CN102304545A - 一种农杆菌转化大豆的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种农杆菌转化大豆的方法，包括对干燥的大豆种子用氯气法进行消毒，接种到萌发培养基上萌发，获得无菌苗，切制大豆子叶节，用液体培养基，调制活化的农杆菌菌液，调整pH值，然后侵染子叶节，将子叶节转移到共培养基上，调整pH值，在光照条件下进行共培养，将共培养后的大豆子叶节进行脱菌后，转到不定芽诱导培养基上进行芽诱导及筛选培养，15天继代一次，直到抗性芽长出；抗性芽经过伸长、生根、移栽、对植株进行鉴定，获得转化植株。本发明获得的农杆菌转化大豆子叶节的共培养方法，可显著提高农杆菌转化大豆子叶节的效率，对加快大豆转基因育种有重要的理论及实践意义。

Description

一种农杆菌转化大豆的方法

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体说是一种农杆菌介导转化大豆子叶节的方法。

背景技术

早在1988年由Hinchee第1个以农杆菌介导法获得大豆转基因植株，农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化仍然是目前应用最广泛的一种转基因技术，这种方法有很多优点：获得再生植株的时间短、不可育的再生植株少、外植体来源不受时间限制；具有操作简单、费用低廉、可插入基因片段大、不容易发生重排、拷贝数低且符合孟德尔遗传规律等优点(Meurer et a.l,1998;林树柱等,2004,刘海坤2005)。但是也存在一些实际问题，如子叶节细胞的转化效率低，再生转化细胞和再生芽的无效选择，重复性很差，植株再生困难等仍然是该系统实施的瓶颈（Olhoft和Somers2001等；林树柱2004；姬月梅2009）。（Biotechnolog. 1988, 6: 915-922；Plant Cell Report, 1998.18:180-186；植物生理与分子生物学报, 2005,31(2): 126-134； Pla Cell Rep.,2001,20:706-711；生物工程学报,2004,20(6): 817-820；农业科学研究,2009,1: 47-49）。

在已公开的植物转基因技术中，农杆菌介导大豆子叶节遗传转化获得转基因大豆植株经过以下步骤：大豆无菌苗的培养，子叶节制备，农杆菌侵染与共培养，不定芽诱导筛选培养，不定芽生根，植株移栽，转化苗开花结荚获得种子。自1988年Hinchee等首次报告农杆菌转化大豆成功，之后的研究很多都沿用了这种方法，但是农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化效率至今仍没有取得很大突破，原因是大豆转基因的实际操作是一个较复杂的过程，每一个操作步骤都会对最终的转化效率有影响，甚至起决定作用。在农杆菌介导大豆子叶节遗传转化操作过程中，侵染和共培养这两个步骤是农杆菌粘附在外植体表面和外源基因进入植物细胞及整合到植物基因组的过程，因此对转化率起决定作用。这两个步骤要求合适的侵染时间、侵染液浓度、共培养的时间、温度和合适的共培养基成分及其pH值等。子叶节系统目前通常采用的侵染时间一般在10-30min，侵染农杆菌液浓度在OD600=0.3-1.0；目前通常采用的共培养基的pH为5.4，共培养条件是温度为22-24℃、完全黑暗，共培养时间为3d，转化效率一般在3%以下，而且不稳定。Chen认为大豆的转化率一般为 0.5 %～1.8 %，李明春等报道的转化率为 1.27 %,崔欣的转化率为0.49 %～0.91 %,段莹莹的子叶节转化法转化率为 1.86%，吕慧颖研究表明 ,转化率为2.39 % , 姬丹丹转化率为2.2-2.5%（Plant Cell Tissue Organ Cult., 2007, 89: 177-183；Acata Botan Sinc，2004 ,46 (5) :610-617；农 业 科 学 研 究，2009，30（1）:47-49；分子生物学报, 2007, 40(5): 286-294；大豆科学, 2010，29 (1): 8-12；山东大学学 报(理学版 ) 2011，46（5）117-121，）。研究者们相继在 ① 大豆基因型; ② 农杆菌菌株和Ti 质粒; ③ 外植体类型; ④共培养基中酚类化合物和抗氧化剂种类及转化时合适的筛选剂等各种技术性环节进行了探索，每个试验研究的转化效率都有所提高（农业科学研究,2009,1: 47-49）。

另外，共培养基的pH是遗传转化效率最直接的影响因素。农杆菌和外植体大豆子叶节均与培养基直接接触，农杆菌的生长及T-DNA向植物细胞转移的活性均受环境pH影响，农杆菌生长的适宜pH为6-9，因此给农杆菌创造一个合适的环境很重要，目前通用的pH为5.4。武小霞等研究结果显示，大豆遗传转化共培养基的pH在5.2-5.6范围内为宜，不定芽诱导率最高；赵晓雯认为pH 值是影响遗传转化效率的最主要因素,最适宜 pH为5.2，PCR 阳性率1.06-5%，平均为2.27%（东北农业大学学报, 2010, 41(5): 1-4；大豆科学，2011. 30（3）:362-368）。

此外，共培养的时间是农杆菌介导的大豆遗传转化过程中重要的影响因素。共培养的过程是附着在伤口的农杆菌不断繁殖和T-DNA的转入和与植物基因组整合的过程，完成该过程至少需要16h，因为“细胞的调节期”大致为16h。理论上共培养的时间越长，农杆菌就会繁殖越多，完成转化的几率越大，但是时间过长，农杆菌会过度繁殖，使外植体遭受毒害而死亡（王关林1998），目前一般认为大豆子叶节遗传转化的最佳共培养时间为3d。（植物基因工程原理与技术. 科学出版社, 1998； Plant Cell Rep., 1998,18:180-186）。

同样，光照条件也是影响共培养的重要因素，农杆菌是生存在土壤中的一种菌，黑暗是它的自然生存环境状态。共培养时，黑暗条件有利于农杆菌的生长，而光照有利于大豆子叶节分生细胞分裂，因此协调满足农杆菌和大豆子叶节分化的需要对转化很重要。关于共培养光照条件的研究很少，之前的报道认为共培养在黑暗条件下比在光照条件下效果更好，目前通用的方法是在完全黑暗条件下进行共培养（中国农业科学, 2008, 41(3): 661-668；分子生物学报, 2007, 40(5): 286-294）。

因此，农杆共培养是农杆菌完成转化大豆子叶节的关键阶段，是获得转基因植株的前提，改良共培养阶段的重要影响因素，会有效提高大豆子叶节遗传转化效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种农杆菌转化大豆的方法，通过优化共培养基pH值、共培养时间和共培养期间的光照方式，提高了农杆菌转化高大豆子叶节的效率。

本发明是通过以下技术方案实现的：

1、对干燥的大豆种子用氯气法进行消毒12-16h，接种到萌发培养基上萌发4-6d，获得无菌苗，切制大豆子叶节；

2、用液体培养基，其成分为：1/10 B5+1.7mg/L 6-BA+200μmol/L乙酰丁香酮+400mg/L L-半胱氨酸+1mmol/L二硫苏糖醇+1mmol/L硫代硫酸钠+3mmol/L MES+3%蔗糖，pH值为6.0-7.2，调制活化的农杆菌菌液达到OD600为：0.4-0.6，然后侵染子叶节30-60min；

3、将上述的子叶节转移到共培养基上，共培养基成分为：1/10 B5+1.7mg/L 6-BA+200μmol/L乙酰丁香酮+400mg/L L-半胱氨酸+1mmol/L二硫苏糖醇+1mmol/L硫代硫酸钠+3mmol/L MES+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH值为6.0-7.2，在0-16h/d光照、22-25℃条件下，共培养3-10天；

4、将上述共培养后的大豆子叶节进行脱菌后，转到不定芽诱导及筛选培养基上进行芽诱导及筛选培养，15天继代一次，直到抗性芽长出，诱导及筛选培养基成分为B5 +1.7mg/L 6-BA +100mg/LKm +250mg/LCarb +250mg/LCef+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH=5.8；

5、将上述的抗性芽转移到芽伸长培养基上，芽伸长培养基成分为：B5 + 1.0mg/LGA3 + 100mg/LKm + 250mg/LCarb + 250mg/LCef +3%蔗糖+0.8%琼脂，pH=5.8；

6、抗性芽生长到4-6cm后，转移到生根培养基上，生根培养基成分为1/2MS+1.0mg/L IBA+0.2mg/L NAA+250mg/LCef+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH=5.8； 

7、当根长达到4-6cm后，将苗移栽到营养土中，将苗用薄膜覆盖，待新叶长出后去掉薄膜，获得转化植株。

在本发明中，所述的共培养基的pH值，优选的pH范围为6.0-7.2，最佳 pH值为6.6。

进一步地，所述的共培养优选7-10天；最佳为10天。

进一步地，所述的共培养期间的光照时间在优选12-16h/d；最佳为16h/d。

本发明的有益效果：

本发明获得的农杆菌转化大豆子叶节的共培养方法，可显著提高农杆菌转化大豆子叶节的效率，对加快大豆转基因育种有重要的理论及实践意义。

本发明的一个特点是选用共培养基pH在6.0-7.2范围内， 转化率分别达到4.67%、5.59%和 5.43%，转化率均高于目前通用的pH 5.4，提高了3-3.5倍,以pH6.6最高，见表1。

表1不同pH值对大豆子叶节转化效率的影响

另外，共培养天数在7-14d范围内，转化率分别达到5.92%、8.97%和1.99%，转化率均高于目前通用的共培养3d，提高1.8-3倍，以10d转化率最高, 与对照差异显著，共培养天数在14d时转化率下降，见表2。

表2不同共培养天数对大豆子叶节转化效率的影响

 本发明的另一特点是适宜在12-24h/d光照条件下，转化率为12h/d光照和16h/d光照的转化率为分别为5.06%和5.36%，比目前通用的0h/d光照培养提高了3.4倍,12h/d或16h/d光照共培养后的子叶节变绿，有更强的生命力；完全黑暗共培养的的子叶节与共培养前无明显变化，为黄绿色，只有经过2-3d的诱导培养才能变成绿色；24h/d光照获得的子叶节变深绿色，子叶节周围农杆菌少，抑制了农杆菌的生长，转化率下降到0.48%，见表3, 因此适宜的共培养光照方式为12h/d - 16h/d光照。

表3 共培养光照时间对转化率的影响

 具体实施方式

实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如植物基因工程技术与原理所述的条件，或按照具体制造厂商所建议的条件。

实施例1

1、首先挑选无病、饱满的成熟大豆种子用氯气法进行消毒16h，接种到萌发培养基上，萌发培养基为B5+0.5mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.6%琼脂，pH=5.8，萌发5d，获得无菌苗，切制子叶节；

2、用液体培养基：1/10 B5+1.7mg/L 6-BA+200μmol/L乙酰丁香酮+400mg/L L-半胱氨酸+1mmol/L二硫苏糖醇+1mmol/L硫代硫酸钠+3%蔗糖，pH值为5.4，调制农杆菌浓度OD600达到0.5，浸泡切制好的大豆子叶节60min，本实施例中农杆菌含卡纳霉素植物筛选标记；

3、大豆子叶节转移至共培养基上，共培养基的基本成分为：1/10 B5+1.7mg/L 6-BA+200μmol/L乙酰丁香酮+400mg/L L-半胱氨酸+1mmol/L二硫苏糖醇+1mmol/L硫代硫酸钠+3%蔗糖 +0.8%琼脂，pH值为5.4，在24℃、黑暗条件下，共培养3天；

4、将上述共培养后的大豆子叶节进行脱菌后，转到不定芽诱导及筛选培养基上进行芽诱导及筛选培养，15天继代一次，直到抗性芽长出，诱导及筛选培养基成分为B5 +1.7mg/L 6-BA +100mg/LKm +250mg/LCarb +250mg/LCef+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH=5.8；

5、将上述的抗性芽转移到芽伸长培养基上，芽伸长培养基成分为：B5 + 1.0mg/LGA3 + 100mg/LKm + 250mg/LCarb + 250mg/LCef +3%蔗糖+0.8%琼脂，pH=5.8；

6、抗性芽生长到4-6cm后，转移到生根培养基上，生根培养基成分为1/2MS+1.0mg/L IBA+0.2mg/L NAA+250mg/LCef+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH=5.8； 

7、当根长达到4-6cm后，将苗移栽到营养土中，将苗用塑料薄膜覆盖，保持土壤湿润，待新叶长出后去掉塑料薄膜，获得转化植株。

说明：针对上述实施例给出的pH值，对其共培养基的pH值还可进行相应的调整，如选取pH值为6.0、6.6或7.2，其方法均按照上述方案，获得转化植株。

实施例2

大豆子叶节的制备按实施例1中步骤1所述方法进行；

按实施例1中步骤2所述方法进行大豆子叶节侵染；

大豆子叶节转移至如同实施例1中的步骤3所述共培养基上，在24℃、黑暗条件下共培养10d，随后的操作步骤均同实施例1 中4、5、6、7相关步骤。

说明：针对共培养时间还开进行相应的调整，如3d、7d或14d，其方法均按照实施例1的方案，获得转化植株。

实施例3

大豆子叶节的制备按实施例1中的步骤1所述方法进行。

按实施例1中的步骤2所述方法进行大豆子叶节侵染；

大豆子叶节转移至如同实施例1中的步骤3所述共培养基上，在光照培养箱中，温度控制在24℃，光照强度控制在3000LX，16h /d光照条件下共培养3d，随后的操作步骤均同实施例1 中4、5、6、7相关步骤。 

说明：针对共培养期间的光照时间还可进行相应的调整，可选取0h /d光照、12h /d光照或24h /d光照，其方法均按照实施例1的方案，获得转化植株。

Claims (4)

1.一种农杆菌转化大豆的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）对干燥的大豆种子用氯气法进行消毒12-16h，接种到萌发培养基上萌发4-6d，获得无菌苗，切制大豆子叶节；

（2）用液体培养基，其成分为：1/10 B5+1.7mg/L 6-BA+200μmol/L乙酰丁香酮+400mg/L L-半胱氨酸+1mmol/L二硫苏糖醇+1mmol/L硫代硫酸钠+3mmol/L MES+3%蔗糖，pH值为6.0-7.2，调制活化的农杆菌菌液达到OD600为：0.4-0.6，然后侵染子叶节30-60min；

（3）将上述的子叶节转移到共培养基上，共培养基成分为：1/10 B5+1.7mg/L 6-BA+200μmol/L乙酰丁香酮+400mg/L L-半胱氨酸+1mmol/L二硫苏糖醇+1mmol/L硫代硫酸钠+3mmol/L MES+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH值为6.0-7.2，在0-16h/d光照、22-25℃条件下，共培养3-10天；

（4）将上述共培养后的大豆子叶节进行脱菌后，转到不定芽诱导及筛选培养基上进行芽诱导及筛选培养，15天继代一次，直到抗性芽长出，诱导及筛选培养基成分为B5 +1.7mg/L 6-BA +100mg/LKm +250mg/LCarb +250mg/LCef+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH=5.8；

（5）将上述的抗性芽转移到芽伸长培养基上，芽伸长培养基成分为：B5 + 1.0mg/LGA3 + 100mg/LKm + 250mg/LCarb + 250mg/LCef +3%蔗糖+0.8%琼脂，pH=5.8；

（6）抗性芽生长到4-6cm后，转移到生根培养基上，生根培养基成分为1/2MS+1.0mg/L IBA+0.2mg/L NAA+250mg/LCef+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH=5.8； 

（7）当根长达到4-6cm后，将苗移栽到营养土中，将苗用薄膜覆盖，待新叶长出后去掉薄膜，获得转化植株。

2.根据权利要求1所述的农杆菌转化大豆的方法，其特征在于，所述的共培养基的pH值，优选的pH范围为6.0-7.2，最佳 pH值为6.6。

3.根据权利要求1所述的农杆菌转化大豆的方法，其特征在于，所述的共培养优选7-10天；最佳为10天。

4.根据权利要求1所述的农杆菌转化大豆的方法，其特征在于，所述的共培养期间的光照时间在优选12-16h/d；最佳为16h/d。