CN108588116B - 大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP35的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP35的应用，属于基因工程领域。本发明通过GmPAP35在大豆整株转化材料中的功能分析，明确了GmPAP35在植物中参与碳代谢的功能。过量表达GmPAP35能够增加大豆株高、植株体内葡萄糖和果糖含量，从而增加大豆生物量和磷吸收量，提高大豆磷效率，为培育磷高效的转基因作物新品种奠定了理论基础。本发明具有通过转基因技术促进作物碳代谢能力，从而提高植株磷效率、达到节肥高产的新用途，对发展环境友好型可持续农业具有重要的理论和实践意义。

Description

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP35的应用

技术领域

本发明涉及已知基因的新功能及其新应用。具体地，本发明涉及紫色酸性磷酸酶基因GmPAP35在促进大豆碳代谢、培育磷高效转基因豆科植物、提高作物磷效率方面的应用，属于基因工程领域。

背景技术

磷是植物生长过程中必需的营养元素之一，在植物的整个新陈代谢过程中扮演着十分重要的角色。但是，磷易被土壤中的一些金属离子固定形成难溶化合物难以被植物直接吸收和利用，往往造成土壤有效磷缺乏，严重限制了作物的生长(Raghothama,1999；Vance et al.,2003)。在长期的进化过程中，植物发展了许多适应机制提高土壤中磷的利用，包括根系形态构型的改变、体内和外分泌的酸性磷酸酶活性的变化、根际微生物共生等(Wang et al.,2010)。其中，酸性磷酸酶是植物体和土壤中普遍存在的一种非常重要的水解酶，由能够水解磷酸单酯键释放出无机态磷的水解酶类组成，酸性磷酸酶也是一种诱导酶，在磷饥饿条件下，植物根系分泌酸性磷酸酶能够水解土壤中的有机磷供植物生长(delPozo et al.,1999；Hunter and McManus,1999；Wasaki et al.,1999；Hegeman andGrabau,2001)；另一方面，在植物体内，酸性磷酸酶在有机磷的代谢及再利用过程中也起着十分重要的作用，其活性的强弱直接影响着植物体内有机磷的有效性。

紫色酸性磷酸酶的研究大多集中在其与磷营养的关系上。在低磷胁迫下，一些紫色酸性磷酸酶基因表达增强在大豆、截型苜蓿、拟南芥和番茄等植物上均有报道(Hegemanand Grabau,2001；Bozzo et al.,2004；Xiao et al.,2006；Wang et al.,2011)。在拟南芥上，已有29个紫色酸性磷酸酶基因被鉴定(Li et al.,2002)。其中，来自拟南芥的紫色酸性磷酸酶AtPAP15具有较强的植酸酶活性，能促进肌醇六磷酸盐的水解产生水溶性磷酸盐(Zhang et al.,2008)。Wang等(2009)在大豆中过量表达AtPAP15，并利用外分泌的信号肽促使AtPAP15在根际的分泌增强，从而提高了大豆磷吸收效率和产量潜力。Liang等分析了5个菜豆紫色磷酸酶基因，发现都对低磷胁迫有响应，其中PvPAP1和PvPAP3可能参与胞外dNTPs的利用(Liang et al.,2012)。也有研究发现，酸性磷酸酶在拟南芥中通过从老叶中重新活化有机磷来提高植物对磷的利用效率，其直接参与了磷的代谢运转过程，对植物适应低磷胁迫具有重要作用(Hurley et al.2010)。

拟南芥中一共有29个紫色酸性磷酸酶基因被鉴定(Li et al.,2002)。Sun等(Sunet al.,2012)对拟南芥紫色酸性磷酸酶基因AtPAP2的研究，首次报道了紫色酸性磷酸酶还参与调节了植物体的碳(C)代谢过程。这是对紫色酸性磷酸酶功能研究的新发现。该基因具有独特的C-端疏水结构域，并双向通过C端的疏水尾巴靶向质体和线粒体，过量表达AtPAP2的转基因植株，使得拟南芥植株的抽薹提前，并显著提高了产量。分析其代谢过程发现，AtPAP2转基因植物地上部的糖类和三羧酸(TCA)代谢物含量明显增多。将AtPAP2转入亚麻里，与拟南芥相似，不仅表现出侧枝增加，提早开花，产量显著增加，蔗糖磷酸合酶活性等也是显著上调(Zhang et al.,2012)。

在大豆上，目前共鉴定了35个紫色酸性磷酸酶基因家族成员，其中，有23个基因受磷饥饿特异诱导或增强表达(Li et al.,2012)。同源比对发现，GmPAP35是大豆中与AtPAP2同源性最高的基因。并且，GmPAP35也有信号肽和独特的C端疏水结构域，其中C端疏水结构域与AtPAP2的C端疏水结构域也高度相似。然而，所不同的是，AtPAP2的表达不受低磷诱导，而GmPAP35的表达受低磷诱导，那么，GmPAP35是否能够参与大豆体内的碳代谢，从而促进大豆生长，还未见报道。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP35的应用。GmPAP35是一个耐低磷胁迫重要基因。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP35在促进大豆碳代谢方面的应用。

本发明还提供一种大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP35在培育磷高效转基因豆科植物、提高作物磷效率以及提高作物产量方面的应用。

所述的作物为大豆。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了转化获得过量表达GmPAP35的整株转基因大豆株系，比较研究了低磷条件下，过量表达GmPAP35的转基因株系与野生型大豆的磷含量、糖含量及生长表型。

在低磷条件下，本发明所述基因的过量表达大豆转基因植株的株高、总根长、葡萄糖、果糖、磷含量及生物量均显著高于野生型大豆。

本发明通过GmPAP35在大豆整株转化材料中的功能分析，明确了GmPAP35在植物中参与碳代谢的功能，为培育磷高效的转基因作物新品种奠定了理论基础，具有节肥高产的新用途，对发展环境友好型可持续农业具有重要的实践意义。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP35具有调控大豆碳代谢的新功能。过量表达GmPAP35能够增加大豆株高、植株体内葡萄糖和果糖含量，从而增加大豆生物量和磷吸收量，提高大豆磷效率。本发明具有通过转基因技术促进作物碳代谢能力，从而提高植株磷效率、达到节肥高产的新用途，对发展环境友好型可持续农业具有重要的理论和实践意义。

附图说明

图1是GmPAP35基因表达模式分析。

图2是过量表达GmPAP35转基因植株中GmPAP35表达的RNA水平检测。

图3是过量表达GmPAP35转基因植株中GmPAP35表达的蛋白水平检测。

图4是低磷条件下过量表达GmPAP35对转基因大豆株高和总根长的影响。

图5是低磷条件下过量表达GmPAP35对转基因大豆植株蔗糖、葡萄糖、果糖含量的影响。

图6是低磷条件下过量表达GmPAP35对转基因大豆植株生物量及磷含量的影响。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1GmPAP35基因表达模式分析

通过定量PCR技术，确定GmPAP35基因是受低磷诱导强表达的基因。GmPAP35基因的开放阅读框长度为1989bp，编码662个氨基酸的蛋白。

植物材料采用温室营养液水培种植，首先选择籽粒饱满种皮完整的种子，用氯气熏蒸法(100mL次氯酸钠+4mL浓HCl)给种子消毒13.5hrs后，采用卷纸筒法萌发种子。待子叶完全展开后，将长势健康一致的种苗移至pH 5.8左右的大豆全营养液中，两周后，当种苗长出第一片完整的三出复叶时进行磷水平的处理。磷处理包括低磷(5μM)(LP)和高磷(500μM)(HP)。收获磷处理后第3、6、12小时，以及3、6、12天的新叶(YL)、老叶(OL)和根部(R)样品，并抽取相应部位的RNA，反转录成cDNA，进一步用定量PCR检测GmPAP35的表达模式，比较分析GmPAP35受短期和长期磷胁迫诱导的情况。大豆的看家基因EF-1a作为内参。

大豆EF-1a基因的引物为：

EF-1a F：5′-TGCAAAGGAGGCTGCTAACT-3′(SEQ ID NO:1)

EF-1a R：5′-CAGCATCACCGTTCTTCAAA-3′(SEQ ID NO:2)

GmPAP35基因的引物为：

GmPAP35 F：5′-TGTGAGATTTCCACTCGTTT-3′(SEQ ID NO:3)

GmPAP35 R：5′-GTGTATGGTCTCATCCAACA-3′(SEQ ID NO:4)

定量PCR反应程序及条件为：

将RNA样品反转所得cDNA稀释50倍作为定量PCR反应模板。选取适量cDNA原液做梯度稀释为标准曲线的模板。试验中采用20μL反应体系，包括：10μL的2×SYBR Green PCRmaster mix，各0.6μL的10μM正反向引物，2μL稀释的cDNA，最后用Mili-Q水补至20μL。反应条件为95℃变性1分钟，然后94℃裂解15秒，60℃结合15秒，72℃延伸30秒并进行40次循环。用Rotor-Gene的Real-Time Analysis Software 6.0计算每个样品的表达量。

图1为GmPAP35基因时空表达模式分析。图中数据是四次生物学重复的平均值和标准误，星号(＊)代表相对表达量在HP和LP处理之间差异显著。结果表明：GmPAP35主要受低磷长期诱导增强表达，尤其是在根部，长期低磷诱导12天时表达量最高，且低磷处理的表达量远高于高磷处理。这些结果暗示，GmPAP35在植株体内的磷代谢中起重要作用。

实施例2GmPAP35基因的克隆

以大豆叶部cDNA为模板，用上游特异引物5′-CTCGAGATGATTCCCGATCTACCCCTC-3′(SEQ ID NO:5)和下游特异引物5′-ACTAGTTCAAGTTTCCTCAGTCTTCAC-3′(SEQ ID NO:6)扩增GmPAP35基因的ORF全长序列1989bp，并测序比对，获得GmPAP35编码序列见Glyma20g03260.1，对应的蛋白序列见Glyma20g03260.1。

实施例3过量表达GmPAP35载体构建

过量表达载体的构建：以大豆叶部cDNA为模板，用上游特异引物5′-CTCGAGATGATTCCCGATCTACCCCTC-3′(SEQ ID NO:5)和下游特异引物5′-ACTAGTTCAAGTTTCCTCAGTCTTCAC-3′(SEQ ID NO:6)扩增GmPAP35基因的ORF全长序列1989bp，PCR片段回收测序无误后，通过Xho I和Spe I对片段及目的载体进行双酶切后，将GmPAP35基因连接到目的载体pTF101.1。

实施例4大豆转基因植株的获得

将构建好的过量表达载体转化至根癌农杆菌EHA101中，采用根癌农杆菌介导的大豆子叶节整株转化方法获得整株转基因植株(Wang et al.,2009)，后续的表型鉴定均使用转基因株系。

实施例5大豆转基因植株的检测

一方面进行除草剂筛选：在转基因植株上选取刚刚完全展开的三出复叶中的一片，一半用记号笔作标记，另一半用棉签蘸取稀释好的除草剂(

产自法国)涂抹在叶片的正面，2～3d后观察叶片变化。如果叶片发生失绿、变黄，枯萎或者有黄色斑点产生则说明该植株不抗除草剂，为阴性的非转基因材料；如果叶片没有发生变化，说明其植株内有除草剂抗性可能为阳性植株。

另一方面采取单个转化事件样品并提取RNA，反转录成cDNA，进一步用定量PCR检测过量表达的效果，定量PCR试验中以大豆看家基因如上所述EF-1a为参照基因(引物序列：SEQ ID NO:1，2)，相对表达量为目的基因GmPAP35(引物序列：SEQ ID NO:3，4)的表达量与看家基因表达量的比值。经过定量PCR确认得到有效的不同转基因株系。图2为过量表达GmPAP35转基因植株的表达量检测。HN66和HN68表示野生型对照(HN66和HN68均在文献“Acomparison study of Agrobacterium-mediated transformation methods for root-specific promoter analysis in soybean.Plant Cell Rep(2014)33:1921-1932”中公开)；OE1和OE2表示过量表达GmPAP35的转基因植株，转化起始材料为HN66；OE3和OE4表示过量表达GmPAP35的转基因植株，转化起始材料为HN68。LP表示5μM P，HP表示250μM P。试验数据是四个生物学重复的平均值和标准误。星号(＊)代表在同一磷水平下野生型和过量表达植株之间差异显著。图2结果显示，与野生型相比，在低磷条件下，除OE4以外，各个转基因株系叶部过表达效果都较好。

此外，利用SDS凝胶电泳和Western blot检测分析了转基因株系蛋白水平表达情况，如图3所示，OE1、OE2、OE3、OE4这4个转基因株系蛋白水平过表达效果均较好。

实施例6过量表达GmPAP35对转基因大豆株高和总根长的影响

经过抗性基因的检测及定量PCR确认得到有效的不同转基因株系，进行砂培实验。设置一个低磷(LP：5μM KH₂PO₄)处理。实验选用棕色塑料圆盆，每盆装入石英砂1.8kg。用200mL相应LP 1/2Hoagland营养液浇透，每盆点播3粒种子(所有种子尽量选取同一时期、同一环境繁出)，随机区组排列，出苗1周后间苗，每盆保留1株。每一周浇1/2Hoagland营养液一次，常规管理。每个处理设置4个生物学重复。实验在科技楼九楼温室内进行，种植35天后收获不同转基因株系并测定相关生理指标，包括：株高，总根长，蔗糖、葡萄糖、果糖含量，生物量，磷含量等。

图4为过量表达GmPAP35对转基因大豆株高和总根长的影响。其中，A：株高；B：总根长。大豆转基因植株进行低磷(5μM KH₂PO₄)处理35天。HN66和HN68表示野生型对照；OE1和OE2表示过量表达GmPAP35的转基因植株，转化起始材料为HN66；OE3和OE4表示过量表达GmPAP35的转基因植株，转化起始材料为HN68。试验数据是四个生物学重复的平均值和标准误。星号(＊)表示同一性状在OE株系与对照野生型株系之间的差异显著。结果显示：与野生型比较，以HN66起始的转基因株系：OE1株高显著增加；而以HN68起始的转基因株系，与野生型比较，OE3、OE4株高均显著增加。同时，过量表达GmPAP35均显著促进根系生长，与野生型相比，过量表达GmPAP35转基因株系总根长均显著增加。

实施例7过量表达GmPAP35对转基因大豆植株葡萄糖、果糖和蔗糖含量的影响

取0.1g植株地上部干样于研钵中，加入2mL 90％(v/v)乙醇，研磨成匀浆，转入10mL离心管，2mL 90％(v/v)乙醇重复清洗研钵2次，80℃水浴20min后4000rpm离心10min，上清转入15mL玻璃试管，残渣用4mL的90％(v/v)乙醇重复清洗80℃水浴20min后4000rpm离心10min，合并上清液，上清液在

(Labconoco，MO，USA)旋转蒸发系统中55℃3小时蒸干，加入2mL超纯水，涡旋1min，转入2mL离心管-20℃冷藏，使用时解冻后13,000rpm离心10min，上清液过Sep-Pak 1cc(100mg)C18Cartridges后待测。

使用Angilent 1200HPLC system(Agilent Technologies,Waldbronn,Germany)，配有四元泵、视差检测器RID(G1362A)、柱温箱、自动进样器，使用Coregel 87C(Transgenomic CHO-99-5860)色谱柱，流动相为纯水，流速0.6mL/min，柱温80℃，进样量10uL，停止时间30min。购买分析纯的蔗糖、葡萄糖、果糖、白坚木皮醇做标准样，确定出峰时间和制定标准曲线。

图5为过量表达GmPAP35对转基因大豆植株蔗糖、葡萄糖、果糖含量的影响。其中，A：蔗糖；B：葡萄糖；C：果糖。大豆转基因植株进行低磷(5μM KH₂PO₄)处理35天。HN66和HN68表示野生型对照；OE1和OE2表示过量表达GmPAP35的转基因植株，转化起始材料为HN66；OE3和OE4表示过量表达GmPAP35的转基因植株，转化起始材料为HN68。试验数据是四个生物学重复的平均值和标准误。星号(＊)表示同一性状在OE株系与对照野生型株系之间差异显著。结果显示：过表达GmPAP35显著增加转基因株系叶部葡萄糖和果糖含量，然而，除OE1以外，显著降低了转基因株系叶部蔗糖含量。

实施例8过量表达GmPAP35对转基因大豆植株生物量和磷含量的影响

植株生物量测定：百分之一天平称量地上部和根部样品干重，所有样品在105℃烘箱杀青30分钟后置于75℃烘干至恒重，称取干重。

植株磷测定：植株磷含量采用连续流动分析仪(型号为SAN++，产自荷兰)测定，首先称取植株样品0.2g左右，加入5mL浓硫酸消解后用蒸馏水定容致50mL，并将样品稀释4倍制成待测液。待测液流经流动分析仪后将比色信号输入电脑，并由Flow Access软件计算结果。

图6为过量表达GmPAP35对转基因大豆生物量和磷含量的影响。其中，A：生物量；B：磷含量。大豆转基因植株进行低磷(5μM KH₂PO₄)处理35天。HN66和HN68表示野生型对照；OE1和OE2表示过量表达GmPAP35的转基因植株，转化起始材料为HN66；OE3和OE4表示过量表达GmPAP35的转基因植株，转化起始材料为HN68。试验数据是四个生物学重复的平均值和标准误。星号(＊)表示同一性状在OE株系与对照野生型株系之间差异显著。结果显示：过表达GmPAP35均显著促进了转基因大豆植株生长和磷吸收，与野生型相比，转基因植株生物量和磷含量显著增加。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP35的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> EF-1a F

<400> 1

tgcaaaggag gctgctaact 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> EF-1a R

<400> 2

cagcatcacc gttcttcaaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GmPAP35 F

<400> 3

tgtgagattt ccactcgttt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GmPAP35 R

<400> 4

gtgtatggtc tcatccaaca 20

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcgagatga ttcccgatct acccctc 27

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actagttcaa gtttcctcag tcttcac 27

Claims (3)

1.大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP35在促进大豆碳代谢方面的应用，其特征在于：与野生型大豆相比，过量表达GmPAP35的转基因大豆显著增加了株高、总根长、植株体内葡萄糖和果糖含量；

所述的大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP35编码的蛋白序列如Glyma20g03260.1所示。

2.大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP35在培育磷高效转基因豆科植物、提高作物磷效率和/或提高作物产量方面的应用，其特征在于：与野生型大豆相比，过量表达GmPAP35的转基因大豆显著增加了株高、总根长、植株体内葡萄糖和果糖含量；

所述的大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP35编码的蛋白序列如Glyma20g03260.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：与野生型大豆相比，过量表达GmPAP35的转基因大豆显著促进了植株生长，增加了磷含量和生物量。

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