CN113832173B

CN113832173B - 一种蜈蚣草植酸酶及其应用

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Publication number: CN113832173B
Application number: CN202110962355.9A
Authority: CN
Inventors: 孙丹; 曹越; 仇荣亮
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2021-08-20
Filing date: 2021-08-20
Publication date: 2023-09-19
Anticipated expiration: 2041-08-20
Also published as: CN113832173A

Abstract

本发明公开了一种蜈蚣草植酸酶及其应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明首次公开了一种在蜈蚣草根系表达的HAP型植酸酶PvPHY1基因和/或蛋白及其在促进植物吸收和利用磷及促进植物生长的应用。本发明利用蜈蚣草植酸酶基因，促进植物吸收磷、促进植物利用磷和/或促进植物生长，对实现土壤磷营养的高效利用，及遏制由于农业磷肥低效化导致的水体富营养化问题具有重要意义。

Description

一种蜈蚣草植酸酶及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地，涉及一种蜈蚣草植酸酶及其应用。

背景技术

磷对于植物的生长至关重要，但土壤中磷的有效性低。有机磷是土壤中磷的重要组成部分，通常占土壤总磷的30～80％。在有机磷中，植酸的占比最高，占有机磷的50％，土壤总磷的25％。在低磷土壤中，植物可以有效地通过合成磷酸酶水解土壤中的有机磷来增强对磷的吸收。植酸酶是植物利用植酸的基础，但大部分植物难以利用外部土壤中的植酸，这是由于大部分植物的根系不具有高效合成植酸酶进而水解土壤中植酸的能力。

植物中的植酸酶可以分为两类：组氨酸酸性磷酸酶(HAP)和紫色酸性磷酸酶(PAP)。PAP水解底物比较广泛，大部分PAP不能水解植酸，仅有少部分PAP可以同时水解植酸和其他有机磷酸盐。而HAP对植酸的水解专一性更强，是一种以植酸为唯一底物的具有较强特异性的植酸酶。目前，在植物中已鉴定出的几种HAP主要包括小麦(TaPhys)、大麦(HvPhys)、百合(LlALP1/LlALP2)和玉米(ZmphyS11/ZmPHYTI/ZmPHYTII)。这些HAP主要在种子萌发中发挥作用。现有技术中，仅有小麦中的TaPhyIIa2和大麦中的HvPhyIIb得到了基因功能鉴定，有关其他HAP的公开技术非常罕见。

蜈蚣草(Pteris vittata L.)是第一种被发现能超富集砷(As)的植物。除了表现出极强的砷吸收、转运及富集能力外，蜈蚣草的磷营养利用机制也非常独特。因为蜈蚣草通常生长在低磷的土壤环境中，长期的低磷限制帮助蜈蚣草进化出了高效的磷获取策略，其中最具有代表性的就是可以高效地利用植酸。现有技术公开了，在植酸作为唯一的磷源时，蜈蚣草生长良好；而普通植物难以在单一的植酸环境中生长。此外，与大多数植物不同的是，蜈蚣草的植酸酶在根系中发挥重要作用。现有技术公开了蜈蚣草根系的蛋白提取物具有较高的植酸酶活性，蜈蚣草根系植酸酶具有从土壤中的有机磷中获取磷的重要潜力(Lessl,Jason T et al.“Novel phytase from Pteris vittata resistant toarsenate,high temperature,and soil deactivation.”Environmental Science&Technology vol.47,5(2013):2204-11.)。专利CN106164275A公开了蜈蚣草根系蛋白提取物具有耐高温耐砷的植酸酶活性，也公开了整体或部分编码蜈蚣草根系植酸酶的核苷酸序列及其对应的氨基酸序列。但现有技术公开的植酸酶中没有HAP型植酸酶，也没有明确这些公开序列的蛋白是否具有植酸酶活性，更没有公开蜈蚣草公开序列的植酸酶基因在异种植物中表达时对吸收利用磷的影响。因此，目前在蜈蚣草根系中发挥作用的HAP型植酸酶蛋白尚未得到鉴定，限制了利用根系植酸酶提高植物对土壤中磷利用效率的实际应用。

烟草是重要的经济作物，烟草的正常生长和农业生产对矿质营养元素的需求也很大。其中，磷素营养对烟草的生长发育有重要的作用。一方面，磷营养能够有效地改善根系生理性状，并提高根系活力，显著改善烟草抗病、抗逆能力。另一方面，磷营养对烟叶的生长和品质有非常大的影响。适当提高磷营养，能够改善烟草叶片组织结构，使烟叶适时落黄；足够的磷素养分是维持烟草正常光合作用的关键。总的来说，充足的磷营养是保障烟草正常生长、收获高品质烟叶必不可少的条件之一。此外，烟草也是生物学研究的重要模式植物，以烟草为研究对象的实验结果对理解其他植物的矿质营养代谢、植物生理机制等有重要的意义。

土壤中磷低效化一直是重要的农业环境问题。过去由于土壤中的磷多数以无法被植物利用的形态存在，导致土壤中的磷不足够供给农作物的营养需要。近些年来，由于大量施用化肥，农业土壤中磷的总量已经较高，但是大量的磷仍然无法被农作物直接吸收利用。这些土壤中富余的磷进入水体成为微生物的磷源，导致水体富营养化，造成严重的环境污染。因此，提高农作物的磷利用效率是解决土壤磷低效化的重要途径。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种蜈蚣草根系植酸酶及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种蜈蚣草植酸酶基因。

本发明的第二个目的是提供一种蜈蚣草植酸酶蛋白。

本发明的第三个目的是提供一种蜈蚣草植酸酶基因和/或蜈蚣草植酸酶蛋白在促进促进植物吸收磷、促进植物利用磷和/或促进植物生长的应用。

本发明的第四个目的是提供一种重组表达载体。

本发明的第五个目的是提供一种含有蜈蚣草植酸酶基因的重组表达载体在促进植物吸收磷、促进植物利用磷和/或促进植物生长的应用。

本发明的第六个目的是提供一种重组菌株。

本发明的第七个目的是提供一种含有蜈蚣草植酸酶基因的重组表达载体的菌株在促进植物吸收磷、促进植物利用磷和/或促进植物生长的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明从蜈蚣草根系中克隆得到一种蜈蚣草植酸酶基因，将其命名为PvPHY1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。通过分析PvPHY1基因编码的氨基酸序列(如SEQ IDNO：2所示)，确定PvPHY1蛋白属于HAP型植酸酶。构建PvPHY1蛋白的重组表达载体，将载体转入农杆菌中，随后利用农杆菌侵染烟草获得PvPHY1转基因烟草植株，经过对转基因植株的鉴定，获得阳性转化株系。采用沙培或水培的方式使PvPHY1转基因烟草植株处于不同的生长环境，明确PvPHY1基因和/或蛋白能够促进植物吸收磷、促进植物利用磷和/或促进植物生长。

一种蜈蚣草植酸酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述蜈蚣草植酸酶基因在蜈蚣草根系中的表达量显著高于在蜈蚣草地上部分中的表达量。

一种蜈蚣草植酸酶蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，所述蜈蚣草植酸酶蛋白属于植酸酶中的组氨酸酸性磷酸酶。

所述的蜈蚣草植酸酶基因和/或蜈蚣草植酸酶蛋白在促进植物吸收磷、促进植物利用磷和/或促进植物生长的应用，也应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述促进植物吸收磷为植株根系磷信号通路关键基因磷酸盐转运蛋白基因NbPht1；1、NbPht1；2和NbPht1；6的表达量上升和/或植物中的总磷含量增加。

优选地，所述促进植物利用磷为植物中的无机磷含量上升、植酸的含量降低和/或植酸态磷占总磷的比例降低。

优选地，所述促进植物生长为植物的生物量增加。

优选地，所述应用为将含有如SEQ ID NO：1所示的序列的重组表达载体导入目标植物。

本发明选用模式植物烟草作为目标植物，实现构建含有如SEQ ID NO：1所示序列的重组表达载体和转基因植物，以明确蜈蚣草植酸酶PvPHY1基因促进植物吸收磷、促进植物利用磷和/或促进植物生长的能力。

其他植物作为构建含有蜈蚣草植酸酶基因序列SEQ ID NO：1重组表达载体转基因植物的目标植物，也应在本发明的保护范围之内。

一种重组表达载体，所述重组表达载体含有如SEQ ID NO：1所示的序列。

所述的含有蜈蚣草植酸酶基因的重组表达载体在促进植物吸收磷、促进植物利用磷和/或促进植物生长的应用，也应在本发明的保护范围之内。

一种重组菌株，所述重组菌株含有重组表达载体。

优选地，所述重组表达载体含有如SEQ ID NO：1所示的序列。

本发明使用模式菌株大肠杆菌宿主株BL21实现含有蜈蚣草植酸酶基因序列SEQID NO：1的重组表达载体的原核表达。

其他用于含有蜈蚣草植酸酶基因序列SEQ ID NO：1的重组表达载体原核表达的菌株，也应在本发明的保护范围之内。

本发明使用模式菌株农杆菌菌株GV3101实现构建含有蜈蚣草植酸酶基因序列SEQID NO：1的转基因植物。

其他用于构建含有蜈蚣草植酸酶基因序列SEQ ID NO：1的重组表达载体的转基因植物的菌株，也应在本发明的保护范围之内。

所述的含有蜈蚣草植酸酶基因序列SEQ ID NO：1的重组表达载体的菌株在促进植物吸收磷、促进植物利用磷和/或促进植物生长的应用，也应在本发明的保护范围之内。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次公开了一种在蜈蚣草根系表达的HAP型植酸酶PvPHY1基因和/或蛋白及其在促进植物吸收和利用磷及促进植物生长的应用。本发明利用蜈蚣草植酸酶基因，促进植物吸收磷、促进植物利用磷和/或促进植物生长，对实现土壤磷营养的高效利用，及遏制由于农业磷肥低效化导致的水体富营养化问题具有重要意义。

附图说明

图1为蜈蚣草PvPHY1的进化分析与组织表达模式；A为蜈蚣草PvPHY1蛋白的系统发育树分析图；B为基于定量PCR分析的蜈蚣草PvPHY1基因、水稻OsHAP-Like1基因、拟南芥AtHAP-Like1基因在根系和地上部的相对表达模式；星号*的标注代表组间显著差异p<0.05。

图2为重组PvPHY1蛋白的植酸酶活性；A为在大肠杆菌中表达His标签蛋白和PvPHY1重组蛋白纯化前后的蛋白电泳结果；B为纯化后His标签蛋白和PvPHY1重组蛋白的植酸酶活性；不同字母的标注代表显著差异p<0.05。

图3为PvPHY1转基因烟草的构建及阳性转基因烟草株系的鉴定；A为PvPHY1烟草转基因载体示意图；B为PvPHY1在野生型和转基因株系中的相对表达量；不同字母的标注代表显著差异p<0.05。

图4为PvPHY1转基因烟草根系磷信号通路关键基因的变化情况；A为PvPHY1转基因烟草根系中NbPht1；1的相对表达量；B为PvPHY1转基因烟草根系中NbPht1；2的相对表达量；C为PvPHY1转基因烟草根系中NbPht1；6的相对表达量；不同字母的标注代表显著差异p<0.05。

图5为沙培PvPHY1转基因烟草生长的情况；A为PvPHY1转基因烟草株系和野生型烟草生长1个月后的植物状态；B为PvPHY1的转基因烟草株系和野生型烟草根系及地上部生物量的测定结果；不同字母的标注代表显著差异p<0.05。

图6为水培PvPHY1转基因烟草对磷吸收利用的情况；A为PvPHY1转基因烟草植株和野生型烟草植株培养2周后植株总磷浓度的柱状图；B为PvPHY1转基因烟草植株和野生型植株根系和地上部的有机磷含量；C为PvPHY1转基因植株和野生型植株的地上部植酸的相对含量；D为PvPHY1转基因植株和野生型植株的地上部植酸态磷占总磷的比例；E为PvPHY1转基因烟草植株和野生型植株的根系植酸的相对含量；F为PvPHY1转基因烟草植株和野生型植株的根系植酸态磷占总磷的相对比例；不同字母的标注代表显著差异p<0.05。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1蜈蚣草PvPHY1的克隆

1、实验方法

根据蜈蚣草转录组数据库，利用NCBI网站在线设计克隆引物。

PvPHY1-PCR-F：ATGGAAGCTCATTTTGGAAAT(SEQ ID NO：3)。

PVPHY1-PCR-R：TTACAGTTCATCGTGTTTCTC(SEQ ID NO：4)。

提取蜈蚣草根系RNA，并反转录为cDNA，使用克隆引物PvPHY1-PCR-F(SEQ ID NO：3)和PVPHY1-PCR-R(SEQ ID NO：4)进行PCR扩增获得克隆产物。

将克隆产物采用pClone007 Blunt Vector Kit(Tsingke Biotechnology,China)连接克隆载体，最终转入大肠杆菌感受态细胞DH5αChemically Competent Cell(TsingkeBiotechnology,China)中，利用测序引物M13F：GTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO：5)及M13R：CAGGAAACAGCTATGAC(SEQ ID NO：6)进行测序。

2、实验结果

克隆载体的测序结果显示所获得的克隆产物与蜈蚣草转录组数据库中预测的PvPHY1序列完全一致，表明成功克隆获得了PvPHY1基因序列(SEQ ID NO：1)。

实施例2蜈蚣草PvPHY1的特征分析和表达模式鉴定

1、实验方法

(1)蜈蚣草的培养

蜈蚣草孢子来自美国佛罗里达州，于实验室内进行繁殖。将分散在水中的孢子倒在盆栽基质土的表面，通过定期浇水和覆膜保持土壤水分。2个月后，将2～3叶孢子体幼苗移栽到新盆中。待蜈蚣草幼苗长至5～6叶，移至1/5霍格兰营养液(HNS)中曝气培养，每周换一次营养液，预培养两周。所有植株均生长在光照14h、昼/夜温度26/20℃、相对湿度60％、光强3000lx的温室中。

(2)RNA提取和转录分析

为了鉴定蜈蚣草PvPHY1基因、水稻OsHAP-Like1基因、拟南芥AtHAP-Like1基因的组织表达模式，采用FastPure Plant total RNA Isolation Kit(Vazyme Biotech,Nanjing,China)，以水培的蜈蚣草、水稻和拟南芥组织为材料，提取不同材料的总RNA。

将得到的总RNA使用HiScript II一步RT-PCR试剂盒(Vazyme Biotech,Nanjing,China)反转录成cDNA。

以PvActin基因作为蜈蚣草PvPHY1基因的内参，以OsActin基因作为水稻OsHAP-Like1基因的内参，以AtActin基因作为拟南芥AtHAP-Like1基因的内参，定量引物信息见表1。

以所得cDNA作为模板，使用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(VazymeBiotech,Nanjing,China)进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，结果采用2^-ΔΔCT法进行统计。

表1 qRT-PCR引物列表

名称	序列
		qRT-PvActin-F	GGGCAGTATTTCCAAGCATAGTGGG
qRT-PvActin-R	TGCCTCGCTTTGATTGAGCCTCATC
		qRT-PvPHY1-F	AGAGATCAGTTGCATTACCGG
qRT-PvPHY1-R	CGTGTTTCTCTTGGGTTTTCTG
		qRT-AtActin-F	GCCATCCAAGCTGTTCTCTC
qRT-AtActin-R	GCTCGTAGTCAACAGCAACAA
		qRT-AtHAP-Like1-F	GAGATGGCGACGAAGACTGT
qRT-AtHAP-Like1-R	GTGACGGTGGAGAGGTGATG
		qRT-OsActin-F	GGGTTCACAAGTCTGCCTATTGT
qRT-OsActin-R	ACGGGACACGACCAAGGA
		qRT-OsHAP-Like1-F	CCACCTCAATCTCGTGGCAA
qRT-OsHAP-Like1-R	CAACCGAACCGCCAGTCTAT

(3)系统进化树的构建

利用DNAMAN软件翻译PvPHY1基因序列(SEQ ID NO：1)获得PvPHY1蛋白序列(SEQID NO：2)，通过在NCBI网站检索比对水稻、拟南芥中的HAP型植酸酶蛋白，获得水稻中的OsHAK-Like1蛋白(Os03g60370)和拟南芥中的AtHAP-Like1蛋白(AT1G09870)。

通过对蜈蚣草中的PvPHY1蛋白、模式植物水稻中的OsHAK-Like1蛋白和模式植物拟南芥中的AtHAP-Like1蛋白、以及其他植物中已经报道的具有植酸酶活性的HAP和PAP蛋白的氨基酸序列进行分析和比对，利用MEGA 7.0的Neighbor-Joining(邻接法)构建系统发育树，基因的NCBI编号见表2。

表2基因在NCBI中的编号列表

基因	编号	基因	编号
				AtHAP-Like1	AAB60740	GmPhy	AAK49438
OsHAP-Like1	AK121701	GmPAP4	HQ162477
				HvPhyIIa1	DQ995968	GmPAP14	AFH08750
HvPhyIIa2	DQ995969	HvPAPhy_a	FJ974003
				HvPhyIIb	DQ995970	HvPAPhy_b1	FJ974004
LlALP1	ABD96176	HvPAPhy_b2	FJ974005
				LlALP2	ABD96177	NtPAP	EF397753
TaPhyIIa1	DQ995971	MtPHY1	AY878355
				TaPhyIIa2	ABJ98332	MtPAP1	AY804257
TaPhyIIb	DQ995973	OsPAPhy_b	HM006823
				TaPhyIIc	DQ995974	SgPAP23	KU315547
Zmphy S11	P93644	TaPAPhy_a1	FJ973998
				ZmPHYT I	CAA11390	TaPAPhy_a2	FJ973999
ZmPHYT II	CAA11391	TaPAPhy_b1	FJ974000
				AtPAP10	AT2G16430	TaPAPhy_b2	FJ974001
AtPAP15	AT3G07130	ZmPAPhy_b	FJ974007
				AtPAP23	AT4G13700

2、实验结果

图1A反映了植物中具有植酸酶活性的蛋白主要分布于HAP蛋白家族(紫线)和PAP蛋白家族(蓝线)，蜈蚣草中的PvPHY1蛋白属于HAP家族的一员，与拟南芥中的AtHAP-Like1亲缘关系最近。通过qRT-PCR对蜈蚣草中的PvPHY1、水稻OsHAP-Like1基因、拟南芥AtHAP-Like1基因进行分析，PvPHY1在蜈蚣草根系的表达丰度是地上部的25倍，而在拟南芥和水稻中，根系HAP-Like1的表达丰度较低(图1B)。

HAP和PAP家族的成员都具有水解有机磷、释放无机磷供植物利用的能力，但HAP家族成员具有更为专一的底物活性，它们以植酸为唯一底物发挥植酸酶活性；相反，PAP家族成员主要表现为磷酸酶活性，有少数PAP成员可以同时以植酸作为底物。目前，仅有极少数植物的HAP成员被鉴定，但它们缺少在植物中的成功应用。

蜈蚣草根系蛋白提取物有很强的植酸酶活性，现有技术公开了，蜈蚣草根中植酸酶的活性是地上部的7倍，这与普通植物完全不同。在拟南芥和水稻的根系中，HAP同源基因的表达模式与大部分植物类似，主要在地上部中表达(其中主要在种子中表达，因为种子中的植酸占总磷的40～80％)，而在根中的表达丰度很低。所以，这些基因主要在种子中发挥利用植酸的作用。

PvPHY1是一个在蜈蚣草根系表达的植酸酶基因，参与蜈蚣草根系对植酸的高效利用，同时具有提高其他植物根系磷利用效率的潜力。

实施例3重组PvPHY1蛋白的纯化及植酸酶活性测定

1、实验方法

(1)PvPHY1的原核表达与纯化

将PvPHY1基因序列(SEQ ID NO：1)克隆到原核表达载体pCold^TF DNA中，重组载体与空载体一起导入大肠杆菌宿主株(BL21)。

BL21菌株在500ml Luria-Bertani(LB)液体培养基中培养，温度为37℃，转速为200rpm。培养至OD600＝0.4～0.5时，15℃静置30min。加入终浓度为1mM的IPTG，15℃、200rpm的条件下培养24h，诱导BL21菌株表达PvPHY1蛋白。

离心10min富集BL21菌株，用4℃预冷的10mL裂解缓冲液(300mM NaCl、50mM Tris-HCl、10mM咪唑，pH＝8)重悬BL21菌株，超声裂解15min。离心10min去除沉淀，收集含可溶性蛋白的上清液。

获得含有His标签蛋白的PvPHY1融合蛋白及只含有His标签蛋白的上清液，将上清液过HisSep Ni-NTA 6FF色谱柱。使用改良的洗涤缓冲液(300mM NaCl、50mM Tris-HCl、20mM咪唑，pH＝8)去除与色谱柱非特异性结合的蛋白(为了减少背景中磷的含量，用Tris-HCl代替含磷的PBS)。用洗脱缓冲液(300mM NaCl、50mM Tris-HCl、250mM咪唑，pH＝8)洗脱目标蛋白。用50kD超滤离心管离心5min(4000g，25℃)，浓缩洗脱液得到纯化的蛋白提取物。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化的蛋白提取物，电泳结束后用考马斯亮蓝染色，观察并拍照。

(2)测定PvPHY1蛋白的植酸酶活性

采用BCA蛋白检测试剂盒定量测定纯化的蛋白提取物中纯化蛋白的含量。将100μg纯化的蛋白提取物加入到500μL的包含50mM醋酸钠缓冲液(pH＝5.5)和2mM植酸钠反应体系中。37℃孵育1h后，加入500μL的10％(w/v)三氯乙酸溶液终止反应。用钼酸盐比色法在880nm波长下定量体系中释放的无机磷含量。

2、实验结果

利用原核表达和蛋白纯化，获得了融合His标签蛋白的PvPHY1蛋白和只含有His标签的蛋白，以只含有His标签的蛋白作为阴性对照，并测定两者的植酸酶活性。

通过SDS-PAGE分析，可以确定融合His标签蛋白的PvPHY1重组蛋白的分子量大小为108kDa，去除His标签蛋白后，与目标蛋白的大小56kDa一致，图2A中箭头所指的位置代表在52kDa和108kDa处表达的目标蛋白，说明重组PvPHY1载体成功表达了目标PvPHY1蛋白。

纯化的PvPHY1重组蛋白具有以植酸为底物的明显的植酸酶活性，而纯化的His标签蛋白没有植酸酶活性(图2B)。酶活性分析表明PvPHY1重组蛋白能从植酸中释放无机磷，说明PvPHY1编码一种能水解植酸的功能性植酸酶蛋白。

实施例4构建PvPHY1转基因烟草植株

1、实验方法

(1)烟草转基因载体的构建和阳性转基因烟草株系的鉴定

将PvPHY1基因序列(SEQ ID NO：1)转入植物表达载体pSN1301中，构建pSN1301-PvPHY1重组载体。将重组载体pSN1301-PvPHY1导入农杆菌菌株GV3101中。通过农杆菌转化法构建转基因烟草株系。

通过培养繁殖收获转基因株系T₁代种子，在添加30mg/L潮霉素的1/2MS培养基上萌发T₁代烟草幼苗，筛选出阳性转化植株。

通过qRT-PCR检测PvPHY1基因的表达，鉴定阳性的转基因烟草株系。所用的内参定量引物为qRT-NbActin-F：TTCCGTTGCCCAGAGGTCCT和qRT-NbActin-R：GGGAGCCAAGGCAGTGATTTC，所用PvPHY1基因的定量引物为qRT-PvPHY1-F：AGAGATCAGTTGCATTACCGG和qRT-PvPHY1-R：CGTGTTTCTCTTGGGTTTTCTG。

2、实验结果

构建pSN1301-PvPHY1重组载体如图3A所示。通过潮霉素筛选和qRT-PCR鉴定，筛选出三个生长状态良好的烟草株系(Ex11、Ex26、Ex28)。图3B显示三个转基因株系中均检测到PvPHY1高表达，而野生型中未检测到PvPHY1基因的表达信号，说明PvPHY1仅在转基因烟草株系中表达，表明表达PvPHY1的转基因烟草株系构建成功。

实施例5 PvPHY1转基因烟草根系磷信号通路关键基因的变化情况

1、实验方法

(1)PvPHY1转基因烟草的培养

将实施例4获得的阳性转基因烟草株系(Ex26和Ex28)的种子在含有30mg/L潮霉素的无菌1/2MS培养基上萌发，2周后，将长势一致的烟草幼苗移入1/5HNS中水培预培养1个月，每周换一次营养液。

(2)磷转运蛋白基因的表达模式鉴定

采集野生型烟草和转基因烟草株系的根系组织于液氮中速冻，置于-80℃保存。

提取烟草根系总RNA，以NbActin为内参，采用qRT-PCR测定烟草根系中磷酸盐转运蛋白基因NbPht1；1、NbPht1；2和NbPht1；6的表达水平，定量引物见表3，基因的NCBI编号见表4。

表3 qRT-PCR引物列表

名称	序列
		qRT-NbActin-F	TTCCGTTGCCCAGAGGTCCT
qRT-NbActin-R	GGGAGCCAAGGCAGTGATTTC
		qRT-NbPht1；1-F	AGCCAGGCTTAGGTCAACAT
qRT-NbPht1；1-R	CCAATCATCGCTCCTGCTTT
		qRT-NbPht1；2-F	GGGCCATTAATGCTCTGGGA
qRT-NbPht1；2-R	TCCTGTGATGCTTCCTCCAG
		qRT-NbPht1；6-F	GGGAAGTCACTAGAAGAGATGTCA
qRT-NbPht1；6-R	TTGCAGGACCTTTGCAGAAC

表4基因NCBI编号列表

基因	编号
		NbPht1；1	NM_001326210
NbPht1；2	NM_001325966
		NbPht1；6	XM_016600215

2、实验结果

现有技术忽略了磷酸盐转运蛋白在其中的关键作用。植酸作为植物吸收和转运磷的重要信号分子，其含量的改变能够显著影响直接发挥磷酸盐吸收功能的磷转运蛋白基因的表达。磷酸盐转运蛋白基因的表达水平上调，能够显著促进植物对磷酸盐的吸收，从而促进植物体内总磷含量的积累。

NbPht1；1、NbPht1；2和NbPht1；6是烟草植株中典型的磷酸盐转运蛋白基因，负责植物根系对磷酸盐的摄取。图4A、B和C中qRT-PCR的结果表明，表达PvPHY1的烟草植株根系中NbPht1；1、NbPht1；2和NbPht1；6基因的表达量分别是野生型植物的2.1～2.7倍、2.1～2.8倍和6.5～12.0倍。说明转入PvPHY1基因显著促进烟草中磷酸盐转运蛋白基因的表达，因此进而促进了烟草对磷的吸收。

实施例5沙培环境下PvPHY1转基因烟草的生长情况

1、实验方法

将实施例4获得的阳性转基因烟草株系(Ex11、Ex26和Ex28)的种子在含有30mg/L潮霉素的无菌1/2MS培养基上萌发，2周后，将长势一致的烟草幼苗移入1/5HNS中水培预培养2个周。选择长势一致的野生型及转基因烟草幼苗，转移到无菌的河沙中进行沙培盆栽实验。

沙培培养过程中，每3天补充一次45mL的新鲜1/5HNS营养液(含有200μM的KH₂PO₄)。植物生长1个月后，每个株系中选择一个最有代表性的盆栽进行拍照，并将植株分成地上部和根系，分别进行生物量的测定。

2、实验结果

沙培培养一个月后，植物的生长状态如图5A所示，PvPHY1转基因烟草植株生长显著优于野生型烟草植株。图5B对根系和地上部的生物量进行了统计，可以发现PvPHY1转基因烟草植株地上部及根系的生物量均显著高于野型，其中地上部生物量最多增加了38％，根系生物量最多增加了88％。说明转入PvPHY1基因能够显著促进烟草植株生物量的积累，促进烟草生长。

实施例6水培PvPHY1转基因烟草对磷吸收利用的情况

1、实验方法

(1)烟草的水培和处理方法

将实施例4获得的阳性转基因烟草株系(Ex11、Ex26和Ex28)的种子在含有30mg/L潮霉素的无菌1/2MS培养基上萌发，2周后，将长势一致的烟草幼苗移入1/5HNS中水培预培养2周，每周换一次营养液。从中选取长势一致的烟草植株转移至含有100μM KH₂PO₄的1/5HNS营养液中培养1周，分离烟草的根系和地上部组织于液氮中速冻，随后保存于-80℃待使用。

(2)总磷含量的测定

通过低温冷冻干燥机冻干烟草的根系和地上部组织，使用USEPA方法，取0.05g冻干组织在105℃、50％HNO₃-30％H₂O₂中消解。利用钼酸盐比色法测定总磷含量。

(3)无机磷含量的测定

取0.5g冻干烟草的根系和地上部组织样品，在研钵中加入液氮进行研磨，加入1mL10％高氯酸低温匀浆，再用9mL 5％高氯酸稀释得到混合物。将混合物在冰上冷却30min，随后取出于离心管中，4℃、10000g离心10min，取上清液测定无机磷含量。

(4)植酸含量的测定

取0.2g冻干烟草的根系和地上部组织样品，加液氮用研钵磨碎后加入10mL0.5MHCl，振荡提取1h后，4000g离心15min，取上清液于4℃条件下保存待测。

对于植酸浓度较低的根系，使用二氧化钛(TiO₂)进行富集提取，方法如下：取0.05g新鲜组织样本，用液氮磨碎后加入5mL浓度为1M的HClO₄溶液，振荡提取1h。12000g离心10min，取上清液加入TiO₂微珠振荡混合20min。用10％的氨溶液(pH＝10)清洗两次TiO₂微珠，清洗液冻干后重新稀释，4℃条件下保存待测。

植酸能够与Fe³⁺–硫氰酸络合物中的Fe络合显色，使显色发生变化，依据标准曲线，根据显色程度可以确定样品中植酸的浓度。联合使用高效液相色谱和紫外检测器，设定HPLC/UV–vis条件参数为：流动相为30％乙腈(0.1M HNO₃溶液)，流速0.5mL/min，标准样品和待测样品进样量为50μL，色谱分离柱为十八烷基柱，Fe³⁺-硫氰酸络合物检测波长460nm。

2、实验结果

为了明确PvPHY1转基因烟草对磷吸收及利用的能力，对水培PvPHY1转基因烟草植株和野生型植株中总磷、无机磷和植酸态磷的含量进行测定。

与野生型相比，PvPHY1转基因烟草地上部的总磷含量显著增加了35～47％，根系显著增加了10～17％，说明转入PvPHY1基因促进烟草对磷的吸收(图6A)。

与野生型相比，PvPHY1转基因烟草地上部的无机磷含量显著增加了68～74％，根系显著增加了30～56％，说明转入PvPHY1基因促进烟草中无机磷的积累，提高烟草对磷的利用效率(图6B)。

无机磷是植酸水解的产物，同时也是植物吸收磷的主要形式。由于无机磷比包括植酸在内的其他磷形式更容易重新分配到植物需要的组织中，无机磷含量的上升能够显著增加植物细胞内磷的可利用性，提高磷的利用效率。

野生型烟草叶片中含有2.2μmol g^–1植酸，占烟草植株总磷的18％。相比野生型，PvPHY1转基因烟草中的植酸含量降低了25～32％，植酸态磷占总磷的7.7～9.0％，较野生型显著降低(图6C和图6D)。

以上结果说明，转入PvPHY1基因促进了烟草叶片中植酸的水解，从而降低了植酸的含量和植酸态磷占总磷的比例，并增加了无机磷的释放，提高烟草对磷的利用效率。

转基因烟草中的植酸含量较野生型无显著变化，但植酸态磷占总磷的比例显著降低(图6E和图6F)。这一结果与地上部植酸态磷占总磷的比例变化情况类似，说明转入PvPHY1基因促进了烟草植株中植酸的水解和无机磷的释放，提高了转基因烟草对磷的利用效率。

现有公开技术中，为了提高植物中磷的利用效率，主要采用两种基于植物磷酸酶基因表达的方法：一种是表达磷酸酶基因后，促进植物分泌有植酸酶活性的磷酸酶，进而将土壤中的植酸水解为磷酸根，促进植物吸收利用；另一种是通过植酸酶在植物体内的植酸水解作用，增加植物体内无机磷的含量，从而提高植物对磷的利用效率。

现有的利用转基因提高植物利用磷效率的方法中，一类通过表达磷转运体或磷酸酶，这类方法往往只能单一的提高植物对外部磷的吸收或内部磷的再利用效率，而本发明同时实现了吸收和利用效率的提升，获得了更为显著的效果；另一类通过表达转录因子等调控蛋白实现磷营养的高效吸收，但是转录因子等核心调控蛋白往往控制多个(多类型)下游功能基因，在改变磷利用的同时，可能破坏其他尚不清晰的调控网络，而本发明的调控途径清晰，能够对植物细胞磷的信号特异性发挥作用。

本发明成功克隆到蜈蚣草这一具有磷高效利用能力的蕨类植物中的HAP型植酸酶序列，在明确了其植酸酶功能的基础上，在烟草中加以表达。实现了①改变细胞内植酸含量驱动磷转运蛋白的表达增强，提升植株磷的获取能力；②增强了植物组织中植酸的水解，提高了烟草中“自由态”磷的比例，使其可以更迅速地转移到有磷营养需求的组织、细胞中。这两种作用共同实现了转基因烟草中磷吸收、利用效率的大幅提高。

在烟草中表达PvPHY1基因显著提高磷酸盐转运蛋白基因的表达强度，促进烟草生长和对磷酸盐的吸收。另外，PvPHY1基因也促进了烟草体内植酸的水解，进而促进了无机磷的释放。磷酸盐吸收的增强和植酸酶介导的无机磷的释放共同促进了植物对磷的吸收和利用，达到了更好的促进植物生长、提高磷积累和利用效率的效果。

本发明首次对蜈蚣草根系中表达的植酸酶基因PvPHY1进行了鉴定和蛋白功能鉴定，并通过构建PvPHY1转基因烟草植株实现了提高磷吸收和利用效率、促进植物生长的应用。基于PvPHY1在烟草植株中的应用效果，PvPHY1能用于提高其他植物或作物生长、并提高对磷的吸收积累和利用效率。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学

<120> 一种蜈蚣草植酸酶及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1437

<212> DNA

<213> Pteris vittata L.

<400> 1

atggaagctc attttggaaa taagttgcta caagtgcttg ctcttgtaac aataacggag 60

cttgttgcta tctacgcctg tacctccttt tctgaagatt ttgatgtccg ggaacacctt 120

tccactgcta ccaggtatga gtatggaatg cttagcacaa agaagcttgt aggcgacatc 180

ggggagccac cgtcaagttg ttcacctata cacataaatc ttgtggcacg gcacggaaca 240

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aactttcact ctctttgcag tcttcagaaa acccaagaga aacacgatga actgtaa 1437

<210> 2

<211> 478

<212> PRT

<213> Pteris vittata L.

<400> 2

Met Glu Ala His Phe Gly Asn Lys Leu Leu Gln Val Leu Ala Leu Val

1 5 10 15

Thr Ile Thr Glu Leu Val Ala Ile Tyr Ala Cys Thr Ser Phe Ser Glu

20 25 30

Asp Phe Asp Val Arg Glu His Leu Ser Thr Ala Thr Arg Tyr Glu Tyr

35 40 45

Gly Met Leu Ser Thr Lys Lys Leu Val Gly Asp Ile Gly Glu Pro Pro

50 55 60

Ser Ser Cys Ser Pro Ile His Ile Asn Leu Val Ala Arg His Gly Thr

65 70 75 80

Arg Ala Pro Thr Lys Lys Arg Ile Arg Gln Ile Asn Gly Phe Ala Glu

85 90 95

Arg Ile Arg Asp Leu Gly Asn Ser Ser Leu Leu Ala Pro Asn Trp Met

100 105 110

Lys Asp Trp Lys Ser Pro Trp His Gly Arg Val Val Gly Gly Glu Val

115 120 125

Leu Gln Lys Gly Glu Glu Glu Met Phe Glu Leu Gly Gln Arg Ile Arg

130 135 140

Thr Arg Tyr Ser Glu Ile Phe Lys Glu Pro Tyr His Pro Asp Leu Tyr

145 150 155 160

Met Ile Ser Ala Thr Gln Val Pro Arg Ser Ala Ala Ser Ala Val Ala

165 170 175

Phe Gly Met Gly Leu Phe Ser Gly Glu Gly Thr Leu Gly Gln Gly Arg

180 185 190

His Arg Ala Phe Ser Val Ile Ser Asp Ser Arg Thr His Asp Ile His

195 200 205

Leu Arg Phe Tyr Glu Ser Cys Ser Ala Tyr Gln Glu Ser Lys Ala Lys

210 215 220

Ala Ile Pro Val Val Ala Ala Leu Gln Glu Asp Phe His Met Asp Ile

225 230 235 240

Ala Ser Ser Leu Lys Glu Arg Phe Leu Phe Asn Ile Thr Lys Glu Asp

245 250 255

Ile Pro Thr Leu Trp Phe Leu Cys Lys Gln Glu Ala Ala Ala Leu Asp

260 265 270

Ile Val Asp Arg Ser Cys Ser Leu Phe Thr Glu Glu Glu Val Glu Met

275 280 285

Leu Glu Trp Ala Asp Asp Leu Glu Val His Lys Leu Lys Gly Tyr Gly

290 295 300

Glu Ser Ile Asn Tyr Arg Met Gly Ile Pro Leu Leu Thr Asn Val Leu

305 310 315 320

Glu Ser Met Glu Arg Val Ile Ala Ala Ser Lys Ala Gly His Ala Trp

325 330 335

Ser Ala Val Glu Lys Ala His Leu Arg Phe Ala His Ala Glu Thr Val

340 345 350

Ile Pro Phe Ile Cys Leu Leu Gly Leu Phe Leu Asp Ala Glu Glu Val

355 360 365

Gln Lys Ile Leu Met Glu Ala Pro Leu Glu Pro Pro Pro Arg Pro Pro

370 375 380

Lys Thr Arg Leu Trp Arg Gly Ser Ala Val Ala Pro Tyr Gly Ala Asn

385 390 395 400

Asn Met Val Val Leu His Lys Cys Ser Ser Asn Lys Asp Gly Ser Gln

405 410 415

Glu Glu Glu Asp Asp Phe Arg Val Gln Val Leu His Asn Glu Arg Ser

420 425 430

Val Ala Leu Pro Gly Cys Asn Gly Thr His Leu Cys Pro Phe Gln Val

435 440 445

Phe Lys Glu Gln Val Val Val Pro His Leu Lys Tyr Asn Phe His Ser

450 455 460

Leu Cys Ser Leu Gln Lys Thr Gln Glu Lys His Asp Glu Leu

465 470 475

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> PvPHY1-PCR-F

<400> 3

atggaagctc attttggaaa t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> PvPHY1-PCR-R

<400> 4

ttacagttca tcgtgtttct c 21

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> M13F

<400> 5

gtaaaacgac ggccagt 17

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> M13R

<400> 6

caggaaacag ctatgac 17

Claims

1.一种蜈蚣草组氨酸酸性磷酸酶基因，其特征在于，所述蜈蚣草组氨酸酸性磷酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种蜈蚣草组氨酸酸性磷酸酶蛋白，其特征在于，所述蜈蚣草组氨酸酸性磷酸酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.权利要求1所述蜈蚣草组氨酸酸性磷酸酶基因和/或权利要求2所述蜈蚣草组氨酸酸性磷酸酶蛋白在促进植物吸收磷、促进植物利用磷和/或促进植物生长的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将含有如SEQ ID NO：1所示的序列的重组表达载体导入目标植物。

5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有如SEQ ID NO：1所示的序列。

6.权利要求5所述的重组表达载体在促进植物吸收磷、促进植物利用磷和/或促进植物生长的应用。

7.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有权利要求5所述的重组表达载体。

8.权利要求7所述重组菌株在促进植物吸收磷、促进植物利用磷和/或促进植物生长的应用。