CN1219201A - 用于生产小籽或无籽果实的遗传构建体和方法 - Google Patents

用于生产小籽或无籽果实的遗传构建体和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了生产无籽或小籽果实的转移基因方法。它包括在授粉后早期,阶段性地表达目标为终止种子发育的细胞毒性基因或基因的组合的表达,以致果实的发育和成熟正常化而在种子发育早期,种子成熟最小化。本发明同时包括转移基因构建体,载体,和生产含有无籽或小籽果实的植物的生产方法。

Description

用于生产小籽或无籽果实的遗传构建体和方法
发明领域
本发明涉及植物分子生物学领域，特别是转移基因植物，种子和组织，它们已经遗传修饰在授粉后产生无籽果实和蔬菜的植物。
发明背景
长期以来，无籽果实和蔬菜成为生产领域的目标。这些植物由于容易制作和食用这些产品，消费者的需求很大。还具有更甜，更新鲜的水果或蔬菜，并因为不含籽或籽腔很小增加了可食用部分。在这一领域中取得若干进展，通常利用局部应用激素或高度复杂的育种过程，这两种方法能产生三倍体基因型。
长期以来，局部应用赤霉素生产无籽葡萄。这种方法通常需要复杂喷洒过程，依赖于天气，并且在授粉之后准确按时进行。
另一个方法是在生产无籽西瓜时要求的复杂育种过程。西瓜中的无籽特征几乎是在每个细胞中存在三个同源染色体而不是两个的结果，称为三倍体。种子发育由于不平衡的胚胎、胚乳的基因组构成、不规则的减数分裂和配子形成而终止。异常的胚胎形成导致种子在早期终止正常的胚珠发育。通常无籽西瓜含有与未成熟的黄瓜一样小的可食用的白色胚珠。
通过每个细胞含有22个染色体的雄性二倍体(2X)系和每个细胞含有44个染色体的雌性四倍体(4X)系杂交产生这些三倍体种子。通过4n～2n杂交产生三倍体基因型，3n种子是“正常”的，并通过种植生长。三倍体植物是真正的F1杂交品种，所以它们的产生取决于二倍体和四倍体亲本系的发育。为了大规模地进行商业性生产三倍体种子，以混杂方式种植四倍体和二倍体亲本系，允许交叉授粉。三倍体种子只在用二倍体花粉授精的四倍体植株上的西瓜中产生。3n西瓜的生产田有二倍体授粉者。一些3n植物产生非常少的花粉，并且二倍体花粉获得无效授粉。由于总体的不平衡，种子发育在授精后终止。所以为了产生大量混杂的植物群，必须得到充足的二倍体和四倍体种子。生产这一类型的无籽西瓜的主要限制是难于产生足够的四倍体4X亲本系的种子。
通常这是通过使用秋水仙素完成的。秋水仙素抑制有丝分裂的纺锤体的形成，导致细胞含有不同数目的染色体。四倍体是通过每天在二倍体秧苗的顶端滴一滴0.2～0.4％的秋水仙素水溶液产生的。使用秋水仙素处理经常导致秧苗或种子的死亡，或产生非整倍体(含有额外或丢失染色体的细胞或多倍体)。
当一个需要的品种得到鉴定，染色体数目成倍增加后，通过自花授粉产生适当的种子。但是，对于大批量商业用途产生四倍体种子是非常困难的，主要因为四倍体表现出高度的自花不育。所以，在四倍体植株的田间很少有西瓜长成。在每个自花授粉的瓜中产生的四倍体亲本中结出种子更加困难。通常需要十年以上将新的四倍体系的种子数目增加到商业上可接受的数目。
Dennis Cray等人的美国专利第5,007,198号公开了提高西瓜四倍体亲本系的生产方法，该方法允许使用独特的组织培养技术克隆品种以克服四倍体细胞的不育性。通常，该方法利用组织培养繁殖方法，通过将茎分生组织用作繁殖的起始组织在充满营养和生长调节剂的培养皿中繁殖西瓜尖，“克隆”4n亲本，导致一个尖抽条15个茎。依次将茎用于抽条，进一步培养，使其呈几何体积增加。
在国际专利WO91/09957中公开了产生无籽果实的转移基因方法，它包括高度复杂的重组切除系统，称为“CRE-LOX”。通常，CRE的基因产物产生蛋白重组酶，作用于特异的LOX DNA序列。公开了几个重组功能，不变的在LOX DNA序列切除。本申请提出无籽西瓜是在包括用起源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloiquefaciens)的芽孢杆菌RNA酶基因转化的条件下发生的。通常，雌性含有种子包衣特异启动子(SC):CRE：终止子，雄性含有SC启动子：芽孢杆菌RNA酶基因：：Iox：：芽孢杆菌RNA酶基因：终止子。当繁殖时，在两个亲本间没有发生表现型的变化，并且在种子生产田间，雌性种子亲本具有正常的种子因为两个基因不会在同时发生作用(种子包衣仅仅是母本组织)。但是，在F1代中，母本组织将含有两个基因。在这一构型中，种子包衣的构成(F1植物，F2种子)是SC启动子：芽孢杆菌RNA酶基因：：-：：芽孢杆菌RNA酶基因：终止子，其中：：-：：代表切除Iox基因，产生特异于种子包衣的功能性毒素基因的点。在理论上，如果种子包衣破裂，由于流入胚胎的营养缺乏，种子的发育将终止。
目前尚无公开的实验数据，或已提议的方案在真正的无籽西瓜培育方面显示成功的例子。
由此可知，本领域需要简单，直接和容易重复的无籽果实和蔬菜的生产方法。
本发明的一个目的是提供表达构建体，当该构建体在转移基因植物中表达时，产生无籽果实和蔬菜。
本发明的另一个目的是提供近亲交配的亲本系，能够杂交育种产生F1植物，不产生种子，或存在的种子数量明显减少。
本发明的另一个目的是提供含有本发明表达构建体的植物，植物细胞和植物组织。
本发明的另一个目的是提供用于转化植物细胞的载体，包括掺入本发明的基因和启动子的表达盒中的病毒或质粒载体。
本发明的另一个目的是提供包含用于维持复制和转化植物的载体的细菌细胞。
本发明的其它目的可从下面对于本发明的叙述中看出。
发明概要
本发明包括在授粉后一段足够的时间内，对于细胞毒性基因或基因的组合进行短暂表达，终止种子发育，以致果实的发育和成熟正常化而在种子发育的早期，种子本身的成熟最小化。
在一个实施例中，本发明包括一个第一DNA序列，它编码能够给予植物细胞有细胞毒性的非毒性物质的第一基因产物，该物质是种子形成和/或功能的关键，和第二DNA序列，它编码第二个非毒性物质的基因产物，或编码能够将植物细胞的内源性物质转化为非毒性物质的第二基因产物，该物质能够被所述的第一基因产物转化成细胞毒性物质。
两个基因的组合使生产无籽的果实或蔬菜(F2)的杂交品种植株(F1)成为可能。培养转移基因纯合亲本系，每个亲本含有第一或第二重组DNA序列，可选择地与种子特异启动子连接。只有当亲本系杂交时两个序列连结在一起，产生充满细胞毒性功能的基因，它的表达是与种子的发育时期一致的。优选的第一DNA序列编码吲哚乙酰胺水解酶(IamH)，它将吲哚乙酰胺转化成天然植物生长素吲哚乙酸(或者称为生长素基因2)，第二DNA序列编码吲哚乙酰胺合成酶(IamS)，它将色氨酸转化成吲哚乙酰胺(或者称为生长素基因1)，并且第一和第二个启动子是种子特异启动子。生长素以组织特异的方式过度生产可以导致对该组织的局部毒性。过去已经将生长素过度生产与花粉特异启动子结合用于生产雄性不育植物，参见商业Fabijanski的美国专利第5,426,041号，引入本文作为参考。
在本发明的另一个实施例中，可以将第一和第二细胞毒性重组DNA序列转化进入同一植物，然后无性地再生产或培养该植物，生产其它这种遗传性相同的植物。
本发明的详细说明
在下面的叙述中，将使用一些术语。为了在本说明书和权利要求中，明确它们使用的意图和范围以及为了简化理解本发明，提供下面的定义。
如本文使用，术语“果实”应该包括在花中任何具有花粉和胚珠产生器官的被子植物；胚珠包裹在子房中，并在授精后，每个胚珠发育成种子，而子房发育成果实。任何需要以无籽方式生产的这样的果实均包括在此定义中。其它传统上认为是蔬菜的食物来源，但以这一方式产生的也包括在内，如西红柿，胡椒等。
“细胞毒性蛋白”是一种破坏正常细胞功能的蛋白质。
“启动子”是引导结构基因的转录的DNA序列。通常，启动子定位于基因的5’区，邻近结构基因的转录起始位点。
“种子特异启动子”是在授粉后的足够时间中能够调节短暂的表达，以使果实的发育和成熟正常化，而在种子发育的早期种子成熟最小化的启动子。如本文所述，这样的启动子包括，但不限于可诱导的启动子，母本的，亲本的或杂交品种起源的种子特异启动子，或任何其它与参与种子生产或发育的基因相关的启动子。
术语“表达”指基因产物的生物合成。结构基因的表达包括结构基因转录成mRNA，然后将mRNA翻译成一个或多个多肽。
“克隆载体”是在宿主细胞中具有自我复制能力的质粒，粘粒或细菌噬菌体的DNA分子。克隆载体通常含有一个或少量限制性内切酶识别位点，在这些位点，可以确定的方式插入外源DNA序列，而不失去载体的基本生物学功能，以及标记基因，该基因用于对通过克隆载体转化的细胞的鉴定和筛选。标记基因通常包括提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。
“表达载体”是包括宿主细胞中表达的基因的DNA分子。通常基因表达是在某些调节元素的控制下，包括启动子，组织特异调节元素和增强子。这样的基因是与调节元素“可操作地连接的”。
“重组宿主”可以是任何含有克隆载体或表达载体的原核或真核细胞。这一术语也包括那些经过遗传工程而在宿主细胞的染色体或基因组中含有克隆基因的原核或真核细胞。
“转移基因植物”是具有一个或多个含有表达载体的植物细胞的植物。
“植物组织”包括分化和未分化的组织或植物，包括，但不限于根，茎，枝条，叶，花粉，种子，肿瘤组织和各种形式的细胞和培养物如单细胞，原生质，胚胎和愈伤组织。植物组织可以在植株器官，组织或细胞培养物中。
一般的重组技术
在调节启动子的控制下，表达结构基因的遗传修饰植物组织的生产将本公开学说与本领域的各种技术和手段结合起来。在大多数情况下，可替代的手段存在于整个过程的各个时期。手段的选择取决于各种变化，如为克隆和导入重组DNA分子而选择的质粒载体系统，待修饰的植物种类，特殊的结构基因，所用的启动子元素和上游元素。本领域普通技术人员能选择和使用适当的选择对象获得功能的实现。表达所需的结构基因的培养条件和培养的细胞是本领域公知的。同样，如本领域已知，许多单子叶和双子叶植物种类是可转化和可再生的，因此在启动子分子的调整控制下，根据本发明可以得到含有和表达所需基因的整个植物。正如本领域技术人员已知，在转化植物中的表达可以是组织特异性的和/或特异于某些发育时期的。如本领域技术人员已知和本文所述平齐化启动子筛选和结构细胞毒性基因筛选是可以最佳化以便获得所需的植物表达其它参量。
选择适当的表达载体将取决于在宿主细胞中导入表达载体的方法。通常表达载体含有(1)编码细菌复制原点和抗生素抗性标记提供细菌宿主中表达载体的生长和筛选的原核DNA元素；(2)控制转录的原始启动的DNA元素如启动子；(3)控制转录物的加工的DNA元素如转录终止子/多聚腺苷酸化序列；和(4)与DNA元素可操作地连接以控制转录启动的报道基因。报道基因包括β-葡糖苷酸酶，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，荧光素酶等。优选的报道基因是β-葡糖苷酸酶(GUS)或荧光素酶。
在Glich等人《植物转化的载体植物分子生物学和生物技术学方法》(Eds.第89-119页，CRS出版社，1993)《植物分子生物学和生物技术方法》中Gruber等人发现植物表达载体和报道基因的概括叙述。另外，GUS表达载体和GUS基因盒可以从CloneTech Laboratorieo,Inc.,Palo Alto，加利福尼亚得到，而荧光素酶表达载体和荧光素酶基因盒可以从Pro Mega Corp.(Madison,Wisconsin)得到。
含有基因组或合成片断的表达载体可以被导入原生质体或导入完整的组织或分离的细胞。最好表达载体被导入完整的组织。例如，Glich等人(Eds，第67-88页，CRC出版社，1993)在《植物分子生物学和生物技术学的方法》中Maki等人的《在植物中导入外源DNA的过程》；和Sprague等人的《玉米和玉米发育》，第三版，(Eds，第345-387页)American Society of Agronomy Inc.等，1988中Phillips等人的《细胞-组织培养和体外操作》中提供了培养植物组织的方法的实例。
在植物组织中导入表达载体的方法包括使用由根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)植物细胞的直接感染或共培养(Horsch等人，《科学》，227:1229(1985))。Gruber等人(出处同上)提出了对土壤细菌载体系统的描述和用于土壤细菌传导的基因转移的方法。
这种方法不限于利用直接基因转移的方法在植物组织中导入表达载体，包括如微粒传导的传递，DNA注射，电穿孔等。优选利用biolistic装置的微粒传导的传递将表达载体导入植物组织。
本发明包括使用在这些类型的转化过程中产生的含有无籽果实的转移基因植物。在所述植物中导入含有与种子特异启动子可操作地连接的细胞毒性基因的构建体。细胞毒性基因可以是单个基因产物或基因的组合。
在本发明的一个优选的实施例中，它包括使用一对基因，当它们一起表达时产生毒性基因产物。当转移基因近亲交配亲本系建立后，可以允许生产杂交品种植物或种子。对于这一实施例，本发明包括一个第一DNA序列，它编码第一个基因产物，该产物能够给予植物细胞有细胞毒性的非毒性物质，该物质是种子的形成和/或功能的关键，和一个第二DNA序列，它编码属于非毒性物质的第二个基因，或编码能够将植物细胞的内源性物质转化成非毒性物质的第二个基因产物。
使第一DNA序列和第二DNA序列处于纯合状态，这可能需要多次转化过程，以便产生各自的亲本系，需要用第一和第二重组DNA分子转化，这两个分子编码同一个基因产物。
优选地，第一重组DNA分子和第二重组DNA分子定位于同一基因位置，同一对染色体的相对的染色单体上，因此，在减数分裂过程中第一和第二重组DNA分子发生分离，在减数分裂的交叉反应过程中第一和第二重组DNA分子再结合到同一染色单体中的机会大大地减少了。
本发明的方法可以用于任何带有种子的植物，它的果实或蔬菜是可食用的或为了损害或其它原因使其无籽。根据本发明的方法，可以生长为无籽的果实和蔬菜植物包括，但不仅限于瓜果类如罗马甜瓜，白兰瓜，西瓜和甜瓜，浆果类如草莓，乌饭树的蓝色浆果，椒类如青椒，红椒，黄椒，西红柿，橘子，梅，苜蓿，南瓜，茄子，甜玉米，豌豆，棉花，鳄梨，芒果，番木瓜，油桃，苹果，葡萄，柠檬，酸橙，柑橘，梨和桃。参照实施例，下面将叙述本发明的方法。
如前面所述，第一DNA序列可以编码第一个基因产物，该产物能够给予植物细胞有毒性的非毒性物质，该物质是种子形成和/或功能的关键，和第二DNA序列，它编码属于非毒性物质的第二个基因产物，或编码能够将植物细胞的内源性物质转换成非毒性物质的第二个基因产物。
对于种子的形成和/或功能起关键作用的植物细胞和/或组织包括在种子的发育中起工具作用的细胞和/或组织，包括种子由此发育而来的细胞和/或组织，形成部分种子包衣，胚乳，胚胎或其它雌性结构的细胞和/或组织种子在其中发育(如胚珠)，而不破坏子房成熟成为果实或蔬菜。
第一DNA序列可以是编码基因产物的任何可鉴定的DNA序列，该产物能够给予植物细胞有毒性的非毒性物质，该物质是种子的形成和/或功能的关键。这种DNA序列的实施例包括编码吲哚乙酰胺水解酶(IamH)(生长素基因2)的DNA序列，该酶将萘乙酰胺转化成植物生长调节剂α萘乙酸(NAA)(生长素基因2)，它将吲哚乙酰胺转化成吲哚乙酸(IAA)，一种植物生长调节剂。酶IamH的一个来源是细菌根癌土壤杆菌(Inze,D.等人，1984,Mol.Gen.Genet.194:265-74和Koncz,C.和Schell,J.1986,204:383-396repPCV311质粒衍生物)。遗传上等同于IamH的酶的另一个来源是来自萨伏斯诺氏假单胞菌(Pseudomonas Savastanoi)(Follin等人(1985)Mol.Gen.Genet.201:178-185)的编码吲哚乙酰胺水解酶的基因。还是另一个来源于美国专利第5,426,041号。其它细胞毒性基因包括DAM甲基化酶，白喉毒素或破坏正常细胞功能的其它蛋白质。
第一DNA序列也可以编码基因产物，该产物能够提供非毒性物质，该物质是对植物细胞有细胞毒性的强亲和毒素，是种子的形成和/或功能的关键。已经鉴定了一种强亲和毒素，对植物是失活的，但在酶转化基础上成为有细胞毒素。(Dotson,S.B.和G.M.Kishore，在植物细胞过程的遗传解剖的植物中具有潜在用途的显性致死因子的分离1991)。
第二DNA序列可以编码属于非毒性物质的第二个基因产物，或编码将植物细胞的内源性物质转化成非毒性物质的第二个基因产物。例如，细胞可以含有编码IamH(生长素基因2)的DNA序列(该酶将吲哚乙酰胺转化成吲哚乙酸的细胞毒性水平)，和编码IamS(生长素基因1)的DNA序列。IamS将植物细胞的遗传内源物色氨酸转化成吲哚乙酰胺，它依次被IamH转化成细胞毒性水平的吲哚乙酸。酶IaMS的一个来源是来自细菌根癌土壤杆菌的T-DNA基因1(Inze,D等人，1984,Mol.Gen.Genet.194:265-74)。等同于IamS的功能的酶的另一个来源，是来自萨伏斯诺氏假单胞菌的编码色氨酸2-加单氧酶(Follin等人(1985)Mol.Gen.Genet.201:178-185)的基因。还是另一个来源是美国专利第5,426,041号。第二DNA序列也可以编码非毒性物质如上面提到的强亲和毒素。
在单个基因的实施例中，所用的细胞毒性基因是从破坏正常细胞功能的一组基因产物筛选出的。当在非自然情况下表达时存在许多对细胞有毒性的蛋白质。如包括限制性内切酶EcoRⅠ[Barnes和Rine，《美国核酸科学进程》82:1354-1358(1985)]，白喉毒素A[Yamaizumi等人，《细胞》15:245-250(1987)]，抗生蛋白链菌素[Sano和Cantor，《美国核酸科学进程》87:142-146(1990)]，和芽孢杆菌RNA酶[Paddon和Hartley，《基因》53:11-19(1987)]的基因。
用于本发明的方法中的启动子可以是种子特异启动子，可诱导的启动子或构成启动子。
所用的种子特异启动子是从已知在发育种子的胚胎和/或胚乳中直接表达的启动子的组中筛选。一系列种子特异启动子的例子包括，但不限于种子储藏蛋白的启动子。种子储藏蛋白是受到严格调节的，它以高度组织特异和阶段特异的方式几乎完全在种子中表达的[Higgins等人，《植物生理年评》，35:191-221(1984)；Goldberg等人，《细胞》56:149-160(1989)]。同时不同的种子储藏蛋白可以在种子发育的不同时期和种子的不同部分表达。
其它实施例包括母本组织启动子如种子包衣，果皮和胚珠。转移基因双子叶植物中存在许多种子储藏蛋白基因的种子特异表达实施例。这些包括来自双子叶植物的基因，如豆β-菜豆蛋白[Sengupta-Goplalan等人，《美国核酸科学进程》82:3320-3324(1985)和Hoffman等人，《植物分子生物学》11:717-729(1988)]，豆凝集素[Voelker等人EMBO J6:3571-3577(1987)]，菜豆凝集素[Ocamuro等人，《美国核酸科学进程》83:8240-8344(1986)]，大豆kunitz胰蛋白酶抑制剂[Perez-Grau和Goldberg《植物细胞》1:1095-1109(1989)]，大豆β-conglycinin[Beachy等人，EMBO J4:3047-3053(1985),Barker等人，《美国核酸科学进程》85:458-462(1988),Chen等人EMBO J7:297-302(1988),Chen等人，Dev.Genet.10:112-122(1989),Naito等人《植物分子生物学》11:683-695(1988)]，豌豆球蛋白[Higgins等人，《植物分子生物学》11:109-123(1988)]，豌豆convicillin(Newbigin等人，《植物学》180:461(1990)]，豌豆豆球蛋白[Shirsat等人，Mol.Gen.Genetics215:326(1989)]，油菜子napin[Radke等人，《遗传性应用理论》75:685-694(1988)]的基因，以及来自单子叶植物的基因，如玉米15千道尔顿(KD)的玉米醇溶蛋白[Hoffman等人，EMBO J6:3213-3221(1987)]，大麦β-大麦醇溶蛋白[Marris等人，《植物分子生物学》10:359-366(1988)]，和小麦麦谷蛋白[Colot等人EMBO J6:3559-3564(1987)]的基因。另外，在嵌合基因构建中与异源编码区可操作地连接的种子特异基因的启动子在转移基因植物中保持在时间和空间的表达方式。这样的实施例包括在Arabidopsis和油菜种子中表达脑啡肽的鼠耳芥2S种子储藏蛋白基因启动子[Vandekerckhove等人《生物/技术》7:929-932(1989)]，表达荧光素酶的菜豆凝集素和菜豆β-菜豆蛋白启动子[Riggs等人，《植物科学》63:47-57(1989)]，和表达氯霉素乙酰转移酶的小麦麦谷蛋白启动子[Colot等人EMBO J6:3559-3564(1987)]。在本申请中胚乳发育早期高度表达的启动子是有效的。特别需要的是来自大豆β-conglycinin基因的α’亚基[Walling等人，《美国核酸科学进程》83:2123-2127(1986)]的启动子，它在种子发育的早期，在胚乳和胚胎中表达。
种子特异启动子是在对种子形成和/或功能起关键作用的植物的细胞/组织中调节DNA序列的选择性表达和/或限制这样的DNA序列在植物的种子形成的时期中表达的DNA序列。任何可鉴别的种子或胚胎特异启动子可以用于本发明的方法。
具有种子或胚胎特异性的并在本方法中使用的其它启动子，包括在Mycogen的美国专利第5,504,200号中叙述的菜豆蛋白启动子，引入本文作为参考。该专利公开了菜豆蛋白，从P.vulgaris分离的蛋白的基因序列和调节区。菜豆蛋白是受到高度调节的，且编码该蛋白的基因只在种子发育为荚时和参与种子产生的组织中表达。
另一个这样的启动子是Calgene的美国专利第5,110,728号中叙述的Napin启动子，引入本文作为参考。该专利公开了napin启动子在引导酰基载体蛋白的种子组织中表达以便增强种子油生产的用途。
其它启动子包括DC3启动子形式carrots，它是特异于胚胎早期到中期的，并在《植物生理》1992年10月，第576到581页“Carrot Lea-类基因Dc3的激素和环境调节”中公开。另一个在《植物分子生物学》，1992年4月，18(6)第1049-1063页，“种子特异的Carrot基因的转录调节，DC8”中公开。其它启动子包括起源于其表达与胚胎和/或胚乳或后期花粉的形成母本地相关的任何基因。
优选的启动子可以用于与种子特异基因的天然存在的侧接编码或转录序列或与任何其它对种子形成和/或功能起关键作用的编码或转录序列接合。
在启动子构建体中包括一些内含子序列也是所希望的，因为在编码区含有内含子序列可以导致增强的表达和特异性。所以，将待表达的DNA序列与含有多肽的第一个内含子和外显子序列的启动子序列连接是有优点的，该多肽是对种子形成和/或功能起关键作用的植物的细胞/组织特有的。
为了得到产生嵌合启动子的所需的启动子活性，一个启动子的附加区域可以与来自不同的启动子的区域连接。也可以使用调节基因表达到种子发育的合成启动子。
本发明的方法中使用的第一个启动子或第二个启动子可以是可诱导的启动子。可诱导的启动子是能够在应答诱导物时，直接或间接激活DNA序列的转录的启动子。在缺乏诱导物时，DNA序列将不被转录。通常，与可诱导启动子特异结合以便激活转录的蛋白质因子以失活的形式存在，它随后被诱导物直接或间接地转化为活化形式。诱导物可以是化学试剂如蛋白质，代谢物(糖，乙醇等)，生长调节剂，除草剂或生理压力酚化合物或如热，盐，毒性元素等直接或间接通过致病原或致病剂如病毒的作用。将诱导物通过外部应用于细胞可以将含有可诱导的启动子的植物细胞与诱导物接触，如喷洒，浇水，加热或类似方法。可诱导启动子的例子包括可诱导的70千道尔顿(KD)的D.melanogaster的热休克启动子(Freeling,M.,Bennet,D.C.,Maize ADN1，《遗传学年评》19:297-323)和乙醇诱导的乙醇脱氢酶启动子(Nagao,R.T.等人，Miflin,B.J.Ed.《牛津植物分子和细胞生物学调查》，第3卷，第384-438页，牛津大学出版社，牛津1986)和利用化学处理启动并通过配体药学可得的LexA启动子。可诱导启动子可以在种子形成过程或至少对应于重组DNA分子的DNA序列的转录时期中处于诱导状态。
在优选的实施例中，启动子是种子包衣特异的，只在母本组织中表达的，如大豆的β-conglycinin的α’亚基(α’-β-C6)，如在本文作为参考的《生物化学杂志》261:9228(1986)所述，它在种子发育早期，在胚乳和胚胎中被高度表达。
可诱导启动子的另一个例子是从27千道尔顿的玉米谷胱苷肽-S-转移酶(GSTⅡ)基因的亚单位分离的化学可诱导基因启动子序列。这一启动子的两个诱导物是N,N-二烯丙基-2,2-二氯乙酰胺(普通名称：二氯胺)或苄基-2-氯-4-(三氟甲基)-5-羧基噻唑(普通名称：flurazole)。另外，如ICI公开的PCT申请号PCT/GB90/00110所述对这一启动子可以使用许多其它潜在的诱导物。
可诱导启动子的另一个例子也是在ICI公开的PCT申请号PCT/GB90/00110所述的轻微可诱导的叶绿素a/b结合蛋白(CAB)启动子。
在Ciba-Geigy公开的申请号EP89/103888.7中也已经描述了可诱导启动子。在这一申请中，鉴定了许多可诱导启动子，包括PR蛋白基因，特别是烟草PR蛋白基因，如PR-1a,PR-1b,PR-1c,PR-1,PR-A,PR-S，黄瓜几丁质酶基因，酸性和碱性的烟草β-1,3-葡聚糖酶基因。对这些启动子存在许多潜在的诱导物，如申请号EP89/103888.7所述。
第一个或第二个启动子可以是组成启动子。组成启动子是在各种细胞类型包括对花粉形成和/或功能起关键作用的细胞/组织中起作用的启动子。如CaMV 35S或Super mass或HP101，已经从油菜(Brassica napus)中分离。
本申请所述的任何DNA序列和启动子的重组DNA分子另外可以含有选择性标记基因，这些基因编码选择基因产物，该产物给予植物细胞对化学制剂和生理压力的抗性。或给予细胞可区分的表现型特征，以致使用选择试剂可以容易地选择用重组DNA分子转化的植物细胞。一个这样的选择标记基因是潮霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)，它给予对卡那霉素和抗生素G-418的抗性。利用现有技术中叙述的技术测试卡那霉素的体外磷酸化的存在或通过Northern影印分析测试来自转化植物的RNA中编码NPTⅡ基因的mRNA的存在可以选择含有这一选择标记基因的转化细胞。这样筛选的转化植物细胞可以经过诱导以致分化成植物结构，最终产生整个植物。选择性标记基因可以是植物中天然存在的。
含有任何本申请所述的DNA序列和启动子的重组DNA分子可以整合进雄性不育植物或第二种植物的基因组，方法是通过任何一种已知方法首先将重组DNA分子导入植物细胞。优选地将重组DNA分子插入适当的载体并将重组DNA分子导入植物细胞。
已经有人建议将花椰菜花叶病毒(CaMV)(Howell,S.H.等人，1980，《科学》208:1256)和双生病毒(Goodman,R.M.,1981，《遗传病毒学杂志》54:9)作为载体，但是迄今为止，报告最成功的是土壤细菌sp.(Agrobacferia sp.)(Horsch,R.B.等人，1985，《科学》227:1229-1231)。对于许多不同种类，现在已经描述过使用土壤细菌基础上的转化系统的方法。通常，使用的细菌菌株含有修饰的天然存在的Ti质粒，因此将DNA转移到宿主植物中而不会随后形成肿瘤。这些方法包括在Ti质粒的边界内插入与选择性标记基因连接的植物基因组的DNA，以便简化转化细胞的选择。将细菌和植物组织一起培养以便允许将外源DNA转移进入植物细胞，然后在选择培养基上再生转化植物。如对于苷蓝科的成员特别叙述的，来自土壤细菌传导的转化的任何数目的不同器官和组织可以用作靶。这些包括薄的细胞层(Charest,P.J.等人，1988，《遗传应用理论》75:438-444)，胚轴(DeBlock,M.,等人，1989，《植物生理》91:694-701)，叶盘(Feldman,K.A.和Marks,M.D.,1986，《植物科学》47:63-69)，茎(Fry J.,等人，1987《植物细胞报告》6:321-325)，子叶(Moloney M.M.,等人1989，《植物细胞报告》8:238-242)和胚状体(Neuhaus,G.,等人，1987，《遗传应用理论》75:30-36)。但是，在一些作物中选择不同组织或转化方法是所希望的。
为了恢复植物无任何位置效应，再生许多含有任何重组构建体的单个转化的植物可能是有用的。选择含有不止一个拷贝的导入的重组DNA分子的植物以致达到高水平地表达重组分子可能也是优选的。
已经使用其它方法在植物细胞中导入重组分子，包括机械手段如直接的DNA摄入，脂质体，电穿孔(Guerche,P.等人，1987《植物科学》52:111-116)和微注射(Neuhaus,G.等人，1987，《遗传应用理论》75:30-36)。利用微粒和枪或其它装置迫使包衣DNA的小金属颗粒进入细胞的可能性也已经得到注意(Klein,T.M.等人，1987，《自然》327:70-73)。
值得注意的是在本发明过程中的一些实施例中，植物细胞被至少含有两个DNA序列的重组DNA分子转化或用超过一个重组DNA分子转化。在这些实施例中DNA序列或重组DNA分子可以通过处于同一载体物理地连接，或在不同载体上物理地分离。一个细胞可以同时用一个以上的载体转化，假设每个载体有单一的选择性标记基因。可以用一个以上的载体按顺序地转化细胞，并允许在用第一个载体转化后的有中间物再生步骤。另外，在含有不同DNA序列或重组DNA分子的单个植物或植物系之间进行两性杂交是可能的，优选的DNA序列或重组分子连接或定位于同一染色体，然后从杂交子代中选择含有DNA序列或重组DNA分子的植物。
利用本领域技术人员公知的Northern影印技术和/或Southern影印技术，可以监测转化植物细胞中含有本申请所述的DNA序列和启动子的重组DNA分子的表达。
如上所述，希望生产对特定基因是纯合的植物系。在一些种类中，通过利用花粉培养或分离的小孢子培养能相当容易完成。这对于油类种子作物Brassice napus特别正确(Keller和Armstrong,Z.flanzenzucht80:100-108,1978)。通过利用这些技术，生产携带插入基因的单倍体系，然后自发地或使用秋水仙素将染色体数目加倍。这产生了插入基因是纯合的植物，如果插入基因携带适当的选择性标记基因，可以容易地检测携带该基因的植物。植物可以是自花授精，导致最简单情况下产生三种类型：纯合的(25％)，杂合的(50％)，和无(25％)插入基因的种子的混合物。虽然从那些含有该基因的植物中非常容易评估未插入基因的植物，从杂合植物中评估纯合植物在实践中是可能的，方法是southern影印分析，其中必须注意加载来自混合群体的准确的等当量DNA，并由来自特异于插入基因的探针的信号密度评估杂合子。通过允许各个独立的转化体自花授精证实southern影印分析的结果是可取的，因为由简单的事实可以得到其它纯合性的证据，事实即如果植物中插入基因是纯合的，来自自交的种子的所有植物将含有该基因，而如果植物中该基因是杂合的，自交种子的子代将为不含有该基因的植物。所以，利用简单的自花授粉，可以容易地筛选纯合植物系，它也可以通过southern影印分析证实。
可以设想在种子中特异地产生毒性分子的许多不同方式。在所有途径中，在种子，胚乳或种子包衣中至少会特异地发生产生细胞毒性分子中一个步骤。例如，可以使用在植物中的构成表达IamS(生长素基因1)，随后将该植物与含有在种子特异启动子控制下的IamH(生长素基因2)的植物杂交，以致在所有植物细胞中产生IAM，但是由于种子特异IamH基因的作用，生长调节剂IAA只在种子细胞中产生。相反，可以使IamH在植物中构成性地表达，并将该植物与含有启动IamS基因的种子特异启动子的植物杂交。在这种情况下，生长调节剂IAA仅在种子细胞中产生。在几个实施例中，IamH基因和IamS基因是处于种子特异启动子的控制下的，优选地使用同一种子特异启动子或与另一个的表达真正交迭以致各自独立启动这两个基因的表达的种子特异启动子。另外，通过将IamH基因与可选择的试剂如除草剂连接，容易进行杂交植物生产。
任何数目的基因可以用于进行本发明的过程和方法，假设在种子中特异地同时产生一个或多个酶或合成活性导致对正常种子的产生有毒性或抑制的物质的产生或特异地干扰种子包衣或胚乳的发育。这意味着在植物中一个或多个活性可以是构成性的，但所有酶活性的最终组合局限于种子中。
可以看出，几个细胞毒性基因的组合和种子发育特异启动子是属于本发明的范围内。
非常需要的无籽系统是可育F1种子在其中完全发育，然后生长成无籽果实的植物系统。这一系统令人满意之处在于对每个杂交授粉，大量无籽果实的结果是：从一次杂交得到的F1种子的数目×F1植物上产生的果实数目。同时包括在本方案中的是生长杂交品种作物的优点，包括组合更多有价值的试验和杂交品种优势。如上所述，这是与以上面所述相同的方式完成的，除了细胞毒性基因是从种子包衣特异启动子表达的。种子包衣是果被的副产品，严格意义上的母本组织。所以导致破坏基因1和基因2在一起的杂交品种杂交不包括种子包衣组织。F1种子的种子包衣具有基因1或基因2，取决于哪一个用作雌性亲本，因此F1种子发育正常。在F1种子产生含有果实的F1植物后，所有生长性细胞(包括种子包衣细胞)从胚胎中遗传基因1和基因2。所以F1植物的种子包衣具有激活的细胞破坏基因。
种子包衣是种子发育和生存的基本组织。当种子完全成熟时，种子包衣成为种子内部成分的保护层。在种子发育过程中，种子包衣是胚胎发育中重要的营养输入组织。种子对母本植物是营养性“寄生”的。所有种子生长必须的原材料必须输入。在双子叶植物的种子中，维管组织通过珠柄进入种子，然后在种子包衣组织中组合。在种子包衣和胚胎之间没有维管组织连接或胞间连丝连接。所以，所有传递进入发育的种子的营养溶质必须是在种子包衣内卸载，并通过扩散进入胚胎的。已经进行各种技术研究种子包衣中的营养组成[Hsu等人，《植物生理》75:181(1984)；Thorne和Rainbird《植物生理》72:268(1983)；Patrick，《植物生理杂志》115:297(1984)；Wolswinkel和Ammerlaan，《实验植物杂志》36:359(1985)]，和详细的可溶物卸载的细胞机制(Offler和Patrick,Aust.J.Plant Physiol.11:79(1984)；Patrick，《植物生理》78:298(1990)]。显然破坏这一关键的营养漏斗组织导致种子败育。
             实施例1
根据本发明的方法构建了几个载体：
基因1--pal1425(Bp4启动子+基因1)
基因2--pal1426(Bp4启动子+基因2)
根据Moloney等人1989,PI，《细胞报告》8:238-242转化载体。
从每个事件(each eveut)以及每个事件发生的杂交中产生种子。当植物开花并结籽时，在含有基因1和基因2以及只含有基因1的植物中观察到荚是空的。
                  实施例2
根据本发明已经制成几个载体，包括
Supermass:PAT:PIN::DC3:GENE1-GENE2:PIN
Supermass:PAT:PIN::Napin:GENE1-GENE2:PIN
Supermass:PAT:PIN:Phaseolin:GENE1-GENE2:PIN
这些载体的可选择标记是与调控对bialaphos(一种除草剂)抗性的PAT基因可操作地连接的Supermass启动子，和PINⅡ终止子(多聚腺苷酸化信号)。三个GENE1-GENE2启动子都是种子特异的，并导致对种子发育产生毒性。种子发育的抑制程度将取决于启动子发生作用的时间和地点。首次转移基因在种子中显示分离，期望的表现型是不饱满种子与正常种子的比例是3∶1。
                    实施例3
早期的目标是证明原则上在种子特异启动子控制下的基因1：基因2能够终止种子发育而对果实发育不产生不利影响，即基因以组织特异的和细胞自发的方式起作用。瓜果是可选择的植物种类，因为循环时间短，需要相对低的温室空间。
基因1和基因2处于DC3,napin，或菜豆蛋白启动子控制下的植物表达载体将用于测试组织和时间特异性，即瓜果中的早期种子发育。预期的表现型符合TO转移基因学，当自花授粉时产生75％败育种子的果实或当与野生型植物杂交时产生50％败育种子。已经从组织培养再生的控制植物与败育种子相比，证实该表现型不是其它因素的结果。对单个种子的分子分析将同时证明存在转移基因和败育对正常种子的共分离。
除了对基因1：基因2的毒性功能评估，利用细胞化学gus标记和各种种子特异启动子可以进行对其它启动子评估。这似乎是现有启动子需要修饰或者其它启动子需要分离(参见下面)，这使组织和短暂表达与本申请的需要相容。
                  实施例4
用于杂交种子产生系统的基因1：基因2的评估
将评估两个系统产生杂交品种种子的效率。第一个是利用胚胎特异启动子：基因如雄性中的DC3：：基因1和雌性亲本中的DC3：：基因2。当自交或增加生产种子时两个亲本应该正常生产种子。但是，已经观察到在Brassica中不正常的花的表现型含有花药特异启动子和基因1的一些组合(Arnoldo,1995年8月月度报告，Canola转化)。表现型不正常的程度取决于特异的启动子，虽然提议的这些启动子应该比那些在构成启动子控制下的基因更少的表现型干扰(Sitbon，等人1992，“共表达根癌土壤杆菌IAAM和IAAH基因的转移基因烟草植物展示变化的生长和吲哚乙酸代谢”，《植物生理》99:1062-1069；Klee等人1987“两个根癌土壤杆菌T-DNA生长素生物合成基因产物在转移基因矮牵牛植物中过度生产的效果”，Genes Dev.1:86-96)。在组成亲本组合中建立的种子的表现型和分子分析将证实在两个亲本组合中的种子成熟的特性。
这一杂交种子生产的途径可能产生的困难是基因1和基因2将在用于种子生产的雌性亲本中潜在地表达。胚胎是二倍体和种子特异的，如果成份基因的表达是从雄性和雌性配子的同等付出表达的，在种子生产堆中雌性亲本将是无籽的。这一方式的替代途径是释放基因2是纯合的并且是雄性不育或gynoecious的杂交品种。同时将供应含有基因1的花粉供体，这些花粉供体将传粉给含有基因2的雄性不育杂种。所有从杂交品种得到的果实将是“无籽”的。
这种方法的另一个替代方法是通过利用可诱导的启动子抑制雌性中基因1的转录活性。LexA基因(Brent和Ptashne,1985，“原核生物抑制剂的含有DNA特异性的真核生物转录激活剂”是一个这样的启动子。除了在杂交品种的种子生产过程中“诱导物”是用于抑制基因1的，基因1将在雌性中正常地表达。所以种子生产将是“正常”的，而卖给生产者的F1杂种是无籽的。
与传统杂交品种种子生产一致的途径是将基因1和基因2处于种子包衣特异启动子的控制下。因为种子包衣是母本起源的，当与含有基因2的雄性杂交时雌性杂交品种种子亲本将不表达无籽表现型，因为母本组织只表达基因1。F1胚胎的遗传构成含有基因1和基因2，并且在生产者的田间，两者在母本组织中都表达并且是无籽的表现型。
利用Rt-PCR的分化展示技术通常优先用于选择分离种子包衣组织产生的信息而不是胚胎特异组织和果实特异组织。这样的技术已经用于几个包括分离癌基因的申请和用于分离与西红柿中果实成熟相关的基因(Oh等人，1995,“PCR基础上的分化Displan的修饰过程和分离果实成熟相关的基因在植物中的用途的证明”《植物分子学报告》13:70-81)。

Claims (27)

1．用于生产无籽或小籽果实的转移基因植物的表达构建体包括：在表达的基础上，编码细胞毒性蛋白的重组基因或基因的组合；和与所述的基因或多个基因可操作地连接的种子特异启动子。
2．根据权利要求1所述的表达构建体，其特征在于所述的基因的组合包括：编码第一个基因产物的第一DNA序列，该产物能给予植物细胞有细胞毒性的非毒性物质；和一个第二DNA序列，该序列编码属于非毒性物质的第二个基因产物，或编码能将植物细胞内源性物质转化成非毒性物质的第二个基因产物，所述的非毒性物质由所述的第一个基因产物产生细胞毒性。
3．根据权利要求2所述的表达构建体，其特征在于所述的第一DNA序列编码吲哚乙酰胺水解酶(IamH)，其中所述的第二DNA序列编码吲哚乙酰胺合成酶(IamS)。
4．根据权利要求1所述的表达构建体，其特征在于所述的细胞毒性基因编码DAM甲基化酶。
5．根据权利要求1所述的表达构建体，其特征在于所述的启动子是母本组织启动子。
6．根据权利要求1所述的表达构建体，其特征在于所述的启动子选自包括下面内容的组：napin启动子，菜豆蛋白启动子和DC3启动子。
7．根据权利要求1所述的表达构建体，其特征在于所述的启动子是可诱导启动子。
8．用于生产转移基因母本系的表达构建体，该转移基因母本系，当与第二个亲本系杂交时，将产生F1植物，该第二个亲本系含有编码属于非毒性物质的第二个基因产物或编码能够将植物细胞内源性物质转化成非毒性物质的第二个基因产物的DNA序列，所述的非毒性物质由所述的第一个基因产物变成细胞毒性，F1植物发育无籽或小籽的果实，包括编码第一个基因产物的DNA序列，该产物能够给予植物细胞有细胞毒性的非毒性物质，所述的第一个基因产物可操作地与组织特异启动子连接。
9．用于生产转移基因亲本系的表达构建体，该转移基因亲本系当与第二个亲本系杂交时将产生F1植物，第二个亲本系含有种子特异启动子调节的DNA序列，该启动子编码能够给予植物细胞有细胞毒性的非毒性物质的第一个基因产物，F1植物发育无籽或小籽的果实，包括编码属于非毒性物质的第二个基因产物或编码能够将植物细胞内源性物质转化成非毒性物质的第二个基因产物的DNA序列，所述的非毒性物质由所述的第一个基因产物变成有细胞毒性。
10．含有权利要求1,8或9所述的表达构建体的核酸载体。
11．根据权利要求10所述的载体，其特征在于所述的载体是克隆载体。
12．根据权利要求10所述的载体，其特征在于所述载体是表达载体。
13．根据权利要求10所述的载体，进一步包括用于选择转化细胞的标记基因。
14．根据权利要求12所述的载体，其特征在于所述标记基因选自包括下面内容的组：氨苄青霉素抗性基因，四环素抗性和潮霉素抗性基因。
15．根据权利要求10所述的载体，进一步包括多聚腺苷酸化信号。
16．用根据权利要求10所述的核酸载体转化的原核生物或真核生物宿主细胞。
17．包括植物细胞或其祖先的转移基因植物，该细胞已经用权利要求10的载体转化。
18．生产杂交品种种子的方法，该种子将产生一种植物，该植物当授粉时将产生无籽或小籽果实，方法包括：用第二个亲本植物对一个亲本植物授粉，该亲本已经用第一个DNA序列转化，或其祖先已经用第一个DNA序列转化，该DNA序列编码能够给予植物细胞有细胞毒性的非毒性物质的第一个基因产物，所述的DNA序列与母本组织特异启动子可操作地连接，第二个亲本植物已经用第二个DNA序列转化或转化其祖先，该DNA序列编码属于非毒性物质的第二个基因产物或编码能够将植物细胞内源性物质转化成非毒性物质的第二个基因产物，所述的DNA序列与母本组织特异启动子可操作地连接，所述的非毒性物质由所述的第一个基因产物变成有细胞毒性。
19．根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述的母本组织特异启动子是种子包衣特异启动子。
20．根据权利要求18所述的方法生产的杂交品种种子。
21．含有编码在种子发育过程中表达的细胞毒性蛋白的DNA序列的植物生产的无籽或小籽果实。
22．生产无籽或小籽果实的方法：包括用编码与种子特异启动子可操作地连接的细胞毒性基因的DNA序列转化的被子植物细胞；从所述的转化细胞产生植物；和允许所述的植物授粉以致启动种子发育，然后终止而不影响果实生成。
23．根据权利要求22所述的方法，其特征在于所述的植物是瓜果植物。
24．根据权利要求22所述的方法，其特征在于所述的DNA序列编码吲哚乙酰胺水解酶(IamH)和吲哚乙酰胺合成酶(IamS)。
25．根据权利要求22所述的方法，其特征在于所述的启动子选自包括下面内容的组：napin启动子，菜豆蛋白启动子和DC3启动子。
26．生产杂交品种植物的方法，该杂交品种植物，当授粉时将产生无籽或小籽果实，该方法包括：用第二个亲本植物对一个亲本植物授粉，该亲本植物已经用第一DNA序列转化或转化其祖先，该第一DNA序列编码能够给予植物细胞有细胞毒性的非毒性物质的第一个基因产物，所述的DNA序列与种子特异启动子可操作地连接，该第二个亲本植物已经用第二DNA序列转化或转化其祖先，该DNA序列编码属于非毒性物质的第二个基因产物或编码能够将植物细胞内源性物质转化成非毒性物质的第二个基因产物，所述的DNA序列与种子特异启动子可操作地连接，所述的非毒性物质由第一个基因产物变成具有细胞毒性。
27．根据权利要求26所述的表达构建体，其特征在于所述的第一DNA序列编码吲哚乙酰胺水解酶(IamH)，所述第二DNA序列编码吲哚乙酰胺合成酶(IamS)。
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