ITMI20071291A1 - Sistema di contenimento transgenico attraverso l'inibizione recuperabile della germinazione in semi transgenici. - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

CAMPO TECNICO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione è relativa in generale ad un sistema di contenimento transgenico attraverso l’inibizione recuperabile della germinazione in semi transgenici. In particolare, l’invenzione si riferisce ad un costrutto genico che può essere inserito nel genoma di una pianta da coltivazione e che è in grado di bloccare in modo reversibile e controllabile una determinata funzione fondamentale per lo sviluppo di una nuova generazione.

TECNICA DI BASE DELL’INVENZIONE

La diffusione di transgeni da coltivazioni geneticamente modificate a coltivazioni organiche o a generazioni selvatiche rimane una questione di grande interesse pubblico e scientifico. Infatti, piante transgeniche ingegnerizzate per la produzione di prodotti farmaceutici, biocarburanti, prodotti chimici specifici stanno suscitando sempre un maggiore interesse dal punto di vista commerciale.

Ne deriva che sono necessari metodi per mantenere tali geni ed i loro prodotti sotto stretto controllo per evitare contaminazioni per esempio con la catena alimentare.

La coesistenza di coltivazioni transgeniche e non-transgeniche è stata fino ad ora possibile solo sviluppando strategie di contenimento transgenico. Inoltre, per quelle coltivazioni in cui la regolazione dei semi è richiesta dal mercato, il blocco irreversibile delle strategie di out-crossing non può essere utilizzato. Per tali coltivazioni, però, la dispersione di semi da piante geneticamente modificate durante il raccolto, il trasporto e la piantumazione crea una popolazione mista.

La germinazione di semi spontanei crea la possibilità di trasferimento a coltivazioni sessualmente compatibili in generazioni successive e la produzione di ibridi fertili.

La progettazione di un sistema di contenimento transgenico per mezzo di inibizione recuperabile della germinazione di semi transgenici bloccherebbe la germinazione spontanea di semi consentendo una sicura coesistenza tra coltivazioni geneticamente modificate e non geneticamente modificate.

Per risolvere il suddetto problema sono stati proposti sostanzialmente due sistemi differenti di sterilità recuperabile del seme.

Un primo sistema denominato “terminatore” ( terminator ) (US 5,723,765) si basa sul meccanismo seed-suicide. Questo sistema impiega uno stimolo esogeno (tetraciclina) per controllare l’attivazione della ricombinasi sito-specifica che a sua volta consentirà l’espressione della proteina citotossica inibitrice ribosomiale (RIP) specificatamente nel seme. Semi di piante transgeniche non trattate con tetraciclina sono in grado di germinare in condizioni naturali mentre i semi trattati muoiono durante la tarda embriogenesi.

In alternativa, è stato proposto l’impiego di un metodo per la regolazione dell’espressione transgenica attraverso “cassette recettrici di DNA” ( receptor DNA cassettes ) e ligandi chimici di attivazione dei costrutti. Per esempio, blocchi non recuperabili (arresti) dello sviluppo embrionale sono stati ottenuti in Brassica napus tramite l'espressione dell'esotossina A di Pseudomonas aeruginosa sotto controllo del promotore napin.

Un altro sistema impiegato per prevenire la germinazione spontanea dei semi è rappresentato da Recoverable Block of Function (RBF) (US 6,849,776). Questa strategia sfrutta la presenza di una sequenza di blocco legata al gene di interesse e ad una sequenza di recupero, il tutto in un unico costrutto trasformabile. Kuvshinov et al. (2001 ) descrive un esempio di RBF basato sul costrutto di blocco BARNASE e sul costrutto di recupero BARSTAR nel tabacco. Quando i semi trasformati vengono dispersi l’attività del costrutto BARNASE provoca la degradazione dell’RNA in seguito alla germinazione. Nel costrutto recuperabile, l’attività di recupero BARSTAR è sotto il controllo di un promotore heat shock cosicché la fertilità può essere recuperata attraverso shock termici od osmotici.

Il grave problema che si riscontra con l’impiego del sistema terminatore risiede nel fatto che tale tecnica non previene in modo realmente efficace la fuga genica. Infatti, lo sviluppo dei semi viene inibito nella seconda generazione. Senza il meccanismo di soppressione, il gene killer viene attivato durante le fasi tardive dello sviluppo embrionale della progenie ed i semi della generazione successiva non germinano. Se le piante transgeniche che portano il costrutto delia tetraciclina si diffondono neN<’>ambiente, sono in grado di germinare, crescere fino alla maturità, fiorire e riprodursi sessualmente. Ne deriva che viene completamente perso il controllo per il quale il sistema stessa era stato ideato.

Un ulteriore problema legato a tutti i tipi di sistemi non recuperabili è quello di non poter impiegare nuovamente i semi una volta che il sistema viene attivato.

Per questa ragione, il sistema terminatore non ha incontrato apprezzamento nel settore. Inoltre, in questo modo, le aziende produttrici dei semi così modificati hanno il completo controllo della produzione di semi transgenici.

Il suddetto sistema RBF risolve il problema della non ricuperabilità poiché la funziona bloccata non viene recuperata in condizioni naturali, ma è in grado di essere recuperata solo quando viene applicato un trattamento o un intervento esterno controllabile. Ciononostante, dati sperimentali mostrano che tale sistema lavora bene in tabacco ma non lavora così efficientemente bene in altre specie. Inoltre, la strategia BARNASE-BARSTAR è altamente dipendente da un’attività strettamente controllata dei promotori dei costrutti, in quanto un livello anche minimo di trascrizione può portare all’espressone precoce del gene BARNASE ed a morte cellulare. Ne deriva che il successo di questo approccio dipende da quanto bene vengono regolati i costrutti di blocco e di recupero e se essi mostrano un’espressione bilanciata poiché un’espressione da moderata ad alta è necessaria affinché l’attività BARANSE venga inibita dal costrutto di recupero. Un’espressione basale, invece, dell'attività BARNASE, anche se a livelli molto bassi, può essere sufficiente a causare morte cellulare. Questo è un problema fondamentale specialmente per quelle specie che possono essere trasformate solo passando attraverso colture in vitro. In questo caso, durante lo sviluppo del callo parte del promotore tessuto-specifico può essere attivato portando all'espressione del costrutto di blocco.

RIASSUNTO DELL’INVENZIONE

Il problema tecnico alla base della presente invenzione è quello di fornire un sistema di contenimento transgenico che funzioni attraverso l’inibizione recuperabile della germinazione di semi transgenici in modo sicuro senza il pericolo di disseminazioni di transgeni in coltivazioni non di interesse e senza la creazione di ibridi fertili incontrollabili. Un ulteriore problema è quello dì fornire un sistema che funzioni in modo realmente efficace.

Tali problemi sono risolti dall'impiego di un costrutto genico inseribile nei genoma di una pianta in modo stabile tale per cui se l’embrione che porta tale costrutto non subisce specifici stimoli ambientali, i semi che ne derivano non portano a termine la loro maturazione. Al contrario, solo se tale embrione viene stimolato con opportuni e selezionati stimoli ambientali, il seme germoglia dando origine ad una nuova progenie.

Un primo oggetto dell'invenzione è quindi quello di mettere a disposizione un costrutto genico comprendente un elemento genico di blocco ed un elemento genico di recupero operativamente associati.

Un secondo oggetto è quello di fornire un metodo per il contenimento transgenico in piante transgeniche sessualmente riproducibili.

Ulteriori caratteristiche, oggetti ed i vantaggi della presente invenzione diverranno più evidenti dalla seguente descrizione dettagliata di una realizzazione fornita a puro titolo di esempio non limitativo con riferimento alle figure in cui:

la figura 1 rappresenta la sequenza nucleotidica dei gene AGL23 di Arabidopsis thaiiana\

la figura 2 rappresenta la sequenza nucleotidica del promotore Pheres promoter (pPHERES);

la figura 3 rappresenta la sequenza nucleotidica del promotore LEC2 (pLEC2);

la figura 4 rappresenta la sequenza nucleotidica del precursore del micro RNA artificiale amiR-BnAGL23;

la figura 5 rappresenta la sequenza del gene BnAGL23;

la figura 6 rappresenta la sequenza del gene mutato BnAGL23; la figura 7 rappresenta la sequenza del costrutto Pheres promoter:: amiR-BnAGL23;

la figura 8 rappresenta la sequenza del costrutto LEC2::amiR-8nAGL23;

la figura 9 rappresenta le sequenze nucleotidiche degli oligonucleotidi Atp1552, Atp1553, Atp1554, Atp983, Atp984, Atp 3556, Atp1557, Atp1558, Atp1559, Atp1575, Atp1576;

la figura 10 rappresenta il vettore pBGW.O;

la figura 11 rappresenta il plasmide NOB1 ;

la figura 12 rappresenta il plasmide NOB2;

la figura 13 rappresenta le sequenze nucleotidiche degli oligonucleotidi Ve49 e Ve50;

la figura 14 rappresenta il plasmide NOB4;

la figura 15 rappresenta il costrutto pPHERES::GUS;

la figura 16 rappresenta il costrutto pLEC2::GUS;

la figura 17 rappresenta la sequenza GUS;

la figura 18 rappresenta il plasmide NOB7;

la figura 19 rappresenta il plasmide NOB8;

la figura 20 rappresenta il plasmide NOB9;

la figura 21 rappresenta le sequenze nucleotidiche degli oligonucleotidi Bnp1, Bnp2, Bnp3, Bnp4;

la figura 22 rappresenta il plasmide NOB10;

la figura 23 rappresenta la ricombinazione tra il plasmide NOB419 ed il plasmide NOB10 a dare il plasmide NOB11;

la figura 24 rappresenta il plasmide NOB5;

la figura 25 rappresenta la trasformazione del plasmide NOB11 con l’elemento genico della figura 7 a dare il plasmide NOB12; la figura 26 rappresenta il plasmide NOB13;

la figura 27 rappresenta il plasmide NOB6;

la figura 28 rappresenta il plasmide NOB14;

la figura 29 rappresenta il plasmide N0B16.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZÌONE

L’idea alla base dell’invenzione è quella di escogitare un sistema per il contenimento transgenico del tipo a blocco recuperabile della funzione sfruttando una funzionalità di alcuni geni che non comporta i suddetti problemi legati ai sistemi noti.

Sono stati svolti studi su un gruppo di fattori dì trascrizione delle piante chiamato MADS-box ed identificato in numerose specie evolutivamente anche molto distanti. Questi fattori di trascrizione sono responsabili del controllo di un’ampia gamma di procedimenti di sviluppo, inclusi il tempo di fioritura, la transizione dallo stadio vegetativo a quello riproduttivo nonché l’identità dei meristemi floreali, degli organi fiorali e degli ovuli. La scelta è caduta sui fattori di trascrizione di tipo MADS-box proprio alla luce del loro noto ruolo nel controllo di numerosi processi di sviluppo.

I geni MADS-box di Arabidopsis thaliana comprendono 107 membri identificati, tra i quali solo per circa una ventina è nota la funzione.

In particolare, sono stati studiati alcuni geni di piante al fine di trovare nuove funzioni correlate con la maturazione del seme. Tali geni sono stati sottoposti a mutazioni tali da consentire un blocco permanente della loro funzione. In base alle conoscenze acquisite, è stato ideato e generato un costrutto di espressione genica in cui vari elementi genici sono tra loro associati in modo da bloccare reversibilmente la maturazione dei semi di una pianta da coltivazione.

In seguito a numerose sperimentazioni, è stato quindi trovato che il gene AfAGL23 di Arabidopsis thaliana (At1G65360), avente la sequenza SEQ. I.D. N.1 illustrata in figura 1, entra in gioco nella regolazione della mega-gametogenesi e nello sviluppo embrionale.

In particolare, è stato trovato che il gene AGL23 svolge un ruolo chiave nella regolazione della biogenesi dei cloroplasti durante lo sviluppo embrionale: infatti la distruzione del gene AÌAGL23 provoca la formazione di un seme contenente un embrione albino. Gli embrioni omozigoti per ag(23 non riescono a portare a compimento la biogenesi dei cloroplasti e muoiono.

Sulla base di queste osservazioni, è stato pensato di progettare un costrutto comprendente un elemento genico di blocco dotato dì una sequenza genica in grado di inattivare il gene AGL23, ed un elemento di recupero operativamente associato a detto elemento di blocco dotato di una sequenza di AGL23 insensibile a detta sequenza genica di inattivazione. La versione della sequenza di AGL23 insensibile alla sequenza genica di inattivazione è sotto il controllo di una sequenza promotrice regolabile da fattori esterni.

Il primo oggetto della presente invenzione è quindi un costrutto genico per l’inibizione reversibile della germinazione di semi transgenici, comprendente:

un elemento genico di blocco dello sviluppo embrionale comprendente un promotore embrionale vegetale operativamente associato ad una sequenza nucleotidica in grado di inattivare un gene coinvolto in detto sviluppo embrionale;

un elemento genico di recupero dello sviluppo embrionale comprendente un promotore inducibile operativamente associato ad una sequenza di detto gene coinvolto nello sviluppo embrionale mutata in modo da risultare insensibile alla suddetta sequenza in grado di inattivare un gene coinvolto nello sviluppo embrionale ma attiva nella funzione dello sviluppo embrionale.

Il costrutto dell’invenzione può inoltre comprendere uno o più geni o sequenze nucleoniche transgeniche di interesse. Tali geni o sequenze possono essere rappresentate da elementi genici che codificano per un prodotto genico avente una funzione desiderata quale una proteina, un enzima incluso metaboliti, ormoni, antibiotici, tossine. Inoltre, questi elementi genici sono operativamente associati al costrutto in modo da essere contenuti entro le sue estremità chiuse destra e sinistra. In particolare, essi saranno posizionati in prossimità dell<’>elemento genico di blocco.

L’elemento genico di blocco dello sviluppo embrionale è rappresentato da una o più sequenze nucleotidiche operativamente associate in modo tale che la loro espressione possa causare la morte o quantomeno l'alterazione del fenotipo o della fisiologia deli'organismo ospite naturale.

Questo costrutto permette quindi il contenimento dei semi eventualmente dispersi neH’ambiente circostante, durante il raccolto e/o il trasporto, in quanto tali semi sono incapaci di originare piante adulte vitali.

Anche i semi prodotti in seguito ad incroci casuali tra piante ingegnerizzate e varietà selvatiche (o non ingegnerizzate) sarebbero incapaci di germinare e, di conseguenza, anche la dispersione ad opera del polline prodotto da individui transgenici verrebbe controllata.

Questo risultato è stato ottenuto, come verrà descritto in dettaglio in seguito, consentendo l’attivazione dell'elemento genico di blocco in condizioni normali, naturali cioè senza intervento esterno. Ne deriva che il blocco dello sviluppo embrionale avviene in modo automatico, programmato durante una delle fasi delio sviluppo embrionale senza interferire con la maturazione dei gameti maschili o femminili.

L<’>elemento genico di blocco dello sviluppo embrionale comprende un promotore embrionale vegetale, quale ad esempio il promotore di PHERES, di LEC2 o della napine (Josefsson, 1987).

Preferibilmente, il promotore è pPHERES o pLEC2, le cui sequenze nucleotidiche SEQ I.D. N,2 e SEQ I.D. N.3 sono rappresentate rispettivamente nelle figure 2 e 3.

Il promotore è stato scelto proprio in base alla sua capacità di attivarsi solo durante lo stadio embrionale dello sviluppo di una pianta senza, quindi, interferire con la maturazione dei gameti maschili o femminili.

Detto promotore è poi operativamente associato ad una sequenza nucleotidica in grado di inattivare un gene coinvolto nello sviluppo embrionale di una pianta. Tale sequenza può essere una sequenza qualsiasi progettata in modo da esprimere a sua volta una sequenza nucleotidica in grado di legarsi ad un sito attivo di un gene coinvolto nello sviluppo embrionale per inattivarlo, bloccando così il normale sviluppo dell’embrione di una pianta. In alternativa, tale sequenza può essere in grado di inattivare la traduzione di un mRNA o può codificare per una proteina in grado di bloccare o inibire una funzione critica per il normale sviluppo dell’embrione di una pianta.

In particolare, detta sequenza è una sequenza che ibridizza con una sequenza bersaglio da inattivare ed è in grado di provocare una rottura al suo interno. Sequenze di questo tipo sono progettagli impiegando tecnologie quali PCR. Preferibilmente, la sequenza in grado di inattivare dette sequenze o geni bersaglio è una sequenza che codifica per l'espressione di un micro RNA artificiale (amiRNA) o un piccolo RNA di interferenza (siRNA).

Tra le sequenze bersaglio, come descritto in precedenza, le sequenze MADS-box delle piante sono quelle preferite per la presente invenzione. Sono state selezionate per lo studio mutazioni delle sequenze MADS-box della pianta Arabidopsis thaliana, come riportato in precedenza, ed è stato sorprendentemente trovato che tra numerose mutazioni di dette MADS-box, una mutazione del gene AGL23 è responsabile delio sviluppo embrionale. In particolare, è stato osservato che la distruzione del gene AtAGL23 con la mutazione agl23-1 causata dall'inserimento di un elemento T-DNA (linea Salk_147048, ecotipo Col-0 (Alonso et al., 2003)) causa la formazione di un embrione albino incapace di germogliare e sviluppare una pianta adulta. Di conseguenza, il gene non mutato AGL23 è responsabile della biogenesi dei cloroplasti.

Pertanto, la sequenza in grado di inattivare il gene bersaglio è preferibilmente una sequenza amiRNA SEQ I.D. N. 4 (figura 4), progettata in modo da ibridizzare con il gene AGL23 di Arabidopsis thaliana ed inattivarlo tramite scissione.

E’ da notare che altre varianti della sequenza SEQ I.D. N. 4 possono essere impiegate. Tali varianti possono essere rappresentate da sequenze aventi una identità di almeno il 70%, preferibilmente almeno l’80%, con detta sequenza SEQ I.D. N. 4. Esempi di tali varianti sono:

5’-TT AAT G G AG ACTT ACT CG G CC-3’ , e

5 ’-T G AACACGT AT CAT ACAG CTT -3 ’ .

Il costrutto dell’invenzione comprende inoltre un elemento genico di recupero dello sviluppo embrionale in grado di ripristinare la funzione bloccata, cioè riattivare il normale sviluppo embrionale, in seguito ad un preciso stimolo esterno.

A tal fine, questo elemento è dotato di un sistema inducibile in grado di reagire a detto stimolo esterno attivando la trascrizione della sequenza nucleotidica ad esso operativamente associata. Sistemi inducibili sono noti da tempo in letteratura (Wang et al., 2003) ed in generale ognuno di questi sistemi può essere impiegato nella presente invenzione.

Preferibilmente, il sistema inducibile è scelto fra il sistema mediato da glucocorticoìdi (positivamente regolato con il desameiasone), il sistema indotto da shock termico (già impiegati con successo nella specie modello Arabidopsis thaliana (Sablowski e Meyerowitz, 1998)) ed il sistema inducibile con etanolo. E’ preferibile l’uso del sistema inducibile con etanolo, che comprende un promotore inducibile pALCA il quale viene attivato dalla proteina ALCR, presente nella cellula ma in forma inattivata, che a sua volta viene attivata dallo stimolo esterno rappresentato dali'etanolo. Il sistema appena descritto è noto in letteratura (Roslan et al., 2001; Laufs et al., 2003).

L<’>elemento genico di recupero può comprendere un promotore costitutivo operativamente associato a un gene che sintetizza per una proteina che, quando attivata dallo stimolo esterno, è in grado di legarsi al promotore inducibile ed attivare a sua volta la sua trascrizione.

In particolare, il promotore costitutivo può essere scelto tra i promotori costitutivi noti in letteratura, quali ad esempio 35S-CaMV, promotore dell<’>ubiquìtìna, promotore dell’actina e della tubulina. Preferibilmente, il promotore costitutivo è 35S-CaMV, che regola la produzione della proteina ALCR, che risponde all’azione dell’etanolo. Il trattamento con etanolo induce una modificazione conformazionale in ALCR e questa diventa capace di legarsi al promotore pALCA. pALCA regola la trascrizione della sequenza dei gene coinvolto nello sviluppo embrionale mutata in modo tale da essere insensibile all’azione della sequenza che inattiva i geni che regolano lo sviluppo dell'embrione. Tuttavia la versione mutata è una versione attiva per quanto concerne la funzione di promozione dello sviluppo embrionale.

La sequenza dei geni coinvolti nello sviluppo embrionale mutata in modo da risultare insensibile alla suddetta sequenza in grado di inattivare i geni coinvolti nello sviluppo embrionale ma attiva nella sua funzione è associata a valle di detto promotore inducibile.

E<’>da notare che tale sequenza è stata progettata creando una mutazione, alterazione, eliminazione o altre modifiche a livello dei nucleotidi in modo tale che la sequenza dell’elemento genico di blocco non sia più in grado di legarsi ad essa, ibridizzare, e svolgere la funzione di in attivazione. In altre parole, la modifica apportata è tale da rendere non più riconoscibile la sequenza di recupero della funzione bloccata dalla sequenza di inattivazione.

Tale modifica verrà effettuata dal tecnico de! settore adottando procedure note quali quelle a disposizione nella tecnologia del DNA ricombinante, ad esempio per l’ottenimento di una mutazione puntiforme.

In ogni caso, la modifica deve essere progettata in modo da mantenere la funzionalità della sequenza originale proprio per recuperare la funzione naturale. Questo risultato può essere ottenuto tenendo presente la degenerazione del codice genetico per cui l’ultima base nucleotidìca di una tripletta che codifica per un aminoacido può essere sostituita senza alterare la corretta traduzione. La sua alterazione però è utile a provocare il non riconoscimento da parte della sequenza di blocco.

Un sistema particolarmente utile per rendere insensibile una sequenza ad una sequenza di blocco pur mantenendo la sua funzione naturale è quello che sfrutta la tecnologia amiRNA o siRNA accennata in precedenza e dettagliata in seguito.

Infatti, se la sequenza di recupero viene modificata anche tramite la sostituzione di un solo nucleotide, la sequenza di blocco non è più in grado di ibridizzare, cioè riconoscere il suo bersaglio.

Sfruttando questo concetto, è stata modificata preferibilmente la sequenza originale del gene AGL23 SEQ. I.D. N. 5 di Brassica napus ( BnAGL23 ) (figura 5) introducendo una mutazione in posizione 405 da A a G, come verrà descritto in dettaglio in seguito.

La sequenza dei geni coinvolti nello sviluppo embrionale mutata in modo da risultare insensibile alla sequenza di in attivazione di detti geni ma attiva nella sua funzione naturale è quindi preferibilmente rappresentata dalla sequenza mutata BnAGL23 SEQ. I.D. N. 6 (figura 6).

In accordo con un ulteriore oggetto della presente invenzione, il metodo per la preparazione di un costrutto genico per l’inibizione reversibile della germinazione di semi transgenici come descritto in precedenza, comprende le fasi di:

1) isolamento dal genoma di interesse della sequenza nucleotidica di un promotore embrionale vegetale;

2) amplificazione di detta sequenza;

3) digestione della sequenza con opportuni enzimi di restrizione per consentirne l'inserimento in un adatto plasmide di clonazione; 4) digestione di un adatto plasmide di clonazione con i medesimi enzimi di restrizione usati nella fase precedente per consentire l'integrazione di detta sequenza in detto plasmide;

5) integrazione di detto promotore embrionale in detto plasmide;

6) isolamento dal genoma di interesse di una sequenza bersaglio;

7) amplificazione di detta sequenza;

8) sintesi di una sequenza in grado di ibridizzare ed inattivare tale sequenza di bersaglio;

9) donazione di detta sequenza in grado di ibridizzare ed inattivare la sequenza bersaglio in opportuni plasmidi;

10) ricombinazione tra i prodotti della fase 5) e della fase 9) per ottenere un elemento genico di blocco dello sviluppo embrionale;

11) sintesi di una sequenza nucleotidica di un gene coinvolto nello sviluppo embrionale mutata in modo da risultare insensibile a detta sequenza di inattivazione;

12) ricombinazione del prodotto della fase 11 ) in un opportuno vettore;

13) isolamento dal genoma di interesse deila sequenza nucleotidica dì un promotore inducibile;

14) amplificazione di detta sequenza;

15) digestione della sequenza con opportuni enzimi di restrizione per consentirne l'inserimento in un adatto plasmide di clonazione;

16) digestione di un adatto plasmide di clonazione con i medesimi enzimi di restrizione usati nella fase precedente per consentire l’integrazione di detta sequenza in detto plasmide;

17) integrazione del prodotto della fase 15) nel plasmide della fase 16); 18) ligazione tra l’inserto del vettore ottenuto nella fase 12) e il plasmide linearizzato della fase 16) per ottenere un plasmide contenente l’elemento genico di recupero dello sviluppo embrionale;

19) ricombinazione tra i prodotti della fase 12) e della fase 18) per ottenere il costrutto genico per l’inibizione reversibile della germinazione di semi transgenici.

Ognuna delle fasi sopra descritte viene realizzata impiegando metodiche di biologia molecolare note nel settore ed adattabili dal tecnico in base alla tipologia specifica di sequenze, promotori ed altri elementi genici specifici.

Inoltre, ulteriori fasi possono essere previste per inserire ulteriori elementi genici e sequenze descritte in precedenza con riferimento al costrutto dell'invenzione, in modo sostanzialmente simile.

In accordo con un ulteriore oggetto della presente invenzione, il costrutto genico descritto in precedenza viene inserito in un opportuno ospite in grado, quando messo a contatto con l'organismo bersaglio di interesse o parti di questo come i suoi gameti, di infettare e quindi trasferire il costrutto.

Il metodo comprende quindi le fasi di:

a) mettere a disposizione un costrutto genico per l’inibizione reversibile della germinazione di semi transgenici come descritto in precedenza;

b) inserire detto costrutto in un organismo ospite in grado di trasformare un organismo bersaglio o parti di questo.

Il costrutto genico può essere clonato e trasferito in vettori di espressione eterologa, quali vettori binari, impiegando tecnologie note nel settore. Preferìbilmente, può essere impiegato il sistema Gateway (Invitrogen) riassunto in seguito. Tramite tale sistema, plasmidi di clonazione contenenti il costrutto di interesse vengono introdotti ad esempio per elettroporazione in un ospite tra quelli comunemente impiegati per trasferire transgeni in organismi vegetali.

In particolare, può essere usato quale ospite \'Agobacterium tumefactens per trasformare Brassica napus.

Qui di seguito verrà riportata una realizzazione specifica dell’invenzione data a puro titolo di esempio non limitativo.

PREPARAZIONE DEI COSTRUTTI

Il costrutto di blocco è necessario per la degradazione dell’RNA messaggero endogeno prodotto dal gene BnAGL23. E’ costituito da un promotore embrionespecifico che guida la trascrizione del micro-RNA artificiale specifico diretto contro BnAGL23 mRNA (il micro RNA artificiale verrà da qui in poi indicato come amiR-BnAGL23). Gli ami-RNAs sono piccole sequenze lunghe 21 nucleotidi complementari all’RNA messaggero endogeno che si desidera degradare, pertanto amiR-BnAGL23 causa la degradazione specifica del BnAGL23 mRNA, Le basi in posizione 10-11 sono strategiche per il riconoscimento e l’appaiamento al messaggero endogeno che si desidera silenziare, se un mis-match è introdotto in suddette posizioni la proprietà degradativa è irrimediabilmente persa (Schwab et al., 2006).

Si è proceduto alla generazione di due costrutti di blocco che differiscono per l'utilizzo in quanto sono stati utilizzati due promotori embrione-specifici attivi in due fasi diverse dello sviluppo embrionale. Il promotore che guida la trascrizione del gene PHERES (pPHERES) è attivo nelle fasi iniziali dello sviluppo embrionale, dalle fasi immediatamente successive alla fecondazione fino allo stadio di embrione globulare (Kholer et al., 2003). Il promotore del gene LEC2 (pLEC2) è invece attivo durante le fasi finali dello sviluppo embrionale, dallo stadio di embrione globulare fino allo stadio a torpedo (Kroj et al., 2003). Il costrutto di blocco con amiR-BnAGL23 regolato da pPHERES verrà indicato come PHERES::amiR-AGL23 (SEQ. I.D. N.7 rappresentata in figura 7), mentre il costrutto amìR-BnAGL23 regolato da pLEC2 verrà denominato LEC2::amiR-AGL23 (SEG. I.D. N.8 rappresentata in figura 8).

Amplificazione dei promotori

I promotori pPHERES e pLEC2 sono stati amplificati dal DNA genomico estratto da Arabidopsis thaliana. pPHERES è stato amplificato coi primers Atp1552 e Atp1553 (figura 9), mentre pLEC2 è stato amplificato con Atp1554 e Atp1555 (figura 9). Atp1552 e Atp1554 contengono un sito di restrizione Xbal, invece Atp 1553 e Atp 1555 posseggono un sito riconosciuto da Aatli. L’introduzione dei suddetti siti di restrizione si è resa necessaria per il clonaggio dei due promotori nel plasmide pBGW. La reazione di PCR è stata eseguita utilizzando la Taq phuston (Finnzymes), taq polimerasi con alta fedeltà e alta processività, infatti il tasso di errore di questa polimerasi è stato determinato in 4.4 x 10<'7>e grazie anche alla sua attività esonucleasica è in grado di correggere eventuali mis-match inseriti. Per l'amplificazione sono stati utilizzati 10 ng di DNA genomico di Arabidopsis thaliana. Come specificamente richiesto per questo enzima la denaturazione viene eseguita a 98°C. La Taq phusion (Finnzymes) ha una processività di 4 kilo-basi/minuto. Sono stati eseguiti 35 cicli di amplificazione. I prodotti di PCR, dopo essere stati controllati su gei di agarosio 1%, sono stati purificati con l'impiego del “QlAquick PCR purification kit (Qiagen)” seguendo le istruzioni allegate. I prodotti di PCR sono stati poi digeriti con Xbal-Aatll (Roche), la doppia digestione è stata condotta in buffer A (33mM Tris-acetato. 66mM K-acetato, 10 mM Mg-acetato 0,5 mM ditiotreitolo, pH 7.9) seguendo le istruzioni fornite dalla Roche. La reazione è stata incubata a 37°C per 2 ore. Anche il plasmide pBGW è stato digerito con Xbal-Aatll (Roche). pBGW è un vettore gateway (Karimi et al., 2002) con un polilinker situato a monte della cassetta gateway (figura 10).

Successivamente, il plasmide digerito con Xbal-Aatll e i due frammenti di PCR (pPHERES e pLEC2) digeriti con Xbal-Aatll sono stati purificati da gel impiegando il QlAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Per ognuna delle reazioni dì ligazione sono stati usati 10 ng di pBGW, digerito con Xbal-Aatll e poi purificato, e 20 ng circa dei due inserti (pPHERES e pLEC2) anch’essi digeriti e purificati. Per la reazione sono stati usati la T4 ligasi prodotta da Promega, incubando a 16°C per 12 ore.

I vettori così ottenuti sono stati denominati NOB1 (pPHERES::pBGW) {figura 11 ) e NOB2 (pLEC2::pBGW) (figura 12).

amiR-AGL23

II gene BnAGL23 {l’omologo di AtAGL23) in Brassica napus è stato amplificato utilizzando i primers Atp983 eAtp984 (figura 9). Il prodotto di PCR per essere comodamente sequenziato è stato clonato nel vettore pGEM®-T Easy. Il vettore pGEM®-T Easy è stato preparato dalla ditta fornitrice Promega tagliando il vettore pGEM®-5Zf con EcoR V e aggiungendo una timidina terminale alle due estremità 3’. Questo vettore permette un facile clonaggio dei templati se la Taq impiegata per la produzione del frammento di interesse aggiunge delle “Adenine (A)” alle estremità dei frammenti. Dato che il gene BnAGI23 è stato amplificato con l'enzima Taq phusion (Finnzymes), incapace di aggiungere le A alle estremità del nostro amplificato, queste sono state aggiunte in una fase successiva mediante incubazione a 72°C per 20’ con la Taq polimerasi fornita dalla Roche. Il prodotto di PCR è stato poi purificato con il “QlAquick PCR purifìcation kit" e poi ligato in pGEM®-T Easy seguendo le indicazioni fornite da Promega. In particolare la reazione è stata eseguita in un volume finale di 20 pi e incubata per 2 ore a temperatura ambiente.

Le analisi di comparazione tra le sequenze AtAGL23 e BnAGL23 hanno rilevato una fortissima conservazione dei due geni nelle due specie di interesse.

amiR-BnAGL23 è stato generato seguendo l’algoritmo e il protocollo che si trova al seguente sito: http://wmd.weigelworld.org (Schwab et al,, 2006). Secondo tale programma, il miglior micro artificiale diretto contro BnAGL23 è il seguente: 5’-GGTGGAGTAAGTCTCCATTAG-3'. Questa sequenza viene utilizzata per silenziare specificamente BnAGL23. Essa viene inserita tramite la metodologia qui sotto descritta all<’>interno di un gene, che quindi produce il precursore dì amiR-6nAGL23.

In breve, il precursore de!i'amiR-BnAGL23 viene generato con 4 cicli di amplificazioni successivi e sovrapposti di PCR. La prima reazione prevede l'impiego di primers Ve50 (figura 13) con Atp 1559 (figura 9) (l'amplificato viene designato Tei); il templato di partenza è il vettore pRS300. Nella seconda reazione il templato è sempre il plasmide pRS300, ma esso viene amplificato con Atp 1557 e Atp 1558 (figura 9) (il prodotto è denominato Te2). Infine, nella terza amplificazione, pBRS300 è amplificato con Ve 50 e Atp 1556 (il prodotto è denominato Te3). 0.5 pi dei prodotti di PCR Te1-Te2-Te3 vengono mescolati e ulteriormente amplificati usando Ve 49 e Ve 50 (il templato finale è detto Te4). Per le reazioni di PCR qui descritte abbiamo impiegato Taq phusion (Finnzymes). Tutti i prodotti di PCR (Te1,Te2, Te3 e Te4) sono stati separati su gel di agarosio 2%, ed estratti con il QlAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).

Te4 è stato poi clonato in pENTR™/SD/D-TOPO (Invitrogen) generando il Nob4 rappresentato in figura 14. Infatti, Ve 49 possiede l’estensione (CACC) necessaria affinché Te4 entri nel pTOPO. La reazione è stata allestita in un volume finale di 10 pi contenenti 10 ng del prodotto di PCR purificato. La miscela di reazione è stata quindi incubata a 22°C per 30 minuti e 2 pi sono stati utilizzati per la successiva elettroporazione delie cellule di E. coli.

I costrutti finali pPHERES:: amiR-BnAGL23 e pLEC2:: amiR-BnAGL23, sono stati prodotti mediante ricombinazione Gateway di tipo LR tra NOB4 e i vettori precedentemente descritti NOB1 (pPHERES::pBBGW) e NOB2 (pLEC2::BBGW).

Il sistema Gateway (Invitrogen) è un sistema di clonaggio che si basa sulla ricombinazione sito-specifica del batteriofago A in Escherichia coli. Quando il batteriofago λ infetta cellule batteriche di E. coli può intraprendere il ciclo litico o lisogenico. Nel ciclo lisogenico, di converso, il batteriofago si integra nel genoma di E. coli grazie ad un processo di ricombinazione sito-specifica e viene trasmesso alle cellule figlie di generazione in generazione, fino quando non si verificano condizioni adatte alla sua escissione dal genoma. A questo punto il batteriofago inizia lo stadio litico del suo ciclo vitale. I processi tramite i quali il batteriofago si integra e si escìnde dal genoma di E. coli sono mediati da proteine prodotte sia dal batteriofago sia dalla cellula ospite. Queste reazioni di ricombinazione sito-specifica, allestite in vitro, sono alla base della tecnologia Gateway e possono essere riassunte nel seguente modo:

attB X attP attL X attR (X indica il processo di ricombinazione) INTEGRAZIONE ESCISSIONE

f quattro siti att sono siti di ricombinazione del batteriofago λ e contengono i siti di riconoscimento per le proteine coinvolte nei processi di integrazione ed escissione. In particolare la reazione attB X attP media il processo di integrazione, mentre la reazione attL X attR media il processo di escissione dal genoma. Tramite combinazione delle reazioni descritte, è possibile clonare e trasferire geni in diversi vettori di espressione eterologa (nel vettore binario per trasformare Brassica), mantenendo inalterato l'orientamento e il quadro di lettura. Questo rende la tecnologia Gateway altamente versatile ed ad alta processività.

Per mettere amiR-BnAGL23 sotto il controllo di pPHERES e di pLEC2 è stata allestita una reazione di ricombinazione LR in un volume finale di 10 μΙ. La reazione è stata incubata a 25°C per circa 3 ore. Successivamente, 1 pi è stato utilizzato per sottoporre E. coli ad elettroporazione. I plasmidi finali sono stati controllati, estratti da E. coli e introdotti mediante elettroporazione in Agrobacterìum tumefaciens, il microrganismo che verrà poi utilizzato per trasformare Brassica napus al fine di controllare la bontà del costrutto. Tuttavia la generazione di questi plasmidi è anche necessaria per l<'>ottenimento del costrutto finale di interesse, infatti lo scopo è quello di inserire l'elemento genico di blocco e l’elemento genico di recupero all<’>interno dello stesso T-DNA affinché siano trasferiti nel genoma di B. napus in unico locus genetico.

Per la procedura di elettroporazione sìa di agrobatteri che di E. coli è stato usato Γ Elettroporatore 2510 (Eppendorf) applicando un differenza di potenziale di 1500 V.

Attività del promotore e controllo specifico ìissutale

Poiché pPHERES e pLEC2 sono sequenze regolative di Arabidopsis thaliana , è necessario controllare che questi due promotori siano in grado di guidare la trascrizione dei geni da loro regolati anche negli embrioni di Brassica napus. A tal fine sono stati clonati pPHERES e pLEC2 a monte del gene reporter GUS. Sono stati quindi generati due costrutti, pPHERES::GUS (SEQ. I.D. N. 9) e pLEC2::GUS (SEQ, I.D. N. 10) (figure 15 e 16), proprio per verificare che il prodotto del gene GUS SEQ. I.D. 11 (figura 17) sia rintracciabile negli embrioni in via di sviluppo di Brassica.

La sequenza codificante il gene GUS è stata amplificata con Atp 1575 e Atp 1576 (figura 9) e come polimerasi è stata usata la Taq phusion (Finnzymes) per la sua alta fedeltà (vedi sopra). Il prodotto di amplificazione ottenuto è stato purificato con il “QIAquick PCR purification kit (Qiagen)”. Il prodotto di PCR è stato poi clonato in pENTR™/SD/D-TOPO (vedi sopra); l’estensione CACC necessaria per la reazione è portata dal primer Atp 1575, il vettore così generato è stato chiamato NOB7 (figura 18). NOB7 è stato poi ricombinato mediate una reazione di ricombinazione gateway LR (vedi sopra) sia con NOB1 che con NOB2, generando rispettivamente pPHERES::GUS (NOB8 rappresentato in figura 19) e pLEC2::GUS (NOB9, rappresentato in figura 20).

Questi costrutti sono stati poi sottoposti ad elettroporazione con Agrobacterium generando due ceppi indipendenti utilizzati per infettare e quindi trasferire nel genoma di B. napus tali costrutti. Piante positive alla selezione sono state sottoposte al saggio GUS seguendo le istruzioni riportate da Vielle-Calzada et al. (2000). Pertanto semi in via sviluppo di diverse linee indipendenti sono stati immersi per due ore in una soluzione 100% di acetone e lasciati a -20°C. Al termine di queste due ore i semi transgenici di B. napus sono stati trasferiti nella soluzione GUS e incubati in tal buffer a 37°C. Foto di ovuli ed embrioni colorati sono state acquisite con un microscopio Zeiss Axiophot D1 microscope (Jena, Germania) equipaggiato con contrasto di fase { differential interface contrast, DIC). Le immagini sono state catturate con una macchina digitale MRc5 camera (Zeiss) gestita dal programma Axiovision (versione 4.1).

Elemento genico di recupero

L'elemento genico di recupero contiene un promotore inducibile da etanolo che guida l’espressione di una versione di BnAGL23 insensibile all’azione di amiR-BnAGL23 in quanto mediate mutagenesi sito specifica è stata introdotta una mutazione puntiforme nella basi 10-11 riconosciute da amiR-BnAGL23 e fondamentali per il silenziamento del gene. Quando indotto, questo costrutto permette di recuperare i danni apportati al seme dall’azione di amiR-BnAGL23 e piante vitali vengono quindi prodotte solo se desiderate ed in seguito al trattamento con l’alcool del costrutto di recupero.

La versione mutata di BnAGL23 è stata ottenuta introducendo una mutazione puntiforme mediante PCR, utilizzando una coppia di primers (che introducono la mutazione) tra loro complementari, ognuno specifico per un filamento (senso e antisenso). Nel nostro caso sono stati utilizzati i primers Bnp2 e Bnp3 (figura 21) che mutano la posizione 405 della sequenza di BnAGL23 da A a G. Bnp2 viene usato in combinazione con Bnp1 (figura 21) per generare un primo emi-frammento di BnAGL23 (Prodottol, Pr1), mentre in una seconda reazione di PCR Bnp3 e Bnp4 (figura 21) generano il secondo emi-frammento di BnAGL23 (Pr2). I due Pr1 ePr2 vengono corsi su gel di agarosio 1% e purificati. Successivamente 1 pi di Pr1 e PR2 vengono usati come stampi in una reazione di PCR con Bnp1 e Bnp4 come primers, generando un unico frammento di BnAGL23 contenente però la mutazione desiderata. I due Pr1 e PR2 possono annilarsi grazie al fatto che Bnp3 e Bnp2 sono complementari. Per i tre cicli di PCR è stato utilizzato l'enzima Taq phusion (Finnzymes),

I primers Bnp1 e Bnp4 possiedono le estensioni gateway pertanto possono essere clonati in pDNR mediante una reazione di ricombinazione BP. Nel presente caso, quale pDNR è stato usato il NOB10 (figura 22), anche noto come pDONR201 (Invitrogen). La reazione BP è stata eseguita in 10 pi incubando a 22°C per almeno 12 ore. Il costrutto pDNR contenente la versione mutata di BnAGL23 è stato denominato NOB10.

II sistema inducibile

Diversi sistemi inducibili sono riportati ed estensivamente descritti in letteratura (Wang et al., 2003), ad esempio il sistema inducibile da glucocorticoidi (Sablowski e Meyerowitz, 1998) o da shock termici (Huang et al., 2005). Per verificare il presente sistema di contenimento genico è stato deciso di impiegare il sistema indotto da etanolo, già estensivamente descritto in letteratura (Roslan et al., 2001; Laufs et al., 2003).

Il sistema indotto da etanolo è composto dal una proteina ALCR che è costitutivamente espressa poiché trascrizionalmente regolata da promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore {CaMV35S=35S). ALCR può legarsi al promotore pALCA, tuttavia tale legame è possibile solo in presenza di etanolo. Pertanto, qualsiasi gene sia clonato a valle di pALCA verrà trascritto, e quindi tradotto se la pianta verrà sottoposta ad un trattamento con etanolo

Il sistema di recupero contiene 35S::ALCR, mentre pALCA regola la trascrizione e quindi la traduzione della versione mutata di BnAGL23 {35::ALCR; pALCA::BnAGL23mutata). Nel laboratorio del Dipartimento di Scienze Biomolecolare e Biotecnologiche gli inventori avevano già a disposizione alcuni vettori per il sistema inducibile con etanolo, pertanto era già a disposizione il NOB419 con 35S::ALCR e il NOB425 con pALC::cassetta gateway. NOB419 è stato gentilmente fornito da T. Laufs ed è descritto in Roslan et al. (2001). Per il NOB425, la cassetta gateway (frameA) (Life Technologies) è stata inserita in pL4 (Syngenta Ltd) sfruttando il sito Smal tra il promotore pALCA e il terminatore. Il promotore pALCA, la cassetta gateway e il terminatore sono stati excisi dal plasmide mediante digestione con Xbal e inseriti nel pBIN 19 (Clontech).

Lo scopo ultimo è portare il costrutto di blocco e di recupero sullo stesso T-DNA affinché vengano inseriti in linkage nelle piante transgeniche. Ciò è necessario per evitare la loro segregazione nelle generazioni successive.

Pertanto lo scopo ultimo era la costruzione di un vettore finale 35S::ALCR;pALCA::BnAGL23mut (mutato) ;PHERES::amiR-BnAGL23 e di un secondo vettore 35S::ALCR;pALCA::BnAGL23 mut;LEC2::amiR-BnAGL23.

La strategia per ottenere il costrutto finale

Il primo passaggio è stato l'esecuzione di una ricombinazione LR gateway (per la descrizione della procedura vedi sopra) tra il NOB10 e il NOB419 (figura 23). Il vettore finale è stato chiamato NOB11 (figura 23) e quindi è stato prodotto BnAGL23mutato (BnAGL23mut) sotto il controllo del promotore inducibile pALCA (NOB11: pALCA: :BnAGL23mut).

Successivamente è stato amplificato (con Taq phusion, Finnzymes) PHERES::amiR-BnAGL23 (il templato della reazione era il NOB5 rappresentato in figura 24) usando i primers Atp1552 e Ve50. Questi primers introducono un sito di restrizione XBAI, poi il prodotto di PCR è stato digerito con questo enzima di restrizione (Roche, la reazione è stata fatta usando i! buffer H, composizione dello stock 10X: 10 mM Tris-HCI, 0.1 M NaCI, 5 mM MgCI2, 1 mM mercaptoetanolo, pH 8), purificato (QlAquick PCR purifìcation kit) e infine legato con ia T4 DNA ligasi delia Promega nel vettore NOB11. Anche NOB11 era stato in precedenza digerito con Xbal e purificato. Il vettore così ottenuto è stato denominato NOB12 (figura 25).

Il NOB12 è stato a questo punto digerito con l'enzima di restrizione HINDIII della Roche (la digestione è stata eseguita a 37°C con il buffer B, composizione dello stock 10X: 0,5 M Tris-HCI, 1 M NaCI, 0.1 M MgCI2, 10 mM DTT, pH 7.5), digestione che permette di togliere un frammento che contiene pALCA::BnAGI23mut,PHERES::amiR-BnAGL23. La digestione è stata separata su gei di agarosio e il frammento corrispondente alla sequenza sopraccitata è stato estratto dal gel con l'impiego del QlAquick Gel Extraction Kit, Questo frammento è stato poi inserito nel NOB 425 (contenente il T-DNA con il 35S::ALCR) anch’esso digerito con Hindi II (Roche). La reazione di ligazione è stata incubata a 16°C per 12 ore. Questo è il primo costrutto finale che abbiamo chiamato NOB13 (figura 26).

Invece, per la costruzione del secondo costrutto finale (35S::ALCR;pALCA::BnAGL23 mut;LEC2::amìR-BnAGL23) si è operato nella seguente maniera.

Il frammento LEC2::amìR-BnAGL23 è stato amplificato usando come templato il NOB6 (figura 27) ed sono stati usati per al reazione di PCR i seguenti primers: Atp1554 e Ve50. Questi due primers introducono un sito di restrizione riconosciuto dalla endonucleasi Xbal, pertanto dopo aver purificato il prodotto di PCR è stato digerito e successivamente introdotto nel NOB11 (vedi sopra) anch’esso digerito con Xbal, Il costrutto finale (NOB11 LEC2::amiR-BnAGL23 ) è stato chiamato NOB14 (figura 28).

Come già riportato per la costruzione del NOB6, NOB 14 viene digerito con Hindll, il frammento contenente pALCA::BnAGL23 mut;LEC2::amiR-BnAGL23 viene eluito da gel e legato nel NOB 425 precedentemente tagliato con Hindlll. Questo vettore finale (35S::ALCR;pALCA::BnAGL23mut;LEC2::BnamiR-AGL23) è stato denominato NOB16 (figura 29).

NOB14 e NOB16, come anche alcuni precedenti vettori, sono stati introdotti mediante elettropo razione in Agrobacterium tumefaciens. I ceppi modificati di Agrobacterium sono stati usati per la trasformazione di B. napus. La trasformazione di B. napus è un procedimento alquanto lungo che prevede dei passaggi di coltura in vitro, effettuati secondo quanto riportato da Bade e Damm (1995). Per i protocolli di induzione con i'etanolo sono stati seguiti i metodi descrìtti da Roslan et al. (2001), Laufs et al. (2003) e l’esperienza descritta in Battaglia et ai. (2006).

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Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un costrutto genico per l<’>inibizione reversibile della germinazione di semi transgenici, comprendente: un elemento genico di blocco dello sviluppo embrionale comprendente un promotore embrionale vegetale operativamente associato ad una sequenza nucleotidica in grado di inattivare un gene coinvolto in detto sviluppo embrionale; un elemento genico di recupero dello sviluppo embrionale comprendente un promotore inducibile operativamente associato ad una sequenza di detto gene coinvolto nello sviluppo embrionale mutata in modo da risultare insensibile alla suddetta sequenza in grado di inattivare un gene coinvolto nello sviluppo embrionale ma attiva nella funzione dello sviluppo embrionale, 2. Costrutto genico secondo la rivendicazione 1, comprendente inoltre uno o più geni o sequenze nucleotidiche transgeniche di interesse operativamente associati al costrutto in modo da essere contenuti entro le sue estremità chiuse destra e sinistra. 3. Costrutto genico secondo la rivendicazione 2, in cui detti geni o sequenze possono essere rappresentate da elementi genici che codificano per un prodotto genico avente una funzione desiderata quale una proteina, un enzima incluso metaboliti, ormoni, antibiotici, tossine. 4. Costrutto genico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui detto promotore embrionale vegetale è scelto nel gruppo consistente del promotore di PHERES, di LEC2 e della napine. 5. Costrutto genico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui detta sequenza in grado di inattivare un gene coinvolto in detto sviluppo embrionale è una sequenza che codifica a sua volta per una sequenza nucleotidica in grado di legarsi ad un sito attivo di un gene coinvolto nello sviluppo embrionale per inattivarlo. 6. Costrutto genico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui detta sequenza è una sequenza che ibridizza con una sequenza bersaglio da inattivare ed è in grado di provocare una rottura al suo interno. 7. Costrutto genico secondo la rivendicazione 6, in cui detta sequenza in grado di inattivare dette sequenze o geni bersaglio è una sequenza che codifica per l’espressione di un micro RNA artificiale (amiRNA) o un piccolo RNA di interferenza (siRNA). 8. Costrutto genico secondo la rivendicazione 6 o 7, in cui detta sequenza bersaglio è una sequenza MADS-box di piante. 9. Costrutto genico secondo la rivendicazione 8, in cui detta sequenza MADS-box è stata selezionata dal genoma della pianta Arabidopsis thaliana. 10. Costrutto genico secondo la rivendicazione 9, in cui detta sequenza MADS-box corrisponde al gene AGL23, 11. Costrutto genico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 7 a 10, in cui detta sequenza nucleotidica in grado di inattivare un gene coinvolto nello sviluppo embrionale comprende una sequenza scelta fra la sequenza amiRNA-BnAFL23 e le sequenze aventi una identità di almeno il 70%, preferibilmente almeno i’80%, con detta sequenza amiRNA-BnAFL23. 12. Costrutto genico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11, in cui detto elemento genico di recupero dello sviluppo embrionale comprende un promotore inducibile in grado dì reagire ad uno stimolo esterno attivando la trascrizione di una sequenza nucleotidica ad esso operativamente associata. 13. Costrutto genico secondo la rivendicazione 12, in cui detto promotore inducitele è scelto tra i promotori del sistema inducibile mediato da glucocorticoidi, del sistema indotto da shock termico e del sistema inducibile con etanolo. 14. Costrutto genico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13, comprendente inoltre un promotore costitutivo operativamente associato al gene che sintetizza per una proteina che, quando attivata dallo stimolo esterno, è in grado di legarsi al promotore inducibile ed attivare a sua volta la sua trascrizione. 15. Costrutto genico secondo la rivendicazione 14, in cui detto promotore costitutivo è nel gruppo che consiste del promotore 35S-CaMV, promotore dell’ubiquitina, promotore dell’actina e promotore della tubulina. 16. Costrutto genico secondo la rivendicazione 14 o 15, in cui detto promotore costitutivo è operativamente associato ad una sequenza nucleotidica che codifica per una proteina inattiva attivabile tramite uno stimolo esterno. 17. Costrutto genico secondo la rivendicazione 16, in cui detta sequenza codificante è scelta tra le sequenze del sistema inducibile mediato da glucocorticoidi, del sistema indotto da shock termico e del sistema inducibile con etanolo. 18. Costrutto genico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 17, in cui detta sequenza di un gene coinvolto nello sviluppo embrionale mutata in modo da risultare insensìbile alla sequenza di inattivazione di detto gene ma attiva nella sua funzione naturale è rappresentata dalla sequenza mutata BnAGL23. 19. Metodo per la preparazione di un costrutto genico per l’inibizione reversibile della germinazione di semi transgenici secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 18, comprende le fasi di: 1 ) isolamento dal genoma di interesse della sequenza nucleotidica di un promotore embrionale vegetale; 2) amplificazione di detta sequenza; 3) digestione della sequenza con opportuni enzimi di restrizione per consentirne l<'>inserimento in un adatto plasmide di clonazione; 4) digestione di un adatto plasmide di clonazione con i medesimi enzimi di restrizione usati nella fase precedente per consentire l'integrazione di detta sequenza in detto plasmide; 5) integrazione di detto promotore embrionale in detto plasmide; 6) isolamento dal genoma di interesse di una sequenza bersaglio; 7) amplificazione di detta sequenza; 8) sintesi di una sequenza in grado di ibridizzare ed inattivare tale sequenza di bersaglio; 9) clonazione di detta sequenza in grado di ibridizzare ed inattivare la sequenza bersaglio in opportuni plasmidi; 10) ricombinazione tra i prodotti della fase 5) e della fase 9) per ottenere un elemento genico di blocco dello sviluppo embrionale; 11) sintesi di una sequenza nucleotidica di un gene coinvolto nello sviluppo embrionale mutata in modo da risultare insensibile a detta sequenza di inattivazione; 12) ricombinazione del prodotto della fase 11) in un opportuno vettore; 13) isolamento dal genoma di interesse della sequenza nucleotidica di un promotore inducibile; 14) amplificazione di detta sequenza; 15) digestione della sequenza con opportuni enzimi di restrizione per consentirne l'inserimento in un adatto plasmide di clonazione; 16) digestione di un adatto plasmide di clonazione con i medesimi enzimi di restrizione usati nella fase precedente per consentire l’integrazione di detta sequenza in detto plasmide; 17) integrazione del prodotto della fase 15) nel plasmide della fase 16); 18) ligazione tra l’inserto del vettore ottenuto nella fase 12) e il plasmide linearizzato della fase 16) per ottenere un plasmide contenente l<’>elemento genico di recupero dello sviluppo embrionale; 19) ricombinazione tra i prodotti della fase 12) e della fase 18) per ottenere il costrutto genico per l’inibizione reversibile della germinazione di semi transgenici. 20. Metodo per la trasformazione di un organismo vegetale mediante il costrutto genico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 18, comprende le fasi di: c) mettere a disposizione un costrutto genico per l’inibizione reversibile della germinazione di semi transgenici secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 18; d) inserire detto costrutto in un organismo ospite in grado di trasformare un organismo bersaglio o parti di questo e) trasformare detto organismo vegetale o parti di esso con detto organismo ospite portante detto costrutto. 21. Metodo secondo la rivendicazione 21, in cui la fase a) comprende la clonazione ed il trasferimento di detto costrutto genico in vettori dì espressione eterologa, quali vettori binari. 22. Metodo secondo la rivendicazione 20 o 21, in cui la fase b) comprende l’introduzione di plasmidi di clonazione contenenti il costrutto di interesse per elettroporazione in un ospite per trasferire transgeni in organismi vegetali. 23. Metodo secondo la rivendicazione 22, in cui detto ospite è Agrobacterium tumefaciens. 24. Semi, piante o parti di piante modificati geneticamente comprendenti un costrutto genico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 18.