CN101703000B - 一种超甜玉米转基因再生苗的生根方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超甜玉米转基因再生苗的生根方法,该方法生根率高,适用性广。本方法采用两步生根法,先在含NAA的根诱导培养基中诱导根源基的形成;随后转接到含NAA+IBA的生根培养基中继续进行再生根的生长培养。本发明与现有方法相比,生根时间短、速度快,生根培养25天即可移栽;生根率高,根系发达;移栽成活率高;适合多种基因型,是对超甜玉米转基因苗生根培养技术的重要改革。本方法对其他植物的生根也有参考价值。
Description
技术领域
本发明属于玉米组织培养及转基因研究技术领域,具体涉及一种超甜玉米转基因再生苗的生根方法。
背景技术
组织培养技术是指在无菌条件下利用人工培养基对原生质体、悬浮细胞、植物组织等进行培养的技术。组织培养技术在农业领域的应用十分广泛,是转基因技术不可或缺的组成部分,为遗传工程提供理想的受体材料;为常规植物改良程序提供一种新的手段,更快捷、高效地创造出各种农作物和园艺植物的新品种。
超甜玉米组织培养、转基因技术中,转基因再生苗的生根技术严重制约了超甜玉米遗传工程的发展。在生根阶段,通常的做法有两种。其一是转基因再生苗在整个生根过程只在一种培养基上完成,这类方法易产生两种不良现象:(1)、生根培养基中如果生长素含量偏高,则在生根培养后期,根的表面往往表现为结构松散、凸凹不平、无根毛且透亮的玻璃化现象,这种类型的根在移栽时,植株成活率极低;(2)、生根培养基中如果细胞分裂素含量偏高,则不利于根源基的形成,造成生根缓慢甚至不生根。其二是转基因再生苗先在一种生根培养基中培养,一段时间后不生根的幼苗转接入第二种生根培养基,其中不生根的植株再转接入第三种生根培养基,甚至经历第四种、第五种生根培养基等,此类方法不足之处在于:(1)、转基因再生苗整个生根过程复杂,时间跨度大,实验周期长;(2)、生根转基因再生苗历经多次在含不同种类激素(或浓度)的生根培养基上生长,易产生激素中毒现象,最终导致转基因再生苗死亡;(3)、在生育期内生根阶段占用时间长,影响后期的田间生长。
采用第一种生根法虽然也建立了多种基因型玉米的离体再生体系,但是生根情况普遍不理想,不能满足实际生产和研究的需要;加之适合一种基因型玉米的生根方法对另一种基因型却效果不理想,缺乏一种高效、广适性的玉米生根方法。采用第二种生根方法虽然生根率较高,但是,由于生根培养过程繁琐、占用时间长,会明显影响后期的田间生长。因此,改良目前的生根培养方法是超甜玉米基因工程育种的需要,有助于转基因技术在超甜玉米育种实践中的应用。
发明内容
为克服现有超甜玉米转基因再生苗生根方法中存在的生根时间长、生根率不理想、适应性狭窄等问题,本发明的目的在于提供一种适应性广、生根速度快且效果好的超甜玉米转基因再生苗的高效生根方法。
本发明的目的通过下述技术方案来实现:
一种超甜玉米转基因再生苗的高效生根方法,先在含NAA(萘乙酸)的根诱导培养基中诱导根源基的形成;随后转接到含NAA(萘乙酸)+IBA(吲哚丁酸)的生根培养基中继续进行再生根的生长培养。
作为优选,所述根诱导培养基中含NAA0.04~0.15mg/L;更优选,所述根诱导培养基中含NAA0.05mg/L。
作为优选,所述生根培养基中含NAA 0.04~0.15mg/L,IBA 1.5~5.0mg/L;更优选,含NAA 0.05mg/L和IBA 2.0mg/L。
作为优选,所述根诱导培养基成分为:1/2MS大量元素+1/2MS微量元素+1/2铁盐+肌醇125mg/L+VB1 1.75mg/L+VB6 0.5mg/L+烟酸0.25mg/L+甘氨酸2.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖20g/L+植物凝胶2.0g/L+MES 0.5g/L。
生根培养基包括但不限于常规已知的用于组织培养的培养基,如Murashige和Skoog培养基,White培养基,Gamborg B-5培养基,Nitsch培养基,Heller培养基,ER培养基,N6培养基等,其可以是液体培养基或含有凝胶剂的固体培养基,所述凝胶剂为0.5%~1.5%的琼脂、0.1%~0.3%的植物凝胶,或1%~8%的卡拉胶。
作为优选,生根培养基的主要成分除NAA和IBA外,还包括:1/2MS大量元素+1/2MS微量元素+1/2铁盐+1/2RM维生素+植物凝胶。
本发明所述再生苗优选株型正常,主茎明显的再生植株,形成筛管、导管等传导组织。
培养时间方面,所述在根诱导培养基中培养的时间为5~10天,一般又优选8天。
与现有的生根方法相比,本发明具有如下优点:
本发明采用两步法诱导和促进生根培养,首先将再生幼苗培养在含适量生长素的培养基中进行根源基诱导,根源基形成并长出根点后再转接入含NAA和IBA的根生长培养基中,进行根的伸长培养。本发明能够使根在25天内生长到可以移栽的程度,与上述第一种方法相比提前5~10天;生根率达到96.8%,生根率比对照1高出14.5%;与上述第二种方法相比,生根阶段所用时间比对照缩短23天,节省近一半时间。此外,本发明适用于多种基因型甜玉米,对其他植物的生根也有参考价值。
本发明中,术语“生根率”指有根点长出的再生植株占进行生根培养的再生植株的百分比。
附图说明
图1为本发明中转基因再生苗在含NAA的根源基诱导培养基上的长势图。
其中:1a、为再生苗在含NAA0.05mg/L的培养基生长10天时的根长势;1b、为再生苗在含NAA0.15mg/L的培养基生长4天时的根长势;1c、为再生苗在含NAA0.1mg/L的培养基生长6天时的根长势;1d、为再生苗在含NAA0.04mg/L的培养基生长10天时的根长势。
图2为本发明中转基因再生苗在含NAA+IBA的生根培养基上的根长势图。
其中:2a、为再生苗在含NAA0.05mg/L+IBA2.0mg/L的培养基上培养20天的根长势;2b、为再生苗在含NAA 0.15mg/L+IBA 5.0mg/L的生根培养基上培养24天的根长势;2c、为再生苗在含NAA 0.05mg/L+IBA 2.0mg/L的生根培养基上培养21天的根长势;2d、为再生苗在含NAA 0.04mg/L+IBA 1.5mg/L的生根培养基上培养22天的根长势。
具体实施方式
下面结合实例及附图对本发明做进一步详细描述,但本发明的实施方式不限于此:
实施例1:以甜玉米自交系1132愈伤组织转基因再生苗进行生根培养
(1):在无菌条件下,挑选株型正常,主茎明显的再生植株,小心去除基部褐化组织。
(2):将上述准备的植株转入根源基诱导培养基,培养基成分为:1/2MS大量元素+1/2MS微量元素+1/2铁盐+肌醇125mg/L+VB1 1.75mg/L+VB60.5mg/L+烟酸0.25mg/L+甘氨酸2.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖10g/L+植物凝胶2.3g/L(或琼脂粉7.0g/L)+PH5.8。培养第10天时近50%的植株见根点长出(图1a)。
(3):将(2)中有根点长出的植株转入含NAA+IBA(0.05mg/L NAA+2.0mg/L IBA)的生根培养基(其余成分同上)进行根的伸长生长,20天后见大量根长出(图2a),生根率91.3%。
此时移栽,移栽成活率达95%。
实施例2:以甜玉米自交系1132愈伤组织转基因再生苗进行生根培养
(1):在无菌条件下,挑选株型正常,主茎明显的再生植株,小心去除基部褐化组织。
(2):将上述准备的植株转入根源基诱导培养基,培养基成分为:1/2MS大量元素+1/2MS微量元素+1/2铁盐+肌醇125mg/L+VB1 1.75mg/L+VB6 0.5mg/L+烟酸0.25mg/L+甘氨酸2.0mg/L+NAA 0.15mg/L+蔗糖10g/L+植物凝胶2.3g/L(或琼脂粉7.0g/L)+PH5.8。培养第4天时近48%的植株见根点长出(图1b)。
(3):将(2)中有根点长出的植株转入含NAA+IBA(0.15mg/L NAA+5.0mg/L IBA)的生根培养基(其余成分同上)进行根的伸长生长,24天后见大量根长出(图2b),生根率93.1%。
此时移栽,移栽成活率达91%。
实施例3:以甜玉米自交系1132愈伤组织转基因再生苗进行生根培养
(1):在无菌条件下,挑选株型正常,主茎明显的再生植株,小心去除基部褐化组织。
(2):将上述准备的植株转入根源基诱导培养基,培养基成分为:1/2MS大量元素+1/2MS微量元素+1/2铁盐+肌醇125mg/L+VB1 1.75mg/L+VB6 0.5mg/L+烟酸0.25mg/L+甘氨酸2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖10g/L+植物凝胶2.3g/L(或琼脂粉7.0g/L)+PH5.8。培养第6天时近55%的植株见根点长出(图1c)。
(3):将(2)中有根点长出的植株转入含NAA+IBA(0.05mg/L NAA+2.0mg/L IBA)的生根培养基(其余成分同上)进行根的伸长生长,21天后见大量根长出(图2c),生根率96.8%。
此时移栽,移栽成活率达99.4%。
实施例4:以甜玉米自交系日超-1愈伤组织转基因再生苗进行生根培养
(1):在无菌条件下,挑选株型正常,主茎明显的再生植株,小心去除基部褐化组织。
(2):将上述准备的植株转入根源基诱导培养基,培养基成分为:1/2MS大量元素+1/2MS微量元素+1/2铁盐+肌醇125mg/L+VB1 1.75mg/L+VB6 0.5mg/L+烟酸0.25mg/L+甘氨酸2.0mg/L+NAA 0.04mg/L+蔗糖10g/L+植物凝胶2.3g/L(或琼脂粉7.0g/L)+PH5.8。培养第10天时近51%的植株见根点长出(图1d)。
(3):将(2)中有根点长出的植株转入含NAA+IBA(0.04mg/LNAA+1.5mg/L IBA)的生根培养基(其余成分同上)进行根的伸长生长,22天后见大量根长出(图2d),生根率92.8%。
此时移栽,移栽成活率达95%。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种超甜玉米转基因再生苗的生根方法,其特征在于:先在含NAA的根诱导培养基中诱导根原基的形成;随后转接到含NAA+IBA的生根培养基中继续进行再生根的生长培养;
所述根诱导培养基成分为:1/2MS大量元素+1/2MS微量元素+1/2铁盐+肌醇125mg/L+VB1 1.75mg/L+VB6 0.5mg/L+烟酸0.25mg/L+甘氨酸2.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖10g/L+植物凝胶2.3g/L+pH5.8;
所述生根培养基成分中还包括:1/2MS大量元素+1/2MS微量元素+1/2铁盐+肌醇125mg/L+VB1 1.75mg/L+VB6 0.5mg/L+烟酸0.25mg/L+甘氨酸2.0mg/L+NAA 0.05mg/L+IBA 2.0mg/L+蔗糖10g/L+植物凝胶2.3g/L+pH5.8。
2.根据权利要求1所述的超甜玉米转基因再生苗的生根方法,其特征在于:所述再生苗选择株型正常,主茎明显且形成传导组织的再生植株。
3.根据权利要求1所述的超甜玉米转基因再生苗的生根方法,其特征在于:所述在根诱导培养基中培养的时间为5~10天。
4.根据权利要求3中所述的超甜玉米转基因再生苗的生根方法,其特征在于:所述在根诱导培养基中培养的时间为8天。
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