CN101475960B - 基因AtPAP15在提高大豆植株有机磷吸收利用方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基因AtPAP15及其在提高大豆植株有机磷吸收利用方面的应用。本发明通过PCR方法，扩增出AtPAP15基因(At3g07130)的全长cDNA区，并加入来自胡萝卜的信号肽，由强启动子35S驱动，连接到超量表达载体pTF101.1上，进行遗传转化，使其在转基因大豆中超量表达。在转基因大豆T₂代和T₃代植株中发现，AtPAP15的过量表达提高了大豆获取砂培中植酸磷的能力和体内有机磷的再利用能力，进而增加了转基因大豆的生物量和磷吸收量。

Description

基因AtPAP15在提高大豆植株有机磷吸收利用方面的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种紫色酸性磷酸酶基因AtPAP15在提高大豆植株有机磷吸收利用方面的应用。 

背景技术

大豆(Glycine max)是我国重要的粮食和油料作物。在几种主要粮食作物中，大豆蛋白质含量最高，是水稻的4.6倍、小麦的近3倍，所以大豆是人类理想的植物蛋白来源(王文真等，1998)。在农业生产方面，大豆根系具有生物固氮能力，能够培肥地力、改良土壤结构、肥地养地。因此，发展大豆生产对改善我国人民的食物结构，满足市场对植物蛋白、油脂的需求，发展畜牧业、食品业，及保护生态环境都具有十分重要的意义。但大豆生产往往会受到许多生物和非生物胁迫的影响，产量很不稳定。尤其是在我国华南地区酸性红壤上，缺磷和铝毒是限制大豆生产的主要障碍因子(Liao et al，2006)。磷是植物能量代谢中的重要物质，也是核酸和生物膜的重要组成成分(Guo et al，2008)。因此，磷是植物正常生长和发育的必需营养元素之一。然而，大部分土壤中磷的有效性较低，不能满足作物生长的需求。增施磷肥可以促进作物生长，提高产量。但增施的磷肥中只有10～20％的磷被当季作物吸收利用(Holford，1997)，其余大部分被土壤中的有机物或铁铝的氧化胶膜所固定转变为不易被植物吸收利用的无机磷或有机磷(Raghothama，1999)。土壤中有50～80％的磷是 以有机磷的形式存在(Turner et al，2002)，其中，难以被作物利用的植酸磷(多为盐的形式)大约占土壤有机磷的60％(Iyamuremye etal，1996)。然而，无机磷酸根离子是植物直接吸收磷的主要形式，这些有机磷只有在磷酸酶的作用下矿化分解，释放出无机磷后才能被吸收利用(Gilbert et al，1999)。 

因此，通过转基因方法改良作物合成分泌植酸酶的能力，是有效地提高作物吸收利用土壤有机磷、解决限制大豆生产中缺磷这一主要障碍因子的潜在途径(孔凡利等，2006)。 

植物酸性磷酸酶基因和来源于真菌的植酸酶基因或人工合成的植酸酶基因都有增加土壤中磷吸收的潜力(Xiao et al，2006)。其中，植酸酶基因研究的主要目的还是利用植物生产植酸酶作为动物饲料添加剂，改善动物对饲料中植酸磷的利用。尽管有很多关于转植酸酶基因植物的报道，但这些研究多是使植酸酶在子叶和种子中表达，来帮助动物消化吸收利用饲料中的植酸磷(Ponstein et al，2002)。 

有关利用转植酸酶基因植物分泌植酸酶到根际中来利用介质中植酸磷的报道并不多见(Richardson et al，2001a；Mudge et al，2003；George et al，2004)，且多是利用真菌的植酸酶基因，利用来源于植物的植酸酶基因提高磷吸收的研究鲜有报道(Xiao et al，2007)。酸性磷酸酶同样参与了土壤有机磷的水解，释放出可溶性磷供植物吸收。而利用来源于植物的酸性磷酸酶基因提高植物吸收和利用植酸磷能力的报道更加少见(Xiao et al，2006)，转基因大豆在这方面的研究还未见报道。并且，考虑到转基因产品的发展，转基因 安全评价条例以及市场的接受度，研究能提高植物吸收和利用植酸磷能力的来源于植物本身的基因更加重要和迫切。 

紫色酸性磷酸酶作为一种多功能的酶，在正常磷和缺磷条件下均对植物生长和发育起着重要的作用(Zhu et al，2005)。到目前为止，在拟南芥上已有29个紫色酸性磷酸酶基因被鉴定(Li et al，2002)。其中，Hegeman和Grabau(2001)发现大豆的一个植酸酶基因GmPhy与拟南芥的AtPAP15有74.1％的相似性，预示着AtPAP15具有植酸酶活性。Zhang等(2008)通过体内和体外的酶活性评价进一步证明AtPAP15具有较强的植酸酶活性，能促进肌醇六磷酸盐的水解产生肌醇和水溶性磷酸盐，并且在根部的表达量最高。此外，有研究表明拟南芥不能利用植酸盐中的磷主要是由于缺乏细胞外植酸酶活性(Richardson et al，2001b)。 

上述研究尚停留在理论研究AtPAP15具有较强的植酸酶活性阶段，目前并无关于AtPAP15在大豆中表达并提高大豆植株对有机磷的活化、吸收和利用的具体技术方案的相关技术报道。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供基因AtPAP15在提高大豆植株有机磷吸收利用方面的应用。 

本发明的另一个目的是提供所述基因AtPAP15在大豆植株中的表达方法。 

本发明的目的通过以下技术方案来予以实现： 

本发明提供了基因AtPAP15在提高大豆植株有机磷吸收利用效率方面的应用。 

所述应用是在大豆中超量表达编码紫色酸性磷酸酶的基因AtPAP15。 

所述紫色酸性磷酸酶基因AtPAP15是从TAIR(The ArabidopsisInformation Resource)网站上获得的全长cDNA序列(Locus：At3g07130)。该基因全长cDNA为1676bp，编码532个氨基酸，包括6个外显子和5个内含子。通过PCR方法，扩增出AtPAP15基因的编码区，并融合来自于胡萝卜的信号肽(Lung et al.，2005)，由强启动子35S驱动，连接到超量表达载体pTF101.1上。再进行遗传转化，在大豆品种粤春03-3中，超量表达这个基因，得到超量表达植株。在转基因T₂和T₃代植株中发现，阳性植株的吸磷量和生物量都显著高于阴性植株。 

实现所述应用的表达方法包括以下步骤： 

(1)以AtPAP15的基因组片段作为应用基因，设计引物，扩增出AtPAP15基因的编码区，并融合来自于胡萝卜的信号肽(Lung et al.，2005)，由强启动子35S驱动，连接到超量表达载体pTF101.1上； 

(2)进行遗传转化，在大豆中超量表达所述基因，得到超量表达大豆植株。 

步骤(1)所述引物为： 

左端引物(5’-3’)： 

ATGACGTTTCTACTACTTCTAC； 

右端引物(5’-3’)： 

TTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCAATGGTTAACAAGGCGGT。 

所述大豆品种选用粤春03-3。采用根癌农杆菌EHA101介导的大豆子叶节转化方法，在大豆品种粤春03-3中，超量表达AtPAP15基因，得到超量表达AtPAP15的大豆植株。遗传转化包括以下步骤： 

(1)种子消毒和种子萌发； 

(2)根癌农杆菌EHA101菌液制备； 

(3)外植体制备及转化程序； 

(4)侵染与共培养； 

(5)幼芽的诱导、伸长 

(6)幼芽生根，得到转基因单株T₀代植株。 

选择超表达的植株，进行繁种，得到转基因后代植株。 

本发明不仅优化了受体大豆品种，而且在遗传转化过程中，对种子灭菌时间、抑菌剂种类及配比也进行了优化，例如： 

上述步骤(1)所述种子消毒包括以下步骤： 

(1)将大豆种子单层排列在培养皿中，培养皿置于干燥器内，打开培养皿盖子，干燥器内同时放置一个烧杯，向烧杯中加入次氯酸钠溶液，并缓缓加入HCl溶液，盖上干燥器盖子，静置过夜； 

(2)盖上培养皿并将其放到层流净化罩中后将培养皿打开，除去过多的氯气。 

所述HCl溶液浓度为12N，加入量按照次氯酸钠与HCl溶液的体积比为100mL∶4.2mL。 

所述静置过夜时间为13.5小时。 

上述步骤(5)所述幼芽诱导和伸长包括以下步骤： 

(1)外植体共培养后，用加有glufosinate作为筛选剂，特美汀和头孢霉素作为抑菌剂的液体幼芽诱导培养基(SI)浸洗，之后，将外植体放在SI固体培养基上。14天后，在形成中的节的部位齐平地切去子叶下胚轴。将新鲜的切口表面插入至新的SI固体培养基中，在培养箱中继续诱导14天。 

(2)将分化的外植体转移到新鲜的加有glufosinate(Glufosinate，草铵膦或草丁膦)作为筛选剂，特美汀和头孢霉素作为抑菌剂的SE培养基上。每隔2周换一次新鲜的SE培养基。 

所述抑菌剂为100mg/L特美汀和200mg/L头孢霉素。 

本发明构建了AtPAP15过量表达载体，并在AtPAP15前加入了来源于胡萝卜的信号肽，成功引导AtPAP15诱导产生的紫色酸性磷酸酶在细胞壁分泌，在大豆中超量表达了编码紫色酸性磷酸酶的AtPAP15基因，转AtPAP15基因植株显著提高了对有机磷的活化、吸收和利用，研究结果对培育磷高效大豆新品种具有重要的意义，在生产上具有较大的应用前景。 

本发明的有益效果概括如下： 

 (1)本发明提供了一种拟南芥紫色酸性磷酸酶基因AtPAP15的应用。在大豆品种粤春03-3中超量表达编码紫色酸性磷酸酶的基因AtPAP15后，在植酸磷作为唯一磷源的砂培条件下，转基因大豆植株根部酸性磷酸酶活性比其对应的野生型对照大豆提高了42.21～81.44％；根系分泌的植酸酶活性比其对应的野生型对照大豆提高了50.11～159.32％；转基因大豆植株磷吸收量比其对应的野生型对照大豆提高了18.19～90.08％；转基因大豆植株生物量比其对应的野生型对照大豆提高了56.45～117.78％。 

(2)通过与来自于胡萝卜的信号肽(Lung et al.，2005)融合，可以引导AtPAP15诱导产生的酸性磷酸酶在根部分泌，并藉此分解根外环境的有机磷而释放可被植物直接吸收利用的无机磷，从而提高大豆的生长。这是一项能有助于减少对环境构成威胁的磷肥的使用、并对国家未来可持续农业发展提供有利支持的新技术。 

(3)本发明首次在大豆中超量表达一个影响有机磷吸收利用效率的基因AtPAP15，为培育大豆磷高效品种提供了新的思路，也为其它作物利用转基因方法提高养分效率提供了技术支持。 

(4)本发明中应用的基因可以为大豆等豆科作物以及其它作物的养分高效研究提供理论支持。 

附图说明

图1超表达转化载体的结构示意图 

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例来进一步详细说明本发明。本发明在实施例中描述了分离AtPAP15基因，遗传转化，以及酸性磷酸酶活性、植酸酶活性、吸磷量和生物量的测定方法和所述基因在大豆中的表达模式，但并不因此将本发明精神和范围限定于具体的实施例中。 

实施例1超量表达转化载体的构建 

从TAIR(The Arabidopsis Information Resource)上获得编码紫色酸性磷酸酶基因AtPAP15的全长cDNA序列(Locus：At3g07130)。该基因全长cDNA为1676bp，编码532个氨基酸，包括6个外显子和5个内含子。 

根据基因AtPAP15的已知全长cDNA序列设计引物，以拟南芥cDNA为模板，扩增得到包括该基因全长编码区的1599bp片段，并融合来自于胡萝卜的信号肽(Lung et al.，2005)，由强启动子35S驱动，连接到超量表达载体pTF101.1(美国依阿华州立大学转基因中心王凯博士惠赠，Paz et al，2004)上，然后再用设计的引物对得到的克隆进行测序，确定基因按正确的方向连接到pTF101.1载体上。pTF101.1载体包含除草剂的筛选基因，见附图1，其中1表示左边界，2表示NOS终止子，3表示Bar基因，4表示35S启动子，5表示35S启动子，6表示胡萝卜信号肽，7表示AtPAP15基因，8表示NOS终止子，9表示右边界。由附图1可见AtPAP15基因被35S启动子超表达。 

左端引物(5’-3’)： 

ATGACGTTTCTACTACTTCTAC 

右端引物(5’-3’)： 

TTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCAATGGTTAACAAGGCGGT 

实施例2超量表达AtPAP15的转基因实验 

包含编码紫色酸性磷酸酶的AtPAP15基因片段连接到载体 pTF101.1上后，采用转基因的方法，得到转基因的大豆植株，本发明所述的转基因方法具体步骤如下： 

将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌介导大豆子叶节遗传转化体系导入到大豆品种粤春03-3中，经过种子萌发、子叶节侵染、共培养、幼芽诱导和幼芽伸长等过程，具有除草剂抗性的幼芽伸长、生根、练苗移栽，得到转基因植株。 

所述农杆菌(EHA101)介导的大豆遗传转化体系主要参考Paz等人报道的方法(参见：Assessment of conditiohs affectingAgrobacterium-mediated soybean transformation using thecotyledonary node explants，2004，Euphytica，136：167-179)。本试验过程中，在种子灭菌时间，抑菌剂种类及配比，受体大豆品种等方面进行了优化。 

本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述： 

(1)试剂 

本发明中培养基所用到的试剂和溶液及缩写表示如下： 

6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；ZR(Trans-Zeatin Riboside，玉米素核苷)；NAA(Napthalene aceticacid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；GA₃(Gibberellic acid，赤霉素)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；DTT(DL-Dithiothreitol，二硫苏糖醇)；Glufosinate(Glufosinate-ammonium，除草剂)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide， 二甲基亚砜)；B5max(B5大量元素成分溶液)；B5mix(B5微量元素成分溶液)；B5vit(B5维生素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液) 

(2)溶液配方 

1)B5培养基大量元素母液(按照20倍浓缩液(20X)配制)： 

硝酸钾(KNO₃)                 50.00克 

磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)    3.00克 

硫酸铵((NH₄)₂SO₄)            2.68克 

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)          5.00克 

氯化钙(CaCl₂·2H₂O)          3.00克 

将上述试剂逐一溶解，然后用蒸馏水定容至1000毫升。 

2)B5培养基微量元素母液(按照200倍浓缩液(200X)配制 

碘化钾(KI)                   0.15克 

硼酸(H₃BO₃)                  0.60克 

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)          2.00克 

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)          0.40克 

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)        0.05克 

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)          0.005克 

氯化钴(CoCl₂·6H₂O)          0.005克 

将上述试剂在20～25℃下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。 

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制) 

将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78克FeSO₄·7H₂O 分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。 

4)B5维生素贮存液(按照100X浓缩液配制) 

烟酸(Nicotinic acid)        0.01克 

维生素B1(Thiamine HCl)      0.10克 

维生素B6(Pyridoxine HCl)    0.01克 

肌醇(Inositol)              1.00克 

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。 

5)MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照20X浓缩液配制) 

硝酸铵(NH₄NO₃)              33.0克 

硝酸钾(KNO₃)                38.0克 

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)          3.4克 

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)         7.4克 

氯化钙(CaCl₂·2H₂O)         8.8克 

将上述试剂在20～25℃温度下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。 

6)MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照200X浓缩液配制) 

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)        4.46克 

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)        1.72克 

硼酸(H₃BO₃)                1.24克 

碘化钾(KI)                 0.166克 

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)      0.05克 

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)        0.005克 

氯化钴(CoCl₂·6H₂O)    0.005克 

将上述试剂在20～25℃温度下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。 

7)主要抗生素配方 

100mg/mL氨苄青霉素贮备液：1克氨苄青霉素+10mL双蒸水，过滤灭菌，-20℃保存； 

50mg/mL卡那霉素贮备液：0.5克卡那霉素+10mL双蒸水，过滤灭菌，-20℃保存； 

50mg/mL氯霉素贮备液：0.5克氯霉素+10mL 80％乙醇，过滤灭菌，-20℃保存； 

100mg/mL壮观霉素贮备液：1克壮观霉素+10mL双蒸水，过滤灭菌，-20℃保存； 

200mg/mL特美汀贮备液：1.6克特美汀+8mL双蒸水，过滤灭菌，4℃保存； 

250mg/mL头孢霉素贮备液：0.5克头孢霉素+2mL双蒸水，过滤灭菌，-20℃保存。 

8)主要激素、氨基酸和筛选剂配方 

1mg/mL GA₃贮备液：0.0125克GA3+0.25mL 1N NaOH+12.25mL双蒸水，过滤灭菌，4℃保存； 

1mg/mL 6-BA贮备液：0.0125克6-BA+0.25mL 1N NaOH+12.25mL双蒸水，过滤灭菌，4℃保存； 

1mg/mL吲哚乙酸IAA贮备液：0.0125克IAA+0.25mL 1N NaOH+12.25mL双蒸水，过滤灭菌，4℃保存； 

0.5mg/mL NAA贮备液：0.005克NAA+0.2mLNaOH+9.8mL双蒸水，过滤灭菌，4℃保存； 

1mg/mL玉米素核苷贮备液：10毫克玉米素+10mL双蒸水，过滤灭菌，-20℃保存； 

10mg/mL天门冬酰胺贮备液：0.5克天门冬酰胺+50mL双蒸水，过滤灭菌，4℃保存； 

10mg/mL谷氨酰胺贮备液：0.5克谷氨酰胺+50mL双蒸水，过滤灭菌，4℃保存； 

1mg/mL除草剂贮备液：0.025克Glufosinate+25mL双蒸水，过滤灭菌，4℃保存。 

(3)用于大豆遗传转化的培养基配方 

1)种子萌发培养基 

B5max母液(取已经制备好的20X浓缩液，下同)        50毫升 

B5mix母液(取已经制备好的200X浓缩液，下同)       5毫升 

Fe²⁺EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)  10毫升 

维生素贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)    10毫升 

蔗糖                                            20克 

Phytagel                                        3克 

加蒸馏水至1000毫升，1N氢氧化钠调节pH值到5.8，高压灭菌，121℃下灭菌20分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同。 

2)共培养基 

B5max母液(20X)                    5毫升 

B5mix母液(200X)                   0.5毫升 

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)              1毫升 

蔗糖                              30克 

MES                               3.9克 

BBL Agar                          5克 

加蒸馏水至985毫升，1N氢氧化钠调节pH值到5.4，高压灭菌培养基降温至50℃时加入已过滤灭菌的10毫升维生素贮存液(100X)，0.25毫升GA₃(1毫克/毫升)，1.67毫升6-BA(1毫克/毫升)，400毫克半胱氨酸胺，154.2毫克二硫苏糖醇和40毫克AS，混匀后分装倒入培养皿中。 

3)幼芽诱导培养基 

B5max母液(20X)                    50毫升 

B5mix母液(200X)                   5毫升 

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)              10毫升 

蔗糖                              30克 

MES                               0.59克 

Phytagel                          3克 

加蒸馏水至985毫升，1N氢氧化钠调节pH值到5.7，高压灭菌。培养基降温至50℃时加入已过滤灭菌的10毫升维生素贮存液(100X)，1.67毫升6-BA贮存液(1毫克/毫升)，0.5毫升特美汀贮存液(200毫克/毫升)，0.8毫升头孢霉素贮存液(250毫克/毫 升)和5.0毫升除草剂贮存液(1毫克/毫升)，混匀后分装倒入培养皿中。 

4)幼芽伸长培养基 

MSmax母液(20X)                    50毫升 

MSmix母液(200X)                   5毫升 

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)              10毫升 

蔗糖                              30克 

MES                               0.59克 

Phytagel                          3克 

加蒸馏水至975毫升，1N氢氧化钠调节pH值到5.7，高压灭菌。培养基降温至50℃时加入已过滤灭菌的10毫升维生素贮存液(100X)，5毫升天门冬酰胺贮存液(10毫克/毫升)，5毫升谷氨酰胺贮存液(10毫克/毫升)，0.1毫升IAA贮存液(1毫克/毫升)，0.5毫升GA₃贮存液(1毫克/毫升)，1毫升玉米素核苷贮存液(1毫克/毫升)，0.5毫升特美汀贮存液(200毫克/毫升)，0.8毫升头孢霉素贮存液(250毫克/毫升)和2.5毫升除草剂贮存液(1毫克/毫升)，混匀后分装倒入培养皿中。 

5)生根培养基 

B5max母液(20X)                    25毫升 

B5mix母液(200X)                   2.5毫升 

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)              5毫升 

B5维生素贮存液(100X)              10毫升 

NAA贮存液(0.5毫克/毫升)           0.4毫升 

蔗糖                              10克 

Phytagel                          6克 

加蒸馏水至1000毫升，用1N氢氧化钠调节pH值到5.8。高压灭菌后分装倒入培养瓶中。 

(4)农杆菌介导的大豆遗传转化步骤 

试验主要参考美国依阿华州立大学转基因中心的转化程序(Pazet al，2004)。本试验过程中，在种子灭菌时间，抑菌剂种类及配比，受体大豆品种等方面进行了优化。 

1)种子消毒 

种子采用干燥表面消毒。将成熟的大豆种子单层排列在培养皿中，将装有3～4个培养皿的干燥器放到通风橱中，并将所有的培养皿打开，盖子紧挨着培养皿，以保证在中间有足够的空间放置一个250mL的烧杯。在250mL烧杯中加入100mL的次氯酸钠，然后沿着杯壁缓缓加入4.2mL 12N HCl，立即盖上干燥器的盖子，静置过夜，约静置13.5小时。在氯气体中暴露整夜后，盖上培养皿并将其放到层流净化罩中，再将培养皿打开大约30min以便除去过多的氯气。 

2)种子萌发 

将10～12颗消毒后的种子种脐朝下放置在装有萌发培养基(GM)的120×25mm培养皿中。将培养皿放置在光照培养箱中培养5天(24℃，18hr光照，光强140μmoles/m²/sec)。 

3)菌液制备 

从新鲜的YEP培养基上挑取含pTF102或pTF101.1-AtPAP15的根癌农杆菌菌株EHA101的数个单克隆放入2mL添加了100mg/L壮观霉素、25mg/L氯霉素和50mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中。在摇床上(250rpm，28℃)培养菌落，生长至饱和(大约12小时)。取0.3mL饱和菌液加至装有已加相应抗生素的200mL YEP培养基的1L三角瓶中。培养菌落，过夜(250rpm，28℃)，生长至对数生长末期(OD₆₅₀＝1.0～1.2)，离心(3,500rpm，10min，室温)，收集菌落。用液体的共培养基(CM)悬浮农杆菌沉淀。使用时OD₆₅₀为1.0。 

4)外植体制备及转化程序 

种子在光照培养箱中培养5天后，检查萌发培养盒，舍弃污染的。用解剖刀刀片从根系上切下发芽的种子，切口在离子叶节区域大约0.5cm的下胚轴区域。沿着子叶下胚轴垂直剖开种子，并去除子叶上胚轴(幼芽)和轴上的茎/芽。在子叶和子叶下胚轴-子叶节区域垂直于轴切出7～8个切口(约0.5mm深，3～4mm长)。切好的外植体放入培养皿中，备用。 

5)侵染与共培养 

将30mL农杆菌菌液倒入一个25×100mm的培养皿中。每个农杆菌菌液培养皿准备50个外植体。确保整个外植体都被菌液悬浮。侵染30min，期间经常搅动菌液，以使外植体充分接触新鲜菌液。之后，将外植体转移到共培养基上，每皿7个外植体，切口向下，水平放置。用parafilm封口膜封住培养皿，并将它们转移到培养箱中(24℃)，暗培养3天。 

6)幼芽的诱导 

在共培养基上培养3天后，用液体幼芽诱导培养基(SI)浸洗外植体，之后，将外植体放在加有3.5mg/Lglufosinate作为筛选剂，100mg/L特美汀和200mg/L头孢霉素作为抑菌剂的SI培养基上(每皿7个外植体)。外植体的子叶下胚轴部分须插入培养基中，而再生组织则须与水平面成30～45°角斜插在表面。培养皿用透气胶带封口，5个培养皿一叠，培养(24℃，18/6hr的光照周期)。外植体组织在SI培养基上生长14天。在第一个星期末，重新排列每叠的培养皿以使顶部和底部调换。14天后，在形成中的节的部位齐平地切去子叶下胚轴。将新鲜的切口表面插入至新的SI培养基中，而分化区域则与培养基表面齐平。然后让组织在相同的生长条件下，在培养箱中继续诱导14天。 

7)幼芽的伸长 

将分化的外植体转移到幼芽伸长培养基(SE)上，丢弃其余的未分化的外植体。从外植体上切去子叶，并在正在发育的节的基部切一个新切口。将外植体转移到新鲜的加有2.5mg/Lg lufosinate作为筛选剂，100mg/L特美汀和200mg/L头孢霉素作为抑菌剂的SE培养基上，筛选剂和抑菌剂的加入量参照常规技术。在生长箱中培养2～8周。每隔2周换一次新鲜的SE培养基。每一次换培养基时在外植体基部切一个新鲜的水平切口。 

8)生根 

在选择压力下，幼芽生长到至少3cm长时，把它们从组织上切下 来。然后将其转移到装有生根培养基(RM)的玻璃瓶中继续培养。两周后，当茎长出多于2条根时，将植株轻轻地从培养基中取出，用自来水冲洗根部以去除培养基。将苗移植到一个装有基质的盆(直径15cm)中。苗在培养箱中生长4周(24℃，18/6hr光照强度)。每周浇Hoagland营养液一次。然后将苗转移到温室培养至结荚。 

转化大豆品种粤春03-3，得到转基因单株T₀代植株。用southern杂交检测大豆基因组中目的基因的整合，用RT-PCR检测目的基因在植物体内的表达量，Western杂交检测目的基因在蛋白水平上的表达。得到超表达的植株，并且进行繁种，得到T1和T2代转基因植株。 

实施例3超表达AtPAP15的转基因植株的功能鉴定 

测定T₂代和T₃代转基因植株体内酸性磷酸酶活性，生物量和磷吸收量，发现T₂代和T₃代转基因植株和野生型植株相比，表现出期望的表型变化，即植株体内酸性磷酸酶活性显著高于对照，生物量和磷吸收量也高于对照。证明了这个基因可以通过遗传转化来提高大豆植株对介质中有机磷吸收利用效率。 

1、酸性磷酸酶活性测定 

参照Tabatabai和Bremner(1969)酸性磷酸酶的活性测定方法，将ρ-NPP溶于45mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.0)中配成4mmol/L底物溶液，每2mL底物溶液加入约0.01mL酶液，37℃保温15min，再加入1mL NaOH(1mol/L)溶液，混匀终止反应，在405nm处测定光吸收值。以不加酶液的底物溶液中加入1mL NaOH(1mol/L)溶液作对照。 

2、蛋白浓度的测定 

取一定量的上清液加入2.5mL考马斯亮蓝G250溶液，摇匀放置2min后，在595nm下以蛋白浓度为0的溶液作空白调零，测光吸收值。再根据标准曲线算出样品的可溶性蛋白含量。蛋白质标准曲线的制作如下：取6支试管，分别加入1000μg/mL的牛血清蛋白溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL，并用双蒸水补足到1.0mL，充分摇匀后再吸取50μL加入另外6支试管，加2.5mL考马斯亮蓝G250溶液，以蛋白浓度作为横坐标，光吸收值为纵坐标做标准曲线。 

3、植酸酶活性测定 

取200μL根系分泌物，加入200μL含有1mmol/L植酸钠的45mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.0)，37℃反应1个小时，再加入400μL的10％TCA溶液，混匀终止反应，然后加入200μL显色剂(铜锑抗混合液：抗坏血酸按3∶200w/v配比)，用蒸馏水定容到2mL，显色30min后在波长700nm处比色测定反应释放出的磷的光吸收值。同时以不加根系分泌物的底物溶液反应1小时后加入10％TCA溶液作为对照。 

4、植株全磷含量测定 

地上部、根部样品用样品磨粉碎，采用干灰化，钼蓝比色法测定植株全磷含量(Murphy和Riley，1963)，测量波长为700nm。 

表1本发明克隆的AtPAP15基因转基因T₂和T₃代单株的表现 

注：图中数据是三次重复的平均值及其标准误。 

Claims (9)

1.基因AtPAP15在提高大豆植株有机磷吸收利用方面的应用，其特征在于是在大豆中超量表达编码紫色酸性磷酸酶的基因AtPAP15实现；所述AtPAP15基因编号为Locus：At3g07130，全长cDNA为1676bp，编码532个氨基酸，包括6个外显子和5个内含子。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是所述超量表达是通过PCR方法，以AtPAP15的基因组片段作为应用基因，设计引物，扩增出AtPAP15基因的全长编码区，并加入来自胡萝卜的信号肽，由强启动子35S驱动，连接到超量表达载体pTF101.1上，进行遗传转化。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征是所述引物为：左端引物(5′-3′)：

ATGACGTTTCTACTACTTCTAC；

右端引物(5′-3′)：

TTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCAATGGTTAACAAGGCGGT。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征是遗传转化包括以下步骤：

(1)种子消毒和种子萌发；

(2)根癌农杆菌EHA101菌液制备；

(3)外植体制备及转化程序；

(4)侵染与共培养；

(5)幼芽的诱导和伸长；

(6)幼芽生根，得到转基因单株T₀代植株。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征是步骤(1)所述种子消毒包括以下步骤：

(1)将大豆种子单层排列在培养皿中，培养皿置于干燥器内，打开培养皿盖子，干燥器内同时放置一个烧杯，向烧杯中加入次氯酸钠溶液，并缓缓加入HCl溶液，盖上干燥器盖子，静置过夜；

(2)盖上培养皿盖子并将培养皿放到层流净化罩中后将培养皿打开，除去过多的氯气。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征是步骤(1)所述HCl溶液浓度为12N，加入量按照次氯酸钠与HCl溶液的体积比为100mL：4.2mL。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征是步骤(1)所述静置过夜时间为13.5小时。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征是步骤(5)所述幼芽诱导和伸长包括以下步骤：

(1)外植体共培养后，用加有筛选剂和抑菌剂的液体幼芽诱导培养基浸洗；将外植体放在固体培养基上；14天后，在形成中的节的部位齐平地切去子叶下胚轴；将新鲜的切口表面插入新的固体培养基中，在培养箱中继续诱导14天；

(2)将分化的外植体转移到新鲜的幼芽伸长培养基，所述培养基加有筛选剂和抑菌剂；每隔2周换一次新鲜的培养基。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述抑菌剂为100mg/L特美汀和200mg/L头孢霉素的混合物，所述筛选剂为草铵膦。