CN104818294A - 一种农杆菌介导的诸葛菜转基因方法 - Google Patents

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孙小芹
杭悦宇
张艳梅
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Abstract

本发明公开了一种农杆菌介导的诸葛菜转基因方法。当诸葛菜的主枝和部分侧枝现蕾并有几朵小花开放时，去除主花序和每个分枝花序已开放的花朵，只留下花蕾；将含有表达载体的农杆菌用渗透培养基悬浮，渗透培养基中含有表面活性剂Silwet L-77和蔗糖，Silwet L-77最佳浓度为500~1000μl/L，蔗糖最佳浓度为30~60g/L，喷洒于诸葛菜花序上，浸润后立即用羊皮纸包扎；同一花序连续喷洒3次，间隔2~3天；转化的7~10 天后，摘除花序上的羊皮纸袋和花序顶端的花及花蕾。该方法操作简单，所需成本降低，转基因效率高，实验周期短，在利用基因工程手段培育新型特种油料作物和诸葛菜突变体库建立方面都具有很好的应用前景。

Description

一种农杆菌介导的诸葛菜转基因方法
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种农杆菌介导的诸葛菜转基因方法。
背景技术
诸葛菜（Orychophragmus violaceus (L.) O. E. Schulz）为十字花科芸苔族诸葛菜属植物，种子含油量高达35.8%，富含对人体有利的亚油酸、油酸、棕榈酸等，而对人体不利的亚麻酸、芥酸含量极低，是一种新型优质的油料植物，也是特种油料作物新品种创制、选育的优良种源。诸葛菜野生在平原、山地与路旁。分布广，适性强，栽培管理简便，具有良好的开发利用前景。
当前，转基因技术发展迅速，并全面推动了育种技术的升级，已在特种油料作物新品种创制方面发挥了重要作用，如高芥酸工业用油料作物的创制中，在低芥酸油菜中转入来自高芥酸油菜或西蒙得木的FAE1基因，可将芥酸含量明显提高至51%~53.8%。目前诸葛菜的原生质体及子叶和下胚轴组织的转基因体系已初步建立并成功获得转基因植株（周翼明等，见参考文献），但这些遗传转化体系在应用上均较烦琐和困难，因为两者都要经过组织培养和植物再生过程，因而将受到很多因素的影响和培养条件的限制，实验重复性差、遗传转化成本高、周期长、工作量大、效率低。
近年来，在植物花期利用携带有外源基因质粒农杆菌悬浮液对植物的花器进行喷雾接种，从而将外源DNA导入胚珠中直接获得转基因种子的花序喷雾转基因法逐渐得到了应用，对于那些大面积种植在田间或植株较大、花序不集中的植物，花器喷雾法是理想的转基因方法，可望有更广的应用范围。该方法的最大优点是不依赖于植物组织培养和诱导再生植株等一整套人工培养过程，避免了植物组织培养过程中可能会产生的对植物基因型的依赖和各种无法预测的体细胞变异对后代的不利影响，且转化速度快，实验周期短，目前已成功应用于十字花科白菜、萝卜、拟南芥、盐芥和甘蓝型油菜中。
参考文献
[1] 周翼明, 卫志明. PEG法介导转化诸葛菜下胚轴原生质体获得转基因植株. 遗传学报, 1996, 23(1): 69-76。
[2] 周翼明, 卫志明. 根癌农杆菌介导转化诸葛莱获得转基因植株. 植物生理学报, 23(1): 21-28。
发明内容
本发明提供了一种农杆菌介导的诸葛菜转基因方法，通过花器喷雾法，在活体条件下，将诸葛菜花序与农杆菌接触，完成遗传细胞的转化，并通过对后代的筛选，获得转化植株，解决了诸葛菜采用常规组织培养转化法转化效率低，实验周期长的问题。
为了达到上述目的，本发明提供了一种农杆菌介导的诸葛菜转基因方法，包括如下步骤：
（1）将表达载体导入农杆菌中，其中表达载体带有抗除草剂基因Bar；
（2）将步骤（1）中制备的农杆菌用渗透培养基悬浮；
（3）将步骤（2）中含有悬浮农杆菌的渗透培养基喷洒于诸葛菜花序上；
（4）将步骤（3）中转化后的植株采取单株收种，得到T0代种子，在培育过程中利用抗除草剂Basta筛选得到具有抗性的转基因植株。
其中步骤（1）中的表达载体可为pSKI015或pGPTV-BAR系列质粒；农杆菌为GV3101；
步骤（2）中的渗透培养基中含有表面活性剂和蔗糖，表面活性剂优选Silwet L-77，最佳浓度为500~1000μl/L，蔗糖最佳浓度为30~60g/L；
步骤（3）中的诸葛菜花序为当诸葛菜的主枝和部分侧枝现蕾并有几朵小花开放时，去除主花序和每个分枝花序已开放的花朵，只留下花蕾的花序。
步骤（3）中的渗透培养基喷洒过程每隔2~3天进行一次，共重复3次，每次喷洒结束后用羊皮纸袋包扎。
步骤（4）中的抗除草剂Basta使用浓度为1: 800(V/V)，每隔3~4天喷施一次，连续喷3~4次。
本发明提供的农杆菌介导的诸葛菜转基因方法与现有技术相比，转化效率高，实验周期短，具有较大的实际应用价值。
附图说明
图1是处于最佳转化时期的诸葛菜植株照片。
图2是质粒图谱
LB为T-DNA左边界；bar为植物筛选标记基因，具有除草剂草铵膦Basta抗性；RB为T-DNA右边界。A图：pSKI015质粒；B图：pGPTV-BAR质粒。
图3是除草剂喷施之后抗性苗的PCR检测结果
图4是除草剂喷施之后抗性苗的GUS染色结果
其中中间一行3个管中的叶片经GUS染色后呈蓝色。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。引物均由IDT公司合成，PCR试剂盒来自Takara公司，植物基因组DNA提取试剂盒（DNeasy miniprep kit）购自QIAGEN公司，Basta 试剂购自AgroEvo USA公司，X-Gluc购自北京启维益成科技有限公司。常规试剂购自Takara公司。实验中所用菌株为常用菌株。
实施例1：
（1）诸葛菜种植
将诸葛菜种子于2月20日播种于苗床育苗，苗床的土壤应肥沃且湿润，上盖麦秸或塑料薄膜。大约一个月幼苗出齐后，适当通风，苗高3~4cm时逐渐撤除覆盖物，使幼苗直接接受光照，苗高8~10cm时，选择阴天或雨前移栽，行距20~30cm，株距10～15cm，栽后立即淋浇定根水。种植1000株诸葛菜，占地面积大约为50㎡（图1）。诸葛菜肥水管理按常规方法进行，当年4~5月开花。此时，选择最佳时期进行诸葛菜农杆菌转化。
（2）制备含抗除草剂Basta筛选标记基因质粒的农杆菌
农杆菌菌株选用GV3101，表达载体pSKI015质粒带有抗除草剂基因Bar，其图谱如图2所示。图中LB为T-DNA插入左边界；bar为植物筛选标记基因，具有Basta抗性；RB为T-DNA插入右边界。
（3）含有含抗除草剂Basta筛选标记基因质粒的农杆菌的培养、悬浮
挑取甘油冻存的（1）中制备的农杆菌，于含抗生素（利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L、羧苄青霉素50mg/L和庆大霉素25mg/L）的LB培养基平板上画线，28℃黑暗培养2天。挑取单菌落接种于15ml含抗生素（利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L、羧苄青霉素50mg/L和庆大霉素25mg/L）的LB液体培养基中，28℃ 200rpm摇过夜。吸取上述培养液接种于500ml同样的LB液体培养基中28℃ 200rpm摇过夜，直至OD600nm=0.8。将上述农杆菌悬浮液在6000rpm离心15min，沉淀后的悬浮液于配置好的渗透培养基中，稀释到OD600nm=0.8，用于植物转化。
渗透培养基组成成分：每1L体积去离子水中加入Silwet L-77 500-1000ul和蔗糖50g。
（4）在活体条件下进行花器喷雾法转化
当诸葛菜的主枝和部分侧枝现蕾并有几朵小花开放时，去除主花序和每个分枝花序已开放的花朵，只留下花蕾。
使用喷雾器，将步骤（2）中制备的悬浮于渗透培养基的农杆菌菌液均匀地喷洒于供转化植株花序上，农杆菌菌液的喷洒量为每朵花100~400ul。喷洒后，花序立即用羊皮纸袋包扎。
同一花序连续喷雾3次，间隔时间为2~3天。
（5）喷雾后植株的管理
浸染完后套上羊皮纸袋，在完成最后一次转化的7~10 天后，摘除花序上的羊皮纸袋和花序顶端的花及花蕾。待种子成熟后，收获晒干，即得T0代种子。
（6）转基因植株的筛选
抗除草剂筛选：将获得的T0代种子播种，于常规条件下萌发，在幼苗期按1: 800(V/V) 喷施除草剂Basta，每隔3~4天喷施一次，连续喷3~4次，在完成最后一次喷施的7~14天后统计转化率。
PCR电泳检测：对抗除草剂Basta的诸葛菜，提取植物基因组DNA。根据除草剂抗性基因Bar核苷酸序列，设计PCR引物，从植物总DNA中扩增Bar基因片段。引物序列为：BarS: 5'  TGAAGTCCAGCTGCCAGAAAC  3'；BarAS: 5'  CTACATCGAGACAAGCACGGT  3'。扩增产物用1.2%琼脂糖电泳检测，大小为425bp，结果如附图3。本发明的诸葛菜转化效率达2.6％。
实施例2：
（1）诸葛菜种植
将诸葛菜种子于2月20日播种于苗床育苗，苗床的土壤应肥沃且湿润，上盖麦秸或塑料薄膜。大约一个月幼苗出齐后，适当通风，苗高3~4cm时逐渐撤除覆盖物，使幼苗直接接受光照，苗高8~10cm时，选择阴天或雨前移栽，行距20~30cm，株距10～15cm，栽后立即淋浇定根水。种植1000株诸葛菜，占地面积大约为50㎡。诸葛菜肥水管理按常规方法进行，当年4~5月开花。此时，选择最佳时期进行诸葛菜农杆菌转化。
（2）制备含抗除草剂Basta筛选标记基因质粒的农杆菌
农杆菌菌株选用GV3101，表达载体pGPTV-BAR质粒带有抗除草剂基因Bar，其图谱如图2所示。图中LB为T-DNA插入左边界；bar为植物筛选标记基因，具有Basta抗性；RB为T-DNA插入右边界。
（3）含有含抗除草剂Basta筛选标记基因质粒的农杆菌的培养、悬浮
挑取甘油冻存的（1）中制备的农杆菌，于含抗生素（利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L）的LB培养基平板上画线，28℃黑暗培养2天。挑取单菌落接种于15ml含抗生素（利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L）的LB液体培养基中，28℃ 200rpm摇过夜。吸取上述培养液接种于500ml同样的LB液体培养基中28℃ 200rpm摇过夜，直至OD600nm=0.8。将上述农杆菌悬浮液在6000rpm离心15min，沉淀后的悬浮液于配置好的渗透培养基中，稀释到OD600nm=0.8，用于植物转化。
渗透培养基组成成分：每1L体积去离子水中加入Silwet L-77 500-1000ul和蔗糖50g。
（4）在活体条件下进行花器喷雾法转化
当诸葛菜的主枝和部分侧枝现蕾并有几朵小花开放时，去除主花序和每个分枝花序已开放的花朵，只留下花蕾。
使用喷雾器，将步骤（2）中制备的悬浮于渗透培养基的农杆菌菌液均匀地喷洒于供转化植株花序上，农杆菌菌液的喷洒量为每朵花100~400ul。喷洒后，花序立即用羊皮纸袋包扎。
同一花序连续喷雾3次，间隔时间为2~3天。
（5）喷雾后植株的管理
浸染完后套上羊皮纸袋，在完成最后一次转化的7~10 天后，摘除花序上的羊皮纸袋和花序顶端的花及花蕾。待种子成熟后，收获晒干，即得T0代种子。
（6）转基因植株的筛选
抗除草剂筛选：将获得的T0代种子播种，于常规条件下萌发，在幼苗期按1: 800(V/V) 喷施除草剂Basta，每隔3~4天喷施一次，连续喷3~4次，在完成最后一次喷施的7~14天后统计转化率。
GUS染色筛选：对抗除草剂Basta的诸葛菜植株，每个植株上采集一小片叶片，放入离心管中，加入GUS染色液（100mg 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide (X-Gluc)，100 mM phosphate buffer (pH 7.0)，0.5 mM K3Fe(CN)6，0.5mM K4Fe(CN)6，10mM 0.05% Na2EDTA， 0.1% Triton X-100）直至浸没待染组织，15分钟真空渗透后，置入370C水浴过夜，最后用梯度酒精脱色，结果如附图4。本发明的诸葛菜转化效率达1.5％。

Claims (9)

1.一种农杆菌介导的诸葛菜转基因方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将表达载体导入农杆菌中，其中表达载体带有抗除草剂基因Bar；
（2）将步骤（1）中制备的农杆菌用渗透培养基悬浮；
（3）将步骤（2）中含有悬浮农杆菌的渗透培养基喷洒于诸葛菜花序上；
（4）将步骤（3）中转化后的植株采取单株收种，得到T0代种子，在培育过程中利用抗除草剂Basta筛选得到具有抗性的转基因植株。
2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的诸葛菜转基因方法，其特征在于，步骤（1）中所述的表达载体可为pSKI015或pGPTV-BAR系列质粒。
3.根据权利要求1所述的农杆菌介导的诸葛菜转基因方法，其特征在于，步骤（1）中所述的农杆菌菌株为GV3101。
4.根据权利要求1所述的农杆菌介导的诸葛菜转基因方法，其特征在于，步骤（2）中所述的渗透培养基中含有表面活性剂Silwet L-77和蔗糖。
5.根据权利要求4所述的农杆菌介导的诸葛菜转基因方法，其特征在于，所述的表面活性剂Silwet L-77浓度为500~1000μl/L。
6.根据权利要求4所述的农杆菌介导的诸葛菜转基因方法，其特征在于，所述的所述蔗糖浓度为30~60g/L。
7.根据权利要求1所述的农杆菌介导的诸葛菜转基因方法，其特征在于，步骤（3）中所述的诸葛菜花序为当诸葛菜的主枝和部分侧枝现蕾并有几朵小花开放时，去除主花序和每个分枝花序已开放的花朵，只留下花蕾的花序。
8.根据权利要求1所述的农杆菌介导的诸葛菜转基因方法，其特征在于，步骤（3）中所述的渗透培养基喷洒为每隔2~3天进行一次，共重复3次，每次喷洒结束后用羊皮纸袋包扎。
9.根据权利要求1所述的农杆菌介导的诸葛菜转基因方法，其特征在于，步骤（4）中所述的利用抗除草剂Basta筛选具体是在幼苗期按1: 800(V/V)喷施除草剂Basta，每隔3~4天喷施一次，连续喷3~4次。
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