CN1926961A - 应用嫁接技术提高转基因大豆的遗传转化效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及提高转基因大豆遗传转化效率的方法。通过农杆菌介导大豆子叶节转化系统和胚尖转化系统获得转化不定芽，这些不定芽不经过生根、炼苗过程，直接做成接穗，采用劈接法嫁接到大豆实生苗砧木上，接穗与砧木经过接合期、愈合期、融合期和成活期四个阶段。成功的克服了大豆遗传转化效率低的限制性因素。嫁接可以提高转化植株的成活率，使成活率达到90％以上，很大程度上提高了大豆遗传转化效率，显著缩短了大豆遗传转化的周期，将改变大豆遗传转化难的现状，促进大豆遗传转化的研究和产业化发展。

Description

应用嫁接技术提高转基因大豆的遗传转化效率的方法

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及提高转基因大豆遗传转化效率的方法。

背景技术

大豆遗传转化目前已成为许多难转化植物的模式植物。目前，大豆遗传转化方法获得较为广泛认可和应用的主要有根癌农杆菌介导的子叶节转化系统和胚尖转化系统。其中，子叶节转化系统较为成熟，目前已经商业化的几个转基因大豆品种主要来源于该系统。胚尖转化系统的分化效率较高，应用潜力较大。尽管这两种系统的分化效率基本可以满足大豆转基因的需要，但是，这两套系统经过生根和炼苗两个阶段后，移栽的成活率非常低，分别为20％和10％左右，这严重制约了大豆遗传转化的研究和发展。本项发明的大豆嫁接技术，可以使大豆转化植株避开生根和炼苗这两个阶段，显著地提高转基因大豆的遗传转化效率。嫁接所需要的基本条件，大豆转化植株基本具备，但是，鉴于大豆转化不定芽比较弱小，选择劈接法作为大豆嫁接的首选方法。大豆劈接法嫁接的优点很明显，首先，接穗与砧木形成的创面比较大，有利于形成足够大的接触面积；其次，接穗与砧木之间可以形成较多的愈伤组织，愈伤组织的细胞分裂增殖旺盛，易形成的新生维管束使接穗与砧木之间连接贯通，保证嫁接成活。由于嫁接技术优势明显，该技术在大豆遗传转化中的应用，必将大幅度地提高大豆遗传转化的效率。

发明内容

本发明目的在于建立一套应用嫁接技术提高大豆遗传转化效率的方法。

本发明通过农杆菌介导大豆子叶节转化系统和胚尖转化系统获得转化不定芽，这些不定芽不经过生根、炼苗过程，直接做成接穗，采用劈接法嫁接到大豆实生苗砧木上，接穗与砧木经过接合期、愈合期、融合期和成活期四个阶段，接穗成功的转化不定芽与砧木形成一个完整的大豆植株，检测从嫁接大豆植株获得的种子，均为转基因阳性，保持了转化不定芽的遗传特征。

本发明主要技术方案如下：

1.农杆菌介导大豆子叶节转化系统：大豆种子进行氯气灭菌，然后接种到发芽培养基中4-6天，收集子叶节作为外植体，用含有目的基因的农杆菌侵染大豆子叶节，经过共培养阶段后，将外植体接种到分化筛选培养基中进行不定芽诱导，经过几次继代培养后，不定芽长到1.5-3.0cm时就可以作为接穗进行嫁接；

2.农杆菌介导大豆胚尖转化系统：大豆种子进行氯气灭菌，浸泡18-22小时，收集胚尖，用含有目的基因的农杆菌侵染大豆胚尖，经过共培养阶段后，将外植体接种到分化筛选培养基中进行不定芽诱导，经过一次继代培养后不定芽生长到2-3cm时就可以作为接穗进行嫁接；

3.劈接法嫁接：栽种大豆实生苗作为砧木来源，待实生苗的第一片真叶发生时，切除真叶，沿轴线切0.5-1.0cm左右的切口，砧木准备完毕。将获得的大豆子叶节和胚尖的转化不定芽术段造成锲型创口嫁接到砧木上，绑缚结实，嫁接完毕；

4.建立嫁接材料的适宜生长条件：嫁接后的植株用黑色袋罩好，每天喷水保湿，避光培养，培养温度为20-23℃，5-7天后嫁接苗成活。

5.提取嫁接大豆植株的嫩叶总DNA和种子总DNA，用PCR方法检测转基因大豆植株当代和T1代种子的转化特征。

本发明的优点和积极效果如下：

目前大豆是公认的难转化作物，制约大豆遗传转化效率的因素主要有是大豆的分化效率低和大豆转化植株生根难，炼苗移栽成活率低。以子叶节转化系统和胚尖转化系统为例，前者低于20％，而后者低于10％。目前提高大豆遗传转化效率主要集中在提高大豆的分化效率上，但是大豆分化效率的提高幅度不是很明显，而针对大豆转化植株生根困难，移栽成活率低这个限制因素，目前还没有好的办法来克服。通常只能通过提高大豆的分化效率来获得足够多的转化植株，以保证转基因大豆的获得，这无疑增加了大豆遗传转化的工作量。而本项发明应用嫁接技术将不同来源的转化不定芽直接嫁接到实生苗砧木上，获得了完整的和保持原有遗传特性的转化植株，成功的克服了大豆遗传转化效率低的限制性因素。应用嫁接技术优势非常明显，首先，嫁接可以提高转化植株的成活率。嫁接的成活率可以达到90％以上，这与子叶节系统低于20％和胚尖系统低于10％的成活率相比较有大幅度的提高；其次，嫁接显著缩短了大豆遗传转化的周期(从农杆菌浸染到获得T1代种子的过程)。通常，子叶节转化周期大约要4-5个月，胚尖转化周期大约要3-4个月；而采用本发明的嫁接技术，子叶节转化周期只需要3-4个月，胚尖转化周期只需要2-3个月。总之，应用嫁接技术在很大程度上提高了大豆遗传转化效率，这将改变大豆遗传转化难的现状，使大豆遗传转化像模式植物一样容易，促进大豆遗传转化的研究和产业化发展。

具体实施方式：

实施例一：利用子叶节转化的不定芽嫁接获得再生植株

1-实验材料：

1)材料：大豆材料为吉林35和吉林47，购于吉林省农科院。

2)菌株和质粒：农杆菌菌株EHA105为东北师范大学生命科学学院保存；转化载体pSBHO-3含有大豆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的反向重复序列；pBINHX-1含有角碱篷NHXI基因。

2-不定芽的获得

1)无菌大豆种子栽种发芽培养基：B5+3.0％蔗糖+0.58％琼脂，pH5.8，25℃，弱光培养5天。

2)待子叶变绿时用手术刀将其子叶分开，真叶去尽，保留0.5-1cm的下胚轴，然后顺着脉络方向轻划5刀，约3-4mm长，0.5mm深。

3)从农杆菌EHA105/pSBHO-3和EHA105/pBINHX-1平板中挑取单菌落接种到3ml YEB液体培养基中，过夜培养，再取1ml转到50ml的YEB液体培养基中培养，待生长到OD＝0.6左右时，离心4000rpm，10min，收集菌体，待用。

4)收集菌体用共培养液体培养基：1/10B5+3.9g/LMES+0.25mg/L GA3+1.67mg/L6-BAP+3％蔗糖+400mg/L Lysteine+154.2mg/LDTT+40mg/L乙酰丁香酮，pH5.4，15mL重悬两次。

5)取切好的子叶节外植体在菌液中浸染30min，浸染过的子叶平放在半固体共培养基中暗培养5-7天，温度为25℃。

6)将共培养后的子叶节外植体，接种到分化培养基：B5+10mg/L6-BAP+0.2mg/LIBA+0.59g/LMES+3％蔗糖+0.58％琼脂，pH5.7，培养14天后，再此期间要切除先分化出的不定芽。

7)然后将外植体再转入培养基：Ms盐+B5有机+0.5mg/LGA3+1.0mg/L ZT+0.1mg/LIAA+0.59g/LMES+50mg/L Asn+50mg/L Gln+3.0％蔗糖+Cef 300mg+Kanmycin50mg/L，pH5.7，诱导芽的分化，每两周继代一次。培养条件为25℃，18:6光周期。在继代时丢弃先出现的不定芽和坏死的外植体。

8)当不定芽长至1.5-3cm时就可以作为接穗来进行嫁接。

3-嫁接过程

1)吉林35种子或吉林47种子播种在土中，当实生苗长到3-4cm时作为砧木。

2)接穗处理：用手术刀将1.5-3.0cm的不定芽切下来，然后在末端造成锲型创口，露出接穗的韧皮部。

3)砧木处理：用手术刀将实生苗的真叶切除，然后沿着轴线将下胚轴切出0.5-1.0cm左右的创口。

4)劈接法嫁接：将接穗垂直插进砧木的创口中，保证接穗完全被砧木所包围，然后，用棉线在子叶的下面绑缚结实，将接穗固定牢固，再用棉线把子叶绑缚避免创口直接暴露在空气里导致植株失水过快。

5)用带有若干个小孔的黑塑料袋罩好，暗中炼苗。在此期间喷水保湿，温度控制在20-23℃。5-7天后，撤去黑塑料袋，嫁接完成，将嫁接苗移至正常生长条件下，成活率超过90％。

4-结果：

1)本技术共嫁接了32个不定芽，获得了29株转化植株，嫁接成活率为90％。

2)嫁接技术提高了大豆转化植株成活率，成活率可以达到90％，这远比传统的经过生根、炼苗移栽的成活率要高的多，直接提高了大豆的遗传转化效率。

3)应用嫁接技术缩短了大豆遗传转化周期，比原来胚尖转化的4-5个月，可以缩短到3-4个月，至少节省1个月的时间。

4)嫁接没有对大豆转化植株产生遗传突变等负面影响，能够正常的开花结实。

5)大豆转化植株经过嫁接后，T0代植株更接近于实生苗，获得的T1代种子结实饱满、种子数量多，便于对T1代种子的筛选和分析。

6)提取转化材料嫩叶和T1代种子DNA进行PCR扩增，初步证明外源基因已经整合到大豆基因组中。

实施例二：利用胚尖转化的不定芽嫁接获得再生植株

1-实验材料：

1)材料：大豆材料为吉林35和吉林47，购于吉林省农科院。

2)菌株和质粒：农杆菌菌株EHA105为东北师范大学生命科学学院保存；转化载体pSBHO-3含有大豆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的反向重复序列；pBINHX-1含有角碱篷NHXI基因。

2-不定芽的获得

1)外植体准备：取灭菌的成熟大豆种子浸泡过夜20h左右，去掉子叶，将真叶划尽。收集胚尖，插入到培养基A：1/2Ms盐+1/2B5有机+3.5mg/L BAP+3％蔗糖+0.56％琼脂，pH5.8，预培养1天，培养条件为25℃，光周期为18/6h。

2)转化菌制备：将农杆菌EHA105/pSBHO-3生长到OD＝0.6左右，离心4000rpm×10min，收集菌体。用等体积共培养液体培养基：1/2Ms盐+1/2B5有机+6mg/L BAP+3％蔗糖+0.56％琼脂+100μM乙酰丁香酮，重悬两次即可。

3)外植体侵染：将预培养的胚尖外植体放入农杆菌菌液中黑暗震荡培养20h。外植体插入固体共培养培养基中暗培养5天，温度为25℃。

4)共培养：外植体转入培养基B：1/2MS盐+1/2B5有机+加入0.2mg/LBAP+0.2mg/LIBA+3％蔗糖+0.56％琼脂+300mg/LCef，pH5.8，培养5-7天。

5)芽伸长：转入到培养基C：1/2M盐+1/2B5有机+0.2mg/LBAP+0.2mg/LIBA+3％蔗糖+0.56％琼脂+300mg/Lcef+100mg/LKan，pH5.8，培养24-26天换一批培养基。

6)当不定芽长到2-3m时就可以作为接穗来进行嫁接。

3-嫁接过程

1)吉林35种子播种在土中，当实生苗长到3-4cm时作为砧木。

2)接穗处理：用手术刀将1.5-3.0cm的不定芽切下来，然后在末端造成锲型创口，露出接穗的韧皮部。

3)砧木处理：用手术刀将实生苗的真叶切除，然后沿着轴线将下胚轴切出0.5-1.0cm左右的创口。

4)劈接法嫁接：将接穗垂直插进砧木的创口中，保证接穗完全被砧木所包围，然后，用棉线在子叶的下面绑缚结实，将接穗固定牢固，再用棉线把子叶绑缚避免创口直接暴露在空气里导致植株失水过快。

5)用带有若干个小孔的黑塑料袋罩好，黑暗条件下炼苗。在此期间喷水保湿，温度控制在20-23℃。5-7天后，撤去黑塑料袋，嫁接完成，将嫁接苗移至正常生长条件下，成活率超过90％。

4-结果：

1)本技术嫁接了137个不定芽，获得了125株转化植株，嫁接成活率为91％。

2)嫁接技术提高了大豆转化植株成活率，成活率可以达到90％以上，这远比传统的经过生根、炼苗移栽的成活率要高的多，直接提高了大豆的遗传转化效率。

3)应用嫁接技术缩短了大豆遗传转化周期，比原来胚尖转化的3-4个月，可以缩短到2-3个月，至少节省1个月的时间。

4)嫁接没有对大豆转化植株产生遗传突变等负面影响，能够正常的开花结实。

5)大豆转化植株经过嫁接后，T0代植株更接近于实生苗，获得的T1代种子结实饱满、种子数量多，便于对T1代种子的筛选和分析。

6)提取转化材料嫩叶和T1代种子DNA进行PCR扩增，初步证明外源基因已经整合到大豆基因组中。

Claims (3)

1、应用嫁接技术提高转基因大豆的遗传转化效率的方法，其特征是主要步骤如下：

1)农杆菌介导大豆子叶节转化系统：大豆种子进行氯气灭菌，然后接种到发芽培养基中4-6天，收集子叶节作为外植体，用含有目的基因的农杆菌侵染大豆子叶节，经过共培养阶段后，将外植体接种到分化筛选培养基中进行不定芽诱导，经过几次继代培养后，不定芽长到1.5-3.0cm时就可以作为接穗进行嫁接；

2)农杆菌介导大豆胚尖转化系统：大豆种子进行氯气灭菌，浸泡18-22小时，收集胚尖，用含有目的基因的农杆菌侵染大豆胚尖，经过共培养阶段后，将外植体接种到分化筛选培养基中进行不定芽诱导，经过一次继代培养后不定芽生长到2-3cm时就可以作为接穗进行嫁接；

3)劈接法嫁接：栽种大豆实生苗作为砧木来源，待实生苗的第一片真叶发生时，切除真叶，沿轴线切0.5-1.0cm左右的切口，砧木准备完毕，将获得的大豆子叶节和胚尖的转化不定芽末段造成锲型创口嫁接到砧木上，绑缚结实；

4)建立嫁接材料的适宜生长条件：嫁接后的植株用黑色袋罩好，每天喷水保湿，避光培养，培养温度为20-23℃，5-7天后嫁接苗成活；

5)提取嫁接大豆植株的嫩叶总DNA和种子总DNA，用PCR方法检测转基因大豆植株当代和T1代种子的转化特征；

2、按权利要求1所述的应用嫁接技术提高转基因大豆的遗传转化效率的方法，其特征是利用子叶节转化的不定芽嫁接获得再生植株，具体步骤如下；

应用材料：

1)材料：大豆材料为吉林35和吉林47；

2)菌株和质粒：农杆菌菌株EHA105；转化载体pSBHO-3含有大豆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的反向重复序列；pBINHX-1含有角碱篷NHXI基因；

不定芽的获得：

1)无菌大豆种子栽种发芽培养基：B5+3.0％蔗糖+0.58％琼脂，pH5.8，25℃，弱光培养5天；

2)待子叶变绿时用手术刀将其子叶分开，真叶去尽，保留0.5-1cm的下胚轴，然后顺着脉络方向轻划5刀，约3-4mm长，0.5mm深；

3)从农杆菌EHA105/pSBHO-3和EHA105/pBINHX-1平板中挑取单菌落接种到3ml YEB液体培养基中，过夜培养，再取1ml转到50ml的YEB液体培养基中培养，待生长到OD＝0.6左右时，离心4000rpm，10min，收集菌体，待用；

4)收集菌体用共培养液体培养基：1/10B5+3.9g/LMES+0.25mg/L GA3+1.67mg/L6-BAP+3％蔗糖+400mg/L Lysteine+154.2mg/LDTT+40mg/L乙酰丁香酮，pH5.4，15mL重悬两次；

5)取切好的子叶节外植体在菌液中浸染30min，浸染过的子叶平放在半固体共培养基中暗培养5-7天，温度为25℃；

6)将共培养后的子叶节外植体，接种到分化培养基：B5+10mg/L6-BAP+0.2mg/LIBA+0.59g/LMES+3％蔗糖+0.58％琼脂，pH5.7，培养14天后，再此期间要切除先分化出的不定芽；

7)然后将外植体再转入培养基：Ms盐+B5有机+0.5mg/LGA3+1.0mg/L ZT+0.1mg/L IAA+0.59g/LMES+50mg/L Asn+50mg/L Gln+3.0％蔗糖+Cef 300mg+Kanmycin 50mg/L，pH5.7，诱导芽的分化，每两周继代一次；培养条件为25℃，18:6光周期，在继代时丢弃先出现的不定芽和坏死的外植体；

8)当不定芽长至1.5-3cm时作为接穗来进行嫁接；

嫁接过程：

1)吉林35种子或吉林47种子播种在土中，当实生苗长到3-4cm时作为砧木；

2)接穗处理：用手术刀将1.5-3.0cm的不定芽切下来，然后在末端造成锲型创口，露出接穗的韧皮部；

3)砧木处理：用手术刀将实生苗的真叶切除，然后沿着轴线将下胚轴切出0.5-1.0cm左右的创口；

4)劈接法嫁接：将接穗垂直插进砧木的创口中，保证接穗完全被砧木所包围，然后，用线在子叶的下面绑缚结实，将按穗固定牢固，再用线把子叶绑缚；

5)用带有若干个小孔的黑塑料袋罩好，暗中炼苗，在此期间喷水保湿，温度控制在20-23℃，5-7天后，撤去黑塑料袋，将嫁接苗移至正常生长条件下。

3、按权利要求1所述的应用嫁接技术提高转基因大豆的遗传转化效率的方法，其特征是利用利用胚尖转化的不定芽嫁接获得再生植株，具体步骤如下：

应用材料：

1)材料：大豆材料为吉林35和吉林47；

2)菌株和质粒：农杆菌菌株EHA105；转化载体pSBHO-3含有大豆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的反向重复序列；pBINHX-1含有角碱篷NHXI基因；

不定芽的获得：

1)外植体准备：取灭菌的成熟大豆种子浸泡过夜20h左右，去掉子叶，将真叶划尽。收集胚尖，插入到培养基A：1/2Ms盐+1/2B5有机+3.5mg/L BAP+3％蔗糖+0.56％琼脂，pH5.8，预培养1天，培养条件为25℃，光周期为18/6h；

2)转化菌制备：将农杆菌EHA105/pSBHO-3生长到OD＝0.6左右，离心4000rpm×10min，收集菌体，用等体积共培养液体培养基：1/2Ms盐+1/2B5有机+6mg/L BAP+3％蔗糖+0.56％琼脂+100μM乙酰丁香酮，重悬两次；

3)外植体侵染：将预培养的胚尖外植体放入农杆菌菌液中黑暗震荡培养20h，外植体插入固体共培养培养基中暗培养5天，温度为25℃；

4)共培养：外植体转入培养基B：1/2MS盐+1/2B5有机+加入0.2mg/LBAP+0.2mg/LIBA+3％蔗糖+0.56％琼脂+300mg/LCef，pH5.8，培养5-7天；

5)芽伸长：转入到培养基C：1/2M盐+1/2B5有机+0.2mg/LBAP+0.2mg/LIBA+3％蔗糖+0.56％琼脂+300mg/Lcef+100mg/LKan，pH5.8，培养24-26天换一批培养基；

6)当不定芽长到2-3m时就可以作为接穗来进行嫁接；

嫁接过程：

1)吉林35种子播种在土中，当实生苗长到3-4cm时作为砧木；

2)接穗处理：用手术刀将1.5-3.0cm的不定芽切下来，然后在末端造成锲型创口，露出接穗的韧皮部；

3)砧木处理：用手术刀将实生苗的真叶切除，然后沿着轴线将下胚轴切出0.5-1.0cm左右的创口；

4)劈接法嫁接：将接穗垂直插进砧木的创口中，保证接穗完全被砧木所包围，然后，用线在子叶的下面绑缚结实，将接穗固定牢固，再用线把子叶绑缚；

5)用带有若干个小孔的黑塑料袋罩好，黑暗条件下炼苗，在此期间喷水保湿，温度控制在20-23℃，5-7天后，撤去黑塑料袋，将嫁接苗移至正常生长条件下。