CN105647966A - 一种以棉花幼胚为受体接种trv病毒诱导基因沉默方法 - Google Patents

一种以棉花幼胚为受体接种trv病毒诱导基因沉默方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105647966A
CN105647966A CN201610157678.XA CN201610157678A CN105647966A CN 105647966 A CN105647966 A CN 105647966A CN 201610157678 A CN201610157678 A CN 201610157678A CN 105647966 A CN105647966 A CN 105647966A
Authority
CN
China
Prior art keywords
agrobacterium
liquid
cotton
trv
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610157678.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN105647966B (zh
Inventor
张景霞
张军
王芙蓉
陈煜�
张传云
刘国栋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Cotton Research Center
Original Assignee
Shandong Cotton Research Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Cotton Research Center filed Critical Shandong Cotton Research Center
Priority to CN201610157678.XA priority Critical patent/CN105647966B/zh
Publication of CN105647966A publication Critical patent/CN105647966A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105647966B publication Critical patent/CN105647966B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y202/00—Transferases transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C12Y202/01—Transketolases and transaldolases (2.2.1)
    • C12Y202/01007—1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (2.2.1.7)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种以棉花幼胚为受体接种TRV病毒诱导内源基因沉默的方法，步骤如下：(1)将目的基因插入TRV病毒载体中，制备重组载体，然后转化农杆菌，制得转化后的农杆菌；(2)取棉花种子，经脱绒、灭菌后，经萌发后去除萌发种子的内、外皮，幼胚放入含有赤霉素的MS液体培养基中，制得待侵染胚；(3)培养转化后的农杆菌，制得农杆菌侵染液，制得侵染液，将待侵染胚浸入侵染液中，暗培养，经共培养后，栽种到灭菌的营养土中，进行营养土培养，即可。本发明首次以棉花幼胚作为受体接种TRV病毒，不对幼胚进行破坏性处理，不产生任何损伤，克服了接种病毒时对棉苗造成机械损伤的缺点。

Description

一种以棉花幼胚为受体接种TRV病毒诱导基因沉默方法
技术领域
本发明涉及一种以棉花幼胚为受体接种TRV病毒诱导内源基因沉默的方法，属于植物基因工程技术领域。
背景技术
陆地棉全基因组测序已完成，产生海量DNA序列信息，深入研究这些序列的功能尤为迫切。传统的基因功能研究手段主要以遗传转化为基础，但棉花的转化效率低，转化过程繁琐且对受体基因型的依赖性较强，严重限制棉花功能基因组研究的发展。
病毒介导的基因沉默(virusinducedgenesilencing，VIGS)是一种快速、高效、高通量的反向遗传学技术，其原理是利用重组病毒抑制植物内源基因的表达，通过表型及生理数据的分析鉴定基因功能。VIGS技术克服传统研究方法需要依赖遗传转化的局限性，近几年在棉花基因功能研究中得到广泛应用。其中，烟草脆裂病毒(tobaccorattlevirus，TRV)载体是棉花中应用最为广泛VIGS载体。虽然VIGS沉默起效快、效率高，但该技术在具体实验操作中的不足之处亦很明显，如接种病毒的方式多利用注射器渗透子叶或摩擦破坏叶表皮接种，对棉苗造成损伤；接种时间一般在子叶完全平展后，因此，不能用来研究发育较早期的基因功能；接种病毒时所需农杆菌侵染液制备量大，实验成本高；接种过程耗时长等。对VIGS技术体系中的不足之处进行改良，可使该技术在棉花基因功能研究中发挥更大作用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种无损伤、沉默时间更早、成本更低、操作更简便的转化方法，即以棉花幼胚为受体的TRV病毒诱导基因沉默的方法。
一种以棉花幼胚为受体的TRV病毒诱导基因沉默的方法，步骤如下：
(1)将目的基因插入TRV病毒载体中，制备重组载体，然后转化农杆菌，制得转化后的农杆菌；
(2)取棉花种子，经脱绒、灭菌后，经萌发后去除萌发种子的内、外皮，幼胚放入含有2.5～3.5mg/LGA3(赤霉素)的MS液体培养基中，25～30℃，120rpm/min暗培养6～10h，制得待侵染胚；
(3)培养步骤(1)制得的转化后的农杆菌，制得农杆菌侵染液，然后加入农杆菌侵染液质量百分比0.15～0.25％的表面活性剂，制得侵染液，将步骤(2)制得的待侵染胚浸入侵染液中，22～28℃，100～150rpm/min，暗培养20～40分钟，去除多余侵染液，经共培养后，栽种到灭菌的营养土中，进行营养土培养，即可。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的目的基因为棉花GhCLA1基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的重组载体，为将目的基因用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切后，连接入同样经限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切后的TRV病毒载体中。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的转化为冻融法转化。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的病毒载体TRV载体系统，包含TRV1和TRV2载体；农杆菌为GV3101。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中脱绒为采用浓硫酸脱绒，灭菌为采用质量浓度为15％的双氧水浸泡0.5～1.5h，然后用大量的无菌水冲洗。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中萌发为在灭菌水中25～30℃浸泡15～18h。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中农杆菌侵染液的制备步骤如下：
将转化后的农杆菌涂布在含有50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、50mg/L利福平的LB固体培养基上，25～30℃暗培养2～3天；挑取单克隆接入含有相同浓度抗生素的LB液体培养基中，25～30℃振荡过夜培养，制得液体培养物；
取1mL液体培养物扩繁至100mL含有上述相同浓度抗生素且附加了10mM的MES和20μM乙酰丁香酮的LB液体培养基中，25～30℃过夜培养；25℃，4500rpm离心菌体，将菌体重悬在含有10mMMgCl2，10mMMES(2-(N-吗啉)乙磺酸)，200μMAS(乙酰丁香酮)的MS液体培养基中，调整OD600＝1.5，22～28℃，暗处理2.5～3h，制得农杆菌侵染液。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中表面活性剂为SilwetL-77。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中共培养为在共培养培养基中于22～28℃暗培养2～3天；共培养培养基为含有200μM乙酰丁香酮的MS液体培养基；
进一步优选的，所述含有200μM乙酰丁香酮的MS液体培养基为将200μM乙酰丁香酮的MS液体培养基浸润4～7层滤纸制得。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中营养土培养为将生根后的幼苗在22～25℃，14h光照/10h黑暗的条件下，与营养土中培养，即可。
上述MS液体培养基，每升组分如下：
NH4NO31650mg、KNO31900mg、KH2PO4170mg、CaCl2·2H2O440mg、MgSO4·7H2O440mg、FeSO4·7H2O27.85mg、Na2-EDTA37.25mg、MnSO4·4H2O22.3mg、ZnSO4·7H2O8.6mg、H3BO36.2mg、KI0.83mg、Na2MoO4·2H2O0.25mg、CuSO4·5H2O0.025mg、CoCl2·6H2O0.025mg、肌醇100mg、盐酸硫胺素(VB1)10mg、盐酸吡哆醇(VB6)1mg、烟酸1mg。
LB固体培养基，每升组分如下：
胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、Nacl10g、10g/L琼脂粉，pH＝7.0；高压蒸汽灭菌20min。
LB液体培养基，每升组分如下：
胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、Nacl10g，pH＝7.0；高压蒸汽灭菌20min。
有益效果
1、本发明首次以棉花幼胚作为受体接种TRV病毒，诱导基因沉默；该方法不对幼胚进行破坏性处理，不产生任何损伤，克服了接种病毒时对棉苗造成机械损伤的缺点；
2、本发明采用浸泡幼胚接种方式，操作简单，有效缩短接种时间；
3、采用本发明的技术对棉花进行基因沉默实验，第一片真叶即可发生基因沉默，可用于棉花发育早期基因的功能研究。
附图说明
图1是侵染后的棉苗生长2个月时的白化表型照片；
图中：左图为GhCLA1基因沉默棉株，叶片和茎部可见明显的白化表型；右图为对照，未出现白化现象；
图2是一步法RT-PCR检测沉默植株不同组织中病毒RNA的累积情况的电泳检测结果照片；
RT-PCR结果显示，在侵染苗的根、茎、叶、子叶中均能扩增出明亮的特异性条带，说明TRV病毒可全株扩散，未接种病毒的对照株中未扩增出任何产物。
图3是利用QualiPlateKitforCry1Ab/Cry1Ac试剂盒检测棉株中BT蛋白的含量的柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源：
TRV载体的构建参考XiquanGao等论文Agrobacterium-MediatedVirus-InducedGeneSilencingAssayInCotton(Journalofvisualizedexperiments,8/20/2011,URL:http://www.jove.com/details.php？id＝2938)中的内容进行制备；
供试棉花品种为coker312和鲁棉研37号，购自临清鲁壹种业有限公司；
农杆菌GV3101感受态购自华越洋生物科技有限公司；
实施例1
棉花GhCLA1基因(cloroplastosalterados1gene)编码1-deoxyxylulose5-phosphate合成酶，参与叶绿体发育过程。GhCLA1基因沉默产生明显的白化表型，在VIGS体系中被广泛用作基因沉默的标记性状。本实施例中，以幼胚为受体接种TRV病毒诱导棉花GhCLA1基因沉默，具体方法如下：
(1)将目的基因插入病毒载体TRV2中，制备重组载体，然后转化农杆菌，制得转化后的农杆菌：
目的基因的制备：提取棉花叶片总RNA，反转录后获得cDNA，用GhCLA1基因特异引物(F1：5，-GCGGAATTCCACAACATCGATGATTTAG-3’；R1：5’-CGGGGTACCATGATGAGTAGATTGCAC-3’)扩增GhCLA1基因中约400bp的片段。
所述PCR扩增体系为(总体积50μl)：
所述PCR扩增程序如下:
95℃预变性3min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸40s，32个循环；72℃延伸10min。
病毒载体TRV2-GhCLA1的构建与农杆菌转化：将棉花GhCLA1基因中的400bp左右片段用EcoRI和KpnI限制性内切酶酶切后，连入同样酶切的病毒载体TRV2中，构建TRV2-GhCLA1重组载体，利用冻融法转化农杆菌GV3101；TRV1载体利用同样方法转化农杆菌GV3101。
(2)无菌幼胚的制备与预培养：
选取饱满、种子活力高的棉种用浓硫酸脱绒，大量流水冲洗干净，直至没有酸味。用15％的双氧水浸泡棉种1h，期间晃动5次。灭菌水冲洗6次，浸泡在无菌水中2h，再用灭菌水冲洗3次，28℃浸泡18h。种子萌发后，无菌环境下将棉种的内、外种皮剥去，注意不要损伤子叶和胚根，放入含有3mg/LGA3的MS液体培养基中，28℃，120rpm/min暗培养8h。
(3)接种病毒及培养：
培养步骤(1)制得的转化后的农杆菌，制备农杆菌侵染液，然后加入农杆菌侵染液质量百分比0.2％的表面活性剂SilwetL-77，制得侵染液，将步骤(2)制得的待侵染胚浸入侵染液中，28℃，120rpm/min，暗培养20分钟，去除多余侵染液，经共培养后，栽种到灭菌的营养土中，进行营养土培养，即可。
侵染液的制备与接种：将步骤(1)中经TRV2-GhCLA1和TRV1转化后的农杆菌菌种涂布在含50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、50mg/L利福平的LB固体培养基上，28℃暗培养2天。挑取单克隆，接种到5mL含有相同抗生素的LB液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养过夜。取1mL液体培养物扩繁至100mL含有上述抗生素，且另外附加了10mMMES和20μM乙酰丁香酮的LB液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养过夜。25℃，5000rpm转速，离心收集菌体，将菌体重悬在含有100mMMES、10mMMgCl2、200μM乙酰丁香酮的MS液体培养基中。利用分光光度计调整浓度为OD600＝1.5，在黑暗处放置3h。TRV1农杆菌侵染液的制备与TRV2-GhCLA1相同。将制备好的TRV1和TRV2-GhCLA1农杆菌侵染液等体积混匀，加入0.2wt％的表面活性剂SilwetL-77。将用GA3预培养后的棉花幼胚浸入上述制备好的农杆菌侵染液中，25℃，120rpm/min，暗培养30分钟，对棉花幼胚进行接种。
接种后的培养：接种后，将幼胚放在灭菌滤纸上，吸去多余侵染液。在培养皿中铺放5层灭菌滤纸，用含有200μM乙酰丁香酮的MS液体培养基浸湿滤纸，将幼胚平铺在培养皿中，25℃暗培养2天。将长出胚根的幼胚移栽到经过高温灭菌的培养土里，23℃，光照时间为14/10h光暗周期的气候室中培养。培养期间，需保持环境温度不超过24℃。
(4)沉默株的表型观察与分子检测：
培养18天，棉株刚长出的真叶和茎即可出现明显的白化表型，该表型可持续4～5个月(如图1所示)。分别提取白化植株的子叶、真叶、茎和根的总RNA，利用TRV2载体中的特异性序列设计引物(F2：5’-TGGAGTTGAAGAGTTATTACCGAAGG-3’；R2：5’-CCGGAATTCGAAACTCAAATGCTACCAA-3’)，进行一步法RT-PCR，检测接种后病毒RNA的累积情况。
RT-PCR结果显示，在子叶、真叶、茎和根组织提取的RNA样品中，均能扩增出明亮的特异性条带，而在未接种的对照株中没有任何扩增产物。RT-PCR的结果说明，对棉花幼胚进行接种后，病毒RNA可在棉苗不同部位扩散累积(如图2所示)。
实施例2
(1)将目的基因Cry1Ab/Ac插入病毒载体TRV2中，制备重组载体，然后转化农杆菌，制得转化后的农杆菌：
目的基因的制备：利用Cry1Ab/Ac基因特异引物PCR扩增转基因抗虫棉(鲁棉研37号)中的Cry1Ab/Cry1Ac基因(基因序列如SEQIDNO.2所示)中的440bp左右的片段。所用引物为F3(5’-CCGGAATTCAACAGCGCCTTGACCACAGC-3’)和R3(5’-CGGGGTACCGGGCAGAACCACGGAAGC-3’)。
所述PCR扩增体系如下(总体系50μl)：
所述PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，32个循环；72℃延伸10min。
载体的构建与转化：将制备的Cry1Ab/Cry1Ac基因片段经EcoRI和KpnI双酶切后连入同样双酶切的病毒载体TRV2中，制备重组载体TRV2-Cry1Ab/Ac，利用冻融法转化农杆菌GV3101，制得转化后的农杆菌。未经改造的TRV1载体同样利用冻融法转化农杆菌GV3101，作为阳性对照；
(2)无菌幼胚的制备与预培养：
选取饱满、种子活力高的棉种用浓硫酸脱绒，大量流水冲洗干净。用15％的双氧水浸泡棉种1h，期间晃动4次。灭菌水冲洗6次，浸泡在无菌水中2h，再用灭菌水冲洗5次，在灭菌水中28℃浸泡18h。种子萌发后，无菌环境下将棉种的内、外种皮剥去，注意不要损伤子叶和胚根，放入含有3mg/LGA3植物激素的MS液体培养基中，28℃，120rpm/min暗培养8h。
(3)接种病毒及培养：
培养步骤(1)制得的转化后的农杆菌，制备农杆菌侵染液，然后加入农杆菌侵染液质量百分比0.2％的表面活性剂，制得侵染液，将步骤(2)制得的待侵染胚浸入侵染液中，25℃，120rpm/min，暗培养30分钟，去除多余侵染液，经共培养后，栽种到灭菌的营养土中，按常规方法培养即可。
侵染液的制备与接种：将步骤(1)中经TRV2-GhCLA1和TRV1转化后的农杆菌菌种涂布在含50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、50mg/L利福平的LB固体培养基上，28℃暗培养2天。挑取单克隆，接种到5mL含有相同抗生素的LB液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养过夜。取1mL液体培养物扩繁至100mL含有上述抗生素，且另外附加了10mMMES和20μM乙酰丁香酮的LB液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养过夜。室温，5000rpm转速，离心收集菌体，将菌体重悬在含有100mMMES、10mMMgCl2、200uM乙酰丁香酮的MS液体培养基中。利用分光光度计调整浓度为OD600＝1.5，在黑暗处放置3h。TRV1、TRV2农杆菌侵染液的制备与TRV2-Cry1Ab/Ac相同。将制备好的TRV1分别与TRV2和TRV2-Cry1Ab/Ac农杆菌侵染液等体积混匀，制成对照侵染液和实验侵染液，分别加入0.2wt％的表面活性剂SilwetL-77。将GA3预培养后的棉花幼胚分别浸入上述制备好的对照侵染液(TRV1和TRV2)和实验侵染液(TRV1和TRV2-Cry1Ab/Ac)中，25℃，120rpm/min，暗培养30分钟，对棉花幼胚进行接种。
接种后的培养：接种后，将幼胚放在灭菌滤纸上，吸去多余侵染液。在培养皿中铺放5层灭菌滤纸，用含有200μM乙酰丁香酮的MS液体培养基浸湿滤纸，将幼胚平铺在培养皿中，25℃暗培养2天。将长出胚根的幼胚移栽到经过高温灭菌的培养土里，23℃，光照时间为14/10h光暗周期的气候室中培养。培养期间，需保持环境温度不超过26℃。
(4)分子检测：
Cry1Ab/Ac蛋白的ELISA检测：培养2月后，用ENVIROLOGIX公司的QualiPlateKitforCry1Ab/Cry1Ac试剂盒检测棉株种的BT蛋白含量。实验步骤如下：
分别取对照组和实验组棉株(每组10株)的倒3叶，约0.15克，记录重量，用液氮研磨，研细的粉末加到4mL样品提取液PBST(PBS缓冲液加入0.05wt％的Tween-20)中，4℃过夜提取。
4℃，8000rpm，离心10min,将上清液转至干净离心管，测量上清液体积。将上清液稀释到合适的浓度，备用。取50ulCry1Ab/AcEnzymeconjugate加入酶标板中，再加入50ul稀释后的上清液。为制作标准曲线，加入50ul试剂盒提供的Cry1Ab/AcPositivecontrol。每样品3重复。常温避光孵育2h。用PBST洗板4次。加入substrate显色底物100μl,常温避光反应15-30min，加入stopsolution反应终止液100μl，用酶标仪测定450nm的OD值，换算为BT蛋白的含量(单位为ng/g鲜重)。结果见图3。实验组(VIGS)叶片BT蛋白的含量明显低于对照组(CK)，说明VIGS病毒侵染棉花幼胚后，可有效诱发转录后基因沉默，导致BT蛋白含量降低。
对比例
选用完全平展的子叶作为侵染对象，利用注射器渗透子叶法，接种TRV病毒诱发棉花GhCLA1基因沉默。侵染载体的制备和侵染液的制备同实施例1。
选择发育成熟、颗粒饱满的棉种200粒，浸入水中，28℃培养过夜催芽。将棉种播种到培养土中。28℃，光照/黑暗14/10h周期，培养10～20天。待子叶完全平展后，用注射器针尖轻轻划破子叶背面表皮，利用1mL注射器将配置好的农杆菌侵染液压渗入子叶中。侵染后的棉苗用塑料膜覆盖保湿，放置在25℃培养室中，暗培养1～2天。随后，对侵染后的棉苗进行正常培养。培养2周后，观察棉苗白化的情况。
同时，选择发育成熟、颗粒饱满的棉种200粒，利用本发明的方法，对幼胚为受体进行VIGS基因沉默实验。
自棉种28℃浸水催芽始(记做第一天)，对两种方法的接种时间等进行对比。结果如表1所示。
表1不同受体的比较
由表1可以看出，本发明首次以棉花幼胚作为受体接种TRV病毒，不对幼胚进行破坏性处理，不产生任何损伤，克服了接种病毒时对棉苗造成机械损伤的缺点；采用浸泡幼胚接种方式，操作简单，有效缩短接种时间。

Claims (10)

1.一种以棉花幼胚为受体的TRV病毒诱导棉花基因沉默的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将目的基因插入TRV病毒载体中，制备重组载体，然后转化农杆菌，制得转化后的农杆菌；
(2)取棉花种子，经脱绒、灭菌后，经萌发后去除萌发种子的内、外皮，幼胚放入含有2.5～3.5mg/LGA3(赤霉素)的MS液体培养基中，25～30℃，120rpm/min暗培养6～10h，制得待侵染胚；
(3)培养步骤(1)制得的转化后的农杆菌，制得农杆菌侵染液，然后加入农杆菌侵染液质量百分比0.15～0.25％的表面活性剂，制得侵染液，将步骤(2)制得的待侵染胚浸入侵染液中，22～28℃，100～150rpm/min，暗培养20～40分钟，去除多余侵染液，经共培养后，栽种到灭菌的营养土中，进行营养土培养，即可。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的目的基因为棉花GhCLA1基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的重组载体，为将目的基因用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切后，连接入同样经限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切后的TRV病毒载体中；
优选的，所述步骤(1)中的转化为冻融法转化。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的病毒载体TRV载体系统，包含TRV1和TRV2载体；农杆菌为农杆菌GV3101。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中脱绒为采用浓硫酸脱绒，灭菌为采用质量浓度为15％的双氧水浸泡0.5～1.5h；
优选的，所述步骤(2)中萌发为在灭菌水中25～30℃浸泡15～18h。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中农杆菌侵染液的制备步骤如下：
将转化后的农杆菌涂布在含有50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、50mg/L利福平的LB固体培养基上，25～30℃暗培养2～3天；挑取单克隆接入含有相同浓度抗生素的LB液体培养基中，25～30℃振荡过夜培养，制得液体培养物；
取1mL液体培养物扩繁至100mL含有上述相同浓度抗生素且含有10mM的MES和20μM乙酰丁香酮的LB液体培养基中，25～30℃过夜培养；25℃，4500rpm离心菌体，将菌体重悬在含有10mMMgCl2，10mM2-(N-吗啉)乙磺酸，200μM乙酰丁香酮的MS液体培养基中，调整OD600＝1.5，22～28℃，暗处理2.5～3h，制得农杆菌侵染液。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中表面活性剂为SilwetL-77。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中共培养为在共培养培养基中于22～28℃暗培养2～3天；共培养培养基为含有200μM乙酰丁香酮的MS液体培养基。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述含有200μM乙酰丁香酮的MS液体培养基为将200μM乙酰丁香酮的MS液体培养基浸润4～7层滤纸制得。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中营养土培养为将生根后的幼苗在22～25℃，14h光照/10h黑暗的条件下，与营养土中培养，即可。
CN201610157678.XA 2016-03-17 2016-03-17 一种以棉花幼胚为受体接种trv病毒诱导基因沉默方法 Active CN105647966B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610157678.XA CN105647966B (zh) 2016-03-17 2016-03-17 一种以棉花幼胚为受体接种trv病毒诱导基因沉默方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610157678.XA CN105647966B (zh) 2016-03-17 2016-03-17 一种以棉花幼胚为受体接种trv病毒诱导基因沉默方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105647966A true CN105647966A (zh) 2016-06-08
CN105647966B CN105647966B (zh) 2019-05-28

Family

ID=56494716

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610157678.XA Active CN105647966B (zh) 2016-03-17 2016-03-17 一种以棉花幼胚为受体接种trv病毒诱导基因沉默方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105647966B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107173230A (zh) * 2017-07-03 2017-09-19 内蒙古医科大学 一种促进贺兰山丁香种子高效萌发的方法
CN108949809A (zh) * 2018-07-05 2018-12-07 北京林业大学 一种连翘叶片trv载体介导病毒诱导基因沉默的方法
CN110172473A (zh) * 2019-05-17 2019-08-27 郑州大学 一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS
CN111713288A (zh) * 2020-06-29 2020-09-29 宁波大学 一种中国小麦花叶病毒cwmv的接种方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1687424A (zh) * 2005-05-13 2005-10-26 吉林省农业科学院 一种植物转基因方法
CN101120656A (zh) * 2007-09-21 2008-02-13 河北农业大学 一种棉花幼胚离体培养和植株形成的培养基及培养方法
CN102803496A (zh) * 2009-06-10 2012-11-28 淡马锡生命科学研究院有限公司 用于棉花中基因功能性分析的病毒诱导的基因沉默(vigs)
CN104726489A (zh) * 2015-03-31 2015-06-24 陕西师范大学 农杆菌介导的活体幼胚转化获得转基因棉花的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1687424A (zh) * 2005-05-13 2005-10-26 吉林省农业科学院 一种植物转基因方法
CN101120656A (zh) * 2007-09-21 2008-02-13 河北农业大学 一种棉花幼胚离体培养和植株形成的培养基及培养方法
CN102803496A (zh) * 2009-06-10 2012-11-28 淡马锡生命科学研究院有限公司 用于棉花中基因功能性分析的病毒诱导的基因沉默(vigs)
CN104726489A (zh) * 2015-03-31 2015-06-24 陕西师范大学 农杆菌介导的活体幼胚转化获得转基因棉花的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK: "PREDICTED: Gossypium raimondii probable 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate chloroplastic (LOC105777169), mRNA", 《GENBANK DATABASE》 *
XIQUAN GAO 等: "Functional Genomic Analysis of Cotton Genes with Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing", 《METHODS MOL BIOL.》 *
林顺权 主编: "《园艺植物生物技术》", 31 August 2007, 中国农业出版社 *
王心宇 等: "TRV病毒介导的基因沉默体系在棉花中的建立及应用", 《作物学报》 *
陈凌娜 等: "基因枪介导外源基因转化棉花幼胚方法的研究", 《新疆农业大学学报》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107173230A (zh) * 2017-07-03 2017-09-19 内蒙古医科大学 一种促进贺兰山丁香种子高效萌发的方法
CN108949809A (zh) * 2018-07-05 2018-12-07 北京林业大学 一种连翘叶片trv载体介导病毒诱导基因沉默的方法
CN108949809B (zh) * 2018-07-05 2022-03-08 北京林业大学 一种连翘叶片trv载体介导病毒诱导基因沉默的方法
CN110172473A (zh) * 2019-05-17 2019-08-27 郑州大学 一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS
CN110172473B (zh) * 2019-05-17 2023-02-24 郑州大学 一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS
CN111713288A (zh) * 2020-06-29 2020-09-29 宁波大学 一种中国小麦花叶病毒cwmv的接种方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105647966B (zh) 2019-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105647966A (zh) 一种以棉花幼胚为受体接种trv病毒诱导基因沉默方法
CN103966258A (zh) 一种农杆菌介导的甘蓝型油菜遗传转化方法
CN102485897A (zh) 利用棉花基因GbF3H改变花瓣颜色
CN104004781A (zh) 一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法
CN105506057A (zh) 一种利用水稻离体叶片进行纹枯病接种和抗性评价的方法
CN109182146B (zh) 一种脐孢木霉菌株及其应用
CN104450779A (zh) 一种快速高效的农杆菌介导的水稻茎尖遗传转化方法
CN103749309B (zh) 一种生产白术脱毒苗的方法
CN101928724A (zh) 一种利用叶绿体转基因技术的机械化杂交稻制种方法
CN106754925A (zh) 一种脱落酸快速诱导启动子及其应用
CN111876439B (zh) 一种农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法
CN102492721A (zh) 一种农杆菌介导的芝麻遗传转化方法
CN117070557A (zh) 一种快速高效的农杆菌介导的鸢尾种子遗传转化方法
CN104620983B (zh) 一种稗草组织培养成苗的方法
CN106755084A (zh) 一种茶树快速转基因方法
CN106811482A (zh) 三色堇种子浸泡法直接导入外源基因的遗传转化方法
CN107173225B (zh) 用甘薯叶柄进行愈伤组织诱导和分化的方法
CN105779493A (zh) 一种针刺-真空渗透辅助农杆菌介导蓖麻种子的遗传转化方法
CN106609254A (zh) 一种抗草甘膦转基因籼稻的制备方法
CN103026966B (zh) 一种利用离体叶片鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法
CN109837297A (zh) 与黄萎病抗性相关的GhAGD13基因及其应用
CN102002512A (zh) 一种大豆遗传转化方法
JP2008259497A (ja) アグロバクテリウムを介したダイズ国内品種の形質転換体作出方法並びに形質転換体当代及び後代の種子を短期間で獲得する方法
CN1307312C (zh) 四倍体刺槐转基因及组培快繁方法
CN114657206A (zh) 一种柱花草的遗传转化方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant