CN101705243A - 发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法在大豆转化方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法在大豆转化方面的应用。本发明首次将发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法应用于大豆，成功地进行了大豆根部毛状根转化。本发明对种子萌发时间、筛选剂浓度进行优化，不仅能够增加每个大豆外植体诱导出的转基因毛状根数量，而且能够显著提高毛状根的转化频率和生长状态，在无菌条件下成功地利用大豆转化常用的筛选标记除草剂获得大豆“复合植株”，其既有转基因的根部，又有非转基因的地上部，是在无菌组织培养条件下研究与根系形态、根部共生固氮和菌根形成有关的基因的理想材料。

Description

发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法在大豆转化方面的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法在大豆转化方面的应用。

背景技术

农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌。现已发现，与植物基因转化有关的农杆菌有两种：一是发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)，它含有Ri(root inducing plasmid)质粒，能够诱导被侵染的植物细胞产生毛状根(hairy root)；二是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，它含有Ti(tumor inducing plasmid)质粒，能诱导被侵染的植物细胞形成冠瘿瘤。与根癌农杆菌相比，发根农杆菌Ri质粒诱导形成的毛状根，生长速度快，生长条件可以人为控制且遗传上稳定，因而是进行许多与根系相关的理论研究的理想实验系统。毛状根还可以作为研究作物根部寄生的病虫害病理的良好材料，毛状根系统在离子吸收、次生代谢物合成过程及运输等方面的研究中也是非常有用的实验系统。因此，自从Ri质粒被人们发现并认识以来，它已广泛应用于植物基因工程、植物次生代谢产物生产、植物品种改良和植物栽培等领域，显示出了极其广阔的应用前景(杜旻等，2005)。此外，由发根农杆菌感染植物获得的毛状根再生的后代会出现矮化现象，因此在花卉矮化育种中也具有特别的意义。

发根农杆菌的转化方法很多，大体包括植物体直接接种法和外植体共感染接种法两种。植物体直接接种法即用活化好的新鲜菌液或菌斑对植物的无菌幼苗反复注射或涂抹(2～3次)，两周后即可在注射或涂抹部位产生毛状根(张艳馥等，1997；王关林和方宏筠，2002)。针刺注射是常用的转化方法，Van de Velde等(2003)用新鲜菌液直接注射接种生长着的田菁无菌幼苗下胚轴，诱导出毛状根。Rodríguez-Llorente等(2003)用菌液直接针刺接种截型苜蓿下胚轴也获得了毛状根，Kereszt(2007)则用菌液直接针刺接种生长在基质中的大豆幼苗的下胚轴，得到了大豆的“复合植株”(Composite plant)。涂抹法常用于毛状根无菌条件下的诱导。Boisson-Dernier等(2001)将萌发30小时的截型苜蓿种子切除3毫米长的胚根，切口用发根农杆菌菌斑涂抹侵染也得到既有转基因毛状根，又有非转基因的地上部的“复合植株”；Uhde-Stone等(2005)利用相似的方法得到了豌豆的“复合植株”。植物体直接接种法得到的“复合植株”的优点在于既有转基因的根，又有非转基因的地上部，是研究与根部共生固氮和VA菌根形成有关的基因的理想材料。其中，涂抹法可以在无菌组织培养条件下进行发根农杆菌侵染以用于微生物共生及根系生理生化方面的研究(Boisson-Dernier et al，2001；Uhde-Stone et al，2005)。

大豆(Glycine max)是我国重要的粮食和油料作物.在几种主要粮食作物中，大豆蛋白质含量最高，所以大豆是人类理想的植物蛋白来源(王文真等，1998).与此同时，大豆也是基因工程中公认的，难以进行根癌农杆菌介导的整株转化的作物之一.因此，发根农杆菌转化方法由于简便，快速越来越广泛地用于大豆的分子遗传研究，如基因的表达分析、启动子功能分析、大豆与根瘤菌或菌根的共生研究以及大豆病虫害的离体研究等方面(Somers et al，2003)。

发根农杆菌的涂抹法转化可以在无菌组织培养条件下进行发根农杆菌侵染以用于大豆根部共生固氮、菌根共生及根系生理生化方面的研究，但涂抹直接接种法转化在大豆上至今还未见报道。

发明内容

本发明的一个目的是克服现有技术的不足，提供下胚轴涂抹转化方法在大豆转化方面的应用。

本发明的另一个目的是提供大豆根部转化方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法在大豆转化方面的应用。

所述应用是选用大豆种子进行萌发，切除胚根，切口用含有pCAMBIA3301-GUS表达载体的，由A4演化来的MSU440发根农杆菌为涂抹菌斑进行下胚轴涂抹侵染，进行遗传转化，获得含有GUS报告基因的大豆转基因毛状根。

所述大豆基因型选用粤春03-3(YC03-3)或本地2号(BD2)。

本发明提供了一种大豆根部转化方法，包括以下步骤：

(1)种子消毒和种子萌发；

(2)发根农杆菌MSU440菌斑制备；

(3)外植体制备及转化。

本发明不仅建立了大豆发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法，而且在遗传转化过程中，对种子萌发时间、受体大豆基因型和筛选剂浓度也进行了优化，优化条件如下：

上述步骤(1)所述种子萌发包括以下步骤：

将消毒的种子播种于萌发培养基上，28℃暗培养约20小时，待胚根长出有1cm时，准备进行发根农杆菌侵染。

上述步骤(2)是将含质粒载体pCAMBIA3301-GUS的发根农杆菌菌株MSU440，在YEP培养基上划板，28℃培养两天得到含质粒载体pCAMBIA3301-GUS的发根农杆菌MSU440菌斑。

所述含质粒载体pCAMBIA3301-GUS的发根农杆菌菌株MSU440是通过常规的农杆菌冻融法转化将pCAMBIA3301-GUS质粒转入发根农杆菌MSU440感受态细胞获得。

上述步骤(3)所述外植体制备及转化程序包括以下步骤：

(1)将萌发的大豆种子切除约3mm的胚根，切口用农杆菌菌斑涂抹侵染，然后将大豆放在含有毛状根诱导培养基的方形培养皿中，所述毛状根诱导培养基采用改良的1/2×Hoagland营养液配制，加入0.6％琼脂粉。所述毛状根诱导培养基加有浓度为5.0mg/L的筛选剂。

所述筛选剂的配制方法是将0.025克除草剂(Glufosinate)溶于25mL双蒸水后过滤灭菌配制1mg/ml的浓缩液。用时1L培养基中加入2.5或5毫升1mg/ml的浓缩液产生2.5mg/L或5mg/L筛选剂浓度。

(2)培养皿45℃放置3天，然后将培养皿竖直放置在培养箱中，培养条件为温度18～20℃、14小时光照、光强200E/m²/sec；筛选10天后，将培养基中切去胚根的大豆苗放入含有2.5mg/L筛选剂的毛状根诱导培养基中继代培养，筛选转基因毛状根，20～30天后，毛状根产生，用于GUS染色分析。

所述转基因毛状根的筛选方法是采用筛选前期(侵染后10天)使用较高的筛选剂浓度，5.0mg/L；后期(10天后)将筛选剂浓度降低至2.5mg/L筛选剂。

本发明建立和优化了大豆发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法，可以在无菌组织培养条件下进行发根农杆菌侵染以用于大豆根部共生固氮、菌根共生及根系生理生化方面研究。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明首次在大豆中建立了大豆发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法。将发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法成功应用于大豆，在无菌条件下利用大豆转化常用的筛选标记除草剂获得大豆“复合植株”，其既有转基因的根部，又有非转基因的地上部，提供了在无菌组织培养条件下研究与根系生理生化、根部共生固氮和菌根形成有关的基因的理想材料。

(2)本发明优化了大豆发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法，精确确定了种子萌发时间、不同筛选时期使用不同的筛选剂浓度的筛选方法，不仅能够增加每个大豆外植体诱导出的转基因毛状根数量，而且能够显著提高毛状根的转化频率和生长状态。

(3)本发明中建立和优化的大豆发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法可以为其他豆科作物以及其它作物的发根农杆菌转化技术研究提供理论支持。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步详细说明本发明。本发明在实施例中描述了种子消毒和种子萌发；发根农杆菌MSU440菌斑制备；外植体制备及转化程序；转基因毛状根GUS染色检测。但并不因此将本发明精神和范围限定于具体的实施例中。

实施例1

本发明方法主要包括种子萌发、发根农杆菌MSU440菌斑制备、外植体制备及转基因产生转基因毛状根等步骤，所述农杆菌菌斑涂抹侵染转化方法主要参考Limpens等人和Boisson-Dernier等人利用卡那霉素作为筛选剂转化截型苜蓿、以及Uhde-Stone等人利用卡那霉素作为筛选剂转化白羽扇豆报道的方法。大豆至今还未见利用这种转化方法的报道，本发明经过大量长期的实验总结，并对种子萌发时间、筛选剂浓度和受体大豆基因型等方面条件进行了优化，成功利用这种方法转化大豆产生转基因毛状根。

具体所述如下：

(1)试剂

本发明中培养基所用到的试剂和溶液及缩写表示如下：

Glufosinate(Glufosinate-ammonium，除草剂)；B5max(B5大量元素成分溶液)；B5mix(B5微量元素成分溶液)；B5vit(B5维生素成分溶液)；1/2×Hoagland(1/2×Hoagland营养液)

(2)溶液配方

1)B5培养基大量元素母液(按照20倍浓缩液(20X)配制)：

硝酸钾(KNO₃)               50.00克

磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)  3.00克

硫酸铵((NH₄)₂SO₄)         2.68克

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)       5.00克

氯化钙(CaCl₂·2H₂O)       3.00克

将上述试剂逐一溶解，然后用蒸馏水定容至1000毫升。

2)B5培养基微量元素母液(按照200倍浓缩液(200X)配制)

碘化钾(KI)                0.15克

硼酸(H₃BO₃)               0.60克

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)       2.00克

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)       0.40克

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)     0.05克

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)       0.005克

氯化钴(CoCl₂·6H₂O)       0.005克

将上述试剂在20～25℃下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)

将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78克FeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4)B5维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)

烟酸(Nicotinic acid)      0.01克

维生素B1(Thiamine HCl)    0.10克

维生素B6(Pyridoxine HCl)  0.01克

肌醇(Inositol)            1.00克

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。

5)改良的1/2×Hoagland营养液(分别按照200X和1000X浓缩液配制)

将上述各母液中的试剂在20～25℃温度下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

6)主要抗生素配方

250mg/mL羧苄青霉素贮备液：2.5克氨苄青霉素+10mL双蒸水，过滤灭菌，-20℃保存；

7)筛选剂配制

1mg/mL筛选剂：0.025克除草剂(Glufosinate)+25mL双蒸水，过滤灭菌，4℃保存。

配制时配1mg/mL浓缩液，加入2.5或5毫升浓缩液(1mg/mL)到1L培养基产生2.5mg/L或5mg/L筛选剂浓度。

(3)用于遗传转化的培养基配方

1)种子萌发培养基

B5max母液(取已经制备好的20X浓缩液，下同)  50毫升

B5mix母液(取已经制备好的200X浓缩液)       5毫升

Fe-EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液)   10毫升

维生素贮存液(取已经制备好的100X浓缩液)    10毫升

蔗糖                                      20克

Phytagel                                  3克

加蒸馏水至1000毫升，1N氢氧化钠调节pH值到5.8，高压灭菌，121℃下灭菌20分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同。

2)毛状根诱导培养基

改良的1/2×Hoagland母液1(200X)            5毫升

改良的1/2×Hoagland母液2(200X)            5毫升

改良的1/2×Hoagland母液3(1000X)           1毫升

琼脂粉                                    6克

加蒸馏水至1000毫升，1N氢氧化钠调节pH值到5.8，高压灭菌培养基降温至50℃时加入已过滤灭菌的2毫升羧苄青霉素(250毫克/毫升)，2.5或5毫升筛选剂(1毫克/毫升)，混匀后分装倒入培养皿中。

(4)大豆发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法步骤

1)种子消毒

种子采用干燥表面消毒。将粤春03-3(YC03-3)或本地2号(BD2)(广东)成熟的大豆种子单层排列在培养皿中，将装有3～4个培养皿的干燥器放到通风橱中，并将所有的培养皿打开，盖子紧挨着培养皿，以保证在中间有足够的空间放置一个250mL的烧杯。在250mL烧杯中加入100mL的次氯酸钠，然后沿着杯壁缓缓加入4.2mL 12N HCl，立即盖上干燥器的盖子，静置过夜，约静置13.5小时。在氯气中暴露整夜后，盖上培养皿并将其放到层流净化罩中，再将培养皿打开大约30min以便除去过多的氯气。

2)种子萌发

将消毒的种子播种于萌发培养基上，28℃暗培养约20小时，待胚根长出有1cm时，准备进行农杆菌侵染。

3)菌斑制备

在侵染前两天取出甘油贮存的、含质粒载体pCAMBIA3301-GUS的发根农杆菌菌株MSU440，在YEP培养基上划板，28℃培养两天。

所述植物表达载体pCAMBIA3301的质粒图谱可见http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html。

含质粒载体pCAMBIA3301-GUS的发根农杆菌菌株MSU440是通过常规的农杆菌冻融法转化将pCAMBIA3301-GUS质粒转入发根农杆菌感受态细胞获得。

4)外植体制备及转化程序

将萌发的大豆种子切除约3mm的胚根，切口用发根农杆菌菌斑涂抹侵染，然后将大豆放在含有毛状根诱导培养基的方形培养皿中，培养基中加有浓度为5.0mg/L的筛选剂，所述筛选剂是将5毫升1mg/ml的筛选剂浓缩液加入1L培养基中得到的。培养皿于45℃放置3天，然后将培养皿竖直放置在培养箱中，温度18～20℃，14小时光照，光强200E/m²/sec。筛选10天后，将培养基中切去胚根的大豆苗放入含有2.5mg/L筛选剂的毛状根诱导培养基中继代培养，进行转基因毛状根筛选，20～30天后，毛状根产生，用于GUS染色分析。

进行转基因毛状根筛选的方法是采用筛选前期(侵染后10天)使用较高的筛选剂浓度，优选5.0mg/L；后期(10天后)将筛选剂浓度降低，优选2.5mg/L。

实施例2转基因毛状根的GUS染色鉴定

取转化后在毛状根诱导培养基上筛选3周的毛状根与GUS染色液混合培养，37℃放置过夜，用70％酒精洗2～3次后，在实体显微镜下进行观察、拍照，记录染色呈蓝色的GUS阳性毛状根的条数，结果见表1。GUS染色液的底物为X-Gluc，染色液中含0.5g/L X-Gluc，100mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)，20％甲醇，0.5％(V/V)Triton X-100。

同时，以其他试验条件相同，筛选方法不同的另外三种方法进行对比，I：前期在含有2.5mg/L筛选剂的毛状根诱导培养基上培养的大豆苗，后期仍然继代到新的含有2.5mg/L筛选剂的毛状根诱导培养基中培养；II：前期在含有5.0mg/L筛选剂的毛状根诱导培养基上培养的大豆苗，后期仍然继代到新的含有5.0mg/L筛选剂的毛状根诱导培养基中培养；III：前期在含有5.0mg/L筛选剂的毛状根诱导培养基上培养的大豆苗，后期继代到新的含有2.5mg/L筛选剂的毛状根诱导培养基中培养。与这三种筛选方法得到的大豆毛状根进行对比。对比结果如表1所示。

表1本发明获得的毛状根与其它筛选条件下的毛状根的转化率比较

说明：1.表中数据是三次重复的平均值及其标准误；

2.筛选剂浓度，I：前期在含有2.5mg/L筛选剂的毛状根诱导培养基上培养的大豆苗，后期仍然继代到新的含有2.5mg/L筛选剂的毛状根诱导培养基中培养；II：前期在含有5.0mg/L筛选剂的毛状根诱导培养基上培养的大豆苗，后期仍然继代到新的含有5.0mg/L筛选剂的毛状根诱导培养基中培养；III：前期在含有2.5mg/L筛选剂的毛状根诱导培养基上培养的大豆苗，后期继代到新的含有5.0mg/L筛选剂的毛状根诱导培养基中培养；IV：前期在含有5.0mg/L筛选剂的毛状根诱导培养基上培养的大豆苗，后期继代到新的含有2.5mg/L筛选剂的毛状根诱导培养基中培养，每个处理重复3次，20～30天后，毛状根产生，进行GUS染色分析.

从表1对比结果可知：

1)在前、后期均使用筛选剂浓度2.5mg/L的条件下(表1)，筛选剂浓度过低，没能抑制正常根的生长，GUS染色结果显示，切口处诱导出的转基因毛状根较少，大部分为非转基因的毛状根。而在前、后期均使用筛选剂为5.0mg/L时，由于筛选剂浓度较高，侧根无法进一步伸长，同时毛状根产生也较少。GUS染色结果显示，切口处产生的毛状根95％以上是转基因毛状根，但数量较少。而在侵染后10天内使用2.5mg/L筛选剂，10天后将筛选剂浓度提高到5.0mg/L或在侵染后10天内使用5.0mg/L筛选剂，10天后将筛选剂浓度降低到2.5mg/L，这两种方法均能诱导出较多的转基因毛状根产生，相比之下，前期使用较高的筛选剂浓度，后期将筛选剂浓度降低，毛状根的生长状态更好，每个大豆外植体诱导出的毛状根也更多，并且毛状根的转化频率也较高，分别为92％(YC03-3)和80％(BD2)。

2)试验中使用了两个基因型进行发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化，YC03-3是华南农业大学根系生物学研究中心育成品系，籽粒较大；而BD2是广东省本地种，籽粒较小。从GUS染色的结果来看，每个处理YC03-3的转化频率均高于BD2。

Claims (10)

1.发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法在大豆转化方面的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于是选用大豆种子进行萌发，切除胚根，切口用含有pCAMBIA3301-GUS表达载体的、由A4演化来的MSU440发根农杆菌为涂抹菌斑进行下胚轴涂抹侵染，进行遗传转化，获得含有GUS报告基因的大豆转基因毛状根。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述大豆种子的基因型为粤春03-3或本地2号。

4.一种大豆根部转化方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)大豆种子的萌发；

(2)制备发根农杆菌MSU440菌斑；

(3)采用发根农杆菌介导的下胚轴涂抹法进行外植体制备及转化。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(1)所述种子萌发包括以下步骤：将消毒的大豆种子播种于萌发培养基上，28℃暗培养20小时，萌发至胚根长出1cm。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(3)所述外植体制备方法是将萌发的大豆种子切除3mm的胚根，切口用含有pCAMBIA3301-GUS表达载体的农杆菌MSU440菌斑涂抹侵染，然后将大豆放在含有毛状根诱导培养基的培养皿中；所述毛状根诱导培养基采用改良的1/2×Hoagland营养液配制，加入0.6％琼脂粉。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述毛状根诱导培养基加有浓度为5.0mg/L的筛选剂。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(3)所述转化是将装有涂抹侵染了农杆菌菌斑的大豆苗的培养皿于45℃放置3天，然后将培养皿竖直放置在培养箱中，筛选10天后，将培养基中的大豆苗转入含有浓度为2.5mg/L筛选剂的毛状根诱导培养基中继代培养，进行转基因毛状根筛选，20～30天后，毛状根产生。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述培养箱中培养条件是温度18～20℃，14小时光照、光强200E/m²/sec。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于步骤中所述转基因毛状根的筛选方法是筛选前10天采用筛选剂浓度为5.0mg/L，10天后采用筛选剂浓度为2.5mg/L。