CN108949809B - 一种连翘叶片trv载体介导病毒诱导基因沉默的方法 - Google Patents

一种连翘叶片trv载体介导病毒诱导基因沉默的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种连翘叶片TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法。所述方法为：将含有特定目标基因片段的TRV2载体和TRV1载体分别转化到农杆菌感受态中；筛选得到阳性菌株后，进行增殖培养得到含有不同载体的两种单克隆菌体；将两种单克隆菌体离心并利用侵染液分别重悬菌体至OD600＝0.9～1.1后，将二者等体积混合，得到混合侵染液；将所述混合侵染液注入连翘中，实现对特定目标基因的沉默。本发明深入探究了可提高侵染成功效率的关键因素，筛选出了最优的侵染液组成配方和侵染时含有菌体的侵染液的OD值。利用本发明所述方法对连翘进行侵染，可使连翘叶片VIGS侵染的成功率达90％以上。

Description

一种连翘叶片TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种连翘叶片TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法。
背景技术
病毒诱导基因沉默技术(virus-induced gene silencing，VIGS)属于RNA干扰中的一种，属于转录后基因沉默。该技术是携带目的基因片段的重组病毒载体进入植物细胞核后，在RNA引导的RNA聚合酶(RDRP)的作用下合成dsRNA，Dice酶作用于dsRNA，进一步使其产生含有21-25个核苷酸的干扰siRNA，siRNA的反义链再通过与RNA诱导的沉默复合体(RISC)相结合而得到激活，被激活的沉默复合体能够与目标基因的单链mRNA特异性结合，造成其发生特异性降解，目标基因无法行使信使功能继续传递该基因的遗传信息，从而导致基因沉默的发生，最终是由于目的基因的特异性降解阻断了遗传密码成功传出细胞核的分子机制(姚丹青，2009)。目标基因沉默成功的表现为，用带有目标基因片段的重组病毒载体侵染植物体以后，可使植物新生长部位的目标基因表达水平下降或者功能丧失(杨同文等，2014)。
连翘(Forsythia suspensa)是我国重要的观花灌木，也是传统中药药材。随着高通量测序技术的推广应用，可获取大量的基因表达序列标签，但由于尚无高效、稳定的基因功能验证方法，限制了对连翘分子生物学的研究。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种连翘叶片TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法。
本发明的技术方案如下：
一种连翘叶片TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法，所述方法包括：将含有特定目标基因片段的TRV2载体和TRV1载体分别转化到农杆菌感受态中；筛选得到阳性菌株后，进行增殖培养得到含有不同载体的两种单克隆菌体；将两种单克隆菌体离心、并利用侵染液分别重悬菌体至OD600＝0.9～1.1后，将二者等体积混合，得到混合侵染液；将所述混合侵染液注入连翘中，实现对特定目标基因的沉默。
作为优选，利用侵染液分别重悬菌体至OD600＝1。
作为优选，所述侵染液的组成为：以无菌水为母液，并加入400μmol/L乙酰丁香酮、10mmol/L氯化镁、10mmol/L乙磺酸、400mg/L半胱氨酸、5ml/L吐温-20，pH调制5.6，现用现配。
进一步地，将所述混合侵染液注入连翘新萌发枝条从上往下第一对嫩叶的叶背中，注射后黑暗处理一天，第二天正常光周期养护。
所述光周期养护的培养条件：光照16h，22℃；黑暗8h，18℃。
进一步地，上述方法在筛选得到阳性菌株后，制成菌液接种至含抗生素的LB平板培养基上，长出单克隆菌斑；挑取单克隆菌斑置于含有抗生素的LB液体培养基上培养，以实现单克隆菌体的增殖，得到单克隆菌液；然后将所述单克隆菌液以1:20的体积比转入液体诱导LB培养基中进行诱导培养。
其中，所述含抗生素的LB平板培养基和所述含有抗生素的LB液体培养基中所含的抗生素为：100mg/L卡那霉素、100mg/L庆大霉素和50mg/L利福平。
所述液体诱导LB培养基中含有100mg/L卡那霉素、100mg/L庆大霉素、50mg/L利福平、10mmol/L乙磺酸和20μmol/L乙酰丁香酮。
在本发明的具体实施方式中，将所述特定目标基因选择为连翘PDS基因作为示例性说明。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明首次针对连翘提供了一种连翘叶片TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法。并深入探究了可提高侵染成功效率的关键因素，筛选出了最优的侵染液组成配方和侵染时含有菌体的侵染液的OD值。利用本发明所述方法对连翘进行侵染，可使连翘叶片VIGS侵染的成功率达90％以上。
附图说明
图1为连翘叶片注射侵染图，注射前(左)、注射后(右)。
图2为未侵染叶片(上)与侵染部位先出现脓包(中)、后消失(下)的对比图。
图3为未侵染植株(上-左)新生叶片、TRV2侵染后叶片无白化现象(上-右)与TRV-FsPDS侵染后出现白化现象(下)的对比图。
图4为侵染后新萌发叶片PCR检测病毒的检测结果图，TRV1病毒检测(左)；TRV2病毒检测(右)；左图和右图中的泳道由左至右依次为2000Marker、CK、TRV2+TRV1、TRV-FSPDS1+TRV1、TRV-FSPDS2+TRV1、TRV-FSPDS3+TRV1。
图5为PDS基因表达量检测结果(CK：未侵染植株叶片，TRV2：空载，TRV-FSPDS：携带FsPDS基因侵染出现光漂白的植株叶片)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1、实验材料的获得：取盆栽连翘扦插苗，重剪后置于人工气候室培养，备用。培养条件：光照300μmol·m-2·s-1，16h，22℃，黑暗8h，18℃，湿度为60％。
2、重组载体构建：用基因工程的方法将扩增后的连翘八氢番茄红素脱氢酶(下称：FsPDS)基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到重组子pTRV-FsPDS。具体步骤如下：
cDNA的准备：按Trizol的方法提取连翘叶片总mRNA，按天根反转录试剂盒操作说明进行总mRNA的反转录，获得连翘cDNA，稀释20倍后，-20℃备用。
连翘PDS基因片段(FsPDS)的扩增：
设计PCR引物：上游引物：5’-TAAGGTTACCGAATTCGCCACCTTTC CACCA-3’，下游引物：5’-GCTCGGTACCGGATCCCAGTCTTGG AGATGCTG-3’，PCR产物为368bp的连翘PDS基因片段。以连翘第一链cDNA为模板，2×EasyTaq PCR SuperMix(货号：ASⅢ)进行目的片段PCR，采用50μL体系扩增。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；循环结束后72℃延伸10min。PCR产物进行电泳检测，并进行胶回收cDNA，-20℃备用。
pTRV-FsPDS重组载体的构建：胶回收的cDNA与经过EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切的pTRV2质粒用In-fusion酶进行连接(方法参见TaKaRa公司In-Fusion HD Cloning Kits说明书)，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有100mg/L卡那抗生素的LB平板培养基，37℃倒置培养12h，挑取单克隆菌斑至1mL含有100mg/L卡那抗生素的液体LB中，37℃，200r/min震荡培养12h，提取质粒，测序正确的重组质粒，-20℃保存备用。
3、农杆菌转化及培养：
3.1将pTRV-FsPDS、pTRV2、pTRV1质粒分别用液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态中，经菌液PCR鉴定正确后，得到分别含有质粒pTRV-FsPDS、pTRV2、pTRV1的农杆菌GV3101阳性菌株，记为TRV-FsPDS、TRV-TRV2和TRV-TRV1，甘油保菌，-80℃保存备用。
其中，液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态的过程为：农杆菌感受态GV3101购自博迈德公司，取5μL重组质粒(上步获得)加入融化的50μL GV3101中，冰浴30min，液氮速冻3min，37℃金属浴5min，冰浴2min，后加入500μL无抗生素液体LB培养基中复活培养4h，培养条件为，28℃，200r/min。
3.2将3.1中复活的菌液，5000r/min离心2min后，吸掉上清，留50μL，吸混匀菌体后涂到含100mg/L卡那+100mg/L庆大+50mg/L利福平三种抗生素的LB平板培养基上长出单克隆菌斑。
3.3分别挑取上述步骤3.2中的单克隆放于含有100mg/L卡那+100mg/L庆大+50mg/L利福平三种抗生素的LB液体培养基培养，以实现单克隆的增殖；对菌液进行PCR检验后，将带有重组子的单克隆菌液以1:20体积比转入液体诱导LB培养基(100mg/L卡那+100mg/L庆大+50mg/L利福平+10mmol/L乙磺酸+20μmol/L乙酰丁香酮)中诱导培养12h。
3.4侵染液的配置：以无菌水为母液，并加入400μmol/L乙酰丁香酮、10mmol/L氯化镁、10mmol/L乙磺酸、400mg/L半胱氨酸、5mL/L吐温-20，pH调制5.6，现用现配。
3.5将上述步骤3.3得到的TRV1、TRV2、TRV-FsPDS单克隆菌体离心获得菌体，分别用上述步骤3.4配置的侵染液稀释至OD600＝1，静置1h后，将TRV1与TRV2、TRV1与TRV-FsPDS分别以体积比1:1混匀。
4、连翘叶背注射侵染
用1mL注射器将上述步骤3.5获得的含有菌体的混合侵染液注入连翘新萌发枝条的第一对嫩叶的叶背中，用手指拖住叶片，将不带针头的注射器对准叶背远轴端向内注射含菌体的侵染液(见图1)，注射后黑暗处理一天，第二天正常光周期养护。恒温培养条件：光照16h，22℃；黑暗8h，18℃。
5、结果统计及验证
侵染3天后，侵染部位出现脓包(见图2)，侵染15天后，侵染部位恢复正常，并出现光漂白现象(见图3)，并采集叶片进行RNA提取、RT-PCR检测目的基因表达量，验证基因沉默效果。分别采集未侵染植株(CK)、TRV2空载侵染植株和带有标记基因TRV-FsPDS侵染植株的第一、二对叶片，检测TRV-FsPDS、TRV2和TRV1是否成功侵染了植株，并转运至生长点，本发明结果表明病毒均成功侵染了连翘植物体(见图4)；以叶片中表达稳定的CYP为内参基因，检测TRV-FsPDS、TRV2和TRV1对目的基因表达量的影响，确认是否出现了目的基因沉默。本发明发现，TRV-FsPDS重组质粒成功降低了连翘叶片PDS基因的表达量(见图5)，达到了基因沉默的效果。统计侵染成功的植株，连翘叶片VIGS侵染成功效率可达90％以上。
本实施例中，涉及的PCR及荧光定量引物分别为：
TRV1-F：5’-TTACAGGTTATTTGGGCTAG-3’；
TRV1-R:5’-CCGGGTTCAATTCCTTATC-3’；
TRV2-F：5’-TGTTTGAGGGAAAAGTAGAGAACGT-3’；
TRV2-R:5’-TTACCGATCAATCAAGATCAGTCGA-3’；
TRV-FsPDS-F：5’-ATGGTGCAGGTAAGACTTCAG-3’；
TRV-FsPDS-R:5’-GCAGTGGAAGGAGCATTCTAT-3’；
CYP-F：5’-CCGGAATGGATGTGGTGTATAA-3’；
CYP-R：5’-GGGAAGTTCACCACTGTCTG-3’。
对比例1
本对比例通过对所设计的不同侵染液组成及侵染菌液OD600值进行了对比实验，实验数据如下：
表1侵染结果统计
Figure BDA0001720420970000071
由上表中的侵染效率比较，筛选出最佳侵染液组成、及OD600的值。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京林业大学
<120> 一种连翘叶片TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法
<141> 2018-07-02
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taaggttacc gaattcgcca cctttccacc a 31
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctcggtacc ggatcccagt cttggagatg ctg 33
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttacaggtta tttgggctag 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgggttcaa ttccttatc 19
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtttgaggg aaaagtagag aacgt 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttaccgatca atcaagatca gtcga 25
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggtgcagg taagacttca g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcagtggaag gagcattcta t 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccggaatgga tgtggtgtat aa 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gggaagttca ccactgtctg 20

Claims (7)

1.一种连翘叶片TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法，其特征在于，所述方法包括：
将含有特定目标基因片段的TRV2载体和TRV1载体分别转化到农杆菌感受态中；筛选得到阳性菌株后，进行增殖培养得到含有不同载体的两种单克隆菌体；将两种单克隆菌体离心并利用侵染液重悬菌体至OD600＝0.9～1.1后，将二者等体积混合，得到混合侵染液；将所述混合侵染液注入连翘中，实现对特定目标基因的沉默；
所述特定目标基因为连翘PDS基因；
所述侵染液的组成为：以无菌水为母液，并加入400μmol/L乙酰丁香酮、10mmol/L氯化镁、10mmol/L乙磺酸、400mg/L半胱氨酸、5ml/L吐温-20，pH调制5.6，现用现配。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用侵染液重悬菌体至OD600＝1。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将所述混合侵染液注入连翘新萌发枝条从上往下第一对嫩叶的叶背中，注射后黑暗处理一天，第二天正常光周期养护。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述光周期养护的培养条件：光照16h，22℃；黑暗8h，18℃。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，筛选得到阳性菌株后，制成菌液接种至含抗生素的LB平板培养基上，长出单克隆菌斑；挑取单克隆菌斑置于含有抗生素的LB液体培养基上培养，以实现单克隆菌体的增殖，得到单克隆菌液；然后将所述单克隆菌液以1:20的体积比转入液体诱导LB培养基中进行诱导培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述含抗生素的LB平板培养基和所述含有抗生素的LB液体培养基中所含的抗生素为：100mg/L卡那霉素、100mg/L庆大霉素和50mg/L利福平。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述液体诱导LB培养基中含有100mg/L卡那霉素、100mg/L庆大霉素、50mg/L利福平、10mmol/L乙磺酸和20μmol/L乙酰丁香酮。
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