CN112375780B - 一种珊瑚菜pds基因vigs沉默体系及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种珊瑚菜PDS基因VIGS沉默体系及其构建方法和应用，属于生物技术领域。本发明通过构建含有珊瑚菜PDS基因特异性片段的pTRV II病毒沉默表达载体质粒，协同pTRV I质粒，通过农杆菌介导法侵染珊瑚菜组培苗，使珊瑚菜PDS基因发生沉默，有效降低了PDS表达水平，导致叶片白斑白化表型。本发明在珊瑚菜中建立了快速、有效的VIGS病毒沉默体系，操作简单，实验周期短，有效解决验证珊瑚菜基因功能的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地说，涉及一种珊瑚菜PDS基因VIGS沉默体系及其构建方法和应用。
背景技术
珊瑚菜(Glehnia littoralis Fr.Schmidt ex Miq.)是我国传统中药材“北沙参”的基源植物，自然生长于沿海沙滩地带，属于伞形科盐生植物。珊瑚菜野生资源主要分布于我国一些沿海省份，山东、江苏则是珊瑚菜传统道地产区。然而由于沿海开发等原因，导致目前野生资源已经濒危，人工栽培珊瑚菜现已经成为北沙参商品化药材的主要来源。中药材讲究道地性，指在特定自然条件和生态环境的区域内所产的药材质优效佳，然而随着人工栽培种珊瑚菜产区从沿海转移到内陆，内陆地区珊瑚菜存在着长势受限、质量参差不齐等问题，同时其本身耐盐的属性也变得不明显。因此，对珊瑚菜的耐盐机制、育种、活性成分的合成代谢机理等各个方面进行研究，是加快恢复珊瑚菜道地产区种植、新品种培育、提高药材品质的必经途径。
目前对珊瑚菜的分子生物学研究才开始起步，随着转录组、基因组测序技术的发展，虽然获得了很多重要的基因信息，却因为其缺少遗传转化体系而无法进行基因功能验证，而且珊瑚菜为多年生植物，药用部位为根，生长周期长，愈伤诱导和组培难度大，阻碍了进一步的深入研究。VIGS(virus-induced gene silencing)病毒介导的基因沉默技术，以病毒为载体侵染植株，利用植物抗病毒的机制，从而发生转录后水平的基因沉默，具有其周期短，不需要遗传转化，低成本等优势，目前已应用于多种植物进行基因功能验证，但该体系目前在珊瑚菜未建立和应用。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种珊瑚菜PDS基因的VIGS沉默体系。本发明所要解决的另一技术问题在于所述的珊瑚菜PDS基因的VIGS沉默体系的构建方法。本发明还要解决的一个技术问题在于提供所述珊瑚菜PDS基因的VIGS沉默体系的应用，能够快速、简便、低成本验证珊瑚菜基因功能。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种珊瑚菜PDS基因的VIGS沉默体系，所述沉默体系具有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。
所述的珊瑚菜PDS基因的VIGS沉默体系的构建方法，包括以下步骤：
1)提取珊瑚菜叶片RNA，反转录获得珊瑚菜cDNA；
2)依据珊瑚菜转录组数据库基因注释信息得到PDS mRNA序列信息，设计用于沉默珊瑚菜PDS基因的特异性核苷酸片段，如SEQ ID NO.1所示；
3)设计用于沉默珊瑚菜PDS基因的特异性核苷酸片段的引物，并以珊瑚菜cDNA为模板进行PCR扩增；
4)将PCR扩增产物连接到pTRV II上，构建得到珊瑚菜PDS基因的VIGS沉默体系，即pTRV II-PDS。
进一步地，步骤3)中所述引物具体如下：
PDS-F：5′-GTCGCTAAACTTTATCAATC-3′，
PDS-R：5′-CTTCAGTTTCCTGTCGAACC-3′。
所述的珊瑚菜PDS基因的VIGS沉默体系在鉴定珊瑚菜PDS基因功能中的应用。
进一步地，所述的应用，包括如下步骤：
1)将pTRV II-PDS、pTRV I质粒分别通过电击法转入农杆菌感受态细胞中；
2)挑取转化后的阳性农杆菌菌落，接入培养基培养；
3)收集菌液后使用重悬液等比例重悬，将重悬后的pTRV II-PDS与pTRV I菌液混合后黑暗静置一段时间，对珊瑚菜幼苗的叶片进行注射侵染；
4)继续培养珊瑚菜幼苗，观察叶片表型变化和/或通过荧光定量PCR检测被沉默目标基因的表达量。
进一步地，所述的重悬液含有10mM MgCl2，10mM MES和400μM AS。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明首次构建珊瑚菜基因VIGS沉默体系，能够有效降低珊瑚菜目标基因的表达水平；应用获得的珊瑚菜PDS基因沉默的植株，可作为验证沉默其它基因技术实施的阳性对照；实验周期短，能够快速、简便、低成本验证珊瑚菜的基因功能，在药用植物珊瑚菜的功能基因研究中具有应用价值。
附图说明
图1为用于VIGS沉默的PDS片段PCR扩增图，注：M：DNA ladder DL2000；
图2为本发明实施例1中构建的重组病毒载体pTRV II-PDS转入大肠杆菌后的菌落PCR验证图，注：M：DNA ladder DL2000；
图3为本发明实施例1中沉默载体侵染珊瑚菜幼苗后出现的白化表型图；
图4为本发明实施例2中采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测珊瑚菜PDS基因的沉默效果图，PDS-CK：未做侵染的珊瑚菜幼苗；利用VIGS技术沉默PDS基因的幼苗PDS-VIGS-1，PDS-VIGS-2。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规方法、或按照试剂盒制造厂商所建议的方法。
实施例1：构建重组病毒载体pTRV II-PDS
(1)珊瑚菜PDS干扰片段克隆
首先，依据珊瑚菜转录组数据库基因注释信息得到八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，PDS)mRNA序列信息，设计用于沉默PDS基因的特异性核苷酸片段，序列如SEQ ID NO.1所示，然后设计克隆该片段所用引物：
PDS-F：5′-GTCGCTAAACTTTATCAATC-3′(SEQ ID NO.2)；
PDS-R：5′-CTTCAGTTTCCTGTCGAACC-3′(SEQ ID NO.3)。
用RNA提取试剂盒(诺唯赞FastPure Platnt Total RNA Isolation Kit(Polysaccharides&Polyphenolics-rich))提取珊瑚菜叶片RNA(珊瑚菜叶片于二零二零年五月采自江苏省中国科学院植物研究所种质资源圃)，反转为cDNA，以珊瑚菜cDNA为模板，使用KOD-Plus-Neo酶(TOYOBO)扩增PDS基因特异性片段，全长409bp(图1)。扩增条件为：94℃变性2min；98℃10sec，61℃30s、68℃延伸15sec，运行30个循环。
(2)载体构建
将PCR扩增产物回收，连接到T载体上，再以XbaI/BamHI为酶切位点，将PDS连接到pTRV II上，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，抗性筛选后挑取阳性单菌落进行菌落PCR(图2)、提质粒测序验证，将成功连接PDS的pTRV II命名为pTRV II-PDS。
实施例2：VIGS侵染珊瑚菜叶片
将pTRV II-PDS、pTRV I质粒分别通过电击法转入GV3101感受态细胞中，挑取转化后的阳性农杆菌菌落，分别接入5mL YEP抗性培养基(含100mg/L利福平和50mg/L卡那抗生素)，28℃，200rpm培养过夜，将菌液1∶25接入50mL含200μM乙酰丁香酮(AS)的液体抗性培养基，培养至OD 0.6，收集菌液，用含10mM MgCl2，10mM MES和400μMAS的重悬液等比例重悬，将重悬后的pTRV II-PDS与pTRV I菌液1∶1混合后黑暗静置2-3小时，对珊瑚菜幼苗的叶片进行侵染；
液体抗性培养基配方：9.76g MES，0.24g NaH2PO4，5g葡萄糖，50mL 20×AB盐溶液，去离子水定容至1L，高压灭菌冷却后加入100mg/L利福平和50mg/L卡那抗生素。20×AB盐溶液：20g NH4Cl，6g MgSO4·7H2O，3g KCl，0.2g CaCl2，0.05g FeSO4·7H2O，溶解于1L去离子水。
侵染所用的珊瑚菜幼苗为组培快繁体系中的珊瑚菜丛生苗(由腋芽继代而来)，侵染时在超净工作台无菌操作，选择2em左右长度的叶片(太小和靠近最下面的叶片不选)，用一次性注射器的针头在珊瑚菜叶片背面轻轻划出伤口，然后取掉针头，用注射器将侵染液从伤口处推入叶片，用吸水纸吸掉多余菌液，将组培瓶放置于28℃培养箱，黑暗培养24小时后移入光照培养箱正常培养。大约3-4周，叶片有明显白化、白斑出现，取叶片进行基因表达量鉴定，然后将珊瑚菜组培苗经过炼苗、移栽至土中继续培养，进行后续相应实验。
实施例3：鉴定VIGS沉默后的珊瑚菜PDS表达量
待被侵染的植株叶片有白化或白斑的表型时(图3)，取新鲜叶片，用RNA试剂盒提取叶片总RNA，以EXP1为内参基因，通过荧光定量PCR检测被沉默后目标基因的表达量。
所用引物为：
PDS-qRT-F：5′-CTTTTCCACTGCTTCCCGTC-3′(SEQ ID NO.4)；
PDS-qRT-R：5′-CAGCCACCTTTCCACCTAGA-3′(SEQ ID NO.5)；
EXP1-RT-F：5′-AGCCCTCCTGCATGTTTAGT-3′(SEQ ID NO.6)；
EXP1-RT-R：5′-ACGAAGCTGGTCACTGTCAG-3′(SEQ ID NO.7)。
PDS基因表达量测定结果见图4，与对照PDS-CK相比，经过VIGS沉默后的珊瑚菜叶片(PDS-VIGS-1和PDS-VIGS-2)中PDS基因表达量显著降低。
序列表
<110> 江苏省中国科学院植物研究所
<120> 一种珊瑚菜PDS基因VIGS沉默体系及其构建方法和应用
<130> 100
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 409
<212> DNA
<213> Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.
<400> 1
gtcgctaaac tttatcaatc cagacgaact ttcgatgcaa tgtgtattga ttgctttgaa 60
ccgatttctt caggagaagc atggttcaaa gatggctttc ttggatggaa gtcctccaga 120
aagactttgc atgccgatag ttgatcacat acagtcactg ggtggtgaag ttcatctcaa 180
ttcacgagta cagaagatct ctttaaataa agatcatact gttaagagtc tattactaac 240
caatgggaag gttattgaag cagatgcata tgtaattgct gctccagttg atatcctaaa 300
gctacttgtg cctgaagagt ggagagagat tccatacttc aagaagttgg ataaattagt 360
tggagttcca gtaatcaatg ttcacatatg gttcgacagg aaactgaag 409
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> PDS-F(Artificial)
<400> 2
gtcgctaaac tttatcaatc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> PDS-R(Artificial)
<400> 3
cttcagtttc ctgtcgaacc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> PDS-qRT-F(Artificial)
<400> 4
cttttccact gcttcccgtc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> PDS-qRT-R(Artificial)
<400> 5
cagccacctt tccacctaga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> EXP1-RT-F(Artificial)
<400> 6
agccctcctg catgtttagt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> EXP1-RT-R(Artificial)
<400> 7
acgaagctgg tcactgtcag 20
Claims (6)
1.一种沉默珊瑚菜PDS基因的特异性核苷酸片段，其特征在于，序列如SEQ ID NO.1所示。
2.珊瑚菜PDS基因的VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取珊瑚菜叶片RNA，反转录获得珊瑚菜cDNA；
2)依据珊瑚菜转录组数据库基因注释信息得到PDS mRNA序列信息，设计用于沉默珊瑚菜PDS基因的特异性核苷酸片段，如SEQ ID NO.1所示；
3)设计用于沉默珊瑚菜PDS基因的特异性核苷酸片段的引物，并以珊瑚菜cDNA为模板进行PCR扩增；
4)将PCR扩增产物连接到pTRV II上，构建得到珊瑚菜PDS基因的VIGS沉默体系，即pTRVII-PDS。
3.根据权利要求2所述的珊瑚菜PDS基因的VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于，步骤3)中所述引物具体如下：
PDS-F：5′-GTCGCTAAACTTTATCAATC-3′，
PDS-R：5′-CTTCAGTTTCCTGTCGAACC-3′。
4.权利要求2所构建的珊瑚菜PDS基因的VIGS沉默体系在鉴定珊瑚菜PDS基因功能中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
1)将pTRV II-PDS、pTRV I质粒分别通过电击法转入农杆菌感受态细胞中；
2)挑取转化后的阳性农杆菌菌落，接入培养基培养；
3)收集菌液后使用重悬液等比例重悬，将重悬后的pTRV II-PDS与pTRV I菌液混合后黑暗静置一段时间，对珊瑚菜幼苗的叶片进行注射侵染；
4)继续培养珊瑚菜幼苗，观察叶片表型变化和/或通过荧光定量PCR检测被沉默目标基因的表达量。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的重悬液含有10mM MgCl2，10mM MES和400μM AS。
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