CN106148397A

CN106148397A - 一种杨树新种质的培养方法

Info

Publication number: CN106148397A
Application number: CN201510137522.0A
Authority: CN
Inventors: 丁雪; 徐洪伟; 武慧
Original assignee: Jilin Normal University
Current assignee: Jilin Normal University
Priority date: 2015-03-27
Filing date: 2015-03-27
Publication date: 2016-11-23

Abstract

本发明公开了植物遗传工程技术领域的一种杨树新种质的培养方法，该方法由切取杨树叶片进行预培养、含有目标基因的发根农杆菌培养、将预培养杨树叶片放在发根农杆菌的菌液中侵染、侵染后叶片的共培养、侵染后叶片的抑菌培养、将叶片放在抑菌培养基中进行抑菌培养、抗性植株的生根及扩繁、转化植株炼苗及移栽步骤组成。它通过以杨树叶片为外植体，培养发根农杆菌菌液，对杨树进行遗传转化，诱导杨树产生毛状根，经PCR检测，证明毛状根为转化产生，通过快速繁殖培养，获得根系发达，植株粗壮的新种质杨树。对杨树基因工程的理论研究及遗传育种具有重要意义。

Description

一种杨树新种质的培养方法

技术领域

本发明涉及一种树木种质培养方法，属于遗传工程技术领域，具体涉及一种由农杆菌介导的杨树转化培养方法。

背景技术

杨、柳、榆、槐是我国华北、东北地区四大树种，而杨树在四大树种当中位于首位，不仅能够绿化，防止水土流失，其材质也有很高的经济价值。杨树是植物界被子植物门双子叶植物纲杨柳目杨属植物落叶乔木的通称。世界上杨树的树种非常多，在中国有60种之多。杨树适应环境能力强，早期生长迅速，每年直径生长可达4公分以上，树高每年可长4公尺左右，6年左右时间就可以长成完整植株。杨树易杂交，杂交之后易成活，遗传性状容易得到改变，进而得到优良树种。银中杨(Populus alba × P.berolinensis)是由母本银白杨、父本中东杨杂交选育的新品种，主要生活在北半球温带和寒温带地区，在中国大部分地区得到广泛种植，东至黑龙江省的富锦，经度为132°，西至甘肃的武都，经度为103°都有种植。银中杨因其树姿优美、开花不飞絮、抗逆性优于其它树种、根系发达、生长迅速、材质优良等特点，在许多城市都作为绿化树种得到广泛种植。但是，由于银中杨雄性不育，且扦插生根成活率低，导致其幼苗短缺，已经出现供不应求的状况，因此，大量培育银中杨幼苗是急需解决的问题。

杨树作为一种速生绿化树种，它的经济价值和重要性尤为突出。正因为如此，在早期应用组织培养的方式来培育的植物中，杨树就是其中一个。在20世纪中期，组培技术得到了突飞猛进的发展。在20世纪70年代，美国就有科学家以三倍体美洲山杨茎段为外植体进行愈伤组织诱导，获得了其根和茎；80年代，科学家使用组织培养技术获得的欧洲黑杨(Populus nigra)和欧美杨(Populus euramerican)的几个无性系后，其分枝数量、叶子形态、染色体数目等很多特征都发生了一定程度的变异。因此，80年代后，器官组织培养逐渐代替了愈伤组织的培养。接下来的40年间，国外学者获得了大量的杨树的组织培养再生体系，包括颤杨(Populus tremloides) 、黑场(Populm nigra)、健杨(populus X canadensis cv. Robusta)、钻天杨(Populus nigra varitalica)、脂杨(Popuhis balsamifera)、欧美杨(Populuseuramerican)、美洲黑杨（populus deltoids)、灰杨(Populm pruinosa)、加拿大杨(Populus X canadensis Moench)等很多品种，这些新树种已经被广泛的种植，用于防护林育苗。Yadav等在2009年使用三叶杨(Populm deltoides)的叶、根和节间等部位建立了三叶杨高频再生体系，为今后的遗传转化提供了可能。在国内，1978年，徐妙珍以黑杨（Populus nigra)、山杨(Populm davidiana )、胡杨(Populus euphratica )、大青杨(Populus ussuriensis )和小黑杨(Populus simonii X P. nigra)等杨树品种作为实验材料，第一次从组织器官直接获得了分化苗。目前银中杨组织培养不论是理论还是技术都已经达到比较成熟的阶段，所以，采用基因工程的方法来繁育银中杨不失一种好的选择。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的在于克服现有杨树遗传转化效率低、再生植株存活率低、实验周期长等难点，提供一种农杆菌介导的杨树种遗传转化的方法，以提高杨树的转化效率。

本发明的方法是由以下所述步骤实现的：它包括切取杨树叶片进行预培养、含有目标基因的发根农杆菌培养、将预培养杨树叶片放在发根农杆菌的菌液中侵染、侵染后叶片的共培养、侵染后叶片的抑菌培养、抗性植株的生根及扩繁、转化植株炼苗及移栽。

以上所述的方法，其中：

所述的杨树品种为银中杨；

所述的发根农杆菌菌株为A4；

银中杨叶片预培养的叶片大小为1cm*1cm，预培养培养基为由MS液体培养基加入30g/L的蔗糖和7 g·L^-1琼脂组成，pH值5.80-5.82组成；

所述含有目标基因的发根农杆菌培养的方法是：将发根农杆菌接种于LB固体培养基平板上活化2次，之后挑取该菌株的单菌落接种到5 ml 含有 20 ug·ml^-1利福平和50 ug·ml^-1卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26^oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养5-8小时，然后取1 ml 转接于50 ml 含有20 ug·ml^-1 利福平、50 ug·ml^-1卡那霉素和110 umol·L^-1乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26^oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养12-16小时后，取50 ml菌液加入到离心管中，置于低温冷冻离心机中，在温度25^oC、转速3500 rpm的条件下离心10 分钟，弃上清液，得菌体沉淀，用含6 mg·L^-16-BA 和 110 umol·L^-1乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬上述菌体沉淀至A600值为0.5-0.65备用；

所述将预培养的杨树叶片转入到装有制备好的发根农杆菌菌液的无菌三角瓶中，农杆菌菌液量以刚浸没杨树叶片为准，在温度26℃条件下，浸染10-12min ；

所述的共培养是：在25℃黑暗条件下共培养3天，共培养的培养基是：由MS液体培养基加入 0.2mg·L^-1 6-BA、0.02 mg·L^-1NAA 、110 umol·L^-1 乙酰丁香酮、30g/L的蔗糖和7 g·L^-1琼脂组成，pH值5.80-5.82组成；

所述抑菌培养的抑菌培养基是由1/2MS 固体培养基加入0.2mg·L^-1 6-BA和0.02 mg·L^-1NAA 和250mg·L^-1 Cef组成；

所述抗性植株的生根及扩繁的培养基是由1/2MS固体培养基加入 0.4 g·L^-1 活性炭和 250 mg·L^-1 Cef组成；

所述转化后的杨树再生植株的PCR鉴定方法是：当步骤⑨的植株长出新鲜嫩叶时，取新鲜嫩叶组织0.08g，液氮研磨，提取杨树基因组，利用设计好的目的基因的引物，进行PCR扩增反应。

所述转化植株炼苗及移栽是当获得的植株的根长达10 cm左右时，置于温室内开盖2-3天，然后用镊子将苗夹出，用过夜的自来水将植株根部的琼脂洗干净，移栽到花土中，移栽之后第1-2周内保持土壤湿度80%左右，且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射，2周后，栽入花盆中，温室培养。

本发明各步骤中采用的培养基均用蒸馏水按常规方法配制。其中：

固体LB培养基是由：10g·L^-1 NaCl ，10g·L^-1 蛋白胨， 5g·L^-1 酵母浸膏和 15g·L^-1 琼脂组成，pH值7.0；液体LB培养基不加琼脂；

MS培养基组成为：KNO₃ 1900 mg·L^-1，NH₄NO₃ 1650 mg·L^-1，CaCl₂·2H₂O 440 mg·L^-1，MgSO₄·7H₂O 370 mg·L^-1，KH₂PO₄ 170 mg·L^-1，H₃BO₃ 6.2 mg·L^-1，MnSO₄·H₂O 16.9 mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg·L^-1，KCl 0.83 mg·L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg·L^-1，CoCl₂·6H₂O 0.025 mg·L^-1，Na₂EDTA 37.3 mg·L^-1，FeSO₄·7H₂O 27.8 mg·L^-1，肌醇 20 g·L^-1，烟酸 100 mg·L^-1，盐酸吡哆醇 100 mg·L^-1，盐酸硫胺素 100 mg·L^-1，甘氨酸 400 mg·L^-1，蔗糖 30 g·L^-1，pH值5.80-5.83。

其共培养培养基、压力抑菌培养培养基、生根培养基以上均有说明

本发明的方法中所述发根农杆菌菌株A4，该菌株为吉林省植物资源科学与绿色生产重点实验室保存；

该菌株用于侵染杨树种子的菌液浓度优选A600值为0.55。所述的杨树叶片浸染的时间段为10min。

本发明具有以下积极的效果：

1、本发明采用杨树叶片作为实验材料，利用发根农杆菌菌液侵染10-12min，大大提高了转化效率，和转化植株的获得数量。

2、经过对抗性植株进行抑菌培养，简化了实验过程，减少了转化后的鉴定工作量。

3. 本发明的方法操作简单实用，与显微注射法、电击法和聚乙二醇方法相比，具有明显优势和突破性特点，对杨树基因工程的理论研究及遗传育种实践均具有重要意义。

附图说明

图1是杨树叶片预培养经压力抑菌培养培养基培养后，全部白化，确定为转化未成功的杨树植株，见白化苗。

图2是转化的杨树经压力抑菌培养培养基培养后，有绿色苗存活，初步确定为转化成功的杨树植株，见绿色苗。

图3是转基因杨树经压力抑菌培养后，正常生长，证明转入的外源基因不会对转基因杨树的生长发育有不利影响。

图4是转基因杨树经压力抑菌培养获得的抗性植株，移栽后的正常生长。

图5是转基因杨树植株叶片Aux基因检测结果，3号植株扩增出目标条带，为转化带。

具体实施方式

下面结合实施案例对本发明作进一步说明：

一、培养基的配制和灭菌

1、LB液体培养基的配制：分别称量10 g NaCl、10 g 蛋白胨和5 g 酵母浸膏放入到1 L三角瓶中，加入蒸馏水定容到1 L，溶解，调pH值到7.0，用封口膜封口，之后采用121^oC高压湿热灭菌20分钟，冷却后放在4^oC冰箱中，备用；

2、 LB固体培养基的配制：分别称量10 g NaCl、10 g 蛋白胨、5 g 酵母浸膏和15 g 琼脂放入到1 L三角瓶中，加入蒸馏水定容到1 L，溶解，调pH值到7.0，用封口膜封口，之后采用121^oC高压湿热灭菌20分钟，倒入无菌培养皿中，冷却后放在4 ^oC冰箱中，备用；

3、MS培养基的配制：

（1）、MS培养基母液的配制

1）、大量元素母液的配制：

①、KNO₃母液的配制：称取190g KNO₃放入到1000 ml 的烧杯中，用800 ml 蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容到1000 ml，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为100倍。

②、NH₄NO₃母液的配制：称取330g NH₄NO₃放入到1000 ml 的烧杯中，用800 ml 蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容到1000 ml，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。

③、MgSO4·7H₂O母液的配制：称取74g MgSO4·7H₂O放入到1000 ml 的烧杯中，用800 ml 蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容到1000 ml ，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。

④、KH₂PO₄母液的配制：称取34g KH₂PO₄放入到1000 ml 的烧杯中，用800 ml 蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容到1000 ml ，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。

CaCl₂·2H₂O母液的配制：称取88g CaCl₂·2H₂O放入到1000 ml 的烧杯中，用800 ml 蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容到1000 ml，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。

2）、微量元素母液的配制：分别称取6.2 g H₃BO₃，16.9 g MnSO₄·H₂O，8.6 g ZnSO₄·7H₂O，0.83 g KCl，0.25 g Na₂MoO₄·2H₂O，0.025 g CuSO₄·5H₂O，0.025 g CoCl₂·6H₂O放入到1000 ml 的烧杯中，用800 ml 蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容到1000 ml ，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为1000倍。

3）、铁盐母液的配制：分别称取18.65 g Na₂-EDTA和13.9 g FeSO₄·7H₂O，分别放入2个500 ml 烧杯中，分别加入200 ml 蒸馏水，加热并不断搅拌，使之完全溶解；冷却，将2种溶液混合，调pH至5.5，加蒸馏水定容到500 ml ，转移至棕色瓶中，在4^oC冰箱中保存；较使用浓度该母液浓度浓缩倍数为500倍。

4）、B5有机母液的配制：分别称取10 g 肌醇，0.05 g 烟酸，0.05 g 盐酸吡哆醇、0.05 g 盐酸硫胺素和0.2 g 甘氨酸，放入到500 ml 的烧杯中，用300 mL蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容到500 ml，高压灭菌，转移至无菌棕色瓶中，在4^oC冰箱中保存；较使用浓度该母液浓度浓缩倍数为200倍。

（2）、MS培养基的配制：分别吸取上述MS培养基母液：10 ml KNO3、5 ml NH₄NO₃、5 ml MgSO4·7H₂O、5 ml KH₂PO₄、5 ml CaCl₂·2H₂O、1 ml 微量元素、2 ml 铁盐、5 ml B5有机，加入到盛有800 ml 蒸馏水的1000 ml 三角瓶中，加入30 g 蔗糖，加入蒸馏水定容到1 L，充分溶解，调pH值到5.80-5.83，用封口膜封口，然后采用121^oC高压湿热灭菌20分钟；

4、共培养培养基的配制：分别吸取上述MS培养基母液：10 ml KNO3、5 ml NH₄NO₃、5 ml MgSO4·7H₂O、5 ml KH₂PO₄、5 ml CaCl₂·2H₂O、1 ml 微量元素、2 ml 铁盐、5 ml B5有机，加入到盛有800 ml 蒸馏水的1000 ml 三角瓶中，加入30 g 蔗糖、7 g 琼脂，加入蒸馏水定容到1 L，充分溶解，调pH值到5.80-5.82，用封口膜封口，然后采用121^oC高压湿热灭菌20分钟。从高压锅取出，冷却10分钟后加入 6 ml 浓度为1mg·mL^-1 的无菌6-BA，11 ml 浓度为10 mmol·L^-1 的无菌乙酰丁香酮，充分混匀，倒入无菌培养皿中，冷却后放在4^oC冰箱中，备用；

二、杨树种子的遗传转化

1、杨树叶片的预培养

植物材料为杨树叶片，切取杨树叶片为1cm*1cm的正方形，放在预培养培养基上培养3天；见附图说明图1。

2、含有目标基因的发根农杆菌培养

挑选含有的发根农杆菌A4菌株，接种于LB固体培养基平板上活化2次；之后挑取该菌株的单菌落接种到5 ml 含有 20 ug·ml^-1 利福平和50 ug·ml^-1 卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26^oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养5小时；然后取1 ml 转接于50 ml 含有20 ug·ml^-1 利福平、50 ug·ml^-1 卡那霉素和110 umol·L^-1 乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26^oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养6-8小时；至A600值为0.5-0.65备用；

3、侵染

将预培养的杨树叶片转入到装有步骤 ② 制备好的发根农杆菌菌液的无菌三角瓶中，农杆菌菌液量以刚浸没杨树叶片为准，在温度26℃条件下，浸染10-12min ；

4、共培养

25℃黑暗条件下共培养3天，共培养的培养基是：由MS液体培养基加入 0.2mg·L^-1 6-BA、0.02 mg·L^-1NAA 、110 umol·L^-1 乙酰丁香酮、30g/L的蔗糖和7 g·L^-1琼脂组成，pH值5.80-5.82组成；见附图说明图2；

5、抗性植株的抑菌培养

将经步骤⑤共培养后杨树叶片转移至抑菌培养基：由1/2MS 固体培养基加入0.2mg·L^-1 6-BA和0.02 mg·L^-1NAA 和250mg·L^-1 Cef组成；

见附图说明图3；

6、抗性植株的生根及扩繁

遗传转化再生植株的生根及扩繁，再生植株的生根及扩繁的培养基是由1/2MS固体培养基加入 0.4 g·L^-1 活性炭和 250 mg·L^-1 Cef组成，置于光照强度为2000 lx，光照时间为12 day / 8 night 的人工气候箱中培养30-40天，见附图说明图4。

7、转化植株炼苗及移栽

当抗性植株的根长达到10 cm左右时，置于温室内开盖2-3天，然后用镊子将苗夹出，用过夜的自来水将植株根部的琼脂洗干净，移栽到花土中，移栽之后第1-2周内保持土壤湿度80%左右，且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射，2周后，栽入花盆中，在温室中培养。

8、转基因植株的检测

的植株长出新鲜嫩叶时，取新鲜嫩叶组织0.08g，液氮研磨，提取杨树基因组，利用设计好的目的基因的引物，进行PCR扩增反应。

分别以对照组银中杨植株基因组DNA，待测样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应。

选取发根农杆菌中含有的AUX1基因为鉴定的目标基因，根据GeneBank上的农杆菌中AUX1基因的登录号（GI:385070），选择其中的410bp序列为目的基因序列（如下）。采用PrimerPrimer5.0引物设计软件设计引物，由华大基因合成。

Aux引物序列：

上游引物Aux F：CACCGCAGTCACGCTACAAA

下游引物Aux R：TTGGAAAGGAATCGGAGCAG

PCR扩增反应体系：

PCR扩增反应条件：

94 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 sec，44℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。

PCR反应结果经1%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外凝胶成像仪上检测，确定阳性克隆，初步获得携带目的基因的阳性植株。见附图说明图5；红色箭头处标注转化植株含有农杆菌目标基因，证明转化成功。

Claims

1.一种杨树新种质的培养方法，其特征在于：所述方法包括切取杨树叶片进行预培养、含有目标基因的发根农杆菌培养、将预培养杨树叶片放在发根农杆菌的菌液中侵染、侵染后叶片的共培养、侵染后叶片的抑菌培养、抗性植株的生根及扩繁、转化植株炼苗及移栽工艺步骤。

2. 根据权利要求1所述杨树新种质的培养方法，其特征在于：所述杨树为银中杨或者安杂杨。

3.根据权利要求1所述杨树新种质的培养方法，其特征在于：发根农杆菌菌系为：ATCC 15834或A4。

4.根据权利要求1所述杨树新种质的培养方法，其特征在于：银中杨叶片预培养的叶片大小为1cm*1cm，预培养培养基为由MS液体培养基加入30g/L的蔗糖和7 g·L^-1琼脂组成，pH值5.80-5.82组成。

5.根据权利要求1所述杨树新种质的培养方法，其特征在于：所述含有目标基因的发根农杆菌是将发根农杆菌接种于LB固体培养基平板上活化2次，之后挑取该菌株的单菌落接种到5 ml 含有 20 ug•ml^-1利福平和50 ug•ml^-1卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26℃、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养5-8小时，然后取1 ml 转接于50 ml 含有20 ug•ml-1 利福平、50 ug•ml-1卡那霉素和110 umol•L^-1乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26℃、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养6-8小时后，至A600值为0.5-0.65备用。

6.根据权利要求1所述杨树新种质的培养方法，其特征在于：将预培养的叶片放在备用的农杆菌菌液中，侵染时间为10~12 min。

7.根据权利要求1所述杨树新种质的培养方法，其特征在于：所述侵染后叶片的共培养是在25℃黑暗条件下共培养3天，共培养的培养基是：由MS液体培养基加入 0.2mg·L^-1 6-BA、0.02 mg·L^-1NAA 、110 umol·L^-1 乙酰丁香酮、30g/L的蔗糖和7 g·L^-1琼脂组成，pH值5.80-5.82组成。

8.根据权利要求1所述杨树新种质的培养方法，其特征在于：所述侵染后叶片的抑菌培养基是：由1/2MS 固体培养基加入0.2mg·L^-1 6-BA和0.02 mg·L^-1NAA 和250mg·L^-1 Cef组成。

9.根据权利要求1所述杨树新种质的培养方法，其特征在于：所述抗性植株的（即遗传转化再生植株）的生根及扩繁的培养基是由1/2MS固体培养基加入 0.4 g·L^-1 活性炭和 250 mg·L^-1 Cef组成。

10.根据权利要求1所述杨树新种质的培养方法，其特征在于：所述再生植株炼苗及移栽是在抗性植株的生根及扩繁后获得的植株的根长达10 cm左右时，置于温室内开盖2-3天，然后用镊子将苗夹出，用自来水将植株根部的培养基洗净，移栽到花土中，移栽之后第1-2周内保持土壤湿度80%左右，且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射，2周后，栽入花盆中，温室培养。