CN101974561A - 农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学和生物技术领域，公开了农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法。本方法是在遗传转化时用无菌棉棒蘸取农杆菌涂抹于大豆子叶节部位进行接种，共培养3d后GUS染色率可高达93.18％，与传统的大豆子叶节遗传转化方法相比大大提高了农杆菌的转化效率，为进一步开展农杆菌介导的大豆转基因构建一个强有力的技术平台。

Description

农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域，涉及农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法。

背景技术

1984年，大豆的遗传转化研究首次被报道，并且证明农杆菌介导的不同作物之间的DNA转化是可靠而高效的。1988年，Hinchee等从100多份材料中筛选出对农杆菌敏感的大豆品种，以其子叶为受体材料，首次获得了大豆转基因植株(参考文献：Hinchee M AW，Connor-Ward DV，Newell C A，McDonnell R E，Sato S J，Gasser C S，FischhoffD A，Re D B，Fraley R T，Horsch RB.Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated DNA transfer.Biotechnology，1988，6：915-922)。该研究直接证明了农杆菌可以介导大豆的遗传转化，这是遗传工程应用于大豆改良上的一个里程碑。已报导的大豆遗传转化体系包括农杆菌介导法、花粉管通法、基因枪及PEG法等。农杆菌介导的转基因方法操作简便，成本低，是目前应用最广泛的一种方法。它是以大豆的子叶、子叶节、胚轴为外植体，通过抗生素筛选，器官发生再生转化植株。其中以子叶节为外植体的转化体系，即大豆子叶节转化体系由于具有组织培养时间较短，不易产生体细胞突变体和不育的植株；培育出的转基因植株具有较少的外源基因拷贝，遗传行为上较为简单稳定等优点，运用更为普遍。

长期以来，在以植物组织培养为基础的基因转化过程中，由于受基因型限制，以及受体系统不完善、大豆对农杆菌不敏感等原因，使转化的最佳条件难以确定，使农杆菌介导的大豆遗传转化频率低，实验结果重复性差。大豆一直被公认为难转化的作物之一，严重制约着基因工程技术在大豆遗传改良中的应用。在过去的几十年里，大豆的转化研究工作主要集中在通过利用GUS等报告基因优化转化方法，建立高效率的大豆遗传转化及再生体系，但结果都不十分理想，仍存在遗传转化率较低的问题，如刘栋等选用‘科丰6号’和‘合丰35’得到的GUS瞬时表达率分别为52.2％和54.5％(参考文献：刘栋，石强，李鹏丽，王宁宁.利用GUS基因瞬时表达对大豆子叶节和胚尖转化方法的比较及优化.生物学通报，2008，43(12)：35-39)。李文霞等对农杆菌介导的大豆子叶节转化系统优化的研究中发现‘黑农35’子叶节区GUS阳性率最高，为63.3％(参考文献：李文霞，宁海龙，吕文河，李文滨.农杆菌介导的大豆子叶节转化系统优化.中国农业科学，2008，41(4)：971-977)，而本发明所使用的涂抹法，GUS染色率可高达93.18％，与传统的大豆子叶节遗传转化方法相比大大提高了农杆菌的转化效率。

发明内容

本发明为解决农杆菌遗传转化大豆子叶节转化率低的问题，提供一种新型、高效的农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法，大大简化了遗传转化步骤。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法，包括大豆子叶节的外植体的获得、农杆菌的活化、遗传转化、共培养步骤，所述的农杆菌含有携带报告基因和/或外源基因的质粒，所述的遗传转化是用无菌棉棒蘸取经活化的所述的农杆菌涂抹于所述的外植体子叶节部位。

所述的含子叶节的外植体通过如下方法获得：取发育饱满无病害的大豆种子，消毒后将种子在无菌水中浸泡30～60min后接种于B₅培养基，培养5-7d，获得无菌苗；取子叶未完全展开的无菌苗，剥去种皮，切去根和大部分下胚轴，保留3-5mm的下胚轴，沿种子中线切开，分离两片子叶，切除顶芽及初生芽。

所述的大豆种子消毒方法为取发育饱满无病害的大豆种子，70％乙醇浸泡30s表面消毒，无菌水冲洗2次；0.1％升汞消毒10min，无菌水冲洗5～6次，每次4～5min。

所述的共培养是将遗传转化步骤获得的涂抹了农杆菌的外植体插入共培养培养基，黑暗中共培养3-3.5d。

所述的共培养培养基组成为B₅基本培养基+1mM硫代硫酸钠+1mM半胱氨酸+3％蔗糖+1mM二硫苏糖醇+200μmol·L^-1乙酰丁香酮+1.67mg·L^-16-BA+0.25mg·L^-1赤霉素，pH5.4，+0.7％琼脂。上述浓度均为各物质在共培养基中的终浓度。

所述的农杆菌为LBA4404、EHA101或KYRT1，优选LBA4404。

所述的报告基因为GUS基因。

本发明农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法的转化效率可通过如下方法检测：共培养后将外植体用蒸馏水冲洗，按照Jefferson的方法进行GUS组织化学染色。切下外植体的子叶节部位，浸泡在X-gluc溶液中，37℃温育过夜，95％乙醇脱色，检测显色反应。

瞬时GUS表达率＝GUS基因瞬时表达外植体数/总外植体数×100％。

有益效果：

本发明提供一种高效农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法，该方法简单方便，大大简化了遗传转化步骤，可以快速完成遗传转化，并且极大提高了转化效率，优化了农杆菌介导大豆子叶节遗传转化体系，为进一步开展农杆菌介导的大豆转基因研究构建一个强有力的技术平台。

附图说明

图1共培养3d后GUS染色情况。

A、C为对照传统菌液遗传转化外植体的染色结果，图C为图A中个体的放大图；

B、D为涂抹法遗传转化外植体的染色结果，图D为图B中个体的放大图。

具体实施方式

实施例1

1.1外植体的制备

选用‘辽鲜’(Glycine max(L)Merrill；购自南京理想种苗有限公司)作为试验材料。取发育饱满无病害的种子，70％乙醇浸泡30s表面消毒，无菌水冲洗2次后用0.1％升汞消毒10min，无菌水冲洗5～6次，每次4～5min。随后将种子浸泡于无菌水中45min后接种于B₅培养基(主要成分为：大量元素：KNO₃2.5g·L^-1，(NH₄)₂SO₄0.134g·L^-1，CaCl₂·2H₂O 0.15g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 0.025g·L^-1，KH₂PO₄·2H₂O 0.15g·L^-1；微量元素：KI 0.75mg·L^-1，H₃BO₃ 3.0mg·L^-1，MnSO₄·4H₂O 10mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O 2.0mg·L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.025mg·L^-1，CoCl₂·6H₂O 0.025mg·L^-1；有机成分：烟酸1.0mg·L^-1，肌醇100mg·L^-1，盐酸硫胺素10mg·L^-1，盐酸吡哆辛1.0mg·L^-1；铁盐：FeSO₄·7H₂O 27.8mg·L^-1，Na₂EDTA·7H₂O 37.3mg·L^-1)，转入光照培养箱。培养条件为25℃，培养5-7d(光周期为光照16h，黑暗8h)，获得无菌苗。

无菌苗取子叶还未完全展开的无菌苗，剥去种皮，切去根和大部分的下胚轴，保留3-5mm的下胚轴，沿种子中线切开，分离两片子叶，切除顶芽及初生芽，即得含子叶节的外植体。

1.2农杆菌的制备与活化

1.2.1质粒转化农杆菌：

(1)-70℃冰箱中取出一支冻存的感受态农杆菌LBA4404(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)置于冰上融化；(2)取10μl pCAMMBIA3301质粒DNA(澳大利亚国际农业分子生物学应用中心)加入到200μl已解冻的感受态农杆菌LBA4404中，轻轻混合，冰浴30min，并在液氮中速冻1min 15s后迅速转至37℃水浴中温浴5-6min；(3)加入1ml新鲜YEB液体培养基，28℃摇床，250rpm，2-4h；(4)4℃、5000rpm离心5min，弃上清液，取50ul加入200ul YEB液体培养基，涂布于YEB固体培养基(含50μg/ml Km，50μg/ml Rif)，28℃培养2-3d，直到出现菌斑，然后置于4℃条件保存。(5)在平板上挑单克隆，接种到20ml YEB液体培养基(含50μg/ml Km，50μg/ml Rif)，28℃，250rpm培养1-2d到OD₆₀₀值约0.5左右结束培养；加入80％灭菌甘油，制备成甘油菌-70℃冰箱备用。

1.2.2菌种活化

1.2.1制备的含pCAMMBIA3301质粒的农杆菌LBA4404接种于YEB固体培养基平板[含有50mg·L^-1利福平(Rif)、50mg·L^-1卡那霉素(Kan)和50mg·L^-1草丁膦(PPT)]上活化(28℃，约36h)，然后接种于YEB固体培养基平板待用。

1.3遗传转化与共培养

本发明涂抹法：无菌棉棒蘸取1.2中活化的农杆菌涂抹于子叶节部位，插入共培养基[B₅基本培养基+1mM硫代硫酸钠(Na₂S₂O₃)+1mM半胱氨酸(L-cysteine)+3％蔗糖(Sucrose)+1mM二硫苏糖醇(DTT)+200μmol·L^-1乙酰丁香酮(AS)+1.67mg·L^-16-BA+0.25mg·L^-1赤霉素(GA)，pH 5.4，0.7％琼脂(Agar)]，黑暗中共培养3d。

传统菌液法：挑取农杆菌单菌落接种于50ml YEB液体培养基[含有50mg·L^-1利福平(Rif)、50mg·L^-1卡那霉素(Kan)和50mg·L^-1草丁膦(PPT)]中，摇床培养过夜(28℃，200-250rpm)至对数生长期(OD₆₀₀约为0.5)，菌液呈桔黄色时供转化使用。菌液在10℃下5000rpm离心4min，弃上清，收集管底菌体，用液体共培养培养基[B₅基本培养基+1mM硫代硫酸钠(Na₂S₂O₃)+1mM半胱氨酸(L-cysteine)+3％蔗糖(Sucrose)+1mM二硫苏糖醇(DTT)+200μmol·L^-1乙酰丁香酮(AS)+1.67mg·L^-16-BA+0.25mg·L^-1赤霉素(GA)，pH 5.4]重悬菌体，室温下静置1h备用。将外植体浸入到重悬后的菌液中振荡浸泡30min左右，将外植体取出，无菌滤纸吸干菌液，放在铺有滤纸的共培养培养基(加0.5％琼脂的转化培养基)上，在25℃黑暗条件下共培养2-3d。

1.4转化效率检测

共培养后将外植体用蒸馏水冲洗，按照Jefferson的方法(参考文献：Jefferson R A.Assaying chimeric genes in plants：the GUS gene fusion system.Plant Molecular Biology Reporter，1987，5：387-405)进行GUS组织化学染色。切下外植体的子叶节部位，浸泡在X-gluc溶液中[EDTA10mmol·L^-1；磷酸纳缓冲液100mmol·L^-1；亚铁氰化钾0.5mmol·L^-1；铁氰化钾0.5mmol·L^-1；甲醇20％(v/v)；X-gluc 0.1％(v/v)]，37℃温育过夜，95％乙醇脱色，检测显色反应(图1)。

瞬时GUS表达率＝GUS基因瞬时表达外植体数/总外植体数×100％。结果表明(表1)，涂抹法的GUS表达率显著高于传统的农杆菌菌液遗传转化法，较传统的农杆菌遗传转化方法有极大的优势。

表1两种遗传转化方法共培养后GUS染色结果比较

备注：1、数据为3次重复平均值

2、GUS染色面积指数用0～10间数字表明：0＝没有一个外植体子叶节部位GUS呈阳性，2＝少于50％的外植体子叶节部位有10个以下离散的小点，4＝少于75％的外植体子叶节部位有20个以下离散的小点，6＝超过75％的外植体子叶节部位有20个以上离散的小点，8＝超过75％的外植体子叶节部位的GUS染色面积较大，10＝所有的外植体子叶节部位GUS染色面积很大或者整个都呈蓝色

3、*表示T测验结果达到1％的显著水平。

本发明农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法并不局限于实施例中提到的‘辽鲜’这一种大豆品种，该方法对目前常见的‘台湾75’、‘绿领1号’、‘理想95-1’等品种也具有很高的转化率。

Claims (8)

1.农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法，包括含大豆子叶节的外植体的获得、农杆菌的活化、遗传转化、共培养步骤，所述的农杆菌含有携带报告基因和/或外源基因的质粒，其特征在于：所述的遗传转化是用无菌棉棒蘸取经活化的所述的农杆菌涂抹于所述的外植体的子叶节部位。

2.根据权利要求1所述的农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法，其特征在于所述的含子叶节的外植体通过如下方法获得：取发育饱满无病害的大豆种子，消毒后将种子在无菌水中浸泡30～60min后接种于B₅培养基，培养5-7d，获得无菌苗；取子叶未完全展开的无菌苗，剥去种皮，切去根和大部分下胚轴，保留3-5mm的下胚轴，沿种子中线切开，分离两片子叶，切除顶芽及初生芽。

3.根据权利要求2所述的农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法，其特征在于所述的大豆种子消毒方法为取发育饱满无病害的大豆种子，70％乙醇浸泡30s表面消毒，无菌水冲洗2次；0.1％升汞消毒10min，无菌水冲洗5～6次，每次4～5min。

4.根据权利要求1所述的农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法，其特征在于所述的共培养是将遗传转化步骤获得的涂抹了农杆菌的外植体插入共培养培养基，黑暗中共培养3-3.5d。

5.根据权利要求5所述的农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法，其特征在于所述的共培养培养基组成为B₅基本培养基+1mM硫代硫酸钠+1mM半胱氨酸+3％蔗糖+1mM二硫苏糖醇+200μmol·L^-1乙酰丁香酮+1.67mg·L^-16-BA+0.25mg·L^-1赤霉素，pH 5.4，+0.7％琼脂。

6.根据权利要求1所述的农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法，其特征在于所述的农杆菌为LBA4404、EHA101或KYRT1。

7.根据权利要求6所述的农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法，其特征在于所述的农杆菌为LBA4404。

8.根据权利要求1所述的农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法，其特征在于所述的报告基因为GUS基因。

Images