CN106164275A - 蜈蚣草植酸酶核苷酸和氨基酸序列及使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了编码来自蜈蚣草(Pteris vittata；PV)根的植酸酶的分离的和合成的DNA和cDNA分子；PV根植酸酶蛋白质和肽；PV根植酸酶反义分子，载体、转基因细胞和植物，其含有PV根植酸酶核酸分子、分离的多肽、或反义分子；用于PV根植酸酶的遗传标记；以及使用这些核酸或多肽分子改善植物和动物对植酸盐中磷的利用的方法。

Description

蜈蚣草植酸酶核苷酸和氨基酸序列及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年2月4日提交的具有标题“Pteris Vittata Phytase andAmino Acid Sequences and Methods of use”的美国临时申请系列号61/935,387的权益，其公开内容通过引用整体并入本文。

序列表

本申请包括序列表，其作为ASCII.txt文件以电子形式提交，题为02106537.txt，创建于2014年11月6日，并且具有68,543字节大小。序列表的内容整体并入本文。

背景

磷(P)是植物、动物和人类生长的必需元素。长期以来，以肥料或饲料添加剂的形式的磷的补充被认为是维持有益的作物和动物生产所必需的。补充是必需的，因为尽管在岩石圈中是丰富的，磷是影响世界范围的农业生产的最具限制性的营养素之一。参见Cordell,D.,J.等人Global Environmental Change.2009,19:292-305。由于大部分磷不能被利用，磷对植物和非反刍动物而言是限制性营养素。

磷以两种形式存在：1)有机P(P_o)，以及2)无机P(P_i)。P_o占总的土壤磷的30-80％，主要为植酸盐(phytate)[肌醇1,2,3,4,5,6-六磷酸盐]。参见Organic phosphorus in theEnvironment,Eds.B.L.Turner,E.Frossard和D.Baldwind.CAB International.2005,pp165-184。植物、非反刍动物和人需要无机磷，因为它们不能够有效吸收丰富的植酸盐。植酸盐分别组成土壤和饲料/食物中的总磷的>25％和60％-86％。参见同上和Lei,X.G.等人的Annu.Rev.Anim.Biosci.2013,1:283-309。植物具有参与P_i储备物的利用的细胞内磷酸酶。在植物根中，植酸酶可存在于质外体，但常常定位于细胞壁、表皮细胞和顶端分生组织。尽管这样，由于吸附和沉淀、蛋白水解分解和/或有效分泌出P_i动员酶的有限容量，导致土壤中差的底物可用性，植物根的磷酸酶无法水解足够的P_i以维持生长。非反刍动物和人类缺乏植酸酶，所述植酸酶是从植酸盐中移出磷而使磷可用于通过肠吸收的磷酸酶。

由植物和动物的差的磷利用促成富营养化。由于营养素富集，富营养化导致湖泊或溪流退化。参见A.N.Sharpley,T.等人“Agriculture Phosphorus andEutrophication”，第二版，2003年9月，由美国农业部ARS-149(the United StatesDepartment of Agriculture ARS-149)出版。富营养化已被确定为受损的地表水质量的主要原因，并且被磷加速。参见Schindler,D.W.Science.1977,195:260-262和Sharpley,A.N.等人的J.Envir.Qual.1994,23:437-451。未经利用的磷以动物废物的形式被排泄，所述动物废物被用作肥料。来自动物废物和无机肥料的未经利用的磷在土地上积累。过量的磷渗入地表和地下水路，这促成富营养化。

至少在过去的三十年中，农业产业一直致力于减少来自农业的磷污染。尽管经过多学科数十年的努力，磷介导的富营养化仍有待纠正。如此，对改进的磷利用策略存在需要以在保护环境的同时仍然维持农业生产。

概述

简单而言，本公开内容的实施方案提供了编码来自蜈蚣草(Pteris vittata；PV)根的植酸酶的分离的核苷酸和cDNA分子、对应于来自PV根的植酸酶的分离的多肽分子、能够在约100℃的温度从植酸盐裂解磷酸根(phosphate)的多肽、能够抑制PV根植酸酶(rootPV phytase)产生的反义分子、包含PV根植酸酶cDNA或反义分子的载体、包含PV根植酸酶DNA或反义分子的细胞和植物、提高或降低由植物或细胞表达的PV根植酸酶的量的方法以及用于PV根植酸酶基因的遗传标记。

本公开内容提供了编码能够从植酸盐裂解磷酸根的PV根植酸酶的cDNA分子，其中所述cDNA分子与SEQ ID NO:2有约90％或更高的序列同一性。在一些实施方案中，cDNA可操作地连接到调控序列。本公开内容还提供了与SEQ ID NO:3具有至少约90％或更高的序列同一性的分离的多肽。在一些实施方案中，分离的多肽在大于约70℃的温度从植酸盐裂解磷酸根。本公开内容还提供了包含编码PV根植酸酶的cDNA分子的载体，所述cDNA分子与SEQID NO:2具有至少约90％序列同一性。

本公开内容还提供了用包含与SEQ ID NO:2具有至少约90％序列同一性的编码PV根植酸酶的cDNA分子的载体转化的细胞和转基因植物。在一些实施方案中，转化的细胞和植物表达与SEQ ID NO:3具有至少约90％序列同一性的PV根植酸酶多肽。在另外的实施方案中，表达的PV根植酸酶多肽在大于约70℃的温度从植酸盐裂解磷酸根。在一些实施方案中，将转化的细胞与土壤混合。在其他实施方案中，将表达PV根植酸酶的转基因植物的部分包含在动物饲料中。

本公开内容还提供了与SEQ ID NO:3具有至少约90％序列同一性的纯化的重组PV根植酸酶。在一些实施方案中，纯化的重组PV根植酸酶从植酸盐裂解磷酸根。在另外的实施方案中，纯化的重组PV根植酸酶在约70℃或更高的温度从植酸盐裂解磷酸根。本文还提供了用于从转化的细胞制备纯化的重组PV根植酸酶的方法。在一些实施方案中，将纯化的重组PV根植酸酶包含在动物饲料中。

在检查以下附图和详述之后，本公开内容的其他组合物、植物、方法、特征和优势对于本领域技术人员将是明显的或变得明显。意图将所有此类另外的组合物、植物、方法、特征和优势包括在该说明书中，并且在本公开内容的范围内。

附图简述

当联合附图审阅以下描述的本公开内容的多种实施方案的详述后，本公开内容的另外的方面将更容易被理解。

图1A和1B示出了砷酸盐对来自蜈蚣草(PV)、剑叶凤尾蕨(P.ensiformis，PE)的根提取物以及纯化的小麦植酸酶(WP)中的植酸酶(图1A)和磷酸酶(图1B)活性的影响。通过将在缓冲至pH 5.0的5mM植酸盐或pNPP悬浮液中的样品与浓度增加的砷酸盐孵育来确定酶活性。PV、PE和WP的植酸酶的比活性值分别为46.7、42.7和51.8nmol P_i mg^-1蛋白质min^-1，并且PV、PE和WP的磷酸酶的比活性值分别为79.5、149和163nmol pNP mg^-1蛋白质min^-1。数据为10个重复的平均值，棒表示标准误差。

图2A和2B示出了温度对PV根植酸酶(图2A)或PV根磷酸酶(图2B)的影响。来自蜈蚣草(PV)、剑叶凤尾蕨(PE)的提取物和纯化的小麦植酸酶(WP)的酶活性通过以下确定：将缓冲至pH 5.0的5mM植酸盐或pNPP悬浮液在保持在40、60、80或100℃的水浴中预处理10min，然后孵育。数据为10个重复的平均值，棒表示标准误差。

图3示出了在用磷酸盐和砷酸盐处理3天后，蜈蚣草(PV)和剑叶凤尾蕨(PE)的叶和根茎(rhizome)中磷酸酶和植酸酶的活性。

图4示出了在用磷酸盐和砷酸盐处理3天后，蜈蚣草(PV)和剑叶凤尾蕨(PE)的根组织中磷酸酶和植酸酶的活性。

图5示出了在不含P(对照)、含有砷酸盐(As)、磷酸盐(P_i)和植酸盐(P₆)的无菌Murashige&Skoog培养基上生长15天或40天以后，植物(莴苣(L.satvia)、北葱(A.schoenoprasum)、地三叶草(T.subterraneum)、剑叶凤尾蕨、T.kunthii和蜈蚣草)的鲜重。

图6A-6D示出了在含有磷酸盐(P)、植酸盐或磷酸盐和砷酸盐(P+As)的无菌Murashige&Skoog培养基上15天((莴苣(图6B)和地三叶草(图6D))或40天(蜈蚣草(图6A)和剑叶凤尾蕨(图6C))的植物生长。

图7示出了在含有0.6mM植酸盐和砷酸盐的经修改的培养基上生长40天后的蜈蚣草配子体产生的孢子体组织。

图8示出了在具有0.6mM磷酸盐(P_i)、植酸盐(P₆)和砷酸盐(As)的Murashige&Skoog培养基上生长40天的蜈蚣草配子体中磷(P)和砷酸盐(As)的总浓度。

图9A和9B示出了植酸盐对蜈蚣草根分泌物(exudate)(图9A)和配子体(图9B)中植酸酶活性的影响。确定来自在具有磷酸盐(P_i)、植酸盐(P₆)和砷酸盐(As)的情况下生长的蜈蚣草根分泌物(图9A)和配子体(图9B)的植酸酶活性。数据表示8个重复的平均值和标准误差，并且具有相同字母的棒没有显著差异。

图10A和10B示出了与来自蜈蚣草(PV)、剑叶凤尾蕨(PE)的根的根部酶提取物或纯化的小麦植酸酶(WP)混合2小时后，土壤悬浮液中剩余的植酸酶活性(图10A)，以及在24小时的时期内PV提取物对土壤的响应(图13B)。数据为5个重复的平均值，棒表示标准误差。

图11示出了来自用植酸盐(PA)、无机P(P_i)、和/或砷酸盐(As)处理的蜈蚣草的根的分泌物中的蛋白质含量。

图12示出了在用无机P(P_i)、Pi和砷酸盐(As)、或植酸盐(IHP)处理后的配子体根分泌物和孢子体分泌物中的植酸酶活性。

图13示出了不同土壤中PV根植酸酶(PV)、剑叶凤尾蕨(PE)植酸酶或纯化的小麦植酸酶(WP)的活性，证明了即使当吸附于土壤颗粒时PV根植酸酶仍有活性。各种植酸酶的活性在纵轴上示出。土壤样品或对照在横轴上示出。

图14示出了不同pH的PV根植酸酶的活性。植酸酶活性在纵轴上示出。pH在横轴上示出。

详述

在更详细的描述本公开内容之前，要理解该公开内容并不局限于描述的特定实施方案，并且当然此类特定的实施例方案可变化。还要理解的是，本文使用的术语仅为了描述特定的实施方案的目的并且不意图限制。

在提供值的范围的情况下，应理解，除非上下文另外清楚地规定，该范围的上限和下限之间的至下限的单位的十分之一的每个中间值，和在该陈述的范围中的任何其他陈述的或中间的值包括在本公开内容内。这些较小的范围的上限和下限可独立地被包括在所述较小的范围中，并且还被包括在本公开内容内，服从于陈述的范围中的任何特定的排除性限制。在陈述的范围包括限值中的一个或两者的情况下，排除那些包括的限值中的任一个或两者的范围也被包括在本公开内容中。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与由本公开内容所属的领域内的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在本公开内容的实践或测试中还可以使用与本文描述的那些类似或等效的任何方法和材料，现在描述优选的方法和材料。

在该说明书中引用的所有出版物和专利通过引用并入本文，如同每一个单独的出版物或专利被具体地且单独地指示通过引用被并入，并且所述在该说明书中引用的所有出版物和专利通过引用并入本文以公开并且描述出版物关于其被引用的方法和/或材料。任何出版物的引用是为了其在申请日之前的公开内容，并且不应被理解为承认本公开内容由于之前的公开内容而无权先于此类出版物。另外，提供的出版物的日期可能不同于实际出版日期，实际出版日期可能需要独立地确认。

如本领域技术人员阅读该公开内容之后将领会的，本文描述并例证的个体实施方案中的每个具有离散的组分和特征，其可容易地与其他若干实施方案中的任一个的特征分开或组合而不偏离本公开内容的范围或精神。任何列举的方法可以以列举的事件顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来进行。

除非另有指示，本公开内容的实施方案将采用分子生物学、微生物学、纳米技术、有机化学、生物化学、植物学等的技术，其在本领域的技术内。此类技术在文献中被充分地解释。

讨论

植酸酶是启动从植酸及其盐植酸盐逐步除去磷酸根的一类磷酸酶。所有植酸酶使植酸/植酸盐的磷酸单酯的水解成为可能。随着动物饮食在20世纪下半叶转变为以植物为基础(即以大豆为基础)，由于这些植物饲料中的磷是呈植酸盐的形式，排泄出的磷的量增加。结果，增加量的P_i被补充到非反刍动物饮食中以满足动物对磷的需要。此外，植酸盐通过与其他微量营养素(例如铁)螯合而作为抗营养素。以这种方式，植酸盐降低了这些微量营养素的可用性，其影响了植物和动物的生长。早在1960年人们开始努力研究用于动物饲料的商用植酸酶补充物。参见Wodzinski R.J.和A.H.Ullah.Adv.Appl.Microbiol.1996,42:263-301。目前，大部分的猪和家禽饮食补充有植酸酶，并且植酸酶市场代表了全部饲料酶市场的多于60％。参见Adeola,O.和A.J.Cowieson.J.Anim.Sci.2011,89:3189-3218。补充有植酸酶的动物饲养用饮食的改良表现归因于改良的磷和其他微量营养素的利用两者。

在饲料制粒期间植酸酶活性的大量损失仍然是植酸酶用作饲料补充物的最具限制性的因素。在饲料制粒期间温度可以达到80℃或更高。如此，用于饲料补充的植酸酶显示对饲料制粒期间所达到的高温的适应力是有益的。鉴定热稳定的天然存在的植酸酶的努力重点围绕在表征极端微生物中的植酸酶上，所述极端微生物是生活在具有极热的环境中的生物体。基于公开可用的序列的鉴定具有潜在的热稳定性的新植酸酶的生物信息学方法也已被使用。

尽管付出这些努力，没有天然存在的植物来源的植酸酶被鉴定为在饲料碾磨过程期间所达到的高温下是热稳定的。考虑到这一点，本文公开了源自蜈蚣草(Pteris vittataL.)根的热稳定的植酸酶(PV，PV根植酸酶)，所述热稳定的植酸酶用于改进植物和动物中的磷利用，从而降低沉积在土地上的磷的量。还公开了组合物、系统和制备PV根植酸酶的方法以及使用PV根植酸酶用于改进植物和动物中的磷利用的方法。

本公开内容的实施方案包括(除了其他的以外)对应于源自PV根植酸酶的分离的核苷酸(特别是cDNA序列)、PV根植酸酶的分离的多肽序列、包含PV根植酸酶基因的载体、包含PV根植酸酶基因的反义序列的载体、用于过表达PV来源的植酸酶基因的载体、表达外源的根来源的PV植酸酶基因的转基因植物和渐渗(introgressed)植物以及植物细胞、表达外源PV根植酸酶基因的遗传修饰的细菌、真菌和酵母细胞、包含本公开内容的分离的PV植酸酶的动物饲料、以及含有表达外源PV根植酸酶的遗传修饰的细菌、真菌和/或酵母细胞的微生物肥料。

如以下实施例所证明的，本文公开的PV根植酸酶的一个优势可以为其出乎意料地在大于约70℃的温度、特别是在70℃和约100℃之间的温度保留其活性的100％。此外，PV根植酸酶可不受砷酸盐影响，砷酸盐是其他植酸酶的众所周知的抑制剂。此外，与其他植物植酸酶不同，PV根植酸酶可以耐受土壤中通过吸附的钝化作用。

考虑到所公开的实施方案的该一般性描述和若干优势，关注本文描述的各种实施方案的详细讨论。

核酸序列

分离的核苷酸和cDNA序列

本公开内容描述了分离的核苷酸和cDNA序列，其整体或部分可编码来自PV根的植酸酶。在一些实施方案中，由分离的或合成的核苷酸或cDNA序列编码的PV根植酸酶从植酸盐裂解磷酸根。在一个实施方案中，PV根植酸酶在约70℃或更高的温度具有50％或更高的活性。在一些实施方案中，由分离的核苷酸或cDNA序列编码的PV根植酸酶在大于约70℃的温度具有约100％的活性，并且在一个实施方案中，在约70℃和约100℃之间的温度具有约100％的活性。在其他实施方案中，由分离的核苷酸或cDNA序列编码的PV根植酸酶在大于约80℃的温度具有大于约90％的活性，并且在一个实施方案中，在80℃和约100℃之间的温度具有大于约90％的活性。在另外的实施方案中，由分离的核苷酸或cDNA序列编码的PV根植酸酶在大于约90℃的温度具有大于约25％的活性，并且在一个实施方案中，在约90℃和约100℃之间的温度具有大于约25％的活性。

在一些实施方案中，编码来自PV根的植酸酶的核苷酸可具有根据SEQ ID NO:1的分离的核苷酸序列。在一些实施方案中，对应于PV根植酸酶的cDNA可具有对应于SEQ IDNO:2、8、10、12、14、16、18或20中任一项的序列。cDNA可具有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，cDNA可具有与SEQ IDNO:2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有至少98％同一性的序列。在其他实施方案中，cDNA可具有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少70％或至少50％序列同一性的序列。在另外的实施方案中，cDNA序列与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有约70％和约80％之间、或约80％和90％之间、或约90％和约100％之间的序列同一性。

在另外的实施方案中，cDNA序列具有对应于SEQ ID NO:2的序列，并且与SEQ IDNO:4具有约70％和约100％之间的序列同一性。在另外的实施方案中，cDNA具有对应于SEQID NO:2的序列，并且与SEQ ID NO:6具有约70％和约100％之间的序列同一性。在其他实施方案中，cDNA具有对应于SEQ ID NO:2的序列，并且与SEQ ID NO:8具有约70％和约100％之间的序列同一性。cDNA可具有对应于SEQ ID NO:2的序列，并且与SEQ ID NO:10具有约70％和约100％之间的序列同一性。cDNA可具有对应于SEQ ID NO:2的序列，并且与SEQ ID NO:12具有约70％和约100％之间的序列同一性。cDNA可具有对应于SEQ ID NO:14的序列，并且与SEQ ID NO:10具有约70％和约100％之间的序列同一性。cDNA可具有对应于SEQ ID NO:2的序列，并且与SEQ ID NO:16具有约70％和约100％之间的序列同一性。cDNA可具有对应于SEQ ID NO:2的序列，并且与SEQ ID NO:18具有约70％和约100％之间的序列同一性。cDNA可具有对应于SEQ ID NO:2的序列，并且与SEQ ID NO:20具有约70％和约100％之间的序列同一性。

在一些实施方案中，PV根植酸酶cDNA编码具有与SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19或21中任一项具有至少90％同一性的序列的多肽。在另外的实施方案中，PV根植酸酶cDNA编码具有与SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19或21中任一项具有约90％和约100％之间的序列同一性的序列的多肽。在其他实施方案中，PV根植酸酶cDNA编码具有与SEQ IDNO:3、9、11、13、15、17、19或21中任一项具有约90％和约100％之间的序列同一性并且与SEQID NO:5具有约70％和约100％之间的序列同一性的序列的多肽。在另外的实施方案中，cDNA编码具有与SEQ ID NO:3、9、11、13、15、17、19或21中任一项具有约90％和约100％之间的序列同一性并且与SEQ ID NO:7具有约70％和约100％之间的序列同一性的序列的多肽。cDNA可编码与SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19或21中任一项具有约90％和约100％之间的序列同一性的多肽。

本公开内容还描述了分离的核苷酸片段，包括合成的核苷酸片段和cDNA片段，所述分离的核苷酸片段具有与SEQ ID NO:1、2、8、10、12、14、16、18或20中任一项中的任何序列具有约90％和100％之间、约95％和约100％之间、或约99％和100％之间的序列同一性的至少6个核苷酸序列。在一些实施方案中，分离的核苷酸或合成的核苷酸片段与SEQ ID NO:1、2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有约90％至约100％的序列同一性，并且与SEQ IDNO:4和/或SEQ ID NO:6具有约70％至约100％的序列同一性。合适的分离的核苷酸或合成的核苷酸片段可通过本领域技术人员熟知的标准方法获得，包括但不限于限制酶消化和聚合酶链式反应(PCR)或从头(de novo)核苷酸序列合成技术。

在一些实施方案中，分离的或合成的核苷酸片段编码能够从植酸盐裂解磷酸根的肽或多肽。在一个实施方案中，分离的或合成的核苷酸片段编码在约70℃或更高的温度具有约50％或更高的活性的肽或多肽。在一些实施方案中，由分离的或合成的核苷酸片段编码的肽或多肽在大于约70℃的温度具有约100％的活性，并且在一个实施方案中，在约70℃和约100℃之间的温度具有约100％的活性。在其他实施方案中，由分离的或合成的核苷酸编码的肽或多肽在大于约80℃的温度具有约90％的活性，并且在一个实施方案中，在约80℃和约100℃之间的温度具有大于约90％的活性。在另外的实施方案中，由分离的或合成的核苷酸片段编码的肽或多肽在大于约90℃的温度具有约25％的活性，并且在一个实施方案中，在约90℃和约100℃之间的温度具有大于约25％的活性。

在其他实施方案中，本公开内容包括能够抑制内源PV根植酸酶基因的表达的分离的或合成的反义多核苷酸。能够抑制PV根植酸酶基因的表达的多核苷酸可以直接抑制表达(例如，通过结合PV根植酸酶mRNA以阻止翻译)或通过反义多核苷酸的转录产物(例如，RNA，如果反义多核苷酸为DNA的话)抑制表达。这样的反义多核苷酸可以用在载体中以产生转基因植物品种或细胞系，其中PV根植酸酶的表达被抑制或下调，从而降低转基因植物或细胞系中的PV根植酸酶。在一些实施方案中，本公开内容的反义多核苷酸能够抑制内源PV根植酸酶基因的表达，所述内源PV根植酸酶基因的cDNA对应于SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18或20中任一项，或与SEQ ID NO:1、2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有至少约90％序列同一性。在其他实施方案中，反义多核苷酸与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有约90％和约100％之间、或约95％和约100％之间、或约99％和100％之间的序列同一性。在一些实施方案中，当本公开内容的反义多核苷酸在植物或细胞系中转录时，该反义多核苷酸可抑制内源或外源的根来源的PV植酸酶基因的表达，所述内源或外源的根来源的PV植酸酶基因的cDNA对应于SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18或20中任一项，或与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有约90％和100％之间的序列同一性。

重组多核苷酸序列

本公开内容还包括重组多核苷酸序列，其具有前述的分离的核苷酸或cDNA序列或其片段中的任一项以及可操作地连接到所述分离的核苷酸或cDNA序列或其片段的另外的多核苷酸序列。在一些实施方案中，非编码核苷酸可被放置在编码PV根植酸酶肽的多核苷酸或反义多核苷酸的5'端和/或3'端而不影响该分子的功能特性。可以包括在多核苷酸的编码区域的3'端的聚腺苷酸化区域。聚腺苷酸化区域可以来源于内源基因、来源于多种其他植物基因、来源于T-DNA、或通过化学合成。在另外的实施方案中，编码PV根植酸酶多肽的核苷酸可在PV根植酸酶多肽的(例如)N末端与编码信号或转运(或前导)序列的核酸连接，所述信号或转运(或前导)序列在共翻译时或在翻译后指导PV根植酸酶多肽的转移。多核苷酸序列也可以被改变，使得所编码的PV根植酸酶多肽与接头、选择标记(selectablemarker)、或便于蛋白质合成、纯化和/或鉴定的其他序列连接。在一个实施方案中，重组多核苷酸序列包括可操作地连接到分离的核苷酸或cDNA序列或其片段的至少一个调控序列。

为了在细胞中表达外源PV根植酸酶基因或其片段、或反义核苷酸，可将外源核苷酸与在细胞中指导基因的转录和/或所编码的蛋白质的翻译的转录和/或翻译启动调控序列(即，启动子)组合(例如，在载体中)。在一些实施方案中，可采用组成型启动子。用于植物细胞的合适的组成型启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录启动区域、源自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的1'-或2'-启动子、来自拟南芥属(Arabidopsis)的ACT11和Cat3启动子(Huang等人Plant Mol.Biol.1996,33:125-139，和Zhong等人Mol.Gen.Genet.1996,251:196-203)、来自甘蓝型油菜(Brassica napus)的硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶基因启动子(Solocombe等人Plant Physiol.1994,104:1167-1176)、以及来自玉蜀黍(maize)的GPc 1和Gpc2启动子(Martinez等人J.Mol.Biol.1989,208:551-565和Manjunath等人Plant Mol.Biol.1997,33:97-112)。用于细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞的合适的组成型启动子是本领域通常已知的，例如用于细菌表达的T-7启动子和用于在酵母中表达的醇脱氢酶启动子。

在其他实施方案中，可采用组织特异性启动子或诱导型启动子来在特定细胞类型中、在特定环境条件下和/或在特定的发育状态期间指导外源核酸的表达。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括：缺氧条件、高温、光的存在、与化学品或激素接触、或被病原体感染。合适的植物诱导型启动子包括根特异性ANRI启动子(Zhang和Forde.Science.1998,279:407)、光合成器官特异性RBCS启动子(Khoudi等人Gene.1997,197:343)和番茄果实成熟特异性E8启动子(Deikman,J.等人Plant Physiol.1992,100:2013-2017)。

还可以在重组核酸中包括选择标记以在植物细胞中赋予可选择的表型。例如，选择标记可以编码赋予杀生物剂抗性、抗生素抗性(例如，对卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素的抗性)、或除草剂抗性(例如，对氯磺隆或Basta的抗性)的蛋白质。因此，可选择的表型的存在表明宿主细胞的成功转化。示例性选择标记包括β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)报告基因。

可通过使用本领域技术人员已知的标准方法获得合适的重组多核苷酸，包括但不限于限制酶消化、PCR、连接(ligation)和克隆技术。在一些实施方案中，重组多核苷酸编码能够从植酸盐裂解磷酸根的肽或多肽。在一个实施方案中，本公开内容的重组多核苷酸编码在约70℃或更高的温度具有约50％或更高的活性的肽或多肽。在其他实施方案中，重组多核苷酸编码在大于约70℃的温度具有约100％的活性，并且在一个实施方案中，在70℃和约100℃之间的温度具有约100％的活性的肽或多肽。在另外的实施方案中，重组多核苷酸编码在大于约80℃的温度具有约90％的活性，并且在一个实施方案中，在约80℃和约100℃之间的温度具有大于约90％的活性的肽或多肽。在仍然其他实施方案中，重组多核苷酸编码在大于约90℃的温度具有约100％的活性，并且在一个实施方案中，在约90℃和约100℃之间的温度具有大于约90％的活性的肽或多肽。

分离的蛋白质(多肽)和肽序列：

本公开内容还描述了对应于来自PV根的植酸酶的分离的或合成的蛋白质(多肽)。在一些实施方案中，分离的多肽具有对应于SEQ ID NO:3、9、11、13、15、17、19或21中任一项的氨基酸序列。SEQ ID NO:3是来源于蜈蚣草根的植酸酶的氨基酸序列。预测SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19或21对应于PV根的紫色酸性植酸酶。分离的或合成的多肽可具有与SEQ IDNO:3、9、11、13、15、17、19或21中任一项具有至少约99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的或合成的多肽具有与SEQ ID NO:3、9、11、13、15、17、19或21中任一项具有至少约98％的同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，分离的多肽具有与SEQ ID NO:3、9、11、13、15、17、19或21中任一项具有至少约95％、至少约90％、至少约85％、至少约80％、至少约70％、或至少约50％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的或合成的多肽与SEQ ID NO:3、9、11、13、15、17、19或21中任一项具有大于约70％、或约70％和约90％之间、或约90％和100％之间的序列同一性。在一个实施方案中，分离的或合成的多肽与大豆(Glycine Max)植酸酶(SEQ ID NO:5)和/或蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)(SEQID NO:7)具有约80％至约100％的序列同一性。

在一些实施方案中，如本文公开的分离的或合成的多肽从植酸盐裂解磷酸根。在一个实施方案中，分离的多肽在约70℃或更高的温度具有约50％或更高的活性。在一些实施方案中，分离的或合成的多肽在大于约70℃的温度具有约100％的活性，并且在一个实施方案中，在约70℃和约100℃之间的温度具有约100％的活性。在其他实施方案中，分离的或合成的多肽在大于约80℃的温度具有约90％的活性，并且在一个实施方案中，在约80℃和约100℃之间的温度具有大于约90％的活性。在另外的实施方案中，分离的或合成的多肽在大于约90℃的温度具有约25％的活性，并且在一个实施方案中，在约90℃和约100℃之间的温度具有大于约25％的活性。

可以在本公开内容的多肽结构方面进行修饰和改变，其产生与未修饰的多肽具有类似的特征(例如，保守的氨基酸置换)的分子。修饰技术是本领域通常已知的。例如，序列中某些氨基酸可被置换为其他氨基酸而没有可感知的活性损失。因为多肽的相互作用能力和性质定义了多肽的生物学功能活性，可以在多肽序列中进行某些氨基酸序列的置换并仍然获得功能性变体。具有氨基酸序列置换物的仍然保留与对应于PV根植酸酶的多肽基本上类似的性质的多肽在本公开内容的范围之内。

本公开内容还包括对应于PV根植酸酶的多肽的片段的分离的和合成的肽。在一些实施方案中，肽对应于SEQ ID NO:3、9、11、13、15、17、19或21中任一项的部分。分离的或合成的肽与SEQ ID NO:3、9、11、13、15、17、19或21中任一项的任何部分具有至少约90％、或至少约95％、或至少约99％的序列同一性。在一些实施方案中，分离的或合成的肽与SEQ IDNO:3、9、11、13、15、17、19或21中任一项之内的序列具有约90％和约95％之间、或约95％和约99％之间、或约99％和约100％之间的序列同一性。在一些实施方案中，分离的肽与大豆植酸酶(SEQ ID NO:5)和/或蒺藜苜蓿(M.truncatula)(SEQ ID NO:7)的部分具有约70％和100％之间的序列同一性。

在一些实施方案中，分离的肽可以从植酸盐裂解磷酸根。在一个实施方案中，分离的或合成的肽在约70℃或更高的温度可具有至少约50％的活性。在一些实施方案中，分离的或合成的肽在大于约70℃的温度具有约100％的活性，并且在约70℃和约100℃之间的温度具有约100％的活性。在其他实施方案中，分离的肽或合成的肽在大于约80℃的温度具有约90％的活性，并且在约80℃和约100℃之间的温度具有大于约90％的活性。在另外的实施方案中，分离的或合成的肽在大于约90℃的温度具有约25％的活性，在约90℃和约100℃之间的温度具有大于约25％的活性。

在其他实施方案中，如本文所描述的分离的或合成的肽适合用于制备针对PV根植酸酶的抗体。换言之，如本文所描述的分离的或合成的肽用作抗体所针对的抗原。在一些实施方案中，分离的或合成的肽序列还是抗体的表位。针对PV根植酸酶的抗体适合用于在至少用于PV根植酸酶的检测、定量和纯化的方法中使用。抗PV根植酸酶抗体的其他用途是本领域通常已知的。

载体

具有本文所描述的一个或更多个多核苷酸或反义多核苷酸的载体可用于制备表达不同水平的PV根植酸酶的转基因细菌、真菌、酵母、植物细胞、以及转基因植物。含有本文所描述的一个或更多个多核苷酸序列的载体在本公开内容的范围内。

在一个实施方案中，载体包含编码PV根植酸酶的多核苷酸，其中DNA分子与SEQ IDNO:2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有至少约90％、或约90％和约95％之间、或约95％和约100％之间的序列同一性。在一些实施方案中，载体包含编码PV根植酸酶的DNA分子，其中所述DNA分子与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有至少约90％、或约90％和约95％之间、或约95％和约100％之间的序列同一性，并且其中PV根植酸酶催化磷酸根从植酸盐的移除。在另外的实施方案中，载体包含编码PV根植酸酶的DNA分子，其中所述DNA分子与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有至少约90％、或约90％和约95％之间、或约95％和约100％之间的序列同一性，并且其中PV根植酸酶在约70℃和约80℃之间、或约80℃和约90℃之间、或约90℃和约100℃之间的温度催化磷酸根从植酸盐的移除。在其他实施方案中，载体包含编码PV根植酸酶的DNA分子，其中所述DNA分子与SEQ IDNO:2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有至少约90％、或约90％和约95％之间、和或约95％和约100％之间的序列同一性，并且其中PV根植酸酶在大于约100℃的温度催化磷酸根从植酸盐的移除。在一些实施方案中，载体具有编码以下多肽的cDNA分子，所述多肽与SEQID NO:3、9、11、13、15、17、19或21中任一项具有至少约90％、或约90％和约95％之间、或95％和约100％之间的序列同一性的序列。

在一个实施方案中，载体具有可操作地连接到编码PV根植酸酶的DNA分子的至少一个调控序列，使得PV根植酸酶在细菌、真菌、酵母、植物或其转化到其中的其他细胞中表达。在其他实施方案中，载体包含用于启动PV根植酸酶表达的启动子，使得相对于野生型细菌、真菌、酵母或植物细胞，PV根植酸酶在其转化到其中的植物细胞中过表达。在一些实施方案中，载体具有可操作地连接到编码PV根植酸酶的DNA分子的至少一个调控序列以及选择标记。

本公开内容的其他实施方案包括载体，所述载体具有能够抑制内源PV根植酸酶基因表达的反义多核苷酸以及可操作地连接到所述反义多核苷酸的至少一个调控序列，使得所述反义多核苷酸在其所转染到其中的模式细菌、真菌、酵母或植物细胞中转录。在实施方案中，反义多核苷酸可以能够抑制对应于SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18或20中任一项的或与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有至少约90％序列同一性的内源PV根植酸酶基因的表达。

转基因植物

以上所描述的多核苷酸序列和载体可用于制备转基因植物。本公开内容包括具有一种或更多种细胞的转基因植物，其中所述一种或更多种细胞含有前述的具有编码PV根植酸酶的DNA序列的重组多核苷酸或载体中的任一项。在一个实施方案中，重组多核苷酸含有可操作地连接到PV根DNA序列(root PV DNA sequence)的至少一个调控元件，所述PV根DNA序列与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有至少约90％、或约90％和约95％之间、或约95％和约100％之间的序列同一性。

本文还描述了具有一种或更多种细胞的转基因植物，所述一种或更多种细胞用含有以上描述的核苷酸序列中的任何核苷酸序列、和/或编码本公开内容的PV根植酸酶蛋白质的核酸的片段的载体转化。在一些实施方案中，载体含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有至少约90％、或约90％和约95％之间、或约95％和约100％之间的序列同一性的PV根部DNA序列。转基因植物可由任何合适的植物种类或品种制备，包括但不限于拟南芥属(Arabidopsis)、稻、小麦、玉米(corn)、玉蜀黍(maize)、烟草、大豆、芸苔属(Brassicas)、番茄、马铃薯、苜蓿、甘蔗和高粱。

在一些实施方案中，具有编码PV根植酸酶的核苷酸序列的转基因植物相对于野生型植物具有PV根植酸酶的升高的表达。在其他实施方案中，具有编码PV根植酸酶的核苷酸序列的转基因植物相对于野生型植物具有PV根植酸酶的升高的表达，并且产生能够从植酸盐裂解磷酸根的PV植酸酶。在另外的实施方案中，具有编码PV根植酸酶的核苷酸序列的转基因植物相对于野生型植物具有PV根植酸酶的升高的表达。

在一些实施方案中，转基因植物产生从植酸盐裂解磷酸根的PV根植酸酶。在一个实施方案中，转基因植物产生在约70℃或更高的温度具有约50％或更高的活性的PV根植酸酶。在一些实施方案中，转基因植物产生在大于约70℃的温度具有约100％的活性，以及在约70℃和约100℃之间的温度具有约100％的活性的PV根植酸酶。在其他实施方案中，转基因植物产生在大于约80℃的温度具有约90％的活性的PV根植酸酶。在一些实施方案中，转基因植物产生在约80℃和约100℃之间的温度具有大于约90％的活性的PV根植酸酶。在另外的实施方案中，转基因植物产生在大于约90℃的温度具有约25％的活性的PV根植酸酶。在一些实施方案中，转基因植物产生在约90℃和约100℃之间的温度具有大于约25％的活性的PV根植酸酶。

类似地，本公开内容包括具有一种或更多种细胞的转基因植物，其中所述一种或更多种细胞含有前述本公开内容的具有能够降低PV根植酸酶RNA或蛋白质表达的反义DNA序列的重组多核苷酸或载体的任一项。在一个实施方案中，重组多核苷酸含有可操作地连接到能够降低PV根植酸酶RNA或蛋白质表达的反义DNA序列的至少一个调控元件。本公开内容还包括具有一种或更多种细胞的转基因植物，所述一种或更多种细胞用含有能够降低PV根植酸酶RNA或蛋白质表达的反义DNA序列的载体转化。在一些实施方案中，具有能够降低PV根植酸酶RNA或蛋白质表达的反义DNA序列的转基因植物，相对于野生型植物具有减少的PV根植酸酶。

本公开内容的转化的植物细胞可通过将如前述的一种或更多种载体引入植物细胞来制备。在一个实施方案中，本公开内容的转基因植物可由用前述的一种或更多种载体转化的转基因植物细胞生长得到。在一个实施方案中，用载体转化细胞，所述载体含有编码PV根植酸酶的与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有至少约90％、或约90％和约95％之间、或约95％和约100％之间的序列同一性的重组多核苷酸，所述载体具有可操作地连接到DNA分子的至少一个调控序列。

用于用载体或裸露的核酸转化多种植物细胞的技术是本领域公知的，并且在技术和科学文献中描述。参见例如，Weising等人Ann.Rev.Genet.1988,22:421-477。例如，可以使用诸如但不限于植物细胞原生质体的电穿孔和显微注射的技术将载体或裸露的核酸直接引入植物细胞的基因组DNA中，或者可以使用冲击法(ballistic method)诸如DNA粒子轰击将重组核酸直接引入植物组织中。

显微注射技术是本领域已知的并且已经在科学和专利文献中被充分描述。使用聚乙二醇沉淀法引入重组核酸在Paszkowski等人EMBO J.1984,3:2717-2722中描述。电穿孔技术在Fromm等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1985,82:5824中描述。冲击转化技术在Klein等人Nature.1987,327:70-73中描述。重组核酸还可以与合适的T-DNA侧翼区域组合并引入常规的根癌土壤杆菌宿主载体或其他合适的载体中。当细胞被根癌土壤杆菌感染时，该细菌宿主的病毒性功能将指导含有外源核酸和相邻的标记的重组核酸插入植物细胞DNA中。根癌土壤杆菌介导的转化技术(包括卸甲(disarming)和使用双元载体)是本领域技术人员已知的，并且在科学文献中被充分描述。参见，例如，Horsch等人Science.1984,233:496-498；Fraley等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1983,80:4803；以及Gene Transfer toPlants,Potrykus,ed.,Springer-Verlag,Berlin,1995。

用于将载体或重组核酸引入植物细胞的另一方法是通过植物细胞原生质体的转化(稳定的或瞬时的)。植物原生质体仅被质膜封闭，并且因而将更容易摄取诸如外源DNA的大分子。这些经工程化的原生质体可以能够再生完整植株。用于将外源DNA引入植物细胞原生质体的合适的方法包括电穿孔和聚乙二醇(PEG)转化。电穿孔后，经转化的细胞通过在含有选择剂的合适的培养基上生长来鉴定。

可以使用本领域熟知的方法(例如DNA印迹法分析)确定转基因植物中外源核酸的存在和拷贝数。外源PV根植酸酶核酸或反义核酸在转基因植物中的表达可通过检测所述转基因植物中mRNA或PV根植酸酶多肽的升高或降低来确定。用于检测和定量mRNA或蛋白质的方法是本领域熟知的。

通过以上转化技术的任一种或当前已知的或随后发展的其他技术得到的经转化的植物细胞可以被培养以再生完整植株。在实施方案中，这样的再生技术可依赖于在组织培养生长培养基中某些植物激素的操作，通常依赖于与外源核酸一起引入的杀生物剂或除草剂选择标记。从培养的原生质体的植株再生在以下中描述：Evans等人，ProtoplastsIsolation and Culture,Handbook of Plant Cell Culture,pp.124-176,MacMillilanPublishing Company,New York,1983；以及Binding,Regeneration of Plants,PlantProtoplasts,pp.21-73,CRC Press,Boca Raton,1985。还可以由植物愈伤组织、外植体、器官或其部分获得再生。这样的再生技术通常在Klee等人Ann.Rev.Plant Phys.1987,38:467-486中描述。

证实外源PV根植酸酶的核酸或反义核酸已稳定地掺入转基因植物的基因组之后，可通过有性杂交将其引入其他植物中。取决于待杂交的物种，可以使用若干标准育种技术的任一种。

在一些实施方案中，将从根据本公开内容制备的表达PV根植酸酶的转基因植物获得的植物种子或其他部分包括在动物饲料中。例如，表达PV根植酸酶的转基因玉米的籽粒可直接用于生产含有PV根植酸酶的动物饲料。在其他实施方案中，从携带PV根植酸酶的等位基因变体的植物(天然地或通过选择性育种技术)获得的植物种子或其他部分被用作用于生产动物饲料的组分。含有天然表达或被遗传修饰以表达PV根植酸酶的植物的组分的动物饲料然后可以被饲喂至动物。

遗传标记(genetic marker)

本公开内容还包括可用于在其他植物品种或物种中鉴定PV根植酸酶基因的不同等位基因的遗传标记。在实施方案中，这样的标记包括但不限于限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、单核苷酸多态性(SNP)、微卫星标记(例如SSR)、序列特征性扩增区域(SCAR)标记、可变数目串联重复(VNTR)、短串联重复(STR)、酶切扩增多态性序列(CAPS)标记、和同工酶标记，以及用于PV根植酸酶基因的类似标记或这类标记的组合。鉴定核苷酸序列的引物包括正向5’-CCT TGG CAA GCT CAA GAC CA-3’(SEQ ID NO:22)和反向5’-ATG GAC ATG GCC AGC AAA CA-3’(SEQ ID NO:23)，其编码PV根的DNA的400bp的核苷酸链。

渐渗系(introgression line)

在一些实施方案中，可以通过使用本公开内容的遗传标记在市售相关植物中鉴定PV根植酸酶的同源等位基因或变体。这些同源或变体等位基因可被表征，并且负责所需的热和砷耐受的植酸酶表达的等位基因可以被鉴定。在本公开内容的实施方案中，新的市售相关植物品种可以通过使赋予热和砷耐受的植酸酶活性的期望的等位基因渐渗而得到。渐渗可以为标记辅助的渐渗。使来自一种植物品种的含有期望的等位基因的基因和染色体区段渐渗的育种技术在本领域中是通常已知的。

转化的细胞

本公开内容还包括了用如前述的一种或更多种分离的核苷酸或cDNA序列和/或载体转化的一种或更多种细胞。在一些实施方案中，转化的细胞为植物、细菌、真菌或酵母细胞。在一个实施方案中，植物、细菌、真菌或酵母细胞含有如前述的一种或更多种载体。细胞群体也在本公开内容的范围内，其中群体中约1％至约100％、或约50％和约75％之间、或约75％和约100％之间的细胞含有如前述的载体。

在一些实施方案中，群体中的一种或更多种细胞含有多于一种类型的载体。在一些实施方案中，含有载体的所有细胞(约100％)具有相同类型的载体。在其他实施方案中，不是含有载体的所有细胞具有相同类型的载体或多种载体。在一些实施方案中，群体中约1％至约100％、或约50％和约75％之间、或约75％和约100％之间的细胞含有相同的载体或多种载体。在一些细胞群体中，所有细胞来自同一物种。其他细胞群体含有来自不同物种的细胞。用于建立转化的(转基因)细胞的转染方法是本领域熟知的。

在一个实施方案中，转化的细胞产生从植酸盐裂解磷酸根的肽或多肽。在一个实施方案中，转化的细胞产生在约70℃或更高的温度具有约50％或更高的活性的PV根植酸酶。在一些实施方案中，转化的细胞产生在大于约70℃的温度具有约100％的活性并且在约70℃和约100℃之间的温度具有约100％的活性的肽或多肽。在其他实施方案中，转化的细胞产生在大于约80℃的温度具有约90％的活性并且在约80℃和约100℃之间的温度具有大于约90％的活性的肽或多肽。在另外的实施方案中，转化的细胞产生在大于约90℃的温度具有约25％的活性的肽或多肽。在另一实施方案中，转化的细胞产生在约90℃和约100℃之间的温度具有大于约25％的活性的肽或多肽。

载体、多肽和微生物肥料

在一些实施方案中，如本文前述的一种载体或更多种载体用作肥料以提高植酸盐通过植物的利用。在一个实施方案中，将一种载体或更多种载体以任何合适的浓度与土壤混合。在另外的实施方案中，将一种载体或更多种载体与土壤中围绕植物根尖的土壤混合。

在其他实施方案中，如本文所描述的纯化的PV根植酸酶或分离的PV根的多肽用作肥料以提高植酸盐通过植物的利用。在一个实施方案中，将纯化的PV根植酸酶或分离的PV根的多肽以任何合适的浓度与土壤混合。在另外的实施方案中，将纯化的PV根植酸酶或分离的PV根的多肽与围绕植物根尖的土壤混合。

在另外的实施方案中，如本文前述的转化的细胞可以用作微生物肥料。在一些实施方案中，将转化的细胞包括在用作微生物肥料的组合物中。微生物肥料可以包括细胞群体，其中约1％至约100％、或约50％和约75％之间、或约75％和约100％之间的细胞被转化并包含前述的一种或更多种类型的载体。在一个实施方案中，转化的细胞含有载体，所述载体具有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有至少约90％、或约90％和约95％之间、或约95％和约100％之间的序列同一性的cDNA。

在一些实施方案中，细胞群体中的所有细胞用相同类型的载体或更多种载体转化。在其他实施方案中，一些细胞用与其他细胞不同的类型的载体或更多种载体转化，产生混合的细胞群体。微生物肥料中所用的细胞可以是任何合适的细胞，包括细菌、真菌、酵母细胞或植物细胞。微生物肥料可以以任何合适的浓度添加至土壤中。在一个实施方案中，将微生物肥料添加至土壤中围绕植物根尖的土壤。

纯化的重组PV根植酸酶

本公开内容还包括用作饲料添加剂或动物饲料补充物的纯化的重组PV根植酸酶。纯化的重组PV根植酸酶可从如前述的以及如以下进一步讨论的转化的细胞纯化得到。根据本公开内容制备的纯化的重组PV根植酸酶还可被进一步修饰以优化通过动物的利用。在一些实施方案中，纯化的重组PV根植酸酶具有与SEQ ID NO:3、9、11、13、15、17、19或21中任一项具有至少约90％、或约90％和约95％之间、或约95％和约100％之间的序列同一性的一级氨基酸序列。

在一个实施方案中，纯化的重组PV根植酸酶从植酸盐裂解磷酸根。在一个实施方案中，纯化的重组PV根植酸酶在约70℃或更高的温度具有约50％或更高的活性。在一些实施方案中，纯化的重组PV根植酸酶在大于约70℃的温度具有约100％的活性。在其他实施方案中，纯化的重组PV根植酸酶在约70℃和约100℃之间的温度具有约100％的活性。在另外的实施方案中，纯化的重组PV根植酸酶在大于约80℃的温度具有约90％的活性，并且在其他实施方案中，在约80℃和约100℃之间的温度具有大于约90％的活性。在另一个实施方案中，纯化的重组PV根植酸酶在大于约90℃的温度具有约25％的活性。在另外的实施方案中，纯化的重组PV根植酸酶在约90℃和约100℃之间的温度具有大于约25％的活性。

在一些实施方案中，纯化的重组PV根植酸酶被合适的包衣包被以优化稳定性、提高消化吸收率、或另外地优化在动物中的重组PV根植酸酶的活性。纯化的重组PV根植酸酶可以在碾磨过程期间的任何阶段添加到饲料中。含有纯化的重组PV根植酸酶的饲料然后可以被饲喂至动物。

在实施方案中，为了制备纯化的重组PV根植酸酶，将如本文所描述的具有编码重组PV根植酸酶的分离的核苷酸、cDNA和/或载体的转化的细胞在培养物中培养，并且培养物中产生的重组PV根植酸酶然后根据本领域通常已知的方法从细胞培养物组分中纯化。可以根据本领域已知的方法按比例调整并相应改变培养物，以制备任何规模的纯化的重组PV根植酸酶。

实施例

现在已大体上描述了本公开内容的实施方案，以下实施例描述本公开内容的一些另外的实施方案。尽管结合以下实施例以及相应的文字和附图描述本公开内容的实施方案，但不意图限制本公开内容的实施方案至本说明书。相反，意图覆盖在本公开内容的实施方案的精神和范围内包括的所有的替代形式、修改形式、以及等同物。

实施例1：根来源的PV植酸酶的克隆

材料和方法

从新鲜的蜈蚣草根尖提取总RNA，所述蜈蚣草生长在用植酸替代可溶性磷酸盐的营养液中。使用Spectrum^TM植物总RNA试剂盒(Spectrum^TM Plant Total RNA Kit；Sigma-Aldrich)分离总RNA。使用2Step RT-PCR试剂盒(Qiagen)合成cDNA。使用以下引物通过PCR从cDNA扩增编码植酸酶的DNA：简并正向引物(degenerate forward primer)5’-GGN GAYYTI GGN CAR AC-3’(P1)(SEQ ID NO:24)和反向引物5’-TGC CAI SWC CAR TGN GCR TG-3’(P2)(SEQ ID NO:25)，所述引物是从江南卷柏(Selaginella moellendorffii)(NCBI登录号XP_002981872.1)与其他充分表征的植物植酸酶的高序列同源性的区域设计的。

逆转录的反应体系包括4μL的RT缓冲液(Qiagen)、2μL dNTP(10mM)、1μL Oligo-dT(20μM)、0.2μL RNA酶抑制剂、1μL逆转录酶、2μg的模板RNA、以及不含RNA酶的水，终体积为20μL。在42℃孵育样品90分钟，然后在85℃孵育样品5分钟使酶失活。

PCR扩增反应体系含有具有Mg²⁺的5μL PCR缓冲液(Qiagen)、2.5μL dNTP(10mM)、1μL的正向和反向引物(0.4uM)、0.4μl PCR酶混合物、3μL的模板cDNA、以及不含RNA酶的水，终体积为50μL。将样品放置在具有以下条件的PCR循环仪(Thermo-Scientific)中：在95℃预变性5分钟、在95℃变性0.25分钟、在56℃退火0.5分钟、在72℃延伸2分钟，在72℃最终延伸5分钟。将样品在0.8％的琼脂糖凝胶上运行，切下单独的条带用于使用DNA Clean andConcentrator Kit(Zymo)的DNA纯化。将样品送至位于佛罗里达大学的生物技术研究跨学科中心(Interdisciplinary Center for Biotechnology Research；ICBR)进行Sanger分析以确定核苷酸序列。使用NCBI BLAST中的核苷酸查询，扩增的序列包含与>50个植物植酸酶的>70％的同源性。

蜈蚣草序列的5’和3’端的扩增使用第二代5’/3’RACE试剂盒(5’/3’RACE kit,2^ndGeneration；Roche)进行。引物从以下部分序列得来：正向引物5’-CCT TGG CAA GCT CAAGAC CA-3’(P3)(SEQ ID NO:26)、反向引物5’-ATG GAC ATG GCC AGC AAA CA-3’(P4)(SEQID NO:27)和反向引物5’-GCC AAA TCA GCC AGA AGC CA-3’(P5)(SEQ ID NO:28)。为了鉴定3’端，通过添加4μL的cDNA合成缓冲液(Roche)、2μL dNTP(10mM)、1μL Oligo-dT-锚定引物(Roche)、1μL逆转录酶、2μg的模板RNA和不含RNA酶的水至终体积20μL，进行第一链cDNA合成。将样品在55℃孵育60分钟，然后在85℃孵育5分钟使酶失活。然后，将1μL的cDNA产物与以下组合：1μL的PCR锚定引物、1μL dNTP(10mM)、1μL的引物P3、0.75μl高保真酶混合物(Expand high fidelity enzyme mix)、具有15mM MgCl₂的5μl高保真缓冲液(Expand highfidelity buffer)以及不含RNA酶的水，至终体积50μL。将样品放置在具有以下条件的PCR循环仪(Thermo-Scientific)中：在95℃预变性5分钟、在95℃变性0.25分钟、在60℃退火0.5分钟、在72℃延伸2分钟，在72℃最终延伸5分钟。将样品在0.8％的琼脂糖凝胶上运行，切下单独的条带用于使用DNA Clean and Concentrator Kit(Zymo)的DNA纯化。将样品送至位于佛罗里达大学的生物技术研究跨学科中心(ICBR)进行Sanger分析以确定核苷酸序列。使用NCBI BLAST中的核苷酸查询，扩增的序列包含与>50个植物植酸酶的>70％的同源性。为了鉴定5’端，通过添加4μL的cDNA合成缓冲液(Roche)、2μL dNTP(10mM)、1μL引物P4、1μL逆转录酶、2μg的模板RNA和不含RNA酶的水至终体积20μL进行第一链cDNA合成。将样品在55℃孵育60分钟，然后在85℃孵育5分钟使酶失活。样品使用DNA Clean and ConcentratorKit(Zymo)纯化。cDNA样品的Poly(A)加尾通过以下实现：将19μL的cDNA样品、2.5μL的反应缓冲液(Roche)、2.5μL dATP(2mM)组合，并在94℃孵育3分钟，然后在冰上冷却。然后，添加1μL的末端转移酶，并将样品在37℃孵育30分钟以及在70℃孵育10分钟。

然后，将5μL的dA-加尾的cDNA产物与以下组合：1μL的Oligo dT-锚定引物(Roche)、1μL dNTP、1μL的引物P5、0.75μl高保真酶混合物、具有15mM MgCl₂的5μl高保真缓冲液以及不含RNA酶的水，至终体积50μL。将样品放置在具有以下条件的PCR循环仪(Thermo-Scientific)中：在95℃预变性5分钟，然后是在95℃变性0.25分钟、在60℃退火0.5分钟、在72℃延伸2分钟的25个循环，以及在72℃最终延伸5分钟。将样品在0.8％的琼脂糖凝胶上运行，切下单独的条带用于使用DNA Clean and Concentrator Kit(Zymo)的DNA纯化。将样品送至位于佛罗里达大学的生物技术研究跨学科中心(ICBR)进行Sanger分析以确定核苷酸序列。使用NCBI BLAST中的核苷酸查询，扩增的序列包含与>50个植物植酸酶的>70％的同源性。3’和5’区域的重叠区域确定含有>99％的序列同源性。使用生物信息学软件ExPASy和NCBI BLAST中的tblastx将该序列翻译为氨基酸序列。使用NCBI B通过将氨基酸序列与其他植物植酸酶比较确定cDNA区域。使用NCBI BLAST中的蛋白质查询，扩增的序列包含与>50个植物植酸酶的>70％的同源性。

结果：

PV根植酸酶cDNA(SEQ ID NO:2)与大豆(Glycine Max)克隆GMPhy03mRNA(>gb|GQ422771.1)(其对应于cDNA SEQ ID NO:4)具有66％的序列同一性，查询覆盖率为79％。PV根植酸酶cDNA与紫色酸性磷酸酶(蒺藜苜蓿)mRNA(MTR_5g092360)(其对应于SEQ ID NO:6)具有66％的序列同一性，查询覆盖率为72％。PV根植酸酶的氨基酸序列与紫色酸性磷酸酶多肽的氨基酸序列(蒺藜苜蓿)(SEQ ID NO:7)(>gb|AES70308.1)具有60％的序列同一性，查询覆盖率为85％。PV根植酸酶的氨基酸序列与紫色酸性磷酸酶多肽的氨基酸序列(大豆)(>gb|ADM32490.1)(SEQ ID NO:5)具有60％的序列同一性，查询覆盖率为92％。查询覆盖率是与目的序列重复的查询序列的百分比。

实施例2：根来源的植酸酶对砷的耐受性

方法：

酶的收集.将来自蜈蚣草(PV)和剑叶凤尾蕨(PE)的根组织在10mM Ca(NO₃)₂中冲洗并吸干、称重，并与含有1mM EDTA、1mM DTT(二硫苏糖醇)、0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)、和4％PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮)的10mM乙酸盐缓冲液(pH 5.0)混合(1:2w/v)。将样品用Magic搅拌器(四次15秒脉冲)均质化，使其通过粗棉布(cheesecloth)，并以10,000g离心15分钟。使上清液经受硫酸铵分级分离，以20％的间隔从0-80％的级分收集沉淀物，随后在Sephadex G-25上凝胶过滤，Sephadex G-25用10mM乙酸盐缓冲液(pH5.0)预平衡。从40天龄的PV孢子体的培养物中收集根分泌物(root exudate)，根据前述的纯化步骤分析酶的活性。

植酸酶和磷酸酶测定.使用Bradford法(Walker等人，The Bradford Method forProtein Quantitation.In The Protein Protocols Handbook；Humana Press,2002；pp.15-21)相对于牛血清白蛋白(BSA)标准品测量蛋白质含量。将～100μg蛋白质在37℃在含有5mM植酸盐或5mM pNPP(p-硝基苯基磷酸二钠盐；Sigma)的1mL的10mM乙酸盐缓冲液(pH5.0)中孵育，分别分析植酸酶和磷酸酶的酶活性。在120分钟(植酸酶)后用等体积的10％(wt/v)三氯乙酸或是在30分钟(磷酸酶)后用等体积的25mM NaOH终止反应。比活性计算为孵育和未孵育的提取物中P_i或pNP浓度之间的差异，表示为每分钟每mg蛋白质释放的nmolP_i或pNP。添加显色试剂之后在固定时间(20分钟)使用钼蓝反应在880nm处通过分光光度法测量磷酸盐(Carvalho等人，Ecotoxicol.Environ.Saf.1998,1:13-19)。磷酸酶活性通过测量相对于标准溶液的在405nm处的吸光度从pNP的释放确定。

砷和磷分析.将PV和PE组织在60℃干燥96小时，称重并研磨通过2-mm网筛。使样品(0.1克)经受热块消化(USEPA Method 3051)并使用石墨炉原子吸收光谱法(GFAAS，VarianAA240Z，Walnut Creek，CA)分析总As。使用前面提到的钼蓝方法计算总P。为了在使用钼蓝方法时防止砷酸盐干扰，将样品与300μL 5％的半胱氨酸一起在80℃孵育5分钟以将砷酸盐还原为亚砷酸盐。同上。

植酸酶的砷耐受性.植酸酶和磷酸酶的砷耐受性通过在砷酸盐的存在下进行前述的测定来分析。除了5mM P₆或pNPP之外，将PV、PE的植物提取物以及纯化的小麦植酸酶(WP)与0、0.5、2、2.5和5mM砷酸盐一起孵育。

统计分析.数据表示为所有重复的平均值，并且误差棒表示平均值任一侧的一个标准误差。通过使用单因素方差分析(ANOVA)和以p<0.05通过邓肯多重范围检验(Duncan’smultiple range test)(PRO,Version 10.SAS Institute Inc.,Cary,NC,1989-2010)比较的处理平均值确定显著差异。

结果

图1A和1B示出了砷酸盐对来自PV、PE的根提取物以及WP中的植酸酶(图1A)和磷酸酶(图1B)活性的影响。PV植酸酶的部分纯化极大地提高了其酶活性。粗制蛋白质中PV活性为2.6nmol P_i和8.6nmol pNP mg^-1蛋白质min^-1。硫酸铵沉淀、随后凝胶过滤将活性提高了9至26倍。最高程度的纯化与20-40％的硫酸铵级分相关(68nmol P_i和181nmol pNP mg^-1蛋白质min^-1)，用其来评价As耐受性。

植酸酶和磷酸酶活性在递增浓度的砷酸盐(0-5mM)的存在下，通过用PV、PE的提取物和粗制小麦植酸酶水解产生P_i和pNP来测量。在缓冲至pH 5.0的5mM植酸盐或pNPP悬浮液情况下，PV、PE和WP对于植酸酶的酶活性分别为46.7、42.7和51.8nmol P_i mg^-1蛋白质min^-1，并且对于磷酸酶的酶活性分别为79.5、149和163nmol pNP mg^-1蛋白质min^-1(图1A和1B)。在多至2mM的砷酸盐下PV提取物中植酸酶的活性没有受到影响(46.7至46.1nmol P_i mg^-1蛋白质min^-1)，在砷酸盐浓度为2.5mM以上时活性略有下降(～41.1nmol P_i mg^-1蛋白质min^-1)，其与对照没有显著差异(p<0.05；图1A)。然而，来自部分纯化的PE和小麦提取物的植酸酶活性在添加0.5mM砷酸盐的情况下表现出显著的下降，随着砷酸盐浓度升高直线下降(～50％、43％、34％和24％下降)(图1A)。部分纯化是通过硫酸铵沉淀、然后交联葡聚糖过滤进行的。在5mM时，它们的活性是对照的～25％。在来自PV、PE提取物中和粗制小麦提取物中的磷酸酶活性类似地受到砷酸盐的影响，在0.5mM As时显著下降，在5mM As时降低至对照的36-45％(图1B)。

砷酸盐干扰酶的功能，包括植酸酶(Zhao等人，New Phytologist.2008,181:777-794)。砷酸盐和磷酸盐共享的同源性允许竞争性抑制，这得到了PE和小麦植酸酶的活性随着砷酸盐增加而下降的支持(图1A)。然而，PV植酸酶的活性并没有受到砷酸盐的影响，这可能是由于催化结合位点的改变。这些结果表明根来源的PV植酸酶可耐受其他植酸酶抑制剂，诸如其他重金属。

实施例3：根来源的PV植酸酶的热稳定性

材料和方法

按照实施例2中所述的进行酶的收集、植酸酶测定、磷酸酶测定和统计分析。通过在40℃、60℃、80℃和100℃的水浴中预孵育酶提取物10分钟确定酶活性的热稳定性。

结果

图2A和2B示出了温度对根来源的PV植酸酶(图2A)或根来源的磷酸酶(图2B)的影响。PV植酸酶的部分纯化极大地提高了其酶活性。粗制蛋白质中PV活性为2.6nmol P_i和8.6nmol pNP mg^-1蛋白质min^-1。硫酸铵沉淀、随后凝胶过滤将活性提高了9至26倍。最高程度的纯化与20-40％的硫酸铵级分相关(68nmol P_i和181nmol pNP mg^-1蛋白质min^-1)，用其来评价热稳定性。与在60℃失去显著活性、在100℃降至0的PE和WP相比，PV提取物的植酸酶活性不受所有热处理的影响(p<0.05)(图2A)。出乎意料地，PV植酸酶的热稳定性在植物中是前所未有的。在100℃预处理10分钟后，100％的PV植酸酶活性被保留(图2A)。与植酸酶不同，来自所有三种植物的酶提取物的磷酸酶活性随着温度升高以类似的速率降低(图2B)。

实施例4:植酸酶和磷酸酶在蜈蚣草和剑叶凤尾蕨中的组织分布。

材料和方法

水培植物培养.将两个月龄的蕨类植物蜈蚣草(PV)和剑叶凤尾蕨(PE；非As-超富集植物)在0.2×强度Hoagland-Arnon营养液(HNS)中水培三周。将植物用去离子(DI)水冲洗，并转移至具有0或210μM P_i(KH₂PO₄)以及0或267μM As(Na₂HAsO₄·2H₂O)的500mL 0.2×修改的HNS中持续3天。处理被称为对照(无P)、P_i、As和P_i+As，并且重复四次。

酶的收集、植酸酶测定、磷酸酶测定和统计分析按照实施例2中所描述的进行。

结果

图6示出了在磷酸盐和砷酸盐中处理3天后，PV和PE的叶和根茎中磷酸酶和植酸酶的活性。图7示出了在磷酸盐和砷酸盐中处理3天后，PV和PE的根组织中磷酸酶和植酸酶的活性。在移植到具有P_i、砷酸盐或两者皆有的培养基中72小时后，PV和PE未示出毒性症状，并且在所有组织中检测到磷酸酶和植酸酶活性。在所有处理中，在PE的所有组织中的磷酸酶的活性比PV中的高得多，在叶中具有最大差异(85-198倍)(图3)。与磷酸酶不同，在所有处理中PV中的植酸酶活性普遍更高，表明这两个物种之间的固有差异。

在PV和PE二者的叶或根茎中，P_i或As处理对酶活性均不具有显著影响(图6)。然而，在根提取物中，酶活性响应某些处理。P_i的去除是用于在根中提高磷酸酶和植酸酶活性的最有效的处理。然而，As的添加取消了PV根植酸酶活性中的该响应，将活性从19.7nmolP_i mg^-1蛋白质min^-1显著降低至6.1nmol P_i mg^-1蛋白质min^-1(图4)。

在P限制期间，植物提高了其内部磷酸酶和植酸酶的产生以维持P_i水平(Sanchez-Calderon,L.等人Phosphosrus:Plant Strategies to Cope with its Scarcity.In CellBiology of Metals and Nutrients.2010,p 173-198)。当在As的存在下生长时，由于砷酸盐与P_i竞争摄取并扰乱了涉及磷酸化和磷酸盐信号传导通路的过程，植物通显示出P缺乏的症状(Abercrombie,J.,等人BCM Plant Biol.2008,8:87)。在PE根组织中观察到植酸酶和磷酸酶活性的该响应，所述植酸酶和磷酸酶活性在P_i缺乏或As存在的情况下显著升高(p<0.05；图4)。

出乎意料的是，在PV根提取物中并非如此，其不响应于As处理。由于砷酸盐是磷酸盐类似物，PV根可能不区分它们。相反，代谢和调控系统由于P_i的丰富供给可能已经感知到有毒类金属(metalloid)，抑制了植酸酶产生的上调。

叶和根茎组织中的酶活性没有受到处理的影响，可能是由于3天的孵育期不足以引起足够的P缺乏响应。此外，剑叶凤尾蕨未将As转移至根茎和叶中。可选地，在这两种蕨类植物中的酶活性可与从土壤获得P_i相关，而不与内部P内稳态相关，这可以解释为什么在叶和根茎组织中未观察到活性响应(图3)。考虑到与根来源的PV植酸酶相比，叶来源的植酸酶的低活性，可能的是这些植酸酶彼此不同。

实施例5:蜈蚣草在用砷和植酸盐修改的培养基上的生长

引言

为了评价PV利用植酸盐作为单一P源的能力，将在用0.6mM P_i和/或植酸盐(P₆)修改的具有和不具有0.6mM砷酸盐(P_i+As，P₆+As和P_i+P₆+As)的修改的MS培养基上的PV生长与具有已知植酸酶活性的三种被子植物(莴苣、地三叶草和北葱)以及两种蕨类植物(剑叶凤尾蕨和T.kunthii)进行比较。

材料和方法

幼苗和配子体培养.将来自莴苣、地三叶草和北葱的种子、以及来自PE、Thelypteris kunthii和PV的孢子在20％漂白剂溶液中持续20分钟进行表面灭菌，然后在无菌DI水中洗涤3次。将孢子悬浮于2mL无菌DI水中。用不含P的0.8％的琼脂制备半强度修改的Murashige&Skoog(MS)培养基，然后高压灭菌。将磷酸盐、植酸盐和砷酸盐溶液进行过滤灭菌，并添加到经高压灭菌的MS培养基以得到作为P_i或植酸盐(P₆；肌醇六磷酸十二钠盐)的0.6mM终浓度的P以及0或0.6mM砷酸盐。然后将MS培养基(pH 6.5)倒入无菌培养皿(100mm×13mm)中。将种子和孢子(10μL或0.05mg孢子)放置在琼脂(每板5个，每个处理4块板)上，在冷/暖荧光灯下在25℃和60％的湿度条件下针对种子植物和蕨类植物分别持续15天和40天。在对于被子植物使植物生长15天和对于蕨类植物使植物生长40天后确定鲜重。

统计分析按照实施例2中所描述的进行。

结果

图5示出了植物(莴苣、北葱、地三叶草、剑叶凤尾蕨、T.kunthii和蜈蚣草)在生长15天或40天时的鲜重。图6示出了在经修改的培养基中在15天(莴苣和地三叶草)或40天(PV和PE)的植物生长。在用0.6mMP_i修改的经修改的MS培养基上生长的种子的萌发率为至少90％并且蕨类植物孢子的萌发率为100％。与P_i处理相比，在P₆-修改的培养基上生长的所有三种被子植物中，其生物量的产生显著减少(2.1-3.3倍)(图5)。两种比较性蕨类植物孢子(PE和T.kunthii)萌发，但是不能够使用P₆生长。然而，在用P_i+P₆修改的培养基上所有植物的生长等同于P_i处理(p<0.05)，证明P₆的存在对生长没有负面影响。

蜈蚣草是唯一有效利用P₆的植物，保持了生物量等同于P_i处理(p<0.05)，并且其在0.6mM As的存在下在萌发后仍然存活(图5)。与P_i处理相比，在P_i+As上的PV生长显著增加(115至225mg)，而含有P₆的所有处理保持等同(p<0.05；图5)。

考虑到PV根中高植酸酶酶促活性，尤其是在P_i限制条件下，我们研究了PV孢子是否能够在用P₆作为唯一P源的修改的无菌培养基上生长。由于底物可用性和酶活性限制，植酸盐已被显示是用于植物的差的P源(George,T.,等人Plant Cell Environ.M2004,27:1351-1361以及Hayes,J.,等人Plant Soil.2000,165-174)。对于PV而言，情况并非如此，其在具有等同的总P的P_i或P₆上生长40天后生长一样良好(p<0.05)。此外，在所有处理上生长40天后，PV配子体产生孢子体组织(图7)，显示植酸盐利用并不限于单倍体生长阶段。大多数植物缺乏获得外部植酸盐的能力，原因是它们的植酸酶局限在内胚层区域(Hayes,J.等人Aust.J.Plant Physiol.1999.26:801-806)，这得到以下事实的支持：我们的实验中其他植物在植酸盐处理中产生与不含P的对照相当的生物量(p<0.05)(图5)。尽管地三叶草和莴苣已被显示在P限制和其他应激环境中提高根的植酸酶活性(同上和Nasri,N.,等人ActaPhysiol.Plant.2010,33:935-942)，在我们的实验中它们不能够水解足量的植酸盐以维持生长。PV使用植酸盐作为唯一P_i源生长的能力，以及在两种其他蕨类植物中缺乏生长表明，植酸盐利用是仅在某些蕨类植物类群中特定进化的适应特性。

在本实施例中，PV是唯一在0.6mM砷酸盐的存在下在萌发后存活的植物，所述砷酸盐取决于P源影响PV生物量和总P浓度。在生长40天后，在P_i+As琼脂上生长的PV比所有其他处理大～2倍(p<0.05；图5)。尽管具有最大的生物量，来自P_i+As琼脂的PV组织具有最低的P浓度，这与之前的发现结果一致，即砷酸盐刺激生长并与P_i竞争摄取(Gumaelius,L.,等人Plant Physiol.2004,136:3198-3208)。

实施例6:蜈蚣草配子体响应低可用的磷和砷增加摄取磷和砷

材料和方法

幼苗和配子体培养按照实施例5中所描述的。统计分析按照实施例2中所描述的进行。

结果

图11列出了在具有0.6mM P_i、P₆和/或As的MS培养基上生长40天的PV配子体中的总P和As。在P_i处理中，平均P浓度为2,208mg kg^-1，相比之下，在P₆处理中平均P浓度为2,351mgkg^-1，它们之间没有显著差异，表明PV配子体容易从植酸盐中水解并积累磷。在P_i+As处理中，总P和As组织浓度分别为1,579和1,777mg kg^-1或51和24mmol kg^-1(图8)。与P_i+As处理相比，来自P₆+As处理的组织中P和As的浓度都显著增加，其为2,672mg kg^-1和2,630mg kg^-1(p<0.05)。这表明，P₆与As联合中的低可用的P促进了P转运子(transporter)的上调，帮助P和As两者的摄取。

与实施例5相比，砷酸盐对在植酸盐条件下生长的配子体具有相反的作用，将生物量降低至低于P_i对照同时显著增加总P(p<0.05；图8)。与PV根组织中缺乏植酸酶响应类似(图4)，生长培养基中砷酸盐的存在可被PV配子体感知为P_i(由于其同源性)，延迟了有利于植酸盐水解的转录、生理和形态学响应。

虽然生长被减慢，与P_i+As处理相比，来自P₆+As培养基的组织具有显著更高的P和As浓度(p<0.05；图8)。因此，在具有P_o的As污染的土壤上生长时，维持低可溶性P_i能够促进As的摄取，提高PV的修复能力。这也具有例如在植物修复期间除去对P肥的需要的附加的益处。应当指出的是，在生长80天后，在P₆+As处理上的PV的初始缓慢生长减轻，实现等同于P_i处理的重量。

实施例7:蜈蚣草根分泌物中植酸酶的活性

考虑到PV有效地利用P₆作为唯一的P源用于生长，评价响应P/As应激和P₆的来自配子体根分泌物的植酸酶活性。

材料和方法

幼苗和配子体培养按照实施例5中所描述的。

组织收集和酶测定.从40天龄的PV孢子体的培养基收集根分泌物。使根分泌物经受硫酸铵分级分离，以20％的间隔从0％至80％的级分收集沉淀物，随后在Sephadex G-25上凝胶过滤，Sephadex G-25用10mM乙酸盐缓冲液(pH5.0)预平衡。磷酸酶和植酸酶活性按照实施例2中所描述的确定。

统计分析按照实施例2中所描述的进行。

结果

图9A-9B示出了植酸盐对蜈蚣草根分泌物(图9A)和配子体(图9B)中植酸酶活性的影响。从P₆处理收集的分泌物表现出最高的植酸酶活性。然而，来自所有处理的酶活性与P_i对照没有显著差异(图9A和9B)。与根组织中的植酸酶活性相比(5.1至20nmol P_i mg^-1蛋白质min^-1；图7)，在根分泌物中的那些是相当的或更高(9.3至19nmol P_i mg^-1蛋白质min^-1)，表明在根分泌物中的植酸酶可能是P获取的原因。同样，与P_i处理(对于P_i、P_i+As和P_i+P₆分别为1.0、1.1和1.0mg蛋白质g^-1组织)相比，来自P₆和P₆+As的分泌物的总蛋白质含量增加(2.2和2.0mg蛋白质g^-1组织)。然而，由于我们使用部分纯化的提取物，难以确定蛋白质含量的多少百分比是由植酸酶组成的。无论如何，如图11中所示的，在低P环境(P₆)中,蛋白质分泌增加。

来自在植酸盐的情况下生长的组织的植酸酶活性表现出最高的植酸酶活性，相比之下，P_i+As处理相比具有最低的植酸酶活性(图9B)。在配子体根分泌物中，植酸酶活性比配子体组织大～3倍，再次表明在内部再动员期间它们在P获取中的作用。在配子体根分泌物中的植酸酶活性与从孢子体根分泌物收集的活性是相当的(p<0.05)，表明如图15中所示出的，P获取通路存在于PV的两个生殖生长阶段。

在P₆处理中相关活性是最高的，尽管与P_i处理没有显著差异。因此，PV配子体中植酸酶的产生和分泌显示为是组成型的，与P_i的可用性无关。然而，在P₆和P₆+As处理的分泌物中总蛋白质含量是P_i处理中的两倍，表明PV通过增加总酶分泌响应低可用的P环境。

实施例8:根来源的蜈蚣草植酸酶的活性未被土壤钝化。

根分泌物中的大部分植酸酶被土壤钝化。如此，土壤对PV植酸酶活性的影响通过测量离心后溶液中P_i从植酸盐的水解的速率来分析。水解的P_i的量表示未被土壤基质吸附的植酸酶。为了比较分析，酶样品在不含土壤下孵育(对照)，并且将土壤样品与非酶促蛋白质(牛血清白蛋白(BSA))混合，以评价从蛋白质-土壤相互作用释放的残余土壤P_i。

材料和方法

简言之，将2.0g空气干燥的土壤与DI水和酶提取物(或BSA，作为阴性对照)混合得到20mL的体积，其中每ml含有50μg蛋白质。在室温将样品放置在旋转振荡器(150rpm)上。按照实施例3中所描述的从根组织制备酶提取物。使用具有宽开口的移液管尖将充分混合的土壤浆液的等分试样(250μL)移出，并在7,500g下离心5分钟，2小时后使用上清液(250μL)测量植酸酶活性。按照实施例2中所描述的确定植酸酶活性。在6、12和24小时后进行另外的PV植酸酶活性测量。根据植物酶介导的P_i释放和BSA土壤悬浮液中P_i的量的差异得出活性。按照实施例2中所描述的进行统计分析。

结果

图10A和10B示出了与来自PV、PE的根来源的酶提取物或WP混合2小时后，土壤悬浮液中剩余的植酸酶活性，以及在24小时的时期内PV提取物对土壤的响应(图10B)。将来自PV、PE的根提取物和小麦植酸酶与三种土壤混合。土壤1为含有2％OM的酸性(pH 5.6)砂质土，具有4.2cmol⁺kg^-1的阳离子交换能力(CEC)。土壤2为具有0.8％OM和12.4cmol⁺kg^-1的CEC的酸性(pH 5.8)壤质土。土壤3为具有0.4％OM和24.8cmol⁺kg^-1的CEC的中性(pH＝6.5)粘土。整个实验期间，与BSA混合的土壤溶液没有可测量的P_i，表明P_i或天然酶的解吸附对结果没有可辨别的影响。

在不存在土壤的情况下，PV、PE和小麦的初始植酸酶活性平均为26、17和19nmolP_i mg^-1蛋白质min^-1。与土壤混合2小时后，PV植酸酶未受到显著影响，在土壤1、2和3中分别保留其活性的94％、93％和98％。相比之下，在所有土壤中在2小时后，PE和小麦保留～6％的活性，其与零无显著差异(p<0.05；图7A)。6小时后，对照中的PV活性下降25％，其在24小时期间稳定在该处，平均为～20nmol P_i mg^-1蛋白质min^-1(图10B)。对在三种土壤中混合的PV提取物观察到相似的趋势，在6小时和24小时之间土壤1、2和3分别保留对照活性的77％、86％和97％。与对照相比，土壤3的添加对PV植酸酶活性没有影响(p<0.05)。相比之下，对照以及土壤1和2之间略有差别，尽管其为<23％，代表在6小时和24小时之间的下降(p<0.05；图10B)。

虽然植物具有分泌植酸酶的能力，土壤中的吸附和沉淀反应限制了它们直接从土壤植酸盐获得P_i的能力(Brejnholt,S.M.,等人J.Sci.Food Agric.2011,91:1398-1405)。对于PV酶而言，情况并非如此，与PE和小麦提取物中>90％的减少相比，PV酶在与土壤混合2小时后保留其植酸酶活性的93-98％，进一步表明PV植酸酶的独特性质(图10A和10B)。在相似的土壤研究中，通常观察到在土壤添加的数分钟内植酸酶活性的对数下降(George,T.S.,等人Soil Biol.Biochem.2005,37:977-988)。混合24小时后，PV提取物保留其原始活性的～64％，这反映了无土壤对照中的下降。

通常情况下，具有更高粘土含量、有机质和阳离子/阴离子交换能力的土壤更迅速地抑制植酸酶活性(Rao,M.等人Soil Biol.Biochem.2000,32:1007-1014)。尽管土壤3具有最高的粘土含量和CEC，其并未有效地减少PV植酸酶活性(图10B)。土壤1和2具有更高的酸度和OM，这可能导致PV植酸酶活性中的略微下降。在正常情况下，植酸酶的吸附损害酶从植酸盐水解磷酸酯的能力，但是根来源的PV植酸酶即使在吸附于土壤颗粒时仍然保持为有活性的，如图13中所示，表明对植酸盐的高亲和力。由于很少有植物能够从土壤中的植酸盐直接获得P_i，这具有重大意义。因此，根来源的PV植酸酶不具有其他植物植酸酶的限制，即在分泌到土壤中之后被钝化(Richardson,A.E.等人Plant,Cell Environ.2000,23:397-405和Hayes,J.E.等人Aust.J.Plant Physiol.1999,26:801-809)。

实施例9:根来源的PV植酸酶具有为大约5的最佳pH。

材料和方法

为了测定PV植酸酶活性的最佳pH值，制备呈不同pH值的一系列5mM植酸盐溶液。测定缓冲液在50mM甘氨酸-HCl(pH 3)、乙酸(pH 4和5)、柠檬酸盐(pH 6)和tris(pH 7)中制备。在37℃进行孵育2小时。结果

如图14中所示，在pH>7的酶孵育导致PV提取物活性的丧失。

实施例10:

蜈蚣草蕨类植物在用植酸作为唯一P源的营养液中水培生长4周。切下活跃生长的根尖，在液氮中冷冻并储存在-80℃。使用Sigma植物RNA提取试剂盒，从根组织中提取RNA。将样品送至位于佛罗里达大学的生物技术研究跨学科中心。在那里，使用Illumina MiSeq产成cDNA文库。鉴定具有保守紫色酸性磷酸酶结构域的序列，并使用BLAST与已知紫色酸性磷酸酶进行比较。

定义

在描述本公开的主题方面，以下术语将根据以下陈述的定义被使用。

如本文所用的，“约(about)”、“大约(approximately)”等当与数值变量连用时，通常指该变量的值，并指在实验误差以内的(例如，在平均值的95％置信区间以内的)或是在所示值的.+-.10％以内的所有变量值，取较大者。

如本文所用的，“核酸”和“多核苷酸”通常指至少两个碱基-糖-磷酸酯(base-sugar-phosphate)组合的串，并且除了其他的以外指：单链和双链DNA、为单链和双链区域的混合物的DNA、单链和双链RNA、以及为单链和双链区域的混合物的RNA、含有DNA和RNA的杂合分子(可以是单链或更通常是双链、或单链和双链区域的混合物)。另外，如本文所用的多核苷酸指包含RNA、或DNA、或RNA和DNA二者的三链区。在这样的区域中的链可以来自相同的分子或来自不同分子。该区域可以包括一种或更多种分子的全部，但更通常地仅涉及某些分子的区域。具有三螺旋区域的分子之一常常是寡核苷酸。“多核苷酸”和“核酸”还包括多核苷酸的此类化学、酶促或代谢修饰的形式，以及病毒和细胞(尤其包括简单和复杂细胞)特征性的DNA和RNA的化学形式。例如，术语多核苷酸包括如上所描述的含有一个或更多个修饰的碱基的DNA或RNA。因此，包含稀有碱基诸如肌苷或经修饰的碱基诸如三苯甲基化的碱基(仅举两个例子)的DNA或RNA也是如本文所用的术语多核苷酸。“多核苷酸”和“核酸”还包括PNA(肽核酸)、硫代磷酸酯、以及具有天然核酸的磷酸酯主链的其他变体。天然核酸具有磷酸酯主链，人工核酸可以包含其他类型的主链，但包含相同的碱基。因此，具有为了稳定性或为了其他原因修饰的主链的DNA或RNA为如本文意图包含的术语“核酸”或“多核苷酸”。

如本文所用的，“脱氧核糖核酸(DNA)”和“核糖核酸(RNA)”通常指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可为未经修饰的RNA或DNA、或经修饰的RNA或DNA。RNA可以呈tRNA(转移RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA、RNAi(RNA干扰构建体)、siRNA(短干扰RNA)或核酶的形式。

如本文所用的，“核酸序列”和“寡核苷酸”还包括如上所定义的核酸和多核苷酸。

如本文所用的，“脱氧核糖核酸(DNA)”和“核糖核酸(RNA)”通常指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可为未经修饰的RNA或DNA、或经修饰的RNA或DNA。RNA可以呈tRNA(转移RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA、RNAi(RNA干扰构建体)、siRNA(短干扰RNA)或核酶的形式。

如本文所用的，“基因”指的是对应于DNA序列的遗传单位，其在染色体上占据特定位置并包含生物体的特征或性状的遗传指令。

如本文所用的，“基因座”指的是给定基因或其部分在给定物种的染色体上占据的位置。

如本文所用的，“等位基因”是指基因的一种或更多种可选形式中的任一形式，其中等位基因涉及至少一个性状或特征。在二倍体细胞或生物体中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体的相应基因座。

术语“杂合的”是指一种遗传状况，其中生物体或细胞在同源染色体的相应基因座处具有不同的等位基因。

如本文所用的，“纯合的”是指一种遗传状况，其中生物体或细胞在同源染色体的相应基因座处具有相同的等位基因。

如本文所用的，术语“外源DNA”或“外源核酸序列”或“外源多核苷酸”指的是通过转染引入到细胞、生物体、或细胞器中的核酸序列。外源核酸源自外部来源，例如，外源核酸可以源自另一细胞或生物体，和/或可以是合成的和/或重组的。尽管外源核酸有时源自不同生物体或物种，它也可以源自相同物种(例如，除了天然存在的核酸之外或是作为用于天然存在的核酸的替代物引入到细胞或生物体中的另外的拷贝或重组形式的核酸)。通常，引入的外源序列是重组序列。

如本文所用的，术语“重组”通常是指非天然存在的核酸、核酸构建体、或多肽。这样的非天然存在的核酸可包含经修饰的天然核酸，例如具有缺失、置换、倒位、插入等的天然核酸，和/或使用分子生物学技术连接在一起的不同起源的核酸序列的组合(例如，编码“融合蛋白”(例如，从两种不同蛋白质或蛋白质片段的组合形成的蛋白质或多肽)的核酸序列；编码多肽的核酸与启动子序列的组合，其中编码序列和启动子序列来自不同来源或否则在自然情况下通常不会一起存在(例如，核酸和组成型启动子)等)。重组还指由重组核酸编码的多肽。非天然存在的核酸或多肽包括由人修饰的核酸和多肽。

如本文所用的，术语“转染”是指将外源和/或重组核酸序列引入活细胞的膜封闭空间的内部，包括将核酸序列引入细胞的细胞溶胶以及线粒体、细胞核或叶绿体的内部空间。核酸可以呈裸露的DNA或RNA的形式，它可以与各种蛋白质或调控元件(例如，启动子和/或信号元件)缔合，或核酸可以掺入载体或染色体中。

如本文所用的，“转化(transformation)”或“转化的(transformed)”是指将核酸(例如，DNA或RNA)引入细胞中，以这样的方式以允许所引入的核酸的编码部分的表达。

如本文所用的，“转化的细胞”是转染了核酸序列的细胞。

如本文所用的，“转基因”是指用于转化生物体的细胞的人工基因，所述生物体诸如细菌或植物。

如本文所用的，“转基因的”是指含有转基因的细胞、组织、或生物体。

如本文所用的，“多肽”或“蛋白质”是指氨基酸残基序列。这些序列以从氨基端到羧基端的方向从左到右书写。按照标准命名法，氨基酸残基序列通过如下示出的三字母或单字母代码表示：丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)，脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。

如本文所用的，“肽”是指具有至少2个氨基酸的相对于蛋白质或多肽短的链。

如本文所用的，“变体”是指与参考多肽(reference polypeptide)不同但保留基本特性的多肽。典型的多肽变体的氨基酸序列与另一多肽，参考多肽不同。通常，差异是有限的，使得参考多肽和变体的序列总体上非常相似并且在许多区域是相同的。变体和参考多肽可在氨基酸序列上由于一个或更多个修饰(例如，置换、添加和/或缺失)而不同。置换或插入的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基。多肽的变体可以是天然存在的，诸如等位基因变体，或者它可以是未被已知为天然存在的变体。

如本文所用的，“功能变体”是指蛋白质或多肽的变体(例如，PGR5蛋白质的变体)，所述变体可以执行与原始蛋白质或多肽相同的功能或活性，虽然不必须以同一水平(例如，变体可以具有提高的、降低的或改变的功能性，只要其保留了基本功能)。

如本文所用的，“同一性”是两个或更多个多肽序列之间的关系，如通过比较序列确定的。在本领域中，“同一性”也指多肽之间的序列相关性程度，如通过这些序列的字符串之间的匹配确定的。“同一性”可以容易地通过已知的方法来计算，包括但不限于，在以下中所描述的那些：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,Ed.,Oxford UniversityPress,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,Ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,Eds.,Humana Press,New Jersey,1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；以及SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,Eds.,M Stockton Press,New York,1991；以及Carillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.1988,48:1073。确定同一性的优选的方法被设计为给出在所测试的序列之间的最大匹配。确定同一性的方法被整理于公众可获得的计算机程序中。两个序列之间的同一性百分比可使用分析软件来确定(例如，Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group,MadisonWis.)，其并入了Needelman and Wunsch,(J.Mol.Biol.,1970,48:443-453,)算法(例如，NBLAST和XBLAST)。默认参数(default parameter)被用于确定本公开内容的多肽的同一性。

如本文所用的，“耐受(tolerant)”或“耐受性(tolerance)”是指植物完全地或在一定程度上克服环境应激或其他限制因子的不利影响的能力。

如本文所用的，如本文使用的“表达”描述了结构基因所经历的以产生多肽的过程。它是转录和翻译的组合。表达是指核酸的“表达”以产生RNA分子，但其指多肽的“表达”时表示该多肽通过相应的核酸的表达而产生。

如本文所用的，“过表达”和“上调”是指在基本上相似的条件下，编码多肽的核酸(例如，基因)在经转化的植物细胞中以比在“野生型”植物细胞(例如，未转染所述基因的基本上等同的细胞)中更高的水平表达(因此产生增加的量的由该基因编码的多肽)。

如本文所用的，“低表达”和“下调”是指多核苷酸(例如，基因)以比在野生型植物细胞中更低的水平表达(产生减少的量的由该多核苷酸编码的多肽)。

如本文所用的，“抑制(inhibit)”或“抑制(inhibiting)”基因的表达是指某物质(例如，反义核苷酸、抑制子、拮抗剂等)起作用以(完全或部分地)减少或防止转录、翻译和/或基因表达中的其他处理步骤，从而下调基因表达，使得与野生型相比，减少的量的由该基因编码的活性蛋白质产生。

如本文所用的，如本文使用的“质粒”指包括完整的“复制子”的非染色体双链DNA序列，使得该质粒在宿主细胞中复制。

如本文所用的，术语“载体(vector)”用于提及用来将外源核酸序列引入细胞中的媒介物。载体可以包括DNA分子，线性或环状(例如质粒)，其包括编码目的多肽的区段，所述区段可操作地连接到另外的区段，所述另外的区段在引入宿主细胞或宿主细胞细胞器中后提供所述区段的转录和翻译。这样的另外的区段可包括启动子和终止子序列，并且还可以包括一个或更多个复制起点、一个或更多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常来源于酵母或细菌基因组或质粒DNA、或病毒DNA、或可含有这两者的元件。

如本文所用的，“启动子”包括能够驱动编码序列转录的所有序列。特别地，如本文所用的术语“启动子”是指通常被描述为邻近起始密码子定位的基因的5'调控区域的DNA序列。相邻的编码序列的转录在启动子区域启动。术语“启动子”还包括在启动基因转录中有功能的启动子片段。

如本文所用的，“可操作地连接”表示将可用于表达核酸编码序列的调控序列放置在核酸分子中相对于所述编码序列的适当位置处，以产生编码序列的表达。该相同的定义有时应用于表达载体中编码序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)和/或选择标记的排布。

如本文所用的，“选择标记”是指其表达允许人们鉴定用含有标记基因的载体转化或转染的细胞的基因。例如，重组核酸可以包括可操作地连接到目的基因和启动子的选择标记，使得选择标记的表达指示用目的基因成功转化细胞。

如本文所用的，“组成型启动子”是允许其相关基因或多核苷酸的连续或遍在的转录的启动子。组成型启动子通常不受细胞或组织类型、时间或环境的调控。

如本文所用的，“诱导型启动子”是允许其相关基因或多核苷酸响应物质或化合物(例如，抗生素、或金属)、环境条件(例如温度)、发育阶段、或组织类型而转录的启动子。

如本文所用的，“野生型”是如其在自然界中存在的生物体、品种、品系、基因、蛋白质、或特征的典型形式，区别于可能由于选择性育种或用转基因转化得到的突变体形式。

如本文所用的，“电穿孔”是一种转化方法，其中将高浓度的质粒DNA(含有外源DNA)添加到宿主细胞原生质体的悬浮液中，并将该混合物用约200至600V/cm的电场电击。

如本文所用的，“分离的”是指从其中多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段在自然界中通常与其相关的成分、细胞等等中分离。在本公开内容的一个方面，分离的多核苷酸是从3'和5'连续核苷酸分离的，所述分离的多核苷酸在其天然或自然环境中(例如，在染色体上)通常与所述3'和5'连续核苷酸相关。如对本领域技术人员明显的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”以将其与其天然存在的对应物区分开来。此外，“浓缩的”、“分离的”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段，在以下方面与其天然存在的对应物可区别：每体积的分子浓度或数目大于(对于“浓缩的”)或小于(对于“分离的”)其天然存在的对应物的每体积的浓度或数目。在其一级序列或例如通过其糖基化模式与天然存在的对应物不同的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段，不需要以其分离的形式存在，因为其与其天然存在的对应物在其一级序列上或者可选地在另一特征诸如糖基化模式上可区分。虽然未明确陈述本文公开的每个实施方案，但应理解的是，本公开内容提供了关于如下公开的以及在合适的条件下的每个组合物的所有以上实施方案。因此，非天然存在的多核苷酸被提供为与分离的天然存在的多核苷酸不同的实施方案。细菌细胞中产生的蛋白质被提供为与天然存在的蛋白质不同的实施方案，所述天然存在的蛋白质是从其在自然界中在其中产生的真核细胞中分离的。

如本文所用的，“cDNA”是指在细胞中与RNA转录物互补的DNA序列。它是一种人造分子。通常，cDNA是使用RNA转录物作为模板通过称为逆转录酶的酶在体外制备而来。

如本文所用的，“纯化的”用于提及相对于自然环境具有增加的纯度的核酸序列、肽或多肽。

如本文所用的，“对照”是在实验中用于比较目的的可选受试者或样品，并且被包括以最小化或区分多个变量而不是一个独立变量的影响。“对照”可以是阳性的或阴性的。

如本文所用的，提及分子、化合物、或组合物包括但不限于化学化合物、多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段的量使用的“浓缩的”，表示样品与其天然存在的对应物在以下方面可区分：每体积的分子浓度或数目比其天然存在的对应物的每体积的浓度或数目大。

如本文所用的，提及分子、化合物、或组合物包括但不限于化学化合物、多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段的量使用的“稀释的”，表示样品与其天然存在的对应物在以下方面可区分：每体积的分子浓度或数目比其天然存在的对应物的每体积的浓度或数目小。

如本文所用的，“分离的”是指与原始来源或群体在物理上分开的状态，使得分离的化合物、试剂、颗粒、化学化合物、或分子可以不再被认为是原始来源或群体的部分。

如本文所用的，“合成的”是指通过发生在化合物可被天然发现的天然生物体之外并且与之独立的化学或生物合成方法制备的化合物。

Claims (63)

1.一种纯化的重组植酸酶，所述纯化的重组植酸酶具有与SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19或21中任一项具有约90％或更高的序列同一性的多肽序列。

2.如权利要求1所述的纯化的重组植酸酶，其中所述植酸酶催化磷酸根从植酸盐的释放。

3.如权利要求1或2所述的纯化的重组植酸酶，其中所述植酸酶在大于约70摄氏度的温度具有约50％或更高的活性。

4.一种用于在动物中提高植酸盐的利用的方法，所述方法包括将如权利要求1或2中所述的纯化的重组植酸酶添加至动物饲料。

5.如权利要求4所述的方法，其中在饲料制粒前将所述纯化的重组植酸酶添加至所述饲料。

6.一种动物饲料，所述动物饲料含有如权利要求1或2所述的纯化的重组植酸酶。

7.一种用于在动物中提高植酸盐的利用的方法，所述方法包括将如权利要求6所述的饲料饲喂至动物。

8.一种分离的多肽分子，所述分离的多肽分子包含蜈蚣草(Pteris vittata)根植酸酶多肽。

9.如权利要求8所述的分离的多肽分子，其中所述蜈蚣草根植酸酶多肽与SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19或21中任一项具有100％的序列同一性。

10.如权利要求8所述的分离的多肽，其中蜈蚣草根植酸酶多肽与SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19或21中任一项具有约90％或更高的序列同一性。

11.如权利要求8所述的分离的多肽，其中蜈蚣草根植酸酶多肽分子与SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19或21中任一项具有约70％或更高的序列同一性。

12.如权利要求8-11中任一项所述的分离的多肽，其中蜈蚣草根植酸酶多肽为在大于或等于70摄氏度的温度具有约50％或更高的活性的植酸酶。

13.一种cDNA分子，所述cDNA分子编码来自蜈蚣草根的植酸酶。

14.如权利要求13所述的cDNA分子，所述cDNA分子与SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18和20中任一项具有100％的序列同一性。

15.如权利要求13所述的cDNA分子，所述cDNA分子与SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18和20中任一项具有大于或等于约90％的序列同一性。

16.如权利要求14-15中任一项所述的cDNA分子，其中所述植酸酶在大于或等于约70摄氏度的温度具有大于或等于约50％的活性。

17.一种cDNA分子，所述cDNA分子编码与SEQ ID NO：3、9、11、13、15、17、19或21中任一项具有大于或等于约90％的序列同一性的多肽。

18.一种重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含可操作地连接到调控多核苷酸序列的如权利要求13-15或17中任一项所述的cDNA分子。

19.一种载体，所述载体包含如权利要求13-15和17中任一项所述的cDNA分子。

20.一种载体，所述载体包含如权利要求18所述的重组多核苷酸。

21.如权利要求20所述的载体，所述载体还包含至少一个选择标记序列。

22.一种载体，所述载体包含编码与SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19或21中任一项具有约90％或更高的序列同一性的多肽的cDNA分子。

23.一种细胞，所述细胞包含载体，所述载体包含如权利要求13-15和17中任一项所述的cDNA分子。

24.一种细胞，所述细胞包含载体，所述载体包含重组核苷酸，所述重组核苷酸包含可操作地连接到调控多核苷酸序列的如权利要求13-15或17中任一项所述的cDNA分子。

25.如权利要求24所述的细胞，其中所述cDNA分子还可操作地连接到选择标记多核苷酸序列。

26.如权利要求23-25中任一项所述的细胞，其中所述细胞为植物、细菌、酵母或真菌细胞。

27.一种细胞群体，其中至少一个细胞包含至少一种如权利要求19所述的载体。

28.一种细胞群体，其中至少一个细胞包含至少一种如权利要求20所述的载体。

29.一种细胞群体，其中至少一个细胞包含至少一种如权利要求21所述的载体。

30.一种细胞群体，其中至少一个细胞包含至少一种如权利要求22所述的载体。

31.如权利要求27-30中任一项所述的细胞群体，还包含改变蛋白质产生、蛋白质回收或翻译后的蛋白质修饰的至少一种载体。

32.如权利要求27-30中任一项所述的细胞群体，其中所有细胞来自同一物种。

33.如权利要求27-30中任一项所述的细胞群体，其中一种或更多种细胞来自不同物种。

34.如权利要求27-30中任一项所述的细胞群体，其中所述群体中约1％至约100％的细胞含有相同类型的载体。

35.如权利要求31所述的细胞群体，其中所述群体中约1％至约100％的细胞含有相同类型的载体。

36.如权利要求32所述的细胞群体，其中所述群体中约1％至约100％的细胞含有相同类型的载体。

37.如权利要求33所述的细胞群体，其中所述群体中约1％至约100％的细胞含有相同类型的载体。

38.一种用于制备纯化的重组PV根植酸酶的方法，所述方法包括：

在培养物中培养根据权利要求27-30中任一项所述的转化的细胞群体，使得所述细胞产生所述重组PV根植酸酶；以及

从所述培养物中分离所述重组PV根植酸酶。

39.一种肥料，所述肥料包含如权利要求27-30中任一项所述的细胞群体。

40.一种肥料，所述肥料包含载体，所述载体包含如权利要求13-15和17中任一项所述的cDNA分子。

41.一种肥料，所述肥料包含载体，所述载体包含重组核苷酸，所述重组核苷酸包含可操作地连接到调控多核苷酸序列的如权利要求13-15或17中任一项所述的cDNA分子。

42.如权利要求41所述的肥料，其中所述cDNA分子还可操作地连接到选择标记多核苷酸序列。

43.一种肥料，所述肥料包含如权利要求1或2中任一项所述的纯化的重组PV根植酸酶。

44.一种用于在植物中提高植酸盐的利用的方法，所述方法包括将如权利要求27-30所述的细胞群体与土壤混合。

45.一种用于在植物中提高植酸盐的利用的方法，所述方法包括将如权利要求18所述的载体与土壤混合。

46.一种用于在植物中提高植酸盐的利用的方法，所述方法包括将如权利要求19所述的载体与土壤混合。

47.一种用于在植物中提高植酸盐的利用的方法，所述方法包括将如权利要求20所述的载体与土壤混合。

48.一种用于在植物中提高植酸盐的利用的方法，所述方法包括将如权利要求21所述的载体与土壤混合。

49.一种用于在植物中提高植酸盐的利用的方法，所述方法包括将如权利要求22所述的载体与土壤混合。

50.一种用于在植物中提高植酸盐的利用的方法，所述方法包括将如权利要求23所述的载体与土壤混合。

51.一种用于在植物中提高植酸盐的利用的方法，所述方法包括将如权利要求1或2所述的纯化的重组PV根植酸酶与土壤混合。

52.一种用于在植物中相对于野生型植物提高蜈蚣草根植酸酶的表达的方法，所述方法包括：

将编码蜈蚣草根植酸酶的DNA分子以及可操作地连接到所述DNA分子的至少一个调控序列整合到所述植物的至少一个细胞的基因组中，使得所述蜈蚣草根植酸酶在所述植物细胞中表达，其中所述DNA分子与SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有至少约90％的序列同一性；以及使所述植物生长，据此蜈蚣草根植酸酶相对于野生型植物细胞过表达。

53.如权利要求52所述的方法，其中所述蜈蚣草根植酸酶催化磷酸根从植酸盐的释放。

54.如权利要求52-53中任一项所述的方法，其中蜈蚣草根植酸酶在约70摄氏度或更高的温度具有约50％或更高的活性。

55.一种转基因植物，所述转基因植物包含：含有重组多核苷酸的多个细胞，所述重组多核苷酸包含：编码蜈蚣草根植酸酶的DNA分子和可操作地连接到所述DNA分子的至少一个调控序列，使得所述蜈蚣草根植酸酶在所述植物细胞中表达，其中所述DNA分子与SEQ IDNO：2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有至少约90％的序列同一性。

56.如权利要求55所述的转基因植物，其中所述蜈蚣草根植酸酶催化磷酸根从植酸盐的释放。

57.如权利要求55所述的转基因植物，其中所述转基因植物相对于野生型植物具有增加的蜈蚣草根植酸酶的表达。

58.如权利要求55-57中任一项所述的转基因植物，其中所述DNA分子与SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中任一项具有100％的同一性。

59.如权利要求55-57中任一项所述的转基因植物，其中所述DNA分子编码具有SEQ IDNO：3、5、7、9、11、13、15、17、19或21中任一项的多肽。

60.如权利要求55-57中任一项所述的转基因植物，其中所述DNA分子编码与SEQ IDNO：3、5、7、9、11、13、15、17、19或21中任一项具有约90％或更高的序列同一性的多肽。

61.一种动物饲料，所述动物饲料包含根据权利要求55-57中任一项所述的转基因植物的部分。

62.一种动物饲料，所述动物饲料包含根据权利要求55-57所述的转基因植物的部分。

63.一种用于在动物中提高植酸盐的利用的方法，所述方法包括将如权利要求55-57中任一项所述的转基因植物的部分包含在动物饲料中。