JP2002533089A - 作物植物での異系交雑および望ましくない遺伝子拡散を制限するための方法および遺伝子組成物 - Google Patents

作物植物での異系交雑および望ましくない遺伝子拡散を制限するための方法および遺伝子組成物

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、遺伝子組成の異なる性的和合性植物間での組換えＤＮＡ分子の拡散を制御する方法に関する。本発明は、抑制可能な致死遺伝子に結合させた、目的のまたは関心のある組換え形質を含むトランスジェニック植物の生産について開示する。この致死遺伝子は、異なる遺伝子座に配置されたリプレッサー遺伝子の発現により生産されるリプレッサー分子の作用により遮断される。致死表現型は、減数分裂に続いて起きる、前記抑制可能致死遺伝子構築物とリプレッサー遺伝子の隔離の後においてのみ発現する。本発明は、開放受粉系および雑種種子生産系の双方に用いることができ、また、特異的リプレッサー遺伝子を欠く植物からの意図しない遺伝子移入を遮断することにより、遺伝的純度を維持するために用いることもできる。本発明は、環境応答性異種タンパク質生産に望ましい形質を付与する方法、該形質を付与するために用いる遺伝物質、並びに該方法により得られる新規な植物および産物を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
組換えＤＮＡ研究から誘導された新規な形質を含む多種多様な植物が増加する
ことにより、環境的および商業的関心が持たれるようになってきている。これら
の関心は、新規な形質が天然または培養個体群において性的和合性植物への受粉
によって広がる可能性に起因する。
【０００２】 遺伝技術、および特に組換えＤＮＡ技術によって付与された新規かつ変更され
た形質を有する植物は、いまや農作物バイオテクノロジー産業の礎石と見なされ
ている。現在、組織培養、ソマトクローン変異(somatoclonal variation)または
突然変異並びに遺伝子工学によって得られた新規形質を有する多数の農作物植物
が、実地試験および商業的公開の第一段階に至っている。これらの植物には、一
年ベースで成長した通常の作物だけでなく、新規形質を含んでなり多年生である
樹木または灌木のような他の植物もある。
【０００３】 最近の農作物品種には、特定の形質を付与する個々の遺伝子、および通常の植
物の品種改良によって収集した遺伝子の組合わせの両方が含まれる。従って、さ
らに多数の新規形質が開発されて最新の作物品種に組込まれるため、特定の作物
品種、栽培品種または品種改良系統の遺伝子組成など、遺伝子組成を保存する手
段を有することが重要である。特に重要なものは、通常はその作物には見られな
い形質を有する作物、例えば新規な油、ミールまたは他の成分を生産する植物、
または特別な化合物を生産するように修飾された植物の保存である。さらに、リ
グニン濃度を変更したもの、昆虫耐性および真菌耐性、並びに除草剤耐性のよう
な新規形質を有する樹木のような多年生植物が生産されている。
【０００４】 新規形質は、通常の品種改良または遺伝子操作によって植物に導入される。し
かしながら、今日までのところは、いずれの経路によっても、生殖細胞質純度の
保持または新規形質の持続性または潜在的拡散の制御に日常的に用いることがで
きる特性は得られない。現在用いられているベクターおよび遺伝子組成物は、典
型的には２つの重要な問題、すなわち(1)形質転換した作物植物または極上品種
が他の商業的生産物を汚染することの防止、または緊密に関連した栽培品種また
は植物種由来の異種生殖細胞質の遺伝子移入の防止などの商業的問題、および(2
)非農業的環境から問題の遺伝子を獲得した形質転換作物植物または関連種の除
去のような環境的問題を扱っていない。さらに、現在用いられている形質転換法
では、受粉によって媒介される異系交雑による他の栽培品種または（野生型また
は培養された）関連種への遺伝子の導入を減少させる手段は得られない。
【０００５】 新規形質を有する多くの作物を使用することの唯一最大の直接的危険性は、同
一作物種の商業的生産中における汚染の危険性である。油糧種子ナタネまたはカ
ノーラ(Brassica napus)のような作物種が雑草となり、または野生の雑草性近縁
生物と雑種形成する危険性は、特に大きな生産面積がある場合には、カノーラの
他の商業生産物との交雑がほぼ確実であることに比べれば大きくはない。以前は
、これは幾つかの理由から農家および商業的加工業者にとって大した問題ではな
かった。第一に、品種改良の目的はカノーラ作物について比較的均一であり、第
二に、少数の栽培品種だけで農家が栽培した総エーカー数の９０〜１００％に上
り、第三に、極上の種類の伝統的な方法で栽培された高エルカ酸工業油の栽培品
種だけは、物理的に隔離されて栽培されてきたからである。従って、高エルカ酸
を付与する遺伝子を有する食用品質のカノーラ品種の交雑汚染は、重要な問題と
はならなかった。
【０００６】 最近、さらなる独特な品種が出回っている。これらには、除草剤耐性を付与す
る組換え遺伝子を有する品種、および高オレイン酸のような脂肪酸プロフィール
に変異を有する通常の栽培によって開発された品種がある。カノーラ種子を生産
して収穫し、磨砕および加工する際の種子の純度が、いまや問題となってきてい
る。油に異なる特性（例えば、高ラウリン酸含量）を付与する多数のさらなる組
換え遺伝子を有するカノーラの改質が切迫しており、また、医薬のような異種タ
ンパク質の製造装置として植物が用いられるため、重大な産業上の交雑汚染の可
能性が予想される。
【０００７】 これらの問題は、アブラナ属の油糧種子の他に、多くの作物についても存在す
る。トウモロコシでは、除草剤耐性、昆虫耐性および改質された最終生産物（例
えば、澱粉、油、粉末）の多様性へ注目度が増加しているため、多くの異なる形
質がトウモロコシ作物に組み入れられることが明確に示唆される。幾つかのトウ
モロコシ品種は、湿式製粉もしくは飼料、または薬理学的に重要なタンパク質の
生産のような限定された用途に用いられるので、本流からこれらの特定の種類を
隔離する問題もある。トウモロコシの花粉が時にはかなりの距離を移動し得るこ
とを考慮すれば、受粉を制御する遺伝学的手段は極めて有利である。
【０００８】 同様に、多年生植物がそれらの野生型近縁生物へ接近していることも問題であ
る。例えば、昆虫耐性を発現するトランスジェニック樹木は、野生種の樹木と交
雑して昆虫耐性を発現する雑種を作製する可能性がある。農園のような管理され
た条件下では、昆虫耐性は環境に対してそれ程大きな影響力を持たない。しかし
ながら、昆虫耐性形質が天然の森林個体群に広がると、重大な生態学的問題が生
じる可能性がある。昆虫個体群は森林系における食物連鎖の一部であり、昆虫の
レベルが減少すると、トリの在来種であることが多い捕食生物の個体群が崩壊す
る可能性がある。従って、未管理系については、環境上の重要性を有することが
ある遺伝子の広がりを制御することが極めて望ましい目標である。
【０００９】 現在用いられている、花粉トラップとして働くボーダーロウ(border rows)と
組み合わせた物理的隔離は、研究中および開発中のトランスジェニック植物を格
納するために採用されている。しかしながら、この方法は、広汎な栽培には実用
的でない。さらに、様々なトランスジェニックタイプの数が増加し、それらの生
産および分布が増加すると、汚染の可能性は急激に増加する。この問題は、近来
油糧種子ナタネ産業について大きな関心を集めており、多数の様々な組換えおよ
び特別の遺伝子型が市場に登場するにつれて、他の主要作物（例えば、トウモロ
コシ）についても一層大きな問題となるであろう。
【００１０】 商業的作物生産物の間における交雑汚染の他に、商業上または医薬上重要な異
種タンパク質生産のためのビヒクルとして用いられる作物が広がる可能性も重要
である。これらの新規タンパク質産物は、食用および輸出用の植物を汚染する可
能性がある。個々のトランスジェニック系の同一性を保存し、意図しない汚染を
減少させようとする生産基準を実行することができるが、結局は遺伝子が他の栽
培品種へ流出することとなる。例えば除草剤耐性によって、容易には確認するこ
とができずかつ特有の形態も伝えない遺伝子の潜在的広がりは、未だ当局や産業
界によって検討されていない。
【００１１】 環境や他の商業的栽培品種への導入遺伝子の広がりを制御する方法は、異種生
殖細胞質の、同一性が保存された商業品種への遺伝子移入の防止にも有用である
。ここで、「異種生殖細胞質」とは、同一性が保存された栽培品種の形質の完全
な相補物を含まない任意の生殖細胞質として定義される。従って、異種生殖細胞
質としては、作物の性的和合性の野生型類縁種および他の商業的品種の両方を挙
げることができる。商業的生産が意図される新規形質を有する植物の数が増加し
ているため、種子生産および一次産品の汚染を防止する方法により、生殖細胞質
純度および同一性保存を保持するための重要な手段が提供される。
【００１２】 一例としては、大豆、トウモロコシおよびカノーラのような油糧種子作物の植
物油生産性を変更する多くの酵素が試験されている。これらの植物種は、食用に
適さない短鎖または長鎖の工業用脂肪酸、並びに食用油の生産に用いられてきた
。改質油分種子は、油分改質遺伝子を有する花粉を確保し、食用油品質種子を汚
染しないように単離しなければならないので、これにより種子生産産業における
問題点が増大する。多数の作物について種子生産で日常的に実施されている隔離
距離は、必要な水準の純度を確保するのに十分ではないことがある。作物植物を
用いて医薬活性化合物のような特殊な産物を生産する場合には、生殖細胞質の僅
かな汚染であっても極めて望ましくない。
【００１３】 カノーラのような油糧種子作物は、典型的には収穫前に種子を粉砕する。これ
により、翌年にかなりの数の自生植物が生じ、交雑および発生する作物に対する
花粉の直接的影響（キセニア効果）によってその後の商業的生産物を汚染する可
能性がある。さらに、将来の植え付けのために農家が確保して散布しておいた種
子も、汚染の問題に影響を与える可能性がある。
【００１４】 多年生植物については、樹木の寿命が長く、土地固有の野生類縁種が存在する
ことにより別の問題が起きる。ある種の樹木は開花までに多くの年月がかかり、
多くの年月にわたって継続することができ、かつ風による広範な受粉に特に適し
ている多量の花粉を生産する。従って、トランスジェニック樹木は特殊な問題を
引起し、野生類縁種への遺伝子の流れを制御する機構を必要とすることがある。
【００１５】 幾つかの新規な種類の作物は、野生類縁腫との雑種形成によって天然の生態系
を侵食することがある。この問題や関連の問題は、詳細に討議されてきている（
例えば、カリフォルニア大学、農業生物学における危険性アセスメント：国際会
議議事録、１９９０年、Casper, R., & Landsman, J., 1992, 遺伝子修飾植物お
よび微生物の屋外試験の生物学的安全性の成績。遺伝子修飾植物および微生物の
屋外試験の生物学的安全性に関する第二回国際シンポジウム議事録、１９９２年
、ゴスラー、ドイツ、Dale, P. et al., 1992, トランスジェニック植物の野外
放出。英国作物保護会議。ブライトン作物保護会議：有害生物および疾病、第Ｉ
、IIおよびIII巻。遺伝子修飾植物および微生物の屋外試験の生物学的安全性の
成績についての第三回国際シンポジウム議事録、１９９４年、モンデレー、カリ
フォルニア、D.D. Jones, 1994）。
【００１６】 これまでに行われたこれらの研究および実験成績の総意は、導入遺伝子の野生
類縁種への潜在的広がりの程度は種および環境条件によって著しく異なるという
考察を支持している。類縁種との交雑は起こらないと思われる種もあれば、その
可能性のある種もある(Raybould & Grey, J. Applied Ecology, 30: 199-219, 1
993)。多くの作物は極めて特殊化されており、非競合的栽培に適しているので、
それら自体が重大な環境上の危険とは一般には考えられない(Dale et al., Plan
t Breeding, 111: 1-22, 1993, Fishlock, D., PROSAMOレポート(PROSAMO Repor
t), 政府化学者の実験室により公表、クイーンズロード、テッディングトン、ミ
ドルセックス、英国 TW11 0LY）。例えば、ウイルス組換えおよび広汎な宿主範
囲による新規ウイルスの発生の潜在的可能性を有するウイルスコートタンパク質
遺伝子の封入は現在のところは知られていない(Gal S., et al., Virology, 187
:525-533; Grimsley, N., et al., EMBO Journal, 5:641-646, 1986; Lecoq, H.
, et al., Molec. Plant Microbe Interact., 6:403-406, 1993; Tepfer, M., B
iotechnology, 11:11251132, 1993)。従って、この種の遺伝子の潜在的流出を制
限し、またはこのような遺伝子を含む植物を選択的に除去する方法が必要である
。
【００１７】 組換えＤＮＡによって導入された新規形質を含む植物を特異的に除去しまたは
同定する方法の開発が試みられてきた。例えば、条件致死遺伝子、すなわち一定
条件下で植物細胞を死滅させる遺伝子の使用が、特定の組換えＤＮＡを含む植物
細胞を選択的に殺す手段として示唆されている。最近は、植物で条件的に致命的
になる遺伝子の開発が報告されている（例えば、ＷＯ９４／０３６１９号明細書
）。しかしながら、これらの遺伝子を用いる方法は、致死表現型の発現を誘発す
る物質の適用に限定されている。広汎な農業での実施については、これらの方法
は非常に制限されている。
【００１８】 条件致死遺伝子の一例は、「遺伝子２」または「癌遺伝子２」と通常呼ばれて
いるAgrobacterium Tiプラスミド由来の癌遺伝子である。この遺伝子は、本質的
に植物ホルモン活性を持たない化合物であるインドールアセタミドを加水分解し
て活性なオーキシン植物ホルモンであるインドール酢酸を形成する酵素であるイ
ンドールアセタミドヒドロラーゼ（ＩＡＭＨ）をコードする。この酵素ＩＡＭＨ
は、ナフタレンアセタミドなど、多数のインドールアミド基質を加水分解して、
周知の合成植物成長調節因子であるナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を生産することが
できる。異常植物(roguing plants)についてのＩＡＭＨ遺伝子の使用は、Jorgen
sonによって報告されている（米国特許第５，１８０，８７３号明細書）。この
方法は、条件致死遺伝子を有する植物を識別するためにＮＡＭを適用する必要が
ある。
【００１９】 他の酵素を、条件致死遺伝子として用いることもできる。これらの酵素として
は、毒性のない物質を毒素に転換するために直接作用する酵素、例えば、毒性の
ない２−アミノ−４−メトキシ−酪酸（メトキシニン）を毒性のあるメトキシビ
ニルグリシンに転換する酵素メトキシニンデヒドロゲナーゼ(Margraff, R., et
al., 1980, Experimentia, 36: 846)、毒性のない２−アミノ−４−メトキシ−
酪酸を毒性のある２−アミノ−４−［２−アミノ−３−ヒドロキシプロピル］−
トランス−３−酪酸（リゾビトキシン）に転換する酵素リゾビトキシンシンター
ゼ(Owens, L.D., et al., 1973, Weed Science, 21: 63-66)、不活性な除草剤誘
導体Ｌ−Ｎ−アセチル−ホスフィノトリシンを活性な植物毒性化合物ホスフィノ
トリシンに特異的に転換する作用を行うデアシラーゼ酵素（Bartsch, K. and Sc
hultz, A., 欧州特許第６１７１２１号明細書）、および除草剤グリフォセート
の不活性なエステル誘導体を加水分解して活性な除草剤を形成することができる
酵素ホスホネートモノエステルヒドロラーゼ（Dotson, S.B. and Kishore, G.M.
, 1993, 米国特許第５，２５４，８０１号明細書）が挙げられる。他の条件致死
遺伝子は、致死遺伝子から遺伝子工学により作成することができる。環境または
生理的条件に応答してのみ発現する致死遺伝子は、これらの条件下で致死的であ
る。例えば、致死活性をコードする遺伝子を、特異的な化学的誘導または人工的
または天然に存在する生理学的ストレスに応答して誘導されるプロモーターの制
御下に置くことができる。このやり方では、致死遺伝子活性の発現は、インデュ
ーサーの存在を条件とする。
【００２０】 毒性のない物質に作用してこの物質を毒性物質に転換する条件致死遺伝子の発
現は、典型的には総てのまたはほとんどの細胞の種類で発現する構成的プロモー
ターまたは一定の細胞の種類でまたは所定の発生段階で発現する発生制御プロモ
ーター(developmentally regulated promoter)であるプロモーターによって調節
される。十分なレベルの発現を行う任意のプロモーターを用いることができる。
しかしながら、実際には、長期間にわたり高レベルの発現を行うプロモーターが
、望ましくない植物を除去するための最善の機会を提供する。
【００２１】 致死表現型を誘導するために薬品を用いる必要があるため、条件致死遺伝子の
有用性が減少している。薬品の広汎な適用は非実用的であり、別の環境問題を引
起すことがある。従って、現在報告されている条件致死遺伝子の使用は、致死表
現型を発現させるための介在を必要とするため、一般的適用については理想的な
ものではない。
【００２２】 抑制致死遺伝子を用いて雑種作物の残存率を制限する可能性が、最近Oliver e
t al.によって示唆されている（特許出願ＷＯ９６／０４３９３号明細書）。こ
の系では、致死遺伝子の発現は特異的リプレッサータンパク質に結合する遺伝子
要素によって遮断される。リプレッサータンパク質は、典型的には細菌のリプレ
ッサー遺伝子の産物である。リプレッサータンパク質に結合する遺伝子要素は、
遮断配列(blocking sequence)と呼ばれ、ＤＮＡリコンビナーゼ酵素（例えば、
ＣＲＥ酵素）によって認識されるＤＮＡ配列をも含んでなるように構築する。上
記の遮断された致死遺伝子を含む植物を、ＤＮＡリコンビナーゼ遺伝子を含んで
なる植物と交雑させる。致死遺伝子またはリコンビナーゼ酵素（または両方）を
、植物発生の特定の段階（例えば、種子胚）でのみ発現することができる調節要
素によって制御する。その結果、生成するＦ１雑種植物におけるリコンビナーゼ
機能によって特異的遮断配列が除去され、致死遺伝子が活性化されて、Ｆ２植物
が生成しなくなる。特に、この機構は、新規形質を有する生殖細胞質異系交雑も
異種生殖細胞質の遺伝子移入も制御することができない。この方法は、自家また
は開放(open-)受粉品種には適用されない。従って、この方法は、Ｆ１雑種種子
への使用（例えば、移植）を制限する手段としてのみ用いられる。
【００２３】 選択可能マーカーのような形質転換体を得るのに用いられる組換えＤＮＡ配列
を除去する方法が開発されている。トランスポザーゼまたはリコンビナーゼを用
いてトランスジェニック作物植物から選択された組換え配列を除去することは、
米国特許第５，４８２，８５２号明細書（生物学的に安全な形質転換系、Yoder
and Lassner）に記載されている。この発明には、ベクターおよびマーカー遺伝
子配列をトランスポゾンに封入することによってこれらを除去する方法が記載さ
れている。従って、これらの配列は、この植物をトランスポザーゼ機能を有する
植物と交雑することによって除去される。
【００２４】 しかしながら、公表された方法では、交雑受粉による関連品種の汚染の問題に
ついては全く検討されていない。当該技術分野でも、関連花粉、特に（複数の）
遺伝子形質を欠いていることを除き同一品種からの花粉を用いる受粉による異種
生殖細胞質の遺伝子移入を防止する手段は提供されていない。
【００２５】 従って、異系交雑および遺伝子移入を介在なしに制限する方法が、新規形質お
よび新規形質を有する作物の管理および制御に必要である。商業作物の交雑汚染
を制御する機構も必要である。このような機構は、樹木、灌木およびブドウの木
のような多年生作物の管理にも必要である。特に、介在を必要とせずに機能する
任意の機構が、多年生作物に極めて適している。本発明は、これらの要望に応じ
る方法および遺伝子組成物を記載する。
【００２６】
【発明の概要】
本発明は、組換えＤＮＡを含む植物によって生産される花粉による意図しない
異系交雑から生じる同一種または関連種の他の栽培品種における遺伝子の広がり
および残存率を遮断する方法および組換えＤＮＡ組成物を含んでなる。さらに、
本発明によれば、異種生殖細胞質の遺伝子移入は自殖個体群では確実に除去され
る。
【００２７】 本発明は、組換えＤＮＡを含む植物に新規特徴を付与する新規な組換えＤＮＡ
構築物に関する。この特徴は、組換えＤＮＡの完全な相補物を含む植物でのみ生
育可能な種子を形成させることができる。さらに、本発明は、組換えＤＮＡの完
全な相補物を含まない植物では致死的である形質の発現によって所定の個体群内
の生殖細胞質または遺伝子形質を確実に有性単離する手段も提供する。本発明に
よれば、トランスジェニック植物によって受精するが組換えＤＮＡを持たない植
物は、生育可能な種子を形成することができない。
【００２８】 この新規な遺伝子構築物は、植物に形態学的に明確なまたは容易に検出される
表現型を付与しない。それらは、意図しない有性交雑が起こるときにのみ発現さ
れるサイレント遺伝子を含んでなる。意図しない交雑により、致死形質が発現し
、望ましくない植物細胞は除去される。従って、本発明は、性的和合性種との異
系交雑による生育可能な種子の形成を制限する。新規なＤＮＡ構築物は、この構
築物を欠いている性的和合性種からの花粉による交雑受粉からの形質の遺伝子移
入を効果的に減少させる手段も提供する。
【００２９】 本発明は、特定の栽培品種または品種改良系が異種生殖細胞質によって汚染さ
れず、または他の栽培品種および品種改良系を汚染しないことを確保するＤＮＡ
構築物中でコードされる遺伝的形質を提供する。これにより、トランスジェニッ
ク植物を遺伝学的に単離するための好都合な手段が提供される。新規なＤＮＡ構
築物は、種子生産および野外での一次産品の生産の際に生殖細胞質純度を確保す
る手段として用いることができ、また開放受粉および雑種作物品種のいずれでも
用いることができる。
【００３０】 新規なＤＮＡ構築物を新規な作物学的または表現型形質をコードするＤＮＡ分
子に結合することによって、新規な作物学的または表現型形質はそれが導入され
た遺伝子型の外側では持続しないようにする。本発明のこの側面は、新規な作物
学的または表現型形質を有する作物または食物育種法によって開発された通常の
形質の独特な組合わせを有する作物の管理に有用である。
【００３１】 一態様では、本発明は２種類のＤＮＡ構築物を含んでなる遺伝子系を提供する
。一つのＤＮＡ構築物は、活性であるときには細胞を死滅させ、かつリプレッサ
ー遺伝子を含んでなり、このリプレッサー遺伝子が抑制可能な優性致死遺伝子か
ら独立して隔離されている遺伝子座に配置されている第二のＤＮＡ構築物を含む
植物細胞では、その発現が抑制される優性抑制可能致死遺伝子を含んでなる。こ
のリプレッサー遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質、致死遺伝子活性の直接的阻害
剤、または致死表現型を阻害することができるＲＮＡ、リボザイムまたはアンチ
センスＲＮＡであることができるリプレッサー分子をコードする。
【００３２】 図１は、本発明のこの態様で用いることができる遺伝子構築物を示している。
【００３３】 好ましい態様では、優性抑制可能致死遺伝子は種子特異的プロモーターによっ
て制御され、リプレッサー分子をコードする遺伝子は抑制可能優性致死遺伝子か
ら独立して隔離されている遺伝子座に配置される。抑制可能優性致死遺伝子およ
びリプレッサー遺伝子は、いずれもホモ接合状態である。自家受粉は、この遺伝
子の組合わせを保持する。
【００３４】 もう一つの好ましい態様では、ＤＮＡ構築物は、抑制可能致死遺伝子に結合し
た条件致死遺伝子をも含んでなる。条件致死遺伝子は化学的または生理学的スト
レスを加えて活性化し、必要な場合には環境から組み換えＤＮＡを含む植物また
は細胞を完全に除去する手段を確保することができる。従って、抑制可能致死遺
伝子を含む自家受粉細胞をも、条件致死遺伝子によって個体群から選択的に除去
することができる。
【００３５】 さらに好ましい態様では、条件致死遺伝子に結合した抑制可能致死遺伝子を、
さらに新規形質をコードする遺伝子に結合する。第二のＤＮＡ構築物は、抑制可
能致死遺伝子の活性を遮断することができるリプレッサーをコードする遺伝子を
含んでなる。別々のＤＮＡ構築物が、同一細胞に導入される。新規な形質を抑制
可能致死遺伝子に結合させることによって、新規な形質は、有性交雑による遺伝
子導入(transfer)によって関連種では持続することができなくなる。
【００３６】 さらにもう一つの態様では、抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子を含ん
でなるＤＮＡ構築物は、植物細胞に導入される単一の組換えＤＮＡ分子中にある
。単一の組換えＤＮＡ分子は、さらに部位特異的リコンビナーゼまたはトランス
ポザーゼによって認識される配列を含む。リコンビナーゼまたはトランスポザー
ゼ活性によって、挿入された組換えＤＮＡからリプレッサー遺伝子が除去される
。この態様の要素として、リプレッサー遺伝子が独立して隔離された遺伝子座に
再度組込まれ、特に相同染色体対の対向染色体上の同じ遺伝子座に再度組込まれ
る。この態様の範囲内で用いることができるＤＮＡ構築物を、図２に示す。
【００３７】 もう一つの好ましい態様では、２種類の抑制可能致死遺伝子とこれらの抑制可
能致死遺伝子に対する２種類の機能的に異なるリプレッサーを含んでなるＤＮＡ
構築物が植物細胞に導入される。これらの遺伝子は、好ましくは、図３に示すよ
うに、第一の抑制可能致死遺伝子が第二の抑制可能致死遺伝子を抑制することが
できるリプレッサーに結合し、第二の抑制可能致死遺伝子が第一の抑制遺伝子を
抑制することができるリプレッサーに結合するように配置される。場合によって
は、構築物は、植物細胞に導入される単一の組換えＤＮＡ分子を含んでなる。単
一の組換えＤＮＡ分子は、部位特異的リコンビナーゼまたはトランスポザーゼで
あって、その活性によって組換えＤＮＡから第一の抑制可能致死遺伝子と第二の
抑制可能致死遺伝子とが除去されるものによって認識される配列を含んでいる。
この任意態様の要素として、第一の抑制可能致死遺伝子と、結合した第二のリプ
レッサー遺伝子とが独立して隔離されている遺伝子座に再度組込まれる植物が選
択される。
【００３８】 上記の態様は、独立して隔離されている遺伝子座にＤＮＡ構築物をランダムに
挿入することに依存している。しかしながら、幾つかの応用については、組換え
ＤＮＡを特異的遺伝子座に導入する手段が望ましいことがある。従って、本発明
は、組換えＤＮＡを特定の遺伝子座へ標的設定する方法を提供する。
【００３９】 植物ゲノムで予め確立された遺伝子座に組換えＤＮＡを導入するための部位特
異的リコンビナーゼの使用を考察する。部位特異的リコンビナーゼによって認識
されるリコンビナーゼ標的ＤＮＡ配列を、標準的形質転換手続きによって植物ゲ
ノムに挿入する。植物を、自家受粉および葯または単離した小胞子培養物の選択
のような既知の方法によって標的ＤＮＡ配列についてホモ接合性とする。あるい
は、上記挿入配列についてホモ接合性の植物を、半数体細胞または組織の形質転
換に続いて染色体倍加によって直接作製することができる。
【００４０】 植物で発現可能な適当なリコンビナーゼを、形質転換、マイクロインジェクシ
ョン、電気穿孔などの数種類の方法のいずれかによって標的ＤＮＡ配列にホモ接
合性の植物細胞に挿入する。次いで、植物細胞を、抑制可能致死遺伝子またはリ
プレッサー遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物で独立して再形質転換する。これら
のＤＮＡ構築物を部位特異的リコンビナーゼ認識配列を含むように修飾して、Ｄ
ＮＡ構築物を予め存在しているリコンビナーゼ標的ＤＮＡ配列に挿入することが
できるようにする。従って、第一の抑制可能致死遺伝子または第一のリプレッサ
ー遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物を含む植物系が回収される。この系を交雑す
ることによって、相同染色体対の対向染色体上の同じ遺伝子座に導入されたＤＮ
Ａ構築物（抑制可能致死遺伝子およびリプレッサー）を含む植物を回収すること
ができる。
【００４１】 従って、部位特異的挿入法は、抑制可能致死遺伝子と、幾つかの態様では優性
条件致死遺伝子とを含んでなるＤＮＡ構築物の調製を含んでなる。この方法は、
致死遺伝子と同時にまたは独立して挿入することができるリプレッサー遺伝子の
調製をも含んでなる。抑制可能致死遺伝子を、好都合には挿入された抑制可能致
死遺伝子から独立して隔離されている染色体部位に配置されたリプレッサー遺伝
子によってコードされるリプレッサーによって抑制する。植物ゲノム中の特定の
部位、特に特異的リコンビナーゼ認識部位を挿入した部位にリプレッサーおよび
抑制可能致死遺伝子を標的設定する手段として部位特異的組換えを用いることは
、本発明の方法の範囲内にある。本発明のこの態様で用いることができるＤＮＡ
構築物および工程の一例を、図４に示す。
【００４２】 本発明は、開放受粉作物での単純な自家受粉によってトランスジェニック植物
の遺伝学的純度を保持することができる方法および組成物を提供する。いかなる
介在も不要である。本発明は、さらに組換えＤＮＡを含む植物の好都合な調製、
増殖および管理の方法を提供する。遺伝子組成物が、開放受粉および雑種植物生
産系で使用する目的で提供される。Brassica napus油糧種子のような開放受粉作
物で用いられる方法の使用を図５に示し、トウモロコシのような雑種作物で用い
られる方法の使用を図６に示す。
【００４３】 花粉の生産の際には、抑制可能致死遺伝子は、上記の遺伝子機構に従ってリプ
レッサー遺伝子から隔離されている。従って、任意の異系交雑した植物（すなわ
ち、抑制可能致死遺伝子を有する花粉を不注意によって受け取った植物）は生育
可能な種子を形成することができないのであり、これは、新たに形成した種子は
致死遺伝子の発現を抑制するリプレッサーを含まないからである。致死遺伝子は
自家受粉した植物では抑制されるのであり、これは、これらの植物は致死および
リプレッサー遺伝子を両方とも保持しているからである。抑制可能致死遺伝子に
結合した条件致死遺伝子をも含んでなる態様については、これらの遺伝子を含む
植物は化学的または生理学的ストレスを加えて条件致死遺伝子を活性化すること
によって除去することができる。
【００４４】 本発明は、交雑による遺伝子導入の危険性が実質的に減少したまたはゼロの組
換え植物を生産するための方法および組成物を提供する。幾つかの態様では、廉
価で環境に優しい薬品を加えることによって植物を生育部位から安全かつ特異的
に除去することができる。
【００４５】 本発明は、交雑受粉または自生植物種子による同一種の他の商業的生産の汚染
の可能性を回避しなければならない大規模な農業および産業上の用途の作物植物
の生産に極めて適している。本発明は、さらに他の生育地の侵食によって環境破
壊を引起すことがありまたは野生の雑草類縁種と交雑することによってその導入
遺伝子を広げることがある組換え植物の安全使用および環境保護の機構を提供す
る。
【００４６】 本発明は、特に同一種の他の商業生産を汚染する危険性なしに異種タンパク質
生産者としての作物植物の生産法を提供する。
【００４７】 本発明は、さらに商業的植物品種への異種生殖細胞質の遺伝子移入を制御しか
つ導入遺伝子を含んでなる系統の遺伝学的純度を保持する手段を提供する。これ
らの遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物を新規形質遺伝学に結合してまたは結合す
ることなく用いて、種子生産または一次産品の生産中に遺伝学的純度を確保する
手段を提供することができることが注目される。
【００４８】 自家不和合性作物のような幾つかの作物については、本発明は自家不和合性に
よる雑種種子生産を改良する。本発明のこの特定の態様では、自家不和合性の雌
性親を、抑制可能致死遺伝子を有するがリプレッサー遺伝子は持たないように改
質する。この雌性系は、生育可能な種子を形成することができない。この自家不
和合性の雌性親をリプレッサー遺伝子を有する花粉と交雑すると、抑制可能致死
遺伝子とリプレッサー遺伝子とをいずれも有する生育可能な雑種種子を生産する
。昆虫耐性のような新規形質を抑制可能致死遺伝子と結合することによって、関
連種での形質の伝播および残存も防止される。
【００４９】 自家不和合性作物で抑制可能致死遺伝子を用いることによって、商業的種子生
産でしばしば見られる雌性親での自家不和合性の崩壊の問題が除去される。この
崩壊の問題は、雑種種子の自家受粉種子汚染を生じる。抑制可能致死遺伝子を用
いることによって、自家受粉種子はリプレッサーを欠いておりかつ自家不和合性
であるので雌性親では不可能である。雌性系を保持するための好都合な手段（例
えば、所定条件下での誘導可能なリプレッサーの使用）を用いて、雌性親の数を
増加することができる。あるいは、この系をクローニングによって増殖させるこ
とができる。自家不和合性を解決するための現在用いられている機構としては、
高二酸化炭素および他のストレス処理が挙げられる。自家不和合性を解決するの
に用いたのと同一条件下で誘導可能なプロモーターを用いることは、雌性親の種
子生産を増加するための特に好都合な手段を提供するので、本発明の範囲内にあ
る。この方法は、自家不和合性が一般に適用されるアブラナ属の野菜作物の生産
に特に有用である。
【００５０】 下記の用語は、本発明の範囲内で定義され、用いられる。
【００５１】 異種生殖細胞質：個々の作物植物または品種の特有の遺伝学的性質の一部では
ない遺伝子、または遺伝子または遺伝形質の組合せ。
【００５２】 遮断または「ブロック」：リプレッサーによる致死遺伝子活性の抑制。遮断と
しては、リプレッサーの特異的ＤＮＡ配列への結合、アンチセンスＲＮＡまたは
リボザイムの一次ＲＮＡまたはｍＲＮＡ転写体への結合、抑制因子の致死遺伝子
産物への結合、例えば毒性を有するリボヌクレアーゼまたは毒性を有するプロテ
アーゼへのＲＮアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤の結合によるＲＮＡ転写の防止
が挙げられる。致死表現型の発現を防止する任意の方法は、致死表現型を「遮断
する」ものと考えることができる。
【００５３】 条件致死遺伝子：植物細胞を薬品感受性にする表現型を植物細胞に付与する遺
伝学であり、上記薬品は遺伝学的または化学的性質のものでよく、上記感受性は
究極的には植物細胞を死滅させる。
【００５４】 構成的プロモーター：実質的に総ての植物細胞、組織および器官で遺伝子発現
を引起すことができるＤＮＡ配列。
【００５５】 脱抑制致死遺伝子：機能的リプレッサーが存在しないため致死表現型を発現す
る致死遺伝子。
【００５６】 遺伝子：転写終結シグナルをも含んでなるプロモーターの制御下で被転写領域
を含んでなるＤＮＡ発現カセット。
【００５７】 誘導性プロモーター：化学、物理または環境インデューサーに応答して遺伝子
発現を引起すことができるＤＮＡ配列。
【００５８】 遺伝子移入：種子を形成するための花粉ドナーであることを意図しない植物か
らの通常は花粉による有性交雑による遺伝子または複数の遺伝子の望ましくない
移動。
【００５９】 致死遺伝子：植物細胞で発現するとき、究極的には植物細胞を死滅させる遺伝
子。
【００６０】 致死遺伝子活性：植物細胞を死滅させる遺伝子活性。致死遺伝子活性は単一遺
伝子によるものであることができ、または２個以上の遺伝子の組合せ発現の結果
であることもできる。
【００６１】 癌遺伝子：Agrobacterium sp.による影響を受けやすい植物の感染の結果とし
て腫瘍形成または異常植物生長に関与する酵素をコードする遺伝子。既知の癌遺
伝子としては、TiプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域のtmrおよびtms座を含んでなるも
のが挙げられる。
【００６２】 異系交雑：ある遺伝子型の植物からの花粉の異なる遺伝子型の性的和合性植物
への移動。異系交雑は、通例は花粉の意図しない移動を記載するのに用いられる
が、幾つか植物種、特に自家不和合性の植物種では、異系交雑は不和合性植物の
個体群内の正常な受粉の結果を表すのにも用いられる。
【００６３】 プロモーター：植物細胞で遺伝子発現を引起すことができるＤＮＡ配列。
【００６４】 リプレッサー：遺伝子産物の活性または遺伝子の発現を特異的に遮断すること
ができる遺伝子産物。リプレッサーはタンパク質、ＲＮＡ、またはリプレッサー
遺伝子産物の活性によって生産される特異的物質であることができる。
【００６５】 リプレッサー結合部位：リプレッサーによって特異的に認識されるＤＮＡ配列
であり、上記認識により、上記リプレッサー結合部位を含む遺伝子の発現が阻害
される。幾つかの態様では、リプレッサー結合部位はリボザイムまたはアンチセ
ンスＲＮＡによって認識されるＲＮＡ配列を表すこともできる。
【００６６】 リプレッサー遺伝子：機能的リプレッサーを発現することができるＤＮＡ発現
カセット。
【００６７】 抑制された致死遺伝子：遺伝子活性の結果である致死表現型がリプレッサーの
存在によって遮断される致死遺伝子。
【００６８】 抑制可能致死遺伝子：致死遺伝子であって、その発現を特異的リプレッサー分
子の作用によって阻害することができるもの。
【００６９】 リプレッサーに対して応答性：致死遺伝子または致死遺伝子産物であって、そ
の致死活性が致死遺伝子活性のリプレッサーの存在に応答して阻害されるもの。
【００７０】 自家受粉：種子または生殖構造を形成する自家受粉。
【００７１】 組織特異的プロモーター：特定の植物細胞、器官または組織でのみ実質的な遺
伝子発現を引起すことができるＤＮＡ配列。
【００７２】 被転写領域：プロモーターの制御下で転写されるＤＮＡ配列。上記ＤＮＡ配列
は、タンパク質に翻訳することができるＲＮＡをコードすることができ、または
遺伝学の発現を特異的に阻害しまたは防止することができるＲＮＡをコードする
ことができる。
【００７３】 転写終結配列：転写の終結を定義するＤＮＡ配列。
【００７４】
【発明の具体的説明】
本発明によれば、トランスジェニック植物を生産する新規手段についての方法
および組成物であって、上記植物由来の花粉を介して他の栽培品種または関連種
への組換え遺伝子の導入および残存率が実質的に減少していることを特徴とする
ものが提供される。また、この方法は、生殖細胞質の異系交雑を制限し、さらに
性的和合性植物種においても異種生殖細胞質の遺伝子移入を制限するＤＮＡ構築
物を有する自家受粉植物系を生産することができる。
【００７５】 従って、この方法は、抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子とを含んでな
る組換え分子を含む生殖細胞質の遺伝子単離および同一性保存を提供する。この
方法は、さらに化学薬品の適用または植物を生理学的ストレスに暴露することに
よる任意の生長部位から組換え植物を除去する手段を可能にする。
【００７６】 第一の態様では、本発明は、 I.)植物細胞での形質転換および選択に必要なＤＮＡ配列の他に、細胞にとっ
て有害または破壊的であって、細胞を死滅させおよび究極的には全植物体を死滅
させる生成物をコードするＤＮＡ配列（致死遺伝子）を含んでなる第一のＤＮＡ
発現カセットを調製する。致死遺伝子の発現を、適当なプロモーター、好ましく
は種子特異的プロモーターによって調節する。上記致死遺伝子構築物は、さらに
リプレッサーに応答性のＤＮＡ要素を含んでなり、致死遺伝子活性の発現は上記
リプレッサー分子の存在下では遮断される。目的とする形質（新規形質）をコー
ドする遺伝子を致死遺伝子に結合することができる； II.)植物細胞での形質転換および選択に必要なＤＮＡ配列の他に、第一のＤＮ
Ａ発現カセットに含まれる致死遺伝子活性の発現を遮断することができるリプレ
ッサー分子をコードするリプレッサー遺伝子を含んでなる第二のＤＮＡ発現カセ
ットを調製する。リプレッサー遺伝子の発現を、植物細胞で活性なプロモーター
、好ましくは総ての植物細胞で発現するプロモーター、さらに好ましくは致死遺
伝子の発現を阻害するのに十分なレベルおよび時間で発現するプロモーターによ
って調節する；および III.)(I)および(II)で記載した組換えＤＮＡを形質転換することができる植物
細胞に挿入し、この細胞を完全な植物体に再生し、減数分裂の際に(I)および(II
)のＤＮＡが独立して調和している植物ゲノムの位置に(I)および(II)のＤＮＡを
含む植物を回収する； ことを含んでなる方法を提供する。
【００７７】 「新規形質」をコードする遺伝子は、目的とする任意の組換えタンパク質また
はペプチドであることができる。典型的には、この「新規形質」は商業的関心の
ある異種タンパク質、または除草剤耐性のような作物学的に有用な形質を付与し
ているタンパク質である。リプレッサーを欠いている自生または栽培された性的
和合性植物との交雑による新規形質の導入は、致死表現型が種子に現れるため限
定されており、新規形質遺伝子を受け取った種子は発育不全となる。致死遺伝子
活性は単一のコード生成物または協同的に作用する２個以上の独立した遺伝子産
物を含んでなり、致死表現型を発現することができることも考えられる。
【００７８】 減数分裂の際に抑制致死ＤＮＡおよびリプレッサー構築物の通常は「隔離(seg
regation)」と呼ばれる独立した分類を最大にするため、組換えＤＮＡ分子を異
なる染色体上に配置する。形質転換の標準的方法では、組換えＤＮＡは植物ゲノ
ム中にランダムに挿入されることが知られており、従って、大部分の植物では、
組換えＤＮＡは異なる染色体に配置されることが予想される。遺伝子の独立した
分類および挿入ＤＮＡの配置は、簡単な周知の方法によって決定される。
【００７９】 異なる染色体に配置された抑制致死およびリプレッサー構築物を有する植物の
種子増加は、植物が２種類の組換えＤＮＡ構築物についてホモ接合性であるとす
れば、分離して単純な自家受粉によって行うことができる。このようなホモ接合
性植物は、一次形質転換体の自家受粉によって、または形質転換手続きを二倍体
組織で行う場合には葯または小胞体培養によって得ることができる。あるいは、
このような植物は、小胞体または他の半数体細胞の形質転換に続いて染色体倍加
によって直接得ることができる。抑制可能致死遺伝子およびリプレッサーのいず
れにとってもホモ接合性の植物系は抑制可能致死遺伝子またはリプレッサーを含
んでなる同系の形質転換植物系を交雑することによって得ることができることは
当業者には明らかである。あるいは、葯培養および有性交雑のような単純な組織
培養法の組合せを用いて、両方の挿入されたＤＮＡにホモ接合性である植物を回
収することもできる。
【００８０】 上記のホモ接合性植物は、開放受粉作物として商業的規模で生育させることが
できる。このような植物の非組換えの性的和合性植物への異系交雑では、組換え
形質についてヘテロ接合性の植物の第一世代が得られる。異系交雑植物の次世代
では、減数分裂の際に遺伝子が独立して隔離され、新規形質を発現する植物の発
生率が急激に減少する。さらに、この方法の変法であって、抑制致死−新規形質
構築体がさらに条件致死遺伝子も含んでなるものも考えられる。このような遺伝
子構築物を含んでなる植物は、必要な場合には、致死表現型を活性化することに
よって、例えば薬剤噴霧によって除去することができる。
【００８１】 上記のホモ接合性植物は、雑種種子を形成することができる受粉制御系をも含
んでなるときには、雑種作物として商業的規模で生育させることができる。この
ような受粉制御系は、細胞質雄性不稔性、自家不和合性および遺伝子雄性不稔性
のような既知の種類の雄性不稔系のいずれかであることができる。さらに、雄性
不稔性は、幾つかの種では機械的手段によって達成することができ、または花粉
を特異的に殺す薬剤（花粉発育破壊剤）の投与によって得ることもできる。適当
な系の選択は、個々の作物種によって変化する。このような方法は、植物栽培に
熟練した者には周知である。抑制致死およびリプレッサー組換え遺伝子構築物に
ついてホモ接合性の植物を雑種交雑における雄性または雌性親として使用すると
、組換えＤＮＡ構築物についてヘテロ接合性の雑種種子が得られる。Ｆ２および
次世代におけるこれらの構築物を隔離すると、導入した新規な組換え形質を含ん
でなる植物は急激に減少する。
【００８２】 組換えＤＮＡのランダム挿入では、幾つかの場合に、相同染色体対の対向染色
体上で上記組換えＤＮＡが組込まれる。このような事象の発生頻度は、所定の植
物の遺伝子構成を含んでなる染色体対の数によって変化し、染色体対の数が少な
い植物で最大頻度で起こる。組換えＤＮＡ構築物の様々な数の相同染色体対への
導入は、減数分裂の際に抑制致死−新規およびリプレッサー構築物の隔離が直ち
にかつ完全に起こり、交差による組換えが起こらなかった場合にはこれらの構築
物を含む植物が異系交雑の結果として形成されないという利点を有する。本発明
のこの特別な変法は、目的とする形質（例えば、ホルモンまたは他の医薬活性分
子の生産）を厳密に制御する必要がある場合には組換え作物の開発に特に適して
いる。
【００８３】 組換えＤＮＡ構築物を様々な数のホモ接合性染色体対に挿入した植物の種子増
加は、抑制可能致死遺伝子およびリプレッサーに関して植物細胞が本質的にヘテ
ロ接合性であり、致死表現型が確実に抑制されるようにすることが必要である。
これは、抑制可能致死遺伝子を特異的薬剤に対する耐性を付与した選択可能なマ
ーカー遺伝子に結合することによって容易に達成することができる。特異的組換
え形質を有する植物の維持および選択に除草剤耐性遺伝子を使用することは、文
献に詳しく報告されており、本発明で用いることができる。野外レベルの耐性を
付与した任意の遺伝子を用いることができる。ホスフィノトリシンに対する耐性
を付与するホスホトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐａｔ）遺伝子のよう
な選択された遺伝子を、形質転換の際に選択に用いることも可能である。上記の
遺伝子構築物を含んでなる植物を自家受粉し、種子を野外条件下で生育し、除草
剤を噴霧する。抑制−致死的新規形質についてホモ接合性の植物（２５％）は、
リプレッサーの非存在下で致死遺伝子の作用によって枯れる。リプレッサー遺伝
子についてホモ接合性の植物（２５％）は、除草剤の作用によって枯れる。対照
的に、抑制致死−新規遺伝子とリプレッサー遺伝子を両方とも含む植物（５０％
）は、影響を受けない。新規形質遺伝子を抑制可能致死遺伝子に結合することに
よって、新規形質遺伝子は任意の意図しない性的和合性種への花粉の不注意によ
る導入によって生育可能な種子を形成することができなくなる。従って、意図し
ない植物個体群における新規形質の残存率は完全に限定される。
【００８４】 幾つかの応用については、２種類の抑制可能致死遺伝子およびリプレッサー遺
伝子構築物を用いる場合には、新規形質の広がりの制御が最適である。
【００８５】 本発明のこの態様によれば、２種類の抑制可能致死遺伝子構築物を含むトラン
スジェニック植物の新規な生産手段についての方法および組成物が提供される。
トランスジェニック植物の異系交雑によって生じる組換えＤＮＡを含んでなる総
ての植物は、環境から速やかに除去される。第一の抑制可能致死遺伝子構築物は
致死遺伝子であり、第二の抑制可能致死遺伝子および場合によっては目的とする
新規形質をコードする遺伝子の発現を遮断するリプレッサー遺伝子を含んでなる
。第二の抑制可能致死遺伝子構築物は、第二の致死遺伝子および第一の抑制可能
致死遺伝子の発現を遮断するリプレッサー遺伝子を含んでなる。これらの遺伝子
構築物を含む細胞は、２種類のリプレッサー分子を生産し、従って、いずれの致
死遺伝子も抑制状態のままである。減数分裂の際に遺伝子構築物を隔離すると、
リプレッサーおよび致死遺伝子が分離され、本来２種類の抑制可能致死遺伝子を
含む植物由来の任意の組換えＤＮＡを含む総ての植物を最終的に死滅させる。
【００８６】 従って、本発明のもう一つの態様では、トランスジェニック植物の新規な生産
手段の方法であって、 I.)植物細胞での形質転換および選択に必要なＤＮＡ配列の他に、第一の致死
遺伝子を含んでなる第一のＤＮＡ発現カセットを調製する。第一の致死遺伝子の
発現を、適当なプロモーター、好ましくは種子特異的プロモーターによって調節
する。この第一の致死遺伝子発現カセットは、第一のリプレッサー応答性部位を
含み、第一のリプレッサー分子によって致死遺伝子の発現を阻害することができ
る。場合によっては、第一のＤＮＡ発現カセットに、優性条件致死遺伝子、およ
び第一のリプレッサー分子とは機能的に異なり第二の致死遺伝子の発現を阻害す
ることができる第二のリプレッサーをコードする第二のリプレッサー遺伝子を含
んでなる第四のＤＮＡ発現カセットを含んでなる第三のＤＮＡ発現カセットが結
合している。新規形質をコードする遺伝子も包含されることがある； II.)植物細胞での形質転換および選択に必要なＤＮＡ配列の他に、第一のＤＮ
Ａ発現カセットに含まれる致死遺伝子の発現を阻害することができる第一のリプ
レッサー分子をコードする第一のリプレッサー遺伝子を含んでなる第二のＤＮＡ
発現カセットを調製する。第二のＤＮＡ発現カセットには、第二の抑制可能致死
遺伝子を含んでなり、その発現が第四のＤＮＡカセットに含まれている第二のリ
プレッサー分子によって抑制される第四のＤＮＡ発現カセットが結合している；
および III.)(I)および(II)で記載した組換えＤＮＡを形質転換することができる植物
細胞に挿入し、この細胞を完全な植物体に再生し、減数分裂および異系交雑の際
に(I)および(II)のＤＮＡが隔離されている植物ゲノムの位置に(I)および(II)の
ＤＮＡを含む植物を回収する； ことを含んでなる方法が提供される。
【００８７】 第一、第三または第四のＤＮＡカセットは、商業的または作物学的に興味深い
組換えタンパク質またはペプチドなどこれらに限定されない新規形質をコードす
る遺伝子に結合することができる。生成するトランスジェニック植物は、自生ま
たは栽培された優性の和合性植物で持続する能力が実質的に減少した形質を有す
る。これは、後者の植物がリプレッサーを欠いているからである。従って、結合
によって生じるあらゆる種子は致死遺伝子を発現し、発育不全となる。従って、
意図しない遺伝子型（すなわち、完全な組換えＤＮＡ相補物を含まない）におけ
る(I)または(II)の組換えＤＮＡの持続は阻害される。第一の(I)組換えＤＮＡを
含む植物は、条件致死マーカー遺伝子を用いることによって識別することもでき
る。
【００８８】 致死遺伝子活性は、単一のコードされた産物または２種類の独立した遺伝子産
物であって、協同的に作用して致死表現型を発現するものを含んでなることがで
きる。さらに、条件致死遺伝子は、上記抑制可能致死遺伝子と共同して致死表現
型を発現しまたは直接作用して致死表現型を発現させることができる外部から加
えられた物質に応答して作用することができる生成物を含んでなることがある。
【００８９】 上記の態様は、減数分裂の際に隔離される遺伝子座に２種類の組換えＤＮＡを
配置するための形質転換工程中のＤＮＡのランダム挿入に依存している。これは
、単一交雑および子孫の分析の結果として、または植物育種家によって実施され
る任意の手法を用いる挿入されたＤＮＡのマッピングによって達成される。この
ようにして、所望な遺伝子の組合せが得られる。
【００９０】 しかしながら、総ての必要とされるＤＮＡ発現カセットを単一分子内に同時に
導入した後、トランスポザーゼを用いて所望な（複数の）カセットを置き換える
ことは、本発明の範囲内にある。特異的転位は、トランスポザーゼのような組換
え酵素によって認識されるＤＮＡ配列の適当な組合せおよび配置を提供すること
によって生じることができる。
【００９１】 既知のトランスポゾンおよび関連トランスポザーゼ活性としては、トウモロコ
シ由来のAc/DsおよびEn/Spm要素（例えば、Federoff, N., トウモロコシ転位要
素(Maize Transposable Elements): Berg, D.E.およびHowe, M.M.（監修）移動
性ＤＮＡ(Mobile DNA), pp. 375-411, 米国微生物学会, ワシントン, コロンビ
ア特別区, １９８９年を参照）、キンギョソウ属由来のTam-1およびTam-3（例え
ば、Sommer et al., Antirrhinum majusの転位要素(Transposable Elements of
Antirrhinum majus): 植物転位要素(Plant Transposable Elements), O. Nelson
監修, Plenum Press, ニューヨーク, pp. 227-235, １９８８年を参照）、タバ
コ由来のTnt-1(Pouteau, S. et al., Mol. Gen. Genet., 228: 233-239, 1991)
、ペチュニア由来のTph-1(Gerats, A.G.M. et al., The Plant Cell, 2: 1121-1
128, 1991)、およびジャガイモ由来のTst-1(Koster-Topfer, et al., Plant Mol
. Biol., 14: 239-247, 1990)が挙げられる。
【００９２】 幾つかのトランスポゾンは、本発明で特に用いられる転位特性を有することが
ある。例えば、Ds要素は、同一染色体上の比較的短い距離にわたって転位する傾
向がある(Dooner and Belachew, Genetics, 122: 447-457, 1989; Dooner et al
., The Plant Cell, 3: 473-482, 1991; Jones et al., The Plant Cell, 2: 70
1-707, 1990; Osborne et al., Genetics, 129: 833-844, 1991, Rommens et al
., Plant Molecular Biology, 20: 61-70, 1992)。このような転位パターンは、
転位したリプレッサーを抑制可能致死遺伝子を有する染色体対の対向染色体上の
部位に転位する場合の遺伝子組合せの回収を促進する。
【００９３】 従って、特異的トランスポザーゼ酵素用いてリプレッサー遺伝子を抑制可能致
死遺伝子から独立して隔離されている遺伝子座に移動させることは、下記のよう
にして提供される。
【００９４】 ＤＮＡ構築物を、第一の抑制可能致死遺伝子の他にこの第一の抑制可能致死遺
伝子に結合したリプレッサー遺伝子を含むように改質する。リプレッサー遺伝子
を、さらにトランスポザーゼ酵素によって認識される特異的ＤＮＡ配列を３′お
よび５′末端に有することによって改質する。認識配列を、リプレッサー遺伝子
がトランスポザーゼによって切り取ることができるようなやり方で配置する。ト
ランスポザーゼは、さらに切り取ったリプレッサー遺伝子をゲノムのランダム位
置に再挿入してリプレッサー遺伝子が第一の抑制可能致死遺伝子から独立して隔
離されるようにすることを触媒する。
【００９５】 トランスポザーゼ酵素を植物細胞に一時的に導入し、または誘導性プロモータ
ーによって制御して、転位が誘導されるようにすることができる。あるいは、ト
ランスポザーゼを、活性トランスポザーゼを発現するように改質された同系また
はほぼ同系の植物系との単純な優性交雑によって導入することができる。
【００９６】 あるいは、２種類の抑制された致死遺伝子および２種類の独立リプレッサーを
用いる態様については、下記の方法が提供される。
【００９７】 ＤＮＡ構築物を、第二のリプレッサーに結合した第一の抑制可能致死遺伝子の
他に第一のリプレッサーに結合した第二の抑制可能致死遺伝子を含むように改質
する。第二の抑制可能致死遺伝子および第一のリプレッサーを互いに結合させ、
トランスポザーゼ酵素によって認識される特異的ＤＮＡ配列によって３′および
５′末端で結合する。認識配列を、結合した第二の抑制可能致死遺伝子−第一の
リプレッサー遺伝子配列をトランスポザーゼ酵素によって切り取ることができる
ようなやり方で配置する。トランスポザーゼは、さらに切り取った遺伝子配列を
ゲノム中のランダム位置に再挿入して、結合した第二の抑制可能致死遺伝子−第
一のリプレッサー遺伝子配列が結合した第一の抑制可能致死遺伝子−第二のリプ
レッサー遺伝子配列から独立して隔離されるようにすることを触媒する。
【００９８】 トランスポザーゼ活性は、導入したＤＮＡの一過性発現、トランスポザーゼ酵
素の直接的注入、またはさらに好ましくは活性トランスポザーゼを発現するよう
に改質された同系またはほぼ同系の植物系との単純な優性交雑などの任意の手段
によって導入することができる。
【００９９】 単純な交雑および選択によって、両方の抑制可能致死遺伝子を含むがトランス
ポザーゼ酵素を含まない植物系を選択することができる。トランスポザーゼ酵素
を容易に同定できるマーカー遺伝子へ結合することによって、所望な遺伝子の組
合せの選択を促進することができる。所望な組合せは、染色体対の対向娘染色体
上に抑制可能致死遺伝子およびリプレッサー遺伝子を含んでなる。
【０１００】 部位特異的組換え配列を用いてリプレッサーおよび抑制可能致死遺伝子の部位
特異的挿入を行うことは、本発明の範囲内にある。多くの部位特異的リコンビナ
ーゼが、文献に記載されている(Kilby et al., Trends in Genetics, 9(12): 41
3-418, 1993)。３種類のリコンビナーゼ系であるZygosaccharomyces rouxiiのpS
R1プラスミドによってコードされたRとして同定された活性、Saccharomyces cer
evisiae由来の２μmの円形プラスミドによってコードされたFLPリコンビナーゼ
、およびファージP1由来のCre-loxが広汎に用いられている。これらのリコンビ
ナーゼ系の総ては、異種宿主で機能することが示されている。例えば、Rはタバ
コ細胞で働くことが示されている(Onouchi et al., Nucl. Acids Res., 19(23):
6373-6378, 1991)。FLPは、タバコおよびシロイヌナズナで機能を有することが
示されており(Kilby et al., The Plant Jour., 8(5): 637-652, 1995)、Cre-lo
xはタバコで機能することが示されている(Russell et al., Mol. Gen. Genet.,
234: 49-59, 1992; Odell et al., Mol. Gen. Genet., 223: 369-378, 1990; Da
le and Ow, Gene, 91: 79-85, 1990; Dale and Ow, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 88: 10558-10562, 1991; Haaren and Ow, Plant Molecular Biology, 23: 52
5-533, 1993)。導入したＤＮＡを、部位特異的リコンビナーゼの組込み機能を用
いて特異的に定義された遺伝子座に標的設定することは、本発明の範囲内にある
。
【０１０１】 高等細胞で相同組換えを指定する目的で部位特異的リコンビナーゼを用いるこ
とは、詳細に報告されている。例えば、Fukishige and Sauer (Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 89: 7905-7909, 1992)は、Cre-lox相同組換え系を用いて、ＤＮＡ
を哺乳類細胞中の予め定義した遺伝子座に導入することに成功したことを示した
。この実例では、コード配列の５′末端のlox配列を含むように改質したプロモ
ーターを欠いた抗生物質耐性遺伝子を、チャイニーズハムスター卵巣細胞に導入
した。細胞を、lox配列を有するプロモーターおよび一過性発現を行ったCreリコ
ンビナーゼ遺伝子を含むプラスミドを用いて電気穿孔によって再形質転換した。
用いた条件下では、Cre酵素の発現により、染色体上に配置されたプロモーター
を欠いた抗生物質耐性遺伝子のlox部位と機能的抗生物質耐性遺伝子を形成する
導入されたプロモーター配列のlox部位との間の相同組換えが触媒された。著者
らは、導入した配列の効率的かつ正確なターゲッティングを示し、分析を行った
５６系列の５４はlox配列間のCre触媒部位特異的相同組換えのため、ＤＮＡの予
想された単一コピー挿入に相当した。
【０１０２】 Cre-lox系を用いることによるＤＮＡの特異的切り取り、欠失、または挿入は
、植物で例示されている(Dale and Ow, Gene, 91: 79-85, 1995)。正確な事象は
、loxＤＮＡ配列の配置によって制御される。シスでは、lox配列はCreリコンビ
ナーゼを指定して上記配列がフランクしたＤＮＡを欠失（同方向のlox配列）ま
たは反転（逆方向のlox配列）させ、トランスでは、lox配列が相同組換え事象を
指定し、組換えＤＮＡを挿入することができる。従って、本発明では、lox配列
は最初に植物細胞のゲノムに導入して、完全な植物体に再生することができる。
lox配列は「アンカー」またはリコンビナーゼ標的ＤＮＡ配列として働き、次い
で抑制された致死遺伝子またはリプレッサー遺伝子またはそれらの組合せを含ん
でなる組換えＤＮＡ構築物を導入することができる。上記のlox配列は最適に改
質し、不活性であるがある配列をlox部位に挿入することによって活性化するこ
とができる選択マーカーをも含んでなるようにすることができる。植物細胞に、
プロモーターを欠きlox配列に結合したマーカー遺伝子を挿入することは本発明
の範囲内にある。次いで、標的lox部位に挿入されるＤＮＡを改質して、lox部位
を含むプロモーターを含み、ＤＮＡの挿入によってプロモーターがプロモーター
を欠くマーカー遺伝子に結合し、これによってマーカー遺伝子が活性化されるよ
うにする。Creリコンビナーゼ遺伝子をＤＮＡインサートと同時に植物に導入し
て、相同組換えによる組換えＤＮＡの標的lox部位への挿入によりCre遺伝子の発
現を終わらせるようにすることができる。
【０１０３】 本発明によれば、植物への組換えＤＮＡの部位特異的挿入は、 形質転換可能な植物のゲノムに部位特異的リコンビナーゼによって認識される
ＤＮＡ配列（すなわち、リコンビナーゼ標的ＤＮＡ配列）を含んでなるＤＮＡ構
築物を挿入し、上記配列を含む植物を回収することを含んでなる。次に、形質転
換植物を自家受粉および選択によって、または葯または小胞体培養によって上記
のようなリコンビナーゼ標的ＤＮＡ配列についてホモ接合性にする。
【０１０４】 次いで、ホモ接合性植物を、下記のもので独立して形質転換する。 I.)植物細胞での形質転換および選択に必要なＤＮＡ配列の他に、(1)部位特異
的リコンビナーゼによって認識し、使用し、特異的ＤＮＡ配列で上記ＤＮＡを挿
入することができる配列、および(2)抑制可能致死遺伝子を含んでなる第一のＤ
ＮＡ発現カセット。抑制可能致死遺伝子の発現は、適当なプロモーター、好まし
くは種子特異的プロモーターによって調節される。新規タンパク質または形質を
コードする遺伝子を、上記の第一の発現カセットの一部として包含させることが
できる；そして II.)植物細胞での形質転換および選択に必要なＤＮＡ配列の他
に、(1)部位特異的リコンビナーゼによって認識し、使用し、特異的ＤＮＡ配列
で上記ＤＮＡを挿入することができる配列、および(2)第一のＤＮＡ発現カセッ
トに含まれる致死遺伝子活性の発現を遮断することができるリプレッサー分子を
コードするリプレッサー遺伝子を含んでなる第二のＤＮＡ発現カセット。リプレ
ッサー遺伝子の発現は、植物細胞で機能し得るプロモーター、好ましくは総ての
植物細胞で機能するプロモーター、さらに好ましくは致死遺伝子の発現を阻害す
るのに十分なレベルおよび時間で機能するプロモーターによって調節される。
【０１０５】 形質転換の後、上記の(I)または(II)で定義した配列をゲノムに組込んだ植物
を回収する。リコンビナーゼ機能を、トランスでまたは予め存在するリコンビナ
ーゼ遺伝子を活性化することによって植物に導入し、上記(I)または(II)に記載
のＤＮＡを切り取り、リコンビナーゼ標的ＤＮＡ配列にそれらを再挿入する。再
挿入したリコンビナーゼＤＮＡを含む植物を回収する。これらの植物は、同一の
遺伝子座に抑制可能致死遺伝子またはリプレッサー遺伝子を含むこととなる。
【０１０６】 有性交雑を、抑制可能致死遺伝子またはリプレッサー遺伝子を含む植物の間で
行う。これらの有性交雑から、相同染色体対の対向染色体上の同一の遺伝子座に
ある抑制可能致死遺伝子およびリプレッサー遺伝子を両方とも含む植物を選択す
る。
【０１０７】 本発明の幾つかの態様については、リコンビナーゼ標的ＤＮＡ配列をも含んで
なるリコンビナーゼ酵素をコードするＤＮＡで植物細胞を最初に形質転換するの
が好ましいことがある。リコンビナーゼ遺伝子は、構成的または組織特異的プロ
モーター、または発現を良好に調節することができるプロモーターで制御し、遺
伝子の発現およびそれに続く抑制された致死およびリプレッサー遺伝子の部位特
異的組込みを特定の時間に誘導することができるようにすることができる。
【０１０８】 本発明のもう一つの態様では、上記の第一および第二のＤＮＡ発現カセットの
他に、優性条件致死遺伝子を含んでなり、条件致死遺伝子を含む植物を化学薬剤
に暴露することによって殺すことができる第三のＤＮＡ発現カセットを含む組換
え植物を生産する新規手段の方法および組成物が提供される。好ましくは、条件
致死遺伝子は、第一のＤＮＡ発現カセットに結合している。
【０１０９】 上記の結合した第一および第三のＤＮＡカセットを含んでなるＤＮＡ構築物は
、さらに新規なタンパク質または形質をコードする標的遺伝子を含んでなること
ができる。このような新規形質は、自生のまたは栽培された優性和合性植物と交
雑することによって形質を導入した遺伝子型の外側には導入することはできない
。これらの植物はリプレッサーを欠いているので、結合(union)によって生じる
種子は生育不能である。新規形質を含む植物は、条件致死マーカー遺伝子を用い
て識別することもできる。従って、偶然によってリプレッサー遺伝子を受け取っ
た可能性のある植物個体群でも、条件致死遺伝子を用いてリプレッサーと抑制さ
れた致死遺伝子を両方とも含んでなる可能性がある植物を除去することができる
。
【０１１０】 条件致死遺伝子は、上記の抑制された致死遺伝子と共同作用して致死表現型を
発現し、または機能を発揮させることができる外部から加えた物質に応じて作用
して致死表現型を発現させることができる生成物を含んでなることができること
も注目される。
【０１１１】 上記の態様では、隔離は、新規形質または生殖細胞質が意図しない個体群に残
存しまたは広がるのを制限する目的で用いられる。
【０１１２】 本発明の最も基本的な形態では、目的とする形質に結合した抑制可能致死遺伝
子をリプレッサー遺伝子から隔離することによって、交雑受粉による意図しない
個体群で目的とする形質を含んでなる生育可能な種子の形成が遮断される。典型
的な農業条件下では、目的とする形質が種子特異的プロモーターの制御下で抑制
可能致死遺伝子に結合している場合には、目的としない植物または植物個体群中
の形質の残存は自家受粉を行うことができる植物では世代当たり７５％だけ速や
かに低下する。この予言モデルでは、抑制可能致死遺伝子とリプレッサーとを含
んでなる植物によって交雑受粉した目的としない植物個体群のＦ５世代までには
、目的としない個体群の抑制可能致死遺伝子に結合した目的とする形質の残存率
はゼロに近づく。２種類の単純な遺伝子モデルである、主として自家受粉性であ
る植物、例えばBrassica napus、および主として自家不和合性である植物、例え
ばBrassica rapaについてのモデルを示す。
【０１１３】自家受粉植物での系についての単純な遺伝子モデル SL＝目的とする遺伝子に結合した種子特異的プロモーターによって制御されて
いる抑制可能致死遺伝子。 R＝リプレッサー。 ホモ接合性抑制可能種子致死、 リプレッサー植物の遺伝子型： SL/SL, R/R 未形質転換の野生型植物と交雑： -/-, -/- 半接合体系を含んでなる 半接合性野生型植物個体群を生成。SL/-, R/- この野生型植物個体群が自家受粉植物個体群である場合には、下記の子孫を生
じる： 自家受粉半接合性植物の理論的子孫分析
【０１１４】
【表１】 個体群でのSL形質に結合した遺伝子の残存率 植物：有り なし1 1/16はSL/SL, R/Rホモ接合性 .0625 .00006, 7, 10 3/16は種子致死形質のみを有し、生殖 行き止まりである .0000 .18754, 13 2/16はホモ接合性リプレッサー、ヘテロ接合性 SLを有し、種子の半数だけがSL遺伝子を有する .0625 .06252, 5 2/16はホモ接合性SL、半接合性Rを有し、 種子の半数のみが残存する .0625 .062511, 12, 15, 16 4/16はSL遺伝子を持たない .0000 .2500 2/16はSLについて半接合性であり、Rについて ホモ接合性であり、これはSL遺伝子の半数が失われることを表している .0625 .0625 総計 .2500 .7500
【０１１５】 従って、SL遺伝子に結合した形質の損失は、自家受粉個体群では世代当たり７
５％である。これは、種子におけるSLの発現を有する形質の損失に基づいている
。
【０１１６】 しかしながら、半接合性植物が大部分が異系交雑（または自家不和合性）植物
であるときには、SL形質に結合した遺伝子の残存率はかなり低くなる。これを下
記に示す。
【０１１７】異系交雑植物での系についての単純な遺伝子モデル ホモ接合性抑制種子致死、リプレッサー植物の遺伝子型： SL/SL, R/R 未形質転換の野生型植物と交雑： -/-, -/- 半接合体系を含んでなる半接合性野生型植物個体群を生成。SL/-, R/- 自家受粉半接合性植物の理論的子孫分析
【０１１８】
【表２】 個体群でのSL形質に結合した遺伝子の残存率 植物：有り なし1, 5, 9, 13 4/16はSL/-, R/-半接合性であり、個体群の ７５％だけがSLとRの組合せを有することが 期待される（4/16 x .75) .0625 .18752, 6, 10, 14 4/16は種子致死形質のみを有し、生殖 行き止まりである .0000 .25003, 7, 11, 15 4/16はSL遺伝子を持たない .0000 .25004/16はRについて半接合性であり、SL遺伝子を持たない .0000 .2500 総計 .0625 .9375
【０１１９】 従って、主として異系交雑である植物個体群は、世代当たり９３．７３％の割
合でSL形質に結合した遺伝子を速やかに喪失する。
【０１２０】 これらのモデルから、SL形質は、未管理個体群（すなわち、抑制可能致死遺伝
子およびリプレッサーの組合せが維持されていない個体群）における抑制可能致
死遺伝子に結合した目的とする形質をコードする遺伝子の維持には選択上の不利
益が生じる。未管理個体群としては、性的和合性の野生種並びに性的和合性の栽
培種を挙げることができることに留意すべきである。
【０１２１】 一態様では、抑制可能致死遺伝子は種子特異的プロモーターによって発現され
る。これは、独立して形質転換した抑制致死およびリプレッサー系の有性交雑を
考慮している。抑制致死系を雌性親として用いることによって、リプレッサー遺
伝子の導入から誘導される種子のみが形成され、種子致死形質が完全に抑制され
ることが確かめられる。抑制が不完全であり、従って商業的価値が限定されてい
る種子では、種子の発育停止が起こる。従って、この態様の方法により、通常の
交雑により最も有用な遺伝子組成物を選択するための好都合な手段が得られる。
【０１２２】 種子特異的プロモーターも、致死形質の調節について構成的プロモーターと比
較して幾らかの利点を有する。第一に、種子致死形質を含む植物は、下記のよう
にしてリプレッサー遺伝子を導入した後に容易にホモ接合系に転換することがで
きる。リプレッサーおよび抑制種子致死遺伝子の有性導入（または同時導入）に
よって形成された種子から生育した植物に、葯または単離した小胞体培養を施し
て、ホモ接合性植物系を直接回収することができる。あるいは、交雑およびホモ
接合系の選択などの通常の方法を用いて、適当な植物系を回収することができる
。
【０１２３】 幾つかの場合には、商業目的の最終生成物または植物系は、抑制可能致死遺伝
子とリプレッサー遺伝子との半接合性の組合せであることができる。本発明の一
態様によれば、自家不和合性を用いて自家不和合性作物における雑種種子の生産
を改良する方法が提供される。現在用いられている雑種種子生産の方法では、２
種類の自家不和合系であって、一方が「雌性」親として作用し、他方が「雄性」
親として機能するものを用いることが多い。理想的条件下では、雌性親で形成し
た種子は、自家不和合性であるが雌性親と和合性である雄性親による受粉の結果
として形成される雑種種子である。しかしながら、このような系は、雌性親での
自家受粉を生じる自家不和合性の不注意による崩壊により汚染されやすい。従っ
て、雌性親で種子特異的プロモーターの制御下で抑制可能致死遺伝子を使用する
と、種子致死形質が自家受粉した種子で発現するので、自家受粉種子の形成が遮
断される。雄性親系の花粉によりリプレッサー遺伝子を提供することにより、抑
制可能致死遺伝子およびリプレッサー遺伝子を有する生育可能な雑種種子を形成
することができる。
【０１２４】 雌性親は、クローン増殖によって増加させることができる。あるいは、ある種
の物理的または化学的処理によって自家不和合性を解決することができるので、
これらの条件に応答する誘導リプレッサー遺伝子の使用が有利である。これらの
条件の幾つかは野外で自然に起きることがあり、本発明の実施には大して重要で
はないが、アブラナ種での自家不和合性を解決することが知られている塩ストレ
スまたは高濃度の二酸化炭素のような幾つかの条件を用いることができる。ある
いは、一定条件下でのみ活性であるリプレッサー（例えば、特定の物質の存在下
でＤＮＡ配列に結合するリプレッサー）を雌性親の種子を増加するのに用いるこ
とができる。多くのこのようなリプレッサーは、当該技術分野で見出すことがで
きる。上記のように、様々な手段を用いて、所望なときに雌性親を増加させるこ
とができる。雑種交雑の最終産物は、雌性親由来の抑制可能致死遺伝子と雄性親
由来のリプレッサー遺伝子とを有する種子であることが注目される。上記の種子
は、さらに上記抑制可能致死遺伝子に結合した新規形質を含んでなることもでき
る。
【０１２５】 本発明に関して、細胞の致死遺伝子の産物の蓄積を効果的に遮断する任意の機
構は抑制を含んでなる。このような機構としては、上記致死遺伝子のプロモータ
ー中で特異的「リプレッサータンパク質または因子」の「オペレーター」のＤＮ
Ａ領域への結合を挙げることができる。当該技術分野における例としては、細菌
リプレッサーおよび関連ＤＮＡ結合領域（オペレーターＤＮＡ）、例えばLac Z
リプレッサー、tetリプレッサー、LacR、GutR、DeoR、FucRおよびGlpRなどの細
菌系で糖の異化作用を調節するリプレッサータンパク質のクラス(van Rooijen,
R.J. and de Vos, W.M., J. Biol. Chem., 265: 18499-18503, 1990)、またはア
グロシノピンの生合成および接合伝達を調節するaccRとして知られているAgroba
cterimリプレッサー(Bodman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 643-64
7, 1992)が挙げられるが、これらに限定されない。酵母のような真菌または任意
の他の生物で見出されるものなどの他のリプレッサーの供給源を用いることがで
きる。本発明によれば、リプレッサーは植物プロモーターの領域にある特異的Ｄ
ＮＡ配列に結合することができ、この結合は上記改質プロモーターの制御下でＤ
ＮＡ配列の発現を実質的に阻害することができる。
【０１２６】 植物細胞における異種遺伝子の最適発現にはある種の修飾が必要なことがある
ことが理解されている。典型的には、これらの修飾としては、通常の植物コドン
優先を反映するためのコード配列の変更、植物転写または翻訳機構によって余り
認識されない配列の除去、翻訳エンハンサーまたは安定化配列の付加、および上
記遺伝子によってコードされるタンパク質が正確に区分されるようにする局在化
シグナルをコードするＤＮＡ配列の付加が挙げられる。従って、細菌性の幾つか
のリプレッサーについては、これらの修飾が抑制遺伝子の完全な抑制を考慮して
リプレッサーを十分なレベルで発現させるのに必要であることがある。
【０１２７】 特異的ＤＮＡ配列に強力に結合するように改質された他のＤＮＡ結合タンパク
質、いわゆる「トランスドミネーター(transdominators)」を、リプレッサーと
して用いることもできる。他のリプレッサーとしては、致死遺伝子に指定された
アンチセンスＲＮＡ、または致死遺伝子の産物の特異的阻害剤が挙げられる。一
例は、植物細胞で発現するときには毒性を有するリボヌクレアーゼバルナーゼの
特異的阻害剤である「バルスター(Barstar)」である。
【０１２８】 致死遺伝子のダウンレギュレーションは、致死表現型の共抑制に関与する導入
遺伝子の隔離によって致死表現型が回復される限り、共抑制の使用によって幾つ
かの場合に行うことができると考えられている。従って、本発明に関する抑制は
、致死表現型の発現を可逆的に阻害する任意の機構を含んでなる。
【０１２９】 上記抑制可能致死遺伝子をコードするＤＮＡは、さらに上記致死遺伝子の発現
を調節するプロモーター領域を含んでなる。好ましい態様は種子特異的プロモー
ターを含んでなるが、他のプロモーターが考えられる。上記のプロモーターは構
成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーターであるこ
とができ、特異的リプレッサータンパク質を結合して、このリプレッサータンパ
ク質の存在下では上記致死遺伝子の転写が遮断されるようにするオペレーター配
列（リプレッサー結合配列）を含んでなることができる。プロモーターの選択は
当業者には明らかであろうし、特に本発明を用いようとする植物種で発現するこ
とが知られているプロモーターであろう。
【０１３０】 本発明のもう一つの態様によれば、条件致死遺伝子を含む組換え植物を生産し
て、この遺伝子と組換えＤＮＡ分子を含む植物を化学薬品に暴露することによっ
て枯らすことができるようにする新規な手段の方法および組成物が提供される。
化学薬品は、他の植物には効果を持たない。この機構は、花粉によって媒介され
る異系交雑を介して同一種および関連種の他の栽培品種へ組換えＤＮＡが広がる
のを完全に排除する。条件致死遺伝子は当該技術分野で報告されており、毒性の
ない物質に直接作用してこの物質を毒性のある物質に転換する遺伝子が本発明の
範囲内にあると考えられる。
【０１３１】 条件致死遺伝子は、外部から加えられた物質または人工的または自然に誘導さ
れる生理学的ストレスによって抑制解除することができる抑制可能致死遺伝子の
みを含んでなることもできる。従って、一つの具体的態様では、条件致死遺伝子
はＤＮＡ結合タンパク質の結合によって抑制される致死遺伝子活性を有する。抑
制は、結合を破壊する特異的物質によって高めることができる。例えば、細菌性
tetリプレッサーであって、オペレーター配列へのその結合がテトラサイクリン
によって遮断されるものが挙げられる。この場合には、隔離によって異系交雑ま
たは遺伝子移入の際の致死遺伝子活性が抑制解除され、この遺伝子をさらに条件
致死遺伝子として用いて、組換えＤＮＡ構築物を含む植物をテトラサイクリンへ
暴露することによってこの植物を除去することができる。
【０１３２】 さらに、致死遺伝子活性の抑制解除は、リプレッサー遺伝子の発現を阻害する
ことによって行うこともできると考えられる。例えば、リプレッサー遺伝子の発
現を阻害することができるアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムを用いることが
できる。このような「アンチ−リプレッサー」遺伝子を誘導性プロモーターによ
って制御するのが好ましい。本発明の範囲内で用いることができる誘導性プロモ
ーターの一例としては、トウモロコシグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(G
ST II)遺伝子の２７kDサブユニットのプロモーター（ＰＣＴ／ＧＢ９０／００１
１０号明細書）のような単純な薬剤、またはPR-1a、PR-1b、PR-1c、PR-1、PR-Q
、PR-Sまたはキュウリキチナーゼ遺伝子プロモーターのようなPRプロモーター、
または酸性または塩基性タバコβ−１，３−グルカナーゼプロモーターによって
誘導可能なものが挙げられる。これらおよび関連プロモーターを誘導することが
できる多数の薬剤が、欧州特許第８９／１０３８８８．７号明細書に記載されて
いる。
【０１３３】 新規形質をコードする標的遺伝子の花粉に媒介される移動の制限は、減数分裂
の後に花粉中でリプレッサー遺伝子から離れて隔離されている抑制可能致死遺伝
子への標的遺伝子の結合を伴う。制御または抑制要素をコードする組換えＤＮＡ
から致死遺伝子を隔離した後に、抑制致死表現型が活性化される。従って、標的
遺伝子の目的としない雄性和合性植物への導入が排除される。抑制された致死遺
伝子の発現を制御する目的で種子特異的プロモーターを用いると、リプレッサー
の非存在下で種子で発現する形質遺伝子および致死遺伝子を有する花粉を用いる
交雑受粉から生じる生育不能な種子が得られる。種子特異的プロモーターを用い
て抑制可能致死遺伝子の発現を制限することによって、組換え植物上に種子セッ
トを確保する花粉を生産することもできる。
【０１３４】 抑制可能致死遺伝子に結合した形質遺伝子と独立して隔離されているリプレッ
サー遺伝子とを含む総ての組換えＤＮＡ分子の花粉によって媒介される移動を制
限するには、第一のリプレッサー遺伝子の成分として第二の抑制可能致死遺伝子
の封入を必要とする。この機構では、減数分裂の際に独立して隔離されている組
換え遺伝子がいずれも致死遺伝子を有しているが、それぞれの致死遺伝子は別個
のリプレッサーによって抑制される。従って、標的遺伝子に結合した種子特異的
致死表現型は独立して隔離されている相当するリプレッサー遺伝子によって抑制
され、上記の独立して隔離されているリプレッサー遺伝子に結合している第二の
抑制可能致死遺伝子の発現は形質遺伝子に結合している第二のリプレッサー遺伝
子によって抑制される。従って、植物は、２種類の抑制可能致死遺伝子を有し、
それぞれが機能的に異なるリプレッサーによって制御されている。従って、一方
、他方または両方の致死遺伝子は、減数分裂および異系交雑の後に抑制解除され
る。その結果、異種生殖細胞質の異系交雑または遺伝子移入によって形成された
種子細胞は生育不能である。
【０１３５】 形質転換によって導入された商業的に興味深い形質の発現は、致死または条件
致死表現型を調節するプロモーターと同一であるかまたは異なっていてもよい構
成的、誘導または発生制御プロモーターによって調節することができる。プロモ
ーターの選択は、所定の商業的用途に関して変化する。
【０１３６】 商業的に興味深い形質が植物細胞から単離される異種タンパク質の生産である
本発明の具体的態様については、種子の発生において機能する発生上調節された
プロモーターは論理的選択である。多くの様々な種類の細胞、組織および発生上
調節されたプロモーターが文献に記載されており、これから商業的に興味深い形
質に適するものを選択することができる。さらに、本発明の具体的態様で用いる
ことができる新規プロモーターを発見して特性決定するための方法は、周知であ
る。
【０１３７】 新規形質をコードするＤＮＡは、改質油、トウモロコシ粉、澱粉、または他の
種子成分のような検出可能な表現型を生じる遺伝子であることができる。あるい
は、除草剤耐性、または昆虫または有害生物耐性のような特定の作物学的形質を
付与する遺伝子であることもできる。この遺伝子は、検出可能な表現型を付与し
ないタンパク質、または薬学上または産業上有用な活性を有するタンパク質をコ
ードすることもできる。新規形質をコードするＤＮＡは、形質によって多数の様
々なプロモーターの制御下で発現することができる。多数の方法を用いて新規形
質を発現させることができることは、当業者には明らかである。
【０１３８】 商業上興味深い組換え標的タンパク質を植物種子に生産し、これから回収する
本発明の好ましい態様については、第一の発現カセットは植物種子の発生におい
て特異的に発現させることができる転写および翻訳調節領域を含んでなる組換え
ＤＮＡ配列と、さらに具体的には種子胚またはトリグリセリドを保管できる他の
種子組織、および油体(oil-body)にターゲッティングするのに十分な油体特異的
タンパク質の部分、商業上興味深い標的タンパク質、および植物で機能する転写
および翻訳終止領域を含んでなるキメラペプチドまたはタンパク質をコードする
第二の組換えＤＮＡ配列を包含する。キメラペプチドまたはタンパク質は、油体
特異的部分と商業上興味深い標的タンパク質を結合し、化学的または酵素的手段
によって特異的に開裂することができるペプチド配列を含んでなることもできる
。
【０１３９】 ＤＮＡ発現カセットは、転写および翻訳調節領域、および標的、リプレッサー
および致死遺伝子をコードするＤＮＡを含んでなるＤＮＡ配列が多重クローニン
グ部位によって結合され、代替標的、リプレッサーおよび致死ＤＮＡ配列の好都
合な置換を考慮するように構築することができる。
【０１４０】 本発明の好ましい態様としては、抑制可能致死遺伝子活性はAgrobacteriumのT
iまたはRiプラスミド由来の癌遺伝子１および２である。これら２個の組み合わ
せた遺伝子の活性により、ＩＡＡの生産および植物細胞死を生じる。
【０１４１】 癌遺伝子１は、植物細胞に普通に見られるアミノ酸であるトリプトファンをイ
ンドールアセタミドに転換する酵素インドールアセタミドシンターゼ（ＩＡＭＳ
）をコードする。癌遺伝子１の機能、すなわちトリプトファン（総ての植物細胞
中に含まれる内生アミノ酸）のインドールアセタミドへの転換は、VanOnckelen
et al., FEBS lett., 198, 357-360, 1986に記載されている。
【０１４２】 癌遺伝子２は、インドールアセタミドをインドール酢酸に転換する酵素インド
ールアセタミドヒドロラーゼ（ＩＡＭＨ）をコードする。遺伝子２の機能、すな
わちインドールアセタミドをインドール酢酸に転換する能力は、Tomashow et al
., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5071-5075, 1984およびSchroder et al.,
Eur. J. Biochem., 138, 387-391, 1984によって立証された。具体的には、癌
遺伝子２は癌遺伝子１と協奏的に、細菌細胞には見られるが植物細胞には見られ
ない経路によりトリプトファンから植物生長調節因子であるインドール酢酸の合
成を準備する。関連癌遺伝子の活性は、A. rhizogenes, A. vitis (Canaday, J.
et al., Mol. Gen. Genet., 235: 292-303, 1992)およびPseudomonas savastan
oi (Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6522-6526, 1985)で見
出されている。
【０１４３】 癌遺伝子の好ましい用途は、植物細胞で普通に見られる物質を過剰生産し、か
つジフテリア毒素Ａ鎖のような毒素、バルナーゼのようなリボヌクレアーゼ、お
よびリシンおよび関連毒素のようなリボソーム阻害タンパク質と関連した致死活
性とは異なり、遺伝子活性の抑制は絶対的である必要はない天然に見られる活性
であるという既知の事実に基づいている。低水準の発現を上回ると、リシンのよ
うな強力な細胞毒性薬剤の細胞当たり１分子であっても、細胞死を生じることが
できることが示唆されている。本発明の範囲内でこのような強力な毒素を用いる
ために、抑制された致死表現型の抑制が完全である必要があり、機能的分析法に
よってこの抑制の水準に達成するための様々な方法が用いられることが注目され
る。
【０１４４】 ＤＮＡ結合タンパク質またはリプレッサー、または毒素活性の特異的阻害剤（
例えば、バルナーゼおよびバルスター）の使用のような本完全な抑制は発明の範
囲内で容易に達成することができるが、生長調節因子を過剰発現する致死遺伝子
活性の使用では、本発明の範囲内で多数の異なる抑制機構を用いる機会が提供さ
れる。好ましくは、遺伝子１、または遺伝学１と遺伝子２とに標的設定した致死
遺伝子の発現のアンチセンスＲＮＡまたはリボザイム阻害；好ましくは遺伝子１
に対する相同配列をコードする遺伝子を用いる共抑制；または過剰ＩＡＡを代謝
または接合することができる酵素の発現が挙げられる。このような酵素活性は、
当該技術分野で知られている。
【０１４５】 遺伝子２についての物質であるインドールアセタミドは、通常は植物細胞によ
って生産されない。インドールアセタミドの転換の他に、遺伝子２は、強力なオ
ーキシン類似体であるナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を形成する合成薬剤であるナフ
タレンアセタミドなど他のインドールアミドを代謝することもできる。遺伝子２
産物ＩＡＭＨを発現する植物細胞にＮＡＭ（ナフタレンアセタミド）を適用する
と、致死濃度のＮＡＡを生産する。従って、癌遺伝子２は、条件致死遺伝子とし
て機能することができる。しかしながら、本発明の範囲内では、癌遺伝子１およ
び２は、優先的に致死遺伝子活性を含んでなる。
【０１４６】 ＩＡＭＳをＩＡＭＨと組み合わせて両者を使用することは、雑種種子生産法に
おいて花粉を選択的に除去する手段として記載されている（米国特許第５，４２
６，０４１号明細書）。組換え非天然癌遺伝子２のみを核をコードした雄性不稔
性にランダムに結合した条件致死遺伝子として使用することができることは、望
ましくない導入遺伝子植物を除去するための同じ組換え癌遺伝子２の使用（米国
特許第５，１８０，８７３号明細書）と同様に示唆されている。しかしながら、
癌遺伝子１の活性なしで癌遺伝子２のみを用いると、致死遺伝子活性を生じるこ
とはできない。さらに、癌遺伝子２を導入遺伝子植物を除去する方法として用い
るには、化学薬剤を適用して組み換えＤＮＡを含む細胞を選択的に除去する必要
がある。
【０１４７】 対照的に、本発明は、介在の必要なしに異種ＤＮＡを不注意によって受け取っ
た植物を本質的に除去する。この方法は、さらに植物細胞に自然に見られる化合
物の過剰発現を用いて、環境の安全性を確保する致死表現型を付与する。従って
、本発明は、癌遺伝子１および２を用いて本発明を実施するときに条件致死表現
型も提供する。特に、未修飾の天然癌遺伝子２を用いる。
【０１４８】 癌遺伝子１および２の他に、癌遺伝子４の使用も考えられる。Agrobacterium
sp.のTiプラスミドの癌遺伝子４は、もう一つの天然の植物生長調節因子である
サイトキニンを合成することができる酵素イソペンチルトランスフォーミング
コードする。サイトキニンの過剰発現により、細胞死を生じることができ、従っ
て本発明の範囲内の致死遺伝子活性である。Agrobacterium sp.が感染した後の
植物上のクラウンゴール腫瘍の生長は、癌遺伝子１および２と癌遺伝子４の組合
せ活性によるサイトキニンとオーキシンの両方の過剰発現から生じるものと考え
られる。
【０１４９】 癌遺伝子１および２と癌遺伝子４の両方の活性を抑制して用いることは、本発
明の範囲内にある。これは、両方の致死遺伝子活性を抑制する必要がある。抑制
解除により、生長調節因子が過剰発現し、植物細胞の正常な活性が破壊され、従
って種子を生産しまたは再生する能力が遮断される。従って、（複数の）癌遺伝
子に結合した形質または生殖細胞質は、抑制解除した状態に固執することはでき
ない。
【０１５０】 癌遺伝子１、２および４は、総ての天然遺伝子の一つを修飾する必要なしに抑
制することができるとも考えられる。種子特異的抑制可能致死遺伝子を使用しな
い応用については、癌遺伝子の天然プロモーターを用いて、アンチセンスＲＮＡ
またはリボザイムのようなリプレッサー分子と組み合わせ、癌遺伝子の発現を阻
害することができる。
【０１５１】 癌遺伝子を用いることができるが、本発明の方法はそれらによって限定されな
い。致死および条件致死表現型を付与する様々な遺伝子を本発明の範囲内で用い
ることができ、上記方法は癌遺伝子に限定されない。従って、植物細胞の適正な
機能および／または生長、および発生を阻害することができるあらゆる遺伝子は
致死遺伝子であると考えられる。
【０１５２】 致死遺伝子の活性を機能的に抑制する多数の方法が報告されている。しかしな
がら、当該技術分野でさらに多数の方法が記載されているので、本発明は上記の
抑制法によって限定されない。本発明の範囲内で様々な抑制法を用いることがで
きることは、当業者には明らかである。
【０１５３】 細胞の形質転換および形質転換細胞の回収を行うあらゆる方法（例えば、Agro
bacteriumによって伝達されるＤＮＡ導入またはバイオリスティック(biolistic)
法) を用いて、本発明の範囲内でＤＮＡ構築物を導入することができる。本発明
は、形質転換の方法によって変化しない。さらに、抑制可能致死遺伝子またはリ
プレッサーの様々な植物系への導入は、組換えＤＮＡを同時にまたは段階的に挿
入することによって実施することもできることが注目される。あるいは、単純有
性交雑によって抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子の所望な組合せを得る
ことができる。遺伝子構築物を有性不和合性の近縁生物に導入しようとする場合
には、広汎な交雑および／または胚救出(embryo rescue)のような組織培養法を
用いることができる。当業者に知られている様々な手法を用いて、本発明の範囲
内で最大の有用性を提供する抑制可能致死遺伝子およびリプレッサー遺伝子の組
合せを誘導することができる。
【０１５４】 下記の例は、この方法を例示する目的で示すものであり、本発明の範囲を制限
するものではない。
【０１５５】例１： Agrobacterium Ti−プラスミドpTi15955からの癌遺伝子１および２の単離 癌遺伝子を単離するため、下記の工程を用いた。癌遺伝子１(p202)および癌遺
伝子２(p101)をコードするＤＮＡを包含する米国特許第５，４２８，１４７号明
細書に詳細に記載されているサブクローンp101およびp202を、遺伝子の供給源と
して用いる。遺伝子を分離するため、好都合な制限部位を導入するためのＰＣＲ
と天然遺伝子断片のサブクローニングとの組合せを用いて、植物形質転換ベクタ
ーに好都合に挿入することができる癌遺伝子を誘導する。
【０１５６】 天然の癌遺伝子２を単離するため、下記の方法を用いる。癌遺伝子２の天然プ
ロモーターを含む５′領域を、下記のプライマーを用いるプラスミドp101のＰＣ
Ｒ増幅によって単離する。 G2P1（配列番号１） 5' ATAGCATGCTCTAGATGTTAGAAAAGATTCGTTTTTGTG 3' および G2P2（配列番号２） 5' ATACCATGGCGATCAATTTTTTTGGCGC 3'
【０１５７】 G2P1はSph 1部位（肉太活字）およびXba I部位（下線部）を含み、pTi15955の
公表された配列におけるヌクレオチド５８０８〜５７８５の相補物に相当する。
G2P2はNco 1部位（肉太活字）を含み、pTi15955の公表された配列におけるヌク
レオチド５２８５〜５３０９に相当する。G2P1およびG2P2を使用すると、天然の
癌遺伝子２の５′領域を表す５２３bpの断片を生じ、プロモーターの５′末端の
Sph 1およびXba Iを含むように修飾したプロモーターを包含する。
【０１５８】 天然のターミネーター構造を包含する癌遺伝子２の３′領域を単離するため、
２種類のＰＣＲプライマーを用いる。使用した第一のプライマーは、 G2P3（配列番号３） 5' ATAAAGCTTGAAAATTAAGCCCCCCCCCG 3' および G2P4（配列番号４） 5' ATAGGATCCGCATGCCCAGTCTAGGTCGAGGGAGGCC 3' である。
【０１５９】 G2P3はHind III部位（肉太活字）を含み、pTi 15955の公表配列のヌクレオチ
ド３３９６〜３３７１の相補物に相当する。G2P4はSph 1部位（肉太活字）およ
びBam H1部位（下線部）を含み、pTi 15955の公表配列のヌクレオチド３２３７
〜３２６４に相当する。G2P3およびG2P4を用いると、天然の癌遺伝子２の３′末
端の一部を表す１６４bpの断片を生じる。
【０１６０】 プラスミドp101をNco IおよびHind IIIで消化して、コード領域のほとんどを
包含する癌遺伝子２の約１８９５bpの断片を生成する。天然の癌遺伝子２の５′
末端の５２３bpの断片をNco Iで消化して、１８９５bp断片のNco I部位に連結し
、遺伝子の１６４bpの３′末端をHind IIIで消化し、1895bp断片のHind III部位
に連結する。次に、再構築した天然の癌遺伝子２をSph 1で消化し、共通のクロ
ーニングベクターpGEM-4Z（Promega、ラホーヤ、カリフォルニア）のSph 1部位
にサブクローニングする。このベクターはpG2と呼ばれる。ＤＮＡシークエンシ
ングを用いて、天然の癌遺伝子２の真正のＤＮＡ配列に相当するこの再構築した
ＤＮＡの組成を検証した。
【０１６１】 癌遺伝子１の単離は、好都合な制限部位を導入するためのＰＣＲと天然遺伝子
断片のサブクローニングの組合せを用いる。必要な断片を単離するため、下記の
方法を用いる。コード領域の５′末端に、好都合な制限部位を下記の２種類のプ
ライマーを用いるＰＣＲによって導入する。 G1P1（配列番号５） 5' ATAATCGATATAGAAACGGTTGTTGTGGTT 3' および G1P2（配列番号６） 5' ATAAGATCTCGGGGAAGCGACC 3'
【０１６２】 G1P1はCla 1部位（肉太活字）を含み、pTi 15955の公表配列のヌクレオチド５
７５５〜５７７５に相当する。G1P2はBgl II部位（肉太活字）を含み、pTi 1595
5の公表配列のヌクレオチド６０２８〜６０１０の相補物に相当する。G1P1およ
びG1P2を用いて、コード領域の５′末端におけるCla 1部位を含むように修飾さ
れている癌遺伝子１の２７３bp断片を増幅する。
【０１６３】 癌遺伝子１のコード領域の３′断片を単離するため、２種類のプライマーを用
いてコード領域の３′末端に好都合な制限部位を導入する。 G1P3（配列番号７） 5' AATGATATCTGAACTTTATGATAAGG 3' および G1P4（配列番号８） 5' ATAGAGCTCATCGATACTAATTTCTAGTGCGGTAGTT 3'
【０１６４】 G1P3はEco RV部位（肉太活字）を含み、pTi 15955の公表配列のヌクレオチド
７３５０〜７３７２に相当する。G1P4はCla 1部位（肉太活字）およびSac 1部位
（下線部）を含み、pTi 15955の公表配列のヌクレオチド８０７６〜８０５６に
相当する。G1P3およびG1P4を用いて、癌遺伝子１のコード領域の３′末端を表す
７３２bpの断片を生じる。
【０１６５】 癌遺伝子１の完全なコード領域を再構築するため、プラスミドp202をBgl IIで
消化し、癌遺伝子１の部分コード領域を包含する１６９７bpの断片を単離する。
この断片の５′末端に、２７３bpのＰＣＲ断片を加え、Bgl IIで消化し、コード
領域の５′末端Cla I部位を含むように修飾された部分癌遺伝子１を生成する。
全癌遺伝子１を再構築するため、３′配列を表す７２６bpのＰＣＲ断片をBam HI
およびSac 1で消化し、生成する断片を１６９７bpの断片の３′末端のBam HI部
位に連結し、コード領域の５′および３′末端にCla 1部位とコード領域の３′
末端にSac 1部位を有する再構築癌遺伝子１を生成する。これらの断片は、ベク
ターpBluescript (Promega、ラホーラ、カリフォルニア）内に含まれている。生
成するプラスミドは、pG1と呼ばれる。ＤＮＡシークエンシングを用いて、天然
の癌遺伝子１の真正のＤＮＡ配列に相当するこの再構成したＤＮＡの組成を立証
した。
【０１６６】 pG1およびpG2の構築に用いた工程の図解表現を、図７ａおよび７ｂに示す。
【０１６７】例２： 細菌リプレッサー結合部位を用いるファゼオリンプロモーターの構築 この例では、テトラサイクリン（tet）オペレーターＤＮＡをファゼオリンプ
ロモーターに導入する。tetオペレーター配列をファゼオリンプロモーター配列
に挿入するため、ＰＣＲを用いて天然のTATAボックスのＤＮＡ配列５′およびte
tオペレーター配列の３種類のコピーを含む合成ＤＮＡ配列に相当するプロモー
ターの領域を単離する。TATAボックスをプロモーターのＰＣＲ断片に連結して、
tetオペレーター配列の３種類のコピーを含む再構築したファゼオリンプロモー
ターを形成する。これを行う手段は下記の通りであり、図８に示されている。
【０１６８】 ファゼオリン遺伝子のプロモーター領域（Slightom, J.L., Sun, S.M. and Ha
ll, T.C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 1897-1901, 1983に記載）を、Dr.
G. Cardineau （Mycogen Plant Sciences、サンディエゴ、カリフォルニア）の
厚意により提供を受けたベクターpAGM 219を用いるＰＣＲによって単離する。プ
ラスミドpAGM 219はファゼオリン遺伝子のプロモーター領域の約１６００塩基対
とファゼオリン遺伝子の天然の終結領域を含む。TATAボックスに対するプロモー
ター５′の領域を、tetオペレーターＤＮＡおよびTATAボックスを含んでなる合
成ＤＮＡ配列の付加に備えて、ＰＣＲによって単離した。
【０１６９】 用いた第一のＰＣＲプライマーを作成し、天然のプロモーター配列にヌクレオ
チド配列のマイナー変さらによってCsp45 1部位を導入した。このプライマーの
配列を下記に示す。 配列番号９ 5' GGTGGTTCGAACATGCATGGAGATTTG 3'
【０１７０】 Csp45 1制限部位は、肉太活字で示す。ＰＣＲに用いた第二のプライマーは、
下記の配列を有する。 配列番号１０ 5' CCGTATCTCGAGACACATCTTCTAAAGTAATTT 3'
【０１７１】 Xho 1部位は、肉太活字で示す。これらのプライマーを用いて得たＰＣＲ生成
物はpPHASと呼ばれ、λゲノムクローンAG-λPVPh177.4 (λ177.4)のファゼオリ
ンプロモーターのＤＮＡ配列のヌクレオチド１２８〜８３３に相当する(Slighto
m, J.L., Sun, S.M. and Hall, T.C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 1897-
1901, 1983)。合成tetオペレーター配列を、合成二本鎖ＤＮＡをＰＣＲ生成物の
Csp45 1部位に連結することによってこの断片に加えた。合成オペレーターＤＮ
Ａ配列は、この配列の３′末端にCla 1部位も有する。合成ＤＮＡの最上部の鎖
は、下記の配列を有する。 配列番号１１ 5' TTCGAAGACTCTATCAGTGATAGAGTGTATATAAGACTCTATCAGTG ATAGAGTGAACTCTATCAGTGATACAGTATATCGAT 3'
【０１７２】 これは、３コピーのオペレーターＤＮＡ（肉太活字）、TATAボックス（下線部
）、５′末端のCsp45 1部位（斜体および下線部）、および３′末のCal 1部位（
斜体および下線部）を含んでなる。下記の配列を有する下部の鎖断片を用いる。 配列番号１２ 5' CGATATACTGTATCACTGATAGAGTTCACTCTATCACTGATAGAGTC TTATATACACTCTATCACTGATAGAGTCTTCGTT 3'
【０１７３】 これは、配列番号９に相補的鎖を含んでなり、肉太活字で同定されているCla
1付着末端を含む。二本鎖ＤＮＡは「最上部」ＤＮＡと呼ばれ、Csp45 1およびCl
a 1切断pPHASに連結され、挿入された「最上部」ＤＮＡを含むクローンを選択す
る。このベクターは、pPHAStet1と呼ばれる。ＤＮＡシークエンシングを用いて
、この再構築したＤＮＡの組成を立証した。
【０１７４】例３： 活性な癌遺伝子２に結合した改質した抑制ファゼオリンプロモーターの制
御下で癌遺伝子１を含んでなる植物形質転換ベクターの構築 この例では、２種類の遺伝子である癌遺伝子１（改質ファミリープロモーター
によって制御）および天然の癌遺伝子２の組合せ活性から生じる抑制可能致死遺
伝子活性を含んでなる植物形質転換ベクターの形成を説明する。発現を行うと、
このベクターの２種類の癌遺伝子により過剰のＩＡＡが形成され、致死遺伝子活
性が発現した植物細胞を殺す。このベクターを構築するために、下記の工程を用
いる。
【０１７５】 プラスミドpPHAStet1およびpG1をCla 1で消化し、癌遺伝子１のコード領域をp
PHAStet1のCla 1部位に挿入して、ベクターpPG-1を生産させる。Pst 1部位に末
端を有する約１４００ヌクレオチドに及ぶSac I部位を含んでなるタンパク質終
結コドンTGAの３６bp下流で出発するヌクレオチド配列を含んでなるプラスミドp
AGM 219に含まれるファゼオリンターミネーターをさらに改質して、Sac 1部位の
位置にPst 1部位を導入した。この修飾により、全ターミネーター配列を、約１
４００bpのPst 1断片としてpAGM 219から切り取ることができる。この１４００b
pのターミネーター断片をpPG-1のPst 1部位に挿入してpPG-2を形成し、これは３
種類のtetオペレーターＤＮＡ配列、癌遺伝子１のコード領域、およびファゼオ
リンターミネーター配列を含むように改質したファゼオリンプロモーターを含ん
でなる。
【０１７６】 天然癌遺伝子２を含むpG2のSph 1断片を、pPG-2のユニークSph 1部位に挿入し
て、ベクターpGG-1を形成する。ベクターpGG-1をXba 1で消化して、３種類のtet
オペレーターＤＮＡ配列、癌遺伝子１のコード領域、およびファゼオリンターミ
ネーター配列、および天然の癌遺伝子２をそれ自身のプロモーターの制御下で含
むように改質したファゼオリンプロモーター含んでなる全インサートを切り取る
。このXba I断片を、植物形質転換ベクターBinterのXba I部位に挿入する。
【０１７７】 植物形質転換ベクターBinterは、下記の方法でnosターミネーター断片が挿入
された広く用いられている植物形質転換ベクターBin 19 (Clontech、パロアルト
、カリフォルニア）を含んでなる。ベクターpBI 221 (Clontech)に含まれるnos
ターミネーターを最初にSac I - Eco RI断片として単離し、Sac IおよびEco RI
部位でpGEM-4Zにクローニングした。このプラスミドpGEMterをHind IIIおよびEc
o RIで消化して、nosターミネーターおよび全ポリリンカーを除き、Hind III -
Eco RIで消化したBin 19に挿入した。このベクターは、Binterと呼ばれる。
【０１７８】 ３種類のtetオペレーターＤＮＡ配列、癌遺伝子１のコード領域、およびファ
ゼオリンターミネーター配列、および天然の癌遺伝子２をそれ自身のプロモータ
ーの制御下で含むように改質したファゼオリンプロモーター含んでなるXba I断
片を含むBinterは、pGG-2と呼ばれる。pGG-2の構築に用いた工程を、図９に示す
。
【０１７９】例４： 改質ファゼオリンプロモーターの制御下で抑制種子致死遺伝子を導入する
ための植物の形質転換 この例では、タバコ植物を、標準的Agrobacterium依存性形質転換を用いてベ
クターpGG-2で形質転換し、抑制種子致死遺伝子活性を含んでなる植物を得る。
得られた植物を温室で生育し、開花させた。自家受粉した種子並びに野生型タバ
コを用いる相互交雑から誘導される種子を集めた。抑制種子致死遺伝子を有する
がリプレッサーを持たないタバコ植物は、発芽分析から生育可能ではないと判定
される種子を形成する。これを、図１０および１１に示す。図１０では、種子致
死ベクターを含んでなるタバコ種子と野生型タバコ種子の発芽の光学顕微鏡写真
を比較する。種子は表面殺菌して、塩基性培地で培養した。種子を発芽させた。
野生型種子を「WT」の印を付け、種子致死遺伝子を含んでなる種子を「SL」とし
て同定した。性状に発芽した野生型種子は、正常な子葉と真の第一葉を有してい
た。「SL」苗木は肥厚した子葉を有し、真の第一葉を欠いており、カルスおよび
過剰に根の多い表現型などのオーキシン過剰生産の典型的な徴候を示した。正常
な苗木または「WT」苗木が種子致死構築物を欠いている証拠を提供するため、同
一形質転換体からの種子をカナマイシンを含むまたは含まない培地で培養した。
カナマイシン含有培地で発芽した後、総ての正常な苗木は白くなって枯れ、これ
らは種子致死構築物を含まず（すなわち、pGG-2形質転換ベクターでカナマイシ
ン遺伝子に結合している）、従ってカナマイシン感受性であることを示していた
。これを、図１１に示す。この実験では、「-kan」の印を付けたプレートは、致
死およびカナマイシンを含まない培地で発芽した種子からの野生型タバコ苗木の
種子の混合物を示している。「+kan」のラベルを付けたプレートでは、致死およ
び野生型の種子の種子を同様に採取したものをカナマイシン３００μg/mlの存在
下で発芽させた。種子致死表現型は、いずれのプレートでも見られ、種子致死苗
木は過剰の根、肥厚した子葉を有し、真の第一葉を欠いている。カナマイシンを
含まないプレートでは、野生型種子は正常な苗木を生産し、カナマイシンを含む
プレートでは野生型植物は生長できず、苗木は白くなって最終的には枯れた。種
子致死苗木の総ては、正常な苗木を形成することはできなかったが、緑のままで
あった。従って、種子致死表現型は、種子致死遺伝子の存在に依存している。相
互交雑の結果に基づいて、種子致死表現型を花粉によって伝達することができる
ことも明らかである。従って、種子致死表現型は種子に現れるだけであり、植物
の他の組織には影響を及ぼさない。
【０１８０】例５： 抑制可能致死遺伝子およびリプレッサー遺伝子の植物系への導入 この例の最初の部分では、改質ファゼオリンプロモーターの制御下で抑制可能
致死遺伝子を有するタバコ植物を、35Sプロモーターの制御下でtetリプレッサー
をコードする遺伝子で予め形質転換し、挿入されるリプレッサー遺伝子とホモ接
合性であるタバコとの交雑における雌性親として用いる。植物は、表現型的に正
常である（図１２）。図１２では、植物Ａは抑制種子致死遺伝子を含む植物であ
り、植物Ｂはリプレッサー遺伝子を含む植物であり、植物Ｃは植物ＡおよびＢの
交雑によって誘導された植物であり、植物Ｄは野生型のタバコ植物である。植物
は総てが正確に同一年齢ではないことに留意すべきであり、これらの植物は繁殖
によって保持した。この写真は、抑制種子致死遺伝子を有する植物は表現型的に
正常であることを示すために提供されている。植物Ｃゆらいの種子を回収し、カ
ナマイシンの存在下で発芽させ、抑制可能致死遺伝子を含む種子を選択する。生
育可能な種子（すなわち、性状に発芽する種子）は、抑制可能致死遺伝子とリプ
レッサー遺伝子のコピーを両方とも含む。抑制可能致死遺伝子とリプレッサーの
存在についてのＰＣＲ分析により、遺伝子型を確認した。表現型は、発芽分析に
よって評価した。有意な数の独立して形質転換した系を得て、上記の方法で分析
した。これらの独立して形質転換した植物のほとんどは、完全に発芽することが
できない種子から、発芽するが過剰の根、肥厚した子葉を有し、真の第一葉を欠
いている異常苗木を生じる種子までの範囲の種子致死表現型を示した。表１は、
これらの様々な植物の代表的試料を用いて行った一連の交雑からのデータ一覧を
含んでいる。同定した植物を種子致死遺伝子（第２欄で「SL」と略記）の存在に
ついて試験し、第３欄で種子の生長可能性について評価し、標記リプレッサー系
（第４欄で「R」と略記）と交雑させ、これらの植物から集めた種子を発芽分析
によって分析し（第５欄に示す）、植物組織をリプレッサーおよび種子致死遺伝
子の存在について分析した。この分析により、種子致死遺伝子のリプレッサーに
よる抑制により、生育可能な種子を形成することができることを明らかにされた
。生育可能な種子は性状に発芽し、抑制種子致死遺伝子とリプレッサーとを含む
ことが分かった。
【０１８１】
【表３】
【０１８２】 抑制種子致死遺伝子を含む植物系を、リプレッサー遺伝子を含む植物系と交雑
した。抑制種子致死遺伝子を含む元の植物系とリプレッサー系と交雑した植物由
来の植物系の分離種子個体群を、土壌で発芽させた。種子致死遺伝子を含む植物
から誘導される種子の分離個体群内では、種子致死遺伝子を持たない分離物のみ
が生長することが分かった。種子致死遺伝子を有する植物は回収されず、リプレ
ッサーが存在しない場合には、種子致死遺伝子型を有する種子から生育可能な植
物を形成することはできないことが分かった。しかしながら、リプレッサーとの
交雑の種子からは、正常な植物が回収された。これらの正常な植物は、種子致死
およびリプレッサー遺伝子をいずれも有していた。これは、種子致死表現型は正
常な生育条件下で抑制できることを示している。種子致死遺伝子とリプレッサー
遺伝子が野生型植物との交雑の後に分離されると、種子致死表現型が再度出現し
、抑制が分離によって喪失してしまったことを示唆している。従って、これらの
一連の実験は、この方法が遺伝子モデルに基づいて予想されたように作用するこ
とを示している。
【０１８３】 上記の例から、抑制種子致死遺伝子とリプレッサーを含んでなる遺伝子の組合
せの誘導は、当業者の通常の技術範囲内にあることは明らかである。この方法に
対する様々な修飾、例えばホモ接合系の誘導体形成、様々な交雑処理、または植
物系を再形質転換して抑制可能致死遺伝子およびリプレッサーを組み合わせるこ
とも、当業者には明らかであり、完全に理解されている。
【０１８４】例６： ホモ接合性植物系の生産 上記の例５で得た植物は、本発明の方法の有用性を示しており、多種多様な同
様な工程を異なる作物で用いることができることが理解される。本発明の遺伝子
組合せを油糧種子Brassica napusのような作物で行う方法を例示するものとして
、この例では、この方法を葯培養と組み合わせて用いて、ホモ接合性植物系を速
やかに得ることを説明する。この例では、第一工程はBrassica napus植物を、好
ましくはGUS遺伝子のような容易に同定可能なマーカー遺伝子に結合した抑制可
能致死遺伝子を有する組換えＤＮＡ構築物で形質転換することによって種子致死
形質を有する植物を得ることである。抑制可能致死遺伝子の単一コピーで形質転
換した植物の一次形質転換体の個体群から、種子致死形質が発現し、従って、植
物が、自家受粉種子のGUSスクリーニングによって同定された遺伝子構築物を有
する種子を全く生産することができない植物を同定する。次に、このような植物
に葯培養を施して、この植物を自家受粉種子を生産できない二重ハプロイド植物
に転換する。この植物は抑制可能致死遺伝子についてホモ接合性である。
【０１８５】 種子致死表現型を抑制できるリプレッサー含有植物を誘導するため、Brassica
napus、好ましくは同一植物品種をリプレッサーＤＮＡを有する組換えＤＮＡ構
築物で形質転換する。上記のリプレッサーＤＮＡを含む植物の個体群を選択する
。リプレッサー含有植物のこの個体群を雄性親として用いて、種子致死形質を発
現する植物に交雑する。交雑した種子の回収率を単純化するため、交雑の際に雌
性親を除雄するのが好ましい。上記交雑の結果として生産した生育可能な種子は
、抑制可能致死遺伝子と種子致死表現型を抑制できるリプレッサー遺伝子を含ん
でいなければならない。それぞれの個々の交雑からの種子を回収し、生育させる
。この植物の個体群から、完全に自家受粉セットが可能でありかつ抑制致死種子
形質を有する個々の植物を選択する。リプレッサー遺伝子を欠いている他の品種
に交雑受粉すると、このような植物は上記の抑制された致死遺伝子に結合したGU
S活性について陽性である種子を実質的に生産することができない。
【０１８６】 このような方法により、交雑を極めて効率的に制限し、完全な自家受粉種子セ
ット能力を保持する遺伝子組合せを選択することができる。最も好ましい遺伝子
組合せは、減数分裂の際に最も効果的に隔離される遺伝子座に挿入されたＤＮＡ
を含む植物であるので、挿入したＤＮＡの詳細なマッピングを行う必要はない。
この植物系からの種子抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子のみを含むよう
に改質された元の出発品種である。しかしながら、上記植物系は、抑制可能致死
遺伝子に関連した形質または複数の形質を実質的に導入することはできない。
【０１８７】 雑種Brassica napusのような抑制された致死遺伝子とリプレッサーを有する雑
種作物を生産するために、本発明の方法の改質法を提供して、親系を生産させる
。抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子を組み合わせるための最も明白な方
法は、雑種種子の生産の際である。従って、このようにして生産される雑種種子
は抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子の遺伝子組成物を有することとなる
。
【０１８８】 この遺伝子組成物を生産させるため、雄性親の種子を増加させる手段を提供す
る。この方法としては、抑制可能致死遺伝子を含んでなるＤＮＡ分子と誘導性プ
ロモーターの盛業かでリプレッサー遺伝子を含んでなるＤＮＡ分子による植物の
形質転換が挙げられる。好ましくは、遺伝子同士を結合させ、さらに新規な形質
を有することができる。プロモーターの誘導により、抑制された致死遺伝子およ
び誘導リプレッサー遺伝子について植物をホモ接合性とする。得られた植物種子
は、雑種交雑における雄性親として働くことができる。種子はインデューサーの
存在下で増加する。
【０１８９】 上記雑種交雑における雌性親は、植物をリプレッサー遺伝子を含んでなるＤＮ
Ａ分子で形質転換し、植物をリプレッサー遺伝子についてホモ接合性とし、自家
受粉および自家受粉−種子形成させ、この植物を雑種交雑における雌性親として
使用することによって生産される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子が独立して隔離された遺伝子座に配
置されている略図。「新規形質」という用語は、結合した組換えＤＮＡ、または
１個以上の形質の組合せを含んでなる特異的遺伝子型を表す。PRO 1は、抑制可
能致死遺伝子の発現を制御するプロモーターを表し、種子特異的プロモーターが
好ましい。リプレッサー遺伝子の十分な発現により、致死表現型の発現が防止さ
れる。
【図２】 致死遺伝子およびリプレッサー遺伝子を両方とも含んでなるＤＮＡ構築物。リ
プレッサー遺伝子は、部位特異的リコンビナーゼまたはトランスポザーゼの子葉
によって新規な染色体上の遺伝子座に特異的に標的設定される。トランスポザー
ゼまたはリコンビナーゼ認識配列により、活性リコンビナーゼまたはトランスポ
ザーゼ酵素の存在下でリプレッサー遺伝子を、抑制可能致死遺伝子から独立して
隔離されている遺伝子座に再配置することができる。
【図３】 ２個の抑制可能致死遺伝子と２個の独立したリプレッサー遺伝子を含んでなる
、ＤＮＡ構築物。新規な形質または複数の形質を、一方または両方に、または抑
制可能致死遺伝子に結合させることができる。リプレッサー遺伝子は機能的に異
なっており、すなわち独立して作用する。抑制可能致死遺伝子は、同一または異
なる抑制可能致死遺伝子活性をコードすることができる。PRO 1およびPRO 2は同
一または異なるプロモーターであることができ、種子特異的プロモーターが好ま
しい。
【図４】 リプレッサーと致死遺伝子が相同染色体対の対向染色体上に配置されている抑
制可能致死遺伝子を植物の生産の略図。部位特異的リコンビナーゼは、リプレッ
サーおよび致死遺伝子構築物を相同染色体対の対向娘染色体に標的設定する。「
標的リコンビナーゼ配列」は、さらに、構築物を挿入することによって活性化さ
れる不活性な選択マーカーを含んでなることができる。 この略図により、エリート親系を、標的リコンビナーゼ配列で形質転換する。
半接合性植物が回収され、ホモ接合性状態に転換される。植物を、抑制可能致死
遺伝子または（複数の）リコンビナーゼ標的配列がフランクしたリプレッサー遺
伝子で再形質転換する。ランダムに組込まれたSLまたはRを含んでなる植物を回
収する。次に、リコンビナーゼ機能を用いて、SLまたはRを特異的に切り取り、
小敵染色体対上にある標的リコンビナーゼ配列に挿入する。SLおよびRを含む植
物を回収する。
【図５】 自家受粉作物における抑制可能致死遺伝子の使用。条件致死遺伝子は、場合に
よって用いる。 この図では、組換えＤＮＡ１は、抑制種子致死（SL）および他の組織で条件致
死（CL）である。組換えＤＮＡ２は、リプレッサーである。
【図６】 雑種作物における抑制可能致死遺伝子法の使用。条件致死遺伝子は、場合によ
って用いる。 この図では、組換えＤＮＡ１は、抑制種子致死（SL）および他の組織で条件致
死（CL）であり、誘導リプレッサー（IndR）も含む。組換えＤＮＡ２は、非致死
リプレッサー（R）である。
【図７】 Agrobacterium tumifaciens株ATCC 15955のTiプラスミドpTi15955由来の致死
遺伝子である癌遺伝子２（図７ａ）および１（図７ｂ）の単離。
【図８】 種子特異的プロモーターである、ファゼオリンプロモーターであって、細菌性
リプレッサー結合部位を含むように改質したものの構築。この改質プロモーター
を含むベクターは、pPHAStet1である。
【図９】 1)細菌リプレッサー結合部位を含むように改質したファゼオリンプロモーター
の制御下にあるAgrobacterium tumifaciens Ti プラスミドpTi15955の癌遺伝子
１（図９ａ）、および2)その天然プロモーターの制御下にある条件致死遺伝子で
ある癌遺伝子２を含んでなる植物形質転換ベクターの構築。
【図１０】 抑制種子致死遺伝子を含みリプレッサー遺伝子（種子致死またはSL表現型）を
含まない種子と比較した野生型（WT）種子の発芽。
【図１１】 野生型苗木、並びに選択的および非選択的条件下で発芽した抑制種子致死遺伝
子を含む植物の隔離個体群の苗木。
【図１２】 抑制種子致死遺伝子を含む植物(A)、リプレッサー遺伝子を含む植物(B)、抑制
種子致死遺伝子およびリプレッサー遺伝子を含む植物(C)、および野生型植物(D)
の比較。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１１月５日（２００１．１１．５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】 天然の癌遺伝子２を単離するため、下記の方法を用いる。癌遺伝子２の天然プ
ロモーターを含む５′領域を、下記のプライマーを用いるプラスミドp101のＰＣ
Ｒ増幅によって単離する。
【化１】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】 天然のターミネーター構造を包含する癌遺伝子２の３′領域を単離するため、
２種類のＰＣＲプライマーを用いる。使用した第一のプライマーは、
【化２】 である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６１】 癌遺伝子１の単離は、好都合な制限部位を導入するためのＰＣＲと天然遺伝子
断片のサブクローニングの組合せを用いる。必要な断片を単離するため、下記の
方法を用いる。コード領域の５′末端に、好都合な制限部位を下記の２種類のプ
ライマーを用いるＰＣＲによって導入する。
【化３】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】 癌遺伝子１のコード領域の３′断片を単離するため、２種類のプライマーを用
いてコード領域の３′末端に好都合な制限部位を導入する。
【化４】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６９】 用いた第一のＰＣＲプライマーを作成し、天然のプロモーター配列にヌクレオ
チド配列のマイナー変さらによってCsp45 1部位を導入した。このプライマーの
配列を下記に示す。
【化５】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７０】 Csp45 1制限部位は、肉太活字で示す。ＰＣＲに用いた第二のプライマーは、
下記の配列を有する。
【化６】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】 Xho 1部位は、肉太活字で示す。これらのプライマーを用いて得たＰＣＲ生成
物はpPHASと呼ばれ、λゲノムクローンAG-λPVPh177.4 (λ177.4)のファゼオリ
ンプロモーターのＤＮＡ配列のヌクレオチド１２８〜８３３に相当する(Slighto
m, J.L., Sun, S.M. and Hall, T.C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 1897-
1901, 1983)。合成tetオペレーター配列を、合成二本鎖ＤＮＡをＰＣＲ生成物の
Csp45 1部位に連結することによってこの断片に加えた。合成オペレーターＤＮ
Ａ配列は、この配列の３′末端にCla 1部位も有する。合成ＤＮＡの最上部の鎖
は、下記の配列を有する。
【化７】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７２】 これは、３コピーのオペレーターＤＮＡ（肉太活字）、TATAボックス（下線部
）、５′末端のCsp45 1部位（斜体および下線部）、および３′末のCal 1部位（
斜体および下線部）を含んでなる。下記の配列を有する下部の鎖断片を用いる。
【化８】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences Canada Inc. <120> Methods and Genetic Compositions to Limit Gene Flow and Undesired Outcrossing in Crop Plants <130> 131879 <140> JP 2000-589714 <141> 1999-12-22 <150> US 60/113545 <151> 1998-12-22 <160> 12 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 atagcatgct ctagatgtta gaaaagattc gtttttgtg 39 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ataccatggc gatcaatttt tttggcgc 28 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ataaagcttg aaaattaagc ccccccccg 29 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ataggatccg catgcccagt ctaggtcgag ggaggcc 37 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ataatcgata tagaaacggt tgttgtggtt 30 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ataagatctc ggggaagcga cc 22 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aatgatatct gaactttatg ataagg 26 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 atagagctca tcgatactaa tttctagtgc ggtagtt 37 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ggtggttcga acatgcatgg agatttg 27 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ccgtatctcg agacacatct tctaaagtaa ttt 33 <210> 11 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ttcgaagact ctatcagtga tagagtgtat ataagactct atcagtgata gagtgaactc 60 tatcagtgat acagtatatc gat 83 <210> 12 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cgatatactg tatcactgat agagttcact ctatcactga tagagtctta tatacactct 60 atcactgata gagtcttcgt t 81
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ローリアン、ロバート カナダ国ケベック州、ガティノー、ドゥメ ゾン、12 (72)発明者 ジョハン、シャーンタナー カナダ国オンタリオ州、オーリンズ、アビ ニョン、コート、1118 Ｆターム(参考） 2B030 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB03 CD03 CD07 CD09 4B024 AA08 AA20 CA02 CA06 CA11 DA01 EA04 FA01 FA02 GA11 HA08 4B065 AA11Y AA41Y AA88X AB01 AC20 BA02 BA30 CA24 CA53 CA60

Claims (99)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 (a)形質転換を行って完全な植物体に再生することができる植物細胞に (i)抑制可能な致死遺伝子であって、その遺伝子産物の活性が植物細胞にとっ
    て致死的であるものを含んでなるＤＮＡ構築物、および (ii)リプレッサー遺伝子であって、その遺伝子産物が上記致死遺伝子産物の活
    性を抑制することができるものを含んでなるＤＮＡ構築物 を導入し、 (b)上記植物細胞から完全な植物体を再生し、 (c)挿入されたリプレッサー遺伝子が、挿入された抑制可能致死遺伝子から独
    立して隔離されている植物を選択する ことを含んでなる、遺伝子修飾された植物を生産する方法。
  2. 【請求項２】 抑制可能致死遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物がリプレッサー遺伝子を含んで
    なるＤＮＡ構築物から分離しており、工程(b)で生成した植物を交雑することに
    よって選択を行う、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 挿入された抑制可能致死遺伝子と挿入されたリプレッサー遺伝子が染色体対の
    向き合った姉妹染色体上に配置されている、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 抑制可能致死遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物がリプレッサー遺伝子を含んで
    なるＤＮＡ構築物と同じものであり、独立した隔離が部位特異的リコンビナーゼ
    またはトランスポザーゼを用いることによって行われる、請求項１に記載の方法
    。
  5. 【請求項５】 抑制可能致死遺伝子もしくはリプレッサー遺伝子または両方が、組織特異的プ
    ロモーターによって制御されている、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 抑制可能致死遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物が特異的ＤＮＡオペレーター配
    列をも含んでなり、リプレッサーが特異的ＤＮＡオペレーター配列に結合できる
    細菌リプレッサーであり、細菌リプレッサーと特異的ＤＮＡオペレーター配列と
    の結合により致死遺伝子の抑制を生じる、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 リプレッサー遺伝子が構成的プロモーターによって制御されている、請求項１
    に記載の方法。
  8. 【請求項８】 リプレッサー遺伝子が誘導性プロモーターによって制御されている、請求項１
    に記載の方法。
  9. 【請求項９】 致死遺伝子産物の活性が天然に存在する植物成長調節物質の過剰発現または不
    十分発現を含んでなる、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 抑制可能致死遺伝子がAgrobacteriumの癌遺伝子４、癌遺伝子１および２、リ
    ボソーム不活性化タンパク質をコードする遺伝子、ジフテリアＡ鎖毒素をコード
    する遺伝子、およびリボヌクレアーゼをコードする遺伝子からなる群から選択さ
    れる、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 抑制可能致死遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物が条件致死遺伝子をも含んでな
    る、請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 抑制可能致死遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物がリプレッサー遺伝子を含んで
    なるＤＮＡ構築物から分離しており、これらの構築物が形質転換して完全な植物
    体に再生することができる植物細胞に同時に導入される、請求項１に記載の方法
    。
  13. 【請求項１３】 抑制可能致死遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物がリプレッサー遺伝子を含んで
    なるＤＮＡ構築物と同じものであり、上記ＤＮＡ構築物が挿入された抑制可能致
    死遺伝子および挿入されたリプレッサー遺伝子の独立した隔離を可能とするＤＮ
    Ａ配列をも含んでなる、請求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 (a)形質転換を行って完全な植物体に再生することができる植物細胞に (i)第一の抑制可能致死遺伝子であって、その遺伝子産物の活性が植物細胞に
    とって致死的であるものを含んでなるＤＮＡ構築物、 (ii)第一のリプレッサー遺伝子であって、その遺伝子産物が上記第一の致死遺
    伝子の活性を抑制することができるものを含んでなるＤＮＡ構築物、 (iii)第二の抑制可能致死遺伝子であって、その遺伝子産物の活性が植物細胞
    にとって致死的であるものを含んでなるＤＮＡ構築物、および (iv) 第二のリプレッサー遺伝子であって、その遺伝子産物が上記第二の致死
    遺伝子の活性を抑制することができるものを含んでなるＤＮＡ構築物 を導入し、 (b)上記植物細胞から完全な植物体を再生し、 (c)挿入された第一のリプレッサー遺伝子が、挿入された第一の抑制可能遺伝
    子から独立して隔離されており、挿入された第二のリプレッサー遺伝子が挿入さ
    れた第二の抑制可能遺伝子から独立して隔離されている植物を選択する ことを含んでなる、遺伝子修飾された植物を生産する方法。
  15. 【請求項１５】 第一の抑制可能致死遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物が第一のリプレッサー遺
    伝子を含んでなるＤＮＡ構築物から分離しており、第二の抑制可能致死遺伝子を
    含んでなるＤＮＡ構築物が第二のリプレッサー遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物
    から分離しており、工程(b)で生成した植物を交雑することによって選択を行う
    、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 挿入された第一の抑制可能致死遺伝子と挿入された第一のリプレッサー遺伝子
    が染色体対の向き合った姉妹染色体上に配置されており、挿入された第二の抑制
    可能致死遺伝子と挿入された第二のリプレッサー遺伝子が染色体対の向き合った
    姉妹染色体上に配置されている、請求項１４に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 第一の抑制可能致死遺伝子が第一のリプレッサー遺伝子と同じＤＮＡ構築物内
    にあり、第二の抑制可能致死遺伝子が第二のリプレッサー遺伝子と同じＤＮＡ構
    築物内にあり、独立した隔離が部位特異的リコンビナーゼまたはトランスポザー
    ゼを用いることによって行われる、請求項１４に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 第一の抑制可能致死遺伝子が第二のリプレッサー遺伝子に結合しており、第二
    の抑制可能致死遺伝子が第一のリプレッサー遺伝子に結合している、請求項１４
    に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 第一もしくは第二または両方の抑制可能致死遺伝子が組織特異的プロモーター
    によって制御されている、請求項１４に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 (a)第二の抑制可能致死遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物が第一の特異的ＤＮ
    Ａオペレーター配列をも含んでなり、第一のリプレッサーが第一の特異的ＤＮＡ
    オペレーター配列に結合することができる細菌リプレッサーであり、第一の細菌
    リプレッサーと第一の特異的ＤＮＡオペレーター配列の結合によって、第二の致
    死遺伝子が抑制され、 (b)第一の抑制可能致死遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物が第二の特異的ＤＮ
    Ａオペレーター配列をも含んでなり、第二のリプレッサーが第二の特異的ＤＮＡ
    オペレーター配列に結合することができる細菌リプレッサーであり、第二の細菌
    リプレッサーと第二の特異的ＤＮＡオペレーター配列の結合によって、第一の致
    死遺伝子が抑制される、 請求項１４に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 第一もしくは第二または両方のリプレッサー遺伝子が組織特異的プロモーター
    によって制御されている、請求項１４に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 第一、または第一および第二のリプレッサー遺伝子が構成的プロモーターによ
    って制御されている、請求項１４に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 リプレッサーが抑制可能致死遺伝子の発現を抑制することができるセンス遺伝
    子またはアンチセンスＲＮＡを含んでなるものである、請求項１または１４に記
    載の方法。
  24. 【請求項２４】 リプレッサーが抑制可能致死遺伝子の発現を抑制することができるリボザイム
    を含んでなるものである、請求項１または１４に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 抑制可能致死遺伝子の一方または両方が、Agrobacteriumの癌遺伝子１および
    ２、Pseudomonasの癌遺伝子１および２、Agrobacteriumの癌遺伝子４、リボソー
    ム不活性化タンパク質をコードする遺伝子、ジフテリアＡ鎖毒素をコードする遺
    伝子、およびリボヌクレアーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される、
    請求項１４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 癌遺伝子１および２がAgrobacteriumまたはPseudomonasに由来する、請求項１
    ０または２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 癌遺伝子４がAgrobacteriumに由来する、請求項１０または２５に記載の方法
    。
  28. 【請求項２８】 リボヌクレアーゼがバルナーゼ(Barnase)またはＴ１リボヌクレアーゼである
    、請求項１０または２５に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 第一の抑制可能致死遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物、もしくは第二の抑制可
    能致死遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物、または両方が、さらに条件致死遺伝子
    を含んでなるものである、請求項１４に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 第一の抑制可能致死遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物が第一のリプレッサー遺
    伝子を含んでなるＤＮＡ構築物から分離しており、第二の抑制可能致死遺伝子を
    含んでなるＤＮＡ構築物が第二のリプレッサー遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物
    から分離しており、これらの構築物を形質転換を行って完全な植物体に再生する
    ことができる植物細胞に同時に導入する、請求項１４に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 第一の抑制可能致死遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物が第一のリプレッサー遺
    伝子を含んでなるＤＮＡ構築物と同じものであり、第二の抑制可能致死遺伝子を
    含んでなるＤＮＡ構築物が第二のリプレッサー遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物
    と同じものであり、上記ＤＮＡ構築物が、挿入された第一の抑制可能致死遺伝子
    の挿入された第一のリプレッサー遺伝子からの独立した隔離を可能とし、かつ挿
    入された第二の抑制可能致死遺伝子の挿入された第二のリプレッサー遺伝子から
    の独立した隔離を可能とするＤＮＡ配列をも含んでなる、請求項１４に記載の方
    法。
  32. 【請求項３２】 第一の抑制可能致死遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物が第二のリプレッサー遺
    伝子を含んでなるＤＮＡ構築物と同じものであり、第二の抑制可能致死遺伝子を
    含んでなるＤＮＡ構築物が第一のリプレッサー遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物
    と同じものであり、上記ＤＮＡ構築物がＤＮＡ構築物の独立した隔離を可能とす
    る単一植物形質転換ベクター内に含まれている、請求項１４に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 独立した隔離が部位特異的リコンビナーゼまたはトランスポザーゼを用いて行
    われる、請求項３２に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 組織特異的プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求項５、１９ま
    たは２１のいずれか一項に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 種子特異的プロモーターがファゼオリンプロモーターである、請求項３４に記
    載の方法。
  36. 【請求項３６】 植物がさらに新規な形質を含んでなる、請求項１または１４に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 新規な形質が、変更された表現型、天然の植物細胞には見られないタンパク質
    、または天然の植物細胞に見られずかつ検出可能な表現型を付与しないタンパク
    質を含んでなる、請求項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 新規な形質をコードする遺伝子が抑制可能致死遺伝子に結合されている、請求
    項３６または３７に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 新規な形質をコードする遺伝子が種子特異的プロモーターによって制御されて
    いる、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 異種生殖細胞質の遺伝子移入または異系交雑の際に発現される抑制可能致死遺
    伝子を含んでなる雄性親を雑種交雑(hybrid cross)のために生産する方法であっ
    て、 (a)形質転換を行って完全な植物体に再生することができる植物細胞に (i)種子特異的プロモーターによって制御されている抑制可能致死遺伝子であ
    って、その遺伝子産物の活性が植物細胞にとって致死的であるものを含んでなる
    ＤＮＡ構築物、および (ii)誘導性プロモーターによって制御されているリプレッサー遺伝子であって
    、その遺伝子産物が上記致死遺伝子の活性を抑制することができるものを含んで
    なるＤＮＡ構築物 を導入し、 ここで、挿入されたリプレッサー遺伝子が挿入された抑制可能遺伝子から独立
    して隔離されており、 (b)上記植物細胞から完全な植物体を再生し、 (c)上記植物から、抑制可能致死遺伝子および誘導性リプレッサー遺伝子につ
    いてホモ接合性である植物を生成させる ことを含んでなり、 ここで、ホモ接合性植物が雑種交雑の雄性親として機能し得ることを特徴とす
    る方法。
  41. 【請求項４１】 (a)ホモ接合性植物を自家受粉させ、 (b)種子が形成される期間中にホモ接合性植物中の誘導性プロモーターを誘導
    し、そして (c)種子を得る ことを含んでなる、請求項４０に記載の雄性親を保持する方法。
  42. 【請求項４２】 請求項４０または４１に記載の方法によって生産される植物。
  43. 【請求項４３】 抑制可能致死遺伝子を有する雌性親を雑種交雑のために生産する方法であって
    、 (a)形質転換を行って完全な植物体に再生することができる植物細胞に、種子
    特異的プロモーターによって制御されている抑制可能致死遺伝子であって、その
    遺伝子産物の活性が植物細胞にとって致死的であるものを含んでなるＤＮＡ構築
    物を導入し、 (b)上記植物細胞から完全な植物を再生する ことを含んでなる、方法。
  44. 【請求項４４】 抑制可能致死遺伝子および誘導性リプレッサー遺伝子を含んでなる雌性親を雑
    種交雑のために生産する方法であって、 (a)形質転換を行って完全な植物体に再生することができる植物細胞に、 (i)種子特異的プロモーターによって制御されている抑制可能致死遺伝子であ
    って、その遺伝子産物の活性が植物細胞にとって致死的であるものを含んでなる
    ＤＮＡ構築物、および (ii)誘導性プロモーターによって制御されているリプレッサー遺伝子であって
    、その遺伝子産物が上記の致死遺伝子の活性を抑制することができるものを含ん
    でなるＤＮＡ構築物 を導入し、 ここで、挿入されたリプレッサー遺伝子が挿入された抑制可能遺伝子から独立
    して隔離されており、 (b)上記植物細胞から完全な植物を再生し、 (c)上記植物から抑制可能致死遺伝子および誘導性リプレッサー遺伝子につい
    てホモ接合性である植物を生成させる ことを含んでなり、 ここで、ホモ接合性植物が雑種交雑の雌性親として機能し得ることを特徴とす
    る方法。
  45. 【請求項４５】 (a)ホモ接合性植物を自家受粉させ、 (b)種子が形成される期間中にホモ接合性植物中の誘導性プロモーターを誘導
    し、 (c)種子を得る ことを含んでなる、請求項４４に記載の雌性親を保持する方法。
  46. 【請求項４６】 請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法によって生産される植物。
  47. 【請求項４７】 上記種子特異的プロモーターがファゼオリンプロモーターを含んでなる、請求
    項４０、４１、および４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 植物がさらに新規な形質を含んでなる、請求項４０、４１、および４３〜４５
    のいずれか一項に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 新規な形質が、変更された表現型、天然の植物細胞には見られないタンパク質
    、または天然の植物細胞に見られずかつ検出可能な表現型を付与しないタンパク
    質を含んでなる、請求項４８に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 新規な形質をコードする遺伝子が抑制可能致死遺伝子に結合されている、請求
    項４８または４９に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 新規な形質をコードする遺伝子が種子特異的プロモーターによって制御されて
    いる、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 抑制可能致死遺伝子およびリプレッサー遺伝子を含んでなる雑種種子を生産す
    る方法であって、 (a)請求項４６に記載の植物を開花させ、 (b)上記植物を、リプレッサー遺伝子であって、その遺伝子産物が上記抑制可
    能致死遺伝子を抑制することができるものを含んでなる花粉で受粉させ、そして (c)抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子を含んでなる雑種種子を回収す
    る ことを含んでなる、方法。
  53. 【請求項５３】 リプレッサー遺伝子を有する雌性親を雑種交雑のために生産する方法であって
    、 (a)形質転換を行って完全な植物体に再生することができる植物細胞に、リプ
    レッサー遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物を導入し、 (b)上記植物細胞から完全な植物を再生し、 (c)上記植物からリプレッサー遺伝子についてホモ接合性である植物を生成さ
    せる ことを含んでなり、 ここで、ホモ接合性植物が雑種交雑の雌性親として機能し得ることを特徴とす
    る、方法。
  54. 【請求項５４】 雌性親が自家受粉することができない、請求項５３に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 請求項５３または５４に記載の方法によって生産される植物。
  56. 【請求項５６】 異種生殖細胞質の遺伝子移入または異系交雑の際に発現される抑制可能致死遺
    伝子を含んでなる遺伝子修飾された植物を生産する方法であって、 (a)請求項４２に記載の雄性親を請求項５５に記載の雌性親と交雑させ、ここ
    で、雌性親のリプレッサー遺伝子産物が雄性親の抑制可能致死遺伝子を抑制する
    ことができ、 (b)雄性親からの抑制可能致死遺伝子と雌性親からのリプレッサー遺伝子とを
    含んでなる雑種種子を雄性親から収穫する ことを含んでなる方法。
  57. 【請求項５７】 植物種子が自家不和合性である、請求項５６に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 請求項１〜３９、５２、５６および５７のいずれか一項に記載の方法によって
    生産される植物。
  59. 【請求項５９】 マーカー遺伝子をさらに含んでなる、請求項４２、４６、５５および５８のい
    ずれか一項に記載の植物。
  60. 【請求項６０】 双子葉植物(Dicotyledoneae)である、請求項５８または５９に記載の植物。
  61. 【請求項６１】 単子葉植物(Monocotyledoneae)である、請求項５８または５９に記載の植物。
  62. 【請求項６２】 アオイ科(Malvaceae)、アマ科(Linaceae)、キク科(Compositae)、マメ科(Faba
    ceae)、トウダイグサ科(Euphorbiaceae)、またはモクセイ科(Oleaceae)のメンバ
    ーである、請求項５８または５９に記載の植物。
  63. 【請求項６３】 アブラナ属(Brassica)のメンバーである、請求項５８または５９に記載の植物
    。
  64. 【請求項６４】 アマ属(Linum)、ワタ属(Gossypium)、ダイズ属(Glycine)、ナンキンマメ属(Ar
    achis)、ベニバナ属(Carthamus)、ヒマワリ属(Helianthus)、カラシ属(Sinapis)
    、ダイコン属(Raphanus)、トウゴマ属(Ricinus)、またはオリーブ属(Olea)のメ
    ンバーである、請求項５８または５９に記載の植物。
  65. 【請求項６５】 ジュウジバナ科(Brassicaceae)（＝アブラナ科(Cruciferae)）のメンバーであ
    る、請求項５８または５９に記載の植物。
  66. 【請求項６６】 Brassica napusまたはrapaである、請求項５８または５９に記載の植物。
  67. 【請求項６７】 菜種またはカノーラである、請求項５８または５９に記載の植物。
  68. 【請求項６８】 油糧種子植物である、請求項５８または５９に記載の植物。
  69. 【請求項６９】 植物の異系交雑を制限するための該植物の形質転換に用いる植物形質転換ベク
    ターであって、 (a)抑制可能致死遺伝子であって、その遺伝子産物の活性が植物細胞にとって
    致死的であるもの、および (b)リプレッサー遺伝子であって、その遺伝子産物が上記致死遺伝子産物の活
    性を抑制することができるもの を含んでなる、植物形質転換ベクター。
  70. 【請求項７０】 異種生殖細胞質の遺伝子移入を制限するために用いる植物形質転換ベクターで
    あって、 (a)抑制可能致死遺伝子であって、その遺伝子産物の活性が植物細胞にとって
    致死的であるもの、および (b)リプレッサー遺伝子であって、その遺伝子産物が上記致死遺伝子産物の活
    性を抑制することができるもの を含んでなる、植物形質転換ベクター。
  71. 【請求項７１】 植物の異系交雑を制限するための該植物の形質転換に用いる、または異種生殖
    細胞質の遺伝子移入を制限するための植物形質転換ベクターであって、 (a)第一の抑制可能致死遺伝子であって、その遺伝子産物の活性が植物細胞に
    とって致死的であるもの、 (b)第一のリプレッサー遺伝子であって、その遺伝子産物が上記第一の致死遺
    伝子の活性を抑制することができるもの、 (c)第二の抑制可能致死遺伝子であって、その遺伝子産物の活性が植物細胞に
    とって致死的であるもの、および (d)第二のリプレッサー遺伝子であって、その遺伝子産物が上記第二の致死遺
    伝子の活性を抑制することができるもの を含んでなる、植物形質転換ベクター。
  72. 【請求項７２】 第一の抑制可能致死遺伝子が第一のリプレッサー遺伝子に結合しておらず、第
    二の抑制可能致死遺伝子が第二のリプレッサー遺伝子に結合していない、請求項
    ７１に記載のベクター。
  73. 【請求項７３】 第一の抑制可能致死遺伝子が第一のリプレッサー遺伝子に結合しており、第二
    の抑制可能致死遺伝子が第二のリプレッサー遺伝子に結合しており、形質転換後
    における、第一の抑制可能致死遺伝子の第一のリプレッサー遺伝子からの独立し
    た隔離および第二の抑制可能致死遺伝子の第二のリプレッサー遺伝子からの独立
    した隔離を可能とする少なくとも一個のＤＮＡ配列をさらに含んでなる、請求項
    ７１に記載のベクター。
  74. 【請求項７４】 (a)第一の特異的ＤＮＡオペレーター配列が第二の抑制可能致死遺伝子に結合
    しており、第一のリプレッサーが第一の特異的ＤＮＡオペレーター配列に結合す
    ることができる細菌リプレッサーであり、第一の細菌リプレッサーと第一の特異
    的ＤＮＡオペレーター配列との結合によって第二の致死遺伝子が抑制され、そし
    て (b)第二の特異的ＤＮＡオペレーター配列が第一の抑制可能致死遺伝子に結合
    しており、第二のリプレッサーが第二の特異的ＤＮＡオペレーター配列に結合す
    ることができる第二の細菌リプレッサーであり、第二の細菌リプレッサーと第二
    の特異的ＤＮＡオペレーター配列との結合によって第一の致死遺伝子が抑制され
    る、 請求項７１〜７３のいずれか一項に記載のベクター。
  75. 【請求項７５】 雑種交雑のための親植物の生成に用いる植物形質転換ベクターであって、 (a)種子特異的プロモーターによって制御されている抑制可能致死遺伝子であ
    って、その遺伝子産物の活性が植物細胞にとって致死的であるもの、および (b)誘導性プロモーターによって制御されているリプレッサー遺伝子であって
    、その遺伝子産物が上記致死遺伝子の活性を抑制することができるもの を含んでなる、植物形質転換ベクター。
  76. 【請求項７６】 抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子とが結合していない、請求項６９、
    ７０および７５のいずれか一項に記載のベクター。
  77. 【請求項７７】 抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子とが結合しており、形質転換後にお
    ける抑制可能致死遺伝子とリプレッサー遺伝子との独立した隔離を可能とする少
    なくとも一個のＤＮＡ配列をさらに含んでなる、請求項６９、７０および７５の
    いずれか一項に記載のベクター。
  78. 【請求項７８】 前記少なくとも一個のＤＮＡ配列が部位特異的リコンビナーゼまたはトランス
    ポザーゼの認識配列を含んでなる、請求項７３または７７に記載のベクター。
  79. 【請求項７９】 抑制可能致死遺伝子もしくはリプレッサー遺伝子または両方が組織特異的プロ
    モーターによって制御されている、請求項６９〜７８のいずれか一項に記載のベ
    クター。
  80. 【請求項８０】 組織特異的プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求項７９に記載
    のベクター。
  81. 【請求項８１】 種子特異的プロモーターがファゼオリンプロモーターである、請求項８０に記
    載のベクター。
  82. 【請求項８２】 特異的ＤＮＡオペレーター配列が抑制可能致死遺伝子に結合しており、リプレ
    ッサーが該特異的ＤＮＡオペレーター配列に結合することができる細菌リプレッ
    サーであり、該細菌リプレッサーと該特異的ＤＮＡオペレーター配列との結合に
    よって致死遺伝子が抑制される、請求項６９、７０および７５〜７８のいずれか
    一項に記載のベクター。
  83. 【請求項８３】 リプレッサー遺伝子が構成的プロモーターによって制御されている、請求項６
    ９〜７８のいずれか一項に記載のベクター。
  84. 【請求項８４】 リプレッサー遺伝子が誘導性プロモーターによって制御されている、請求項６
    ９〜７８のいずれか一項に記載のベクター。
  85. 【請求項８５】 致死遺伝子産物の活性が天然に存在する植物成長調節物質の過剰発現または不
    十分発現を含んでなる、請求項６９〜７８のいずれか一項に記載のベクター。
  86. 【請求項８６】 抑制可能致死遺伝子が、Agrobacteriumの癌遺伝子４、癌遺伝子１および２、
    リボソーム不活性化タンパク質をコードする遺伝子、ジフテリアＡ鎖毒素をコー
    ドする遺伝子、およびリボヌクレアーゼをコードする遺伝子からなる群から選択
    される、請求項６９〜７８のいずれか一項に記載のベクター。
  87. 【請求項８７】 癌遺伝子１および２がAgrobacteriumまたはPseudomonasに由来する、請求項８
    ６に記載のベクター。
  88. 【請求項８８】 癌遺伝子４がAgrobacteriumに由来する、請求項８６に記載のベクター。
  89. 【請求項８９】 リボヌクレアーゼがバルナーゼ(Barnase)またはＴ１リボヌクレアーゼである
    、請求項８６に記載のベクター。
  90. 【請求項９０】 抑制可能致死遺伝子に結合した条件致死遺伝子をさらに含んでなる、請求項６
    ９〜７８のいずれか一項に記載のベクター。
  91. 【請求項９１】 リプレッサー遺伝子が構成的プロモーターによって制御されている、請求項６
    ９〜７８のいずれか一項に記載のベクター。
  92. 【請求項９２】 リプレッサー遺伝子の産物が、抑制可能致死遺伝子の発現を抑制することがで
    きるリボザイム、アンチセンスＲＮＡ、またはセンス遺伝子を含んでなる、請求
    項６９〜７８のいずれか一項に記載のベクター。
  93. 【請求項９３】 新規な形質をコードする遺伝子をさらに含んでなる、請求項６９〜７８のいず
    れか一項に記載のベクター。
  94. 【請求項９４】 新規な形質が、変更された表現型、天然の植物細胞には見られないタンパク質
    、または天然の植物細胞に見られずかつ検出可能な表現型を付与しないタンパク
    質を含んでなる、請求項９３に記載のベクター。
  95. 【請求項９５】 新規な形質をコードする遺伝子が抑制可能致死遺伝子に結合されている、請求
    項９３または９４に記載のベクター。
  96. 【請求項９６】 新規な形質をコードする遺伝子が種子特異的プロモーターによって制御されて
    いる、請求項９３〜９５のいずれか一項に記載のベクター。
  97. 【請求項９７】 種子特異的プロモーターによって制御されている抑制可能致死遺伝子であって
    、その遺伝子産物の活性が植物細胞にとって致死的であるものを含んでなる、雑
    種交雑のための親植物の生成に用いる植物形質転換ベクター。
  98. 【請求項９８】 リプレッサー遺伝子を含んでなる、雑種交雑のための親植物の生成に用いる植
    物形質転換ベクター。
  99. 【請求項９９】 プラスミドpG1、pG14、pPHAStet1またはpGG-14。
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