CN105779493A - 一种针刺-真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子的遗传转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程转化技术领域，公开了一种针刺‑真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子的遗传转化方法，通过蓖麻种子预培养、针刺预培养蓖麻种子的上胚轴、真空渗透将含目的基因的农杆菌菌液侵染蓖麻种子，然后共培养、菌除移栽即可；所述真空渗透是将针刺好的种子在菌液中，抽真空负压‑30～‑70 kPa下处理5～20min，放空气2～5min，再次负压‑30～‑70 kPa下处理2～5min，本发明直接以预培养的种子为受体，不需要离体组织培养，该方法从蓖麻种子预培养至提取DNA检测需要15天可获得转基因植株，转化周期短，转化率高，操作较简单，重复性好。

Description

一种针刺 - 真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子的遗传转化方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程转化技术领域，更具体地，涉及一种针刺-真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子的遗传转化方法。

背景技术

蓖麻是世界十大油料作物之一，是特种工业油源作物和新型石油作物。蓖麻油有独特的品质和作为“绿色石油”的可再生性能，国内外对蓖麻的研究已日益重视，并有了很大的进展。现在限制蓖麻大面积推广发展的主要问题是病害、虫害和蓖麻毒素等，所以培育抗病虫害、低毒蛋白的品种是蓖麻育种关键，但用常规方法获得这些新种质资源很难。随着2010年蓖麻的全基因组测序工作已经完成，以及分子生物学和分子遗传学的迅速发展。如果能将基因工程育种结合到蓖麻育种来，有目的的将外源基因或内源DNA导入蓖麻基因组，通过外源基因的直接表达，或通过内源基因表达的调控，从而选育出抗病、抗虫、抗逆、高产优质的蓖麻品种，为快速培育出蓖麻新种质资源提供强有力保证。但蓖麻基因工程工作已经开展多年，有关蓖麻转基因方面报道很少。Mckeon TA等（2003年）申请美国专利，用农杆菌介导方法把目的基因从蓖麻花蕾受伤处转入，所结的种子经GUS基因检测证明目的基因已转入到蓖麻中。这种方法不用复杂仪器，操作简单，避免繁琐的组织培养过程，但其缺点是获得阳性株大多数为嵌合体。Sujatha等（2005）首次以蓖麻种子的胚轴作为外植体，用农杆菌介导法将hpt和gus基因导入蓖麻受体内，经潮霉素筛选后共获得0.08%转化率植株。Malathi等（2006）在Sujatha建立的遗传转化体系基础上，体系稍作变动，以蓖麻子叶节作为外植体，同样采用农杆菌介导法将目的基因cry IAb导入蓖麻受体内，经潮霉素筛选后共获得0.42%转化率植株。Sujatha等（2009）以蓖麻胚轴作为外植体，用农杆菌介导法和基因枪法将cry 1EC基因导入蓖麻受体内，经潮霉素和卡那霉素筛选后分别获得0.82%和0.69%转化率植株，获得了抗斜纹夜蛾和尺蠖的植株。Ganesh（2012）以蓖麻子叶节作为外植体，采用农杆菌介导法将GUS基因和可可的几丁质酶基因分别导入蓖麻受体内，经卡那霉素筛选后分别获得1.17%和1.06%转化率植株，阳性株具有抗枯萎病特性。刘鹏（2012）以蓖麻子叶节为外植体，采用农杆菌介导法将蓖麻P450基因干涉载体导入蓖麻受体内，经卡那霉素筛选后获得0.1%转化率植株。黄凤兰等（2011年）申请专利，以蓖麻子叶节作为受体，用农杆菌介导法获得阳性株。但上面这些技术的缺点是所需要的时间较长，离体组织培养再生难，转化效率低，重复性差，蓖麻再生体系不能与现有的植物转化方法更好结合。所以蓖麻转基因的研究还缺乏深入，满足不了开展蓖麻分子水平的研究，急需建立一种比较成熟的蓖麻遗传转化体系。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种针刺-真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子的遗传转化方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种针刺-真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子的遗传转化方法，通过蓖麻种子预培养、针刺预培养蓖麻种子的上胚轴、真空渗透将含目的基因的农杆菌菌液侵染蓖麻种子，然后共培养、菌除移栽即可；所述真空渗透是将针刺好的种子在菌液中，抽真空负压-30～-70 kPa下处理5～20min，放空气2～5min，再次负压-30～-70 kPa下处理2～5min。

现有技术中对于蓖麻种子的遗传转化，多是采用离体组织培养，其培养时间长，且成功率低，本发明直接以蓖麻种子作为受体，蓖麻种子前期不需要进行特别的消毒，直接通过针刺、间歇式的真空渗透即可获得高转化率的蓖麻种子。

优选地，所述预培养是将蓖麻种子放在40℃温水浸泡30min，然后放到用培养皿装有吸好水的滤纸上面培养12～24h。

优选地，所述针刺预培养蓖麻种子的上胚轴是指用沾有含目的基因的农杆菌菌液的细针针刺经预培养的种子的上胚轴；更优选地，所述针刺是在超净工作台中，一手用1 mL（针头ø 0.45）规格的一次性注射器蘸取含目的基因农杆菌菌液，一手用镊子固定住预培养的种子，将针头刺向种子的胚部位，针刺位置要准（上胚轴），每次刺前先蘸取菌液，针刺深度约1 mm。

具体地，本发明所说的真空渗透是把针刺好的种子，放到盛悬浮好的含目的基因的农杆菌菌液的650 mL透气的组培瓶中，将透气的组培瓶放在真空压缩机中，抽真空负压-30～-70 kPa下处理5～20min，放空气2～5min，再次负压-30～-70 kPa下处理2～5min。抽真空结束后，继续在摇床上28℃，100 rpm摇30 min。

优选地，所述共培养是取出侵染后的种子，用无菌滤纸吸干蓖麻种子表面的菌液，转入1/2 MS培养基28℃黑暗条件下共培养3～4 d。

优选地，所述菌除是从培养基取出共培养的种子，转入无菌水中清洗5 min，再转入含1000 mg/L 头孢霉素的无菌水中浸泡1h，再用无菌水清洗3～4次，尽可能去除种子表面的农杆菌。

优选地，所述移栽是暗培养后，去除发芽的种子表面的农杆菌，直接放在育苗土中育苗；具体地，所述移栽是将菌除种子播种到装有进口芬兰诺万播基质NOVARBO培养土32孔育苗盘（规格：上口5.8 cm×高5.0 cm×底部3.0 cm）。

当种子从培养土长出至3～5叶期，剪取新叶用简易CTAB方法提取DNA检测。

优选地，所述含目的基因的农杆菌菌液的OD₆₀₀为0.6～1.1。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种针刺-真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子的遗传转化方法，通过蓖麻种子预培养、针刺预培养蓖麻种子的上胚轴、真空渗透将含目的基因的农杆菌菌液侵染蓖麻种子，然后共培养、菌除移栽即可；所述真空渗透是将针刺好的种子在菌液中，抽真空负压-30～-70 kPa下处理5～20min，放空气2～5min，再次负压-30～-70 kPa下处理2～5min，本发明直接以预培养的种子为受体，不需要离体组织培养，该方法从蓖麻种子预培养至提取DNA检测需要15天可获得转基因植株，转化周期短，转化率高，操作较简单，重复性好。

附图说明

图1 是pCAMBIA1305.1空载体图谱。

图2 是pYLRNAi-PAL超表达（A）和反义表达载体（B）图谱。

图3 是pYLRNAi-PEPC1反义表达载体图谱。

图4是蓖麻遗传转化过程示意图。

图5是不同浓度潮霉素筛选转化株。

图6是萌发种子组织化学GUS染色，其中，1～5： pCAMBIA1305.1空载体转化蓖麻种子3天胚轴染色，6：pCAMBIA1305.1空载体转化蓖麻种子7天胚轴、子叶染色；CK：没有处理的蓖麻种子胚轴染色。

图7是pCAMBIA1305.1空载体转化后潮霉素标记PCR鉴定，其中，泳道M：Marker DL2000；泳道1：阳性对照，以载体为模板进行PCR扩增；泳道2：阴性对照，以未转化蓖麻植株DNA进行PCR扩增；泳道3～9：蓖麻转基因株的PCR鉴定，其中泳道3、4、5、6、8、9是阳性转化株，泳道7是未转化株。

图8是pCAMBIA1305.1空载体转化后根茎叶潮霉素标记RT-PCR鉴定，其中，泳道M：Marker DL2000；泳道1：阳性对照，以pCAMBIA1305.1载体为模板进行PCR扩增；泳道2：阴性对照，以未转化蓖麻植株DNA进行PCR扩增；泳道3～5：蓖麻转基因株根的PCR鉴定；泳道6～8：蓖麻转基因株茎的PCR鉴定；泳道9～11：蓖麻转基因株叶的PCR鉴定。

图9是pYLRNAi.2空载体、PAL基因超表达载体和反义表达载体转化后植株表型：CK（35S⁰-8）为pYLRNAi.2空载体转化后植株，35S^{－ -}38为PAL基因反义表达载体转化后植株，35S⁺-43、35S⁺-63均为PAL基因超表达载体植株。

具体实施方式

下面结合说明书附图和 具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例 1

植物材料：蓖麻泰国202，由云南省农业科学院提供。

菌种：农杆菌EHA105；植物表达载体pCAMBIA1305.1，该载体带有GUS、Hyg基因。

药品：LA Taq、Ex Taq、pMD18-T vector均购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）；抗生素、RNaseA、Taq DNA Polymerase、dNTP（10 mmol/L）、CTAB、β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）、胰蛋白胨、琼脂粉、氨苄青霉素（Amp）、酵母粉、DEPC、甘油、氯化钙、无水乙醇、硼酸等试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

利用针刺－真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子遗传转化的方法，将pCAMBIA1305.1植物表达空载体转化到蓖麻泰国202，步骤如下：

1、农杆菌的活化与悬浮：将含有pCAMBIA1305.1表达空载体的EHA105菌液在含有Kan（50 mg/L）和Rif（25 mg/L）抗生素的YEB平板上划线，28℃倒置暗培养66～72 h。用勺子将平板上所有的菌体挖到加有100 mg/L AS的1/2 MS液体培养基里，摇匀使菌体悬浮起来。

2、种子预培养处理：挑选籽粒饱满的蓖麻种子，放在40℃温水浸泡30min，然后放到用培养皿装有吸好水的滤纸上面培养12～24h。

3、针刺：在干净的实验台面先用解剖针刺破蓖麻种子的壳，再用1 mL（针头ø 0.45）规格的一次性注射器蘸取pCAMBIA1305.1表达空载体阳性农杆菌菌悬浮液，将针头刺向种子的胚部位，针刺位置要准（上胚轴），每次刺前先蘸取菌液，针刺深度约1 mm，特别注意用力不能过猛，不能损伤胚芽顶端的分生组织。

4、农杆菌浸染：把针刺好的种子，放到盛悬浮好的菌液的650 mL透气的组培瓶中，将透气的组培瓶放在真空压缩机中，在-30 kPa下保持20 min，放空气2 min，继续在-30 kPa下保持2 min。抽真空结束后，继续在摇床上28℃，100 rpm摇30 min。

5、共培养：取出抽真空侵染后的种子，用无菌滤纸吸干蓖麻种子表面的菌液，转入1/2 MS培养基中，28℃黑暗条件下共培养3～4 d。

6、移栽：暗培养后将发芽的种子浸泡在1000 mg/L头孢霉素溶液里1 h，杀死种子表面农杆菌，用32孔育苗盘（规格：上口5.8 cm×高5.0 cm×底部3.0 cm）装进口芬兰诺万播基质NOVARBO培养土，每孔种一粒。

7、检测：真叶3叶期（大概需要15天时间），从成活224株转化株中提取DNA，经PCR检测有GUS、Hyg基因的阳性株共有184株，转化率为82%。

目前已从转基因株中获得具有GUS、Hyg转基因的T1代株系3份。

实施例 2

植物材料：蓖麻自交系HY1，由广东海洋大学农学院植物分子育种实验室提供。HY1于2005年在广东省河源市东源县收集的野生材料，经过6年多代自交稳定材料，该材料较其他栽培材料有根系发达、叶片颜色深、肥厚，经多年种植观察表现抗旱、耐涝、耐贫瘠、耐荫和高抗叶蝉特性。

菌种：农杆菌EHA105；植物表达载体pYLRNAi-PAL超表达和反义表达载体（广东海洋大学农学院植物分子育种实验室构建），该载体带有Hyg基因。

利用针刺－真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子遗传转化的方法，将pYLRNAi-PAL超表达和反义表达载体分别转化到蓖麻自交系HY1，步骤如下：

1、农杆菌的活化与悬浮：分别将含有pYLRNAi-PAL超表达和反义表达载体的EHA105菌液在含有Kan（50 mg/L）和Rif（25 mg/L）抗生素的YEB平板上划线，28℃倒置暗培养66～72 h。用勺子将平板上所有的菌体挖到加有100 mg/L AS的1/2 MS液体培养基里，摇匀使菌体悬浮起来。

种子预培养处理：挑选籽粒饱满的蓖麻种子，放在40℃温水浸泡30min，然后放到用培养皿装有吸好水的滤纸上面培养12～24h。

3、针刺：在干净的实验台面先用解剖针刺破蓖麻种子的壳，再用1 mL（针头ø 0.45）规格的一次性注射器分别蘸取pYLRNAi-PAL超表达和反义表达载体阳性农杆菌菌悬浮液，将针头刺向种子的胚部位，针刺位置要准（上胚轴），每次刺前先蘸取菌液，针刺深度约1 mm，特别注意用力不能过猛，不能损伤胚芽顶端的分生组织。

4、农杆菌浸染：把针刺好的种子，放到盛悬浮好的菌液的650 mL透气的组培瓶中，将透气的组培瓶放在真空压缩机中，在-50 kPa下保持10 min，放空气2 min，继续在-50 kPa下保持2 min。抽真空结束后，继续在摇床上28℃，100 rpm摇30 min。

5、共培养：取出侵染后的种子，用无菌滤纸吸干蓖麻种子表面的菌液，转入1/2 MS培养基中，28℃黑暗条件下共培养3～4 d。

6、移栽：暗培养后将发芽的种子浸泡在1000 mg/L头孢霉素溶液里1 h，杀死种子表面农杆菌，用32孔育苗盘（规格：上口5.8 cm×高5.0 cm×底部3.0 cm）装进口芬兰诺万播基质NOVARBO培养土，每孔种一粒。

7、检测：真叶3叶期（大概需要15天时间），分别从PAL超表达成活136株和反义表达成活114株的转化株中提取DNA，经PCR检测具有Hyg基因的阳性株分别为103株和89株，转化率分别为76%、78%。

目前已从转基因株系获得具有PAL超表达转基因的高抗和矮杆T1株系2份。

实施例 3

植物材料：蓖麻自交系YC2，由广东海洋大学农学院植物分子育种实验室提供。

菌种：农杆菌EHA105；植物表达载体pYLRNAi-PEPC1反义表达载体（广东海洋大学农学院植物分子育种实验室构建），该载体带有Hyg基因。

利用针刺－真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子遗传转化的方法，将pYLRNAi-PEPC1反义表达载体转化到蓖麻自交系YC2，步骤如下：

1、农杆菌的活化与悬浮：分别将含有pYLRNAi-PEPC1反义表达载体的EHA105菌液在含有Kan（50 mg/L）和Rif（25 mg/L）抗生素的YEB平板上划线，28℃倒置暗培养66～72 h。用勺子将平板上所有的菌体挖到加有100 mg/L AS的1/2 MS液体培养基里，摇匀使菌体悬浮起来。

2、种子消毒及预培养处理：挑选籽粒饱满的蓖麻种子，放在40℃温水浸泡30min，然后放到用培养皿装有吸好水的滤纸上面培养12～24h。

3、针刺：在干净的实验台面先用解剖针刺破蓖麻种子的壳，再用1 mL（针头ø 0.45）规格的一次性注射器分别蘸取pYLRNAi-PEPC1反义表达载体阳性农杆菌菌悬浮液，将针头刺向种子的胚部位，针刺位置要准（上胚轴），每次刺前先蘸取菌液，针刺深度约1 mm，特别注意用力不能过猛，不能损伤胚芽顶端的分生组织。

4、农杆菌浸染：把针刺好的种子，放到盛悬浮好的菌液的650 mL透气的组培瓶中，将透气的组培瓶放在真空压缩机中，在-70 kPa下保持5 min，放空气2 min，继续在-70 kPa下保持2 min。抽真空结束后，继续在摇床上28℃，100 rpm摇30 min；

5、共培养：取出侵染后的种子，用无菌滤纸吸干蓖麻种子表面的菌液，转入1/2 MS培养基中，28℃黑暗条件下共培养3～4 d；

6、移栽：暗培养后将发芽的种子浸泡在1000 mg/L头孢霉素溶液里1 h，杀死种子表面农杆菌，用32孔育苗盘（规格：上口5.8 cm×高5.0 cm×底部3.0 cm）装进口芬兰诺万播基质NOVARBO培养土，每孔种一粒。

7、检测：真叶3叶期（大概需要15天时间），分别从PEPC1反义表达成活305株的转化株中提取DNA，经PCR检测具有Hyg基因的阳性株共有220株，转化率为72%。

目前已从转基因株系获得具有PEPC1沉默表达转基因高油株系5份。

对比例 1

实验方法同实施例1，唯一不同的是步骤3中针刺的位置为子叶节，其结果发现容易破坏生长点，造成种子不萌发或生长过程中死掉。若针刺的位置为胚乳或下胚轴，其结果发现转化率低，出现嵌合体阳性转化株多。

对比例 2

实验方法同实施例1，唯一不同的是，步骤4中是：透气的组培瓶放在真空压缩机中，在-30 kPa 下保持24min，抽真空结束后，继续在摇床上28℃，100 rpm摇30 min。

其结果发现成活率高，但转化率低，实验过程中成活105株的转化株中提取DNA，经PCR检测具有Hyg基因的阳性株只有13株，转化率为12%。

对比例 3

实验方法同实施例1，唯一不同的是，步骤4中是：透气的组培瓶放在真空压缩机中，在-30 kPa下保持20min，放空气2 min，继续在-30 kPa下保持2 min。抽真空结束后，直接取出侵染后的种子，放到28℃黑暗条件下共培养。

其结果发现：成活率影响不大，但转化率低，实验过程中成活85株的转化株中提取DNA，经PCR检测具有Hyg基因的阳性株只有26株，转化率为31%。

Claims (6)

1.一种针刺-真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子的遗传转化方法，其特征在于，通过蓖麻种子预培养、针刺预培养蓖麻种子的上胚轴、真空渗透，将含目的基因的农杆菌菌液侵染蓖麻种子，然后共培养、菌除移栽即可；所述真空渗透是将针刺好的蓖麻种子在菌液中，抽真空负压-30～-70 kPa下处理5～20min，放空气2～5min，再次负压-30～-70 kPa下处理2～5min。

2. 根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，所述预培养是将蓖麻种子放在40℃温水浸泡30min，然后放到用培养皿装有吸好水的滤纸上面培养12～24h。

3. 根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，所述针刺预培养蓖麻种子的上胚轴是指用沾有含目的基因的农杆菌菌液的细针针刺经预培养的种子的上胚轴。

4. 根据权利要求3所述的遗传转化方法，其特征在于，所述含目的基因的农杆菌菌液的OD₆₀₀为0.6～1.1。

5. 根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，所述共培养是取出侵染后的种子，用无菌滤纸吸干蓖麻种子表面的菌液，转入1/2 MS培养基28℃黑暗条件下共培养3～4 d。

6. 根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，所述移栽是暗培养后，去除发芽的种子表面的农杆菌，直接放在育苗土中育苗。