/l Saccharose und
1,5 g/l Gerite, in 100 X 25 mm-Petrischalen subkultiviert und bei
einer Lichtperiode 16 Stunden Licht: 8 Stunden Dunkelheit und 40
Millieinstein m–2s–1 aus
Leuchtstoffröhren
inkubiert. Nach etwa 7 Tagen haben die somatischen Embryos gekeimt
und produzierten einen gut definierten Schößling und eine Wurzel. Die
einzelnen Pflanzen werden in Keimmedium in 125 X 25 mm-Glasröhrchen subkultiviert,
um eine weitere Pflanzenentwicklung zu erlauben. Die Pflanzen werden
unter einer Lichtperiode von 16 Stunden Licht: 8 Stunden Dunkelheit
und 40 Millieinstein m–2s–1 aus
Leuchtstoffröhren
gehalten. Nach etwa 7 Tagen sind die Pflanzen gut entwickelt und
werden in Gartenerde transplantiert, abgehärtet und in ein handelsübliches
Gewächshauserdegemisch
getopft und in einem Gewächshaus
zur sexuellen Reife wachsen gelassen. Als männliche Pflanze wird eine Eliteinzuchtlinie
verwendet, um regenerierte transgene Pflanzen zu bestäuben.
-
Beispiel 4: Identifizierung von transgenen
Maislinien mit hohem Phosphorgehalt
-
Die
resultieren Transformanten werden bezüglich erhöhter Level an anorganischem
Phosphor durchgemustert, wobei ein einfacher kolorimetrischer Assay
verwendet wird. Einzelne transgene Körner werden in den Vertiefungen
eines Megatiter-Züchtungstabletts
unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit 2000 psi zerkleinert.
Die zerkleinerten Körner
werden dann für
2 Stunden bei Raumtemperatur in 2 ml 1 N H2SO4 eingeweicht. Durch Zugabe von 4 ml Entwicklungslösung (1
Teil 10%iger Ascorbinsäure,
6 Teile 0,42%iges Ammoniummolybdat in 1 N H2SO4) zu jedem zerkleinerten Korn wird eine
Farbentwicklung initiiert. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur
werden Körner
entweder als positiv (blau) oder negativ (klar) bewertet. Positiv
bezieht sich in diesem Fall auf einen hohen Level an anorganischem
Phosphor. Dieses Protokoll ist eine modifizierte Version von dem,
das bei Chen et al., Anal. Chem. 28: 1756 (1956) beschrieben ist.
Solche Transformanten, die mit dem kolorimetrischen Assay als positiv
durchgemustert wurden, werden dann härteren Analysen unter Einschluss
von Southern-, Northern- und Western-Blotting und einer Quantifizierung
der Phytinsäurelevel
unterzogen.
-
Bestätigung von erhöhten Nicht-Phytat-Phosphorleveln
-
Die
vorliegenden transgenen Pflanzen haben vorzugsweise Nicht-Phytat-Phosphorlevel über den
natürlichen
Leveln von verfügbarem
Phosphor für
die Pflanzenspezies von Interesse. Für Mais ist es bevorzugt, Nicht-Phytat-Phosphorlevel
von 0,175%, bevorzugter etwa 0,2% und am bevorzugtesten etwa 0,255%
oder höher
zu haben. Diese Prozentangaben basieren auf %G/G bei 13% Feuchtigkeitsgehalt
für beide
Maissamen. Was Sojabohnen angeht, so ist es bevorzugt, Nicht-Phytat-Phosphorlevel
von etwa 0,47%, bevorzugter etwa 0,49% und am bevorzugtesten etwa
0,51%, zu haben. Dieser zuletzt genannte Prozentwert basiert auf
dem Gewicht von Nicht-Phytat-Phosphor/(Nicht-Phytat-P/Gramm
Mahlzeit mit 13% Feuchtigkeit).
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Jede
Pflanze, die als potentielle transgene Pflanze mit hohem Phosphorgehalt
identifiziert wurde, wird erneut getestet, um den ursprünglichen
erhöhten
Phosphorwert zu bestätigen.
Einige vermeintliche transgene Pflanzen können bezüglich des Merkmals erhöhter Phosphorgehalt
nicht bestätigt
werden. Solche, die bestätigt
werden, werden auf der Basis der Einheitlichkeit bezüglich des
Merkmals erhöhter
Phosphorgehalt ausgewählt.
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Bestätigung
von reduzierten Phytatleveln
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Um
zu bestimmen, dass transgene Pflanzen mit hohem Nicht-Phytat-Phosphor
auch durch reduzierte Phytatlevel charakterisiert sind, wird das
folgende Verfahren verwendet, um den Phytinsäurelevel in einer getesteten
Probe quantitativ zu bestimmen.
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Die
Probe wird vermahlen, in ein konisches Kunststoffzentrifugenröhrchen gegeben
und mit Salzsäure behandelt.
Sie wird mit Polytron homogenisiert und bei Raumtemperatur unter
Vortex-Behandlung extrahiert. Die extrahierte Probe wird in eine
Klinikzentrifuge bei 2500 UpM für
15 Minuten gegeben. 2,5 ml des Überstands
werden entfernt und zu 25 ml Wasser gegeben. Die Probe wird durch
enie SAX®-Säule gewaschen.
Die Säule
wird mit HCl gewaschen, eluiert und das Eluat zur Trockene eingedampft.
Die getrocknete Probe wird in Wasser resuspendiert und durch ein
0,45 Mikrometer-Spritzenspitzefilter in eine Phiole filtriert. 10
bis 20 Mikroliter-Proben werden hergestellt, um sie in eine HPLC-Säule zu injizieren.
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Das
eluierende Lösungsmittel
wird hergestellt, indem 515 ml Methanol, 485 ml zweifach destilliertes Wasser,
8 ml Tetrabutylammoniumhydroxid, 40% (TBAH), 200 Mikroliter 10 N,
(5 M) Schwefelsäure,
0,5 ml Ameisensäure
und 1–3
mg Phytinsäure
gemischt werden. Phytinsäure
wird hergestellt, indem 16 mg in Natriumphytat in 5 ml Wasser gegeben
werden. Diese Lösung
wird auf Dowex-Ionenaustauschharz (1 ml Dowex-50, saure Form, auf
Glaswolle in 5 ml Pipettenspitze) gegeben. Dieses wird mit 1–2 ml Wasser
gespült und
das Filtrat wird mit Wasser auf 10 ml gebracht. Die Konzentration
ist 1 mg/ml Phytinsäure.
2 ml werden für 1
Liter Lösungsmittel
verwendet. Der pH des Lösungsmittels
wird mit 10 N Schwefelsäure
auf 4,10 +/– 0,05 eingestellt.
Chromatographie wird durchgeführt,
indem die Probe durch eine Hamilton PRP-1-reverse Phase-HPLC-Säule, erwärmt auf
40°C, mit
einer Geschwindigkeit von 1 ml pro Minute gepumpt wird. Die Detektion von
Inositolphosphat wird mit einem Brechungsindex-Detektor (Waters), der wenigstens zwei
(2) Minuten vor jedem Lauf automatisch auf null eingestellt wird,
erreicht.
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Die
bestätigten
transgenen Pflanzen mit hohem Phosphorgehalt werden auf diese Weise
getestet. Einige, aber nicht alle, der Mutanten, die so evaluiert
wurden, bewiesen niedrigen Phytatgehalt. Sequenzeschreibung
Sequenzprotokoll