CN101381732A

CN101381732A - 基因OsGS1;2在提高水稻对除草剂Basta抗性中的用途

Info

Publication number: CN101381732A
Application number: CNA2008101972787A
Authority: CN
Inventors: 练兴明; 张启发; 蔡红梅
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2008-10-17
Filing date: 2008-10-17
Publication date: 2009-03-11

Abstract

本发明公开了一种基因OsGS1；2在提高水稻对除草剂Basta抗性中的用途。根据公开的编码水稻内源谷氨酰胺合成酶的OsGS1；2基因的mRNA序列，通过同源匹配，获得此基因的全长cDNA序列。通过限制性内切酶酶切获得此基因的完整编码序列，连接到超量表达载体pCAMBIA1301s上。再进行遗传转化，在水稻品种中，超量表达，在转基因植株后代中发现，阳性植株相对于阴性植株和非转基因野生型植株在种子萌发期，幼苗期和成熟期对除草剂Basta表现为极显著的抗性。

Description

基因OsGS1；2在提高水稻对除草剂Basta抗性中的用途

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种提高水稻对除草剂Basta抗性的基因OsGS1；2的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是我国主要粮食作物之一，在水稻种植过程中“除草”一向是农民最为繁重的劳动之一。随着人们生活质量的不断提高，除草剂的应用以及抗除草剂水稻新品种的推广日益受到人们的关注。因此，培育和推广一种有效实用的抗除草剂水稻新品种对我国的水稻种植业甚至整个农业发展都具有十分重要的意义。

1986年，转基因农作物首次获准进入田间试验；1994年，第一个转基因植物产品一延熟保鲜的转基因番茄“Flavr Savr”获得美国农业部(USDA)和美国食品与药品管理局(FDA)批准，进入市场；2005年，转基因作物的全球面积比1996年增加50多倍，约9000万hm²，其中，转基因抗除草剂性状在转基因植物中应用最多，约占78％。Basta是一种广谱非选择性的除草剂，其有效成分是L-phosphiothricin(PPT)的铵盐，对植物的地上部分和地下部分均有枯死作用。Bar基因(bialaphosresistancegen)能使植物抵抗以PPT为活性成分的除草剂。bar基因是目前抗除草剂基因工程研究中应用最为广泛的一个基因，也是迄今为止用得最多的一个抗除草剂选择标记基因。因此，广大科学研究工作者与农作物育种家们一直选用这个外源基因应用于转基因植物的抗性筛选工作和抗Basta的品种研究。1997年抗除草剂Basta的转基因玉米在美国的种植面积达30万公顷以上，抗Basta的转基因油菜在加拿大的种植面积达90万公顷以上，占加拿大油菜种植总面积的20％左右。现己通过生物技术将bar基因导入小麦(Vasil et al.，1993)、大麦(Wan et al.，1994)、水稻(Rathore et al.，1993)、玉米(Lauren et al.，1994)、高粱(Casas et al.，1993)、油菜和番茄(De Block et al.，1989)等20多种作物。然而本发明区别于以上的主要方面是选用水稻本身内源谷氨酰胺合成酶基因OsGS1；2，将之超量表达，避免了由于引入外源基因对转基因植株造成的不确定影响，不仅仅有利于提高水稻体内氮代谢水平，并且水稻在发芽、幼苗和成熟期对除草剂Basta都具有显著的抗性。

谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS；E.C.6.3.1.2)是第一个从植物中分离纯化和鉴定的酶，也是第一个被发现的能将植物无机盐形式的氨催化同化成有机氮形式的酶。在谷氨酸合成酶的联合作用下，GS将植物吸收的无机态氨转变成有机形式的谷氨酰胺(Gln)和谷氨酸(Glu)，在高等植物体内含氮有机物的生物合成中作为氮的供体。GS广泛分布于高等植物的种子、叶、根、根瘤和果实等器官中，主要以胞质型GS1和叶绿体型GS2的形式存在，在植物发育过程的许多器官中具有活性。对豌豆、水稻、拟南芥、豆类玉米和大豆等高等植物GS的研究表明，GS1和GS2的生理功能与它们存在的组织和细胞特异性表达模型相关；叶绿体型GS2大量存在于叶肉细胞中，而细胞质型GS1存在于叶肉细胞中比较少，主要存在于韧皮筛管中。由于GS1在植物的根中大量存在，其主要功能是催化根中硝酸盐还原的铵和从土壤中吸收的铵同化成有机形态氮；在豆科植物的根瘤中，GS1催化同化根瘤菌固定的氨；在发芽的子叶中，GS1催化同化活化的含氮储存物；GS2主要分布于植物的叶中，其主要功能是在叶绿体再同化光呼吸过程中释放出的氨中起作用。其中GS1是一个基因家族，至今发现在水稻中存在3个GS1基因(OsGS1；1，OsGS1；2和OsGS1；3)，OsGS1；1主要在地上部绿色组织中表达，OsGS1；2主要在根部表达，而OsGS1；3主要在小穗中表达。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的技术缺陷，提供了一种提高水稻对除草剂Basta的抗性的基因OsGS1；2的应用。基因OsGS1；2在提高水稻对除草剂Basta的抗性中的用途如下：在水稻中超量表达编码内源胞质型谷氨酰胺合成酶的OsGS1；2基因后，发现转基因阳性植株的种子在萌发过程中对10mg/L的Basta具有显著的抗性，能够正常发芽并生长，而对应的阴性植株和非转基因野生型植株的种子则不能发芽，继而死掉；转基因阳性植株在幼苗期和成熟期喷施0.5％(v/v)的Basta后，仍然可以正常生长，而对应的阴性植株和非转基因野生型植株则在两个星期以后枯死。具体表现在种子发芽时期，100％的转基因阳性种子可以在10mg/L的Basta筛选条件下发芽并且生长，而100％的转基因阴性和非转基因野生型种子发芽后却不能继续生长；在幼苗期，98％以上的转基因阳性植株，但是只有7％的非转基因野生型植株可以在喷施0.5％(v/v)的Basta条件下正常生长；在成熟期，93％以上的转基因阳性植株，但是只有11％的转基因阴性植株和9.7％的非转基因野生型植株可以在涂抹0.5％(v/v)的Basta条件下正常生长(见表1)。可见，超量表达OsGS1；2的转基因植株在水稻的三个不同生育期对除草剂Basta都具有显著的抗性。

本发明是这样实现的：

本发明利用OsGS1；2的基因组片段作为应用基因，进行转基因超量表达验证，将该基因转入水稻品种中花11，转基因植株表现出对除草剂Basta极显著的抗性现象。本发明在水稻品种中花11中(来自与中国农业科学院作物科学研究所的商业品种)，通过农杆菌介导的转基因方法超量表达了编码水稻内源胞质型谷氨酰胺合成酶的OsGS1；2基因，提高了水稻对除草剂Basta的抗性，为抗除草剂水稻新品种的育种和应用提供新的思路和方法。

申请人在NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上输入“Glutamine synthetase ANDrice”，得到序列号为AB180688的一段编码水稻内源胞质型谷氨酰胺合成酶基因OsGS1；2的mRNA序列。在本实验室(华中农业大学作物遗传与改良国家重点实验室)明恢63cDNA文库中，根据同源匹配，找到此基因的全长cDNA序列，克隆号为EI^#03-A15。通过限制性内切酶酶切方法，使用BamHI和KpnI酶切获得此基因的全长编码区，连接到超量表达载体pCAMBIA1301s(超表达载体pCAMBIA1301s是本实验在载体pCAMBIA1301【来自澳大利亚一个公开报道和使用的质粒，参见：http://www.cambia.org】的基础上改造得到的：首先把载体pCAMBIA1301用多克隆位点最外端的两个限制性核酸内切酶HindIII和EcoRI进行酶切，去掉多克隆位点，再连接上一段包含CaMV35S启动子、多克隆位点和polyA终止子的序列，从而得到了可以运用于基因超量表达的新载体pCAMBIA1301s，此载体包含GUS的报告基因和潮霉素的筛选基因)上。再进行农杆菌介导的遗传转化，在水稻品种中花11中，超量表达此基因，得到超量表达植株。在转基因植株中发现，阳性植株表现为对除草剂Basta极显著的抗性现象。

本发明的优点在于：

(1)本发明提供了一种提高水稻对除草剂Basta抗性的基因OsGS1；2的应用。申请人在水稻品种中花11中，超量表达编码水稻内源胞质型谷氨酰胺合成酶的OsGS1；2基因后，发现转基因阳性植株对除草剂Basta具有极显著的抗性(见图4)。具体表现在种子发芽时期，100％的转基因阳性种子可以在10mg/L的Basta筛选条件下发芽并且生长，而100％的转基因阴性和非转基因野生型种子发芽后却不能继续生长；在幼苗期，98％以上的转基因阳性植株，但是只有7％的非转基因野生型植株可以在喷施0.5％(v/v)的Basta条件下正常生长；在成熟期，93％以上的转基因阳性植株，但是只有11％的转基因阴性植株和9.7％的非转基因野生型植株可以在涂抹0.5％(v/v)的Basta条件下正常生长(见表1)。

(2)本发明首次在水稻中超量表达一个参与水稻氮代谢并且能够影响对除草剂抗性的基因OsGS1；2，并且避免了引入外源基因对转基因植株造成的不确定影响。为水稻培育新品种提供了新的思路和方法，也为其它作物利用同源基因法获得新品种提供了理论支持。

(3)本发明中应用的基因可以为水稻等禾谷类作物以及其它作物的营养代谢研究提供支持，为更详细的研究基因的功能提供参照。

附图说明

图1为提高水稻对除草剂Basta抗性的基因OsGS1；2的应用技术路线示意图。

图2为载体pCAMBIA1301s结构示意图。

图2a是载体pCAMBIA1301结构示意图；

图2b是在多克隆位点中，插入片段的结构示意图；

图2c是改造后的载体pCAMBIA1301s的结构示意图。

图3为超表达转化载体的结构示意图。可见OsGS1；2基因被35S启动子超量表达。

图4分为图4a图4b图4c：图为超量表达OsGS1；2基因的转基因植株相对与阴性植株和非转基因野生型植株在种子萌发期，幼苗期和成熟期都表现为对除草剂Basta的极显著抗性现象。

图4a：超量表达OsGs1；2的转基因阳性植株(A1，A3)相对于阴性植株(Neg)、非转基因野生型植株(CK)在种子萌发时期体现的抗除草剂Basta现象，CK-basta为野生型植株在MS培养基上正常发芽生长。

图4b：超量表达OsGs1；2的转基因阳性植株(A3)相对非转基因野生型植株(CK)在幼苗时期体现的抗除草剂Basta现象。

图4c：超量表达OsGs1；2的转基因阳性植株(A1，A3，A4)相对于阴性植株(Neg)、非转基因野生型植株(CK)在成熟期体现的抗除草剂Basta现象，CK-basta为野生型植株叶片没有涂抹Basta的正常生长情况。

具体实施方式

申请人在NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上输入“Glutamine synthetase ANDrice”，得到序列号为AB180688的一段编码水稻内源胞质型谷氨酰胺合成酶基因OsGS1；2的mRNA序列。在本实验室(华中农业大学作物遗传与改良国家重点实验室)明恢63cDNA文库中，根据同源匹配，找到此基因的全长cDNA序列，克隆号为EI^#03-A15。通过限制性内切酶酶切方法，使用BamHI和KpnI酶切获得此基因的全长编码区，把该片段连接到超表达载体质粒pCAMBIA1301s(超表达载体pCAMBIA1301s是本实验在载体pCAMBIA1301【来自澳大利亚一个公开报道和使用的质粒，参见：http://www.cambia.org】的基础上改造得到的：首先把载体pCAMBIA1301用多克隆位点最外端的两个限制性核酸内切酶HindIII和EcoRI进行酶切，去掉多克隆位点，再连接上一段包含CaMV35S启动子、多克隆位点和polyA终止子的序列，从而得到了可以运用于基因超量表达的新载体pCAMBIA1301s，此载体包含GUS的报告基因和潮霉素的筛选基因)上，用农杆菌介导的方法，在水稻品种中花11中超量表达OsGS1；2基因，获得转基因植株。通过分子生物学手段，即PCR和Southern、Western分子杂交方法鉴定转基因后代的阳性植株和阴性植株。在Basta筛选条件下观察鉴定转基因植株后代，发现转基因植株表现出对除草剂Basta极显著的抗性现象。

以下实施例进一步定义本发明，并描述了分离OsGS1；2基因，遗传转化，以及Basta抗性实验方法和鉴定。根据以下的描述和这些实施事例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：OsGS1；2基因确定和序列的获得

在NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上输入“Glutamine synthetase AND rice”，得到序列号为AB180688的一段编码水稻内源胞质型谷氨酰胺合成酶基因OsGS1；2的mRNA序列。在本实验室(华中农业大学作物遗传与改良国家重点实验室)明恢63cDNA文库中，根据同源匹配，找到此基因的全长cDNA序列，克隆号为EI^#03-A15。

实施例2：超量表达转化载体的构建

根据基因OsGS1；2的已知全长cDNA序列寻找合适的酶切位点，通过限制性内切酶酶切方法，使用BamHI和KpnI酶切获得此基因的全长编码区，使基因按正确的方向连接到pCAMBIA1301s载体上，并通过测序验证基因序列的完整与正确性。

实施例3：超量表达OsGS1；2的转基因实验

包含编码水稻内源胞质型谷氨酰胺合成酶的OsGS1；2基因的片段连接到载体pCAMBIA1301s上后，采用转基因的方法，得到转基因的水稻小植株，本发明的转基因具体步骤如下：

将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌(EHA105由澳大利亚CAMBIA实验室提供，参见：New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants，1993，Transgenic Res 2：208-218)介导水稻遗传转化体系导入到水稻品种中花11中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(参见：Efficient transformation of rice，Oryzasativa L.，mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of theT-DNA，1994，PlantJournal 6：271-282)基础上进行优化。

本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein EnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(DimethylSulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量元素成分溶液)；N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)

(2)溶液配方

1)N6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)：

硝酸钾(KNO₃) 28.3克

磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 4.0克

硫酸铵((NH₄)₂SO₄) 4.63克

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 1.85克

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 1.66克

将上述试剂逐一溶解，然后用蒸馏水定容至1000毫升。

2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制

碘化钾(KI) 0.08克

硼酸(H₃BO₃) 0.16克

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 0.44克

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.15克

将上述试剂在20-25摄氏度下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)

将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78克FeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)

烟酸(Nicotinic acid) 0.1克

维生素B1(Thiamine HCl) 0.1克

维生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1克

甘氨酸(Glycine) 0.2克

肌醇(Inositol) 10克

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X浓缩液配制)

硝酸铵(NH₄NO₃) 16.5克

硝酸钾 19.0克

磷酸二氢钾 1.7克

硫酸镁 3.7克

氯化钙 4.4克

将上述试剂在20-25℃温度下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

6)MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X浓缩液配制)

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 2.23克

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.86克

硼酸(H₃BO₃) 0.62克

碘化钾(KI) 0.083克

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.025克

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.0025克

氯化钴(CoCl₂·6H₂O) 0.0025克

7)2，4-D贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取2，4-D100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于20-25℃温度下保存。

8)6-BA贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取6-BA100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，20-25℃温度保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取NAA100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取IAA100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制：

秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

秤取AS0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，20-25℃温度保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(取已经制备好的10X浓缩液，下同) 100毫升

N6mix母液(取已经制备好的100X浓缩液，下同) 10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同) 10毫升

维生素贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同) 10毫升

2，4-D贮存液(取上述制备好的) 2.5毫升

脯氨酸(Proline) 0.3克

CH 0.6克

蔗糖 30克

Phytagel 3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

2)继代培养基

N6max母液(10X) 100毫升

N6mix母液(100X) 10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10毫升

维生素贮存液(100X) 10毫升

2，4-D贮存液 2.0毫升

脯氨酸 0.5克

CH 0.6克

蔗糖 30克

Phytagel 3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

3)预培养基

N6max母液(10X) 12.5毫升

N6mix母液(100X) 1.25毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5毫升

维生素贮存液(100X) 2.5毫升

2，4-D贮存液 0.75毫升

CH 0.15克

蔗糖 5克

琼脂粉 1.75克

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X) 12.5毫升

N6mix母液(100X) 1.25毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5毫升

维生素贮存液(100X) 2.5毫升

2，4-D贮存液 0.75毫升

CH 0.2克

蔗糖 5克

琼脂粉 1.75克

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X) 5毫升

N6mix母液(100X) 0.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 0.5毫升

维生素贮存液(100X) 1毫升

2，4-D贮存液 0.2毫升

CH 0.08克

蔗糖 2克

加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。

使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X) 25毫升

N6mix母液(100X) 2.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5毫升

维生素贮存液(100X) 2.5毫升

2，4-D贮存液 0.625毫升

CH 0.15克

蔗糖 7.5克

琼脂粉 1.75克

加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升)。

7)预分化培养基

N6max母液(10X) 25毫升

N6mix母液(100X) 2.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5毫升

维生素贮存液(100X) 2.5毫升

6-BA贮存液 0.5毫升

KT贮存液 0.5毫升

NAA贮存液 50微升

IAA贮存液 50微升

CH 0.15克

蔗糖 7.5克

琼脂粉 1.75克

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

8)分化培养基

N6max母液(10X) 100毫升

N6mix母液(100X) 10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10毫升

维生素贮存液(100X) 10毫升

6-BA贮存液 2毫升

KT贮存液 2毫升

NAA贮存液 0.2毫升

IAA贮存液 0.2毫升

CH 1克

蔗糖 30克

Phytagel 3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10X) 50毫升

MSmix母液(100X) 5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 5毫升

维生素贮存液(100X) 5毫升

蔗糖 20克

Phytagel 3克

加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤(EHA105由澳大利亚CAMBIA实验室提供，参见：New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants，1993，Transgenic Res 2：208-218)。

3.1 愈伤诱导

1)将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；

2)用灭菌水洗种子4-5次；

3)将种子放在诱导培养基上；

4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

3.2 愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.3 预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.4 农杆菌培养

1)在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上预培养农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)两天，温度28℃；

2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

3.5 农杆菌侵染

1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

3.6 愈伤洗涤和选择培养

1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

2)浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；

3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

4)转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

3.7 分化

1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；

2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

3.8 生根

1)剪掉分化时产生的根；

然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

3.9 移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

转化粳稻品种中花11，得到转基因单株T₀代植株。用southern检测拷贝数，用northern检测基因在植物体内的表达量。得到单拷贝、超表达的植株，并且进行繁殖，得到T₁和T₂代转基因植株。

实施例4：超表达OsGS1；2的转基因植株的功能鉴定

鉴定转基因植株后代在种子萌发期，幼苗期和成熟期对除草剂Basta的抗性，发现转基因阳性植株和阴性植株、非转基因野生型植株相比，表现出期望的表型变化，即阳性植株对Basta具有极显著的抗性，在Basta筛选条件下仍然可以维持正常的生长，而阴性和野生型植株则不能生长而枯死(见附图4)。具体表现在种子发芽时期，100％的转基因阳性种子可以在10mg/L的Basta筛选条件下发芽并且生长，而100％的转基因阴性和非转基因野生型种子发芽后却不能继续生长；在幼苗期，98％以上的转基因阳性植株，但是只有7％的非转基因野生型植株可以在喷施0.5％(v/v)的Basta条件下正常生长；在成熟期，93％以上的转基因阳性植株，但是只有11％的转基因阴性植株和9.7％的非转基因野生型植株可以在涂抹0.5％(v/v)的Basta条件下正常生长(见表1)。

由此可见，超表达OsGS1；2的转基因植株可以作为一种抗除草剂的水稻新品种来应用和推广。

1、种子萌发期对Basta抗性的鉴定方法

1.配制MS培养基和添加Basta溶液的抗性筛选培养基，其Basta浓度为10mg/L。

2.将需要鉴定的水稻种子去壳，并在无菌工作台上进行消毒处理。步骤如下：75％酒精浸泡1分钟，0.15％HgCl₂浸泡15分钟，再用灭菌水洗涤6此以上。

3.将消毒处理好的种子移至MS培养基和Basta筛选培养基上发芽一星期，观察照相。

2、幼苗期和成熟期对Basta抗性的鉴定方法

1.将需要鉴定的水稻种子室温浸种3天，37度催芽一天，之后播种；待生长至2叶期，移栽至栽培盒或栽培桶中。

2.在幼苗期用0.5％(v/v)的Basta溶液喷施苗子，一个星期后观察照相，记录枯死苗子和绿色正常生长苗子的数目。

3.在成熟期用0.5％(v/v)的Basta溶液涂抹叶片，两个星期后观察照相，记录枯死叶片和绿色正常生长叶片的数目。

表1 本发明克隆的OsGs1；2转基因植株在Basta筛选条件下的表现

CK：非转基因野生型植株

Neg：转基因阴性植株

A1，A3，A4：转基因阳性植株

ND：无数据。

Claims

1、基因OsGS1；2在提高水稻对除草剂Basta的抗性中的用途。